KARAKTERISASI MOLEKULER BAKTERI ISOLAT LOKAL

TERPILIH ASAL LIMBAH SINGKONG DENGAN METODE 16S rRNA

(Skripsi)

Oleh

Widya Kusuma

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2019

ABSTRACT

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF LOCAL ISOLATE BACTERIA

SELECTED FROM CASSAVA WASTE WITH 16S rRNA METHOD

By

Widya Kusuma

Lampung province has a number of cassava production at 7,384,084 tons. The

increasing of cassava production related to the increase in cassava waste

automatically. Indirectly one of the main waste of cassava industry is cassava peel.

Cassava peel consists of components such as cellulose and amylum, so that, this

material could be as a medium for bacterial growth such as cellulolytic and

amylolytic bacteria. This research aims to characterize the molecular of local

isolate bacteria that selected in cassava waste indigenously, conducted by 16S

rRNA method and identify the type or species through phylogenetic analysis. The

results of DNA isolation obtained DNA from cell culture of SCWB1 and SCWB17

were 33.9 ng/µl and 218 ng/µl respectively. The purity of isolated DNA was

examined by comparing absorbance of λ260/280 and λ260/230. Our result show

that the value of comparison for SCWB1 were 2,061 and 2,519, since for SCWB17

were 1,904 and 1,585 respectively. Amplicons appear for both of isolates had DNA

fragment at ± 1500 bp. Based on BLAST analysis on NCBI and phylogenetic tree

construction it was noted that SCWB1 isolates have a percent identity of 97.73%

connected to Bacillus cereus strains IAM 12605 and SCWB17 isolates has a

percent identity of 97.90% connected to Klebsiella variicola strains F2R9.

Keywords: Cassava waste, 16S rRNA, Bacillus cereus, Klebsiella variicola

ABSTRAK

KARAKTERISASI MOLEKULER BAKTERI ISOLAT LOKAL

TERPILIH ASAL LIMBAH SINGKONG DENGAN METODE 16S rRNA

Oleh

Widya Kusuma

Provinsi Lampung memiliki angka produksi singkong sebesar 7.384.084 ton.

Meningkatnya produksi singkong menyebabkan peningkatan pada jumlah limbah

singkong. Limbah utama dari industri singkong adalah kulit singkong. Kulit

singkong mengandung komponen seperti selulose dan amilum, sehingga dapat

dijadikan suatu media bagi pertumbuhan bakteri seperti bakteri selulolitik dan

amilolitik. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi molekuler isolat lokal

terpilih asal limbah singkong indigenous yang dilakukan dengan metode 16S

rRNA dan ditentukan jenis atau spesiesnya melalui analisis filogenetik. Hasil

isolasi DNA menunjukkan bahwa isolat SCWB1 memiliki konsentrasi sebesar

33,9 ng/µl dan isolat SCWB17 memiliki konsentrasi sebesar 218 ng/µl. Hasil

kemurnian DNA dari isolat SCWB1 adalah 2,061 pada λ260/280 dan 2,519 pada

λ260/230. Sementara pada isolat SCWB17 diperoleh hasil yaitu 1,904 pada

λ260/280 dan 1,585 pada λ260/230. Amplikon menunjukkan bahwa kedua isolat

memiliki fragmen DNA yang berukuran ± 1500 bp. Berdasarkan analisis BLAST

pada situs NCBI dan konstruksi pohon filogenetik dapat disimpulkan bahwa isolat

SCWB1 memiliki nilai percent identity 97,73% terhadap Bacillus cereus strain

IAM 12605 dan isolat SCWB17 memiliki nilai percent identity 97,90% terhadap

Klebsiella variicola strain F2R9.

Kata kunci : Limbah singkong, 16S rRNA, Bacillus cereus, Klebsiella variicola

KARAKTERISASI MOLEKULER BAKTERI ISOLAT LOKAL TERPILIH

ASAL LIMBAH SINGKONG DENGAN METODE 16S rRNA

Oleh

WIDYA KUSUMA

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar

SARJANA SAINS

Pada

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Lampung

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2019

RIWAYAT HIDUP

Penulis bernama lengkap Widya Kusuma dan dilahirkan di

Tulang Bawang pada tanggal 4 Februari 1997. Penulis

merupakan anak kedua dari tiga bersaudara dari pasangan

Bapak Untung Supriyono (Alm) dan ibu Esti Karyani.

Penulis beralamat di Jl. KS Tubun No. 38 Rawa Laut,

Bandar Lampung.

Penulis memiliki jenjang pendidikan diawali dari Taman Kanak-Kanak (TK)

ABA Aisyiyah Purbolinggo dan lulus pada tahun 2003. Kemudian melanjutkan

pendidikan di Sekolah Dasar (SD) Negeri 3 Taman Fajar dan lulus pada tahun

2009. Lalu melanjutkan pendidikan di Sekolah Menengah Pertama (SMP) Negeri

1 Purbolinggo dan lulus pada tahun 2012. Selanjutnya melanjutkan pendidikan

di Sekolah Menengah Kejuruan (SMK) SMTI (Sekolah Menengah Teknologi

Industri) Bandar Lampung dan lulus pada tahun 2015. Pada tahun 2015, penulis

terdaftar sebagai mahasiswi Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Lampung melalui jalur Seleksi Bersama

Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SBMPTN) dan merupakan salah satu penerima

beasiswa BIDIKMISI angkatan ke enam Universitas Lampung dan berhasil

menyelesaikan S1 pada tahun 2019.

Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia

Dasar I dan Kimia Dasar II Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Pada

bulan januari 2018, penulis melaksanakan Praktik Kerja Lapangan (PKL) di Balai

Pengujian Mutu dan Sertifikasi Produk Hewan (BPMSPH) Bogor dengan judul

“Identifikasi Spesies Babi (Pork) Pada Kornet Menggunakan Metode Cepat

(Rapid Test), Metode Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), dan

RealTime-PCR (Polymerase Chain Reaction)”. Penulis juga melaksanakan

Kuliah Kerja Nyata (KKN) selama 32 hari di Desa Jaya Murni, Kecamatan

Gunung Agung, Kabupaten Tulang Bawang Barat pada bulan Juli-Agustus tahun

2018. Penulis juga aktif dalam organisasi yang dimulai dengan menjadi anggota

Garuda BEM FMIPA tahun 2015, Kader Muda Himaki (KAMI) tahun 2015,

anggota Bidang Sosial Masyarakat (SOSMAS) Himaki FMIPA Unila tahun 2016,

dan menjadi anggota PSLH BEM FMIPA Unila tahun 2016 serta penulis kembali

menjadi anggota Bidang Sosial Masyarakat (SOSMAS) Himaki FMIPA Unila

periode 2017.

Motto

"Sesungguhnya Allah tidak akan mengubah nasib suatu kaum hingga mereka

mengubah diri mereka sendiri” (QS. Ar-Ra’d:11)

“Life is a choice, but trust in God's will ” (Widya Kusuma)

“Maka sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan. Maka apabila engkau

telah selesai (dari suatu urusan), tetaplah bekerja keras (untuk urusan yang lain),

dan hanya kepada tuhanmulah engkau berharap”

(QS. Al-Insyirah 6-8)

“Allah tidak membebani seseorang itu melainkan sesuai dengan kesanggupannya”

(QS. Al-Baqarah: 286)

"Dan boleh jadi kamu membenci sesuatu tetapi ia baik bagimu, dan boleh jadi

kamu menyukai sesuatu tetapi ia buruk bagimu, dan Allah mengetahui dan

kamu tidak mengetahui“

(QS. Al-Baqarah:216)

“Bila kau tak tahan lelahnya belajar, maka kau harus tahan menanggung perihnya

kebodohan”

(Imam Syafi’i)

Dengan menyebut nama Allah yang Maha pengasih

lagi Maha penyayang

Puji syukur kepada Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga

terciptalah sebuah karya tulis sederhana ini yang kupersembah kan untuk :

Orang tuaku

Bapak Untung Supriyono (Alm) dan Ibu Esti Karyani serta Bapak Hadi tersayang,

Terimakasih atas segala cinta, kasih sayang, dukungan, kekuatan serta pengorbanan yang

selalu diberikan dalam setiap langkahku untuk meraih kesuksesan dalam hidup ini.

Terimakasih atas kebahagiaan yang telah diberikan selama ini, karena doa yang tiada henti

dari kalianlah aku bisa berdiri sampai titik ini.

Saudara-Saudaraku tersayang,

Kakakku Savela Utari dan adikku M. Aryono Siraj tersayang, yang selalu mendukung dan

mendoakanku, serta memberikan kekuatan padaku, sehingga aku bisa sampai pada titik ini.

Keluarga besarku yang selalu mendoakan kesuksesan dan keberhasilanku.

Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si., Bapak Dr. Eng. Heri Satria, M.Si., dan Bapak Andi Setiawan, Ph.D., yang telah membimbing dan memeberikan ilmu kepada penulis selama

mengerjakan penelitian dan skripsi, serta Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia

FMIPA Unila yang telah memberikan ilmu pengetahuan dan dukungan kepada

penulis.

Seluruh sahabat dan teman-teman yang telah mengajarkan arti kebersamaan, kekeluargaan, dan kebahagiaan.

Almamater Tercinta Universitas Lampung

SANWACANA

Alhamdulillahhirabbilalamiin, puji syukur penulis ucapkan atas kehadirat Allah

SWT karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Karakterisasi Molekuler Bakteri Isolat Lokal Terpilih Asal

Limbah Singkong Dengan Metode 16S rRNA” sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Sains pada program studi Kimia FMIPA Universitas

Lampung.

Sholawat serta salam tak lupa penulis ucapkan kepada suri tauladan Nabi

Muhammad SAW beserta para sahabat dan keluarganya, semoga kita termasuk

umatnya yang mendapat syafa’at beliau di yaumilakhir kelak, Aamiin.

Penyusunan skripsi ini telah terselesaikan dengan baik berkat bantuan dan

dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini izinkanlah penulis

menghaturkan ucapan terima kasih. Jazakumullahu Khairan Katsiran Wa

Jazakumullah Ahsanal Jaza kepada:

1. Orang tuaku, Bapak Untung (Alm), Bapak Hadi dan ibu Esti tercinta serta

mbah ibu dan mbah kung (Alm) atas kasih sayang, dukungan, bantuan, doa,

dan segala pengorbanan yang telah diberikan kepada penulis, semoga Allah

senantiasa melimpahkan segala kebaikan kepada kalian, Aamiin yarobbal

alamiin.

2. Kakakku Savela Utari dan adikku Muhammad Aryono Siraj yang telah

memberikan dukungan, kasih sayang, doa, dan canda tawa yang mengisi hari-

hariku saat suka maupun duka.

3. Keluarga keduaku Bulek Yanti, Om Ika, Nadya dan Ganta, serta Bude sri, Pak

Santoso, mba Atid, dan mas Seno yang telah memberikan bantuan, dukungan,

doa, kasih sayang, dan segala pengorbanan untuk penulis.

4. Keluarga besar penulis yang tak pernah berhenti mendukung dan memberikan

doa sehingga menjadi semangat tersendiri bagi penulis.

5. Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si., selaku pembimbing 1 yang telah dengan sabar

memberikan ilmu, membimbing, memberikan nasihat, serta kritik dan saran

yang membangun bagi penulis dalam menyelesaikan penulis dalam

menyelesaikan skripsi ini.

6. Bapak Dr. Eng. Heri Satria, M.Si., selaku pembimbing II yang dengan sabar

memberikan ilmu, membimbing, memberikan nasihat, serta kritik dan saran

yang membangun bagi penulis dalam menyelesaikan penulis dalam

menyelesaikan skripsi ini.

7. Bapak Andi Setiawan, Ph.D., selaku pembahas dalam penelitian yang telah

memberikan ilmu, nasehat, kritik dan saran kepada penulis sehingga skripsi ini

dapat terselesaikan dengan baik.

8. Bapak Mulyono, Ph.D., selaku pembimbing akademik yang telah memberikan

bimbingan, bantuan serta nasehat kepada penulis.

9. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T., selaku ketua Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

10. Bapak dan ibu Dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung yang telah

memberikan ilmu pengetahuan dan dukungan kepada penulis.

11. Bapak Drs. Suratman, M.Sc., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

12. Bapak Wawan A. Setiawan, M.Si., dan mba Maria Bramastri Susilo, S.Si.,

yang telah membantu dan membimbing seta memberikan ilmu selama proses

penelitian berlangsung.

13. Segenap staff dan karyawan Jurusan Kimia dan FMIPA Universitas Lampung,

khususnya Pak Gani dan mba Monic atas segala bantuan yang telah diberikan

kepada penulis.

14. Kepala dan segenap staff serta karyawan Unit Pelayanan Teknis Laboratorium

Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung atas segala

bantuan yang telah diberikan kepada penulis.

15. Seluruh guru-guruku dari TK, SD, SMP, dan SMA atas segala ilmu,

pengalaman, nasehat dan motivasi yang diberikan kepada penulis.

16. Somplaak-ku tercinta, Meitri Ayu Ningrum, S.Si., Yesi Oktiara Kasih, S.Si.,

Dira Avista, S.Si., Elsina’Azmi, S.Si., Meynisa Zunaidar, S.Si., Fatry Sinjia,

S.Si., Nur Wulandari, S.Si., Hani Chintia Ramadani, S.Si., dan Zuwita

wulandari, S.Si., Terimakasih karena telah memberikan arti pertemanan yang

sesungguhnya, terimakasih atas segala rasa yang telah diberikan, kita akan

selalu terikat satu sama lain kapanpun dan dimanapun kita berada.

17. CCA-ku tercinta, Meitri Ayu Ningrum, S.Si., Dira Avista, S.Si., Intan

Tsamrotul Fu’adah, S.Si., Sri Budi Asih, S.Si., Alifa Dyah Savira, S.Si., Nadya

Syarifatul Fajriah, S.Si., Aulia Yulanda, S.Si., Nurmala, S.Si., dan Tri Agus

18. Wijayanti, S.Si., Terimakasih karena telah memberikan arti pertemanan yang

sesungguhnya, terimakasih atas segala rasa yang telah diberikan, kita akan

selalu terikat satu sama lain kapanpun dan dimanapun kita berada.

19. Nurhasanah Squad 2015, Meitri Ayu Ningrum, S.Si., Viky Dila Cahyani, S.Si.,

Intan Tsamrotul Fu’adah, S.Si., dan Siwi Meutia Sadewi, S.Si., Terimakasih

atas bantuan, doa, kritik dan saran serta suka dan duka yang telah diberikan

kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian dan skripsi ini.

20. Cassava Squad 2015, Melina Putri Ahmad, S.Si., Widya Susanti, S.Si., Rani

Fitria, S.Si., Dwi Nurhayati, S.Si., Desi Damayanti, S.Si., dan Uhti Alaika,

S.Si., Terimakasih atas bantuan, doa, kritik dan saran serta suka dan duka yang

telah diberikan kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian dan skripsi ini.

21. Biokim Research 2014, 2015, dan 2016 khusunya Leony Fransiska, S.Si.,

Asrul Fanani, S.Si., dan Angga Hidayatullah Eza, S.Si., terimakasih atas segala

bantuan dan dukungannya untuk penulis selama proses penelitian berlangsung.

22. LTSIT Research khususnya Jevi Muhammad Anwar dan Oklis Syahrin Wijaya

yang telah banyak membantu saat proses penelitian berlangsung.

23. Keluarga Chem15try Unila khususnya Kelas C, terimakasih atas

kebersamaannya selama penulis menempuh pendidikan di jurusan kimia.

24. Keluarga Besar Mahasiswa Kimia angkatan 2011, 2012, 2013, 2014, 2015,

2016, 2017, 2018,dan 2019, atas kebersamaan dan kekeluargaan yang terjalin

selama ini.

25. Teman-teman Kuliah Kerja Nyata (KKN) Jaya Murni, Gunung Agung, Tulang

Bawang Barat, yang telah memberikan doa dan dukungan kepada penulis.

26. Keluarga SMK SMTI Bandar Lampung khusunya Kimia Industri I, terimakasih

atas segala doa dan dukungannyayang telah diberikan selama ini kepada

penulis.

27. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang secara tulus

dan ikhlas memberikan bantuan moril dan materil kepada penulis.

28. Almamaterku tercinta, Universitas Lampung.

Terimakasih atas segala bantuan yang telah diberikan, semoga ALLAH SWT

membalasnya dan menjadi ladang pahala bagi kita semua, Aamiin. Penulis

menyadari bahwa masih banyak terdapat kekurangan dalam skripsi ini, namun

penulis berharap skripsi ini bermanfaat bagi rekan-rekan khususnya mahasiswa

kimia dan pembaca pada umumnya.

Bandar Lampung, Desember 2019

Penulis

Widya Kusuma

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL .................................................................................................iii

DAFTAR GAMBAR .............................................................................................iv

I. PENDAHULUAN..........................................................................................1

A. Latar Belakang ...........................................................................................1

B. Tujuan Penelitian .......................................................................................4

C. Manfaat Penelitian .....................................................................................4

II. TINJAUAN PUSTAKA................................................................................6

A. Singkong ....................................................................................................6

B. Bakteri Selulolitik ......................................................................................6

C. Bakteri Amilolitik ......................................................................................7

D. Isolasi DNA ...............................................................................................8

E. Identifikasi Molekuler................................................................................9

F. Polymerase Chain Reaction (PCR) .......................................................... 12

G. Sekuensing ................................................................................................16

H. Analisis Filogenetik .................................................................................18

I. Program MEGA7 .....................................................................................20

ii

III. METODE PENELITIAN............................................................................22

A. Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................22

B. Alat dan Bahan.........................................................................................22

C. Prosedur Kerja..........................................................................................23

a. Pembuatan Media Kultur Cair. . ...........................................................23

b. Isolasi DNA..........................................................................................23

c. Analisis Kemurnian Hasil Isolasi DNA...............................................25

d. Amplifikasi Gen 16S rRNA ................................................................25

e. Penentuan Urutan DNA (Sekuensing)..................................................26

f. Analisis Filogenetik..............................................................................26

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................29

A. Ekstrak DNA..........................................................................................29

B. Kemurnian Ekstrak DNA .......................................................................30

C. Amplikon Fragmen Gen 16S rRNA.......................................................32

D. Urutan Nukleotida Fragmen Gen 16S rRNA......................................34

E. Pohon Filogenetik..................................................................................39

V. SIMPULAN DAN SARAN.........................................................................45

A. Simpulan...................................................................................................45

B. Saran ........................................................................................................46

DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................47

LAMPIRAN ........................................................................................................52

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. RNA Ribosomal pada prokariot.….................................................................10

2. Primer Universal 16S rRNA...........................................................................13

3. Hasil Nanophotometer....................................................................................31

4. PCR Mix Solution...........................................................................................32

5. Tahapan PCR…..............................................................................................33

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Struktur 16S rRNA .........................................................................................11

2. Siklus Amplifikasi ..........................................................................................16

3. Tampilan Pohon Filogenetik ..........................................................................20

4. Tampilan Menu MEGA7................................................................................21

5. Bagan Alir Penelitian.......................................................................................28

6. Elektroforegram Hasil Amplifikasi Fragmen gen 16S rRNA.........................34

7. Urutan Basa Nukleotida Gen 16S rRNA SCWB1..........................................36

8. Urutan Basa Nukleotida Gen 16S rRNA SCWB17........................................36

9. Hasil BLASTn SCWB1...................................................................................37

10. Hasil BLASTn SCWB17.................................................................................38

11. Alignment menggunakan Program ClustalW..................................................40

12. Pohon Filogenetik SCWB1 dengan Metode Neighbor Joining......................41

13. Pohon Filogenetik SCWB17 dengan Metode Neighbor Joining....................42

I. PENDAHULUAN

A. Latar belakang

Singkong adalah salah satu tanaman yang banyak terdapat di Indonesia.

Berdasarkan data dari Badan Pusat Statistik Tahun 2016, Provinsi Lampung

memiliki angka produksi singkong sebanyak 7.384.084 ton pada tahun 2015

(Badan Pusat Statistik, 2016). Peningkatan produksi singkong di dunia

industri secara tidak langsung akan berhubungan dengan peningkatan limbah

singkong. Limbah singkong yang dihasilkan dapat berupa padatan maupun

cairan, misalnya kulit singkong, onggok, dan limbah tapioka.

Limbah utama dari industri singkong adalah kulit singkong. Kulit singkong

mengandung beberapa komponen yaitu selulosa 43,626%, pati/amilum

36,58%, hemiselulosa 10,384%, lignin 7,646%, dan komponen lainnya 1,762%

(Artiyani, 2011). Adanya kandungan tesebut menyebabkan kulit singkong

dapat dijadikan suatu media bagi pertumbuhan bakteri seperti bakteri

selulolitik dan amilolitik.

Beberapa penelitian terkait keberadaan mikroba pada limbah kulit singkong

sudah dilakukan oleh Makkadafi dkk. (2017), yang menunjukkan bahwa

terdapat satu spesies bakteri selulolitik yaitu Bacillus subtilis yang berhasil

2

diidentifikasi menggunakan metode uji hidrolisis dengan menentukan indeks

hidrolisisnya. Begitu juga pada penelitian yang dilakukan oleh Hanzen dkk.

(2017), terdapat 4 spesies bakteri amilolitik dari limbah kulit singkong yaitu

Bacilus circulans, Bacilus subtilis, Bacilus coagulans, dan Pseudomonas

aeruginosa yang diidentifikasi menggunakan pengukuran indeks hidrolisis.

Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan 2 pendekatan, yaitu secara

konvensional dan molekuler. Menurut Petti et al. (2005), proses identifikasi

bakteri secara konvensional berdasarkan karakter fenotip bakteri seperti

pewarnaan gram, morfologi koloni, dan aktivitas enzim seringkali tidak

bersifat statis dan dapat berubah seiring dengan adanya evolusi. Kesalahan

identifikasi sering terjadi karena hadirnya karakteristik fenotip bakteri yang

tidak biasa ataupun kurangnya pengalaman dalam menginterpretasikan data

karakter fenotip.

Untuk mengatasi permasalahan tersebut, digunakan metode identifikasi

secara molekuler menggunakan gen 16S rRNA atau biasa disebut juga

sebagai uji genotip. Selain itu, uji genotip memiliki banyak keuntungan

diantaranya lebih mudah, lebih valid dan lebih cepat. Identifikasi secara

molekuler ini dapat dilakukan juga untuk mempelajari adanya keragaman

genetik dari suatu lingkungan lebih detil karena mikroba yang tidak dapat

dikulturkan pun dapat diperoleh gen 16S-rRNA-nya. Urutan yang lebih

conserved (lestari) dapat digunakan untuk menghasilkan pohon filogenetik

yang lebih diskriminatif sehingga dapat membagi organisme ke dalam tiga

domain, yaitu Archaea, Bacteria, dan Eucarya (Amann et al., 1994).

3

Sehingga identifikasi urutan nukleotida yang didasarkan pada gen 16S rRNA

dapat digunakan untuk menentukan hubungan kekerabatan bakteri

berdasarkan konstruksi pohon filogenetiknya dan untuk mengidentifikasi

bakteri yang belum diketahui jenisnya. Selain itu, database tentang bakteri

berdasarkan identifikasi 16S rRNA sudah banyak sehingga memudahkan

dalam pembandingan (Koonin, 2003).

Beberapa penelitian yang telah dilakukan dalam mengidentifikasi bakteri

menggunakan teknik 16S rRNA yaitu dilakukan oleh Sabbathini dkk. (2017),

yang berhasil mengetahui spesies tiap isolat bakteri endofit dari daun tanaman

padi menggunakan metode PCR pada gen 16s rRNA. Pada penelitian ini

diperoleh 15 isolat dari daun padi dan setelah dilakukan identifikasi

molekuler 16S rRNA bakteri, terdapat empat isolat yang menunjukkan

kemiripan dengan genus Sphingomonas. Begitu juga dengan penelitian yang

dilakukan oleh (Harun, 2018) diperoleh isolat IROD5 yang dapat tumbuh

dalam media Skim Milk Agar dan memiliki potensi menghasilkan protease

yang diidentifikasi secara molekuler menggunakan fragmen gen 16S rRNA.

Berdasarkan hasil analisis, bakteri strain IROD5 penghasil protease memiliki

kemiripan 99% dengan fragmen gen 16S rRNA bakteri Staphylococcus

hominis. Penelitian selanjutnya oleh Rambitan dkk. (2018), mengidentifikasi

Bakteri asam laktat yang diisolasi dari fermentasi kol merah yang

diamplifikasi dengan gen 16S rRNA yang diketahui memiliki kemiripan 100%

dengan Weissella cibaria dan Weissella confusa.

4

Pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Satria dkk. (2018),

didapatkan tujuh isolat bakteri dari limbah kulit singkong. Tujuh isolat yang

didapatkan telah dianalisis secara kualitatif untuk mengetahui aktifitas

hidrolitiknya dan terpilih 2 isolat, dimana isolat SCWB1 dan SCWB17

memiliki potensi amilolitik dan selulolitik yang cukup besar. Namun kedua

isolat ini belum diidentifikasi genetiknya. Berdasarkan latar belakang diatas,

maka pada penelitian ini akan dilakukan karakterisasi molekuler isolat lokal

terpilih asal limbah singkong yang dilakukan dengan metode 16S rRNA dan

ditentukan jenis atau spesiesnya melalui analisis filogenetik.

B. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Mengidentifikasi bakteri isolat lokal terpilih asal limbah singkong

dengan menggunakan 16S rRNA.

2. Mengetahui jenis bakteri isolat lokal terpilih asal limbah singkong.

3. Mengetahui kekerabatan bakteri isolat lokal terpilih asal limbah singkong.

C. Manfaat Penelitian

Adapun manfaat dari penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Memberikan informasi terbaru tentang bakteri isolat lokal terpilih asal

limbah singkong.

5

2. Metode 16S rRNA yang digunakan dalam penelitian ini dapat dijadikan

acuan untuk mengidentifikasi mikroba lainnya yang berasal dari limbah

singkong.

3. Isolat terpilih yang berhasil diidentifikasi dapat dimanfaatkan untuk

perkembangan ilmu pengetahuan dan bioteknologi.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Singkong

Singkong merupakan salah satu sumber karbohidrat yang paling penting

setelah beras, namun dengan kemajuan teknologi pengolahan singkong tidak

hanya terbatas pada produksi pangan, tetapi juga merambah sebagai bahan

baku industri (Rukmana, 1997). Pengolahan singkong secara terpadu

merupakan upaya yang dilakukan untuk memanfaatkan seluruh bagian dari

singkong tanpa ada yang terbuang termasuk kulitnya. Menurut penelitian

Turyoni (2005), kulit singkong segar mengandung karbohidrat sebesar 4,55%,

sehingga memungkinkan digunakan sebagai sumber energi bagi

mikroorganisme dalam proses fermentasi. Berdasarkan penelitian yang

dilakukan oleh Artiyani (2011), diketahui bahwa kulit singkong mengandung

beberapa komponen yaitu selulosa 43,626%, pati/amilum 36,58%,

hemiselulosa 10,384%, lignin 7,646%, dan komponen lainnya 1,762%.

B. Bakteri Selulolitik

Bakteri selulolitik adalah bakteri yang mampu mensekresikan enzim selulase

Madigan et al. (2003). Enzim selulase merupakan enzim ekstraseluler yang

7

dihasilkan di dalam sel kemudian dikeluarkan ke medium pertumbuhannya

untuk mendegradasi nutrien. Enzim selulase diproduksi untuk mengkatalisis

pemecahan selulosa menjadi glukosa dengan pemutusan ikatan β-1,4-

glukosidik (Acharya et al., 2008). Enzim selulase termasuk salah satu jenis

enzim yang sangat penting peranannya dalam proses biokonversi limbah-

limbah organik berselulosa menjadi glukosa, makanan ternak, etanol dan lain-

lainnya. Kebutuhan enzim selulase dari hari ke hari semakin meningkat

sesuai dengan kemajuan industri (Soeka, 1992).

Bakteri selulolitik dan enzim selulasenya banyak dimanfaatkan untuk

berbagai macam keperluan industri karena biaya produksinya murah, waktu

produksi singkat, menghasilkan kompleks multienzim dan cenderung stabil

pada kondisi ekstrim. Selain itu, selulase banyak digunakan dalam industri

pulp dan kertas untuk modifikasi serat, penghilangan warna dan peningkatan

drainase (Ladeira et al., 2015) industri tekstil sebagai bio- polishing kain dan

deterjen yang digunakan untuk meningkatkan kelembutan dan kecerahan kain

(Sadhu, 2013) serta produksi biofuel (Bogati, 2011). Aplikasi enzim selulase

di bidang peternakan telah dilakukan untuk peningkatan kualitas bahan pakan

ternak, digunakan untuk meningkatkan kecernaan bagas tebu (Rayhan dkk.,

2013), eceng gondok (Riswandi, 2014), dan bahan baku lainnya.

C. Bakteri Amilolitik

Bakteri amilolitik adalah bakteri yang mampu memecah pati menjadi

senyawa sederhana seperti glukosa. Bakteri yang diisolasi dari sumber kaya

8

pati umumnya berpotensi menghasilkan enzim amilase yang lebih baik

(Vaseekaran et al., 2011). Enzim amilase berperan dalam menghidrolisis pati

pada ikatan 1,4-glikosidik menjadi monosakarida dan disakarida (Sudiana

dan Rahmansyah, 2002).

Bakteri potensial yang telah banyak digunakan untuk memproduksi enzim

amilase pada skala industri yaitu Bacillus licheniformis dan B.

stearothermophillus. Penggunaan B. stearothermophillus pada skala industri

lebih disukai karena mampu menghasilkan enzim yang bersifat termostabil

sehingga menekan biaya produksi. Hingga saat ini kebutuhan akan enzim

amilase di Indonesia belum dapat dipenuhi, sehingga masih harus diimpor

(Naiola, 2008).

D. Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan DNA

dari sel nya (Surzycki, 2000). Metode isolasi DNA terdiri dari 3 tahapan

yaitu :

1. Penghancuran (Lisis) sel

Lisis merupakan proses perusakan dinding dan membran sel sehingga

seluruh isi sel keluar. Pemecahan dapat dilakukan secara fisik, misalnya

dengan freeze- thawing, ultrasonikasi, atau penggerusan dalam nitrogen

cair. Sel juga dapat dilisiskan secara kimiawi maupun enzimatik. Lisis

secara kimiawi biasanya menggunakan detergen SDS (Sodium Dodecyl

9

Sulfate) atau CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide), dan lisis

secara enzimatik biasanya menggunakan proteinase K atau lisozim.

2. Ekstraksi DNA

Ekstraksi merupakan proses yang bertujuan untuk memisahkan DNA dari

kontaminan lain. Pada tahap ini, berbagai modifikasi biasa dilakukan,

meliputi inkubasi pada temperatur tinggi, penggunaan agen pengkhelat

seperti EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) yang berfungsi untuk

menghambat enzim nuklease, juga phenol atau chloroform yang

menggunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol dan

merupakan metode standar untuk ekstraksi DNA yang akhir-akhir ini

mulai ditinggalkan, karena sifat toksik dari phenol.

3. Presipitasi DNA

Presipitasi merupakan proses pengendapan DNA yang bertujuan

mengisolasi DNA dari larutan yang digunakan selama ekstraksi.

Pengendapan DNA dapat dilakukan dengan menambahkan etanol dingin

beserta NaCl ke dalam ekstrak. Hasil pengendapan DNA yaitu akan

diperoleh benang-benang DNA berwarna putih.

(Widyastuti, 2011).

E. Identifikasi Molekuler

Metode identifikasi molekuler adalah identifikasi berdasarkan urutan 16S-

rRNA (16S ribosomal Ribonucleic acid/Asam ribonukleat pengkode ribosom

16S, S menyatakan Svedberg, yaitu satuan ukuran ribosom). Sebagian besar

10

prokariot memiliki 3 jenis rRNA, yaitu 5S, 16S dan 23S seperti terlihat pada

Tabel 1.

Tabel 1. RNA Ribosomal pada prokariot

Jenis rRNA Ukuran (Nukleotida)

5S rRNA 120

16S rRNA 1500

23S 2900

Sumber : Clarridge, 2004.

Gen 5S rRNA memiliki ukuran 120 basa sehingga gen ini terlalu kecil untuk

digunakan dalam penentuan filogenetik. Gen 23S rRNA memiliki ukuran

2900 basa, molekul ini menyulitkan analisis karena memiliki struktur

sekunder dan tersier yang cukup panjang. Prosedur baku yang sudah

digunakan untuk menentukan hubungan filogenetik dan mendefinisikan

spesies adalah melalui amplifikasi gen 16S rRNA (Jusuf, 2001). Gen 16S

rRNA ini digunakan untuk mempelajari spesies bakteri, dengan alasan

bahwa:

1. Gen 16S rRNA terdapat di dalam semua sel bakteri.

2. Fungsi gen 16Sr RNA dalam waktu yang lama tidak berubah tergantung

jarak evolusinya.

3. Gen 16Sr RNA cukup panjang yaitu 1500 bp.

(Janda and Abbott, 2007).

Identifikasi berdasarkan urutan 16S rRNA dilakukan karena mengandung

urutan yang sangat conserved (lestari) secara evolusi. Daerah yang sangat

conserved dapat digunakan sebagai situs pelekatan primer sehingga dapat

11

diamplifikasi secara in vitro dengan PCR. Urutan yang lebih beragam dari

16S rRNA sangat cocok untuk membedakan suatu organisme ke dalam taksa

yang lebih rendah seperti genus dan spesies. Urutan 16S rRNA ini juga

menyediakan data yang secara statistik cukup valid (Amann et al., 1994).

Struktur 16S rRNA dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur 16S rRNA (Fuchs et al., 1998)

Beberapa penelitian menggunakan metode identifikasi molekuler telah

dilakukan oleh Roslan et al. (2018), yang telah mengidentifikasi isolat dari

ragi, yaitu dua isolat bakteri pendegradasi pati yang diidentifikasi

menggunakan sekuensing gen 16S rRNA sebagai Bacillus licheniformis

dengan kesamaan 97% dan 98%, dan satu isolat diidentifikasi sebagai bakteri

12

asam laktat, Enterococcus faecium (98%). Begitu juga dengan penelitian

yang dilakukan oleh Awan et al. (2018), telah mengisolasi empat bakteri

termofilik sumber air panas Chakwal di Pakistan yang diidentifikasi

menggunakan sekuensing gen 16S rRNA yang diketahui bahwa semua isolat

berasal dari Bacillus licheniformis dengan kemiripan 98-99%.

F. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode enzimatis untuk

amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR pertama kali dikembangkan pada

tahun 1985 oleh Kary B. Mullis (Yuwono, 2006). Menurut Erlich (1989),

PCR merupakan teknik yang sangat tepat dan paling sering digunakan untuk

biologi molekuler karena mudah, cepat dan murah. Teknik amplifikasi DNA

dari sumber DNA yang dihasilkan merupakan DNA yang spesifik dari

sejumlah kecil gen-gen yang berbeda. Pada proses amplifikasi DNA oleh

PCR, digunakan enzim yang dinamakan dengan “Taq polymerase”.

Beberapa komponen PCR antara lain:

1. Enzim DNA Polimerase

Enzim Taq DNA polimerase berfungsi untuk menggabungkan nukleotida

pada proses ekstensi/elongasi, dimana enzim ini memiliki keaktifan pada

suhu tinggi. Oleh karena itu, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di

setiap siklusnya.

13

2. Primer

Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal atau potongan dari

DNA utuh yang berperan sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan

diamplifikasi. Primer juga menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’

yang diperlukan untuk proses elongasi DNA komplemen dengan DNA

template yang akan diperbanyak. Panjang dari primer berkisar antara 20-30

basa. Beberapa primer yang digunakan untuk identifikasi 16S rRNA

disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Primer Universal 16S rRNA

Primer

Name Sequence (5'-3') Ref.

27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG (Brosius et al., 1978)

1492R CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT (Brosius et al., 1978)

928F TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG (Lane et al., 1985)

336R ACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT (Lane, 1991)

63F CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC (Marchesi et al., 1998)

1387R GGG CGG WGT GTA CAA GGC (Marchesi et al., 1998)

3. Reagen lainnya

Selain enzim dan primer, terdapat juga reagen lain yang ikut menentukan

keberhasilan reaksi PCR, yaitu antara lain dNTPs (deoxynucleotide

triphosphates) yang merupakan suatu campuran yang terdiri dari dATP

(deoxyadenosine triphosphates), dTTP (deoxythimydine triphosphates) ,

dCTP (deoxycytidine triphosphates) dan dGTP (deoxyguanosine

triphosphates). dNTPs berfungsi sebagai building block DNA yang

diperlukan dalam proses ekstensi/elongasi DNA. dNTP ini akan menempel

pada gugus -OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang

14

komplementer dengan untai DNA templat. Selain dNTP, terdapat buffer

yang mengandung MgCl2 (magnesium klorida). Konsentrasi ion Mg2+

ini

sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, dan aktivitas

enzim (Yuwono, 2006).

Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA template,

penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (elongasi) rantai DNA.

Denaturasi merupakan suatu proses pemutusan untai ganda DNA menjadi dua

untai tunggal DNA, dimana DNA tersebut akan menjadi template (cetakan)

yang berfungsi sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA

polimerase dengan pemanasan singkat yaitu pada suhu 90-95°C selama

beberapa menit. Penjelasan ringkas tentang proses siklus reaksi PCR adalah

sebagai berikut:

1. Pradenaturasi

Predenaturasi dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk

memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA polimerase.

Predenaturasi biasanya dilakukan pada suhu 95°C.

2. Proses Siklus PCR

a. Denaturasi

Denaturasi terjadi dengan adanya proses terbukanya DNA untai ganda

menjadi dua untai tunggal. Hal ini terjadi karena suhu denaturasi yang

tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang

komplemen. Pada denaturasi, seluruh reaksi enzim tidak berjalan,

misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi

biasanya dilakukan antara suhu 90 – 95°C.

15

b. Penempelan Primer (Annealing)

Proses yang terjadi pada tahap penempelan primer (annealing) yaitu

primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan

primer. Pada proses annealing, ikatan hidrogen akan terbentuk antara

primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya

dilakukan pada suhu 50 – 60°C.

c. Reaksi Polimerisasi (Elongasi)

Reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai umumnya terjadi pada suhu

72°C. Primer yang telah menempel pada DNA template akan mengalami

perpanjangan pada sisi 3’ nya dengan penambahan dNTP yang

komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Apabila siklus

amplifikasi dilakukan secara berulang, maka daerah yang dibatasi oleh dua

primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang

berupa untai ganda). Jika enzim Taq DNA polimerase yang digunakan

pada akhir dari setiap siklus, maka akan menyebabkan terjadinya

penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang

dihasilkan. Proses PCR dilakukan menggunakan alat yang disebut

thermocycler.

3. Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72C) selama 5-15

menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah

diperpanjang secara sempurna (Handoyo dan Rudiretna, 2000).

16

Gambar 2. Siklus Amplifikasi (Ferdiansyah, 2014)

G. Sekuensing

Sekuensing DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida

pada suatu segmen molekul DNA. Urutan basa nukleotida tersebut dikenal

sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen

atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk

pembentukan tubuh mahluk hidup. Pengurutan (sequencing) asam nukleat

dapat digunakan untuk mengetahui kode genetik dari molekul DNA,

identitas maupun fungsi gen ataupun fragmen DNA dengan cara

membandingkan sekuensnya dengan sekuens DNA yang sudah diketahui

(Glick, 2010).

17

Macam-macam metode sekuensing :

1. Metode Maxam-Gilbert

Metode sekuensing DNA yang pertama kali dikenal adalah metode kimia

yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977.

Chemical degradation method (metode degradasi kimia), merupakan metode

yang digunakan untuk pengurutan molekul DNA untai ganda yang

ditentukan dengan menggunakan bahan kimia yang dapat memotong molekul

DNA pada posisi nukleotida tertentu. Biasanya digunakan fosfat radioaktif

atau suatu nukleotida pada ujung 3’ untuk melabeli fragmen-fragmen DNA

yang akan disekuensing. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan untuk

DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan

basa spesifik (Maxam and Gilbert, 1992).

2. Metode Sanger

A. Sanger dan kawan-kawan telah mengembangkan metode lain yang jauh

lebih praktis dibandingkan dengan metode sekuensing Maxam-Gilbert, yaitu

metode dideoksi yang dikembangkan pada tahun 1977. Chain termination

method (metode terminasi rantai) merupakan pengurutan molekul DNA untai

tunggal yang ditentukan dengan sintesis rantai polinukleotida komplementer

secara enzimatis. Metode terminasi rantai yang telah dikembangkan oleh

Frederick Sanger dan rekan-rekannya telah digunakan pada hampir semua

usaha sekuensing DNA. Metode Sanger menggunakan teknik penghentian

(terminasi) reaksi sintesis DNA in vitro yang spesifik untuk sekuens tertentu

menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi. Keunggulan

metode ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam

18

satu reaksi. Pada metode ini digunakan dideoksinukleotida, dimana masing-

masing dideoksinukleotida yang merupakan pemutus rantai ditandai dengan

pewarna fluoresens, yang berpendar pada panjang gelombang yang berbeda-

beda. Metode ini telah banyak digunakan karena keunggulannya, yaitu lebih

sederhana dan murah, serta primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel

secara terpisah (Sanger et al., 1977).

H. Analisis Filogenetik

Kata filogeni berasal dari bahasa Yunani yaitu phylon yang berarti suku, dan

genesis yang berarti asal mula. Secara terminologi, filogeni telah diartikan

sebagai sejarah evolusi spesies atau kelompok spesies yang berkerabat dekat

(Campbell et al., 2003). Pohon filogenetik merupakan diagram dengan

bentuk percabangan yang menggambarkan hubungan evolusi antara berbagai

sekuens organiseme berdasarkan kemiripan dan perbedaan karakter fisik serta

genetik yang telah diturunkan dari induknya (Smith et al., 1986).

Beberapa metode analisis filogenetik adalah sebagai berikut :

1. Metode Maximum Parsimony/Minimum Evolution

Metode parsimony atau minimum evolution pertama kali digunakan dalam

bidang filogenetik oleh Camin and Sokal pada tahun 1965 (Felsenstein, 1978).

Metode ini dapat memperkirakan pohon evolusi/evolutionary tree yang

meminimalkan jumlah langkah yang dibutuhkan untuk menghasilkan variasi

yang diamati dalam sekuen. Metode ini dapat digunakan untuk sekuen yang

mirip dan dalam jumlah yang sedikit. Tahapan yang digunakan dalam

19

metode ini tidak rumit, tetapi dijamin untuk dapat menemukan pohon yang

terbaik, sebab semua kemungkinan pohon yang dibentuk berhubungan

dengan kelompok sekuen yang diperiksa. Dengan adanya alasan tersebut,

metode ini cukup membutuhkan banyak waktu dan tidak berguna untuk data

sekuen dalam jumlah besar dan asumsi lain harus dibuat untuk root pohon

yang diprediksikan.

2. Metode Jarak/Distance Method

Metode Jarak merupakan metode yang digunakan karena adanya jumlah

perubahan diantara masing-masing pasangan dalam kelompok untuk

mengkonstruksi pohon filogenetika dalam kelompok. Pasangan sekuen yang

memiliki jumlah perubahan terkecil diantara mereka disebut neighbors.

Tujuan dari metode ini adalah untuk mengidentifikasi pohon pada posisi

neighbors dengan benar, dan juga mempunyai cabang yang menghasilkan

data orisinil sedekat mungkin.

3. Metode Fitch dan Margoliash

Metode Fitch dan Margoliash 1987 mengombinasi sekuen-sekuen untuk

mendefinisikan cabang-cabang pohon yang diprediksikan dan untuk

menghitung panjang-panjang cabang dari pohon, hal ini disebut metode

averanging distance. Metode ini merupakan metode yang paling akurat

untuk pohon dengan cabang yang pendek. Adanya cabang yang panjang

cenderung menurunkan tingkat kepercayaan dari prediksi.

4. Metode Neighbor - Joining (NJ)

Metode neighbor-joining memiliki prinsip yang hampir sama dengan metode

Fitch dan Margoliash, perbedaannya yaitu tentang pemilihan sekuen untuk

20

berpasangan ditentukan oleh perbedaan alogaritma (Saitou and Nei, 1987) .

Metode ini memilih sekuen yang jika digabungkan akan memberikan estimasi

terbaik dari panjang cabang yang paling dekat, sehingga menunjukkan jarak

yang nyata diantara sekuen. Metode yang paling sering digunakan yaitu

metode Neighbor-Joining (NJ). Metode NJ adalah metode yang

disederhanakan dari metode Minimum Evolution (ME) (Swofford et al.,

1996).

Gambar 3. Tampilan Pohon Filogenetik (Anonim, 2019)

I. Program MEGA 7

Program MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) digunakan

untuk mengetahui tingkat kemiripan antara sekuen satu dengan sekuen

21

pembanding (standart). Ge et al. (2018) menyatakan bahwa program MEGA

7 dapat digunakan untuk pengambilan kesimpulan hubungan evolusi dari

sekuen-sekuen yang homolog. Selain itu, MEGA 7 ini juga dilengkapi

dengan hasil berupa diagram pohon filogenetik. Contoh tampilan Program

MEGA7 dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4. Tampilan Menu MEGA7

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April hingga September 2019 di UPT

Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi (LTSIT) Unila dan

analisis urutan nukleotida dilakukan melalui jasa Bioneer, Korea.

B. Alat dan Bahan

Adapun alat-alat yang akan digunakan pada penelitian ini adalah erlenmeyer

50 mL, kasa, kapas, jarum ose, gelas ukur 10 mL, neraca analitik digital,

shaker inkubator, LAF (Laminar Air Flow), bunsen, dan autoclave,

centrifuge, microcentrifuge tube 2 mL, thermomixer, vortex, mini spin,

micropet, tips, GeneJET Genomic DNA Purification Column, collection tube

2 mL, Instrumen PCR SensoQuest Labcycler, Nanophotometer Pearl, dan

Instrumen elektroforesis QIAxcel Advanced dengan DNA High Resolution

Kit, serta program MEGA 7, ClustalW, dan QIAxcel ScreenGel Software.

Adapun bahan-bahan yang digunakan yaitu isolat SCWB1, isolat SCWB17,

NB (Nutrient Broth), aquades, GeneJET Genomic DNA Purification Kit,

23

NEXpro™ Pfu PCR 2X Master Mix, primer 63F 5’-CAG GCC TAA CAC

ATG CAA GTC-3’, 1387R 5’-GGG CGG WTG GTA CAA GGC-3’.

C. Prosedur Kerja

a. Pembuatan Media Kultur Cair

Pembuatan media kultur cair ini bertujuan untuk memperbanyak sel yang

akan di isolasi. Tahap ini dilakukan dengan cara menimbang media NB

sebanyak 0,13 g, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 mL dan

ditambahkan aquades sebanyak 10 mL, lalu disterilkan dengan autoclave

selama 15 menit pada suhu 121C dan tekanan 2 atm. Setelah 15 menit,

media cair didinginkan pada suhu ruang di dalam LAF (Laminar Air Flow).

Setelah media dingin, masukkan 1 ose isolat bakteri ke dalam media cair, dan

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C dengan kecepatan 125 rpm.

b. Isolasi DNA

Isolasi DNA digunakan untuk memperoleh materi genetik yang diinginkan

dari masing-masing isolat. Tahap ini dilakukan dengan cara memindahkan

1,5 mL medium cair yang telah ditumbuhi bakteri ke dalam microcentrifuge

tube yang steril. Microcentrifuge tube disentrifugasi selama 10 menit pada

5.000 x g dan supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Pelet yang dihasilkan

siap diisolasi DNA nya dengan cara disuspensikan dalam 180 µL digestion

solution. Kemudian ditambahkan 20 µl larutan proteinase K dan

dihomogenkan menggunakan vortex atau menggunakan pipet agar larutan

tercampur rata dan diinkubasi pada suhu 56C dalam thermomixer selama 15

24

menit. Kemudian ditambahkan 5 µl Rnase A solution dan dihomogenkan

dengan menggunakan vortex dan dilanjutkan dengan inkubasi selama 10

menit dalam suhu ruang. Tahap berikutnya ditambahkan etanol 99%

sebanyak 400 µl dan dihomogenkan kembali menggunakan pipet.

Lysate yang diperoleh dipindahkan ke dalam GeneJET Genomic DNA

Purification Column yang sebelumnya telah dimasukan dalam collection tube,

kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada 6.000 x g, lalu collection tube

yang mengandung larutan flow-trough dibuang dan GeneJET Genomic DNA

Purification Column dimasukkan kembali ke dalam collection tube baru

ukuran 2 mL. Selanjutnya ditambahkan 500 µl wash buffer I (yang telah

ditambahkan ethanol), dan disentrifugasi selama 1 menit pada 8.000 x g, lalu

buang flow-through dan letakan kembali GeneJET Genomic DNA

Purification Column dalam collection tube. Tambahkan 500 µl wash buffer II

(yang telah ditambahkan ethanol) ke dalam GeneJET Genomic DNA

Purification Column dan sentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan

maksimum (12.000 x g). Tahap berikutnya tambahkan 200 µl elution buffer

pada bagian tengah membran GeneJET Genomic DNA Purification Column

dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, setelah itu disentrifugasi

selama 1 menit pada 8.000 x g, kemudian GeneJET Genomic DNA

Purification Column dibuang dan filtrat yang berisi DNA berhasil diperoleh.

DNA yang diperoleh diuji tingkat kemurniannya dengan menggunakan alat

NanoPhotometer yang kemudian hasilnya digunakan sebagai

template/cetakan untuk proses amplifikasi.

25

c. Analisis Kemurnian Hasil Isolasi DNA

Analisis ini dilakukan untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA yang

diisolasi agar siap digunakan untuk proses amplifikasi. Analisis dilakukan

dengan memasukkan sampel DNA pada alat NanoPhotometer Pearl. Adapun

langkahnya yaitu dengan memipet buffer TE 1 µL dan dimasukkan ke dalam

kuvet, lalu tekan tombol blank, maka nilainya 0 . Kemudian memipet filtrat

hasil isolasi DNA sebanyak 1 µL dan dimasukkan ke dalam kuvet, lalu tekan

tombol sampel, maka akan keluar nilai konsentrasi dan kemurniannya.

d. Amplifikasi Gen 16S rRNA

Tahap amplifikasi ini dilakukan untuk memperbanyak DNA. DNA yang

sudah diisolasi sebelumnya, diamplifikasi dengan ditambahkan komposisi

reaksi yang memiliki total volume 20 µL NEXpro™ Pfu PCR 2X Master Mix,

dengan primer 63F 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’, 1387R 5’-

GGG CGG WTG GTA CAA GGC-3’yang dimasukkan ke dalam micro tube.

Kemudian setting alat PCR SensoQuest Labcycler dengan tahap

Predenaturasi selama 5 menit pada 95 °C, denaturasi selama 30 detik pada

94 °C, annealing selama 30 detik pada 50 °C, elongasi selama 2 menit pada

72 °C, final elongasi selama 5 menit pada 72 °C yang dilakukan selama 35

siklus. Isolat DNA siap diamplifikasi.

Setelah proses amplifikasi selesai, tahap berikutnya analisis menggunakan

alat elektroforesis. Elektroforesis digunakan untuk mengetahui tingkat

kemurnian DNA. Elektroforesis dilakukan dengan menganalisis sampel

DNA dalam tube PCR dengan menggunakan alat QIAxcel Advanced dengan

26

DNA High Resolution Kit. Tahapannya yaitu sampel hasil amplifikasi dalam

tabung mikro PCR 0.2 mL atau plate 96 well diletakkan dalam isolat tray alat.

Tampilan “Instrument Control” memerlukan beberapa informasi yang perlu

diisi. Proses elektroforesis akan dimulai dengan memberi perintah dengan

mengklik “Run”. Hasil elektroforesis menggunakan QIAxcel adalah

elektroforegram dan hasil amplifikasi DNA ditampilkan dalam komputer

berupa gambar gel.

e. Penentuan urutan DNA (Sekuensing)

Tahap sekuensing produk PCR dilakukan untuk mengetahui urutan basa

nukleotida isolat SCWB1 dan SCWB17. Penentuan urutan DNA (sekuensing)

dilakukan melalui jasa Bioneer, Korea. Proses penentuannya adalah

menggunakan metode Sanger yang meliputi beberapa tahap yaitu: penyiapan

template, pemurnian produk PCR, elektroforesis dengan scanning

fluorescence, dan reaksi sekuensing.

f. Analisis Filogenetik

Pohon filogenetik dibuat untuk mengetahui kekerabatan antara isolat SCWB1

dan SCWB17 dengan spesies yang diduga memiliki tingkat kemiripan

berdasarkan urutan basa nukleotidanya. Sekuen DNA yang diperoleh

dianalisis menggunakan program MEGA 7 untuk melihat hubungan

kekerabatannya dengan menjajarkan urutan nukleotida 16S rRNA yang

didapatkan dengan data yang terdapat di GenBank menggunakan BLASTn

(Basic Local Alignment Search Tool – Nucleotide) dari situs NCBI (National

Center for Biotechnology Information) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

27

Seluruh sekuen DNA yang diperoleh kemudian dilakukan menggunakan

ClustalW pada program MEGA 7 dan kemudian kontruksi pohon filogenetik

menggunakan menu pembuatan pohon filogenetik dengan metode Neighbor-

Joining pada program MEGA 7.

28

Bagan alir penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Bagan Alir Penelitian

Inokulasi

DNA

Isolat SCWB1

dan SCWB17

Inokulum SCWB1 dan SCWB17

Isolasi DNA

Analisis Kemurnian DNA Hasil Isolasi

Amplifikasi Gen 16S rRNA

Elektroforesis

Amplikon

Sekuensing Urutan Basa Nukleotida gen 16S

rRNA dan electropherogram

Analisis Hasil Sekuensing

Konstruksi Pohon Filogenetik

Hasil

DNA murni

(Template)

DNA Sekuens

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Adapun kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah sebagai

berikut :

1. Isolat SCWB1 memiliki nilai query coverage 100%, percent identity

97,73% dan e-value 0.0 dengan Bacillus pacificus, Bacillus

paranthracis, dan Bacillus cereus.

2. Isolat SCWB17 memiliki nilai query coverage 100%, percent identity

97,90% dan e-value 0.0 dengan Klebsiella pneumoniae dan

Klebsiella variicola.

3. Isolat SCWB1 memiliki keidentikan tertinggi dengan 8 spesies bakteri

yaitu Bacillus pacificus strain MCCC 1A06182, Bacillus

paranthracis strain MCCC 1A00395, dan Bacillus cereus strain

ATCC 14579, JCM 2152, CCM 2010, NBRC 15305, IAM 12605.

4. Isolat SCWB17 memiliki keidentikan tertinggi dengan 2 spesies

bakteri yaitu Klebsiella pneumoniae strain DSM 30104 dan Klebsiella

variicola strain F2R9.

5. Analisis kekerabatan memperkirakan bahwa isolat SCWB1 memiliki

kekerabatan terdekat terhadap Bacillus cereus strain IAM 12605 dan

46

isolat SCWB17 memiliki kekerabatan terdekat terhadap Klebsiella

variicola strain F2R9.

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian ini, terdapat beberapa saran yaitu :

1. Isolat SCWB1dan SCWB17 yang berhasil diidentifikasi dapat

digunakan pada tahap selanjutnya untuk mengkonversi limbah

singkong menjadi bioetanol.

2. Gen selulolitik dan amilolitik yang ada pada isolat SCWB1 dan

SCWB17 perlu dieksplorasi untuk dikembangkan lebih lanjut pada

bidang-bidang penelitian.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2019. Figure 1: Phylogenetic tree: Relationship amongst test strains by

neighbor joining method. https://www.omicsonline.org/articles-images/2157-

7463-4-158-g001.html. Diakses pada 4 November 2019.

Acharya, P. B., Acharya, D. K., and Modi, H. A. 2008. Optimization for cellulase

production by Aspergillus niger using saw dust as substrate. African Journal

of Biotechnology. 7(22): 4147-4152.

Amann, R., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. 1994. Identification of uncultured

bacteria: A challenging task for molecular taxonomists. ASM NEWS. 60(7)

360-365.

Artiyani, A. 2011. Bioetanol dari Limbah Kulit Singkong Melalui Proses

Hidrolisis dan Fermentasi dengan Saccharomyces cerevisiae. (Tesis). ITS.

Surabaya.

Badan Pusat Statistik. 2016. Tanaman Ubi Kayu Per-Provinsi. Badan Pusat

Statistik. Jakarta.

Bogati, D. R. 2011. Cellulose Based Biochemicals and Their. (Thesis). Saimaa

University of Applied Sciences. Finlandia.

Brosius, J., Palmer, M. L., Kennedy, P. J., and Noller, H. F. 1978. Complete

nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America. 75(10): 4801–4805.

Campbell, Reece dan Mitchel. 2003. Biologi Terjemahan edisi kelima jilid 1.

Erlangga. Jakarta.

Clarridge, J. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for

Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases.

Clinical Microbiology Reviews. 17(4): 840–862.

48

Erlich, H. A. 1989. Polymerase chain reaction. Journal of Clinical Immunology.

9(6): 437–447.

Fatchiyah, Estri, L.A., Sri, W., dan Sri, R. 2011. Biologi Molekular-Prinsip Dasar

Analisis. Erlangga. Jakarta.

Felsenstein. 1978. Cases in which Parsimony or Compatibility Methods will be

positively misleading. Systematic Zoology. 27(4): 401 – 410.

Ferdiansyah, N. 2014. Polymerase Chain Reaction.

http://nedfer.blogspot.com/2014/09/polimerase-chain-reaction-pcr.html.

Diakses pada 4 November 2019.

Fuchs, B., G. Wallner, W. Beisker, I. Schwippl, W. Ludwig, and R. Amann.

1998. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia

coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Appl.

Environ.Microbiol. 64:4973–4982.

Ge, S., Li, J., Fan, X., Liu, F., Li, L., Wang, Q., and Wang, Z. 2018. Molecular

characterization of African swine fever virus, China, 2018. Emerging

Infectious Diseases. 24(11): 2131–2133.

Glick B.R., Pasternak J.J., and Patten C.L. 2010. Molecular Biotechnology:

Principles and Applications of Recombinant DNA, 4th ed. ASM Press.

Washington DC.

Handoyo, D., dan Rudiretna, A. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan

Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas. 9(1): 17-29.

Hanzen, W. F. E., Hastuti, U. S., Makkadafi, S. P., Asna, P. M. Al, Sarwendah, F.,

dan Nugraheni, A. 2017. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Amilolitik Dari

Tanah Yang Tercampur Limbah Kulit Ubi Kayu Di Bondowoso , Jawa

Timur. Prosiding Seminar Nasional III Tahun 2017. Malang.

Hartl, D. L. 1988. A Primer of Population Genetics (Second Edition). Sinauer

Associates Inc. Sunderland.

Harun, A. 2018. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Staphylococcus hominis

Pada Oncom Merah Pasca Fermentasi. Seminar Nasional Edusainstek.

Semarang.

Janda, J. M., and Abbott, S. L. 2007. 16S rRNA gene sequencing for bacterial

identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal

of Clinical Microbiology. 45(9): 2761–2764.

Jusuf, M. 2001. Genetika I : Struktur dan Ekspresi Gen. CV. Sagung Seto. Jakarta.

49

Koonin, E. V. 2003. Comparative genomics, minimal gene-sets and the last

universal common ancestor. Nature Reviews Microbiology. 1(2): 127–136.

Ladeira, S. A., Cruz, E., Delatorre, A. B., Barbosa, J. B., and Martins, M. L. L.

2015. Cellulase production by thermophilic Bacillus sp. SMIA-2 and its

detergent compatibility. Electronic Journal of Biotechnology. 18(2): 110–

115.

Lane, D. J. 1991. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics In

Development and Application of Nucleic Acid Probes. International Journal

of Food Microbiology. 120(3): 225-236.

Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahl, D. A., Sogin, M. L., and Pace, N. R.

1985. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for

phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America. 82(20): 6955-6959.

Madigan, M. T., Martinko, J. M., and Parker, J. 2003. Brock Biology of

Microorganisms, 10th ed. Prentice Hall. London.

Makkadafi, S. P., Hastuti, U. S., Hanzen, W. F. E., Asna, P. M. Al, and Nugraheni,

A. S. F. 2017. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Selulolitik Dan Pektinolitik

Dalam Limbah Kulit Singkong Pabrik Tape Di Bondowoso , Jawa Timur.

Prosiding Seminar Nasional III Tahun 2017. Malang.

Marchesi, J. R., Sato, T., Weightman, A. J., Martin, T. A., Fry, J. C., Hiom, S. J.,

and Wade, W. G. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific

PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Applied and

Environmental Microbiology. 64(2): 795–799.

Maxam, A. M., and Gilbert, W. 1992. A new method for sequencing DNA. 1977.

Biotechnology (Reading, Mass.). 24(2): 99–103.

Naiola, E. 2008. Amylolitic microbes of nira and laru from Timor Island, East

Nusa Tenggara. Biodiversitas, Journal of Biological Diversity. 9(3): 165–168.

[NCBI] National Center for Biotechnology Information. 2019.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Diakses pada 24 September 2019.

Petti, C. A., Polage, C. R., and Schreckenberger, P. 2005. The Role of 16S rRNA

Gene Sequencing in Identification. Journal of Clinical Microbiology. 43(12):

6123–6125.

Rambitan, G., Pelealu, J. J., and Tallei, T. E. 2018. Isolasi dan identifikasi bakteri

asam laktat hasil fermentasi kol merah (Brassica oleracea L.) sebagai

probiotik potensial. Jurnal Bioslogos. 8(2): 33.

50

Rayhan, M., Suryapratama, W., dan Sutardi, T. R. 2013. Fermentasi Ampas Tebu

(Bagasse) Menggunakan Phanerochaete chrysosporium Sebagai Upaya

Meningkatkan Kecernaan Bahan Kering Dan Kecernaan Bahan Organik

Secara in vitro. Jurnal Ilmiah Peternakan. 1(2).

Riswandi. 2014. Kualitas Silase Eceng Gondok (Eichhornia crassipes) dengan

Penambahan Dedak Halus dan Ubi Kayu. Jurnal Peternakan Sriwijaya. 3(1):

1–6.

Roslan, R., Rehan, M. M., Kamarudin, K. R., Noor, H. M., Huda-Faujan, N., and

Radzi, S. M. 2018. Isolation and identification of amylolytic bacteria from

ragi. Malaysian Applied Biology. 47(2): 83–88.

Rukmana, R. 1997. Ubi Kayu, Budidaya dan Pascapanen. Kanisius.Yogyakarta

Sabbathini, G. C., Wijanarka, Pujiyanto, S., dan Lisdiyanti, P. 2017. Isolasi dan

Identifikasi Bakteri Genus Sphingomonas Dari Daun Padi ( Oryza Sativa ) di

Area Persawahan Cibinong. Jurnal Biologi. 6(1): 59–64.

Sadhu, S. 2013. Cellulase Production by Bacteria: A Review. British

Microbiology Research Journal. 3(3): 235–258.

Saitou, N. and M. Mei. 1987. The neighbor-joining method: a new method for

reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution. 4: 406-

425.

Sambrook, J., and Russel, J.W. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

Cold-Spring Harbor Laboratory Pr. New York (US).

Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. 1992. DNA sequencing with chain-

terminating inhibitors. 1977. Biotechnology (Reading, Mass.). 24: 104-108.

Santella, R. M. 2006. Approaches to DNA/RNA extraction and whole genome

amplification. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 15(9):

1585–1587.

Satria, H., Nurhasanah, Aspita, L., dan Dian, H. 2018. Pretreatment Limbah Padat

Singkong (LPS) Menggunakan Ionic Liquid [Emim]Oac dan Isolat-Isolat

Bakteri Indigenous Untuk Peningkatan Hasil Intermediate Produk. Seminar

Nasional Hasil Hasil Penelitian 2018. Universitas Lampung.

Smith, L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C. R.,

and Hood, L. E. 1986. Fluorescence detection in automated DNA sequence

analysis. Nature. 321(6071): 674–679.

Soeka Y.S. dan Sastraatmadja D.D. 1992. Pengaruh Penambahan Sumber-Sumber

Nitrogen Terhadap Produksi Enzim Selulase Oleh Aspergillus niger

Terseleksi Pada Media Dedak. Jurnal Penelitian. Bogor.

51

Sudiana, I.M. dan Rahmansyah, M. 2002. Aktivitas amilase dan selulase jamur

tiram putih yang ditumbuhkan pada medium ampas aren dan serbuk gergaji

kayu. Jurnal Mikrobilogi Indonesia. 7:7-10.

Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer. German.

Swofford, D.L., Olsen, G.J., Waddell, P.J. and Hillis, D.M. 1996. Phylogenetic

Inference. In: Hillis, D.M., Moritz, C. and Mable, B.K., Eds., Molecular

Systematics, 2nd ed. Sinauer Associates. Sunderland.

Turyoni, D. 2005. Pembuatan Dodol Tape Kulit Singkong (Cassava) Teknologi

Jasa dan Produksi. (Skripsi). Universitas Negeri Semarang. Semarang.

Vaseekaran, S., Balakumar, S., and Arasaratnam, V. 2011. Isolation and

Identification of a Bacterial Strain Producing Thermostable α- Amylase.

Tropical Agricultural Research. 22(1): 1.

Widyastuti, D. A. 2011. Isolasi DNA Kromosom Salmonella sp . dan

Visualisasinya pada Elektroforesis Gel Agarosa. Prosiding SNPBS (Seminar

Nasional Pendidikan Biologi dan Saintek) Ke-2. Semarang.

Yeates, C., Gillings, M. R., Davison, A. D., Altavilla, N., and Veal, D. A. 1998.

Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification.

Biological Procedure Online. 1(1):40-47.

Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Erlangga.

Jakarta.