Karakter Molekuler dan Fenotip dari Pseudomonas syringae pv. Actinidiae yang Diisolasi Selama Epidemi Bakteri Penyebab Kanker

pada Buah Kiwi Kuning (Actinidia chinensis) di Italia Tengah

Oleh :

Nama: Arida Fauziyah

NIM: B1J010173

Rombongan: IKelompok: 3

Asisten: Tria MuhammadTUGAS PRAKTIKUM FITOPATOLOGIKEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGI

PURWOKERTO

2013

I. Pendahuluan

Selama musim semi tahun 2008-2009, dan musim salju pada tahun yang sama, kemunculan bakteri penyebab kanker diteliti pada tanaman kiwi kuning (Actinidia chinensis) cvs Hort 16A dan Jin Tao yang dikultivasi di daerah Italia Tengah (Provinsi Latina). Gejala yang umum terjadi adalah menurunnya jumlah eksudat yang berwarna kemerah-merahan secara perlahan sepanjang batang utama dan cabang, perubahan warna lentisel (yang terletak di bawah epidermis) menjadi merah, bercak-bercak daun yang terkadang dikelilingi oleh klorosis yang melingkar yang disebut dengan chlorotic halo, cacat daun, kematian pada ujung ranting (dieback), dan kecacatan tanaman.

Berbagai bidang telah melakukan survey untuk mengetahui tingkat keparahan dari infeksi Pseudomonas syringae pv. Actinidiae (Psa) yang diisolasi dari sampel tumbuhan yang terinfeksi. Patogen ini diisolasi untuk pertama kalinya pada daerah yang sama dengan Actinidia deliciosa cv. Hayward pada tahun 1992, dan sejak saat itu sampai tahun 2008, bakteri tersebut hanya menimbulkan kerusakan yang bersifat sporadis (seperti bercak daun dan kematian ujung ranting) pada Actinidia delicosa. Kerusakan yang parah dan atau epidemic tersebut tidak pernah diteliti. Namun demikian, dimungkinkan harena penyebaran inokulum bakteri Psa lebih dikenal pada tahun 2008-2009 dibandingkan pada saat penelitian pada A. delicosa.

Informasi mengenai struktur populasi dari pathogen selama epidemic dan peniliaian awal dari sensitivitas mikroorganisme terhadap antimikorba yang berbeda merupakan syarat fundamental untuk merencanakan strategi yang efektif untuk mengatur penyebaran dari bakteri tersebut, dan untuk mengurangi insiden penyakit dalam jangka panjang. Dengan tujuan yang dsebutkan di atas, strain dari Psa diisolasi dari A. chinensis cvs Hort 16A dan Jin Tao, dari pollinator cv. CK3, dan juga yang berasal dari bakterei kanker A. deliciosa cv. Hayward yang muncul baru-baru ini di Italia Tengah. Kedua strain ini ditambahakan dengan dua strai Psa yang didapat dari kasus tunggual bakteri penyebab kanker pada A. chinensis di Italia Utara (Provinsi Ravenna) dan dua isolate P. s. pv. syringae yang diisolasi dari gejala bercak daun pada A. chinensis cv. Hort 16A di Italia Tengah. Perbandingan dengan beberapa strain dari Psa, menunjukkan stimulasi bakteri penyebab kanker pada A. deliciosa cv. Hayward pada waktu yang lalu yang diisolasi di Jepang dan Italia. Semenjak diketahuia bahwa Psa, Pseudomonsa avellanae, dan P. s. pv. theae termasuk ke dalam kelompok genomospescies 8, perwakilan strain dari genomospecies ini diikutsertakan untuk tujuan yang komparatif.

Paper ini melaporkan mengenai karakter molekuler dan hubungan strain dari kultur Psa yang didapat menggunakan sekuens berulang PCR (menggunakan primer BOX dan ERIC dan sekuens multilokus). Pathogen tersebut juga diteliti untuk keberadaannya pada gen-gen yang dihindarkan untuk memproduksi toksin dan sintesis protein dari efektor. Pada akhirnya, sensitivitas in vitro dari bakteri terhadap tembaga murni dan senyawa organik seperti antibiotic dan tarpenes dapat diketahui.II. Materi dan Metode

1. Isolasi dan strain bakteri

Pada tahun 2008 dan 2009, sampel dari daun, ranting, cabang, dan batang yang berpenyait dari tumbuhan A. chinensis cvs Hort16A, Jin Tao, CK3, dan A. deliciosa cv. Hayward diproses untuk diidentifikasi agen penyebab dari epidemi bakteri penyebab kanker di Italia Tengah. Sebanyak 101 strain Psa yang terisolasi dan dua strain P. s. pv. syringae diperoleh. Kemudian, kelompok lain yang merupakan perwakilan dari 21 strain Psa dipilih untuk dinilai dan dibandingkan karakter molekuler dan fenotip nya. Strain-strain tersebut dipilih dengan tujuan untuk menguji sampel yang didapat dari semua kultivar, dengan perkebunan dan organ tumbuhan yang berbeda selama dua thun epidemic. Selain itu strain-strain berikut juga diikutsertkan yaitu, dua strain Psa yang diperoleh dari kasus tunggal bakteri penyebab kanker pada A. chinensis di Italia Utara (Provinsi Ravenna) pada tahun 2009, tiga strain Psa dari Jepang yang mewakili epidemi pertama dari bakteri penyebab kanker yang terjadi pada tahun 1984 pada A. deliciosa cv. Hayward ,dan dua strain Psa yang diisolasi dari Italia pada tahun 1992 (Provinsi Latina) dari A. deliciosa cv. Hayward. Strain-strain tersebut dikultur pada nutrien agar (Oxoid) yang diberi suplemen dengan 5% sukrosa (NSA) dan diinkubasi pada suhu 25-27oC. 2. Sekuens berulang PCR

Strain-strain Psa yang diperoleh dari A. chinensis dan A. deliciosa selama 2008-2009 dibandingkan dengan strain Psa lain yang diisolasi sebelumnya di Jepang dan Italia dari A. deliciosa dengan menggunakan sekues berulang PCR (rep-PCR) (menggunakan set primer BOXA1R dan ERIC). Selain itu, strain tersebut juga dibandingkan menggunakan rep-PCR dengan perwakilan strain dari genomeospecies 8 yang bernama P. avellanae dan P. s. pv. theae sama seperti dua strain P. s. pv. syringae yang diisolasi dari A. chinensis pada tahun 2009. Dari setiap strain, 50 ng genom DNA diekstrak menggunakan lisis alkalin yang nantinya akan digunakan sebagai templat. Dalam waktu singkat, loop yang penuh akan koloni murni disuspensi ke dalam tabung Eppendorf yang berisi salinitas steril (0,85% NaCl pada air yang didestilasi) dan dicampurkan pada pusaran air. Selanjutnya, tabung disentrifugasi selama dua menit pada kecepatan 10 000 g. Kemudian, pelet disuspensi dalam 100L 0,05 M NaOH dan dipanaskan pada suhu 95oC selama 15 menit. Setelah sentrifugasi selama dua menit supernatan sebagai produk ahir digunakan sebagai templat DNA atau disimpan pada suhu -20oC. Produk PCR dipisahkan meggunakan gel elektroforesis. 3. Typing sekuens multilokusMultilocus sequence typing (MLST) bekerja seperti rep-PCR dengan tujuan untuk mengetahui hubungan di antara strain-strain Psa.

4. Deteksi gen-gen efektor

Keberadaan dua belas gen-gen efektor pada Psa dan P. s. pv. syringae diujikan menggunakan PCR menggunakan primer tertentu. Primer-primer efektor dirancang menggunakan program PRIMER3 berdasarkan sekuens P. s. pv. tomato DC3000 dan gen-gen efektor P. s. pv. phaseolicola 1448A.

5. Deteksi terhadap fototoksin

Keberadaan pengkodean gen cfl untuk coronatine dan untuk fragmen-frgamen dari kelompok gen tox-argK yang mengkode phaseolotoxin diujikan menggunakan amplifikasi PCR pada semua kultur Psa. Keberadaan atau ketidakberadaan pita dari ukuran yang diharapkan mengindikasikan keberadaan atau ketidakberadaan gen pada genom yang strain nya diujikan.6. Sensitivitas terhadap tembaga murni dan senyawa organik

7. Sensitivitas terhadap antibiotik dan terpenesIII. Hasil dan PembahasanA. Hasil

Isolasi spesimen berpenyakit dari A. chinensis dan A. deliciosa menghasilkan 101 isolasi Psa, dari seluruh orahn tumbuhan yang dipengaruhi oleh penyakit (daun, ranting, cabang, dan batang). Semua strain yang terisolasi berupa positif-levan, oksidase-, akar halus kentang- dan arginin dehidrolase-, dan menginduksi respon hipersensitif pada daun tembakau setelah 24 jam infiltrasi. Selain itu, strain-strain tersebut tidak menghasilkan pigmen fluorescent dan bersifat negative pada perlakuan arbutin dan tirosin. Strain-strain yang diisolasi mengakibatkan kecacatan pada tumbuhan A. chinensis Hort 16A, 10-12 hari setelah inokulasi. Strain tersebut tidak mengakibatkan gejala apapaun pada buah lemon. Dua strain P. s. pv. syringae diperoleh dari bercak daun pada A. chinensis cv. Hort 16A di Italia Tengah pada tahun 2009 menunjukkan respon yang sama seperti isolate Psa, namun menghasilkan pigemn fluorescent. Selain itu, strain tersebut megakibatkan nekrotik lokal pada buah lemon, 7-8 hari setelah inokulasi. Ketikka diinokulasikan pada ranting A. chinensis, strain tersebut hanya mengakibatkan nekrotik lokal di sekitar daerah inokulasi dan tidak mengakibatkan kecacatan pada tumbuhan. B. Pembahasan

Variasi genetik pada strain-strain Psa yang diisolasi selama epidemic bakteri penyebab kanker pada A. chinensis dan A. delicosa yang terjadi di Italia Tengah pada tahun 2008-2009 diujikan menggunakn rep-PCR. Rep-PCR tidak menunjukkan perbedaan di anatara strain-strain ini, emskipun demikian, strain-strain tersebut dapat dengan jelas dibedakan dari strain Psa yang sebelumnya diisolasi dari A. deliciosa di Jepang dan Italia yang sama dengan dua strain P. s. pv. syringae yang diisolasi dari bercak daun pada A. deliciosa pada tahun 2009. Konfirmasi ini memberikan kesamaan secara menyeluruh dari penyakit tumbuhan yang merupakan bagian dari genomospecies 8, bernama Psa, P. avellanae, dan P. s. pv. theae.

MLST menunjukkan variabilitas di antara starin-strain Psa dibandingkan rep_PCR, meskipun demikian secara keseluruhan kesamaan di antara strain-strain tersebut masih tetap tinggi. pada analisis MLST, strain Psa yang sebelumnya diisolasi dari pada A. deliciosa di Jepang dan Italia memberikan hasil yang berbeda dari strain yang diperoleh baru-baru ini dari Italia Tengah. Menariknya, beberapa strain Psa diperoleh dari tahun dan tempat yang berbeda dari kultivasi A. chinensis atau diisolasi dari spesies Actinidia, identic pada totl panjang dari keempat fragmen gen yang dianalisa.

Ketika semua hasil diperoleh dengan menggunakan rep-PCR dan MLST, sangat jelas bahwa (i) epidemi yang terjadi di Italia Tengah pada A. chinensis dan A. deliciosa pada tahun 2008-2009 diakibatkan oleh populasi yang berbeda dari Psa dibandingkan dengan yang sebelumnya ditemukan di Jepang dan Italia, (ii) strain dari populasi baru ini dapat menginfeksi baik A. chinensis cvs Hort16A, Jin Tao dan CK3 atau A. deliciosa cv. Hayward, (iii) beberapa populasi baru-baru ini di Italia Tengah (Provinsi Latina) dan setidaknya pada beberapa daerah kecil di Italia Utara (Provinsi Ravenna), dan (iv) dua strain P. s. pv. syringae yang diisolasi dari A. chinensis memberikan hasil yang jauh berbeda dengan Psa dari pengujian yang dilakukan pada kasus ini.

Isolasi dan Identifikasi Jamur Indigenous Rhizosfer Tanaman Kentang dari Lahan Pertanian Kentang Organik di Desa Pakis, Magelang

Oleh :

Nama: Arida Fauziyah

NIM: B1J010173

Rombongan: IKelompok: 3

Asisten: Tria MuhammadTUGAS PRAKTIKUM FITOPATOLOGIKEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGI

PURWOKERTO

2013

I. PendahuluanPenyakit hawar daun tanaman kentang oleh jamur paogen Phytopthora infestans sejak lama menjadi masalah bagi para petani kentang dan penyakit ini merupakan penyakit yang paling serius di antara penyakit dan hama yang menyerang tanaman kentang di Indonesia. Serngan pathogen dapat menurunkan produksi kentang hingga 90% dari total produksi. Jmaur rhizosfer merupakan salah sau kelompok mikrobia yang telah dilaporkan dapat menginduksi ketahanan tanaman terhadap berbagai penyakit. Banyak jenis jamur dapat diisolasi dari rhizosfer tanaman budidaya seperti cabai, kentang, tembakau, dan jagung. Jmur ini dapa memacu pertumbuhan tanaman sehingga termasuk dalam kelompok Plant Growth Promoting Fungi / PGPF . Jamur yang menempati rhizosfer tanaman dan menumpang pada tanaman sebagai simbion dikenal sebagai jamur endomikroiza dan ektomikoriza. Jamur ini dapat bersifat menguntungkan maupun merugikan. Penelitian ini melaporkan hasil isolasi jamur-jamur rhizosfer dari pertanaman kentang organik di daerah Pakis Magelang. Tujuannay untuk mengetahui jumlah dan marga jamur indigenous rhizosfer pertanaman kentang yang dibudidayakan secara organik. Selanjutnya hasil penelitian akan dikaji lebih lanjut dalam pengujian in vitro dalam emngendalikan pertumbuhan jamur pathogen penyebab penyakit hawar daun tanaman kentang dan kemungkinannya sebagai peluang dalam alternatifnya sebagai bahan baku biofertilizer dan biokontrol dalam mengendalikan penyait hawar daun tanaman kentang.

II. Materi dan MetodePenelitian dilakuan dengan metode isolasi tanah rhizosfer secara langsung dari daerah perakaran beberapa tanaman kentang sehat dari daerah pertanian kentang organik di Dusun Sembungan Desa Gondangsari Kecamatan Pakis Kabupaten Magelang Provinsi Jawa Tengah. Pemurnian jamur dan identifikasinya dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi, Fakultas MAtematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Diponegoro, Semarang, mulai bulan Juli sampai November 2008.

III. Hasil dan PembahasanHasil isolasi dari rhizosfer tanaman kentang di Pakis Magelang didpatkan delapan tipe atau kelompok isolate jamur yang terdiri dari empat macam marga amur teridentifikasi, dua tipe jamur yang belum teridentifikasi dikarenakan tidak memiliki konidia.

Isolat 1 : Mucor sp.

Secara makroskopis jamur ini seperti Rhizopus sp. yakni miseliumnya seperti kapas tetapi warnanya lebih putih dibandingkan dengan Rhizopus sp. dan secara mikroskopis jamur ini memiliki stolon tetapi tidak memiliki rhizoid dan sporangiofornya lebih pendek dibading dengan Rhizopus.

Isolat 2 dan 3: Trichoderma sp.

Mempunyai konidia yang berdinding halus, koloni mula-mula berwarna hialin, lalu menjadi putih kehijauan, dan selanjutnya hijau tua terutama pada bagian yang menunjukkan banyak terdapat konidia. Konidiofor dapat bercabang menyerupai piramida yaitu pada bagain bawah cabang lateral yang berulang-ulang, sedangakn semkain ke ujung percabangan menjadi bertambah pendek. Isolat 4 dan 6: Phytophthora sp.

Hifanya tidak bersepta, reproduksi seksual dengan zoospore berflagela, organ seksualnya antheridia dan oogonia. Sporangiofor biasanya tidak dibedakan dengan miselium. Sporangia berbentuk ovoid, seperti lemon, memiliki papilla. Adanya papilla menjadi ciri khas Phytophthora sp. yang dapat membedakannya dengan Phytium sp. yang tidak memiliki papila.

Isolat 5 : Penicillium sp. Bersepta, badan buah berbentuk seperti sapu yang diikuti sterigma dan konidia yang terususn seperti rantai. Kondia pada hampir semua spesies saat masih muda berwarna hijau kemudian berubah menjadi kecoklatan.