karen batschinski avaliação da eficácia da 5-azacitidina e

Karen Batschinski

Avaliação da eficácia da 5-Azacitidina e SAHA nas linhagens de hemangiossarcoma canino

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências Programa de Oncologia Orientadora: Profa. Dra. Maria Lúcia Zaidan Dagli

São Paulo 2017

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: BATSCHINSKI, Karen Título: Avaliação da eficácia da 5-Azacitidina e SAHA nas linhagens de

hemangiossarcoma canino.

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências Programa de Oncologia

Data: __/__/____

Banca Examinadora

Prof(a) Dr(a)_______________________________________________________ Instituição:____________________________ Julgamento:____________________________

Prof(a) Dr(a)_______________________________________________________

Instituição:____________________________ Julgamento:____________________________

Prof(a) Dr(a)_______________________________________________________


Prof(a) Dr(a)_______________________________________________________


Prof(a) Dr(a)_______________________________________________________


A minha linda filha Eva, com quem aprendi o verdadeiro significado da palavra amor.

AGRADECIMENTOS

A minha querida orientadora, Profa. Maria Lúcia Zaidan Dagli, por me incentivar e

ensinar conhecimentos na área de Oncologia Básica, contribuindo muito com o meu

crescimento profissional.

Aos meus amigos Daniel Sanches, Ivone da Fonseca e Márcia Nagamine por todo o

incentivo e ensinamentos que ajudaram na conquista dos meus resultados.

As queridas amigas, Tati, Nayra e Andréa, pelos muitos momentos de diversão no

Laboratório.

A Marília Takada, amiga que me ajuda desde a época da residência, que contribuiu com

o meu trabalho mesmo a distância fazendo várias sessões de Skype.

Aos amigos do Provet, Rodrigo, Juliana, Greice, Alessandra Rinah, Karine, e também à

Alessandra Nobre, pela ajuda com a coleta de dados para o estudo retrospectivo.

A Profa. Cristina Massoco por ter gentilmente me auxiliado com os experimentos que

utilizaram a citometria de fluxo.

A Marguite, por sua paciência em me ajudar com o passo a passo da imunoistoquímica.

A Fátima Cavalcante, por contribuir com a pesquisa do hemangiossarcoma permitindo o

uso de amostras da sua tão adorada cadela Liss para o desenvolvimento de uma cultura

primária de hemangiossarcoma canino.

Aos meus pais, Norma e Karl, que sempre vibraram com as minhas conquistas.

A minha nova família, Benjamin, Eva e Pum, por deixar a vida muito mais gostosa.

A FAPESP, pelo apoio financeiro para termos condições de desenvolver essa pesquisa.

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1

Figura 1. Raças mais acometidas de cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral………………………………………………………………………….30

Figura 2. Curvas de sobrevida (Kaplan-Meier) de cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral em diferentes sítios primários. Fígado (3), rim (2), intestino (1), vesicula urinária (1) e linfonodo (1) foram os órgãos primários acometidos além do baço………………………………….…………………31

Figura 3. Curva Kaplan-Meier de sobrevida de cães tratados somente com cirurgia e cães tratados com cirurgia e Doxorrubicina adjuvante…………….………………………………………………………….34

Figura 4. Curva Kaplan-Meier de sobrevida global de cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral...…………………………………………………..35 CAPÍTULO 2

Figura 5. A- Aspecto macroscópico de hemangiossarcoma esplênico não rompido. B - Presença de sangramento intra-abdominal durante procedimento cirúrgico para retirada de hemangiossarcoma esplênico. C - Aspecto macroscópico de hemangiossarcoma esplênico.………………………………………………….52

Figura 6. A e B - Aspecto macroscópico de hemangiossarcoma cutâneo em cão, sem invasão para tecidos subcutâneo, localizado em região alopécica e com pouca pigmentação…………………………………………………...………...53

Figura 7. Amostras de hemangiossarcoma submetidas à marcação imunoistoquímica com anticorpo anti-5-metilcitidina. Marcações forte (A), fraca (B) e negativa (C) evidenciadas por setas em amostras de hemangiossarcoma canino esplênico. Marcações forte (D), fraca (E) e negativa (F) evidenciadas por setas em amostras de hemangiossarcoma canino de derme…………………………………………………………………………...60

Figura 8. Avaliação da metilação de DNA em hemangiossarcoma esplênico e cutâneo de cães. Marcações apresentadas através da avaliação de imunoistoquímica, sendo consideradas forte, fraca e negativa. Letras iguais indicam sem diferença estatística significativa (p≥0,05) e letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,0001)………………………61

Figura 9. Amostras de hemangiossarcoma submetidas à marcação imunoistoquímica com anticorpo anti-Ki-67. A- Marcações positivas evidenciadas por setas em amostras de hemangiossarcoma canino esplênico. B - Marcações positivas evidenciadas por setas em amostras de hemangiossarcoma canino de derme…………………………………………………………….…..62

Figura 10. Índice de proliferação celular (células positivas e negativas) para marcação com anticorpo anti-Ki-67 em hemangiossarcoma esplênico e cutâneo. Não foram observadas diferenças estatísticas significantes………..62

Figura 11. Correlação de Pearson para células com marcação positiva para os anticorpos anti-metilcitidina e anti-Ki67 em hemangiossarcoma esplênico. Não foram observadas diferenças estatísticas significantes (p = 0,611)……64

Figura 12. Correlação de Pearson para células com marcação positiva para os anticorpos anti-metilcitidina e anti-Ki67 em hemangiossarcoma cutâneo. Diferença estatística significante de p = 0,0008……………………………65 CAPÍTULO 3

Figura 13. Hemangiossarcoma. Hematoxilina e eosina. A- Aspecto arquitetônico microscópico da neoplasia apresentando áreas solidas e espaços vasculares. Objetiva de 10X. B – Maior aumento da figura 1A mostrando características celulares como pleomorfismo moderado com discreta anisocitose e discreta anisocariose. Objetiva de 20X………………………………………………96

Figura 14. Hemangiossarcoma. Maior aumento da figura 1 mostrando detalhes (indicados por setas) como figuras de mitose. Hematoxilina e eosina. Objetiva de 40X………………………………...……………………………………...96

Figura 15. A, B, C - Fotomicrografia das células provenientes de um hemangiossarcoma mesentérico nos primeiros 5 dias de cultivo apresentando um formato mais arredondado. A- Objetiva 10X. B - Objetiva 20X. C – Objetiva 40X. D, E, F - Fotomicrografia das células provenientes de um hemangiossarcoma mesentérico apresentando um formato mais alongado e fibroblastóide. D - Objetiva 10X. E - Objetiva 20X. F - Objetiva 40X……97

Figura 16. A - Fotomicrografia da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico imunomarcada com fator von Willebrand. B - Fotomicrografia da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico imunomarcada com CD31. C - Fotomicrografia da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico imunomarcada com CD117. D - Fotomicrografia da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico imunomarcada com vimentina……………99

Figura 17. Fotomicrografia do controle negativo da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico…………………………....………….100

Figura 18. A - Histograma de citometria de fluxo evidenciando quantificação de conteúdo de DNA de linfócitos de um cão saudável que foi utilizado como controle. Linfócitos encontram-se na fase G0/G1 do ciclo celular. B - Histograma de citometria de fluxo evidenciando quantificação de conteúdo de DNA de linhagem de hemangiossarcoma canino LISS-HSA. Células neoplásicas encontram-se na fase S (síntese do DNA) do ciclo cellular…101

Figura 19. Microscopia eletrônica de transmissão de células endoteliais HEK293 mostrando corpúsculos de von Willebrand…………………………………103

Figura 20. Microscopia eletrônica de transmissão de células endoteliais HUVEC………………………………………………………………...……..103

Figura 21. Fotomicrografia da linhagem LISS-HSA proveniente de um hemangiossarcoma canino fixada com glutaraldeído e corada com azul de toluidina. A - Objetiva 40X. B – Objetiva 100X…………………………104

Figura 22. Eletromicrografia das células LISS-HSA provenientes de um hemangiossarcoma canino fixadas em resina e analisadas pela microscopia eletrônica de transmissão. A – 2500X, B – 6000X, C – 10000X…………104

Figura 23. Morfologia ultraestrutural de corpúsculo de Weibel-Palade das células LISS-HSA. A – Setas pretas evidenciando diversos corpúsculos de Weibel-Palade dentro das células endoteliais LISS-HSA (15000X), B – Seta branca evidenciando formato alongado do corpúsculo de Weibel-Palade da célula endotelial LISS-HSA (60000X)……………………………………………105

Figura 24. Gráfico de crescimento celular na linhagem celular de hemangiossarcoma canino DD1 através da técnica de incorporação pelo cristal violeta. Aumento crescente na leitura da densidade óptica com o passar do tempo e com o maior número de células por poço…………………………106

Figura 25. Gráfico de crescimento celular na linhagem celular de hemangiossarcoma canino FROG através da técnica de incorporação pelo cristal violeta. Aumento crescente na leitura da densidade óptica com o passar do tempo e com o maior número de células por poço………………………106

Figura 26. Gráfico de crescimento celular na linhagem celular de hemangiossarcoma canino LISS-HSA através da técnica de incorporação pelo cristal violeta. Aumento discreto crescente na leitura da densidade óptica com o passar do tempo e com o maior número de células por poço……………107

Figura 27. Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro na linhagem celular de hemangiossarcoma canino DD1 tratada com (A) Doxorrubicina, (B) 5-Azacitidina e (C) SAHA…………………………………………………108

Figura 28. Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro na linhagem celular de hemangiossarcoma canino FROG tratada com (A) Doxorrubicina, (B) 5-Azacitidina e (C) SAHA……………………………………………109

Figura 29. Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro na linhagem celular de hemangiossarcoma canino EMMA tratada com (A) Doxorrubicina, (B) 5-Azacitidina e (C) SAHA……………………………………………110

Figura 30. Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro pelo teste de MTT nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino EMMA, DD1, LISS e

FROG tratadas com as Doxorrubicina e 5-Azacitidina utilizadas isoladamente ou em combinação…………………..………………………………..…………..112

Figura 31. Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro pelo teste de MTT nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino EMMA, DD1, LISS e FROG tratadas com as Doxorrubicina e SAHA utilizadas isoladamente ou em combinação…………………………………………………………………....113

Figura 32. Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro pelo teste do cristal violeta nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino EMMA, DD1, LISS e FROG tratadas com as Doxorrubicina e 5-Azacitidina utilizadas isoladamente ou em combinação……………………………………………115

Figura 33. Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro pelo teste do cristal violeta nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino EMMA, DD1, LISS e FROG tratadas com Doxorrubicina e 5-Azacitidina utilizadas isoladamente ou em combinação……………………………………………116

Figura 34. Gráficos da análise de viabilidade celular utilizados para calcular o IC50 nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino DD1, FROG e LISS-HSA após a exposição aos agentes Doxorrubicina, 5-Azacitidina e SAHA testados isoladamente………………………………………..………………………....118

Figura 35. Isobologramas criados com o software Compusyn® mostrando relação entre a combinação de Doxorrubicina com 5-Azacitidina ou SAHA nas linhagens de hemangiossarcoma canino LISS-HSA (A), FROG (B) e DD1 (C)……………………………………………………...……………………...121

LISTA DE QUADROS CAPÍTULO 1

Quadro 1. Sistema de estadiamento clinico de hemangiossarcoma canino de acordo com a Organização Mundial da Saúde.................................................33

Quadro 2. Protocolos quimioterápicos utilizados nos cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral......................................................................34 CAPÍTULO 2

Quadro 3. Tabela contendo as principais diferenças entre o o hemangiossarcoma esplênico e dérmico em cães............................................................................52

Quadro 4. Médias (em porcentagem %) ± desvio padrão das avaliações da metilação do DNA de hemangiossarcoma esplênico e cutâneo de cães..........61

Quadro 5. Médias (em porcentagem %) ± desvio padrão das avaliações da marcação anti-Ki-67 de hemangiossarcoma esplênico e cutâneo de cães.......63

Quadro 6. Tabela mostrando índice de correlação de Pearson. Coeficiente (r) de correlação mede o grau pelo qual duas variáveis tendem a mudar juntas. O coeficiente descreve a força e a direção da relação.............................................63 CAPÍTULO 3

Quadro 7. Tabela mostrando aspectos comparativos entre o hemangiossarcoma canino e humano..................................................................................................76

Quadro 8. Dosagens utilizadas para a combinação de Doxorrubicina com SAHA ou 5-Azacitidina nas linhagens LISS-HSA, FROG e DD1 para determinação de efeito antagonista, aditivo ou sinérgico...............................................................92

Quadro 9. Dados dos animais incluídos no projeto..................................................95

Quadro 10. Referência de valores estimados para análise de ploidia (BD Biosciences).......................................................................................................101

Quadro 11. Valores do IC50 da Doxorrubicina, SAHA e 5-Azacitidina nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino DD1, FROG e LISS-HSA...................................................................................................................117

Quadro 12. Valores dos índices de combinação (CI) obtidos após tratamento com Doxorrubicina e 5-Azacitidina e Doxorrubicina e SAHA nas linhagens de hemangiossarcoma LISS-HSA, FROG e DD1. Valores de CI menores que 1 indicam sinergismo............................................................................................120

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AH Histona acetiltransferase

AZA 5-Azacitidina

bFGF Fator de crescimento fibroblasto básico

Brdu Bromodeoxiuridina

C5 Quinta posição do carbono

CI Índice de combinação

CO2 Dióxido de carbono

COX-2 Ciclooxigenase

CpG Citosina-fosfatodiéster-guanina dinucleotídeo

DAB Diaminobenzidina

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido deoxinucleico

EDTA Ácido etinodiamino tetra acético

FBS Soro fetal bovino

FDA Food and Drug Administration

FITC Isotiocianato de fluoresceína

IV Intravenoso

Gy Gray

HD Histona desacetilase

HE Hematoxilina e Eosina

HOVET Hospital Veterinário

HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência

HSA Hemangiossarcoma

kg Quilograma

L MTP-PE Muramil tripeptídeo fosfatidiletanolamina encapsulado

MBV Vacina bacteriana mista

5 –Metcit 5-Metilcitidina

5-Metil-dC 5-Metil-2’-desoxicitidina

m2 Metro quadrado

µg Micrograma

µL Microlitro

µm Micrometro

µM Micromolar

MFI Intensidade média da fluorescência

mg Miligrama

ml Mililitro

mm Milímetro

min Minutos

M Molar

MTP-PE Muramil tripeptídeo fosfatidiletanolamina

MTT Sal tetrazólico (3-) 4,5-dymethylthiazol-2-(yl)-2,5-(diphenyl tretrazolium

bromide)

ng Nanograma

nm Nanometro

nM Nanomolar

PBS Tampão fosfato-salino

pH Potencial de hidrogênio

PI Iodeto de propídeo

r Coeficiente de correlação de Pearson

RNA Ácido ribonucleico

Rpm Rotações por minuto

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SAHA Ácido suberanilohidroxâmico

TBST Solução tris salina tamponada

TMS Tempo mediano de sobrevida

VEGF Fator de crescimento vascular endotelial

SUMÁRIO CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO GERAL....................................................................14 1 INTRODUÇÃO GERAL.............................................................................................15 2 OBJETIVOS GERAIS.................................................................................................16 3 REFERÊNCIAS...........................................................................................................17 CAPÍTULO 2: HEMANGIOSSARCOMA VISCERAL EM CÃES: ESTUDO RETROSPECTIVO DE 42 CASOS (2005-2014)........................................................19 1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA.....................................................22 2 MATERIAL E MÉTODO............................................................................................29 3 RESULTADOS............................................................................................................30 3.1 Pacientes....................................................................................................................30 3.2 Localização do tumor primário e estadiamento clínico no momento do diagnóstico.......................................................................................................................30 3.3 Terapia.......................................................................................................................32 3.4 Sobrevida global........................................................................................................35 4 DISCUSSÃO................................................................................................................36 5 CONCLUSÃO..............................................................................................................40 6 REFERÊNCIAS............................................ ...............................................................41 CAPÍTULO 3: AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE METILAÇÃO GLOBAL DO DNA E TAXA DE PROLIFERAÇÃO CELULAR NO HEMANGIOSSARCOMA CANINO ESPLÊNICO E DE DERME.......................................................................48 1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA.....................................................51 2 MATERIAL E MÉTODO............................................................................................55 2.1 Amostras de tecido tumoral.......................................................................................55 2.2 Marcação imunoistoquímica......................................................................... ............55 2.3 Aquisição de imagem e contagem da marcação imunoistoquímica..........................57 2.4 Análise estatística......................................................................................................57 3 RESULTADOS............................................................................................................59 3.1 Avaliação da metilação global do DNA....................................................................59 3.2 Índice de proliferação celular....................................................................................61 3.3 Análise de correlação de Pearson..............................................................................63 4 DISCUSSÃO................................................................................................................66 5 CONCLUSÃO..............................................................................................................68 6 REFERÊNCIAS...................................................... .....................................................69 CAPÍTULO 4: AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA 5-AZACITIDINA E SAHA NAS LINHAGENS DE HEMANGIOSSARCOMA CANINO.................................72 1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA.....................................................75 2 OBJETIVOS.................................................................................................................81 2.1 Objetivo geral............................................................................................................81 2.2 Objetivos específicos.................................................................................................81

3 MATERIAL E MÉTODO............................................................................................82 3.1 Desenvolvimento de cultura celular primária de hemangiossarcoma canino............82 3.1.1 Animais...................................................................................................................82 3.1.2 Coleta de neoplasias abdominais............................................................................82 3.1.3 Análise histopatológica..........................................................................................82 3.1.4 Cultura celular........................................................................................................83 3.1.5 Cultura celular primária de hemangiossarcoma canino..........................................83 3.1.6 Congelamento e descongelamento de células........................................................84 3.1.7 Colorações imunocitoquímicas de cultura primária de hemangiossarcoma...........85 3.1.8 Citometria de fluxo.................................................................................................85 3.1.9 Ploidia e ciclo celular.............................................................................................86 3.1.10 Microscopia eletrônica de transmissão.................................................................87 3.2 Ensaios para determinação de citotoxicidade............................................................88 3.2.1 Curva de crescimento de células de hemangiossarcoma canino............................88 3.2.2 Análise da viabilidade celular com ensaio de MTT após exposição inicial aos agentes antineoplásicos utilizados isoladamente.............................................................88 3.2.3 Análise da viabilidade celular com ensaio de MTT após exposição aos agentes antineoplásicos utilizados em combinação......................................................................89 3.2.4 Análise da viabilidade celular com o teste de cristal violeta após exposição aos agentes antineoplásicos utilizados em combinação.........................................................90 3.2.5 Cálculo do IC50......................................................................................................90 3.2.6 Avaliação de sinergismo.........................................................................................91 3.3 Quantificação da metilação global do DNA..............................................................92 4 RESULTADOS............................................................................................................95 4.1 Animais utilizados e coleta de neoplasias abdominais..............................................95 4.2 Cultura celular...........................................................................................................95 4.2.1 Cultura de tecido tumoral.......................................................................................95 4.2.2 Caracterização imunofenotípica da cultura celular primária de hemangiossarcoma..........................................................................................................98 4.3 Ploidia e ciclo celular..............................................................................................100 4.4 Microscopia eletrônica de transmissão....................................................................102 4.5 Ensaios para determinação de citotoxicidade..........................................................105 4.5.1 Curva de crescimento de células de hemangiossarcoma. canino.........................105 4.5.2 Análise da viabilidade celular com ensaio de MTT após exposição inicial aos agentes antineoplásicos utilizados isoladamente...........................................................107 4.5.3 Análise da viabilidade celular com ensaio de MTT após exposição aos agentes antineoplásicos utilizados em combinação....................................................................111 4.5.4 Análise da viabilidade celular com o teste de cristal violeta após exposição aos agentes antineoplásicos utilizados em combinação.......................................................114 4.5.5 Cálculos do IC50..................................................................................................117 4.5.6 Avaliação de sinergismo.......................................................................................118 4.5.7 Quantificação da metilação global do DNA.........................................................122 5 DISCUSSÃO..............................................................................................................123 6 CONCLUSÃO............................................................................................................128 7 REFERÊNCIAS..................................................... ....................................................129 8 CONCLUSÕES GERAIS.......................................................................................... 149

Capítulo 1

INTRODUÇÃO GERAL

15

1 INTRODUÇÃO GERAL

O hemangiossarcoma, também conhecido como angiossarcoma, é uma neoplasia

que tem origem no endotélio vascular. Trabalhos mais recentes sugerem que a

ontogenia do hemangiossarcoma seja a partir de células-tronco hematopoiéticas

transformadas (FOSMIRE et al., 2004). O hemangiossarcoma é uma neoplasia

extremamente frequente em cães, representando 5%-7% de todos os tipos de câncer

nessa espécie (PRIESTER; MCKAY, 1980; SPANGLER; CULBERSTON, 1992;

HAMMER et al., 1991). Já em seres humanos, o diagnóstico de angiossarcoma é raro,

representando apenas 0,01%-0,1% das neoplasias nos homens (SPIRTAS et al., 1983;

FALK et al., 1981). Em ambas as espécies, o hemangiossarcoma apresenta um

comportamento bastante agressivo com o desenvolvimento de metástases ocorrendo no

início do curso da doença (KIM et al., 2015).

Inicialmente, o diagnóstico de angiossarcoma em seres humanos costumava

estar associado à exposição crônica, no ambiente de trabalho, principalmente ao dióxido

de tório e cloreto de vinilo (SPIRTAS et al., 1983; FALK et al., 1981). Os primeiros

relatos de hemangiossarcoma canino datam dos anos 50 e 60 e coincidem com o

período no qual a relação entre cães e humanos começou a mudar (LIEBERMAN,

1955; QUIGLEY et al., 1965; GEIB, 1967). Os cães deixaram de exercer funções como

cães de guarda, caça e pastoreio e passaram a ser considerados como membros da

família. Em meados da década de 1970, ficou aparente que a incidência do

hemangiossarcoma nos cães era 25 a 100 vezes maior do que a incidência de

angiossarcoma em humanos e uma predileção racial passou a ser notada (APPLEBY et

al., 1978; BROWN, et al., 1985; PRYMAK et al., 1988; SPANGLER; CULBERSTON,

1992). Nos últimos 40-50 anos, os fatores causais do angiossarcoma em humanos

também mudaram, com a maior parte dos pacientes não apresentando histórico de

exposição ocupacional às substâncias tóxicas (KOCH et al., 2008; COHEN et al., 2009)

Por estas razões, o hemangiossarcoma canino de ocorrência espontânea tem sido

considerado como modelo para o estudo do câncer de origem vascular na espécie

humana, em função de suas similaridades morfológicas, anatômicas e fisiológicas e

também em função dos cães dividirem o mesmo ambiente com seus tutores, expondo-

se, assim, aos mesmos fatores ambientais de risco.

16

2 OBJETIVOS GERAIS

• Realizar estudo retrospectivo de cães portadores de hemangiossarcoma

visceral na cidade de São Paulo.

• Avaliar a metilação global do DNA em hemangiossarcoma canino .

• Estabelecer e caracterizar linhagem de hemangiossarcoma canino para

realizar estudos in vitro de novas terapias.

• Analisar os efeitos in vitro dos agentes antineoplásicos 5-Azacitidina e

SAHA, utilizados isoladamente ou associados à Doxorrubicina, em cultura

celular de hemangiossarcoma canino.

17

3 REFERÊNCIAS

APPLEBY, E. C.; HAYWARD, A. H.; DOUCE, G. German shepherds and splenic

tumors. Veterinary Record, 1978.

BROWN, N. O.; PATNAIK, A. K.; MACEWEN, E. G. Canine hemangiosarcoma:

retrospective analysis of 104 cases. Journal of the American Veterinary Medical

Association, v. 186, p. 56-58, 1985.

COHEN, S. M.; STORER, R. D.; CRISWELL, K. A.; DOERRER, N. G.; DELLARCO,

V. L.; PEGG, D. G.; WOJCINSKI, Z. W.; MALARKEY, D. E.; JACOBS, A. C.;

KLAUNIG, J. E., et al. Hemangiosarcoma in rodents: mode-of-action evaluation and

human relevance. Toxicological Sciences, v. 111, p. 4-18, 2009.

FALK, H.; HERBERT, J.; CROWLEY, S.; ISHAK, K. G.; THOMAS, L. B.; POPPER,

H.; CALDWELL, G. G. Epidemiology of hepatic angiosarcoma in the United States.

Environmental Health Perspectives, v. 41, p. 107-113, 1981.

FOSMIRE, P.F.; DICKERSON, E.B.; SCOTT, A.M.; BIANCO, S.R.; PETTENGILL,

M.J.; MEYLEMANS, H.; PADILLA, M.P.; FRAZER-ABEL, A.A.; AKHTAR, N.;

GETZY, D.M.; WOJCIESZYN, J.; BREEN, M.; HELFAND, S.C.; MODIANO, J.F.

Canine malignant hemangiosarcoma as a model of primitive angiogenic endothelium.

Laboratory Investigation, v. 84, p. 562-572, 2004.

GEIB, L. W. Primary angiomatous tumors of the heart and great vessels. A reporto f

two cases in the dog. Cornell Vet, v. 57, p. 292-296, 1967.

HAMMER, A. S.; COUTO, C. G.; SWARDSON, C.; GETZY, D. Hemostatic

abnormalities in dogs with hemangiosarcoma. Journal of Veterinary Internal

Medicine, v. 5, n. 1, p. 11-14, 1991.

KIM, J. H.; GRAEF, A. J.; DICKERSON, E. B.; MODIANO, J. F. Pathobiology of

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hemangiosarcoma in dogs: research advances and future perspectives. Veterinary

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KOCH, M.; NIELSEN, G. P.; YOON, S. S. Malignant tumors of blood vessels:

angiosarcomas, hemangioendotheliomas, and hemangiopericytomas. Journal of

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LIEBERMAN, L. L. Malignant hemangioendothelioma of the canine heart. Journal of

the American Veterinary Medical Association, v. 126, p. 296, 1955.

PRIESTER, W.; MCKAY, F. The occurrence of tumors in domestic animals,

Washington, DC. National Cancer Institute Monograph, n. 54, p. 1-210, 1980.

PRYMAK, C.; MCKEE, L. J.; GOLDSCHMIDT, M. H.; GLICKMAN, L. T.

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hemangiosarcoma and splenic hematoma in dogs: 217 cases. Journal of the American

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QUIGLEY, P. J.; DE SARAM, W.; DAWSON, I. M.; PRYSE-DAVIES, J. Two cases

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1209, 1965.

SPANGLER, W.L; CULBERTSON, M.R. Prevalence, type, and importance of splenic

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SPIRTAS, R.; BEEBE, G.; BAXTER, P.; DACEY, E.; FABER, M.; FALK, H.; VAN

KAICK, G; STAFFORD, J. Angiosarcoma as a model for comparative carcinogenesis

(Letter to the Editor). Lancet, v. 83, 1983.

Capítulo 2

HEMANGIOSSARCOMA VISCERAL EM CÃES : ESTUDO RETROSPECTIVO DE 42 CASOS (2005-2014)

20

RESUMO

Batschinski K. Hemangiossarcoma visceral em cães: estudo retrospectivo de 42 casos (2005-2014) [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017. O hemangiossarcoma é uma neoplasia maligna de origem endotelial vascular de ocorrência comum em cães. Nessa espécie, o órgão primário mais acometido é o baço. O hemangiossarcoma de partes moles em cães é caracterizado por ter um comportamento biológico muito agressivo e metástases, principalmente para o pulmão e fígado, são frequentes e ocorrem de maneira rápida no início do curso da doença. O óbito ocorre na maioria dos casos devido a hemorragia interna aguda secundária à ruptura do tumor e/ou devido ao processo metastástico. A cirurgia continua a ser o principal método de tratamento para quase todos os cães com hemangiossarcoma, mas a quimioterapia adjuvante é indicada em razão do alto índice metastático e do prognóstico ruim associado com o procedimento cirúrgico sozinho. Um estudo retrospectivo foi realizado para determinar o tempo de sobrevida e potenciais fatores de risco em cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral. Prontuários de 42 cães foram revisados. Dados como idade e peso no momento do diagnóstico, raça, sexo, localização do tumor, estágio clínico da doença, tipo de tratamento, e tempo mediano de sobrevida foram analisados. Vinte e três cães foram tratados apenas com cirurgia, enquanto que 19 cães foram tratados com cirurgia e quimioterapia adjuvante. Houve diferença estatística na sobrevida dos cães tratados com cirurgia e Doxorrubicina (274 dias) em comparação com cães tratados apenas com cirurgia (66 dias). Cães com hemangiossarcoma esplênico tiveram um tempo mediano de sobrevida mais longo do que os cães com hemangiossarcoma localizados em outros sítios primários e com metástase (274 versus 117 versus 38 dias, respectivamente, p = 0,013). O tempo mediano global de sobrevida para esses 42 cães foi de 237 dias, e a taxa de sobrevida de um ano foi estimada em 26,32%. Conclui-se que a localização primária do hemangiossarcoma teve associação com o prognóstico e que o uso da Doxorrubicina após o tratamento cirúrgico aumentou a sobrevida dos cães diagnosticados com essa doença. Neste estudo, o estadiamento clínico dos cães não influenciou o prognóstico. Descritores: hemangiossarcoma; cães; esplenectomia; doxorrubicina; baço

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ABSTRACT Batschinski K. Visceral hemangiosarcoma in dogs: a retrospective study of 42 cases (2005-2014) [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2017. Hemangiosarcoma is a very common canine neoplasm of vascular endothelial origin. In the dog, the most frequent primary site for hemangiosarcoma is the spleen. Typically, canine hemangiosarcoma has a very aggressive biologic behavior with metastases, especially to lung and liver, occurring early in the course of the disease. In the majority of cases, death is related to acute hemoabdomen secondary to tumor rupture and/or metastases. Surgery remains the main method of treatment for most dogs with this type o cancer, but adjuvant chemotherapy is highly recommended due to the high risk of metastasis and the poor outcome associated with surgery alone. A retrospective study was performed to determine survival times and potential risk factors in dogs diagnosed with visceral hemangiosarcoma. Medical records of 42 dogs were reviewed. Age and baseline weight at the time of diagnosis, breed, sex, tumor location, clinical stage of the disease, treatment type and median survival time were evaluated. Twenty-three dogs were treated with surgery alone, while 19 dogs were treated with surgery and adjuvant chemotherapy. There was significant difference in survival between dogs treated with surgery alone (66 days) and with surgery followed by Doxorubicin (274 days). Dogs with splenic hemangiosarcoma had a longer median survival time than dogs with hemangiosarcoma of other sites, and with metastasis (274 versus 117 versus 38 days, respectively, p = 0,013). The overall median survival time for these 42 dogs was 237 days, and the one-year survival rate was estimated to be 26.32%. In conclusion, primary tumor location was associated with prognosis and the addition of doxorubicin after surgery did improve survival. In this study, clinical stage had no association with prognosis. Descriptors: hemangiosarcoma; dogs; splenectomy; doxorubicin; spleen

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1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA

O hemangiossarcoma (HSA), também conhecido como angiossarcoma, é uma

neoplasia agressiva que tem origem no endotélio vascular. Apesar desse tumor se

manifestar em qualquer espécie, os cães são os mais acometidos (PRIESTER; MCKAY,

1980; SPANGLER; CULBERSTON, 1992). O HSA representa aproximadamente 5 a

7% de todos os tumores primários malignos não cutâneos, de 12 a 21% de todas as

neoplasias mesenquimais e de 51 a 66% dos tumores esplênicos observados em cães

(PRIESTER; MCKAY, 1980; SPANGLER; CULBERSTON, 1992; HAMMER et al.,

1991).

Cães de meia idade a idosos são os mais descritos, porém há relatos em cães

com menos de 3 anos de idade. Labrador, Golden Retriever e Pastor Alemão são as

raças mais predispostas para o desenvolvimento do HSA. Alguns estudos mostram que

os machos são os mais afetados, porém essa predisposição sexual não é confirmada em

toda a literatura veterinária (KAHN et al., 2013; SZIVEK et al., 2013).

Embora a etiologia do HSA ainda não esteja completamente elucidada, existem

relatos em humanos que têm sido correlacionados com a exposição ao dióxido de tório,

arsênicos, cloreto de vinilo, e androgênios. Dois fatores de risco já são bem

estabelecidos na literatura oncológica médica: o linfedema crônico e o tratamento

prévio com radioterapia (WOODWARD et al., 1972; PENEL et al., 2008). Já em cães

de laboratório, o HSA cutâneo foi associado com a exposição à luz ultravioleta

(CLIFFORD et al., 2001; HARGIS et al., 1992).

Acredita-se que a inflamação, hipóxia e a angiogênese também contribuam para

a patogênese do HSA idiopático ou do HSA associado à exposição a agentes

genotóxicos (TAMBURINI et al., 2010). Sabe-se que a desregulação de vias

moleculares que controlam a angiogênese representa um fator importante na patogênese

do HSA. Por exemplo, estudos em humanos e cães demonstraram um aumento da

expressão do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), fator de crescimento de

fibroblasto básico e angiopoietina-1 em linhagens celulares e tecidos de HSA

(CLIFFORD et al., 2001; YAMAMOTO et al., 1999). Estudos em murinos, humanos e

cães revelaram que mutações em genes, tais como p53, PTEN, Ras, Tsc2 e Von Hippel-

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Lindau, estão implicadas na patogênese do HSA (THAMM et al., 2001; ONDA et al.,

1999).

Em cães, o sítio primário mais comum dessa neoplasia é o baço. O HSA ocorre

também em outras localizações como átrio direito, pele, subcutâneo e fígado. Pode

ainda ocorrer com menor frequência no pulmão, rim, cavidade oral, músculo, osso,

bexiga urinaria, ventrículo esquerdo, útero, língua, dígitos e retroperitônio (KAHN et

al., 2013).

Em geral o comportamento dessa neoplasia, principalmente quando encontrada

na forma visceral, é altamente agressivo, com rápido desenvolvimento de metástase. A

única exceção é o HSA de derme, sem qualquer evidência clinica ou histológica de

infiltração subdermal, no qual o potencial metastático é menor que 30% (SZIVEK et al.,

2013). Metástases ocorrem preferencialmente pela via hematógena ou por implantação

transabdominal (KAHN et al., 2013). Os órgãos mais atingidos pelo processo

metastático são o fígado, omento, mesentério e pulmões, no entanto metástases também

são vistas com menor frequência nos rins, miocárdio, peritônio, linfonodos, glândulas

adrenais, cérebro, intestinos e no diafragma (KAHN et al., 2013). O HSA é a neoplasia

com maiores chances de disseminação para o cérebro, principalmente quando os

pacientes apresentam metástases múltiplas ou pulmonares. Apesar da metástase cerebral

ocorrer preferivelmente pela via hematógena, também pode ocorrer pela via linfática

através da liberação de êmbolos tumorais (KAHN et al., 2013).

O HSA canino necessita de uma combinação de modalidades de tratamento que

inclui no mínimo uma terapia local seguida de terapia sistêmica devido ao alto potencial

metastático. O tratamento de eleição para o HSA primário é a ressecção cirúrgica

completa do tumor. No entanto, a cirurgia representa apenas um tratamento paliativo

(KAHN et al., 2013; TAMBURINI et al., 2010). Uma vez realizada a esplenectomia em

cães com diagnóstico de HSA esplênico, o tempo mediano de sobrevida (TMS) é baixo,

variando de 19 a 86 dias, sendo que menos de 16% dos cães sobrevivem 12 meses

(SPANGLER; CULBERSTON, 1992; SPANGLER; KASS, 1997; BROWN et al.,

1985; PRYMAK et al., 1988; WOOD et al., 1998; MOORE et al., 2017). Em um outro

estudo contendo 9 cães com o diagnóstico de HSA localizado em átrio direito tratados

com cirurgia como terapia única, o TMS foi de 4 meses (PLOYAR, 2013). Além da

cirurgia utilizada como modalidade para o tumor primário, a radioterapia está

começando a ser estudada para essa doença. Nolan et al., 2017, tratou 6 pacientes com

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radioterapia (dose única de 12 Gy) diagnosticados presuntivamente com HSA em átrio

direito com efusão pericárdica. O tratamento foi bem tolerado e a frequência de

pericardiocenteses diminuiu após o tratamento. O TMS foi 79 dias (NOLAN et al.,

2017). Além da excisão cirúrgica, deve-se associar algum tipo de terapia sistêmica,

como por exemplo a quimioterapia e/ou imunoterapia, com o intuito de aumentar a

sobrevida dos pacientes. Devido ao alto potencial metastático desse tipo de câncer, a

quimioterapia é indicada em todos os casos de HSA, com exceção do HSA de derme

que possui um baixo potencial metastático. Um estudo recente com 208 cães

diagnosticados com HSA esplênico mostrou que cães tratados com esplenectomia e

quimioterapia adjuvante apresentaram um TMS superior, porém modesto, em relação a

cães tratados somente com cirurgia (3.4 meses versus 1.6 meses) (WENDELBURG et

al., 2015).

A Doxorrubicina utilizada como agente único ou em combinação com outros

quimioterápicos é considerada a droga de eleição nesse tipo de câncer (HAMMER et

al., 1991; PAYNE et al, 2003). Apesar da combinação de quimioterápicos teoricamente

potencializar o efeito citotóxico das drogas de uma maneira aditiva ou mesmo

sinergística, diversos estudos com o HSA mostram que não existem grandes diferenças

estatísticas de sobrevida quando a Doxorrubicina é utilizada concomitantemente com

outras drogas ou de maneira isolada. Por exemplo, cães tratados com a Doxorrubicina

como agente único após a esplenectomia apresentaram um TMS de 123 dias, enquanto

que quando a Doxorrubicina foi combinada com outras drogas como no protocolo VAC

(Doxorrubicina + Ciclofosfamida + Vincristina) o TMS foi de 145 dias e com o

protocolo AC (Doxorrubicina + Ciclofosfamida) foi de 141 a 179 dias (VAIL et al.,

1995; HAMMER et al., 1991; SORENMO et al, 2004; PAYNE et al, 2003).

Outras combinações utilizadas como o protocolo VCM (Vincristina,

Ciclofosfamida e Metotrexato) também não melhoraram muito o prognóstico, tendo um

TMS de 164 dias (SORENMO et al, 2000). Finotello et al. (2015), de maneira

prospectiva comparou o uso de dois protocolos quimioterápicos adjuvantes em cães

com HSA: Doxorrubicina e Ciclofosfamida ou Doxorrubicina e Dacarbazina. Cães

tratados com a segunda combinação apresentaram taxas de sobrevida superiores aos

cães tratados com Doxorrubicina e Ciclofosfamida (>550 dias versus 142 dias),

representando até a atualidade o protocolo quimioterápico que atingiu uma taxa de

sobrevida mais longa.

25

Na tentativa de melhorar o TMS, a administração da Doxorrubicina na forma

encapsulada em lipossomas foi investigada e infelizmente também não resultou em

nenhum benefício significativo na taxa de sobrevida, tendo um TMS igual a 132 dias

(SORENMO et al., 2007). Assim como a Doxorrubicina, o agente quimioterápico

Ifosfamida também mostrou uma modesta atividade antitumoral no HSA canino,

apresentando um TMS de 149 dias (PAYNE et al, 2003; RASSNICK et al., 2000).

A ciclooxigenase-2 (COX-2) desempenha um papel na formação, no

crescimento, e na metástase de tumores e o uso de inibidores de COX-2 têm

demonstrado um benefício terapêutico em certas neoplasias caninas, inclusive no

HSA. Um estudo prospectivo com 21 cães avaliou o efeito do tratamento combinado de

Doxorrubicina com o inibidor seletivo da Cox-2, Deracoxib, após a esplenectomia. Essa

combinação foi bem tolerada com apenas toxicidades gastrointestinais e hematológicas

discretas. Um TMS de 150 dias foi observado nessa população estudada (KAHN et al.,

2013). Embora o estadiamento clínico não tenha representado diferença significativa na

sobrevida, os cães com estágio III (cães com metástase) de HSA apresentaram uma

sobrevida mediana de 149 dias, o que parece ser superior quando comparado com

animais com o mesmo estágio de doença em outros estudos (KAHN et al., 2013). Mais

estudos são necessários para avaliar o real benefício de inibidores de Cox-2 no

tratamento da HSA canino.

A quimioterapia metronômica (baixas doses de quimioterápicos com curtos

intervalos entre as administrações) também pode ser usada como uma alternativa para o

tratamento quimioterápico convencional (altas doses com longos intervalos entre as

administrações), levando a uma sobrevida equivalente ao tratamento com

Doxorrubicina em cães com HSA esplênico com estagio II da doença (LANA et al.,

2007). Nessa população de cães, o uso de baixas doses de quimioterápicos utilizando

uma combinação de Ciclofosfamida ou Etoposida junto com Piroxicam mostrou um

TMS de 178 dias (LANA et al., 2007). Wendelburg et al. (2015), mostrou um potencial

benefício do uso da quimioterapia metronômica após terapia prévia com quimioterapia

adjuvante convencional. Nesse contexto, cães tratados com quimioterapia metronômica

e convencional tiveram um TMS de 4.3 meses, enquanto que cães tratados somente com

quimioterapia adjuvante ou metronômica obtiveram um TMS de 3 meses e 3.4 meses,

respectivamente (WENDELBURG et al., 2015).

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Em casos em que a cirurgia não é possível de ser realizada devido ao tamanho,

localização e/ou presença de metástases, a quimioterapia pode ser utilizada como

terapia única com a tentativa de promover uma regressão tumoral e aumentar a

sobrevida. Cães tratados com o protocolo quimioterápico DAV (Dacarbazina,

Doxorrubicina e Vincristina) tiveram uma taxa de resposta tumoral de 47.4% com uma

duração média de 101 dias e TMS de 125 dias (DERVISIS et al., 2011). Apesar de

quase metade dos cães nessa população ter tido uma resposta parcial ou completa,

infelizmente o tempo de resposta foi curto (DERVISIS et al., 2011).

Além da quimioterapia convencional, a imunoterapia também tem sido

explorada e estudada em cães com HSA. O muramil tripeptídeo fosfatidiletanolamina

(MTP-PE) é um imunomodulador capaz de estimular a habilidade de macrófagos e

monócitos e de reconhecer e destruir células neoplásicas humanas e caninas por uma

variedade de mecanismos. Seu encapsulamento em lipossomo (L MTP-PE) aumenta a

endocitose e a captação tecidual de MTP-PE por monócitos e macrófagos e prolonga

sua meia vida na circulação. Em humanos e cães, L MTP-PE estimula a ação anti-

tumoral dos monócitos, bem como gera um aumento na concentração plasmática do

fator de necrose tumoral e de outras citocinas, de modo a promover também uma

atividade anti-metástatica em tumores altamente malignos, como o HSA. A associação

de esplenectomia, Doxorrubicina e Ciclofosfamida com L MTP-PE conseguiu aumentar

significativamente a sobrevida de cães com HSA, apresentando um TMS de 273 dias,

enquanto que o tratamento com a esplenectomia seguida do uso de quimioterapia sem a

adição de L MTP-PE teve um TMS de de 141 a 179 dias (VAIL et al., 1995; KAHN et

al., 2013; HAMMER et al., 1991; OGILVIE et al., 1996; SORENMO et al., 2004;

SORENMO et al., 1993; PAYNE et al., 2003; KIM et al., 2007; SORENMO et al.,

2007).

Pesquisas de vacinas MBV (vacina bacteriana mista) em combinação com a

quimioterapia também foram testadas em cães com HSA. O TMS de cães submetidos a

esplenectomia seguida da quimioterapia e associada a vacina foi de 117 dias, enquanto

que cães tratados somente com esplenectomia e vacina foi de 91 dias. Mais estudos são

necessários para avaliar a potencial contribuição da imunoterapia no HSA (VAIL et al.,

1995; BROWN et al, 1985).

27

De maneira geral o prognóstico para cães com HSA esplênico tratado apenas

com cirurgia é extremamente baixo, tendo um TMS que varia entre 19 a 86 dias

(SPANGLER; CULBERSTON, 1992; SPANGLER; KASS, 1997; BROWN et al.,

1985; PRYMAK et al., 1988; WOOD et al., 1998). Já cães tratados com cirurgia e

quimioterapia possuem um TMS maior, variando de 141 a 179 dias, porém ainda assim

a taxa de sobrevida de uma ano é menor que 10%. (KAHN et al., 2013; HAMMER et

al., 1991; OGILVIE et al., 1996; SORENMO et al., 2004; SORENMO et al., 1993;

PAYNE et al., 2003; KIM et al., 2007; SORENMO et al., 2007).

Até o presente momento, a terapia sistêmica que proporcionou o TMS mais

longo foi a utilização de esplenectomia seguida de quimioterapia convencional

adicionada a imunoterapia com L MTP-PE (VAIL et al., 1995) e o protocolo

quimioterápico utilizando a Doxorrubicina junto com Dacarbazina (FINOTELLO et al,

2015).

O HSA cardíaco, primário hepático e outros HSA viscerais possuem um

prognóstico desfavorável similar ao HSA esplênico (YAMAMOTO et al, 2013).

Apenas o HSA renal tem tido um resultado um pouco mais favorável em relação a

outros sítios primários de HSA, apresentando um TMS de 278 dias (LOCKE;

BARBER, 2006).

Um dos fatores prognósticos que tem sido mais correlacionado com a sobrevida

é o estágio clínico da doença – Quadro 1 (WOOD et al., 1998; HAMMER et al., 1991;

VAIL et al., 1995). Estudos mostram que cães com estágio I sobrevivem mais do que

cães com estágios II e III (WOOD et al., 1998; HAMMER et al., 1991; VAIL et al.,

1995). Outro fator prognóstico importante é a graduação histológica dos HSA viscerais.

Cães com HSA bem diferenciados aparentam ter sobrevidas mais longas quando

comparados com tumores pouco diferenciados ou de diferenciação intermediária

(OGILVIE et al., 1996). Além disso, um índice mitótico alto influenciou negativamente

o prognóstico (KIM et al., 2007; MOORE et al., 2017). Spangler et al. (1997), mostrou

que cães com massas solitárias no baço tem um prognóstico superior do que cães com

HSA múltiplas massas distribuídas por todo o parênquima do baço.

O objetivo deste estudo retrospectivo é expandir e atualizar as informações já

descritas na literatura, determinando a sobrevida dos pacientes e também os fatores

prognósticos de cães diagnosticados com HSA visceral tratados somente com cirurgia

28

ou com cirurgia e quimioterapia em dois grandes centros de oncologia veterinária de

São Paulo, o Provet e o Petcare.

29

2 MATERIAL E MÉTODO

Cães foram incluídos no estudo se tivessem o diagnóstico histopatológico de HSA

visceral em qualquer localização. Critérios de exclusão do estudo incluem o diagnóstico

histopatológico de HSA cutâneo (derme, subcutâneo e intramuscular). Foram incluídos

no estudo casos de HSA visceral do acervo dos Serviços de Oncologia do Provet e do

Hospital Veterinário Petcare Unidade Ibirapuera.

Informações coletadas incluem: nome do animal, local de atendimento, idade e

peso no momento do diagnóstico (> ou < que 15 kg) (SHERWOOD et al., 2016), sexo,

localização do tumor primário, estágio clínico da doença, data da cirurgia, exames

diagnósticos, protocolo quimioterápico utilizado (nome da droga, dose e número de

ciclos), data de progressão da doença e TMS.

Exames de estadiamento clínico no momento do diagnóstico de HSA incluíam

hemograma completo, a análise bioquímica sérica, exame de urina, radiografias

torácicas e ultrassonografia abdominal. O diagnóstico histopatológico foi obtido a partir

de biópsia excisional.

O estadiamento clínico no momento do diagnóstico foi determinado baseado no

Sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos da Organização Mundial da

Saúde (adaptado para o uso em animais domésticos) – Quadro 1.

O TMS foi definido a partir da data de cirurgia e a documentação da data de morte.

Para efeitos de cálculos de sobrevida, cães que tiveram morte relacionada com a

neoplasia foram considerados eventos concluídos, e os cães sem notícias de seguimento

foram censurados. Os resultados foram determinados através da utilização do método de

Kaplan-Meier. Foram utilizados os testes de log rank para análise univariada e regressão

de Cox para análise multivariada de fatores de risco potenciais. Um valor de p <0,05 foi

considerado estatisticamente significante. O software STATA 13.1 comercialmente

disponível para Mac (Stata Corp., Texas, EUA) foi utilizado para todos os cálculos

estatísticos.

30

3 RESULTADOS

3.1 Pacientes

Foram incluídos no estudo 42 casos de HSA visceral do acervo dos Serviços de

Oncologia do Provet e Hospital Veterinário Petcare Unidade Ibirapuera. As raças mais

acometidas nesse estudo foram: SRD (sem raça definida) (9), Labrador (6), Pit Bull (4),

Schnauzer (4), Golden Retriever (2), Pastor Alemão (2), Poodle (2), Rottweiler (2),

Beagle (2), Boxer (2), Lhasa Apso (1), Yorkshire (1), Bichon Frisé (1), West Highland

White Terrier (1), Fox Americano (1), Cocker Spaniel Inglês (1), Weimaraner (1) –

Figura 1. A idade mediana no momento do diagnóstico foi de 10,5 anos (3-15 anos) e o

peso mediano foi de 20 kg (6-43 kg). Catorze cães eram machos inteiros e 9 eram

machos castrados, enquanto que 2 eram fêmeas inteiras e 17 fêmeas castradas. Nem o

peso e nem o estado de castração tiveram influência estatística na sobrevida de cães

diagnosticados com HSA.

Figura 1. Raças mais acometidas de cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral.

3.2 Localização do tumor primário e estadiamento clínico no momento do

diagnóstico

O diagnóstico histopatológico de HSA foi obtido através de biópsia excisional

em todos os cães. Apesar do prognóstico desfavorável, os cães com metástase no

31

momento do diagnóstico também tiveram seus tumores primários cirurgicamente

removidos devido ruptura e hemorragia secundária.

Os órgãos primários mais acometidos nesse estudo foram: baço (34), fígado (3),

rim (2), intestino (1), bexiga (1) e linfonodo (1). O cão diagnosticado com HSA em

linfonodo foi classificado como tendo um tumor primário já que outras lesões não

foram detectadas por métodos de imagem, tais como exame abdominal

ultrassonográfico e radiografia torácica 3 projeções (CHAN et al., 2016). A localização

do tumor primário influenciou estatísticamente a sobrevida dos cães estudados. O HSA

esplênico (TMS = 274 dias, variação entre 160 a > 1075 dias) apresentou uma taxa de

sobrevida estatisticamente superior aos HSA localizados em outras regiões primárias

incluindo o fígado, rim, intestino, bexiga e linfonodo (TMS = 117 dias, variação entre 8

a > 622 dias) e também em relação a cães com metástase (TMS = 38 dias, variação 9 a

788 dias) (p = 0,013) – Figura 2.

Figura 2. Curvas de sobrevida (Kaplan-Meier) de cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral em diferentes sítios primários. Fígado (3), rim (2), intestino (1), vesicula urinária (1) e linfonodo (1) foram os órgãos primários acometidos além do baço.

A classificação do estadiamento de todos os cães foi feita de acordo com o

Sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos da Organização Mundial da

Saúde (adaptado para o uso em animais domésticos), mostrado no Quadro 1. Vinte e

32

nove cães foram classificados com estágio I (69%), 6 cães com estágio II (14,28%) e 7

com estágio III (16,6%). No momento do diagnóstico de HSA, 7 cães apresentavam

metástase para: pulmões (3), fígado (3), e mesentério (1). Um desses animais tinha mais

de um local metastático concomitante. Nesse estudo não houve diferença estatística na

sobrevida de cães com estágios menos avançados quando comparados com estádios

mais avançados (p = 0,506).

3.3 Terapia

Como parte da terapia, 23 cães foram tratados somente com cirurgia, enquanto

que 19 cães foram tratados com cirurgia e quimioterapia adjuvante. Catorze (73%) cães

foram tratados com Doxorrubicina como agente único e 2 (10,5%) cães foram tratados

com Ciclofosfamida como agente único. O protocolo quimioterápico dos 3 cães

restantes foi: Doxorrubicina e Cliclofosfamida (5,2%), Epirrubicina (5,2%) e

Carboplatina e Epirrubicina (5,2%). Os protocolos quimioterápicos utilizados estão

apresentados na Quadro 2.

Curvas de Kaplan-Meier foram criadas para os 23 cães tratados com cirurgia

como terapia única e cães tratados com cirurgia e Doxorrubicina adjuvante (14 cães de

um total de 19). Cães tratados com cirurgia e outros protocolos antineoplásicos foram

excluídos da análise (total de 5 cães). Houve diferença estatística na sobrevida de cães

tratados com Doxorrubicina em relação a cães que passaram somente pelo

procedimento cirúrgico (p = 0,042) – Figura 3. O TMS de cães tratados somente com

cirurgia foi de 66 dias (variação entre 7 a 1075 dias), enquanto que o TMS de cães

tratados com cirurgia e Doxorrubicina foi 274 dias (variação entre 202 a > 1944 dias).

33

Quadro 1. Sistema de estadiamento clinico de hemangiossarcoma canino de acordo com a Organização Mundial da Saúde.

34

Quadro 2. Protocolos quimioterápicos utilizados nos cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral.

Figura 3. Curva Kaplan-Meier de sobrevida de cães tratados somente com cirurgia e cães tratados com cirurgia e Doxorrubicina adjuvante.

35

3.4 Sobrevida global

No momento da análise dos dados, 27 cães estavam mortos (14 foram eutanasiados

e 13 tiveram morte natural) e 15 estavam vivos. A necropsia não foi feita em nenhum

dos cães, porém o diagnóstico presuntivo de HSA levando a morte foi baseado em

achados clínicos, exames laboratoriais e de imagem.

De um total de 42 cães analisados, 17 foram censurados. Treze foram censurados,

pois ainda estavam vivos no momento da análise e 4 devido à informações insuficientes

sobre o seguimento. O tempo mediano global de sobrevida de cães diagnosticados com

HSA visceral foi de 237 dias (variação entre 1 a > 1944 dias) – Figura 4. A taxa de

sobrevida de um ano foi estimada em 26.32%.

Figura 4. Curva Kaplan-Meier de sobrevida global de cães diagnosticados com hemangiossarcoma visceral.

36

4 DISCUSSÃO

O tratamento do HSA visceral continua representando um grande desafio na

medicina veterinária. Apesar dos mais diversos esforços, os avanços terapêuticos não

evoluíram muito ao longo dos últimos 20 anos provavelmente devido ao conhecimento

escasso sobre o comportamento biológico desse tumor (GARDNER et al., 2015). No

presente estudo, encontramos resultados semelhantes à literatura já descrita sobre o

HSA, mas também fornecemos informações adicionais sobre fatores prognósticos de

cães acometidos por essa neoplasia.

Sabe-se que estágios clínicos menos avançados influenciam positivamente o

prognóstico do HSA (WOOD et al., 1998; HAMMER et al., 1991; VAIL et al., 1995).

Diferentemente de controles históricos, nesse estudo o estadiamento clínico não teve

associação com o prognóstico e não influenciou o tempo de sobrevida. Uma possível

explicação para essa falta de associação pode ter sido a distribuição heterogênea em

cada grupo de estágio clínico, podendo assim ter afetado o intervalo de confiança. A

maioria dos cães foi categorizada como estágio I (85,29%; 29/42), em contrapartida

somente 14,2% (6/42) dos cães foram classificados com HSA estágio II e 16,6% (7/42)

como estágio III. Portanto, é muito difícil estabelecer conclusões definitivas sobre a

importância do estágio clínico do HSA neste estudo retrospectivo.

Atualmente já existe um embasamento científico bastante sólido sobre a localização

do HSA determinando de maneira previsível o comportamento biológico da doença. Por

exemplo, o HSA puramente de derme sem qualquer evidência clínica ou histológica de

infiltração subdermal possui um potencial metastático bastante baixo em relação aos

HSA de vísceras (SZIVEK et al, 2011). Dentre os HSA viscerais, o HSA primário de

rim está associado a taxas de sobrevida superiores com uma menor incidência de

hemoperitôneo e de metástase a distância no momento do diagnóstico em relação a

outros sítios primários de HSA, tais como o baço e átrio direito (LOCKE; BARBER,

2006). Em contrapartida, cães com HSA retro-peritoneal em aproximadamente 90% dos

casos possuem metástase a distância no momento do diagnóstico (LIPTAK et al., 2004).

Assim como a maior parte dos estudos, o baço foi o local mais afetado pelo HSA,

representando 80,9% dos casos (KAHN et al., 2013). Em relação a outras localizações,

37

o HSA esplênico (TMS = 274 dias) apresentou uma taxa de sobrevida estatisticamente

superior aos HSA localizados em outras regiões primárias incluindo o fígado, rim,

intestino, bexiga e linfonodo (TMS = 117 dias). Os mecanismos determinantes da

diferença de prognóstico entre os diferentes locais de HSA primário ainda não estão

completamente elucidados, porém uma explicação plausível para um prognóstico

melhor em cães com HSA esplênico seria o fato de tumores primários de baço ainda não

rompidos poderem ser removidos cirurgicamente com uma certa facilidade através da

esplenectomia evitando uma possível ruptura do órgão afetado com secundária

implantação de células neoplásicas na cavidade abdominal, além de apresentarem uma

baixa mortalidade peri-operatória (WENDELBURG et al., 2015; THAMM, 2013).

Assim como esperado, cães com metástase no momento do diagnóstico tiveram um

TMS baixo e igual a 38 dias, o que representa um valor bem inferior ao TMS de cães

diagnosticados somente com HSA primário. Devido a impossibilidade de ressecção

cirúrgica em animais com HSA metastático, muitos animais acabam morrendo de

hemorragia descontrolada das lesões metastáticas e também de distúrbios de

coagulação.

Nossos resultados de sobrevida foram semelhantes aos resultados da literatura

disponível sobre cães com HSA visceral. De acordo com a maior parte das publicações,

protocolos quimioterápicos contendo a Doxorrubicina normalmente aumentam a

sobrevida de cães com HSA esplênico em uma média de 3 a 9 meses (KAHN et al.,

2013; HAMMER et al., 1991; OGILVIE et al., 1996; SORENMO et al., 2004;

SORENMO et al., 1993; PAYNE et al., 2003; KIM et al., 2007; SORENMO et al.,

2007). A sobrevida global encontrada nesse estudo foi de 237 dias (aproximadamente 8

meses) . O TMS de cães tratados somente com cirurgia foi de 2 meses e o TMS de cães

tratados com Doxorrubicina adjuvante foi de 9 meses. Já que a quimioterapia

convencional adjuvante demonstra apenas um benefício modesto de sobrevida, novas

modalidades terapêuticas são necessárias para o tratamento desta doença. Wendelburg

et al. reportou que o TMS de cães tratados com quimioterapia convencional e

metronômica foi subjetivamente maior que o TMS de cães que receberam apenas

quimioterapia convencional ou metronômica isoladamente (WENDELBURG et al.,

2015). Em um outro estudo, o uso de quimioterapia metronômica somada à

quimioterapia de dose máxima tolerada foi associada com maior sobrevida e intervalo

livre de doença (FINOTELLO et al., 2017). De acordo com esses resultados, é razoável

38

acreditar que o uso da terapia metronômica pode desempenhar um papel na

desaceleração da progressão do HSA possivelmente devido ao seu efeito anti-

angiogênico e imunomodulador. Mais estudos são necessários para confirmar o real

benefício de utilizar a quimioterapia metronômica como terapia de manutenção após o

tratamento prévio com Doxorrubicina em cães diagnosticados com HSA visceral.

Existem especulações que cães pequenos são menos propensos ao diagnóstico de

HSA quando apresentam formações esplênicas e que quando são diagnosticados com

essa neoplasia podem apresentar resultados mais favoráveis de sobrevida do que cães de

grande porte (SHERWOOD et al., 2016). Bryan et al. (2013), analisou 23 cães com

menos de 15 kg com HSA e não obteve nenhuma diferença estatística de sobrevida em

relação aos cães com peso maior que 15 kg. No presente estudo, 30.9% (13/42) dos cães

apresentavam peso inferior a 15 kg e assim como verificado por Bryan et al. (2013), o

prognóstico desses cães pequenos não foi diferente e nem superior ao de cães grandes.

Mais estudos contendo um número maior de cães pesando menos de 15 kg são

necessários para verificar se realmente não existe uma diferença na agressividade do

HSA nesses animais.

Alguns trabalhos atuais sugerem que a remoção de hormônios gonadais deixa

cães mais vulneráveis a ocorrência de alguns tipos de câncer, incluindo o HSA (HART

et al., 2014). Um estudo de HSA cardíaco mostrou que a incidência desse tipo de câncer

é 4 vezes maior em fêmeas castradas do que em fêmeas inteiras (WARE; HOPPER,

1999). Um outro estudo com HSA esplênico mostrou que fêmeas castradas tiveram 2

vezes mais chances de desenvolver o HSA do que fêmeas inteiras (PRYMAK et al.,

1985). Fizemos uma análise da correlação do estado de castração com a sobrevida para

determinar se cães inteiros tiveram um efeito protetor hormonal favorecendo

positivamente o prognóstico da doença. Apesar de 38% (16/42) dos cães estudados

serem inteiros, houve uma desigualdade na distribuição entre machos e fêmeas, já que

somente 2/19 fêmeas eram inteiras enquanto que 14/23 eram machos inteiros. Essa

distribuição desigual acabou prejudicando a análise estatística de maneira que não foi

possível encontrar uma associação entre sobrevida e o estado de castração nessa

população de cães.

O nosso estudo sofre de limitações inerentes a estudos retrospectivos, incluindo

o pequeno número de casos diagnosticados com estágios II e III de HSA em

39

comparação com o estágio I, o uso de terapias heterogêneas, além da falta de realização

de necropsia em todos os casos levando ao diagnóstico presuntivo de HSA e assumindo

que comorbidades não tenham tido relação com a causa de morte desses animais.

40

5 CONCLUSÃO

Os dados relatados neste trabalho demonstram que o prognóstico de cães com

HSA visceral tratados somente com cirurgia ou com terapia padrão ouro, incluindo

remoção cirúrgica agressiva do tumor primário e quimioterapia adjuvante, permanece

pobre com a maioria dos cães sucumbindo à doença dentro de um curto período de

tempo. A localização do tumor primário teve associação com prognóstico e cães com

HSA esplênico tiveram um desfecho discretamente melhor do que cães com HSA

localizados em outros sítios primários. Neste estudo retrospectivo, a adição de

Doxorrubicina após a cirurgia beneficiou de maneira modesta a sobrevida dos pacientes.

Desta maneira, novas abordagens terapêuticas, incluindo o uso de quimioterapia

metronômica como terapia de manutenção após o uso de quimioterapia convencional,

devem ser avaliadas. Uma melhor compreensão sobre a biologia do HSA canino

provavelmente ajudará no avanço e desenvolvimento de terapias.

Artigo submetido para o Canadian Veterinary Journal (número 2017 - 0196).

41

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Capítulo 3

AVALIAÇÃO DO PADRÃO DE METILAÇÃO GLOBAL DO DNA E TAXA DE PROLIFERAÇÃO CELULAR NO HEMANGIOSSARCOMA CANINO ESPLÊNICO E DE

DERME

49

RESUMO

Batschinski K. Avaliação do padrão de metilação global do DNA e taxa de proliferação celular no hemangiossarcoma canino esplênico e de derme [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017.

O hemangiossarcoma é um tumor de origem endotelial que frequentemente é diagnosticado em cães. O baço é o órgão mais afetado por essa neoplasia, no entanto outras regiões como a pele também podem desenvolver a doença. O hemangiossarcoma esplênico está associado com um comportamento bastante agressivo, enquanto que o hemangiossarcoma de derme normalmente pode ser curado com cirurgia. As aberrações epigenéticas, incluindo a hipometliação e a hipermetilação do DNA, estão envolvidas com a iniciação e progressão do câncer. A avaliação do padrão de metilação global do DNA ainda não foi investigada no hemangiossarcoma canino. O objetivo desse estudo é determinar a metilação global do DNA através da detecção por imunoistoquímica de 5-metilcitidina e também avaliar a taxa de proliferação celular através da detecção por imunoistoquímica de Ki-67 em amostras de hemangiossarcomas esplênico e de derme. Um total de 8 amostras de hemangiossarcoma esplênico e 8 de hemangiossarcoma de derme, sem infiltração subcutânea, foram analisadas. Para a avaliação da metilação global de DNA e do índice de proliferação celular foi realizada a técnica de imunoistoquímica anti-5-metilcitidina e anti-Ki-67. As marcações nucleares obtidas pela imunoistoquímica anti-5-metilcitidina foram classificadas em forte, fraca e negativa, enquanto que as marcações obtidas pela imunoistoquímica anti-Ki-67 foram classificadas em positiva e negativa. Foi realizada uma contagem mínima de 1000 células por lâmina em no mínimo dez campos de aumento 200X. Foi encontrado um padrão de hipometilação global nos hemangiossarcomas de baço e derme. As células pouco ou não metiladas no hemangiossarcoma dérmico tiveram associação com um maior índice de proliferação. Essas alterações epigenéticas encontradas nas amostras de hemangiossarcoma necessitam de maiores investigações, podendo servir futuramente como novos alvos tumorais e contribuindo para o desenvolvimento de novas terapias.

Descritores: baço; pele; metilação; cães; hemangiossarcoma

50

ABSTRACT

Batschinski K. Evaluation of the global DNA methylation and cell proliferation index in splenic and dermal canine hemangiosarcoma [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2017.

Hemangiosarcoma is a tumor of vascular endotelial origin that is frequently diagnosed in dogs. The most common site for this neoplasia is the spleen, however other sites including the skin may develop this disease. Splenic hemangiosarcoma has a very aggressive behavior, while dermal hemangiosarcoma may be cured with surgery. Epigenetic aberrations, including hypomethylation and hypermethylation of DNA, are involved in the initiation and progression of cancer. Evaluation of the global DNA methylation has not been investigated yet in canine hemangiosarcoma. The aim of this study is to determine the global DNA methylation using immunohistochemistry detection of 5-methylcytidine and also to evaluate tumor cell proliferation using immunohistochemistry detection of Ki-67 in splenic and dermal canine hemangiosarcoma samples. A total of 8 splenic and 8 dermal (without subdermal invasion) hemangiosarcoma samples were analyzed. For the evaluation of global DNA methylation and the cell proliferation index, the anti-5-methylcytidine and anti-Ki-67 immunohistochemistry technique was used. The anti-5-methylcytidine immunostained nuclei were classified as strong, weak and negative pattern, whereas markers obtained by immunohistochemistry were classified as strong, weak and negative, whereas the anti-Ki-67 immunostained nuclei were classified as positive and negative. A minimum count of a 1000 cells per slide was performed in at least ten 200X magnification fields. A global hypomethylation pattern was noted in spleen and dermal hemangiosarcoma. The hypomethylated cells or cells with no methylation in dermal hemangiosarcomas were correlated with a high proliferation index. These epigenetic alterations encountered in hemangiosarcoma samples require further investigation and may be used in the future as a new tumor target, therefore contributing for the development of new therapies.

Descriptors: spleen; skin; methylation; dogs; hemangiosarcoma

51


O HSA é um tumor de origem endotelial que pode ocorrer em diversas

localizações nos cães, como por exemplo no baço, fígado, coração, tecidos subcutâneos

e pele (PRIESTER; MCKAY, 1980; SPANGLER; CULBERSTON, 1992). O HSA

visceral exibe um comportamento bastante agressivo com metástases ocorrendo no

início do curso da doença (Quadro 3). Pulmões, órgãos abdominais e sistema nervoso

central representam os sítios mais frequentes para o desenvolvimento de metástases

(KAHN et al., 2013). Mesmo que os cães sejam tratados com cirurgia agressiva e

quimioterapia adjuvante, o prognóstico ainda assim é ruim com menos de 16% dos cães

sobrevivendo 1 ano após o diagnóstico – Figura 5 (SPANGLER; CULBERSTON,

1992; SPANGLER; KASS, 1997; BROWN et al., 1985; PRYMAK et al., 1988; WOOD

et al., 1998; MOORE et al., 2017). Os cães das raças Pastor Alemão, Golden Retriever e

Labrador Retriever são frequentemente acometidos (KAHN et al., 2013; SZIVEK et al.,

2013). A etiologia ainda é desconhecida, porém novos estudos evidenciam que fatores

de crescimento que favorecem a angiogênese, tais como o VEGF (fator de crescimento

vascular endotelial), as angiopoietinas 1 e 2, fator de crescimento de fibroblasto básico

(bFGF), e também mutações em genes supressores tumorais como o PTEN tenham

influência no desenvolvimento do HSA visceral (TAMBURINI et al., 2010;

CLIFFORD et al., 2001; YAMAMOTO et al., 1999; DICKERSON et al., 2005).

O HSA exclusivamente de derme, sem invasão para tecidos subcutâneos, possui

um comportamento biológico bem menos agressivo do que os HSAs de outras

localizações (SZIVEK et al., 2013). O índice metastático é baixo, aproximadamente

30%, sendo que a maior parte dos pacientes pode apresentar um tempo longo (> de 2

anos) de sobrevida após tratamento cirúrgico (SZIVEK et al., 2013; WARD et al.,

1994). Whippets e Pit Bulls são as raças mais acometidas pelo HSA de derme que afeta

regiões pouco pigmentadas e alopécicas normalmente expostas à radiação ultravioleta

(Figura 6) (SZIVEK et al., 2013). Apesar do HSA de derme estar associado com um

longo tempo de sobrevida nos cães, existem alguns fatores que influenciam

negativamente o prognóstico. Lesões localizadas no abdome ventral (TMS = 1085 dias)

estão associadas com maior tempo de sobrevida do que lesões presentes em regiões não

52

expostas à luz ultravioleta (TMS = 539 dias) (SZIVEK et al., 2013). Somando-se a isso,

cães com HSA de pele mostrando dermatite actínica em tecidos vizinhos, tiveram um

prognóstico mais favorável (TMS = 1549 dias) quando comparados com cães sem essas

alterações (TMS = 545 dias) (SZIVEK et al., 2013). Cães HSA de pele com invasão em

tecidos subcutâneos possuem um risco relativo duas vezes maior de desenvolver

metástases do que cães com lesões exclusivamente dérmicas (SZIVEK et al., 2013;

WARD et al., 1994).

Quadro 3. Tabela contendo as principais diferenças entre o hemangiossarcoma esplênico e dérmico em cães.

Figura 5. A- Aspecto macroscópico de hemangiossarcoma esplênico não rompido. B - Presença de sangramento intra-abdominal durante procedimento cirúrgico para retirada de hemangiossarcoma esplênico. C - Aspecto macroscópico de hemangiossarcoma esplênico rompido. Fonte: Imagens cedidas por Ms Rodrigo Ubukata.

53

Figura 6. A e B - Aspecto macroscópico de hemangiossarcoma cutâneo em cão, sem invasão para tecidos subcutâneo, localizado em região alopécica e com pouca pigmentação.

Existem diversos fatores prognósticos associados com o HSA: localização do

tumor primário, presença de formação solitária ou múltiplas formações no baço,

estadiamento clínico, graduação histológica e índice mitótico (WOOD et al., 1998;

HAMMER et al., 1991; VAIL et al., 1995; OGILVIE et al., 1996; KIM et al., 2007;

MOORE et al., 2017). Somente dois estudos mencionam o índice mitótico como tendo

uma correlação com o prognóstico (KIM et al., 2007; MOORE et al, 2017). Moore et al.

(2017) reportou que a sobrevida de cães com índice mitótico baixo (< 11 mitoses/ 10

campos de grande aumento) foi estatisticamente mais longa do que cães com índices

mitóticos mais altos (≥11 mitoses/ 10 campos de grande aumento). Cães com uma baixa

taxa de proliferação tiveram um TMS de 292 dias, sendo que a taxa de sobrevida de um

ano foi de 42% (MOORE et al, 2017). A expressão da proteína nuclear Ki-67 é um

indicador da porcentagem de células que está dentro do ciclo celular (ABADIE et al.,

1999). Em diversos tumores o estabelecimento da fração de crescimento celular através

da marcação por Ki-67 já foi correlacionado com o prognóstico, sendo que altas taxas

de proliferação costumam ter uma forte correlação com o alto grau de uma neoplasia e

menor tempo de sobrevida (MAGLENNON et al., 2008; FONSECA-ALVES et al.,

2015). Até o presente momento não existem estudos publicados na literatura veterinária

analisando o uso do Ki-67 para a determinação da taxa de proliferação celular em HSAs

viscerais e de pele.

Nos últimos anos, a epigenética tem ganhado ênfase nos estudos relacionados à

diversos tipos de cânceres humanos e também mais recentemente em animais

(MORIMOTO et al., 2016; SEIFERT et al., 2007; TANNAPFEL et al., 2001;

HERMAN et al., 1998). A epigenética pode ser descrita como o conjunto de

54

mecanismos moleculares herdáveis com capacidade de regular a expressão gênica na

ausência de qualquer alteração na sequência do DNA (YAN et al., 2010). Estes

mecanismos, tais como a metilação do DNA, modificações pós-traducionais de histonas

e ação de RNAs não-codificantes estão associados à regulação da expressão gênica

(YAN et al., 2010). Quando estes mecanismos encontram-se em seu estado aberrante,

pode ocorrer o desenvolvimento e a manutenção de um fenótipo neoplásico, já que

essas alterações estão envolvidas com a iniciação e progressão do câncer (KRITENSEN

et al., 2009). A metilação do DNA é o componente epigenético mais estudado até hoje

(KRITENSEN et al., 2009). Sabe-se que a hipermetilação das ilhas CpG pode silenciar

genes supressores tumorais, enquanto que a hipometilação global do DNA pode resultar

na superexpressão de fatores de crescimento ou oncogenes, alteração nos mecanismos

de reparo do DNA e perda da estabilidade genômica favorecendo as mutações

(HERNANDEZ-BLAZQUEZ et al., 2000; KRITENSEN et al., 2009).

O uso de anticorpos específicos para anti-5-metilcitidina (5-Metcit) permite a

avaliar o padrão de metilação global do DNA em tecidos tumorais como demonstrado

por Morimoto et al. (2016) em amostras de mastocitoma cutâneo em cães. Neste estudo,

verificou-se que mastocitomas de alto grau e com pior prognóstico apresentavam um

padrão de hipometilação global do DNA em comparação com mastocitomas mais

diferenciados (MORIMOTO et al., 2016). O padrão de metilação global do DNA em

tecidos de HSA canino ainda não foi investigado ou publicado na literatura veterinária.

O objetivo do presente estudo é determinar a metilação global do DNA através

da detecção por imunoistoquímica de 5-Metcit e também avaliar a taxa de proliferação

celular através da detecção por imunoistoquímica de Ki-67 em amostras de HSAs

esplênico e de derme.

55

2 MATERIAL E MÉTODO 2.1 Amostras de tecido tumoral

Um total de 16 amostras, fixadas em formalina a 10%, foram obtidas a partir do

Laboratório CVAP (Centro Veterinário de Anatomia Patológica) e analisadas por dois

patologistas. Oito amostras foram diagnosticadas como HSA esplênico e o restante

como HSA de derme, sem infiltração subcutânea.

Resumidamente, o material dos blocos histológicos foi cortado em cortes com 5

µm de espessura, montados em lâmina de vidro e submetidos à coloração de

hematoxilina e eosina (HE) para, então, serem avaliados.

Como os blocos histológicos foram enviados de diversas clínicas veterinárias

para o Laboratório CVAP, não foi possível obter o histórico clínico, incluindo o tempo

de sobrevida dos cães.

2.2 Marcação imunoistoquímica

As amostras conservadas em parafina foram cortadas com micrótomo em

fragmentos de espessura 5 µm e montadas em lâminas silanizadas para posteriormente

serem submetidas ao estudo de imunorreatividade por meio da técnica de

imunoistoquímica.

Para detecção do antígeno objeto deste estudo, foi utilizado como anticorpo

primário, o anticorpo monoclonal de camundongo anti-5metilcitidina – 5-Metcit (mouse

monoclonal [33D3] to-Methyl Cytidine – ChIP grade – abcam ab 10805) na diluição de

1:150. A citosina é uma nucleobase enaquanto a citidina é uma molécula formada

quando uma citosina se liga a um anel de ribose, tornando-se um nucleosídeo. O

anticorpo 5-Metcit é capaz de reconhecer as bases modificadas de citosina em 5-

metilcitidina, segundo o fabricante.

Lâminas com cortes das preparações com 5 µm de espessura foram

desparafinizadas em xilol, gradualmente hidratadas em etanos e imersas em tampão

fosfato 0.01 M, pH 7.4 com Tween 20 a 0.05% (PBST) para então, serem submetidas à

recuperação antigênica com tampão citrato 10 µM pH 6.0 em forno micro-ondas por 3

ciclos de 5 minutos à potência máxima. Após resfriadas a temperatura ambiente, as

56

amostras foram submetidas ao bloqueio de peroxidases endógenas com peróxido de

hidrogênio a 3% em água destilada por 60 minutos a temperatura ambiente e imersas

em PBST. Subsequentemente as lâminas foram incubadas com soro de bloqueio TNB®

(tampão de bloqueio Tris-NaCl CSH Protocols™) em câmara úmida por 60 minutos a

temperatura ambiente. Após o período de bloqueio as lâminas foram incubadas com o

anticorpo primário a temperatura de 4°C em câmara úmida por uma noite. Ao término

do período de incubação, as preparações forma imersas em PBST, submetidas ao

complexo polímero-anticorpo secundário utilizando-se o Kit LSAB+ System-HRP

(K0679 Universal DAKO LSAB®+ Kit, Peroxidase – DakoCytomation) utilizando-se

do reagente Biotynilated Link (imunoglobulinas anti-coelho, anti-camundongo e anti-

cabra) por 30 minutos e então, novamente imersas em PBST, submetido ao reagente

Streptavidin-HRP (estreptavidina conjugada com peroxidase). Após a ação do anticorpo

secundário por 30 minutos, as lâminas foram imersas em PBST e submetidas à

revelação com uso de diaminobenzidina (K3466 Liquid DAB Large Volume Substrate

Chromogen System 3’3 diaminobenzidine, DakoCytomation), contracoradas com

Hematoxilina de Mayer, desidratadas por sucessivas passagens em álcoois

progressivamente mais concentrados e xilol e finalmente montadas com Permount® e

lamínula. Como controle positivo foram utilizados cortes histológicos de baço e pele

sem neoplasias ou outras alterações que apresentaram marcação positiva durante a

padronização dos anticorpos em estudo e como controle negativo foram utilizados

fragmentos histológicos positivos para os quais foi omitido o anticorpo primário.

Para a detecção de Ki-67, inicialmente procedeu-se a desparafinização dos

cortes histológicos, realizando–se dois banhos de xilol, por 10 minutos cada e

reidratação com três banhos em álcool absoluto, por 3 minutos cada, seguidos de mais

dois banhos em álcool graduado (95% e 85%), por 3 minutos cada e dois banhos em

água deionizada. A recuperação antigênica foi realizada com citrato, pH 6,0, em panela

Pascal. Após o resfriamento em temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas em

água deionizada. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado por 10 minutos em

solução de peróxido de hidrogênio 3%. As lâminas foram lavadas em água deionizada e

realizou-se dois banhos, de 5 minutos cada, em solução Tris tamponada com cloreto de

sódio e Tween (pH 7,5). Os cortes foram então incubados em câmara úmida, overnight,

a 4°C, com o anticorpo primário anti-Ki-67, clone MIB-1, M&240 (Dako, 1:50). Após

incubação, realizou-se mais dois banhos, de 5 minutos cada, em solução tamponada Tris

57

com cloreto de sódio e Tween (pH 7,5) e os cortes foram lavados em água deionizada e

posteriormente corados com Hematoxilina de Harris por 2 minutos, seguida de lavagem

em água corrente. Em seguida realizou-se a desidratação em banhos de álcool graduado

(70%, 95% e álcool absoluto duas vezes, com 5 minutos cada), seguida pela

diafanização com solução de álcool misturado ao xilol e dois banhos de xilol por 10

minutos, seguido de montagem com resina sintética e lamínula. Utilizou-se como

controle positivo para Ki-67 as células basais da epiderme e as células germinativas dos

folículos pilosos em divisão. Para o controle negativo do Ki-67, realizou-se a omissão

do anticorpo primário, usando o PBS ao invés do anticorpo de interesse durante o

processamento da imunoistoquímica.

2.3 Aquisição de imagem e contagem da marcação imunoistoquímica

Ao fim do estudo imunoistoquímico os cortes histológicos foram avaliados em

microscópio NIKON® em campos 100, 200 e 400 aumentos. Dez campos de aumento

200X de cada lâmina foram aleatoriamente selecionados e suas imagens registradas por

meio de software de aquisição de imagem Image-Pro Plus versão 4.5.0.29® (Media

Cybernectics™, Inc.). Na avaliação da expressão de 5-Metcit, as imagens obtidas

foram submetidas à contagem manual de células não marcadas, marcadas fracamente e

marcação forte, totalizando-se uma contagem mínima de 1000 células por lâmina. Já

para a avaliação dos índices de proliferação celular pelo Ki-67, as imagens foram

submetidas à contagem manual de células positivas ou negativas para a marcação,

totalizando-se uma contagem mínima de 1000 células por lâmina.

As células tumorais foram consideradas positivas para imunorreatividade de 5-

Metcit quando apresentaram marcação nuclear em tom marrom ou dourado, de

intensidade fraca a forte. Uma vez que não há padronização para a marcação de 5-

Metcit em HSAs caninos e tendo em vista a escassa literatura médica e veterinária a este

respeito, os percentuais de marcação negativa, fraca e forte de cada amostra forma

considerados para a análise estatística.

2.4 Análise estatística

Para a análise estatística entre os grupos foi feita avaliação dos dados quanto a

sua normalidade e variâncias para a escolha adequada do teste a ser realizado. Para

58

distribuição normal e variâncias iguais foi aplicado o teste paramétrico ANOVA (para

comparação entre 3 ou mais grupos – com pós-teste de Tukey-Kramer) ou t-Student

(para comparação entre 2 grupos), e quando não paramétrico o teste de Kruskal Wallis

ou U-MannWhitney. Para a correlação entre grupos, foi realizado o teste de Pearson. Os

dados foram analisados através do programa estatístico GraphPad Prism®, sendo

consideradas diferenças significativas quando p<0,05.

59

3 RESULTADOS

3.1 Avaliação da metilação global de DNA

Para a avaliação da metilação global de DNA foi realizada a técnica de

imunoistoquímica anti-5-metilcitidina em HSA esplênico e de derme de cães, onde

foram avaliadas 8 amostras de baço e 8 de derme. As marcações obtidas pela

imunoistoquímica foram classificadas em forte, fraca e negativa (Figura 7). Também foi

feita a avaliação de possível existência de diferença entre essa marcação para o HSA

esplênico e de pele, uma vez que o esplênico possui um comportamento muito mais

agressivo e metastático que o cutâneo.

Quando realizada a avaliação da metilação de DNA através de imunoistoquímica

foi possível observar diferença estatística significativa entre as marcações encontradas

no HSA esplênico (p<0,0001 para as comparações entre as marcações forte x fraca,

forte x negativa e fraca x negativa). O mesmo padrão foi observado para o HSA

cutâneo, porém não havendo diferença significativa entre a marcação fraca e negativa

(p≥0,05 para a comparação entre a marcação fraca x negativa; p<0,0001 para as

comparações entre as marcações forte x fraca e forte x negativa). Além disso, não se

observou diferença estatística significativa na comparação entre as mesmas marcações

no HSA esplênico e cutâneo (p≥0,05 para as marcações entre baço e pele para cada

intensidade de marcação – forte, fraca e negativa) (Figura 8 e Quadro 4). Assim, pode-

se inferir que a metilação do DNA de HSA esplênico e cutâneo é semelhante, tanto para

a marcação forte quanto fraca, existindo um predomínio de marcação fraca e negativa

nas amostras analisadas.

60

Figura 7: Amostras de hemangiossarcoma submetidas à marcação imunoistoquímica com anticorpo anti-5-metilcitidina. Marcações forte (A), fraca (B) e negativa (C) evidenciadas por setas em amostras de hemangiossarcoma canino esplênico. Marcações forte (D), fraca (E) e negativa (F) evidenciadas por setas em amostras de hemangiossarcoma canino de derme.

61

0

10

20

30

40

50

60

70

80

FORTE FRACO NEGATIVO

Núm

erodecélulas

MetilaçãodeDNAemHemangiossarcomaEsplênicoedeDermedeCães

Baço

Pele

aa

bb

c bc

Figura 8: Avaliação da metilação de DNA em hemangiossarcoma esplênico e cutâneo de cães. Marcações apresentadas através da avaliação de imunoistoquímica, sendo consideradas forte, fraca e negativa. Letras iguais indicam sem diferença estatística significativa (p≥0,05) e letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,0001).

Quadro 4: Médias (em porcentagem %) ± desvio padrão das avaliações da metilação do DNA de hemangiossarcoma esplênico e cutâneo de cães.

Tecido Marcação

Forte

Marcação

Fraca

Marcação

Negativa

Baço 34,74 ± 9,90 46,61 ± 10,27 59,11 ± 14,51

Pele 25,85 ± 11,31 53,25 ± 9,92 61,58 ± 10,19

3.2 Índice de proliferação celular

Para a avaliação do índice de proliferação celular foi realizada a técnica de

imunoistoquímica anti-Ki67 em HSA esplênico e cutâneo de cães, onde foram avaliadas

8 amostras de baço e 8 de pele. As marcações obtidas pela imunoistoquímica foram

classificadas em positiva e negativa (Figura 9).

62

Figura 9: Amostras de hemangiossarcoma submetidas à marcação imunoistoquímica com anticorpo anti-Ki-67. A- Marcações positivas evidenciadas por setas em amostras de hemangiossarcoma canino esplênico. B - Marcações positivas evidenciadas por setas em amostras de hemangiossarcoma canino de derme.

Em relação ao índice de proliferação do baço, não se observou diferença

estatística significativa quando comparadas as células positivas e as células negativas

para a marcação anti-Ki67 (p = 0,6426). O mesmo pôde ser observado em relação à

pele, onde a comparação entre os mesmos parâmetros também não apresentou diferença

significativa (p>0,10). Ao comparar os mesmos parâmetros (positiva no baço x positiva

na pele; negativa no baço x negativa na pele) entre as células do baço e as células da

pele, também não foi possível observar diferenças estatística significantes (p>0,10)

(Figura 10 e Quadro 5). Assim, pode-se inferir que a proliferação celular de células de

HSA esplênico e cutâneo é semelhante, não ocorrendo distinção entre as células

positivas e negativas para ambos os HSAs.

Figura 10: Índice de proliferação celular (células positivas e negativas) para marcação com anticorpo anti-Ki-67 em hemangiossarcoma esplênico e cutâneo. Não foram observadas diferenças estatísticas significantes.

0

10

20

30

40

50

60

70

POSITIVO NEGATIVO

%decélulas

ÍndicedeProliferaçãoCelular

BAÇO

PELE

63

Quadro 5: Médias (em porcentagem %) ± desvio padrão das avaliações da marcação anti-Ki-67 de hemangiossarcoma esplênico e cutâneo de cães.

Tecido Marcação

Positiva

Marcação

Negativa

Baço 47,69 ± 7,25 51,68 ± 7,25

Pele 51,68 ± 9,92 48,32 ± 9,92

3.3 Análise da correlação de Pearson

Para a avaliação do coeficiente de correlação (r) de Pearson entre as marcações

positivas do HSA no baço e também na pele foi feita a comparação entre a marcação

para anti-5-metilcitidina e a marcação para o Ki-67. A correlação de Pearson avalia a

relação linear entre duas variáveis contínuas (MUKAKA, 2012). Uma relação é linear

quando a mudança em uma variável é associada a uma mudança proporcional na outra

variável (MUKAKA, 2012). Expostos abaixo estão os dados de correlação de Pearson

(Quadro 6).

Quadro 6: Tabela mostrando índice de correlação de Pearson. Coeficiente (r) de correlação mede o grau pelo qual duas variáveis tendem a mudar juntas. O coeficiente descreve a força e a direção da relação.

64

Em relação às marcações encontradas no baço, o coeficiente de correlação de

Pearson foi r = -0,058. Isso indica que a relação das marcações para 5-Met e para Ki-67

é inversamente proporcional, isto é, quando as médias encontradas em uma marcação

aumentam, as médias encontradas na outra marcação diminuem proporcionalmente. No

entanto, por r estar muito próximo de 0 (zero), a relação entre essas marcações no baço

pode ser considerada aleatória ou quase inexistente (Figura 11). Desse modo, pode-se

inferir que não existe uma correlação consistente entre as marcações para 5-Met e Ki-67

no HSA esplênico.

Figura 11: Correlação de Pearson para células com marcação positiva para os anticorpos anti-metilcitidina e anti-Ki67 em hemangiossarcoma esplênico. Não foram observadas diferenças estatísticas significantes (p = 0,611).

A mesma relação foi encontrada quando feita a correlação de Pearson para as

mesmas marcações na pele, apresentando r = - 0,392. No entanto, a relação entre essas

marcações na pele é considerada mais consistente, uma vez que está entre 0 e -1, e não

se encontra tão próxima a zero (Figura 12). Dessa maneira, é possível inferir que

quando uma das marcações aumenta, como por exemplo, para Ki-67 (como observado

na figura 12) a outra marcação diminui proporcionalmente, como ocorre com a anti-5-

metilcitidina quando observada na figura 12.

65

Figura 12: Correlação de Pearson para células com marcação positiva para os anticorpos anti-metilcitidina e anti-Ki67 em hemangiossarcoma cutâneo. Diferença estatística significante de p = 0,0008.

66

4 DISCUSSÃO

A metilação do DNA é essencial para o desenvolvimento e manutenção da

homeostase dos seres vivos (YANG et al., 2013). Diversos estudos na oncologia

humana mostraram que tumores primários frequentemente apresentam-se hipometilados

(YANG et al., 2013). Um dos objetivos do nosso estudo foi determinar o padrão de

metilação global do DNA dos HSAs esplênicos e de derme em cães, já que isso nunca

foi investigado nesse tipo tumoral. Além disso, como Hernandez-Blazquez et al. (2000)

e Morimoto et al. (2016) mostraram que tumores mais agressivos possuem baixos níveis

de metilação global do DNA em relação a tumores mais diferenciados, também foi

investigada a possibilidade dos HSAs de baço e derme terem padrões de metilação

diferentes, já que possuem comportamentos bastante distintos.

A maior parte das amostras de HSA, independente da localização, apresentou

uma hipometilação global do DNA ou teve um padrão negativo para a marcação por 5-

Metcit. Apesar de não termos tido acesso aos prontuários clínicos dos cães envolvidos

no estudo, em nenhuma das amostras de pele analisadas foram encontradas dermatites

actinícas nos tecidos vizinhos, alteração que está associada com um prognóstico

favorável (SZIVEK et al., 2013). Desta maneira, pode ser que os tumores de pele

analisados tenham tido um comportamento biológico mais agressivo do que os típicos

HSAs dérmicos relatados na literatura e por esse motivo não apresentaram maior

metilação do que os HSAs esplênicos. São necessários mais estudos contendo um

número maior de animais, cujo histórico e prontuário sejam conhecidos, para determinar

realmente se existe ou não diferença no padrão de metilação global dos HSAs de derme

e de baço.

A média do desvio padrão da avaliação da metilação global do DNA nas

amostras de HSA esplênico e de derme classificadas como marcação negativa para 5-

Metcit foi de 59,11% (+/- 14,51) e 61,58% (+/- 10,19), respectivamente. Especula-se

que a marcação nuclear negativa para 5-Metcit nas células de HSA possa ter relação

com um padrão extremamente baixo de hipometilação e que as técnicas de

imunoistoquímica utilizadas não tenham sido capazes de detectar. Morimoto et al.

(2016) sugere que a hematoxilina usada para contracorar as amostras possa ter

mascarado a detecção da imunomarcação de 5-Metcit no núcleo. Outra teoria possível é

67

que a ausência de marcação nuclear em algumas células possa estar relacionada com

determinada fase do ciclo celular, no qual genes possam estar extremamente

hipometilados. A hipometilação e hipermetilação do DNA frequentemente coexistem no

mesmo tumor, mas a relação entre hipermetilação em algumas partes do genoma e

hipometilação em outras ainda está para ser elucidada (ERLICH et al., 2006).

Em alguns tipos tumorais, a determinação de altas taxas de proliferação celular

através da marcação imunoistoquímica por Ki-67 já foi correlacionada com

agressividade e pior prognóstico (MAGLENNON et al., 2008; FONSECA-ALVES et

al., 2015). As amostras de HSA esplênico e derme foram analisadas quanto ao índice de

proliferação celular, já que diferentes localizações do HSA possuem agressividades

diferentes e também porque essa informação ainda não está disponível na literatura

veterinária. A proliferação celular de células de HSA esplênico e cutâneo foi semelhante

(Baço = 47,69% e derme = 51,68%), não ocorrendo distinção entre as células positivas

e negativas para ambos os HSAs. A marcação por 5-Metcit foi inversamente

proporcional à marcação por Ki-67 na pele, sugerindo que células pouco ou não

metiladas possuem uma maior taxa de proliferação. Esse resultado está de acordo com

Compare et al. (2011), no qual foi notado uma queda gradual da metilação e aumento

proporcional na taxa de proliferação celular conforme lesões gástricas pré-neoplásicas

progrediam para lesões gástricas mais agressivas e invasivas (carcinoma gástrico). Nos

HSAs esplênicos a mesma relação entre 5-Metcit e Ki-67 foi encontrada, no entanto por

r estar muito próximo de 0, a relação entre essas marcações foi considerada quase

inexistente. O fato de termos utilizado poucas amostras para a avaliação de Correlação

de Pearson pode ter levado a ausência de uma relação linear entre as marcações nas

amostras de HSA esplênico, no entanto pode-se observar uma tendência a uma

correlação negativa entre os parâmetros analisados.

O nosso estudo sofre de algumas limitações, incluindo o pequeno número de

amostras analisadas nos grupos de HSA esplênico e dérmico e também pela

indisponibilidade do histórico clínico dos animais, dessa maneira dificultando a

associação dos resultados com o prognóstico.

68

5 CONCLUSÃO

Conclui-se que através da detecção por imunoistoquímica de 5-Metcit, os HSAs

de baço e pele de cães apresentam um padrão de hipometilação global, podendo ter uma

associação com o desenvolvimento e/ou progressão dessa neoplasia. Verificou-se que as

células pouco ou não metiladas no HSA dérmico estão associadas com um maior índice

de proliferação. Essas alterações epigenética detectadas no HSA canino necessitam de

maiores investigações, incluindo a detecção de alterações de metilação em genes

específicos, podendo assim futuramente servir como novos alvos tumorais e

consequentemente ajudando na criação de terapias mais eficazes contra esse câncer

fatal.

69

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Capítulo 4

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA 5-AZACITIDINA E SAHA NAS LINHAGENS DE HEMANGIOSSARCOMA

CANINO

73

RESUMO Batschinski K. Avaliação da eficácia da 5-Azacitidina e SAHA nas linhagens de hemangiossarcoma canino [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017. O hemangiossarcoma é um câncer letal em humanos e cães. O hemangiossarcoma humano tem uma distribuição de lesão e comportamento semelhante ao hemangiossarcoma canino. Em ambas as espécies, metástases são frequentes e a quimioterapia adjuvante proporciona apenas um benefício mínimo. A investigação de novos alvos com potencial terapêutico e o estudo intenso da biologia do hemangiossarcoma canino são necessários para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes contra esse câncer devastador. Tem sido mostrado que a ação hipometilante da droga 5-Azacitidina e a ação de inibidores de histona desacetilase, tais como SAHA, tem o potencial de reverter o fenótipo relacionado com o desenvolvimento e progressão do câncer. O foco do corrente estudo é o de verificar o efeito da 5-Azacitidina e SAHA nas linhagens celulares já pré-estabelecidas de hemangiossarcoma canino FROG, DD1 e EMMA; e também em uma linhagem celular canina primária, LISS-HSA, com ênfase na indução de citotoxicidade, diminuição da viabilidade celular e nas alterações epigenéticas. Ensaios de combinação entre 5-Azacitidina e SAHA com a Doxorrubicina, quimioterápico de eleição no tratamento de hemangiossarcoma, para a verificação de potenciais efeitos de sinergismo, antagonismo ou ação aditiva também foram analisados. Verificou-se que: 1) As linhagens celulares de hemangiossarcoma canino possuem sensibilidades diferentes às terapias. A DD1 foi considerada a mais resistente e a LISS-HSA a mais sensível demonstrando a heterogeneidade presente nas linhagens celulares. 2) Houve uma diminuição da viabilidade celular quando os fármacos 5-Azacitidina, SAHA e Doxorrubicina foram utilizados isoladamente nas linhagens de hemangiossarcoma canino, comprovando a eficácia in vitro desses compostos. 3) Os ensaios de combinação entre a 5-Azacitidina e SAHA utilizadas com altas dosagens com a Doxorrubicina induziram um efeito sinérgico e consequentemente potencializaram a destruição de células de hemangiossarcoma. 4) Quando dosagens baixas de 5-Azacitidina e SAHA associadas à Doxorrubicina foram utilizadas ocorreu um efeito de antagonismo nas linhagens de hemangiossarcoma canino, mostrando a necessidade de maior investigação e descoberta dos mecanismos envolvidos com as interações medicamentosas entre terapias epigenéticas e quimioterápicos convencionais. Descritores: hemangiossarcoma; cães; epigenética; azacitidina; inibidores de histona desacetilases; metilação de DNA; acetilação

74

ABSTRACT Batschinski K. Evaluation of the efficacy of 5-Azacytidine and SAHA in canine hemangiosarcoma cell lines [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2017.

Hemangiosarcoma is a fatal cancer in both humans and dogs. In humans, hemangiosarcoma behaves and has lesions with similar distributions to canine hemangiosarcoma. In both species, metastases are commonly seen and adjuvant chemotherapy provides only a modest benefit. Identification of new tumor-specific targets and the extensive study of canine hemangiosarcoma biology are critical for the development of more effective therapeutics against this devastating cancer. It has been shown that 5-Azacytidine, a drug found to have a hypomethylating effect, and SAHA, which promotes acetylation, have the potential to revert the phenotype associated with the development and progression of cancer. The purpose of the current study is to determine the efficacy of 5-Azacytidine and SAHA in previously established canine hemangiosarcoma cell lines (FROG, DD1, EMMA) and in one primary hemangiosarcoma cell line (LISS-HSA). Induction of cytotoxicity, changes in cell viability and epigenetic alterations were analysed. Combination drug assays of 5-Azacytidine and SAHA with Doxorubicin, chemotherapy of choice in the treatment of hemangiosarcoma, were used to explore potential synergistic, antagonistic and additive effects. It was demonstrated that: 1) Canine hemangiosarcoma cell lines have different sensitivities to the drugs tested. DD1 was considered the most resistant cell line and LISS-HSA was considered the most sensitive one, demonstrating the heterogeneity present in the cell lines analysed. 2) There was a decrease in cell viability when 5-Azacytidine, SAHA and Doxorubicin were used as single agents in canine hemangiosarcoma cell lines, confirming the in vitro efficacy of these compounds. 3) Combination drug assays of high dosages of 5-Azacytidine and SAHA with Doxorubicin induced a synergistic effect and consequently potentiated the destruction of hemangiosarcoma cells. 4) When low dosages of 5-Azacytidine and SAHA associated with Doxorubicin were used, an antagonistic effect occurred in the canine hemangiosarcoma cell lines, indicating the need for further investigation of the mechanisms involved in drug interactions between conventional chemotherapeutic drugs and epigenetic agents. Descriptors: hemangiosarcoma; dogs; epigenetic; azacytidine; histone deacetylase inhibitors; DNA methylation; acethylation

75


O câncer é a principal causa de morte em seres humanos e animais de estimação

idosos. A taxa de incidência anual de câncer é de 470 e 381 por 100.000 para os seres

humanos e cães, respectivamente (DORN et al., 1998; Cancer Health Disparities, 2017).

Os cães desenvolvem naturalmente cânceres que possuem os mesmos subtipos

histológicos que os cânceres em seres humanos, sendo assim podem responder de

maneira similar aos seres humanos à terapia antineoplásica (PALONI; KHANNA,

2008). Portanto, o cão representa um modelo importante para estudos translacionais que

visam o tratamento do câncer ou a compreensão da biologia do mesmo. Exemplos de

tumores espontâneos caninos que são atualmente aceitos como modelos comparativos

de cânceres humanos incluem o linfoma não-Hodgkin, carcinomas mamários, sarcomas

de partes moles, e osteossarcoma (National Cancer Institute, 2017).

Ao contrário dos cães, o HSA ou angiossarcoma nos seres humanos é raro,

representando apenas 0,01%-0,1% de todos os tipos de tumores (FALK et al., 1981;

SPIRTAS et al.; 1983; FATA et al., 1999). Apesar de sua raridade, o angiossarcoma

humano apresenta várias similaridades com o HSA diagnosticado na espécie canina

(Quadro 7). Possui heterogeneidade em termos de apresentação clínica e

comportamento, podendo ocorrer em qualquer local do corpo, mas os locais primários

mais frequentes são face e couro cabeludo, tecidos moles, tecido mamário, baço e

fígado (URY et al., 2005; FAYETTE et al., 2007; MEIS-KINDBLOM; KINDBLOM,

1998; ABRAHAM et al., 2007; PATEL et al., 2014). Em torno de 50% dos

angiossarcomas ocorrem em regiões de cabeça e pescoço (STURGIS; POTTER, 2003).

Assim como os HSAs viscerais nos cães, o angiossarcoma humano de origem em

mama, fígado, baço e couro cabeludo se comporta de forma extremamente agressiva

(PENEL et al., 2008). A cirurgia é considerada como o principal método de tratamento,

mas associações com radioterapia e quimioterapia são tipicamente utilizadas devido ao

alto índice de recidiva local e desenvolvimento de metástases (PATEL et al., 2014). Os

agentes quimioterápicos Doxorrubicina e Paclitaxel proporcionam um aumento no

tempo de sobrevida para pacientes com angiossarcoma localizado avançado e/ou

metastático (PENEL et al., 2011; PENEL et al., 2008). Apesar de todos os esforços

terapêuticos, o prognóstico para pacientes diagnosticados com angiossarcoma é pobre,

76

com uma taxa de sobrevida de 5 anos de 10% a 40% (FAYETTE et al., 2007;

MENDEHALL et al., 2006).

Quadro 7. Tabela mostrando aspectos comparativos entre o hemangiossarcoma canino e humano.

O câncer tradicionalmente foi categorizado como uma doença que resulta de

sucessivos acúmulos de alterações genéticas em oncogenes e genes supressores

tumorais levando ao crescimento celular descontrolado (VIRANI et al., 2012).

Atualmente, sabe-se que as alterações epigenéticas também contribuem para a

carcinogênese (VIRANI et al., 2012). A epigenética pode ser considerada como uma

interface entre o genótipo e fenótipo, já que modifica o resultado final do código

genético sem alterar a sequência de DNA (HERCEG; USHIJIMA, 2010) Desempenha

um papel crucial na regulação de células normais, sendo de extrema importância no

desenvolvimento embriogênico, processo de diferenciação celular, proteção contra vírus

e na integração de sinais endógenos e ambientais durante a vida de um organismo

(FEINBERG et al., 2006; HERCEG, 2007; YAN et al., 2010). A regulação epigenética

pode ser separada em três grupos inter-relacionados: o posicionamento de

77

nucleossomos, as modificações de histonas e a metilação do DNA (YAN et al., 2010).

Entre eles, a metilação do DNA é o componente epigenético mais estudado até hoje.

A metilação consiste na adição de grupamentos metila na quinta posição do

carbono (C5) da base citosina do DNA que fica situada contiguamente a uma guanina

(G) (HERCEG; USHIJIMA, 2010). Representa apenas uma pequena mudança química

no DNA sem alteração no código genético, no entanto quando está desregulada pode

trazer consequências graves, como por exemplo o desenvolvimento de neoplasias

(HERCEG; USHIJIMA, 2010; KRISTENSEN et al., 2009). Existem duas formas

aberrantes de metilação do DNA associadas ao câncer: a hipometilação global e a

hipermetilação de genes promotores ou das ilhas CpG (FEINBERG; TYCKO, 2004). A

hipermetilação das ilhas CpG pode levar ao silenciamento de genes supressores

tumorais, podendo ser um fator causal tanto nas fases iniciais quanto nas fases tardias

da tumorigênese (KRISTENSEN et al., 2009). No câncer, os genes que normalmente

são afetados pela hipermetilação estão envolvidos na apoptose, controle do ciclo celular,

reparo do DNA e no metabolismo de drogas (GLASSPOOL et al, 2006; MERLO et al.,

1995). Somando-se a isso, em tumores sólidos a hipermetilação tem sido associada a

indução de resistência quimioterápica e a um pior prognóstico (GLASSPOOL et al,

2006; LINNEKAMP et al., 2017; DE SOUZA et al., 2011). Em seres humanos, o gene

Rb em retinoblastoma, MLH1 no câncer do cólon, BRCA1 em câncer de mama,

MGMT em glioblastomas, RASSF1A em sarcoma de células sinoviais, e p16INK4A

em angiosarcoma primário hepático são exemplos de genes supressores tumorais

conhecidos por sofrerem silenciamento como um resultado de hipermetilação de genes

promotores (HERMAN et al., 1998; ESTELLER et al., 1999; GREGER et al., 1989;

NUMOKO et al., 2010; TANNAPFEL et al., 2001). Em cães diagnosticados com

linfoma não-Hodgkin, o gene canino DLCI mostrou-se anormalmente hipermetilado

(BRYAN et al., 2009). O gene supressor tumoral DAPK, responsável por sensibilizar

células aos sinais de apoptose, também encontrou-se hipermetilado em cães com

linfoma do tipo B (SATO et al., 2014). A hipometilação global do DNA pode resultar

na superexpressão de fatores de crescimento ou oncogenes, alteração nos mecanismos

de reparo do DNA e perda da estabilidade genômica favorecendo as mutações

(HERNANDEZ-BLAZQUEZ et al., 2000; KRITENSEN et al., 2009). Estudos na

oncologia humana mostraram que diversos tipos de tumores, tais como carcinomas

prostático e gástrico, câncer de colon e tumores ovarianos, frequentemente apresentam-

78

se hipometilados (ERLICH et al., 2006; YANG et al., 2013; COMPARE et al., 2011;

HERNANDEZ-BLAZQUEZ et al., 2000). Verificou-se que mastocitomas caninos de

alto grau apresentam um padrão de hipometilação global do DNA (MORIMOTO et al.,

2016). Além disso, como mostrado no capítulo 3, os HSAs esplênicos e de derme de

cães também apresentaram um padrão de hipometilação global do DNA.

O estado de modificação de histonas tem um papel importante na determinação

da acessibilidade ao DNA para a maquinaria de transcrição, já que modificações das

histonas regulam o grau de condensação da cromatina (BIANCOTTO et al., 2010). A

cauda N-terminal de histonas pode ser pós-traducionalmente modificada por

acetilações, metilações, fosforilações, ubiquitinizações e ribosilações (BIANCOTTO et

al., 2010). Dentre essas modificações das histonas, as alterações de acetilação estão

cada vez mais sendo associadas à malignidades (CHRUN et al, 2017). A acetilação de

histonas (AH) é regulada por um equilíbrio dinâmico entre histona acetiltransferase

(HA) e histona desacetilase (HD), que determina o nível de acetilação e o estado

transcricional da cromatina (LIN et al., 2006). Nucleossomos altamente acetilados são

geralmente associados com atividade transcricional ativa da cromatina, enquanto que

histonas hipoacetiladas são encontradas nas regiões em que a cromatina está inativa

(KISSEBERTH et al., 2008). A hipoacetilação de histonas pode levar a expressão

gênica inadequada, sendo este um evento chave na carcinogênese (LIN et al., 2006).

Três situações podem contribuir para a hipoacetilação de histonas: 1) a superexpressão

ou aumento da atividade de HDs, 2) a diminuição da expressão ou atividade das HAs e

3) as duas condições acontecerem concomitantemente (CHRUN et al, 2017; SUZUKI

et al, 2009). Há evidências crescentes de que a atividade aberrante da HD e HA estejam

fortemente associadas com o desenvolvimento tumoral e a progressão do câncer

(CHRUN et al, 2017). As HDs podem impedir a transcrição de fatores de

diferenciação, inibidores de quinases dependentes de ciclina e fatores pró-apoptóticos

favorecendo o crescimento celular descontrolado (GLOZAK; SETO, 2007). Estudos em

seres humanos revelaram que os níveis de proteína de HDs encontram-se aumentados

em uma variedade de cânceres, como por exemplo em carcinomas gástrico e de cólon,

em sarcomas do endométrio, linfoma e leucemia (SONG et al., 2005; HUANG et al.,

2005; HRZENJAK et al., 2006; LEE et al., 2014; MORENO et al., 2010).

A descoberta de que os estados aberrantes epigenéticos de células malignas

podem levar ao silenciamento de genes supressores tumorais e também o caráter

79

relativamente reversível dessas alterações (em contraste com alterações genéticas)

inspirou o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que tem os componentes

epigenéticos como alvo (YAN et al., 2010).

A 5-Azacitidina (AZA) é um análogo de nucleosídeo classificado como um

inibidor de DNA metiltransferases. Quando essa droga é incorporada ao DNA de

células tumorais em replicação ativa durante a fase S do ciclo celular, ela exerce uma

atividade de hipometilação (BENDER et al., 1998). A desmetilação de genes

supressores tumorais ocorre somente quando a AZA é utilizada em concentrações mais

baixas e não citotóxicas (BENDER et al., 1998). Além de inibir a ação de DNA

metiltransferases, a AZA também é incorporada no RNA e desta maneira, interrompe os

processos celulares normais através da indução da desmontagem ribossomal e do

impedimento da tradução de proteínas oncogênicas (STRESEMANN; LYKO, 2008; LI

et al., 1970). A habilidade da AZA de agir tanto no DNA quanto no RNA aumenta o

efeitos colaterais in vivo e in vitro porque sua ação acontece tanto nas células em

repouso quanto em células em divisão (YAN et al., 2010). Em 2004, a AZA foi

aprovada pelo órgão regulador americano Food and Drug Administration (FDA) para o

tratamento da síndrome mielodisplásica com base nos resultados positivos observados

em pacientes com esta doença (SILVERMAN et al., 2002). Foi relatado que 60% dos

pacientes tratados com essa medicação exibiram vários níveis de resposta, enquanto que

apenas 5% dos pacientes que receberam somente tratamento de suporte mostrou

melhoria hematológica (KORNBLITH et al., 2002; SILVERMAN et al., 2006). Os

análogos de nucleosídeos também foram testados em muitos outros tipos de células

cancerosas, com resultados encorajadores. A AZA beneficiou pacientes diagnosticados

com leucemia mielóide aguda, atrasando o tempo de progressão da doença, e pacientes

com anemia refratária com excesso de blastos prolongando o tempo de sobrevida global

e melhorando a qualidade de vida (KORNBLITH et al., 2002; SILVERMAN et al.,

2006). Além de beneficiar pacientes com tumores hematológicos, a AZA também tem

mostrado um efeito promissor em tumores sólidos principalmente quando é utilizada em

associação com quimioterápicos convencionais (LINNEKAMP et al., 2017). Em um

estudo clínico de fase I, a AZA foi administrada 3 a 5 dias antes do protocolo

quimioterápico contendo Epirrubicina, Oxaliplatina e Capecitabina em pacientes

diagnosticados com carcinomas gástrico e esofágico, cuja resposta objetiva foi de 67%

(SCHNEIDER et al., 2016). O uso de drogas hipometilantes na Medicina Veterinária

80

ainda é infrequente. Fujita e Kaneda (2017) analisaram o efeito de AZA em linhagens

de linfoma felino. Nessas linhagens, AZA inibiu a proliferação celular (FUJITA;

KANEDA, 2017). Em um outro estudo, AZA mostrou atividade clínica promissora em

cães diagnosticados com carcinoma urotelial invasivo (HAHN et al., 2012). Uma

remissão parcial do tumor de 22,2% foi observada nestes pacientes (HAHN et al.,

2012).

Os inibidores de HD representam uma classe de antineoplásicos que modula a

transcrição de genes alvo regulando o acesso de fatores de transcrição e RNA

polimerases às regiões promotoras (MURAHARI et al, 2017). Dessa maneira, uma

inibição na atividade da HD pode resultar na re-expressão de genes supressores de

tumor e, consequentemente, na reversão da situação aberrante epigenética das células

tumorais (DUVIC, 2007). Em 2006, um inibidor de HD chamado de ácido

suberanilohidroxâmico (SAHA) foi aprovado pelo FDA para o tratamento de linfoma

cutâneo de células T com uma taxa de resposta global de 30% (DUVIC, 2007). SAHA

aumentou a acetilação de histonas, causou citotoxicidade e apoptose em uma variedade

de linhagens celulares de câncer canino, incluindo uma linhagem de células de HSA

(KISSEBERTH et al., 2008). Murahari et al. (2017) demonstrou que SAHA induziu a

apoptose e também sensibilizou linhagens celulares de osteossarcoma canino e humano

à Doxorrubicina. Um cão diagnosticado com HSA esplênico foi tratado com SAHA

após esplenectomia e nenhuma evidência de metástase foi notada dentro de um período

de mais de 1000 dias (COHEN et al., 2004).

O prognóstico ruim associado ao diagnóstico de câncer de células endoteliais em

seres humanos e em cães aliado a falta de tratamentos eficazes, faz com que a

investigação de novos medicamentos antineoplásicos, tais como a AZA e SAHA, e a

identificação de modificações epigenéticas de células endoteliais, sejam essenciais para

a descoberta de novos alvos tumorais e para o desenvolvimento de tratamentos mais

promissores contra o câncer devastador que é o HSA.

81

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Analisar os efeitos de AZA e SAHA utilizadas como agentes únicos, ou em combinação

com a Doxorrubicina, em cultura celular de HSA canino.

2.2 Objetivos específicos

• Estabelecimento e caracterização de cultura primária de HSA canino.

• Análise do efeito de AZA e SAHA utilizadas isoladamente e concomitantemente

à Doxorrubicina sobre as células de HSA canino (DD1, FROG, EMMA e LISS-

HSA) com o foco no processo de citotoxidade celular induzida.

• Verificação dos possíveis efeitos de sinergismo, antagonismo ou ação aditiva

após tratamento das células de HSA canino (DD1, FROG, EMMA e LISS-HSA)

com AZA ou SAHA associadas à Doxorrubicina.

• Análise do efeito de AZA e SAHA utilizadas isoladamente e

concomitantementeàDoxorrubicinasobreascélulasdeHSAcanino(DD1,

FROG, EMMA e LISS-HSA) com o foco nas alterações epigenéticas.

82

3 MATERIAL E MÉTODO

3.1 Desenvolvimento de cultura celular primária de hemangiossarcoma canino

3.1.1 Animais

Os cães cujos HSAs foram utilizados na obtenção das células neoplásicas

destinadas ao cultivo celular foram atendidos no Hospital Veterinário Petcare

Ibirapuera. Após a realização de exame físico e de exames de imagem que indicavam a

presença de uma massa em um ou mais órgãos viscerais, estes animais foram

encaminhados para a cirurgia como parte de um tratamento inicial e também para obter

o diagnóstico definitivo. Seguida a cirurgia, células neoplásicas foram isoladas e

devidamente preparadas para cultivo. Fragmentos representativos das neoplasias foram

obtidos e rotineiramente processados para inclusão em parafina. Cortes histológicos

(5µm) foram corados com hematoxilina e eosina para realização do exame

histopatológico.

3.1.2 Coleta de neoplasias abdominais

O tecido visceral alterado com suspeita de HSA foi colhido imediatamente após

a cirurgia de retirada (3 animais). Fragmentos representativos foram obtidos e

rotineiramente incluídos em parafina para exame histopatológico e imunofluorescência

ou outras eventuais colorações histoquímicas ou imunoistoquímicas. Outros fragmentos

viscerais das mesmas regiões foram imediatamente coletados assepticamente e

processados para o início do estabelecimento do cultivo celular de HSA canino.

3.1.3 Análise histopatológica

Os fragmentos de tecidos viscerais alterados com suspeita de neoplasia, após

confecção de lâminas e coloração de rotina através de hematoxilina e eosina, foram

observados ao microscópio óptico comum, possibilitando conjuntamente com dados

clínicos, um diagnóstico morfológico, e graduação através de critérios histopatológicos

padronizados (BERTAZZOLO et al., 2005).

83

3.1.4 Cultura celular

Os estudos foram conduzidos utilizando-se quatro linhagens distintas de HSA

canino: DD1, FROG, EMMA e LISS-HSA (FOSMIRE et al., 2004; LAMERATO-

KOZICKI et al., 2006; SCHAPPA et al., 2013). As três primeiras linhagens celulares de

HSA são linhagens previamente estabelecidas que foram gentilmente cedidas pelo Dr.

Jaime Modiano do Masonic Cancer Center da Universidade de Minnesota. A quarta

linhagem celular (LISS-HSA) foi desenvolvida e estabelecida em nosso laboratório,

Laboratório de Oncologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.

3.1.5 Cultura celular primária de hemangiossarcoma canino

Foram coletados fragmentos de 3 formações viscerais de 3 diferentes cães

submetidos a cirurgia no Hospital Veterinário Petcare Ibirapuera, sendo duas com

origem em baço e uma em mesentério.

Os fragmentos foram mantidos em meio de cultivo RPMI contendo antibiótico e

antimicótico até no máximo 2 horas antes do início da preparação dos cultivos. No

laboratório, dentro do fluxo laminar em condições assépticas, os fragmentos das

formações viscerais caninas foram colocados em placas diferentes contendo meio de

cultura DMEM, RPMI ou AIM-V e mecanicamente separados em fragmentos menores

de aproximadamente 1-3 mm. Os fragmentos foram então lavados em PBS e então

colocados em garrafas de 50 ml contendo meio de cultura DMEM, RPMI ou AIM-V, os

quais foram suplementados com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 unidades/ml)

e estreptomicina (100µg/ml). Os cultivos celulares foram mantidos em estufa de CO2

com atmosfera umidificada e 5% de CO2 a 37ºC. O meio de cultura foi trocado a cada

dois a três dias. Chegada à confluência, as células foram tripsinizadas, e então

subdivididas para novas garrafas ou então criopreservadas em freezer – 80ºC. O

processo de tripsinização consistiu na lavagem da cultura com PBS, para remoção do

meio de cultura, incubação com 2 ml de tripsina-EDTA (0,25% em PBS), sendo a

liberação das células acompanhada em microscópio invertido de luz. Após o

desprendimento das células, a tripsina-EDTA foi inativada pela adição de DMEM,

RPMI ou AIM-V com 10% de soro fetal bovino. As células foram centrifugadas a 1500

rpm, por 5 minutos, ressuspendidas em meio de cultivo e contadas em câmara de

84

Neubauer e a viabilidade celular determinada pelo método de exclusão do corante azul

de tripan (0,01% em PBS). Este método auxilia na diferenciação entre as células vivas e

mortas, por utilizar a propriedade deste corante em penetrar apenas em células mortas,

as quais assumem coloração azul, possibilitando a determinação da concentração das

células vivas, conforme a seguinte fórmula: [nº de células/ml = (nº de células x diluição

x 104)/n° de quadrantes]. Foi considerada aceitável uma viabilidade celular superior a

85%.

3.1.6 Congelamento e descongelamento de células

As células a serem congeladas foram inicialmente lavadas com PBS, e então

tripsinizadas por 10 minutos em estufa de CO2, a 37°C. Depois de verificado o

destacamento celular ao microscópio, adicionou-se DMEM F12 com 10% de soro fetal

bovino para a inativação da tripsina e em seguida as células foram coletadas. A

suspensão de células foi centrifugada por 10 minutos a 1200 rpm. Terminada a

centrifugação, o sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em meio

DMEM F12 com suplementação de fatores de crescimento para células endoteliais.

Uma alíquota foi coletada e contada automaticamente no contador automático de células

(CountessTM Life Technologies), e a concentração ajustada para 106 células/ml com a

mistura de congelamento (10% DMSO + 90% suspensão de células em soro fetal

bovino). A suspensão já com DMSO foi aliquotada em criotubos (Corning®)

devidamente identificados, e estes, foram acondicionados em reservatório próprio para

congelamento (Mr Frosty, Nalgene) e então colocados em freezer a - 80°C. Depois de

congelados os criotubos foram retirados rapidamente do freezer e colocados em tambor

contendo nitrogênio líquido até o momento de sua utilização.

O descongelamento foi realizado sempre que necessário, retirando-se o criotubo

do tambor de nitrogênio, e colocado em banho-maria a 37°C. Uma vez descongelada a

suspensão de células, foi adicionado meio DMEM F12 com soro fetal bovino sendo

então centrifugadas por 10 minutos a 1200 rpm. Após a centrifugação as células foram

então ressuspendidas em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino e então colocadas

em garrafas de 75 cm2 (Corning®) para o início do crescimento celular prévio aos

experimentos.

85

3.1.7 Colorações imunocitoquímicas de cultura primária de hemangiossarcoma

As células foram cultivadas sobre uma lamínula em placas de 6 poços. Após 2

semanas de cultivo em meio de cultura RPMI este foi removido, e as células lavadas

com PBS e fixadas em etanol 70% por 20 minutos a -20ºC. As células foram

submetidas ao bloqueio da peroxidase em solução de H2O2 5%, diluído em metanol,

durante 15 minutos. Após lavagens, o bloqueio antigênico das lâminas foi realizado em

5% leite diluído em PBS contendo 0,1% Triton X-100, durante 30 minutos. Em seguida,

os cortes foram lavados e incubados em câmera úmida, overnight e a 4oC, com

anticorpos policlonais anti-fator 8 (Fator de von Willebrand) (Dako, Carpinteria, CA,

USA, 1:100) e anti-CD117 (c-Kit) (Dako, Carpinteria, CA, USA, 1:100); e os

anticorpos monoclonais anti-vimentina e anti-CD31 (PECAM-1) (Dako, Carpinteria,

CA, USA, 1:100). Posteriormente, as lâminas foram lavadas com PBS contendo 0,1%

Triton X-100 e incubadas com anticorpo secundário biotinilado (Dako, Carpinteria, CA,

USA, 1:500) durante 60 minutos, em câmera úmida. Posteriormente, as lâminas foram

lavadas com PBS contendo 0,1% Triton X-100 e montadas em Permount.

3.1.8 Citometria de fluxo

Foi utilizado um citômetro de fluxo (Becton Dickison [BD] Immunocytometry

System, San Jose, CA, USA) conectado a um computador (Machintosh Apple, CA,

USA), sendo os eventos adquiridos por meio de um programa denominado Cell Quest

Pro® (Becton Dickison [BD] Immunocytometry System, San Jose, CA, USA).

As subpopulações celulares foram reconhecidas por meio das propriedades de

FSC – Foward Scatter e SCC – Side Scatter que avaliam o tamanho e a complexidade

interna, respectivamente. As fluorescências do reagente Nucview 488 e do isotiocianato

de fluoresceína (FITC) foram detectadas pelo filtro FL-1 (530 nm) e do iodeto de

propídeo (PI) foi detectada através do programa FlowJo® (Tree Star Inc, Ashland,

USA), sendo as populações de interesse em cada experimento selecionadas por meio de

gates, excluindo assim outros tipos celulares das amostras. Além disto, quando

necessário o aparelho foi compensado com um tubo branco como controle de

fluorescência basal da célula a ser analisada.

86

3.1.9 Ploidia e ciclo celular

A análise de ploidia e ciclo celular foi realizada com a colaboração da Profa.

Dra. Cristina de Oliveira Massoco Salles Gomes no laboratório de Farmacologia e

Toxicologia do departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia da Universidade de São Paulo. Para avaliar a ploidia e ciclo celular por

citometria utilizou-se como padrão de células diplóides as células mononucleares

isoladas de sangue canino, as quais foram separadas por gradiente de densidade e

centrifugação utilizando Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Life Sciences) segundo as

normas do fabricante. O sangue utilizado foi conseguido de cão saudável, tendo sido

coletado de forma asséptica no ambulatório médico do HOVET-USP. Resumidamente,

as células foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de seis poços com fundo chato,

estéril Ultra low attachment (Corning®), em triplicatas 1 ml por poço, na concentração

de 1,5x106 células/ml. A definição desta concentração baseou-se no fato de 106 células

ser a concentração mínima exigida pela técnica. A cultura celular de interesse, LISS-

HSA, foi incubada por 3 dias, em estufa umidificada com 5% de CO2, a 37°C. Após

incubação, as células foram ajustadas para 1x106 células e fixadas em 1 ml de etanol

70% gelado, sendo mantidas a -20°C até o momento da análise por citometria de fluxo.

Para análise, as células foram lavadas três vezes com 1 ml de PBS (1800 rpm/10 min) e,

em seguida, incubadas em 200 uL solução de PI [20 ug/ml de iodeto de propídeo (Fluka

– Sigma Aldrich), 200 uL/mL RNAse A (Invitrogen™) e 0,1% triton X-100 (v/v) em

PBS] por 15 minutos a 37°C. Após esta etapa, foram adquiridas 10000 eventos das

células de interesse em cada amostra em um citômetro FACS Calibur equipado com o

programa Cell Quest Pro® (Becton Dickison [BD] Immunocytometry System, San

Jose, CA, USA). Todos os dados forma analisados pelo programa FlowJo, sendo que os

dados de ploidia forma determinados pelo DNA index, conforme as normas da BD, no

qual a intensidade média da fluorescência (MFI) das células na fase G0/G1 de cada

amostra dividida pela MFI das células padrão diploide da mesma espécie. Assim,

quando o DNA index = 1 as células avaliadas são consideradas diploides, porém quando

este resultado é diferente de um elas são classificadas como aneuploides, sendo

haploides (= 0,5), hipodiploides (<1), hiperdiploides (>1) e tetraploides (=2).

87

3.1.10 Microscopia eletrônica de transmissão

Os procedimentos para avaliação morfológica e ultraestrutural das células

neoplásicas LISS-HSA oriundas de um HSA canino foram realizados de acordo com a

metodologia utilizada pelo laboratório de microscopia eletrônica de transmissão do

Instituto Ciências Biomédicas I da Universidade de São Paulo.

Para a realização da análise ultraestrutural da linhagem LISS-HSA foram

mantidas em cultivo celular pelo período de 72 horas. Um total de 1,2 x 106 células por

ml, foram lavadas com PBS 1x e centrifugadas por 1200 RPM por 10 minutos. O pellet

da linhagem celular foi fixado em glutaraldeído 2,5% em 0,1 M de tampão cacodilato

de sódio (pH 7,2) por 10-12 horas a 4 ºC, e estocado em solução tampão cacodilato de

sódio 0,1 M/sucrose 0,2 M a 4 ºC até o processamento das amostras. Na sequência, a

amostra foi lavadas três vezes em solução salina 0,9% e pós-fixadas em tetróxido de

ósmio 1% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2) por 24 horas. Em seguida

foram novamente lavadas em solução salina 0,9%, impregnadas em acetato de uranila

0,5% overnight e incluídas em agar. O material foi armazenado a 4ºC até a formação do

“pellet”, o qual foi recortado e novamente colocado em acetato de uranila 0,5%

overnight. Ao término desta etapa as amostras foram desidratadas em uma série

graduada de acetona Merck® (30 - 100%) e incluídas em bloco de resina. Após a

inclusão, o material foi levado para a estufa a 60ºC, onde permaneceram por 72 horas

para polimerização da resina. Na seqüência, os blocos foram removidos da forma de

inclusão e trimados para retirada do excesso da resina. Em seguida foram feitos cortes

semifinos e ultrafinos no ultramicrótomo. Os cortes semifinos foram realizados com

navalha de vidro a uma espessura de 500 nm. A cada avanço de 5 µm realizava-se uma

lâmina, corada com azul de toluidina a 0,25% em solução aquosa de borato de sódio a

1%, para verificação da região do corte. Assim que a região contendo as células

neoplásicas endoteliais era ultrapassada, a espessura do corte foi reduzida para 200 nm e

a cada avanço de dois µm, os cortes foram colhidos e montados em lâminas de vidro,

corados e observados para verificação das ultraestruturas celulares.

Quando a lâmina revelava a proximidade de muitas células, a espessura do corte

foi novamente reduzida para 100 nm, trocava-se a navalha de vidro pela de diamante

para realização de cortes ultrafinos (50 - 70 nm), os quais foram montados em grades de

cobre oval de 300 mesh, revestidas com parlódio, impregnados em solução de metais

pesados, acetato de uranila (UO2(CH3COO) 2.2H2O a 2%, em etanol a 50%, contendo

88

1% de ácido acético glacial, durante 7 min. Três passagens por etanol a 50%. Lavagem

em água ultrapura. Solução de citrato de chumbo (CH6H5O7)2Pb3.3H2O, a 0,4%, com

1% de uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 5 M, durante 7 min. Lavagem com

água ultrapura. Secagem das grelhas à temperatura ambiente. Análise e documentação

será feita em microscópio eletrônico de transmissão JEOL.

3.2 Ensaios para determinação de citotoxicidade

3.2.1 Curva de crescimento de células de hemangiossarcoma canino

Utilizamos o método do cristal violeta (4 – [(4 dimetilaminofenila)-metil-fenil]-

N, N-dimetil anilina), a fim de uma análise inicial de proliferação das células de HSA

canino. Para avaliarmos o tempo de duplicação celular utilizamos as linhagens de HSA

canino DD1, FROG e LISS-HSA. Para obtenção da curva de crescimento, garrafas com

células em confluência foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de 96 poços com

fundo chato, estéril (Corning®), em quadruplicatas, 100 µL por poço, na concentração

de 2x103/poço, 5x103/ poço, 1x104/ poço e 2x104/ poço, e depois foram colocadas em

estufa de CO2 com atmosfera umidificada e 5% de CO2 a 37°C pelo seguintes períodos

de tempo: 24, 48, 72 e 96 horas. Ao final de cada período as células foram coradas com

cristal violeta durante 10 minutos. Os núcleos de células viáveis incorporaram o

corante. As placas foram então lavadas em água corrente. Quando todas as placas foram

lavadas e secas, 100 µL de metanol foram adicionados ao cristal violeta incorporado às

células solubilizando-o e a densidade óptica pode ser lida em espectrofotômetro

Multiskanex © (Uniscience), software Ascent Software © (leitor de Elisa), com o

comprimento de onda de 570 nm. Para a realização dos cálculos estatísticos foi utilizado

o software Graphpad Prism 6® e o teste de uma via ANOVA.

3.2.2 Análise da viabilidade celular com ensaio de MTT após exposição inicial aos

agentes antineoplásicos utilizados isoladamente

Para determinar o efeito do tratamento utilizando os agentes antineoplásicos

isoladamente, a viabilidade celular das 4 linhagens celulares foi avaliada utilizando-se o

ensaio de MTT baseado na metabolização do sal tetrazólico (3-) 4,5-dymethylthiazol-2-

(yl)-2,5-(diphenyl tretrazolium bromide) pelas mitocôndrias de células metabolicamente

ativas, no tempo de 72 horas.

89

Para a obtenção da curva de sensibilidade celular aos diferentes agentes

escolhidos (SAHA, AZA e Doxorrubicina), garrafas com células em confluência foram

tripsinizadas e plaqueadas em placas de 96 poços com fundo chato, estéril (Corning®),

em quadruplicatas, 100 µL por poço, na concentração de 1x104 células/poço e então

colocadas em estufa com atmosfera umidificada e 5% de CO2 a 37°C por 24 horas.

Após esse período, diferentes concentrações de cada um dos agentes foram adicionadas.

Agentes anti-neoplásicos utilizados isoladamente: a) SAHA nas concentrações de 0,5

µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM; b) AZA nas concentrações de 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10

µM; c) Doxorrubicina nas concentrações de 20 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml

e 500 ng/ml. As placas foram incubadas durante 72 horas. Ao final de cada período de

tempo (24, 48 e 72 horas) de incubação com os princípios ativos, foi adicionado 10

µL/poço de MTT (5 mg/ml) para cada 100 µL de meio. A placa foi então incubada em

estufa com atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 a 37°C, por 3 horas. Foi

adicionado então 100 µL de solução DMSO em cada poço. Quinze minutos depois do

procedimento, a densidade óptica pode ser lida em espectrofotômetro Multiskanex ©

(Uniscience), software Ascent Software © (leitor de Elisa), com o comprimento de onda

de 570 nm. Para a realização dos cálculos estatísticos foi utilizado o software Graphpad

Prism 6® e o teste de uma via ANOVA.

3.2.3 Análise da viabilidade celular com ensaio de MTT após exposição aos agentes

antineoplásicos utilizados em combinação

Para determinar o efeito do tratamento utilizando a combinação dos agentes anti-

neoplásicos, a viabilidade celular das 4 linhagens celulares foi avaliada utilizando-se o

ensaio de MTT baseado na metabolização do sal tetrazólico (3-) 4,5-dymethylthiazol-2-

(yl)-2,5-(diphenyl tretrazolium bromide) pelas mitocôndrias de células metabolicamente

ativas, no tempo de 72 horas. Diferentes concentrações de cada um dos agentes foram

adicionadas e combinadas. Agentes anti-neoplásicos utilizados isoladamente: a) SAHA

nas concentrações de 5 µM e 10 µM; b) 5-Azacitidina nas concentrações de 5 µM e 10

µM; c) Doxorrubicina nas concentrações de 1 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml e

500 ng/ml. Agentes anti-neoplásicos utilizados em combinação: a) 5 µM de SAHA +

Doxorrubicina em 5 diferentes concentrações (1 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml,

500 ng/ml); b) 10 µM de SAHA + Doxorrubicina em 5 diferentes concentrações (1

ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml); c) 5 µM de 5-Azacitidina +

90

Doxorrubicina em 5 diferentes concentrações (1 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml,

500 ng/ml); d) 10 µM de 5-Azacitidina + Doxorrubicina em 5 diferentes concentrações

(1 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml). Após o tempo de incubação com

os princípios ativos, foi adicionado 10 µL/poço de MTT (5 mg/ml) para cada 100 µL de

meio. A placa foi então incubada em estufa com atmosfera umidificada contendo 5% de

CO2 a 37°C, por 3 horas. Foi adicionado então 100 µL de solução DMSO em cada poço.

Quinze minutos depois do procedimento, a densidade óptica pode ser lida em

espectrofotômetro Multiskanex © (Uniscience), software Ascent Software © (leitor de

Elisa), com o comprimento de onda de 570 nm. Para a realização dos cálculos

estatísticos foi utilizado o software Graphpad Prism 6® e o teste de uma via ANOVA.

3.2.4 Análise da viabilidade celular com o teste de cristal violeta após exposição aos

agentes antineoplásicos utilizados em combinação

O teste de cristal violeta é responsável por corar os ácidos nucléicos das células

(KUENG et al., 1989). Para a realização desse ensaio, garrafas com células em

confluência foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de 96 poços com fundo chato,

estéril (Corning®), em quadruplicatas, 100 µL por poço, na concentração de 1x104/

poço e depois foram colocadas em estufa de CO2 com atmosfera umidificada e 5% de

CO2 a 37°C durante 72 horas. As mesmas concentrações dos agentes antineoplásicos

utilizadas para a realização do teste de MTT foram utilizadas para o teste de cristal

violeta. Ao final desse período as células foram coradas com cristal violeta durante 10

minutos. Os núcleos de células viáveis incorporaram o corante. As placas foram então

lavadas em água corrente. Quando todas as placas foram lavadas e secas, 100 µL de

metanol foram adicionados ao cristal violeta incorporado às células solubilizando-o e a

densidade óptica pode ser lida em espectrofotômetro Multiskanex © (Uniscience),

software Ascent Software © (leitor de Elisa), com o comprimento de onda de 570 nm.

Para a realização dos cálculos estatísticos foi utilizado o software Graphpad Prism 6® e

o teste de uma via ANOVA.

3.2.5 Cálculo do IC50

O valor encontrado após o cálculo do IC50 representa a média (50%) da

concentração máxima inibitória (IC) de uma substância em um particular processo

biológico. No caso do nosso estudo, o IC50 é uma medida de eficácia de uma droga que

91

mostra a quantidade necessária de um agente antineoplásico para inibir 50% da

proliferação celular (BRUCE et al., 2002). Calculamos o IC50 das drogas

Doxorrubicina, AZA e SAHA utilizando seis concentrações diferentes de cada droga de

acordo com a sensibilidade de cada linhagem celular. A Doxorrubicina foi utilizada nas

concentrações de 0,001 µg/ml, 0,005 µg/ml, 0,01 µg/ml, 0,1 µg/ml, 1 µg/ml e 10 µg/ml

nas linhagens mais sensíveis aos agentes antineoplásicos (FROG e LISS-HSA),

enquanto que na linhagem mais resistente (DD1) foram utilizadas as seguintes

dosagens: 0,01 µg/ml, 0,05 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1 µg/ml e 10 µg/ml. A AZA foi

utilizada nas concentrações de 0,1 µM, 1 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM e 50 µM nas

linhagens FROG, LISS-HSA e DD1. SAHA foi utilizada nas concentrações 0,1 µM, 1

µM, 3 µM, 5 µM, 10 µM e 20 µM nas linhagens FROG e LISS-HSA, enquanto que na

linhagem DD1 foram utilizadas dosagens mais altas: 1 µM, 5 µM, 10 µM, 25 µM, 50

µM e 100 µM. Para a realização dos cálculos foi utilizado o software Graphpad Prism

6®.

3.2.6 Avaliação de sinergismo

Os ensaios de combinação dos agentes antineoplásicos AZA e SAHA com a

Doxorrubicina foram realizados através do ensaio de MTT utilizando um aumento

crescente constante (0,25; 0,5; 1; 2; 4) nas dosagens tendo como base o valor de IC50

de cada fármaco para cada linhagem celular analisada (Quadro 8). A análise do efeito

antagonista, aditivo ou sinérgico entre as drogas combinadas foi determinada através do

software Compusyn®.

92

Quadro 8: Dosagens utilizadas para a combinação de Doxorrubicina com SAHA ou 5-Azacitidina nas linhagens LISS-HSA, FROG e DD1 para determinação de efeito antagonista, aditivo ou sinérgico.

3.3 Quantificação da metilação global do DNA

A quantificação da metilação global de DNA em linhagens celulares de HSA

canino após tratamento com Doxorrubicina associada à AZA, expressa como

porcentagem (%) 5-metil-2’-desoxicitidina (5-metil-dC) foi determinada pelo método

de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Tal metodologia inclui a extração

de DNA das células endoteliais, seguida de hidrólise enzimática do DNA e passagem da

amostra pela coluna cromatográfica do sistema analítico de HPLC-DAD disponível no

laboratório da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo,

realizada com a colaboração da Profa. Dra. Ana Paula de Melo Loureiro.

Para extração e purificação do DNA das células endoteliais, utilizou-se o

protocolo do kit de extração Gentra Puregene® (QIAGEN Sciences, Mayland, USA).

Cerca de 6 mL de solução de lise das hemácias (RBC Lysis Solution, Gentra Puregene®

Kit) foi adicionada à amostra correspondente. Submeteu-se a agitação durante 10

minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugação por 5 minutos, 2000 x g a

4°C, e o sobrenadante foi cuidadosamente descartado. A amostra foi agitada na solução

residual remanescente (aproximadamente 500 µL) junto com o precipitado até formação

de uma solução homogênea. Posteriormente, adicionou-se 5 mL de solução de lise de

93

células (Cell Lysis Solution, Gentra Puregene® Kit), as amostras foram vigorosamente

agitadas por 20 segundos e foi adicionado 50 µL de uma solução contendo a enzima

RNAase (Ribonuclease) na concentração de 15 mg/mL. As amostras foram incubadas

por 60 minutos a 37oC. Após a incubação foi adicionado 5 mL da solução de

precipitação de proteínas (Protein Precipitation Solution, Gentra Puregene® Kit), as

amostras foram submetidas a uma vigorosa agitação e posterior centrifugação a 3000 x

g por 10 minutos, 4oC. O sobrenadante foi transferido para um tubo contendo 5 mL de

isopropanol gelado, precipitando o DNA. A solução seguiu sendo submetida a uma

nova centrifugação por 3 minutos, 2000 x g, 4°C. O DNA precipitado foi lavado com 3

mL de etanol 70%, centrifugado por 5 min, 2000 x g, 4°C. Depois de seco, o DNA foi

ressuspenso em 100 µL de uma solução de desferroxamina (0,1 mM) e transferido para

um eppendorf identificado. A concentração do DNA foi determinada pela leitura de

absorbância a 260 nm e sua pureza pela razão de absorbância a 260/280 nm.

Para a reação de hidrólise enzimática, alíquotas contendo 10 µg de DNA em

desferroxamina (0,1 mM) foram adicionadas a 2,5 µL de tampão Tris-HCl/MgCl2 200

mM (pH 7,4) e 1 µL de DNAse 1. As amostras foram incubadas a 37 °C por 1 hora.

Após a incubação, adicionou-se 1 µL de fosfodiesterase 1 (PDE1) e 1,2 unidade de

fosfatase alcalina. As amostras foram novamente incubadas a 37 °C por 1 hora com

agitação de 1000 rpm. Ao término da segunda hora o volume final da incubação (20 µL)

foi centrifugado por 10 min a 9.300 x g e o sobrenadante coletado. Alíquotas de 10 µL

(5 µg de DNA) foram analisadas em um sistema de HPLC-DAD.

As alíquotas de DNA foram injetadas no sistema analítico de HPLC da empresa

Shimadzu Corporation (Kyoto, Japão) equipado com duas bombas LC-20AT, um

detector de arranjo fotodiodos PDA-20AV, um auto injetor (Proeminence SIL-20AC) e

um forno para colunas (CTO-10AS/VP) controlado por um módulo de comunicação

CBM-20A. Os dados foram processados pelo software LC-Solution 1.21 (Shimadzu,

Japão). A seguinte condição cromatográfica foi utilizada para as análises:

- Coluna Luna C18 (2) 250 mm x 4,6 mm, ID, 5 µm, (Phenomenex, Torrance, CA) com

uma pré-coluna C18 4,0 x 3,0 mm (Phenomenex, Torrance, CA) foi eluída com um

gradiente de ácido fórmico (0,1% em água) e CH3OH (0-25 min, 0-18% de CH3OH; 25-

27 min, 18-0% de CH3OH; 27-37 min, 0% de CH3OH), com um fluxo de 1 mL/min,

94

30°C. O detector de DAD é fixado em 260 nm para a quantificação da desoxicitidina

(molécula formada pela ligação da citosina com a desoxirribose – dC) e 286 nm para a

quantificação da 5-metil-dC. As curvas de calibração foram feitas no intervalo de 0,05-6

nmol para dC e de 0,005-0,4 nmol para 5-metil-dC. A porcentagem da metilação global

do DNA é calculada usando a seguinte equação:

5-metil-dC % =5-metil-dC !"#$ ×100

5-metil-dC !"#$ + dC !"#$

95

4 RESULTADOS

4.1 Animais utilizados e coleta de neoplasias abdominais

Para o estabelecimento de uma cultura primária de HSA foram utilizados três cães

(Quadro 9) atendidos no Hospital Veterinário Petcare Ibirapuera.

Quadro 9: Dados dos animais incluídos no projeto.

4.2 Cultura celular

4.2.1 Cultura de tecido tumoral

Já que não tínhamos o diagnóstico de HSA antes do procedimento cirúrgico de

cada um dos três cães citados no Quadro 9, apenas uma suspeita de acometimento pela

doença, todo fragmento de tumor com suspeita de HSA foi preparado e colocado em

cultivo celular até que o resultado histopatológico ficasse pronto. Uma vez tendo sido

determinado o resultado histopatológico das formações, as culturas celulares de cães

com formações benignas foram descartadas. O tumor obtido a partir da cadela “Liss”

obteve um diagnóstico histopatológico consistente com HSA, nossa neoplasia de

interesse. Na análise microscópica da formação de mesentério da cadela “Liss”

observou-se um nódulo de moderada a elevada celularidade, mal delimitado e infiltrado

a tecidos vizinhos, constituído de proliferação neoplásica de células endoteliais

arranjadas de forma sólida e em múltiplos espaços vasculares irregulares, sustentadas

por moderado estroma colagenoso e preenchidos em seu lúmen por variável quantidade

96

de hemácias. O pleomorfismo era moderado com discreta anisocitose e discreta

anisocariose. Essas células exibiam citoplasma eosinofílico de contornos indistintos. Os

núcleos eram ovalados a alongados, de coloração basofílica, com aspecto finamente

vesiculado, com um nucléolo por vezes evidente. Figuras de mitose também foram

observadas em número variando de 1 a 3/ campo (Figuras 13 e 14).

Figura 13: Hemangiossarcoma. Hematoxilina e eosina. A- Aspecto arquitetônico microscópico da neoplasia apresentando áreas solidas e espaços vasculares. Objetiva de 10X. B – Maior aumento da figura 1A mostrando características celulares como pleomorfismo moderado com discreta anisocitose e discreta anisocariose. Objetiva de 20X.

Figura 14: Hemangiossarcoma. Maior aumento da figura 1 mostrando detalhes (indicados por setas) como figuras de mitose. Hematoxilina e eosina. Objetiva de 40X.

97

Foi estabelecida uma linhagem celular a partir de fragmentos do HSA

mesentérico da “Liss”. Nos primeiros 5 dias de cultivo, essas células apresentavam uma

forma mais arredonda (Figura 15 A, B e C), mas com o crescimento e a confluência elas

passaram a apresentar um formato mais alongado e fibroblastóide (Figura 15 D, E e F).

Notou-se também que as células endoteliais malignas em cultivo apresentavam um

crescimento mais rápido quando mantidas no meio de cultura DMEM F12 ao invés do

AIM-V ou RPMI. Devido a esse fato, passamos a utilizar somente o meio DMEM F12

com suplementação de fatores de crescimento para células endoteliais [heparina sódica

de mucosa intestinal de porco 0,01 mg/ml (Heparina Sigma número H3149-100KU) e

suplemento para crescimento de células endoteliais 0,05 mg/ml [(ECGS Corning®

Fisher Scientific número 356006), junto com 10% de soro fetal bovino (FBS - Gibco®),

Glutamina 0,1% (GlutaMAX Gibco®), penicilina (100 unid/ml) e estreptomicina (100

µg/ml) (Anti-anti - Gibco®]. Após 15 dias da coleta, realizamos a tripsinização para

soltar as células e obter mais garrafas da mesma cultura, como descrito anteriormente

em material e métodos. Nomeamos essa linhagem celular como LISS-HSA.

Figura 15: A, B, C - Fotomicrografia das células provenientes de um hemangiossarcoma mesentérico nos primeiros 5 dias de cultivo apresentando um formato mais arredondado. A- Objetiva 10X. B - Objetiva 20X. C - Objetiva 40X. D, E, F - Fotomicrografia das células provenientes de um hemangiossarcoma mesentérico apresentando um formato mais alongado e fibroblastóide. D - Objetiva 10X. E - Objetiva 20X. F - Objetiva 40X.

98

4.2.2 Caracterização imunofenotípica da cultura celular primária de

hemangiossarcoma

O HSA canino origina-se a partir de células endoteliais transformadas. Desta

maneira, a ontogenia do HSA pode ser confirmada pela expressão de marcadores

endoteliais específicos, tais como CD31 e o fator von Willebrand (Fator VIII) (VON

BEUST et al., 1988; FERRER et al., 1995). Para caracterizar as células malignas LISS-

HSA como endoteliais, utilizou-se então esses anticorpos citados acima. Ambos

anticorpos possuem imunorreatividade conhecida em células endoteliais malignas de

cães (VON BEUST et al., 1988; FERRER et al., 1995). As células LISS-HSA

demonstraram forte imunorreatividade citoplasmática para o fator von Willebrand

(Figura 16 A) e moderada marcação citoplasmática para CD31 (Figura 16 B),

confirmando a origem endotelial dessas células.

Outro anticorpo utilizado foi o c-Kit (CD117). CD117 é um receptor de fatores de

células tronco e é normalmente expresso por células tronco hematopoiéticas

(OKSANEN, 1978). Já foi mostrado na literatura que tanto o HSA canino quanto o

angiossarcoma humano são oriundos de células endoteliais indiferenciadas e primitivas,

podendo ser identificados pela expressão de CD117 (MIETTINEN et al., 2000;

FOSMIRE et al., 2004). Como hematomas e hemangiomas são provenientes de células

endoteliais maduras e diferenciadas, eles não expressam CD117 (MIETTINEN et al.,

2000; FOSMIRE et al., 2004). As células LISS-HSA apresentaram marcação

citoplasmática difusa para CD117 indicando uma origem de células endoteliais

primitivas (Figura 16 C).

O anticorpo vimentina não é específico para células endoteliais, já que marca outras

células mesenquimais, tais como fibroblastos, melanócitos e linfócitos (IVASKAA et

al., 2007). As células LISS-HSA apresentaram forte marcação citoplasmática para a

vimentina (Figura 16 D), assim como esperado, já que células endoteliais tem origem

mesenquimal.

99

Figura 16: A - Fotomicrografia da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico imunomarcada com fator von Willebrand. B - Fotomicrografia da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico imunomarcada com CD31. C - Fotomicrografia da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico imunomarcada com CD117. D - Fotomicrografia da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico imunomarcada com vimentina.

100

Figura 17: Fotomicrografia do controle negativo da linhagem primária proveniente de um hemangiossarcoma mesentérico.

Como controle positivo para fator von Willebrand, CD31, CD117 e vimentina foi

utilizada a linhagem celular de HSA canino FROG (estabelecida pelo grupo do

Professor Dr. Jaime Modiano da Universidade de Minnesota) (LAMERATO-KOZICKI

et al., 2006; FOSMIRE et al., 2004; SCHAPPA et al., 2013; GORDEN, et al., 2014).

Para o controle negativo de fator von Willebrand, CD31, CD117 e vimentina, realizou-

se a omissão do anticorpo primário como mostrado na Figura 17.

A partir das marcações imunoistoquímicas observadas nas células LISS-HSA

podemos concluir o estabelecimento de uma nova linhagem celular canina de HSA a

partir de uma massa em mesentério.

4.3 Ploidia e ciclo celular

Com o intuito de avaliar a ploidia celular da linhagem estabelecida LISS-HSA foi

realizado o exame através de citometria de fluxo. Foi encontrado um perfil

hiperdiploide na amostra avaliada (DNA index = 2,488). Expostos abaixo estão os

dados de referência fornecidos pela BD Biosciences para análise de ploidia celular

(Quadro 10).

Através da quantificação de conteúdo de DNA, podemos notar que a linhagem de

HSA canino LISS-HSA apresentou uma proliferação celular ativa já que a maior parte

das células estava na fase S (síntese) do ciclo celular como mostrado na figura 18 B.

Quando comparada com o controle utilizando linfócitos de um cão saudável, nota-se

que os linfócitos encontram-se na fase G0/G1 do ciclo celular (Figura 18 A).

101

Quadro 10: Referência de valores estimados para análise de ploidia (BD Biosciences).

Figura 18: A - Histograma de citometria de fluxo evidenciando quantificação de conteúdo de DNA de linfócitos de um cão saudável que foi utilizado como controle. Linfócitos encontram-se na fase G0/G1 do ciclo celular. B - Histograma de citometria de fluxo evidenciando quantificação de conteúdo de DNA de linhagem de hemangiossarcoma canino LISS-HSA. Células neoplásicas encontram-se na fase S (síntese do DNA) do ciclo celular.

102

4.4 Microscopia eletrônica de transmissão

Com o intuito de avaliar as principais estruturas das células endoteliais neoplásicas

oriundas de um HSA canino foram iniciados os estudos morfológicos de ultraestrutura

nessa linhagem celular. Sabe-se que células endoteliais podem apresentar corpúsculos

de inclusão eletrodensos e limitados por membrana única chamados de corpúsculos de

Weibel-Palade (VALENTIJN et al., 2017; GALLAGHER, 1997). Essas organelas

possuem estrias longitudinais características, um diâmetro de 0,1-0,3 µm e 1-5 µm de

comprimento. Esses corpúsculos são organelas secretoras que possuem um formato de

charuto, como mostrado nas figuras 19 e 20, controlados pelas células endoteliais

(MICHAUX; CUTLER, 2004; VALENTIJN et al, 2008). Funcionam como locais de

armazenamento de diversas proteínas, sendo que a proteína de von Willebrand é a que

mais se destaca já que é essencial na adesão e ativação de plaquetas após lesão

endotelial, inflamação e angiogênese (GALLAGHER, 1997). A proteína de von

Willebrand é um pré-requisito para a existência de corpúsculos de Weibel-Palade

(VALENTIJN et al., 2017). O fator de von Willebrand também é produzido por

megacariócitos e plaquetas além das células endoteliais, sendo que no caso das

plaquetas estruturas semelhantes aos corpúsculos de Weibel-Palade também podem ser

encontradas (SPOM et al., 1985). Animais com deficiência do fator von Willebrand não

possuem esses corpúsculos e acabam desenvolvendo doenças hematológicas e

cardiovasculares (VALENTIJN et al., 2017; MICHAUX; CUTLER, 2004).

103

Figura 19 – Microscopia eletrônica de transmissão de células endoteliais HEK293 mostrando corpúsculos de von Willebrand. Fonte: Adaptado de MICHAUX; CUTLER, 2004. Legenda: A-C Morfologia ultraestrutural de corpúsculo de Weibel-Palade após expressão temporária de fator von Willebrand em células humanas embrionárias de rim HEK293. B – Seta mostrando formato alongado do corpúsculo de Weibel-Palade.

Figura 20: Microscopia eletrônica de transmissão de células endoteliais HUVEC. Fonte: Adaptado de VALENTIJN et al, 2008. Legenda: Microscopia eletrônica de transmissão mostrando diversos corpúsculos de Weibel-Palade dentro de células endoteliais HUVEC provenientes de veias umbilicais humanas.

104

As células LISS-HSA provenientes de um HSA canino foram fixadas em

glutaraldeído 2,5%, e submetidas ao protocolo de microscopia eletrônica de

transmissão. Secção corte fino foi submetida à coloração com azul de toluidina para

monitorar a área de corte da amostra como mostrado na figura 21. Imagens das células

LISS-HSA fixadas em resina e analisadas pela microscopia eletrônica de transmissão

foram obtidas no microscópio eletrônico de transmissão JEOL do Instituto de Ciências

Biomédicas I da Universidade de São Paulo (Figura 22). Através da eletromicrografia

comprovamos que a maioria das células LISS-HSA contém corpúsculos de Weibel-

Palade como mostrado nas figura 23.

Figura 21: Fotomicrografia da linhagem LISS-HSA proveniente de um hemangiossarcoma canino fixada com glutaraldeído e corada com azul de toluidina. A - Objetiva 40X. B – Objetiva 100X.

Figura 22: Eletromicrografia das células LISS-HSA provenientes de um hemangiossarcoma canino fixadas em resina e analisadas pela microscopia eletrônica de transmissão. A – 2500X, B – 6000X, C – 10000X.

105

Figura 23: Morfologia ultraestrutural de corpúsculo de Weibel-Palade das células LISS-HSA. A – Setas pretas evidenciando diversos corpúsculos de Weibel-Palade dentro das células endoteliais LISS-HSA (15000X), B – Seta branca evidenciando formato alongado do corpúsculo de Weibel-Palade da célula endotelial LISS-HSA (60000X).

4.5 Ensaios para determinação de citotoxicidade

4.5.1 Curva de crescimento de células de hemangiossarcoma canino

Com o intuito de estudar a proliferação celular nas células oriundas de HSA para a

determinação da quantidade e tempo adequados do crescimento celular para futuros

experimentos, escolhemos a técnica de incorporação pelo cristal violeta. Como

mostrado nas figuras abaixo (Figuras 24 e 25), essa técnica mostrou um aumento

crescente na leitura da densidade óptica ao longo dos 4 tempos (24, 48, 72 e 96 horas)

analisados e também com o maior número de células plaqueadas por poço. Quando a

linhagem LISS-HSA é comparada com as linhagens FROG e DD1, também é notado

um aumento crescente na leitura da densidade óptica nos 4 tempos analisados e com o

maior número de células plaqueadas por poço, porém um efeito bem mais discreto

evidenciando um tempo maior para o crescimento desse tipo celular (Figura 26).

Optamos por utilizar a quantidade de 1x104 células por poço nos ensaios subsequentes

ao invés de 2x104 células por poço para evitar uma confluência muito rápida levando a

morte celular independente do tratamento administrado.

106

Figura 24: Gráfico de crescimento celular na linhagem celular de hemangiossarcoma canino DD1 através da técnica de incorporação pelo cristal violeta. Aumento crescente na leitura da densidade óptica com o passar do tempo e com o maior número de células por poço.

Figura 25: Gráfico de crescimento celular na linhagem celular de hemangiossarcoma canino FROG através da técnica de incorporação pelo cristal violeta. Aumento crescente na leitura da densidade óptica com o passar do tempo e com o maior número de células por poço.

107

CRESCIMENTO CELULAR LISS-HSA

24 H

48 H

72 H

96 H

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.52 x 103células/poço5 x 103células/poço1 x 104células/poço2 x 104células/poço

TEMPO

DEN

SID

AD

E Ó

PTIC

A

Figura 26: Gráfico de crescimento celular na linhagem celular de hemangiossarcoma canino LISS-HSA através da técnica de incorporação pelo cristal violeta. Aumento discreto crescente na leitura da densidade óptica com o passar do tempo e com o maior número de células por poço.

4.5.2 Análise da viabilidade celular com ensaio de MTT após exposição inicial aos

agentes antineoplásicos utilizados isoladamente

Com o intuito de identificarmos uma melhor dosagem de trabalho para a indução da

citotoxicidade nas linhagens de HSA canino, escolhemos verificar a viabilidade celular

após a exposição a cada um dos agentes escolhidos (SAHA, AZA, Doxorrubicina).

Optou-se então pelo ensaio com MTT.

As linhagens celulares DD1, FROG e EMMA foram tratadas com 4 dosagens

diferentes de Doxorrubicina, 4 dosagens de SAHA e 4 dosagens de AZA, durante três

períodos de tempo (24, 48 e 72 horas). No tempo de 72 horas as duas maiores dosagens

de cada composto inibiram o crescimento em cultura e diminuíram a viabilidade celular

de maneira estatisticamente significativa (p < 0.05) de todas as linhagens, com exceção

de SAHA na linhagem celular EMMA (Figuras 27, 28 e 29). Como as maiores doses de

SAHA e AZA apresentaram a maior citotoxicidade, optamos por utilizar as

concentrações de 5 µM e 10 µM de ambas as drogas em ensaios seguintes.

108

27(A)

27(B)

27(C)

Figura 27: Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro na linhagem celular de hemangiossarcoma canino DD1 tratada com (A) Doxorrubicina, (B) 5-Azacitidina e (C) SAHA.

*** = P ≤ 0,001 ** = P ≤ 0,01 * = P ≤ 0,05

109

28(A)

28(B)

28(C)

Figura 28: Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro na linhagem celular de hemangiossarcoma canino FROG tratada com (A) Doxorrubicina, (B) 5-Azacitidina e (C) SAHA.

*** = P ≤ 0,001 ** = P ≤ 0,01 * = P ≤ 0,05

110

29(A)

29(B)

29(C)

Figura 29: Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro na linhagem celular de hemangiossarcoma canino EMMA tratada com (A) Doxorrubicina, (B) 5-Azacitidina e (C) SAHA.

*** = P ≤ 0,001 ** = P ≤ 0,01 * = P ≤ 0,05

111

4.5.3 Análise da viabilidade celular com ensaio de MTT após exposição aos agentes

antineoplásicos utilizados em combinação

Após a determinação do efeito citotóxico dos agentes antineoplásicos utilizados

isoladamente nas linhagens celulares de HSA canino e também do estabelecimento das

melhores dosagens de SAHA e AZA, assim como o melhor tempo de trabalho para

ensaios subsequentes, realizamos o ensaio de MTT combinando o quimioterápico

convencional Doxorrubicina com 5 dosagens diferentes de AZA ou SAHA para avaliar

se ocorreria uma potencialização do efeito citotóxico com a combinação. Ocorreu um

efeito citotóxico e também uma diminuição da viabilidade celular em relação ao

controle em todas as linhagens celulares de maneira estatisticamente significativa (p <

0.05) quando as drogas AZA e SAHA foram combinadas com todas as doses de

Doxorrubicina e também quando as mesmas foram utilizadas isoladamente com doses

superiores ou iguais a 5 µM. Como as linhagens celulares FROG e LISS são muito

sensíveis aos agentes antineoplásicos estudados, a viabilidade celular após o tratamento

diminuiu bastante, chegando a zero em alguns casos, não permitindo que

conseguíssemos fazer uma comparação entre o resultado da viabilidade celular de

SAHA e AZA utilizadas como agentes únicos com as drogas utilizadas em combinação.

Já nas linhagens EMMA e DD1 houve uma grande diminuição dos valores da

viabilidade celular de SAHA e AZA combinadas com as duas maiores dosagens de

Doxorrubicina quando comparadas com SAHA e AZA utilizadas isoladamente (Figuras

30 e 31).

112

Figura 30: Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro pelo teste de MTT nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino EMMA, DD1, LISS e FROG tratadas com as Doxorrubicina e 5-Azacitidina utilizadas isoladamente ou em combinação.

*** = P ≤ 0,001 ** = P ≤ 0,01 * = P ≤ 0,05

113

Figura 31: Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro pelo teste de MTT nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino EMMA, DD1, LISS e FROG tratadas com as Doxorrubicina e SAHA utilizadas isoladamente ou em combinação.

*** = P ≤ 0,001 ** = P ≤ 0,01 * = P ≤ 0,05

114

4.5.4 Análise da viabilidade celular com o teste de cristal violeta após exposição aos

agentes antineoplásicos utilizados em combinação

Ao analisarmos a viabilidade celular pelo teste do cristal violeta quando as

drogas AZA e SAHA foram combinadas com todas as doses de Doxorrubicina e

também quando as mesmas foram utilizadas isoladamente com doses superiores ou

iguais a 5 µM foi notado que houve um efeito citotóxico com diminuição da viabilidade

celular de maneira estatisticamente significativa (p < 0.05) em relação ao controle

(Figuras 32 e 33). No entanto, em nenhum dos tipos celulares houve uma grande

diferença da viabilidade celular entre os agentes antineoplásicos SAHA e AZA

utilizados isoladamente ou em combinação. De todas as linhagens celulares analisadas,

a EMMA foi a menos sensível às medicações enquanto que a FROG foi a mais sensível.

O ensaio de MTT e o teste de cristal violeta são testes colorimétricos

quantitativos que analisam a densidade celular e consequentemente a viabilidade celular

de maneiras diferentes. O cristal violeta consiste em verificar a densidade celular pela

coloração do DNA obtendo informação quantitativa sobre a densidade relativa de

células vivas aderidas em placas de cultura e o método MTT, verifica a capacidade que

as células viáveis possuem de clivar, no interior da mitocôndria, o sal tetrazólico MTT

em cristais de formazan, sendo estes cristais relacionados quantitativamente com o

número de células metabolicamente ativas (KUENG et al., 1989; MOSMANN, 1983).

Optamos por também analisar a viabilidade celular através do teste de cristal violeta

para verificarmos se conseguiríamos o mesmo resultado obtido com o ensaio de MTT.

Quando comparamos os gráficos do ensaio de MTT com os gráficos do teste de cristal

violeta, verificamos um efeito citotóxico com uma diminuição da viabilidade celular em

ambos os testes. Desta maneira, podemos concluir que através de duas metodologias

diferentes o mesmo efeito foi encontrado.

115

Figura 32: Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro pelo teste do cristal violeta nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino EMMA, DD1, LISS e FROG tratadas com as Doxorrubicina e 5-Azacitidina utilizadas isoladamente ou em combinação.

*** = P ≤ 0,001 ** = P ≤ 0,01 * = P ≤ 0,05

116

Figura 33: Ensaio de viabilidade celular e citotoxicidade in vitro pelo teste do cristal violeta nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino EMMA, DD1, LISS e FROG tratadas com Doxorrubicina e 5-Azacitidina utilizadas isoladamente ou em combinação.

117

4.5.5 Cálculo do IC50

Analisamos e determinamos o IC50 dos agentes antineoplásicos AZA, SAHA

e Doxorrubicina nas linhagens de HSA canino DD1, FROG e LISS-HSA (Quadro 11

e Figura 34). O IC50 no tempo de 72 horas foi atingido nas três linhagens. Ao

analisar os resultados do IC50 verificamos que as linhagens celulares de HSA canino

possuem diferentes sensibilidades aos compostos testados. A linhagem LISS-HSA

apresentou os menores valores de IC50 para todas as drogas testadas, indicando ser a

mais sensível, enquanto que os maiores valores foram encontrados na linhagem DD1,

mostrando ser a mais resistente. A Doxorrubicina apresentou o menor IC50 em todas

as linhagens, sugerindo ser a droga mais potente, enquanto que o maior IC50 foi

encontrado na linhagem DD1 com o uso de SAHA.

Quadro 11: Valores do IC50 da Doxorrubicina, SAHA e 5-Azacitidina nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino DD1, FROG e LISS-HSA.

118

Figura 34: Gráficos da análise de viabilidade celular utilizados para calcular o IC50 nas linhagens celulares de hemangiossarcoma canino DD1, FROG e LISS-HSA após a exposição aos agentes Doxorrubicina, 5-Azacitidina e SAHA testados isoladamente.

4.5.6 Avaliação de sinergismo

Após a determinação do IC50 dos agentes antineoplásicos AZA, SAHA e

Doxorrubicina nas linhagens de HSA canino DD1, FROG e LISS-HSA, foram

realizados ensaios de combinação entre a AZA e SAHA com a Doxorrubicina para

explorar potenciais efeitos de sinergismo na viabilidade celular das linhagens

estudadas. Chou e Talalay em 1983 introduziram o termo índice de combinação

[combination index (CI)] para quantificar o sinergismo, antagonismo ou ação aditiva

entre dois fármacos (CHOU, 2006). Através de uma fórmula criada por eles, CI < 1

indica sinergismo, CI = 1 indica ação aditiva e CI > 1 indica antagonismo (CHOU,

2006). Curvas de resposta dose-dependentes são criadas para cada fármaco utilizado

isoladamente e depois utilizadas para gerar curvas iso-efeitos, também conhecidas

como isobologramas (CHOU, 2006). Os valores dos CI entre os fármacos nas três

119

linhagens analisadas e seus isobologramas podem ser visualizados no Quadro 12 e

Figura 35, respectivamente.

Na linhagem DD1, a AZA e SAHA combinadas com a Doxorrubicina

mostraram sinergismo quando as drogas foram utilizadas com doses que inibem 90%

(IC90) e 97% (IC97) da proliferação celular, enquanto que quando foram usadas

doses que inibem 50% (IC50) e 75% (IC75) um efeito antagônico foi notado. Na

linhagem LISS-HSA, a combinação de AZA com a Doxorrubicina mostrou

sinergismo quando as drogas foram utilizadas com doses que inibem 75% (IC75),

90% (IC90) e 97% (IC97) da proliferação celular. Já quando as doses combinadas

inibiram 50% (IC50) da proliferação da linhagem celular LISS-HSA foi notado um

efeito de antagonismo. A combinação entre SAHA e Doxorrubicina nessa mesma

linhagem não evidenciou sinergismo em nenhuma das doses testadas e mostrou um

efeito de antagonismo entre as combinações. Na linhagem FROG, a combinação de

AZA com a Doxorrubicina mostrou sinergismo quando as drogas foram utilizadas

com doses que inibem 75% (IC75) e 97% (IC97). Já para a combinação de SAHA

com Doxorrubicina o sinergismo foi notado com doses que inibem 90% (IC90) e 97%

(IC97) da proliferação celular. Doses de AZA com a Doxorrubicina que inibem 50%

(IC50) e 90% (IC90) da proliferação celular e de SAHA com Doxorrubicina que

inibem 50% (IC50) e 75% (IC75) mostraram um efeito antagônico.

120

Quadro 12: Valores dos índices de combinação (CI) obtidos após tratamento com Doxorrubicina e 5-Azacitidina e Doxorrubicina e SAHA nas linhagens de hemangiossarcoma LISS-HSA, FROG e DD1. Valores de CI menores que 1 indicam sinergismo.

121

Figura 35: Isobologramas criados com o software Compusyn® mostrando relação entre a combinação de Doxorrubicina com 5-Azacitidina ou SAHA nas linhagens de hemangiossarcoma canino LISS-HSA (A), FROG (B) e DD1 (C).

122

4.5.7 Quantificação da metilação global do DNA

A combinação entre as doses mais altas testadas de AZA com a Doxorrubicina

em linhagens de HSA canino teve uma ação sinérgica, potencializando a ação

citotóxica de ambos os fármacos e consequentemente levando a uma diminuição

importante da viabilidade celular. A nossa hipótese é que a combinação entre essas

drogas leve a uma alteração da metilação global aumentando a citotoxicidade nas

linhagens de HSA canino estudadas. Realizou-se a quantificação da metilação global

de DNA em células de HSA canino, expressa como porcentagem (%) de 5-metil-2’-

desoxicitidina (5-metil-dC), utilizando o método HPLC antes e após o tratamento com

Doxorrubicina e AZA. O sistema analítico do HPLC não conseguiu quantificar a

metilação global devido ausência de DNA suficiente nas amostras analisadas.

Possivelmente grande parte das células não estava viável após o tratamento não

existindo material suficiente para a extração do DNA.

123

5 DISCUSSÃO

Atualmente existe um número limitado de linhagens de HSA canino e

angiossarcoma humano disponíveis para estudos. Na medicina veterinária, as

linhagens DEN-HSA, DD1, Dal-4, CHAD-G4.1, CHAD-G6.4, CHAD-B7.4, CHAD-

G8.2, CHAD-P9.5, MOCHA-HSA, FROG-HSA, SB-HSA e EMMA estão descritas

na literatura (FOSMIRE et al., 2004; THAMM et al, 2006; LAMERATO-KOZICKI

et al, 2006; GORDEN et al, 2014; AKHTAR et al, 2004). Já na literatura humana,

apenas as linhagens AS-M, ISO-HAS, HAEND e HAMON são mencionadas

(MASUZAWA et al, 1999; HOOVER et al, 1993; HOSHINA et al, 2013; KRUMP-

KONVALINKOVA et al, 2003). No presente estudo, estabeleceu-se uma linhagem

celular derivada de um HSA canino metastático para mesentério que foi designada

como LISS-HSA. A partir da imunorreatividade positiva dessa linhagem para CD31 e

fator von Willebrand, marcadores endoteliais específicos, e também pela detecção dos

corpúsculos de Weidel-Palade através da microscopia eletrônica de transmissão, que

são estruturas que armazenam a proteína de von Willebrand, confirmou-se a origem

endotelial dessas células (GALLAGHER, 1997; VALENTIJN et al, 2008; VON

BEUST et al., 1988; FERRER et al., 1995). Acrescidos a esses marcadores

imunocitoquímicos mencionados anteriormente, também foi notada a

imunorreatividade por CD117. Isso comprova que a linhagem LISS-HSA é derivada

de células endoteliais primitivas e indiferenciadas, já que formações provenientes de

células endoteliais maduras e diferenciadas, tais como hematomas e hemangiomas,

não expressam CD117 (MIETTINEN et al., 2000; FOSMIRE et al., 2004). Como uma

segunda parte da caracterização celular, foi realizada através da citometria de fluxo, o

estudo de ploidia e ciclo celular pela incorporação do iodeto de propídeo. Verificou-se

que a linhagem estabelecida era constituída de células hiperdiploides, demonstrando

um desequilíbrio no conteúdo do DNA nuclear, alteração já descrita como essencial

para a transformação maligna em diversos tipos de câncer (CORNELISSE et al, 1994;

GIARETTI et al, 2012). O processo de divisão celular desregulado está associado

com a carcinogênese (MUSGROVE et al, 2011; MOLCHADSKY et al, 2009). Em

tecidos normais e em tumores de baixo grau, aproximadamente 85% das células

encontram-se nas fases G0/G1 do ciclo celular e somente 15% das células estão

124

distribuídas na fase S (síntese do DNA) (FLEISIG; WONG, 2012). Na linhagem

LISS-HSA, notou-se um predomínio da distribuição das células na fase S do ciclo

celular. O comportamento agressivo do HSA canino e também as similaridades que

possui com o angiossarcoma humano faz com que o desenvolvimento de linhagens

oriundas de HSAs caninos seja de extrema importância para uma maior compreensão

da biologia celular e também para o avanço das terapias que tenham as células

endoteliais como alvo.

Nos últimos 20 anos as terapias sistêmicas disponíveis para o HSA canino não

evoluíram muito (GARDNER et al., 2015), sendo que mesmo realizando uma terapia

local agressiva seguida de quimioterapia adjuvante menos de 16% dos cães

sobrevivem 1 ano após o diagnóstico (SPANGLER; CULBERSTON, 1992;

SPANGLER; KASS, 1997; BROWN et al., 1985; PRYMAK et al., 1988; WOOD et

al., 1998; MOORE et al., 2017). Desta maneira, faz-se necessária a investigação de

novos medicamentos antineoplásicos. A metilação do DNA e a acetilação de histonas

são mecanismos epigenéticos primordiais que regulam a transcrição gênica

(BIANCOTTO et al, 2010; BENDER et al, 1998). Os inibidores de HD modulam a

estrutura da cromatina através da hiperacetilação de histonas afetando a transcrição de

genes supressores tumorais, enquanto que os inibidores de metiltransferase exercem

uma atividade de hipometilação das ilhas CpG que consequentemente leva a

desmetilação de genes supressores tumorais (BIANCOTTO et al, 2010; BENDER et

al, 1998; DUVIC, 2007; STRESEMANN; LYKO, 2008).

No estudo aqui relatado, os efeitos in vitro do antineoplásico inibidor de

metiltransferase, AZA, e o inibidor de HD, SAHA foram analisados em quatro

linhagens de HSA canino. Além disso, também foram analisados os efeitos

citotóxicos dessas medicações quando associadas à Doxorrubicina, um dos

quimioterápicos de eleição para o tratamento de HSA canino e angiossarcoma

humano (PENEL et al., 2011; PENEL et al., 2008; HAMMER et al., 1991; PAYNE et

al, 2003).

As dosagens iniciais utilizadas de AZA, SAHA e Doxorrubicina foram

escolhidas baseado no fato de que concentrações teciduais maiores que 10 µM

normalmente não são atingidas in vivo e também a partir de publicações relatando a

atividade desses agentes em diversas linhagens celulares neoplásicas humanas e

caninas (GRABARSKA et al, 2017; KISSEBERTH et al, 2008; MURAHARI et al,

125

2017; SRIVASTAVA et al, 2014; JIANG et al, 2014; PUNTA et al, 2017; MOTEGI

et al, 2013). O efeito de AZA, SAHA e Doxorrubicina nas linhagens de HSA canino

foi semelhante aos efeitos encontrados em linhagens de células neoplásicas humanas e

algumas caninas, no qual baixos valores de IC50 (em micromolar) foram encontrados

(GRABARSKA et al, 2017; KISSEBERTH et al, 2008; MURAHARI et al, 2017;

SRIVASTAVA et al, 2014; JIANG et al, 2014; PUNTA et al, 2017; MOTEGI et al,

2013). A partir da determinação do IC50, verificamos que a linhagem LISS-HSA

apresentou os menores valores para todas as drogas testadas, indicando ser a mais

sensível, enquanto que os maiores valores foram encontrados na linhagem DD1,

mostrando ser a mais resistente. Esses dados evidenciam a necessidade da utilização

de mais de uma linhagem celular para a comprovação dos efeitos das medicações

testadas, assim demonstrando a heterogeneidade presente nas diversas linhagens

celulares analisadas.

Evidenciou-se uma inibição no crescimento e viabilidade celular de maneira

dose-dependente quando as linhagens FROG, LISS-HSA e DD1 foram tratadas com

AZA, SAHA e Doxorrubicina isoladamente, com exceção de SAHA na linhagem

celular EMMA, confirmando a eficácia in vitro desses compostos na maioria das

linhagens de HSA canino. Assim como notado na linhagem celular EMMA, o estudo

de Kisseberth et al. (2008), mostrou que uma outra linhagem celular canina de

hemangiossarcoma (SB-HSA) também não respondeu ao tratamento com SAHA em

relação ao tratamento controle, mostrando ser mais resistente à essa terapia quando

comparada às linhagens DD1, FROG e LISS-HSA. Um fato interessante é que baixas

doses de AZA (< 1 µM) nas 4 linhagens aqui analisadas aparentaram causar um

aumento da viabilidade celular em relação ao controle. Esse resultado pode ser

explicado pelo efeito hormese (CALABRESE, 2005). O efeito hormese é

caracterizado por uma estimulação da proliferação celular variando em torno de 30-

60% acima do controle (CALABRESE, 2008). Esse efeito já foi documentado em 138

linhagens celulares dos mais diversos tipos de câncer induzido por mais de 120

agentes antineoplásicos (CALABRESE, 2005). É de extrema importância conseguir

detectar esse efeito, já que doses baixas subletais poderiam potencializar o tumor em

pacientes.

A indução de quimiorresistência em um tumor representa umas das principais

causas de insucesso no tratamento contra o câncer. Sabe-se que alterações

126

epigenéticas que levam ao silenciamento de genes supressores tumorais, tais como a

metilacão do DNA e o remodelamento da cromatina, estão implicadas como um dos

fatores de indução de resistência à quimioterápicos convencionais em tumores sólidos

(PLUMB et al., 2000). Diversos estudos mostram que a associação entre um inibidor

de HD ou inibidor de metiltransferase com agentes que tem ação específica no DNA,

tais como inibidores de topoisomerases (Doxorrubicina), agentes alquilantes

(Cisplatina) e antimetabólitos (5-Fluoracil), pode levar a um efeito sinérgico através

da diminuição da quimiorresistência em diversos tipos de linhagens celulares

(STIBOROVA e al., 2012). Através da ação sinérgica entre fármacos muitas vezes

pode-se manter a mesma eficácia dos medicamentos, porém utilizando uma dose

reduzida e consequentemente diminuindo sua toxicidade no paciente (THAMM et al,

2012). Além disso, mesmo sem a diminuição das doses dos agentes antineoplásicos

pode ocorrer um aumento do efeito terapêutico devido a utilização de fármacos que

tenham diferentes mecanismos de ação e de resistência (THAMM et al, 2012; CHOU,

2006). Após a confirmação do efeito citotóxico dos agentes antineoplásicos utilizados

isoladamente nas linhagens celulares de HSA canino, foram realizados ensaios de

combinação entre a AZA e SAHA com a Doxorrubicina para explorar potenciais

efeitos de sinergismo na viabilidade celular das linhagens estudadas. A combinação

entre as doses (Quadro 8) mais altas testadas de AZA ou SAHA com a Doxorrubicina

em linhagens de HSA canino teve uma ação sinérgica, potencializando a ação

citotóxica de ambos os fármacos e consequentemente levando a uma diminuição

importante da viabilidade celular. Estudos mostram que o efeito sinérgico entre esses

antineoplásicos pode ocorrer devido alterações na estrutura da cromatina, ativação de

apoptose, desorganização da membrana mitocondrial e inibição de mecanismos de

reparo (VALDEZ et al, 2011; VALDEZ et al, 2016).

Em contrapartida, quando doses mais baixas (Quadro 8) de AZA e SAHA

associadas à Doxorrubicina foram utilizadas foi notada uma menor eficácia e até

presença de antagonismo. Demonstrou-se que inibidores de HD podem causar uma

super expressão de genes das superfamílias de transportadores, tais como o MDR1,

levando a expulsão de fármacos através de bombas de efluxo após penetração em

membrana plasmática (VALDEZ et al, 2016). Como o gene MDR1 é sabidamente

conhecido por catalisar a extrusão de antineoplásicos classificados como

antraciclinas, grupo no qual a Doxorrubicina pertence, especula-se que esse seja o

mecanismo relacionado com o antagonismo encontrado nas linhagens de HSA canino

127

tratadas com SAHA e Doxorrubicina (VALDEZ et al, 2016). Em um estudo mais

antigo utilizando uma linhagem celular humana de leucemia, averiguou-se que

dependendo do momento em que a combinação entre Doxorrubicina e AZA é

instituida tanto resultados positivos quanto negativos podem ser detectados

(PRESANT et al, 1981). Present et al. (1981) mostrou que quando a Doxorrubicina

foi administrada simultaneamente com a AZA houve um efeito antagônico, mas

quando a Doxorrubicina foi administrada separadamente com um intervalo de horas

com a AZA houve um efeito aditivo. O tratamento simultâneo com baixas doses de

AZA e Doxorrubicina nas linhagens de HSA canino pode ter influenciado e

prejudicado a absorção de um ou dos dois fármacos, podendo assim ter contribuído

com o antagonismo nessas células. Assim como mencionado anteriormente, o efeito

hormese também poder ter desempenhado um papel significativo no antagonismo

encontrado (CALABRESE, 2005). Os resultados acima mencionados revelam a

importância de uma melhor compreensão das interações medicamentosas entre

terapias epigenéticas e quimioterápicos convencionais.

Em síntese, a análise in vitro de AZA, SAHA e Doxorrubicina em linhagens

de HSA canino justifica que as terapias epigenéticas em conjunto com

quimioterápicos convencionais continuem sendo investigadas e podendo futuramente

ser consideradas em cães que desenvolvem naturalmente o HSA e consequentemente

contribuindo com informações fundamentais para estudos clínicos em humanos.

Perspectivas futuras desse estudo incluem uma melhor verificação dos possíveis

mecanismos pelos quais ocorre o sinergismo ou antagonismo com a combinação de

Doxorrubicina com SAHA ou AZA. Faz-se necessária a determinação da acetilação e

metilação global após exposição das linhagens de HSA canino aos fármacos

antineoplásicos de interesse.

128

6 CONCLUSÃO

A partir das informações discutidas acima, conclui-se que:

1) Estabeleceu-se uma linhagem primária de HSA canino a partir de uma metástase

para mesentério, contribuindo com estudos posteriores que desejem compreender

melhor a biologia desse tipo tumoral.

2) As linhagens celulares de HSA canino possuem sensibilidades diferentes às

terapias aplicadas in vitro. A DD1 foi considerada a mais resistente e a LISS-HSA a

mais sensível demonstrando a heterogeneidade presente nas linhagens celulares.

3) Houve uma diminuição da viabilidade celular quando os fármacos AZA, SAHA e

Doxorrubicina foram utilizados isoladamente nas linhagens de HSA canino,

comprovando a eficácia in vitro desses compostos.

4) Os ensaios de combinação entre a AZA e SAHA utilizadas com altas dosagens

com a Doxorrubicina induziram um efeito sinérgico e potencializaram a destruição de

células de HSA justificando mais estudos futuros para que novas terapias sejam

exploradas nesse tipo neoplásico.

5) O antagonismo foi verificado quando dosagens baixas de AZA e SAHA associadas

à Doxorrubicina foram utilizadas nas linhagens de HSA canino, mostrando a

necessidade de maior investigação e descoberta dos mecanismos envolvidos com as

interações medicamentosas entre terapias epigenéticas e quimioterápicos

convencionais.

129

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8 CONCLUSÕES GERAIS Diante dos resultados expostos nos capítulos anteriores podemos concluir que:

• Apesar dos demais esforços, o prognóstico de cães diagnosticados com HSA

visceral continua ruim. Cães diagnosticados com HSA esplênico apresentaram

prognóstico discretamente melhor do que cães com HSAs localizados em outros

sítios primários. O uso de Doxorrubicina aumentou a sobrevida dos pacientes

estudados.

• Os HSAs de baço e pele em cães apresentaram hipometilação global do DNA.

Nos HSAs de derme, esse padrão de hipometilação foi associado com um maior

índice de proliferação.

• Estabelecemos e caracterizamos com sucesso uma cultura primária de HSA

canino denominada de LISS-HSA. A partir da imunorreatividade positiva para

fator von Willebrand e CD31 somada à avaliação ultraestrutural com detecção

de corpúsculos de Weidel-Palade, comprovamos que as células em cultivo eram

de fato células endoteliais. A análise do ciclo e ploidia celular revelaram que as

células tumorais estavam na fase S do ciclo e que eram predominantemente

hiperdiploides. Comprovamos também, através de marcação imunoistoquímica

por CD117, que LISS-HSA é derivada de células endoteliais primitivas e

indiferenciadas.

• As linhagens de HSA canino estudadas: LISS-HSA, FROG, DD1 e EMMA

possuem sensibilidades diferentes às terapias aplicadas in vitro. A DD1 foi

considerada a mais resistente enquanto que a LISS-HSA foi a mais sensível.

Confirmou-se a eficácia in vitro dos compostos antineoplásicos AZA, SAHA e

Doxorrubicina em cultura celular de HSA canino. O uso de altas dosagens de

SAHA ou AZA concomitantemente com a Doxorrubicina induziu um efeito

sinérgico, enquanto que baixas doses promoveram um efeito antagônico nas

linhagens de HSA canino estudadas.

karen batschinski avaliação da eficácia da 5-azacitidina e

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