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TRANSCRIPT
i
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
“POTENCIALIDADE DA ALIANÇA DA ESPECTROSCOPIA
DE RAIOS X E QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO DE
VALOR ENERGÉTICO E TEORES DE ALGUNS
MACRONUTRIENTES EM AMOSTRAS DE FARINHAS
PARA CONSUMO HUMANO”
JULIANA TERRA
Orientadora: Profª Drª Maria Izabel Maretti Silveir a Bueno
TESE DE DOUTORADO
Campinas – SP
2009
ii
v
Aos meus pais, Milton e Vera,
e aos meus irmãos (Pedrinho e Juninho),
por todo amor, força e incentivo.
“Todos os fins são também começos, apenas não sabemos disso na hora.”
vii
AGRADECIMENTOS
Inicialmente gostaria de agradecer a Profª Drª Maria Izabel Maretti Silveira
Bueno (BELL), que me fez compreender o significado da palavra orientação. Por
toda a amizade e carinho dedicados, e principalmente por me permitir conhecer o
lado humano e belo que existe por trás da profissional.
Aos meus amigos do GERX (Lidi, Guto, Karen, Vinícius e Bárbara), cujas
conversas e os lanches da tarde animaram até os dias nublados. Em especial ao
meu amigo Alexandre, que mesmo com sua rabugice foi de extrema importância
para a conclusão desta tese.
Ao estagiário, Miguelito, meu obrigado pela ajuda técnica.
Às professoras Regina, Susi, Inês Valéria e Bel Felisbertti (e seus grupos
de pesquisa) pela confiança e palavras de incentivo durante minha mudança de
percurso.
Aos professores Marcelo Alexandre Prado e Celso Aparecido Bertran por
disponibilizar seus equipamentos; e a técnica Cristina Boccado pela paciência e
ensinamentos.
Às minhas amigas (Carmen, Mara, Acacia, Dani, Julia, Lídia, Bianca,
Jana, Cléia, Sônia e Selma) e à minha turma (Vivi, Thaís, Valéria, Tânião, Camila
e Mary), amigas fiéis e confidentes, pela presença em todos os momentos
(alegres ou tristes).
Aos Moura e aos Terra que torceram pela vitória alcançada.
Não poderia deixar de fazer um agradecimento especial aos meus amigos
e educandos da Fundação Bezerra de Menezes pela amizade e carinho
verdadeiros. Ohm!
A toda direção e aos funcionários do Instituto de Química da UNICAMP
pelo apoio acadêmico e técnico
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
ix
CURRÍCULUM VITAE
� Pós-graduação – Mestrado na Área de Química Analíti ca
(Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas-SP, Conclusão: 2005)
� Graduação – Licenciatura em Química
(Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas-SP, Conclusão: 2003)
� Graduação – Bacharelado em Química
(Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas-SP, Conclusão: 2001)
Durante a sua vida acadêmica, a autora desta tese participou de 17 eventos
científicos, incluindo congressos e encontros nacionais e internacionais. Nestes
eventos foram apresentados 23 trabalhos na forma de painel, sendo publicados
em livros de resumo, e 1 trabalho na forma oral (sendo este relacionado com a
tese aqui apresentada).
Publicou 3 artigos em revistas científicas, todos em parceria com a Prof.
Dra. Adriana V. Rossi, e 1 artigo on-line pela Editora Moderna: “Sobre o
desenvolvimento da Análise Volumétrica e Algumas Aplicações” (Quím. Nova
2005, 28, 166), “Volumetria como ferramenta didática no ensino superior no século
XXI: aspectos conceituais e questões práticas para discussão e reflexão” (Rev.
Bras. Ens. Quim. 2008, 2, 33), “Reflexões sobre o que se ensina e o que se
aprende sobre densidade a partir da escolarização” (QNEsc, 2008, 30, 55-60) e
“Diferentes abordagens para aulas de Química no Ensino Médio”
(http://www.moderna.com.br/moderna/didaticos/em/artigos/2004/0016.htm).
Foi monitora em vários programas e eventos científicos: Programa de
Estágio Docente do IQ-UNICAMP (2003, 2004 e 2006); Simpósio de Profissionais
do Ensino de Química (2002 a 2007); Programa Ciência e Arte nas Férias (2003 e
2004); Encontro Paulista de Pesquisa e Ensino de Química (2004).
Ao longo do trabalho científico, a autora ministrou oficinas e cursos
pedagógicos: Oficina de química para professores de Química da rede pública
estadual de ensino da região de Jundiaí (2003); PROJETO TEIA DO SABER da
UNICAMP nas turmas de Química do núcleo de Ciências Exatas e da Terra (2004
x
e 2006), Cursos no Simpósio de Profissionais do Ensino de Química (2004 a
2006).
Também auxiliou na orientação, com supervisão da profa Maria Izabel M. S.
Bueno, do projeto de iniciação científica “Uso de Quimiometria aliada a
Espectroscopia de Raios-X para quantificação do teor de proteínas e valor
energético em ovos”.
Para seu crescimento pessoal e profissional, a autora exerce, desde 2006,
atividades voluntárias na Fundação Bezerra de Menezes, em Campinas-SP,
sendo Educadora de jovens e crianças das Escolas Preparatórias para Vida (EPV)
que integram a Fundação, e Secretária do Conselho de Educação.
De janeiro a junho de 2009, a autora atuou como pesquisadora da empresa
KosmoSCIENCE Consultoria e Assessoria Técnica em Cosméticos na elaboração
e aperfeiçoamento de métodos para verificação da eficácia de produtos
cosméticos.
Para maiores detalhes, consultar o currículo Lattes.
“Cada responsabilidade que o homem assume para o bem de todos,
voluntariamente, é um passo para o crescimento espiritual” (Paulo Zabeu)
xi
RESUMO
POTENCIALIDADE DA ALIANÇA DA ESPECTROSCOPIA DE RAIO S X E
QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO DE VALOR ENERGÉTICO E TEORES
DE ALGUNS MACRONUTRIENTES EM AMOSTRAS DE FARINHAS P ARA
CONSUMO HUMANO
O valor energético (VE) é uma das informações obrigatórias que devem ser
fornecidas no rótulo dos alimentos pré-embalados. O VE que aparece nos rótulos
corresponde a uma relação dos teores de alguns macronutrientes (proteínas,
gorduras e carboidratos) presentes na amostra. A determinação destes
parâmetros é oficialmente feita a partir de procedimentos analíticos distintos e
todos são laboriosos, lentos e geradores de resíduos. Em geral, envolvem o uso
de reagentes (alguns tóxicos), além de provocarem a destruição da amostra. Esse
trabalho apresenta modelos de calibração e validação para determinar o valor
energético (calorias) e o teor de carboidratos e proteínas em amostras de extratos
e farinhas de vegetais para consumo humano. A modelagem foi obtida através dos
métodos PCA (análise por componentes principais) e PLS (regressão por
quadrados mínimos parciais) para espectros de fluorescência de raios X de
amostras com parâmetros conhecidos, determinados através de métodos
convencionais. Amostras originadas do milho, mandioca, leite, trigo e soja,
adquiridas em supermercados brasileiros, foram avaliadas. O método proposto
não gera resíduos e não necessita de qualquer tipo de solvente ou reagente,
atendendo às exigências da chamada “química verde”. Além disso, a sua
aplicação requer 0,2% do tempo necessário para a aplicação dos métodos
convencionais. Os bons resultados da validação (erros menores que 14%) indicam
que se trata de uma alternativa aos métodos analíticos convencionais, sendo
muito atraente para análises de rotina, obedecendo à legislação vigente (portaria
42, resolução RDC 360, ANVISA), que permite erro máximo de 20%.
xiii
ABSTRACT
POTENTIALITIES OF THE ALLIANCE OF X-RAY SPECTROSCOP Y AND
CHEMOMETRICS TO DETERMINATE ENERGETIC VALUE AND SOM E
MACRONUTRIENTS CONTENS OF INDUSTRIALIZES DRIED FOOD S FOR
HUMAN CONSUMPTION
The energetic value (EV) is a quantitative information required on the labels of pre-
packaged foods. The EV appearing on the label corresponds to the sum of the
energetic contributions from food macronutrients (proteins, carbohydrates and
fats). The determinations of these parameters are based on distinct analytical
procedures, each one being time-consuming, laborious and producing residues. In
general, these methods involve the use of reagents (some toxic) besides
destroying the samples. This work presents multivariate calibration and validation
models to determine the energetic value, protein and carbohydrate contents of
industrialized dried foods for human consumption. The modeling was obtained by
using PCA (principal component analysis) and PLS (partial least squares
regression) for X-ray fluorescence spectra of samples with known parameters,
determined through conventional methods. Samples from corn, casava, milk,
wheat and soy, purchased in Brazilian supermarkets, were investigated. The
proposed method does not generate wastes and does not require any solvent or
reagent, given the demands of the "green chemistry”. Moreover, its application
requires only 0.2% of the time necessary for the application of conventional
methods. The good results of the validation process (errors less than 14%) indicate
that this is an alternative to conventional analytical methods and is very attractive
for routine analysis, according to current legislation (Executive Order 42, DRC
resolution 360, ANVISA), which allows maximum errors of 20%.
.
xv
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURA S............................................................................ xvii
LISTA DE TABELAS.... ................................................................................... xix
LISTA DE FIGURAS.... .................................................................................... xxi
LISTA DE EQUAÇÕES... ................................................................................. xxiii
CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO......................................................................... 1
I.1. ROTULAGEM DE ALIMENTOS......................................................... 3
I. 2. ESPECTROMETRIA DE FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X.............. 6
I. 2. 1. BREVE HISTÓRICO............................................................. 6
I. 2. 2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS............................................... 9
I. 3. QUIMIOMETRIA................................................................................ 12
CAPÍTULO II – OBJETIVOS........... ................................................................. 19
II.1. OBJETIVOS....................................................................................... 21
CAPÍTULO III – EXPERIMENTAL........ ........................................................... 23
III.1. REAGENTES.................................................................................... 25
III.2. AMOSTRAS...................................................................................... 26
III.3. EQUIPAMENTOS............................................................................. 30
III.4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL................................................ 31
III.4.1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE....................... 31
III.4.2. MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X... 36
CAPÍTULO IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................ 39
IV.1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE.................................. 41
IV.2. MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X.............. 51
IV.2.1. FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X: RELAÇÃO CUSTO
BENEFÍCIO...................................................................................... 76
CAPÍTULO V – CONCLUSÃO.......................................... ............................... 79
V.1. CONCLUSÃO.................................................................................... 81
CAPÍTULO VI – PERSPECTIVAS................................................................... 83
VI.1. PERSPECTIVAS……………………................................................. 85
CAPÍTULO VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................... 87
VII.1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 89
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Descrição em Inglês Descrição em Português
ANVISA --- Agência nacional de
vigilância sanitária
AOAC Association of official
analytical chemists
Associação de químicos
analíticos oficiais
CA Casava Mandioca
CO Corn Milho
EDXRF Energy dispersive X-ray
fluorescence
Fluorescência de raios X por
dispersão de energia
EqM Mathematical equations Equações matemáticas
EV Energetic value Valor energético
FRX X-ray fluorescence Fluorescência de raios X
GERX --- Grupo de espectrometria de
raios X
IUPAC International union of pure
and applied chemistry
União internacional de
química pura e aplicada
LOD Limit of detection Limite de detecção
LOQ Limit of quantitation Limite de quantificação
LV Latent variable Variável latente
mf Final mass Massa final
mi Initial mass Massa inicial
MI Milk Leite
PC Principal component Componente principal
PCA Principal component analysis Análise por componentes
principais
PLS Partial Least Squares Regressão por Quadrados
Mínimos Parciais
xviii
Abreviatura Descrição em Inglês Descrição em Português
PRESS Predicted residual error sum
of squares
Soma dos quadrados dos
erros de previsão
rcal Correlation coefficient of
calibration
Coeficiente de correlação da
calibração
RDC --- Resolução da diretoria
colegiada
RMSEC Root mean square error of
calibration
Raiz quadrada do erro médio
quadrático de calibração
RMSEP Root mean square error of
prediction
Raiz quadrada do erro médio
quadrático de previsão
rval Correlation coefficient of
validation
Coeficiente de correlação da
validação
SDV Standard deviation of
validation
Desvio padrão dos erros de
validação
SÊN Sensitivity Sensibilidade
SO Soy Soja
TC Carbohydrate content Teor de carboidrato
TP Protein content Teor de proteína
Vclorofórmio Volume of chloroform Volume de clorofórmio
VE Energetic value Valor energético
VP Predicted value Valor previsto
Vpipeta Volume of pipet Volume da pipeta
VR Reference value Valor de referência
WH Wheat Trigo
γγγγ Analytical sensitivity Sensibilidade analítica
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Informações sobre as Figuras de Mérito utilizadas em validação
multivariada (Valderrama et al., 2007).............................................................. 17
Tabela 2: Reagentes utilizados na realização dos experimentos.................... 25
Tabela 3: Descrição das amostras de alimento utilizadas para cada grupo.... 27
Tabela 4: Valores apresentados nos rótulos para valor energético (VE) e
teores de proteína (TP) e carboidrato (TC) para as amostras analisadas........ 28
Tabela 5: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do
desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de milho.............. 46
Tabela 6: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do
desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de soja................ 47
Tabela 7: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do
desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de trigo............... 48
Tabela 8: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do
desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de mandioca....... 49
Tabela 9: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do
desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de leite................ 50
Tabela 10: Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as
amostras de soja, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e
TP o teor de proteína........................................................................................ 60
Tabela 11: Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros
relativos entre VR e VP para as amostras de soja........................................... 61
Tabela 12: Informações sobre as amostras iniciais e selecionadas para a
construção dos modelos de calibração e validação para os grupos de milho,
mandioca, leite e trigo....................................................................................... 62
Tabela 13: Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as
amostras de milho, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e
TP o teor de proteína........................................................................................ 65
xx
Tabela 14: Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros
relativos entre VR e VP para as amostras de milho......................................... 66
Tabela 15: Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as
amostras de mandioca, onde VE é o valor energético, TC o teor de
carboidrato e TP o teor de proteína.................................................................. 68
Tabela 16: Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros
relativos entre VR e VP para as amostras de mandioca.................................. 69
Tabela 17: Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as
amostras de leite, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e
TP o teor de proteína........................................................................................ 71
Tabela 18: Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros
relativos entre VR e VP para as amostras de leite........................................... 72
Tabela 19: Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as
amostras de trigo, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e
TP o teor de proteína........................................................................................ 74
Tabela 20: Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros
relativos entre VR e VP para as amostras de trigo........................................... 75
Tabela 21: Estimativa do custo e do tempo necessários para a obtenção
dos parâmetros estudados pelos métodos convencionais e proposto e da
quantidade de resíduo líquido gerado pelos métodos...................................... 77
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Diagrama de transições de raios X e suas respectivas
denominações................................................................................................... 10
Figura 2: Fotografia do bloco digestor utilizado............................................... 32
Figura 3: Fotografia do destilador de microKjeldahl utilizado.......................... 33
Figura 4: Fotografia do agitador rotatório manual utilizado............................. 36
Figura 5: Reações envolvidas no método de Kjeldahl..................................... 42
Figura 6: Espectros médios sobrepostos das amostras estudadas e
ampliação da região de espalhamento............................................................. 51
Figura 7: Gráficos de scores para o conjunto de todas as amostras, obtidos
para PC1 x PC2 (A) e para PC2 x PC4 (B)...................................................... 53
Figura 8 : Gráficos de loadings obtidos para PC1, PC2 e PC4 para o
conjunto de todas as amostras......................................................................... 53
Figura 9: Gráfico de scores para o conjunto das amostras na ausência do
grupo da soja, obtidos para PC1 x PC2............................................................ 54
Figura 10: Representação gráfica da relação entre Resíduo de Student e
Leverage para carboidrato, considerando o conjunto total de amostras e 5
variáveis latentes.............................................................................................. 55
Figura 11: Representações gráficas da relação entre Resíduo de Student e
leverage para as amostras de soja obtidas para o teor de carboidrato antes
(A) e depois (B) da exclusão dos outliers......................................................... 58
Figura 12: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios
previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis
analisadas para o conjunto de amostras de soja.............................................. 59
Figura 13: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios
previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis
analisadas para o conjunto de amostras de milho............................................ 64
Figura 14: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios
previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis
analisadas para o conjunto de amostras de mandioca..................................... 67
xxii
Figura 15: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios
previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis
analisadas para o conjunto de amostras de leite.............................................. 70
Figura 16: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios
previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis
analisadas para o conjunto de amostras de trigo............................................. 73
xxiii
LISTA DE EQUAÇÕES
EQUAÇÃO 1: Equação de Atwater.................................................................. 04
EQUAÇÃO 2: Decomposição da matriz de dados (X) resultante de
aplicação da análise por componentes principais............................................ 13
EQUAÇÃO 3: Cálculo da leverage máxima admissível de uma amostra
(hcrit). k = número de componentes principais e n = número de espectros do
conjunto de calibração...................................................................................... 38
EQUAÇÃO 4: Cálculo da porcentagem de proteína. CHCl=concentração de
HCl, MN = massa atômica do nitrogênio, VHCl=volume gasto de HCl e mi=
massa inicial da amostra.................................................................................. 43
EQUAÇÃO 5: Cálculo da porcentagem de carboidrato................................... 43
EQUAÇÃO 6: Cálculo da porcentagem de umidade. mi=massa da amostra
inicialmente pesada e mf=massa da amostra seca após o período na
estufa................................................................................................................ 44
EQUAÇÃO 7: Cálculo da porcentagem de cinzas. mi=massa da amostra
inicialmente pesada e mcinzas=massa de cinzas pesada após a carbonização
da matéria orgânica.......................................................................................... 45
EQUAÇÃO 8: Cálculo da porcentagem de gordura. Vclorofórmio=volume de
clorofórmio utilizado para a extração da gordura (20,00 mL), Vpipeta=volume
da pipeta (5,00 mL), mi=massa de amostra inicialmente pesada e mf=massa
de gordura pesada após evaporação do solvente............................................ 45
INTRODUÇÃO
1
II –– IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO
INTRODUÇÃO
3
I. 1. ROTULAGEM DE ALIMENTOS
A ciência da nutrição tenta entender como e por que aspectos específicos
da dieta influenciam a saúde. Deficiências, excessos e descontroles na dieta
podem causar impactos negativos à saúde, ocasionando muitas vezes doenças
como o escorbuto, obesidade ou osteoporose, assim como problemas
psicológicos e comportamentais. Os nutrientes nos alimentos são agrupados em
várias categorias. Os macronutrientes são as gorduras, proteínas e carboidratos.
Os micronutrientes englobam os minerais e as vitaminas. Além disso, os alimentos
contêm água e fibras. O conhecimento da composição dos alimentos consumidos
por uma população é fundamental para avaliar o suprimento e o consumo
alimentar de um país, verificar a adequação nutricional da dieta de indivíduos,
estabelecer relações entre dieta e doença, etc. (Kays et al., 1996; Torres et al.,
2000).
A rotulagem nutricional é exigida na maioria dos alimentos pré-embalados e
contém um conjunto de propriedades nutricionais do alimento que deve ser
apresentado ao consumidor (Agarwal et al., 2006; Kays et al., 1996).
Nos diversos países em que existem, as legislações relacionadas à
obrigatoriedade de informações nutricionais em produtos industrializados exigem
como descrição mínima o valor energético (ou caloria ou energia) e a quantidade
de proteína, carboidrato (glicídio), gordura (lipídio) e fibras alimentares (Celeste,
2001). Informações sobre outros componentes podem ser exigidas, dependendo
da classificação e do tipo de alimento (Kays et al., 1996).
A energia metabolizada de um alimento é geralmente expressa como valor
energético (VE). O método oficial para a obtenção de VE envolve calorimetria
direta. Neste procedimento, o conteúdo energético é obtido por meio da
combustão completa do alimento, requerendo, portanto, o uso de uma bomba
calorimétrica, muitas vezes não encontrada em laboratórios de pesquisa e de
indústria (Harris, 2001).
INTRODUÇÃO
4
Como alternativa para a obtenção de VE, Bryant e Atwater estudaram a
disponibilidade de macronutrientes nos alimentos a partir de dados experimentais
sobre a digestão de proteínas, gorduras e carboidratos. O valor de energia
metabolizada obtido por Bryant e Atwater é referido hoje em dia como “fatores
gerais de Atwater” e leva em consideração, portanto, o calor de combustão e a
digestibilidade do alimento. A equação estabelecida por Atwater (Equação 1) está
exposta a seguir, na qual P, G e C correspondem, respectivamente, a proteína,
gordura e carboidrato, estando todas estas variáveis expressas em grama. VE é o
valor energético, em kcal (Buchholz e Schoeller, 2004).
G9P4C4VE ++=
Equação 1 : Equação de Atwater.
Desta forma, na maioria das vezes, o cálculo de VE é realizado a partir
dos valores de proteínas, lipídios (gorduras) e carboidratos da amostra analisada,
conforme Equação 1. A determinação destes macronutrientes é feita a partir de
procedimentos analíticos distintos.
Os carboidratos compreendem a maior parcela da matéria seca de
plantas, sendo os componentes mais abundantes e amplamente distribuídos entre
os alimentos. Além da importância nutricional, os carboidratos são adoçantes
naturais, matéria prima para produtos fermentados e estão associados às
propriedades reológicas da maioria dos alimentos de origem vegetal (Fennema,
1996; Cecchi, 1999).
O teor de carboidrato pode ser calculado pela diferença entre 100 e a soma
das porcentagens de água, proteína, lipídios, álcool (quando presente) e cinzas
(Anvisa, 2003).
As proteínas são polímeros altamente complexos, formados a partir de um
conjunto de aminoácidos, arranjados em várias sequências específicas. As
propriedades funcionais das proteínas em alimentos variam conforme suas
INTRODUÇÃO
5
estruturas e propriedades físico químicas. Estes compostos apresentam funções
estruturais catalíticas, regulatórias, de defesa, etc (Fennema, 1996; Lehninger,
1990).
O teor de proteína pode ser calculado a partir da quantidade de nitrogênio.
A Association of Official Analytical Chemists (AOAC International, 1996)
recomenda a determinação do nitrogênio pelo método de Kjeldahl. Este método foi
desenvolvido em 1883 por Johan Kjeldahl, e consiste de uma completa digestão
das amostras em ácido sulfúrico concentrado, com catalisadores tais como sais de
cobre, em alta temperatura.
Os lipídios são biomoléculas orgânicas insolúveis em água, que podem
ser extraídas de células e tecidos por solventes orgânicos não polares. Os lipídios
possuem várias funções biológicas importantes; entre elas, são componentes
estruturais de membranas e estão relacionados ao armazenamento e transporte
de combustível metabólico (Lehninger, 1990).
Vários são os métodos encontrados na literatura para determinar a
quantidade de lipídios nas amostras. Entre estes métodos, o Bligh-Dyer (Bligh e
Dyer, 1959) é o mais simples, pois utiliza apenas tubos de ensaio, não
dependendo de nenhum equipamento específico ou sofisticado. Por outro lado,
para sua execução, são necessários solventes orgânicos tóxicos, uma vez que o
procedimento utiliza uma mistura de clorofórmio-metanol-água. A amostra é
misturada com metanol e clorofórmio numa proporção em que formam uma só
fase. Adiciona-se mais clorofórmio e água, promovendo a formação de duas fases
distintas, uma de clorofórmio, contendo lipídios, e a outra de metanol e água,
contendo substâncias não lipídicas. A fase do clorofórmio com a gordura é isolada
e, após a evaporação do solvente, obtém-se a quantidade de gordura por
pesagem.
Todos os procedimentos descritos anteriormente apresentam aspectos
negativos para análises de rotina, pois são laboriosos, lentos e geradores de
INTRODUÇÃO
6
resíduos. Em geral, envolvem o uso de ácidos concentrados ou outros reagentes
orgânicos tóxicos (AOAC International, 1996; Prentice, 2005).
I. 2. ESPECTROMETRIA DE FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X
I.2.1. BREVE HISTÓRICO
Os raios X foram descobertos em 8 de novembro de 1895 pelo físico
alemão Wilhelm Conrad Röntgen durante alguns estudos que fazia sobre a
condutividade dos gases. Por serem desconhecidos, Röntgen chamou tais raios
de X (Birks, 1969; Jenkins, 1999).
Segundo o que contam os historiadores da ciência, Röntgen estava numa
sala totalmente escura. A certa distância da válvula de gases havia uma folha de
papel, usada como tela, tratada com platinocianeto de bário. Röntgen viu a tela
brilhar, emitindo luz, fato que o espantou, uma vez que a válvula estava coberta
por uma cartolina negra e nenhuma luz ou raio catódico poderia ter vindo dela.
Então, ele fez várias investigações; entre elas, colocou diversos objetos entre a
válvula e a tela e viu que todos pareciam transparentes. Mas, ao colocar a sua
mão, ele observou na tela o registro de seus ossos perfeitamente visíveis
(Chassot, 1995).
Meses após seus estudos, Röntgen apresentou à Sociedade Físico –
Médica de Wurzburg, na Alemanha, um relatório descrevendo sua nova
descoberta. Com as perspectivas das várias aplicações que a nova descoberta
teria, Röntgen foi laureado, em 1901, com o primeiro prêmio Nobel de Física
(Bertin, 1970; Chassot, 1995; Jenkins, 1999).
Os estudiosos ligados à medicina viram na nova descoberta a possibilidade
de se ver o interior do corpo humano sem precisar abri-lo e novas investigações
sobre os “misteriosos” raios passaram a ser feitas (Chassot, 1995).
INTRODUÇÃO
7
Em 1911, Barkla mostrou que um elemento, quando estimulado pela
radiação X, emite uma radiação característica. Barkla evidenciou a série de linhas
de emissão, a qual designou de K, L, M, N, etc. (Barkla, 1911).
Estas novas descobertas auxiliaram Henry Moseley nos seus estudos para
obter uma relação entre o nº atômico, o comprimento de onda e as linhas
espectrais de raios X. Tal relação, determinada em 1913, estabelecia a base
qualitativa e quantitativa da análise espectroquímica por raios X (Birks, 1969).
Apesar de toda atenção destinada aos raios X, apenas em 1912, com os
trabalhos de Max von Laue e de Friedrich e Knipping, foi esclarecido que os raios
X eram resultados da colisão entre raios catódicos e os elétrons do cátodo
(Chassot, 1995).
O primeiro equipamento de raios X foi apresentado por Moseley, mas este
era ainda muito primitivo, sendo otimizado aos poucos. Coolidge (1913) introduziu
o filamento quente. Soller (1924) construiu um espectrofotômetro com colimadores
e Geiger e Muller (1928) desenvolveram o tubo detector preenchido com gás.
As aplicações dos raios X em Química Analítica foram iniciadas por
Hadding (1922), com estudos sobre a determinação qualitativa e quantitativa de
metais com número atômicos superiores a 12, a partir dos espectros de
fluorescência obtidos após a excitação por radiação X. Foi Hadding, portanto,
quem realizou a primeira análise envolvendo o espectro de raios X, dando início a
técnica de fluorescência de raios X, o que permitiu Coster e von Hevesy (1923)
descobrirem o elemento háfnio em 1923.
Os métodos analíticos de análise envolvendo a radiação X se
desenvolveram de maneira lenta, mesmo após a já constatação da aplicabilidade
dos mesmos por Hadding, Coster e von Hevesy. Provavelmente, isto tenha
ocorrido devido a maior aceitação por técnicas e métodos já consolidados, como
aqueles chamados de clássicos, como a gravimetria e volumetria (Szabadváry,
1966).
INTRODUÇÃO
8
O primeiro protótipo de um instrumento comercial para fluorescência de
raios X (FRX) foi proposto somente em 1948 (Friedman e Birks, 1948), mas
estudos usando esta técnica continuaram. Em 1929, já se tinha conhecimento do
espalhamento inelástico que os fótons de raios X poderiam sofrer ao interagir com
a matéria (Compton, 1929). Tal fenômeno ficou conhecido como espalhamento
Compton, em homenagem ao seu descobridor, Arthur Holly Compton, cujo
trabalho foi também reconhecido com o recebimento do prêmio Nobel de física.
As décadas de 1950 e 1960 foram marcadas por estudos na busca de
melhorias nos componentes dos equipamentos de FRX e otimização da técnica.
Então, com o passar dos anos, laboratórios de indústrias e centros de pesquisas
se interessaram mais pela técnica, principalmente à medida que suas vantagens,
como rapidez, precisão, exatidão e reprodutibilidade, foram sendo definidas. É
claro que, assim como os demais métodos ditos instrumentais, os avanços da
eletrônica e da computação contribuíram para popularizar os métodos envolvendo
a FRX. No entanto, é provável que o fato destes métodos não serem destrutivos e
não requererem preparo de amostra tenha sido a principal causa para a sua
aceitação (Bertin, 1970; Harris, 2001).
Por volta de 1970, estudiosos começaram a constatar que um novo efeito
de espalhamento (posteriormente chamado de Raman) aparecia em espectros de
raios X de amostras contendo elementos leves, para determinados ângulos entre
a amostra e o feixe. Devido a grande quantidade de espalhamento de raios X
promovida por amostras orgânicas, a técnica de FRX era considerada inadequada
para esta classe de amostras (Mizuno e Ohmura, 1967).
Com o objetivo de minimizar esta deficiência, vários estudos começaram a
ser feitos, principalmente a partir da década de 1990. A união da FRX às
ferramentas quimiométricas mostrou ser muito útil, aumentando assim a
versatilidade da técnica para diferentes tipos de amostras (Alexandre e Bueno,
2006; Bortoleto et al., 2007; Bueno et al., 2005; Goraieb et al., 2007; Molt e
INTRODUÇÃO
9
Schramm, 1999; Pereira e Bueno, 2008; Swerts et al., 1993; Terra et al., 2008a;
Terra et al., 2008b; Vasquez et al., 2002; Verbi et al., 2005, Wang et al., 1990).
I.2.2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
A fluorescência de raios X (FRX) é uma técnica de análise relacionada
com a medida de energia e intensidade características da radiação X emitida por
uma amostra irradiada com radiação eletromagnética (IUPAC, 2008).
O fenômeno fotoelétrico é o principal processo que ocorre junto com os
efeitos de espalhamento dos raios X, sendo estes últimos observados
especialmente quando a matriz é composta por elementos de baixo número
atômico.
O efeito fotoelétrico é verificado quando a fonte de raios X promove a
ejeção de elétrons da camada mais interna do átomo que foi submetido ao
processo de irradiação, o que gera uma situação extremamente instável. Então,
para estabilizar esta situação, elétrons de camadas mais externas se deslocam e
ocupam as vacâncias geradas pela emissão. Neste deslocamento há liberação de
energia que pode ser utilizada na determinação qualitativa de um elemento, uma
vez que ela é característica de cada elemento químico. Paralelamente, a
quantificação do elemento pode ser realizada pela intensidade da radiação
emitida, pois ela é proporcional à concentração da espécie (Jenkins e De Vries,
1970; Skoog et al., 2002).
Conforme as camadas envolvidas neste “deslocamento” dos elétrons, as
emissões de raios X recebem uma nomenclatura específica. A camada a ser
preenchida pelo elétron é que determina a nomenclatura da emissão. Além disso,
se o elétron se desloca para a camada mais próxima, a emissão do fóton de raios
X será denominada de α e as camadas posteriores sucessivamente de β, γ, δ, etc,
conforme esquematizado na Figura 1 (Jenkins, 1999).
INTRODUÇÃO
10
Figura 1 : Diagrama de transições de raios X e suas respectivas denominações.
Entre as vantagens tradicionais é possível destacar que a FRX: (i) é
rápida, (ii) envolve baixo custo operacional, (iii) não promove a destruição da
amostra, e, finalmente, (iv) pode fornecer simultaneamente resultados qualitativos
e quantitativos (Bertin, 1970; Skoog et al., 2002).
Estas diversas vantagens da FRX, associadas ao fato da análise envolver
mínimo (ou nenhum) preparo da amostra, fazem com que esta técnica tenha uma
ampla aplicação não só na área de química, mas também em outras ciências, tais
como medicina (Farquharson e Geraki, 2004), geologia (Schimidt et al., 2002),
biologia (Alexandre e Bueno, 2006; Bode et al., 2008), arqueologia (Calza et al.,
2006; Calza et al., 2007), etc.
Pode-se afirmar que a FRX já está bem consolidada quando aplicada a
determinações inorgânicas em elementos cuja absorção dos raios X apresenta
valores significativos (Z>11). Por outro lado, nos últimos anos vem ganhando
destaque a aplicação de FRX em estudos de amostras orgânicas, nas quais a
radiação X é intensamente dispersada (espalhada) e não apenas absorvida (efeito
fotoelétrico).
INTRODUÇÃO
11
Simultaneamente ao efeito fotoelétrico, na FRX ocorrem os efeitos
Rayleigh, Compton e Raman, relacionados ao espalhamento do feixe incidente. O
processo de espalhamento ocorre quando um fóton de raios X interage com os
elétrons dos elementos químicos, sem que haja absorção ou emissão. Todos os
átomos espalham fótons de raios X, mas a intensidade destes fenômenos
depende do número atômico e da composição da amostra (Jenkins, 1999).
O efeito Rayleigh, também chamado de espalhamento coerente, é
resultado da interação elástica de fótons de raios X com o meio. Neste caso,
portanto, não há perda de energia durante o processo de colisão, o que justifica o
fato do valor do pico máximo de energia observado no espectro de raios X para
esse efeito ser igual a do elemento utilizado na fonte de raios X (Jenkins, 1999;
IUPAC, 2008).
Já o efeito Compton (ou espalhamento incoerente) está associado ao
espalhamento inelástico de fótons de raios X, ou seja, parte da energia do fóton é
dispersada após a colisão, sendo transferida para os elétrons da camada de
valência, que sofrem excitação (Jenkins, 1999; IUPAC, 2008).
Outro espalhamento inelástico que ocorre do feixe de raios X é o Raman.
Neste caso, a perda de energia de fótons é acompanhada pela migração de
elétrons da camada K (Jenkins, 1999). Estudos mais detalhados sobre este
espalhamento (Mizuno e Ohmura, 1967; Suzuki, 1967) permitiram constatar que o
seu comportamento é variável em função do ângulo de incidência, de maneira
que, a 90º, não é observada a banda referente ao espalhamento Raman. Isto
ocorre porque, neste ângulo de incidência, o Raman fica totalmente encoberto
pelos espalhamentos Compton e Rayleigh.
Devido ao fato do espalhamento Raman não ser observado nos espectros
obtidos por fluorescência de raios X por energia dispersiva, muitos estudiosos
ignoram a sua existência ou acreditam que ele não forneça informações
relevantes.
INTRODUÇÃO
12
Hoje, entretanto, já se sabe que, com o auxílio de ferramentas
quimiométricas, a região de espalhamento da FRX pode revelar detalhes
importantes sobre as amostras, uma vez que é dependente de várias
características da amostra como composição, estrutura cristalina e concentrações
relativas de seus componentes.
Em especial, amostras que possuam muitos elementos considerados
leves (Z<11), como é o caso de amostras orgânicas, o espalhamento Raman é
muito intenso. Isto justifica o porquê da técnica de FRX sempre ter sido
considerada inadequada para estes compostos (Alexandre, 2007).
I. 3. QUIMIOMETRIA
Com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais sofisticados, a
possibilidade de aquisição de dados envolvendo a geração de uma quantidade
grande de informações, muitas vezes complexas e variadas, aumenta
proporcionalmente. Na área de química isto não é diferente, o que é comprovado
pela quantidade de variáveis que podem ser medidas em um único equipamento
para uma única amostra. Diante destes dados, a quimiometria foi ganhando
espaço e se estabelecendo, uma vez que ela passou a auxiliar os químicos na
interpretação dos resultados obtidos (Antunes, 2000; Ferreira et al., 1999; Luo,
2006; Swerts et al., 1994).
A quimiometria, segundo a Sociedade Internacional de Quimiometria, é a
área da química que emprega métodos matemáticos e estatísticos para planejar
ou selecionar experimentos de forma otimizada, fornecendo o máximo de
informações químicas com a análise dos dados (ICS, 2008).
A região de espalhamento da FRX é dependente de várias características
da amostra, fornecendo muitas informações sobre ela. Então, para explorar tal
região e obter o máximo de informações sobre amostras orgânicas, o acoplamento
INTRODUÇÃO
13
da FRX e da quimiometria tem mostrado resultados muito promissores,
fortalecendo ainda mais esta união.
Diversos são os métodos estatísticos usados no tratamento dos dados
multivariados. Entre estes estão a análise por componentes principais (PCA – do
inglês, Principal Component Analysis) e a regressão por quadrados mínimos
parciais, o PLS (do inglês, Partial Least Squares).
A PCA consiste na redução da dimensionalidade do conjunto de dados a
partir de combinações lineares das variáveis originais (Beebe et al., 1998). Então,
novas variáveis são geradas e recebem diversos nomes como, por exemplo, fator,
componente principal, autovalores, etc. As componentes principais são ortogonais
entre si, ou seja, as informações contidas em uma são diferentes das contidas na
outra. Além disso, a obtenção destas variáveis ocorre segundo uma ordem
decrescente de quantidade de informação estatística que descrevem, ou seja, a
primeira componente principal é aquela que descreve a maior parte da informação
estatística da amostra (Moita e Moita, 1998).
A análise por componentes principais é um método de agrupamento que,
além de reduzir a dimensionalidade da matriz de dados, permite verificar a
existência de amostras anômalas e as de maior importância, eliminar ruídos
experimentais, classificar as amostras e/ou agrupá-las conforme suas
semelhanças, etc. A sua aplicação implica em decompor a matriz de dados (X) em
duas outras matrizes: a de scores (T) e a de loadings transposta (P’), conforme a
Equação 2, onde E é a matriz de erros ao realizar esta decomposição (Ferreira et
al., 1999; Wold et al., 1987).
E'TPX ++++====
Equação 2 : Decomposição da matriz de dados (X) resultante de aplicação da análise por componentes principais.
INTRODUÇÃO
14
A matriz de scores expressa a relação entre as amostras, apresentando
as suas coordenadas em um novo sistema de eixos. Já a matriz de loadings
expressa a relação entre as variáveis, identificando o quanto cada uma delas
contribuiu na formação das componentes principais (Ferreira et al., 1999; Wold et
al., 1987).
Estabelecer uma relação entre a variável de interesse e as informações
(propriedades) que se tem das amostras significa construir um modelo matemático
cuja equação resultante represente tal relação. Neste modelo, a variável de
interesse é uma grandeza mensurável e o modelo é chamado de calibração
(obtido por métodos quantitativos).
Entre os métodos quantitativos para análise de dados multivariados
destaca-se o PLS. Modelos obtidos por PLS tendem a ser robustos, isto é, seus
parâmetros praticamente não se alteram com a inclusão de novas amostras no
conjunto de calibração. O PLS tem se tornado uma ferramenta extremamente útil
e importante em muitos campos da química, como a físico química, a química
analítica, a química medicinal, ambiental e ainda no controle de inúmeros
processos industriais (Beebe et al., 1998).
A regressão PLS estabelece uma relação quantitativa entre o conjunto das
respostas instrumentais (por exemplo, dados espectrais) e uma ou mais
propriedades físicas ou químicas das amostras de interesse (concentração, índice
de doçura, acidez, viscosidade, etc.), desenvolvendo um modelo matemático que
correlaciona estas informações. Este procedimento engloba duas etapas:
calibração e validação. A etapa de calibração estabelece uma relação entre a
matriz inicial de dados X (sinais instrumentais, variáveis independentes) e as
propriedades conhecidas de amostras de referência (variáveis dependentes)
organizados na matriz Y. A validação permite verificar se o modelo é capaz de
prever as propriedades de novas amostras - valores de incógnitas (Geladi e
Kowalski, 1986).
INTRODUÇÃO
15
Da mesma forma que a PCA, o PLS realiza combinações das variáveis
originais, gerando novas variáveis, geralmente chamadas de variáveis latentes. Na
construção dos modelos de regressão, a escolha do número de variáveis latentes
é uma etapa muito importante. O número ideal de variáveis latentes é aquele que
permite a construção de um modelo com boa capacidade de previsão para
amostras externas, sem super ajustar o modelo nem promover a modelagem de
ruídos (Martens e Naes, 1996).
A validação cruzada é um dos métodos mais utilizados para a
determinação do número de variáveis latentes. Neste procedimento, a calibração é
repetida n vezes, sendo que, em cada uma destas vezes, é feita a previsão das
variáveis para uma i-ésima parte do conjunto de calibração. Ou seja, uma amostra
é retirada do conjunto de n amostras e então é feita a calibração para as n-1
amostras restantes. Na sequência, a amostra não usada na calibração tem sua
variável prevista pelo modelo. O processo é repetido até que todas as amostras
tenham sido excluídas (Martens e Naes, 1996).
Os valores previstos pelo modelo são comparados com os valores de
referência e os erros são calculados. A partir destes, é obtida a soma dos
quadrados dos erros de previsão (PRESS, Predicted Residual Error Sum of
Squares) para cada variável latente. Após a construção do modelo de calibração,
amostras são utilizadas para verificar a capacidade de previsão do modelo
(Martens e Naes, 1996).
Com o objetivo de facilitar a visualização dos resultados, na maioria das
vezes, são realizados pré-processamentos nos dados originais ao realizar o
tratamento quimiométrico. O pré-processamento mais simples e mais utilizado nos
dados de espectrometria consiste em centrar os dados na média. Este
procedimento implica na subtração do elemento de cada coluna pelo valor médio
dos elementos dessa coluna, obtendo-se como resultado uma matriz na qual
todas as colunas têm média zero.
INTRODUÇÃO
16
Em algumas situações, são realizadas transformações nos espectros para
remover matematicamente fontes de variação indesejáveis. Entre estas
transformações destacam-se as técnicas de alisamento que visam aumentar a
razão sinal-ruído, e as correções da linha base, que minimizam as variações
sistemáticas presentes no sistema.
Para verificar a adequação de um procedimento analítico ou de um modelo
proposto, é realizado um processo chamado de validação. A validação permite
constatar se o procedimento ou modelo apresenta um desempenho adequado
para as condições em que será aplicado. A sua realização pode envolver a
determinação de parâmetros que são conhecidos como figuras de mérito (Sena et
al., 2007).
Poppi e colaboradores (Valderrama et al., 2007) propuseram o cálculo de
algumas figuras de mérito. Na Tabela 1 estão expressas as fórmulas para
obtenção de tais parâmetros.
INTRODUÇÃO
17
Tabela 1 : Informações sobre as figuras de mérito utilizadas em validação multivariada
(Valderrama et al., 2007).
Figuras de
Mérito Relação Matemática Definição
SÊN kb
1SÊN=
Fração do sinal responsável pelo acréscimo de uma unidade de concentração à
propriedade de interesse.
γγγγ x
SÊN
δγ = Razão entre a sensibilidade e o ruído
instrumental
RMSEP
v
lv
1i
2^
ii
l
yy
RMSEP∑
=
−=
Grau de concordância entre o valor estimado pelo modelo e o valor tido como
verdadeiro ou de referência
LOD SÊN
13b3LOD xkx δδ ==
Menor valor de sinal líquido (ou concentração) detectável para que as
probabilidades de um falso negativo (α) e um falso positivo (β) sejam iguais a 0,05.
LOQ SÊN
110b10LOQ xkx δδ ==
Valor de concentração analítica (ou sinal) que irá produzir estimativas com um
determinado desvio padrão, usualmente 10%.
tBias SDV
lBiast v
Bias =
bias é a diferença entre a média e o seu valor verdadeiro. Um teste t pode ser
utilizado para se avaliar, quantitativamente, se o bias incluso no modelo é ou não
significativo
bk é o vetor dos coeficientes de regressão estimados pelo PLS δx é uma estimativa do desvio padrão da flutuação do sinal analítico
v
lv
1i
^
ii
l
yy
Bias∑=
−= e
1l
Biasyy
SDVv
2
i
^
i
−
−
−=∑
Iv é o número de amostras do conjunto de validação yi é o valor de referência e ŷi é o valor previsto pelo modelo
OBJETIVOS
19
IIII –– OOBBJJEETTIIVVOOSS
OBJETIVOS
21
II. 1. OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho foi verificar a potencialidade de um novo
procedimento a partir da aliança entre a FRX e a quimiometria para a
quantificação do valor energético e o teor de alguns macronutrientes (proteínas e
carboidratos) contidos em amostras comerciais de farinhas e extratos para
consumo humano, visando minimizar os aspectos negativos dos métodos
convencionais e obter resultados que se enquadrem na legislação vigente no
Brasil, isto é, com erro máximo de 20% (RDC 360, portaria 42, de 23 de dezembro
de 2003 - ANVISA).
EXPERIMENTAL
23
IIIIII –– EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
EXPERIMENTAL
25
III. 1. REAGENTES
Todos os experimentos foram realizados com reagentes de pureza analítica
(Tabela 2), seguindo-se procedimentos recomendados pela literatura (Baccan et al., 2001;
Jeffery et al., 1992). Para a preparação das soluções, foi utilizada água destilada
(destilador de vidro) como solvente, exceto para o preparo das soluções de fenolftaleína,
verde de bromocresol e vermelho de metila, para o qual foi usado álcool comercial 99,3°,
Chemco. As soluções foram utilizadas com prazo máximo de 7 dias após a data do
preparo.
Tabela 2 : Reagentes utilizados na realização dos experimentos.
Regentes Marca
Ácido bórico Synth
Ácido clorídrico Merck
Ácido sulfúrico Ecibra
Carbonato de sódio Synth
Clorofórmio Synth
Etanol Nuclear
Fenolftaleína Nuclear
Hidróxido de sódio Dinâmica
Peróxido de hidrogênio 30% Ecibra
Sulfato cúprico Ecibra
Sulfato de potássio Ecibra
Sulfato de sódio Vetec
Verde de bromocresol Carlo Erba
Vermelho de metila Berzog
EXPERIMENTAL
26
III. 2. AMOSTRAS
Foram utilizadas neste trabalho 55 amostras comerciais de farinhas e
extratos para consumo humano de marcas variadas. Esta quantidade foi
estipulada em função da disponibilidade de amostras em supermercados da
região de Campinas-SP (Brasil) na ocasião da aquisição das mesmas. As
amostras foram agrupadas conforme a sua origem: milho (COrn), soja (SOy), trigo
(WHeat) e mandioca (CAsava). Também foram incluídas no conjunto amostral,
farinhas lácteas de cereais que, além de cereais, possuem leite em sua
composição. Para efeito de agrupamento, a origem destas amostras foi atribuída
ao leite (MIlk), pois na maior parte destas, mais de um vegetal estava presente.
Para alguns produtos, foi analisada mais de uma marca. As amostras
flocadas foram trituradas com auxílio de almofariz e pistilo antes de serem
utilizadas.
A descrição das amostras, com base nas informações dos fabricantes, pode
ser verificada na Tabela 3. Já na Tabela 4, são apresentados os valores de rótulo
das amostras para os parâmetros analisados. Estes valores foram convertidos
para 100 g de amostra, uma vez que cada produto apresentava os valores para
uma quantidade diferente de amostra.
EXPERIMENTAL
27
Tabela 3 : Descrição das amostras de alimento utilizadas para cada grupo.
Grupo Amostras Descrição do Alimento Aspecto Físico
da Amostra
Milho (CO)
CO1-CO2, Fubá de Milho pó
CO3-CO5, CO7, CO9 Farinha de Milho floco
CO6, CO11 Farinha de Milho grânulo
CO8, CO12 Amido de Milho pó
CO10 Sêmola de Milho grânulo
Soja (SO)
SO1-SO3, SO9-SO10 Extrato de Soja pasta
SO4-SO6 Alimento Instantâneo com
Proteína de Soja pó
SO7 Fibra de Soja pó
SO12 Fibra de Soja grânulo
SO8, SO11 Farinha de Soja pasta
Trigo (WH)
WH1, WH6, WH9 Farinha de Trigo pó
WH2-WH3, WH5 Farinha de Rosca grânulo
WH4 Farelo de Trigo Integral grânulo
WH7 Farinha de Trigo Integral pó
WH8 Gérmen de Trigo Tostado grânulo
WH10-WH12 Fibra de trigo grânulo
Mandioca (CA)
CA1-CA2 Farinha de Mandioca
Temperada grânulo
CA3, CA8, CA11 Farinha de Mandioca Crua grânulo
CA4-CA5, CA12 Farinha de Mandioca
Torrada grânulo
CA6, CA9 Polvilho Doce pó
CA7, CA10 Fécula de Mandioca pó
Leite (MI)
MI2, MI4, MI6 Farinha Láctea pó
MI3 Farinha Láctea grânulo
MI1, MI7 Farinha Láctea de Cereais floco
MI5 Farinha Láctea de Cereais
Integral floco
EXPERIMENTAL
28
Tabela 4 : Valores apresentados nos rótulos para valor energético (VE) e teores de
proteína (TP) e carboidrato (TC) para as amostras analisadas.
Grupo Amostra VE (kcal/100g) TP (g/100g) TC (g/100g)
Milho
CO1 340 8,0 78
CO2 340 8,0 78
CO3 327 7,1 69
CO4 338 7,1 73
CO5 350 7,5 80
CO6 350 7,5 80
CO7 350 7,5 82
CO8 340 0 85
CO9 381 6,7 86
CO10 350 7,5 80
CO11 365 7,5 78
CO12 400 0 90
Soja
SO1 413 40 28
SO2 442 31 42
SO3 490 25 40
SO4 355 36 47
SO5 500 37 38
SO6 469 26 37
SO7 200 37 12
SO8 460 37 31,0
SO9 433 40 21,0
SO10 460 21 31
SO11 500 45 28
SO12 200 37 12
EXPERIMENTAL
29
Grupo Amostra VE (kcal/100g) TP (g/100g) TC (g/100g)
Trigo
WH1 360 0 76
WH2 370 10,3 77
WH3 370 10,3 77
WH4 340 14,0 72
WH5 373 12,3 80
WH6 360 10,0 76
WH7 360 13,8 73
WH8 340 27,0 37
WH9 344 10,0 76
WH10 180 15,0 20
WH11 150 16,0 22
WH12 150 20 72
Mandioca
CA1 357 3 77
CA2 357 0 77
CA3 356 1,6 88
CA4 380 1,8 92
CA5 358 0 88
CA6 350 0 85
CA7 355 0 90
CA8 360 2 86
CA9 355 0 90
CA10 345 0 85
CA11 338 1,8 83
CA12 380 1,8 93
EXPERIMENTAL
30
Grupo Amostra VE (kcal/100g) TP (g/100g) TC (g/100g)
Leite
MI1 332 9,8 82
MI2 410 13,0 73
MI3 600 10,0 73
MI4 433 6,7 83
MI5 393 12,7 70
MI6 397 12,7 73
MI7 358 10,4 75
III. 3. EQUIPAMENTOS
� Balança analítica, marca Ohaus, modelo Analytical Plus;
� Bloco digestor MicroKjeldahl para 40 provas, marca Tecnal, modelo TE-40-25;
� Destilador MicroKjeldahl, marca Tecnal, modelo TE-036/1;
� Espectrômetro de fluorescência de raios X por dispersão de energia (EDXRF)
marca Shimadzu, modelo EDX-700, constituído por um tubo de Rh e um detector
semi-condutor de Si(Li);
� Estufa com circulação de ar, marca Nova Ética, modelo 400/3ND, série 0766/00;
� Mufla, marca Fornitec Rebert Shaw Pyrotec.
EXPERIMENTAL
31
III. 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
III. 4. 1 – MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE
Todos os procedimentos descritos a seguir foram realizados em triplicata
para cada uma das amostras.
A – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA - MÉTODO MICROKJELDAHL (AOAC
International, 1996)
O método microKjeldahl envolveu 3 etapas: digestão, destilação e titulação.
• Digestão:
Em 1 tubo de microKjeldahl de 100 mL foram adicionados 200 mg de
amostra pesados em balança analítica, 1,5 g de mistura de catalisador (96%
K2SO4 + 4% CuSO4.5H2O) e 3 mL de H2SO4 concentrado, adicionados com
proveta.
Em seguida, o tubo foi colocado no bloco digestor (Figura 2), que foi
aquecido até 100 ºC, permanecendo nesta temperatura por 30 minutos. A
temperatura foi então elevada de 20 em 20 ºC, permanecendo por 15 minutos em
cada temperatura, para evitar que a amostra levantasse fervura bruscamente e
espirrasse.
Quando a temperatura do bloco atingiu 360 ºC, o tubo foi retirado do bloco
e colocado para esfriar a temperatura ambiente. Se ainda eram observados
resíduos carbonizados, algumas gotas de peróxido de hidrogênio 30% eram
adicionadas ao tubo para auxiliar na digestão dos mesmos; o tubo era novamente
aquecido, elevando a temperatura aos poucos, até atingir 360 ºC.
EXPERIMENTAL
32
Figura 2: Fotografia do bloco digestor utilizado
• Destilação:
O tubo de microKjeldahl contendo a amostra digerida e sem resquícios de
resíduos carbonizados foi colocado em uma das extremidades do destilador de
Kjeldahl. Na saída do destilador, foi colocado um erlemmeyer de 250 mL contendo
10 mL de ácido bórico 20 g L-1, 4 gotas de vermelho de metila 1 g L-1 e 6 gotas de
verde de bromocresol 1 g L-1. A ponta do destilador ficou totalmente mergulhada
na solução ácida.
Em seguida, o destilador foi ligado e aproximadamente 10 mL de NaOH
400 g L-1 foram adicionados ao sistema por uma válvula localizada na parte
superior do destilador (Figura 3). Prosseguiu-se com a destilação até obtenção de
aproximadamente 100 mL de destilado.
EXPERIMENTAL
33
Figura 3 : Fotografia do destilador de microKjeldahl utilizado.
• Titulação:
O destilado obtido na etapa de destilação foi titulado com ácido clorídrico
0,02 mol L-1, previamente padronizado, conforme recomendado na literatura
(Baccan et al., 2001).
Foi calculado então o teor de proteína presente na amostra.
NaOH
EXPERIMENTAL
34
B – QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATO - MÉTODO DA DIFERENÇA
(ANVISA, 2003)
O teor de carboidrato foi calculado pela diferença entre 100 e a soma das
porcentagens de proteína, umidade, cinzas e lipídios determinadas pelos
procedimentos apresentados nos itens III.4.1A, III.4.1B1, III.4.1B2 e III.4.1B3,
respectivamente.
• B1 – QUANTIFICAÇÃO DE UMIDADE (AOAC International, 1996)
Cadinhos de alumínio e suas respectivas tampas foram limpos e secos em
estufa com circulação de ar, por 30 minutos, a 110 ºC. Os cadinhos e tampas
foram colocados em dessecador para esfriar, antes de terem suas massas
medidas.
Em seguida, foram adicionados 2 g de amostras, pesados em balança
analítica. O cadinho com a amostra foi colocado na estufa, sem tampa, por 4 h, a
105 ºC. Decorrido este período, o cadinho foi retirado da estufa, tampado para
evitar a absorção de umidade do meio, e colocado em dessecador. Quando frio,
foi pesado novamente com a tampa.
Na sequência, o cadinho foi levado por mais 30 minutos na estufa a 105 ºC;
sendo pesado novamente depois deste tempo. Este procedimento foi repetido até
a obtenção de massa constante.
Foi feito o cálculo do teor de umidade na amostra, levando em
consideração as três replicatas.
• B2 – QUANTIFICAÇÃO DE CINZAS (AOAC International, 1996)
Cadinhos de porcelana foram previamente limpos e aquecidos a 550 ºC,
por 30 minutos, em mufla. Os cadinhos foram colocados em dessecador para
esfriar, antes de terem suas massas medidas.
EXPERIMENTAL
35
Em seguida, 2 g de amostra, pesados em balança analítica, foram
transferidos para um cadinho, que foi levado novamente a 550 ºC em mufla.
A amostra só foi retirada da mufla após toda parte orgânica ter sido
carbonizada (obtenção de um material esbranquiçado ou cinzento). O cadinho foi
deixado em dessecador para esfriar, sendo pesado logo em seguida, em balança
analítica.
Foi feito o cálculo do teor de cinzas na amostra.
• B3 - QUANTIFICAÇÃO DE GORDURA - BLIGH-DYER (Bligh e Dyer, 1959)
Medidos em balança analítica, 3 g de amostra foram adicionados em um
tubo de ensaio de 70 mL com tampa de rosca. A este tubo foram transferidos, com
auxílio de buretas, 10 mL de clorofórmio, 20 mL de metanol e 8 mL de água
destilada.
O tubo tampado foi então agitado por 30 minutos em um agitador rotatório
manual (Figura 4). Em seguida, foram adicionados com buretas 10 mL de
clorofórmio e 10 mL de solução de sulfato de sódio 15 g L-1. O tubo foi agitado por
mais 2 minutos e deixado em descanso por 40 minutos em geladeira para
separação das fases.
As fases foram separadas, sendo a que continha metanol e água
descartada devidamente e a com clorofórmio, mantida no tubo de ensaio. Foi
adicionado aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro no tubo, que foi
tampado e agitado para remover possíveis traços de água que tivessem
permanecido. O conteúdo do tubo foi filtrado, utilizando funil de vidro e papel de
filtro contendo aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro.
Com o auxílio de pipeta volumétrica, 5 mL do filtrado foram transferidos
para um béquer de 50 mL previamente, limpo, seco e pesado. O béquer foi
colocado em estufa a 105 ºC até evaporação total do solvente. Após resfriado em
EXPERIMENTAL
36
dessecador, o béquer foi novamente pesado e o teor de gordura na amostra foi
calculado.
Figura 4 : Fotografia do agitador rotatório manual utilizado.
C – QUANTIFICAÇÃO DE VALOR ENERGÉTICO (Buchholz e Schoeller, 2004)
O cálculo de VE foi realizado conforme a Equação 1 (p. 4), a partir dos
valores de proteínas, carboidratos e lipídios (gorduras) da amostra analisada,
determinados pelos procedimentos descritos nos itens III.4.1 A, III.4.1 B e
III.4.1 B3, respectivamente.
III. 4. 2 – MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X
• Medidas Analíticas:
Celas de FRX (Chemplex 1300, diâmetro externo de 30,7 mm e volume
interno de 7 cm3) foram montadas com seu fundo sustentado por um filme de
Mylar (Chemplex 100), de espessura de 2,5 µm.
As celas foram preenchidas com a amostra, garantindo completa absorção
do feixe de raios X (modo de espessura infinita). A voltagem aplicada no tubo de
raios X foi igual a 50 kV, com 25% de tempo morto. Os espectros foram obtidos
EXPERIMENTAL
37
sequencialmente, com uma resolução de 0,02 keV, de 0 a 40 keV. O tempo de
irradiação foi de 120 s e para cada amostra foram preparadas 3 celas de FRX,
resultando em 165 espectros.
• Tratamento dos dados:
O tratamento dos dados foi realizado com o programa computacional
Pirouette® 3.11 (Infometrix Co., 2003).
Os dados do espectro inteiro (incluindo a região de espalhamento de raios
X) foram submetidos a tratamento quimiométrico por PCA e PLS, para a
construção dos modelos de calibração e validação. Para todos os casos, o pré-
processamento utilizado foi o de dados centrados na média, o que, de maneira
geral, consiste em subtrair o elemento de cada coluna pelo valor médio dos
elementos dessa coluna, obtendo-se como resultado uma matriz de emissão de
raios X. Os espectros não sofreram qualquer tipo de transformação.
Para a PCA, todos os 165 espectros foram usados para verificar a
possibilidade de separação entre as amostras de cada classe (milho, trigo, soja,
mandioca e leite). O número adequado de componentes principais foi determinado
pela porcentagem de variância acumulada e, uma vez selecionado este número,
foi examinado o gráfico dos scores para verificar a distribuição das amostras.
Foi verificada a possibilidade de construção de modelos de calibração,
utilizando-se todas as amostras num único conjunto. Para este conjunto, foram
primeiramente identificados os outliers, através de duas grandezas
complementares: leverage e resíduo de Student.
A leverage é uma medida da influência de uma amostra no modelo de
regressão. Um valor de leverage pequeno indica que a amostra em questão
influencia pouco na construção do modelo de calibração. Por outro lado, se as
medidas experimentais de uma amostra são diferentes de outras do conjunto de
calibração, ela provavelmente terá alta influência no modelo, que poderá ser
EXPERIMENTAL
38
negativa. Em geral, amostras com leverage maior do que hcrit (Equação 3) devem
ser consideradas suspeitas e analisadas cautelosamente (Ferreira et al., 1999).
nk3
hcrit =
Equação 3 : Cálculo da leverage máxima admissível de uma amostra (hcrit). k =
número de componentes principais e n = número de espectros do conjunto de
calibração.
O resíduo de Student é calculado pela validação cruzada e está relacionado
ao resíduo da variável dependente. Amostras mal modeladas terão resíduos altos.
Supondo-se que os resíduos são normalmente distribuídos, e sabendo-se que
eles são definidos em unidades de desvio padrão do valor médio, os valores com
± 2,5 são considerados altos sob as condições usuais de estatísticas. Ferreira e
colaboradores (1999) descrevem a maioria das fórmulas associadas à leverage e
resíduo de Student para os modelos de calibração, sendo aqui citados como
referência para mais informações sobre este tópico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
39
IIVV –– RREESSUULLTTAADDOOSS EE DDIISSCCUUSSSSÃÃOO
RESULTADOS E DISCUSSÃO
41
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e discussão serão apresentados em itens, conforme os
métodos e procedimentos realizados. Para os métodos convencionais (item IV.1),
os valores obtidos para todas as variáveis estudadas estão apresentados nas
Tabelas 5 a 9, no final deste item.
IV. 1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE
A – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA - MÉTODO MICROKJELDAHL
O método microKjeldahl envolveu 3 etapas: digestão, destilação e titulação.
Na etapa de digestão, o nitrogênio da proteína foi transformado em sulfato
de amônio, resultando num produto de cor verde esmeralda, sem resíduos
carbonizados. A digestão completa de cada amostra demorou aproximadamente 4
horas.
A amostra digerida foi acoplada ao destilador de Kjeldahl. O sistema foi
aquecido e hidróxido de sódio concentrado foi adicionado, para proporcionar a
liberação da amônia. Cabe ressaltar que o destilador é um sistema fechado, e,
portanto, impede a perda de amônia por volatilização. A amônia foi liberada em
uma solução de acido bórico de concentração conhecida, formando o borato de
amônio. A etapa de destilação demorou cerca de 10 minutos por amostra.
Finalmente, o borato de amônio foi titulado com uma solução de HCl
padronizada, para a quantificação do nitrogênio presente na amostra.
Todas as reações envolvidas nas etapas do método de Kjeldahl estão
apresentadas na Figura 5:
RESULTADOS E DISCUSSÃO
42
OH2SONaNH2NaOHSO)(NH 2423424 ++→+
324333 BOHNHBOHNH →+
ClNHBOHHClBOHNH 433324 +→+
Figura 5 : Reações envolvidas no método de Kjeldahl
No método de Kjeldahl, é determinado todo o nitrogênio orgânico presente
na amostra, ou seja, o protéico e o não protéico. Porém, na maioria dos alimentos,
o nitrogênio não protéico representa uma pequena parcela do total. A razão entre
o nitrogênio medido e a proteína estimada depende do tipo de amostra. Em geral,
considera-se o fator 6,25 para os alimentos, uma vez que em média 16% das
proteínas correspondem ao nitrogênio ( 25,616
100 = ) (Cecchi, 1999).
As replicatas foram comparadas, utilizando-se o teste Q, para verificar se
diferiram significativamente entre si com 95% de confiança (Miller e Miller, 2000;
Baccan et al., 2001). Foi calculado o valor médio da quantidade de proteína entre
as replicatas não excluídas pelo teste Q, aplicando-se a Equação 4. Foi
considerada a massa atômica do nitrogênio (MN) igual a 14 g mol-1 e a
concentração de ácido clorídrico (CHCl) igual a média dos valores obtidos para as
seis replicatas da titulação de padronização do mesmo.
H2SO4
∆ + catalisador (NH4)2SO4 Amostra (N)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
43
mi
25,6..VH.Cproteína% NClHCl Μ
=
Equação 4 : Cálculo da porcentagem de proteína. CHCl=concentração de HCl, MN =
massa atômica do nitrogênio, VHCl=volume gasto de HCl e mi= massa inicial da
amostra.
B – QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATO - MÉTODO DA DIFERENÇA
Nas tabelas de composição de alimentos, o conteúdo de carboidratos tem
sido fornecido como “carboidratos totais” pela diferença, isto é, as porcentagens
de água, proteína, gordura e cinza subtraídas de 100, conforme Equação 5:
)gordura%proteína%cinzas%umidade(%100ocarboidrat% +++−=
Equação 5 : Cálculo da porcentagem de carboidrato.
• B1 – QUANTIFICAÇÃO DE UMIDADE
O método mais utilizado para quantificação da umidade em alimentos é
através da secagem em estufa, no qual a remoção da água é feita por
aquecimento, sendo o ar quente absorvido por uma camada muito fina do alimento
e então transportado para o interior, por condução.
O tempo para se obter massa constante das amostras e, portanto, garantir
que toda a água das mesmas fosse removida, variou entre 5 e 6 horas, conforme
a amostra. O elevado tempo observado se deve à baixa condutividade dos
alimentos analisados, o que torna mais difícil o calor se dissipar para as porções
mais internas da amostra.
As triplicatas de cada amostra tiveram seus valores comparados através do
teste Q para verificar se eles não diferiam significativamente, com 95% de
RESULTADOS E DISCUSSÃO
44
confiança. Então, foram calculados os valores médios entre as replicatas que não
foram rejeitadas pelo teste Q. Para isso, foi utilizada a Equação 6:
mi100).mfmi(
umidade%−=
Equação 6 : Cálculo da porcentagem de umidade. mi=massa da amostra
inicialmente pesada e mf=massa da amostra seca após o período na estufa.
� B2 – QUANTIFICAÇÃO DE CINZAS
As cinzas de um alimento correspondem ao resíduo inorgânico que
permanece após a queima da matéria orgânica, que é transformada
principalmente em CO2, H2O e NO2. Os componentes mais abundantes das cinzas
de um alimento são: K, Na, Ca e Mg (Cecchi, 1999).
A cinza obtida não é necessariamente da mesma composição que a
matéria mineral presente originalmente no alimento, pois podem ocorrer perdas
por volatilização ou alguma interação entre os constituintes da amostra. Os
elementos minerais se apresentam na cinza sob a forma de óxidos, sulfatos,
fosfatos, silicatos e cloretos; dependendo das condições de incineração e da
composição do alimento (Cecchi, 1999).
As cinzas obtidas para as amostras analisadas apresentaram coloração
variada. De maneira geral, as amostras de trigo tenderam para uma cor
acinzentada enquanto as demais ficaram de branco a bege.
O tempo necessário para a obtenção das cinzas variou entre 14 e 16 horas,
conforme a amostra.
Antes de realizar o cálculo do teor de cinzas, foi verificado, através da
aplicação do teste Q, se as replicatas diferiram significativamente entre si com
95% de confiança (Miller e Miller, 2000; Baccan et al., 2001). Então, foi calculado o
valor médio do teor de cinzas (Equação 7) entre as replicatas não excluídas pelo
teste Q.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
45
mim.100
cinzas% cinzas=
Equação 7 : Cálculo da porcentagem de cinzas. mi=massa da amostra
inicialmente pesada e mcinzas=massa de cinzas pesada após a carbonização da
matéria orgânica.
B3 - QUANTIFICAÇÃO DE GORDURA - BLIGH-DYER
O método de Bligh-Dyer apresenta algumas vantagens em relação à
extração a quente. É um procedimento simples, que não necessita de
equipamentos especializados ou sofisticados. Este método pode ser aplicado para
amostras com altos teores de umidade, assim como para as amostras ditas secas.
Além disso, é possível destacar a capacidade de, com este procedimento,
promover a extração de todas as classes de lipídios, inclusive os polares.
Por outro lado, o uso de vários solventes e altos volumes são aspectos
negativos, porém estes também estão presentes em extrações feitas a quente.
O tempo necessário para se realizar o procedimento foi de 90 minutos por
amostra.
O cálculo do teor de gordura nas amostras foi feito utilizando a Equação 8 e
apenas com os valores das replicatas não rejeitadas pelo teste Q com 95% de
confiança.
pipeta
oclorofórmi
V.mi
100.mf.Vgordura% =
Equação 8 : Cálculo da porcentagem de gordura. Vclorofórmio=volume de clorofórmio
utilizado para a extração da gordura (20,00 mL), Vpipeta=volume da pipeta (5,00
mL), mi=massa de amostra inicialmente pesada e mf=massa de gordura pesada
após evaporação do solvente.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
46
C – QUANTIFICAÇÃO DE VALOR ENERGÉTICO
A equação estabelecida por Atwater (Equação 1, p.4) foi utilizada para o
cálculo do valor energético, levando em consideração os valores médios obtidos
para proteína, gordura e carboidrato.
Tabela 5 : Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão
dos parâmetros avaliados para as amostras de milho.
Amostra Umidade 1
(g/100g)
Cinzas 1
(g/100g)
Proteína 1
(g/100g)
Gordura 1
(g/100g)
Carboidrato 2
(g/100g)
Valor
Energético 2
(kcal/100g)
CO1 11,9±0,1 0,64±0,09 7,5±0,2 3,2±0,7 76,8±0,7 366±1
CO2 12,27±0,02# 0,30±0,06 5±1 1,34±0,02 81±1 356±1
CO3 11,77±0,05 4,54±0,03 6,5±0,1# 2,3±0,1 74,9±0,2 346,2±0,2
CO4 12,32±0,05 0,58±0,03 6,80±0,01 2,35±0,06 77,90±0,08 360,1±0,1
CO5 14±3 0,27±0,01 6,7±0,9 1,2±0,1 78±3 348±3
CO6 12,4±0,1 0,22±0,02 5±2 1,07±0,05 81±2 355±3
CO7 12,32±0,05 0,22±0,06 7,5±0,2 1,07±0,03 78,9±0,2 355,2±0,3
CO8 12,86±0,06 0,069±0,007 0,67±0,05 0,39±0,06 86,0±0,1 350,2±0,1
CO9 9,12±0,03 1,36±0,02 5,5±0,3 1,6±0,3 83,0±0,4 363,3±0,6
CO10 13±1 0,32±0,04 6,7±0,1 0,6±0,6 79±1 350±1
CO11 9,23±0,02# 0,368±0,004# 7,61±0,09 1,0±0,2 81,8±0,2 366,6±0,3
CO12 8±2 3,53±0,02 0,56±0,07 0,10±0,09 88±2 354±2 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%
2=valor calculado a partir dos valores médios
#=parâmetro que teve uma replicata rejeitada pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% ou excluída
devido a erros determinados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
47
Tabela 6 : Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão
dos parâmetros avaliados para as amostras de soja.
Amostra Umidade 1
(g/100g)
Cinzas 1
(g/100g)
Proteína 1
(g/100g)
Gordura 1
(g/100g)
Carboidrato 2
(g/100g)
Valor
Energético 2
(kcal/100g)
SO1 5,2±0,4 5,15±0,08 45±2 18±2 27±3 446±4
SO2 6,50±0,08 6,07±0,02# 29,7±0,8 15±5 43±5 423±7
SO3 4,0±0,1 5,69±0,08# 25,2±0,5 22,6±0,2 42,5±0,6 474,6±0,8
SO4 8,9±0,6 8,92±0,09 25,5±0,5 0,00 56,7±0,8 328,8±0,9
SO5 6,30±0,01 6,98±0,04# 25,6±0,4 24,6±0,4 36,6±0,6 469,9±0,8
SO6 6,3±0,4 7,00±0,02 32,3±0,2 24±5 30±5 467±7
SO7 7,3±0,2 5,49±0,03 34,30±0,08 2,2±0,1# 50,8±0,2 359,9±0,2
SO8 5,55±0,04 5,2±0,1 40,4±0,2 23,6±0,4 25,3±0,5 474,9±0,7
SO9 7,16±0,08 4,71±0,01 39,8±0,2 26±1# 22±1 485±1
SO10 7,40±0,03 4,9±0,1 39,2±0,3 24,3±0,4 24,1±0,5 472,1±0,7
SO11 5,8±0,1 5,05±0,01 39,87±0,03# 22,0±0,4 27,3±0,4 466,7±0,6
SO12 9,3±0,1 3,9±0,2 13,9±0,2 4,4±0,4 68,5±0,5 368,9±0,7 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%
2=valor calculado a partir dos valores médios
#=parâmetro que teve uma replicata rejeitada pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% ou excluída
devido a erros determinados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
48
Tabela 7 : Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão dos
parâmetros avaliados para as amostras de trigo.
Amostra Umidade 1
(g/100g)
Cinzas 1
(g/100g)
Proteína 1
(g/100g)
Gordura 1
(g/100g)
Carboidrato 2
(g/100g)
Valor
Energético 2
(kcal/100g)
WH1 12,5±0,1 0,56±0,03 12,38±0,08 1,57±0,04 73,0±0,1 355,6±0,2
WH2 10,38±0,07 0,77±0,02 9,52±0,07 2,0±0,4 77,3±0,4 365,3±0,6
WH3 9,15±0,07 0,928±0,001# 11±1 2,2±0,2 77±1 371±1
WH4 11,1±0,2 1,70±0,08# 14,4±0,1 2,04±0,09# 70,8±0,3 359,2±0,3
WH5 9,69±0,2 1,3±0,1 13,5±0,1 1,4±0,3 74,1±0,4 363,1±0,5
WH6 12,92±0,09 0,509±0,006 12,9±0,1 1,24±0,07# 72,5±0,2 352,5±0,2
WH7 11,4±0,1 1,53±0,02 12,60±0,08 1,4±0,2 73,0±0,2 355,5±0,3
WH8 9,2±0,2 4,3±0,2 32,3±0,2 10,5±0,1 43,7±0,4 398,3±0,4
WH9 12,5±0,2 0,46±0,02 11,02±0,03 1,6±0,2 74,4±0,3 356,1±0,4
WH10 10,31±0,07 4,39±0,07 16,1±0,2 4,5±0,1 64,7±0,2 363,9±0,3
WH11 24±3 5,0±0,1 16,3±0,2 4,19±0,09 51±3 305 ±3
WH12 11,7±0,1 4,85±0,04 17,8±0,4 4,4±0,1 61,3±0,4 356,2±0,6 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%
2=valor calculado a partir dos valores médios
#=parâmetro que teve uma replicata rejeitada pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% ou excluída
devido a erros determinados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
49
Tabela 8 : Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão
dos parâmetros avaliados para as amostras de mandioca.
Amostra Umidade 1
(g/100g)
Cinzas 1
(g/100g)
Proteína 1
(g/100g)
Gordura 1
(g/100g)
Carboidrato 2
(g/100g)
Valor
Energético 2
(kcal/100g)
CA1 2,7±0,2# 2,6±0,3 1,7±0,1 5,9±0,1 87,1±0,4 408,7±0,4
CA2 8,04±0,07 2,3±0,1 1,5±0,3 6,0±0,8 82,2±0,9 389±1
CA3 9,74±0,05 0,93±0,02 1,7±0,2 0,6±0,2 87,0±0,3 360,6±0,4
CA4 7,8±0,8 0,98±0,01 1,6±0,1 0,9±0,6 89±1 371±1
CA5 11±3 0,86±0,04 1,1±0,3 0,61±0,08 86±3 355±3
CA6 11,3±0,1 0,05±0,02 0,1±0,1 0,22±0,01 88,4±0,1 355,8±0,2
CA7 12,93±0,04 0,07±0,06 0,36±0,03 0,04±0,02 86,61±0,08 348,23±0,09
CA8 18±2 0,6±0,5 1,1±0,1 0,48±0,01 80±2 328±2
CA9 12,09±0,01# 0,12±0,07 0,4±0,3 0,11±0,01 87,3±0,3 351,7±0,4
CA10 13,07±0,04 0,25±0,01 0,3±0,3 0,02±0,02 86,4±0,3 346,8±0,4
CA11 10,02±0,02 0,9±0,1 1,04±0,06 0,52±0,04 87,5±0,1 358,7±0,1
CA12 6,82±0,03 0,7±0,1 1,3±0,1 0,42±0,07 90,7±0,2 372,1±0,2 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%
2=valor calculado a partir dos valores médios
#=parâmetro que teve uma replicata rejeitada pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% ou excluída
devido a erros determinados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
50
Tabela 9 : Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão
dos parâmetros avaliados para as amostras de leite.
Amostra Umidade 1
(g/100g)
Cinzas 1
(g/100g)
Proteína 1
(g/100g)
Gordura 1
(g/100g)
Carboidrato 2
(g/100g)
Valor
Energético 2
(kcal/100g)
MI1 4,3±0,1 1,360±0,006 8,78±0,09# 1,7±0,8 83,9±0,8 386±1
MI2 3,71±0,06 2,04±0,02 12,5±0,1 6,2±0,2 75,6±0,2 408,2±0,3
MI3 5,12±0,02 1,552±0,008 11,8±0,2 3,97±0,05 77,6±0,2 393,2±0,3
MI4 3,9±0,1 0,73±0,03 6,1±0,2 1,7±0,1 88,2±0,3 386,7±0,3
MI5 5,82±0,08 2,15±0,09 14,3±0,4 2,5±0,6 75,2±0,7 381±1
MI6 7,9±0,2 2,08±0,07 12,7±0,3 2,7±0,3 74,6±0,5 373,9±0,6
MI7 8,6±0,3 4,7±0,1 13,0±0,2 1,9±0,1# 71,7±0,4 356,1±0,5 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%
2=valor calculado a partir dos valores médios
#=parâmetro que teve uma replicata rejeitada pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% ou excluída
devido a erros determinados.
A ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) é o órgão brasileiro
que, entre outras funções, é responsável por “promover a proteção da saúde da
população por intermédio do controle sanitário da produção e da comercialização
de produtos e serviços submetidos à vigilância sanitária, inclusive dos ambientes,
dos processos, dos insumos e das tecnologias a eles relacionados” (ANVISA,
2008). É a ANVISA, portanto, que estabelece a legislação relacionada à
elaboração dos rótulos dos alimentos embalados, além de fiscalizar o
cumprimento da mesma.
Conforme a resolução RDC 360, da portaria 42, de 23 de dezembro de
2003 (ANVISA, 2008), aos valores de nutrientes declarados no rótulo há uma
tolerância de 20%.
Como curiosidade, foram comparados os valores obtidos para valor
energético, carboidrato e proteína pelos métodos convencionais e apresentados
RESULTADOS E DISCUSSÃO
51
na Tabela 5 com os valores fornecidos pelos fabricantes. Esta comparação
permitiu verificar que 42 das 55 amostras analisadas (76%) apresentaram pelo
menos uma das informações fora da tolerância da ANVISA, ou seja, com erros
superiores a 20%. Isso deve refletir a pouca fiscalização que se tem feito nos
rótulos dos alimentos comercializados no país. Possivelmente, a fiscalização seja
feita em cima de como o rótulo é apresentado, e não na fidedignidade dos valores.
IV. 2. MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X
Os espectros de fluorescência de raios X obtidos para as amostras
estudadas estão apresentados na Figura 6.
Figura 6 : Espectros médios sobrepostos das amostras estudadas e ampliação da região de espalhamento.
Observando os espectros sobrepostos, não é possível distinguir ou agrupar
as amostras conforme suas características. Ou seja, usando um método
0 5 10 15 20 25 30 35 400.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
18 19 20 21 22 23 240,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Inte
nsi
da
de
(cp
s/µµ µµA
)
Energia (keV)
Rh kβ (Rayleigh)
Rh kβ (Compton)
Rh kα (Rayleigh)
Inte
nsid
ade
(cps
/µµ µµA
)
Energia (keV)
Rh kα (Compton)LeiteTrigoMilhoSojaMandioca
RESULTADOS E DISCUSSÃO
52
univariado, não é possível verificar se o conjunto amostral apresenta alguma
separação.
Os espectros de raios X obtidos para as diferentes amostras (Figura 6)
foram então tratados com a ferramenta quimiométrica PCA.
O ponto de partida para todas as análises multivariadas é uma matriz de
dados (tabela de dados) chamada de X, com n linhas, denominadas de objetos e p
colunas, que compreendem as medidas ou propriedades relacionadas aos
objetos.
A PCA é uma ferramenta multivariada e, quando aplicada a X, promove a
compressão dos dados originais para um novo sistema de eixos, proporcionando a
representação das variáveis altamente correlacionadas de uma maneira mais
simples, usando apenas um eixo, chamado de componente principal.
Para todos os tratamentos quimiométricos realizados, nenhuma
transformação foi aplicada aos espectros. Paralelamente, o pré-processamento
utilizado consistiu em centrar os dados na média.
Os gráficos da análise de componentes principais (PCA) permitiram
identificar uma separação do conjunto amostral em dois grupos principais:
amostras de soja e as demais amostras. Esta separação foi explicada pelas
componentes principais 1 e 2 (PC1 e PC2) e pode ser vista na Figura 7A (scores).
No gráfico de scores (Figura 7B) entre as PCs 2 e 4 (que explicaram juntas 5,1%
da variância), foi possível verificar uma tendência das amostras de milho se
separarem das demais, assim como as amostras de soja.
O gráfico de loadings (Figura 8) permite identificar quais as variáveis (faixa
espectral) contribuíram para a formação das componentes principais e,
consequentemente, para a separação observada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
53
0 5 10 15 20 25 30 35 40-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4 PC1 (90,4%) PC2 (4,2%) PC4 (0,9%)
Load
ings
Energia (keV)
Figura 7 : Gráficos de scores para o conjunto de todas as amostras, obtidos para PC1 x PC2 (A) e para PC2 x PC4 (B).
Figura 8 : Gráficos de loadings obtidos para PC1, PC2 e PC4 para o conjunto de todas as amostras.
No gráfico de scores (Figura 7A), observa-se que as amostras de soja
apresentam valores positivos na PC2. Os elevados valores na região de energia
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6 Leite TrigoMilho Soja Mandioca
PC
2 (4
,2%
)
PC1 (90,4%)
A
-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
Leite Trigo Milho Soja Mandioca
PC
4 (0
,9%
)PC2 (4,2%)
B
RESULTADOS E DISCUSSÃO
54
entre 3,3 e 3,7 keV observados para esta PC na Figura 8 permitem afirmar que o
alto teor de potássio e ou cálcio das amostras de soja foi o principal fator para a
separação das amostras de soja do conjunto amostral.
Paralelamente, as regiões de espalhamento de raios X (faixa ao redor de
19,2 keV) também contribuíram para a separação das amostras de soja. Como
esta região está associada à parte orgânica da amostra, provavelmente ela seja
reflexo de uma característica marcante da soja: o teor de gordura.
Já no caso das demais amostras, o método não apresentou especificidade,
talvez por serem todas as amostras derivadas de vegetais. Para confirmar esta
hipótese, uma nova PCA foi aplicada ao conjunto de amostras, porém, desta vez,
as amostras derivadas da soja foram excluídas (Figura 9).
-3 -2 -1 0 1 2
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3 Leite Trigo Milho Mandioca
PC
2 (1
,6%
)
PC1 (92,2%)
Figura 9 : Gráfico de scores para o conjunto das amostras na ausência do grupo
da soja, obtidos para PC1 x PC2.
Esta nova análise reforçou a tendência do conjunto originado do milho se
separar das demais amostras, porém não houve de fato discriminação das
amostras em função da origem.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
55
Como apenas a classificação da soja foi conclusiva por PCA, num primeiro
momento, procurou-se obter os parâmetros de interesse para o conjunto total de
amostras.
Na aplicação do PLS, os valores utilizados como esperados foram aqueles
obtidos através dos métodos convencionais, e não os fornecidos pelos rótulos.
Isso porque, além dos fabricantes não especificarem no rótulo quais os
procedimentos utilizados para a determinação das informações fornecidas, foi
verificado o alto índice de amostras cujos valores diferiram em mais de 20%
daqueles obtidos pelos métodos convencionais apresentados anteriormente.
O modelo de calibração via PLS para o carboidrato (Figura 10) permitiu
constatar que havia outliers no conjunto. Ao excluí-los, outras amostras passaram
a ser outliers. A mesma situação foi observada para as demais variáveis
estudadas e as amostras tidas como outliers não eram necessariamente as
mesmas em uma ou outra variável.
0,00 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
MI1aMI1bMI1cMI2aMI2bMI2c
MI3aMI3bMI3c
MI4aMI4bMI4cMI5aMI5bMI5c
MI6a
MI6bMI6c
MI7aMI7bMI7c
WH1aWH1bWH1c
WH2aWH2bWH2cWH3aWH3bWH3cWH4a
WH4bWH4c
WH5aWH5bWH5cWH6aWH6bWH6c
WH7aWH7bWH7c
WH8a
WH8bWH8c
WH9aWH9bWH9c
WH10aWH10bWH10c
WH11a
WH11b
WH11c
WH12aWH12bWH12c
CO1aCO1bCO1cCO2a
CO2bCO2c
CO3a
CO3bCO3c
CO4aCO4bCO4cCO5a
CO5bCO5c
CO6aCO6bCO6c
CO7aCO7bCO7c
CO8aCO8bCO8c
CO9aCO9bCO9c
CO10aCO10bCO10cCO11a
CO11bCO11c
CO12aCO12bCO12cCA1aCA1b
CA1c
CA2aCA2bCA2c
CA3aCA3bCA3cCA4aCA4b
CA4cCA5aCA5bCA5cCA6aCA6bCA6c
CA7aCA7bCA7cCA8aCA8b
CA8cCA9a
CA9b
CA9cCA10aCA10bCA10c
CA11aCA11b
CA11cCA12a
CA12bCA12c
SO1aSO1bSO1cSO2aSO2bSO2cSO3a
SO3b
SO3c
SO4a
SO4bSO4c
SO5aSO5bSO5c SO6a
SO6bSO6c
SO7aSO7bSO7cSO8aSO8b
SO8c
SO9a
SO9b
SO9c
SO10a
SO10bSO10cSO11a
SO11bSO11cSO12aSO12bSO12c
Res
íduo
de
Stu
dent
Leverage
Figura 10 : Representação gráfica da relação entre Resíduo de Student e
Leverage para carboidrato, considerando o conjunto total de amostras e 5
variáveis latentes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
56
Como não foi possível realizar modelos adequados de calibração para o
conjunto envolvendo todas as amostras, e, como através da PCA foi verificado
que as amostras de soja se separaram das demais, novos modelos foram
propostos para um conjunto de todas as amostras excluindo as derivadas da soja.
Modelos com grande número de amostras tendem a ser mais robustos.
Além disso, se as amostras forem bem diferentes umas das outras, os modelos
serão mais completos, abrangendo uma diversidade de amostras. Porém, mesmo
excluindo as amostras de soja, não foi possível obter modelos de calibração e / ou
validação com valores baixos de erros, mesmo realizando seleção de variáveis.
Sendo assim, diante da impossibilidade de se constatar um agrupamento pela
PCA e dados os altos erros de calibração, para ter os seus parâmetros
quantificados, as amostras foram divididas considerando a sua origem (total de 5
grupos).
Em seguida, foram determinados os outliers de cada grupo, definido o
conjunto de amostra a ser trabalhado e as quantidades de variáveis latentes para
cada variável a ser quantificada (teor de proteína, teor de carboidrato e valor
energético). Cabe ressaltar que nos casos em que todas as replicatas de
determinada amostra foram consideradas outliers, houve uma diminuição no
número de variáveis latentes necessário para a construção do modelo, o que
confirmou que tais amostras eram de fato anômalas.
Para determinar o número de variáveis latentes, foi realizada a validação
cruzada. Uma vez que todas as amostras foram usadas como conjunto de
previsão, foi calculado o PRESS (soma do quadrado dos erros de previsão).
Excluídos os outliers, foram construídos os modelos de calibração e
validação, obtendo os valores de previsão para as amostras externas previamente
selecionadas. Tais amostras foram escolhidas aleatoriamente e correspondiam a
25% das amostras de cada grupo, ou seja, 2 amostras de leite e 3 amostras dos
demais grupos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
57
Estudos preliminares permitiram verificar que os resultados do modelo de
calibração via PLS (utilizando o espectro inteiro) apresentavam erros maiores do
que os esperados. Com o objetivo de amenizar tal situação, foi realizada seleção
de variáveis. Para a escolha destas, foram levadas em consideração as regiões
significativas (altos valores) para os vetores de regressão e de correlação, em
todos os conjuntos estudados. As regiões selecionadas foram entre 1,60-9,60 keV
e 18,00-21,00 keV (região de espalhamento da fonte de irradiação).
A – AMOSTRAS DE SOJA
O conjunto originado da soja envolvia 12 amostras diferentes, num total de
36 espectros. Foram selecionadas para serem amostras externas SO2, SO3 e
SO5, levando em consideração as 3 replicatas de cada uma.
Ao estabelecer a relação entre o Resíduo de Student e a Leverage, foi
verificado que a replicata a da amostra SO4 (SO4a) era um outlier para todas os
parâmetros (Figura 11) e, então, foi retirada do conjunto. Também foi verificado
que as replicatas a e b da amostra SO7 tiveram seus espectros sobrepostos, o
que deve significar que houve algum problema na importação dos dados gerados
pelo EDXRF para o programa quimiométrico utilizado (Pirouette®). Sendo assim, a
replicata SO7b foi retirada do conjunto.
Retiradas estas amostras, não foram mais identificados outliers para
carboidrato e valor energético. No entanto, a amostra SO12 (todas as replicatas)
passou a ser um outlier para proteína, tendo, neste caso, sido excluída do
conjunto de calibração. O conjunto final estabelecido para a construção dos
modelos de calibração para as amostras de soja englobou 9 amostras e 25
espectros para o teor de carboidrato e valor energético, e 8 amostras e 22
espectros para o teor de proteína.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
58
Figura 11 : Representações gráficas da relação entre Resíduo de Student e leverage
para as amostras de soja obtidas para o teor de carboidrato antes (A) e depois (B)
da exclusão dos outliers.
Para as amostras de soja, o número de variáveis latentes considerada para
a construção dos modelos de PLS foi igual a 5.
As relações entre os valores previstos (VP) e os valores de referência (VR),
ou seja, os obtidos pelos métodos convencionais, para as variáveis analisadas
para as amostras de soja estão apresentadas na Figura 12. Também são
apresentados os valores dos coeficientes de correlação da calibração (rcal) e da
validação (rval), além das equações matemáticas relacionadas aos modelos de
calibração. Para estas relações foram considerados os valores médios das
replicatas não excluídas.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
SO1aSO1bSO1c
SO4a
SO4bSO4c
SO6aSO6bSO6c
SO7aSO7bSO7c
SO8aSO8bSO8c
SO9a
SO9b
SO9c SO10a
SO10bSO10c
SO11aSO11bSO11c
SO12aSO12bSO12c
A
Res
íduo
de
Stu
dent
Leverage
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5-3
-2
-1
0
1
2
3
SO1aSO1b
SO1c
SO4b
SO4c
SO6a
SO6bSO6c
SO7a
SO7cSO8a
SO8b
SO8c
SO9a
SO9b
SO9c
SO10a
SO10bSO10c
SO11aSO11b
SO11c
SO12aSO12bSO12c
Res
íduo
de
Stu
dent
Leverage
B
RESULTADOS E DISCUSSÃO
59
26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
rval
= 0,859
rcal
= 0,983
VP
(g/
100g
)
VR (g/100g)
VP = 3 + 0,93 VR
Proteína
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7020
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
rval
= 0,953
rcal
= 0,993
VP
(g/
100g
)VR (g/100g)
VP = 1 + 0,97 VR
Carboidrato
320 340 360 380 400 420 440 460 480 500320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
rval
= 0,928
rcal
= 0,991
VP
(kc
al/1
00g)
VR (kcal/100g)
VP = 18 + 0,96 VR
Valor Energético
Figura 12 : Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos
(VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o
conjunto de amostras de soja.
É possível verificar na equação matemática que o coeficiente linear do
modelo de calibração para o valor energético da soja é 18. Isto significa que, se o
valor de referência for zero, o modelo fará uma previsão de VE igual a
18 kcal/100g. Como, para a soja, o menor valor de referência de VE é igual a
328,8 kcal/100g (SO4, Tabela 6), este coeficiente corresponderia a um erro
embutido no resultado previsto de aproximadamente 6%. Este é praticamente o
RESULTADOS E DISCUSSÃO
60
erro que poderia ser considerado, uma vez que o coeficiente angular é muito
próximo a 1 (0,96).
Mais detalhes quanto aos erros dos modelos podem ser obtidos pelas
figuras de mérito apresentadas na Tabela 10.
Tabela 10 : Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as amostras
de soja, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de
proteína.
Figuras de Mérito Parâmetros
VE TC TP
SÊN 0,0015a 0,0046b 0,0137b
γγγγ 0,56c 1,72d 5,12d
γ γ γ γ -1 1,77a 0,58b 0,19b
RMSEP 22,46c 1,69d 2,83d
RMSEC 14,45c 1,03d 1,80d
LOD 5,85c 1,92d 0,64d
LOQ 17,74c 5,82d 1,95d
tBias 0,124 0,040 0,025 a(100g/kcal)
b(100g/g)
c(kcal/100g)
d(g/100g)
tTabelado = 2,04 para VE e TC e tTabelado = 2,09 para TP
Os resultados apresentados na Tabela 10 permitiram constatar que os
limites de detecção e quantificação estão abaixo dos menores valores de todos os
parâmetros, mostrando que o método proposto é adequado para a aplicação
proposta.
O teste t, por sua vez, permitiu concluir que o erro sistemático incluso em
cada um dos modelos (ruído) não é significativo e pode ser desprezado, visto que
RESULTADOS E DISCUSSÃO
61
o tBias calculado foi inferior ao tTabelado (com 95% de confiança), para todas as
situações envolvendo amostras de soja (Miller e Miller, 2000).
Embora num primeiro momento o valor de RMSEP para o valor energético
possa parecer alto, cabe ressaltar que ele é similar ao desvio padrão e, portanto,
sua unidade de medida é a mesma do parâmetro em questão. Então, o RMSEP
do valor energético das amostras de soja representa uma faixa de erro entre 4,6 e
6,8%, uma vez que os valores obtidos pelos métodos convencionais para esse
parâmetro variavam entre 328,8 e 485 kcal/100g. Para os teores de carboidrato e
proteína, o RMSEP corresponde a faixas de 2,5-7,7% e 6,3-11,7%,
respectivamente.
Na Tabela 11 estão apresentados os resultados obtidos no modelo de
validação externa para as amostras de soja SO2, SO3 e SO5. Os dados estão
apresentados em função das médias obtidas entre as três replicatas.
Tabela 11 : Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos
entre VR e VP para as amostras de soja.
Parâmetro Amostra VR VP Er (%)
VE
(kcal/100g)
SO2 423 390 -8
SO3 474,6 412,3 -13,1
SO5 469,9 430,1 -8,5
TP
(g/100g)
SO2 29,7 28,0 -5,7
SO3 25,2 28,3 12,3
SO5 25,6 27,4 7,0
TC
(g/100g)
SO2 43 49 14
SO3 42,5 45,2 6,4
SO5 36,6 41,2 12,6
RESULTADOS E DISCUSSÃO
62
É possível observar na Tabela 11 que os maiores erros obtidos na
validação externa das amostras de soja foram, em módulo, iguais a de 13,1%,
12,3% e 12,6% para valor energético, teor de proteína e teor de carboidrato,
respectivamente. Para todos os casos, estes valores foram inferiores ao máximo
permitido pela ANVISA (20%).
B. Outras amostras
A construção dos modelos de calibração e validação para os demais grupos
de amostras foi feita da mesma maneira como descrito para as amostras de soja,
no item anterior. Então, para facilitar a discussão dos dados, os resultados obtidos
para estes grupos serão apresentados na forma de Tabelas (Tabelas 12 a 20) e
gráficos (Figuras 12 a 16), nos quais devem ser consideradas as seguintes
abreviaturas: valores dos coeficientes de correlação de calibração (rcal) e de
validação (rval).
Tabela 12 : Informações sobre as amostras iniciais e selecionadas para a
construção dos modelos de calibração e validação para os grupos de milho,
mandioca, leite e trigo
Informações Conjunto
Milho Mandioca Leite Trigo
No inicial de amostras 12 12 7 12
Amostras externas
selecionadas
CO1, CO5, CO10
CA1, CA8, CA11 MI5, MI6
WH4, WH6, WH7
Replicatas anômalas
identificadas
CO6a, CO6b, CO6c
CA5a, CA5b, CA5c*
MI3a, MI3b, MI3c
WH11a, WH11b, WH11c
*Amostra CA6 não foi utilizada nos modelos para proteína, pois o valor de referência era zero. As amostras
CA10 e CA12 foram consideradas outliers apenas para proteína.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
63
B.1. Amostras de Milho
Os resultados obtidos da construção dos modelos de calibração e validação
para as amostras de milho estão apresentados na Figura 13 e nas Tabelas 13 e
14.
As relações entre os valores previstos (VP) e os valores de referência (VR),
para as variáveis analisadas para as amostras de milho estão apresentadas na
Figura 13. Também são apresentados os valores dos coeficientes de correlação
da calibração (rcal) e da validação (rval), além das equações matemáticas
relacionadas aos modelos de calibração e os respectivos valores de variáveis
latentes (LV).
Os coeficientes lineares das equações matemáticas revelam erros na
construção dos modelos de 10,1%, 6,7% e 3,6% para valor energético, teor de
carboidrato e teor de proteína, respectivamente.
Outras informações sobre os modelos de calibração multivariada construídos
para as amostras de milho podem ser verificadas pelas figuras de mérito
apresentadas na Tabela 13.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
64
74 76 78 80 82 84 86 8874
76
78
80
82
84
86
88
rval
= 0,961
rcal
= 0,986
VP
(g/
100g
)
VR (g/100g)
VP = 5 + 0,94 VR
Carboidrato
LV = 4
345 348 351 354 357 360 363 366345
348
351
354
357
360
363
366
rval
= 0,714
rcal
= 0,968
VP
(kc
al/1
00g)
VR (kcal/100g)
VP = 35 + 0,90 VR
Valor Energético
LV = 4
0 1 2 3 4 5 6 7 80
1
2
3
4
5
6
7
8
LV = 5
rcal = 0,998
rval = 0,810
VP
(g/
100g
)VR (g/100g)
Proteína
VP = 0,02 + 0,99VR
Figura 13 : Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos
(VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o
conjunto de amostras de milho.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
65
Tabela 13 : Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as amostras
de milho, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de
proteína.
Figuras de Mérito Parâmetros
VE TC TP
SÊN 0,0089a 0,0207b 0,0166b
γγγγ 3,30c 7,73d 6,20d
γ γ γ γ -1 0,30a 0,13b 0,16b
RMSEP 9,34c 0,89d 0,27d
RMSEC 2,88c 0,13d 0,10d
LOD 0,99c 0,43d 0,18d
LOQ 3,02c 1,29d 0,53d
tBias 0,087 0,154 0,183 a(100g/kcal)
b(100g/g)
c(kcal/100g)
d(g/100g)
tTabelado = 2,04
Os resultados expostos na Tabela 13 permitiram verificar que os valores de
LOQ são inferiores aos valores de referência obtidos pelos métodos convencionais
(Tabela 5), para todos os parâmetros estudados. Porém, para as amostras com
valores de TP < 1 g/100g (CO8 e CO12), os erros dos valores previstos são altos
(> 40%). Possivelmente, este erro poderia ser reduzido se houvesse mais
amostras no modelo com baixa quantidade de proteína.
Em todos os casos, o tBias foi menor do que o tTabelado (2,04), o que significa
que o ruído não foi significativo em nenhum modelo construído, com 95% de
confiança (Miller e Miller, 2000).
Os valores previstos para amostras selecionadas para validação externa
estão apresentados na Tabela 14
RESULTADOS E DISCUSSÃO
66
Tabela 14 : Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos
entre VR e VP para as amostras de milho.
Parâmetro Amostra VR VP Er (%)
VE
(kcal/100g)
CO1 366 367 0,3
CO5 348 347 -0,3
CO10 350 350 0
TP
(g/100g)
CO1 7,5 7,4 -1,3
CO5 6,7 6,7 0
CO10 6,7 6,9 3,0
TC
(g/100g)
CO1 76,8 77,7 1,2
CO5 78 77 -1
CO10 79 79 0
Para todos os valores previstos pela validação externa das amostras de
milho, os erros foram inferiores a 20%, obedecendo à legislação brasileira vigente.
B.2. Amostras de Mandioca
Os resultados obtidos após a construção dos modelos de calibração e
validação para as amostras de mandioca estão apresentados na Figura 14 e nas
Tabelas 15 e 16. Na construção dos modelos de proteína, foi excluída a amostra
CA6, pois esta não apresentava este macronutriente. Também foram excluídas as
amostras CA10 e CA12, consideradas outliers.
As relações entre os valores previstos (VP) e os valores de referência (VR),
para as variáveis analisadas para as amostras estão apresentadas na Figura 14.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
67
345 350 355 360 365 370 375 380 385 390345
350
355
360
365
370
375
380
385
390
rval
= 0,817r
cal= 0,949
VP
(kc
al/1
00g)
VR (kcal/100g)
VP = 39 + 0,89 VR
Valor Energético
LV = 3
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,80,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
rval
= 0,989r
cal= 0,992
VP
(g/
100g
)VR (g/100g)
VP = 0,06 + 0,94 VR
Proteína
LV = 3
82 83 84 85 86 87 88 89 90 9182
83
84
85
86
87
88
89
90
91
rval
= 0,819r
cal= 0,999
VP
(g/
100g
)
VR (g/100g)
VP = 1 + 0,99 VR
Carboidrato
LV = 4
Figura 14 : Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos
(VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o
conjunto de amostras de mandioca.
Os valores das figuras de mérito para cada modelo de calibração
multivariada construído para as amostras de mandioca estão exibidos na Tabela
15. Na Tabela 16 estão expostos os valores previstos para as amostras externas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
68
Tabela 15 : Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as amostras
de mandioca, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor
de proteína
Figuras de Mérito Parâmetros
VE TC TP
SÊN 0,0049a 0,0426b 0,1490b
γγγγ 1,82c 15,9d 55,4d
γ γ γ γ -1 0,55a 0,06b 0,02b
RMSEP 13,24c 2,84d 0,22d
RMSEC 4,43c 1,17d 0,08d
LOD 1,81c 0,21d 0,06d
LOQ 5,48c 0,63d 0,18d
tBias 0,220 0,219 0,111 a(100g/kcal)
b(100g/g)
c(kcal/100g)
d(g/100g)
tTabelado = 2,04 para VE e TC e tTabelado = 2,14 para TP
Os resultados expostos na Tabela 15 permitiram verificar que os valores de
LOQ são inferiores aos valores de referência obtidos pelos métodos convencionais
para as amostras utilizadas na construção do modelo. Porém, para amostras com
TP < 1 g/100g, os erros envolvidos na validação são altos, requerendo maior
variedade de amostras no modelo de calibração.
Não foram verificados erros sistemáticos significativos nos modelos
envolvendo as amostras de mandioca, uma vez que em todos os casos o valor do
t calculado (tBias) foi inferior ao tabelado (tTabelado).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
69
Tabela 16 : Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos
entre VR e VP para as amostras de mandioca.
Parâmetro Amostra VR VP Er (%)
VE
(kcal/100g)
CA1 408,7 363,9 -11,0
CA8 328 365 11
CA11 358,7 375,4 4,7
TP
(g/100g)
CA1 1,7 1,7 0
CA8 1,1 1,2 9,1
CA11 1,04 0,91 -12,50
TC
(g/100g)
CA1 87,1 88,4 1,5
CA8 80 89 11
CA11 87,5 90,6 3,5
Como a seleção das amostras externas foi feita ao acaso (aleatoriamente),
as amostras selecionadas poderiam apresentar valores de referência fora da faixa
utilizada na validação interna. A amostra CA1, por exemplo, apresentava valor
energético maior do que as amostras da validação interna e a amostra CA8
apresentava teor de carboidrato inferior a todas as amostras de mandioca.
Os maiores erros obtidos na validação externa das amostras de mandioca
foram, em módulo, iguais a 11% para valor energético, 12,50% para teor de
proteína e 11% para teor de carboidrato. Embora, em todos os casos, os erros
tenham sido inferiores aos 20% permitidos pela ANVISA, provavelmente o uso de
outras amostras para validação externa proporcionaria erros menores aos obtidos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
70
6 7 8 9 10 11 12 13
6
7
8
9
10
11
12
13
rval
= 0,994r
cal= 0,997
VP
(g/
100g
)
VR (g/100g)
VP = 0,4 + 0,96 VR
Proteína
LV = 2
360 370 380 390 400 410
360
370
380
390
400
410
rval
= 0,991r
cal= 0,999
VP
(kc
al/1
00g)
VR (kcal/100g)
VP = 1 + 0,99 VR
Valor Energético
LV = 4
72 74 76 78 80 82 84 86 88
72
74
76
78
80
82
84
86
88
rval
= 0,996r
cal= 0,999
VP
(g/
100g
)
VR (g/100g)
VP = 1 + 0,98 VR
Carboidrato
LV = 2
B.3. Amostras de Leite
Os resultados obtidos da construção dos modelos de calibração e validação
para as amostras de leite estão apresentados na Figura 15 e nas Tabelas 17 e 18.
Na construção dos modelos, foram excluídas todas as replicatas da amostra MI3,
identificadas como anômalas (Tabela 12).
Figura 15 : Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos
(VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o
conjunto de amostras de leite.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
71
Tabela 17 : Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as amostras
de leite, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de
proteína.
Figuras de Mérito Parâmetros
VE TC TP
SÊN 0,0075a 0,0241b 0,0564b
γγγγ 2,80c 8,97d 21,01d
γγγγ -1 0,36a 0,11b 0,05b
RMSEP 9,48c 1,34d 0,85d
RMSEC 5,46c 0,83d 0,49d
LOD 1,17c 0,37d 0,16d
LOQ 3,57c 1,11d 0,48d
tBias 0,221 0,125 0,018 a(100g/kcal)
b(100g/g)
c(kcal/100g)
d(g/100g)
Os limites de quantificação encontrados para os modelos envolvendo
amostras de leite foram menores do que os valores obtidos pelos métodos
convencionais. Os valores de tBias também foram menores do que os ttabelados,
confirmando mais uma vez que o ruído não é significativo para nenhum dos
modelos.
As faixas de erros envolvendo os valores previstos pela validação interna
para as amostras de leite foram de 2,3 a 2,7% para VE; 1,5 a 1,9% para TC e 5,9
a 13,9% para TP.
Na Tabela 18 estão apresentados os valores obtidos na validação externa
para as amostras previamente selecionadas de maneira aleatória.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
72
Tabela 18 : Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos
entre VR e VP para as amostras de leite.
Parâmetro Amostra VR VP Er (%)
VE
(kcal/100g)
MI5 381 407 7
MI6 373,9 416 11,3
TP
(g/100g)
MI5 14,3 13,8 -3,5
MI6 12,7 14,2 11,8
TC
(g/100g)
MI5 75,2 72,5 -3,6
MI6 74,6 72,0 -3,5
Para todos os parâmetros analisados (valor energético e teores de
carboidrato e proteína), os erros entre os valores previstos pela validação externa
e os de referência, obtidos pelos métodos convencionais, foram inferiores aos
20% aceitáveis pela legislação vigente.
Para a construção dos modelos de validação interna foram utilizadas
apenas 4 amostras de leite (12 espectros), uma vez que as replicatas da amostra
MI3 foram consideradas outliers e as amostras MI5 e MI6 foram usadas na
validação externa. Sendo assim, a inclusão de novas amostras aos modelos
poderá proporcionar resultados mais precisos e exatos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
73
355 360 365 370 375 380 385 390 395 400
355
360
365
370
375
380
385
390
395
400
rval
= 0,976r
cal= 0,997
VP
(kc
al/1
00g)
VR (kcal/100g)
VP = 4+ 0,99 VR
Valor Energético
LV = 4
8 12 16 20 24 28 328
12
16
20
24
28
32
rval
= 0,969r
cal= 0,998V
P (
g/10
0g)
VR (g/100g)
VP = 0,1 + 0,99 VR
Proteína
LV = 4
42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 7842
45
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75
78
rval
= 0,971r
cal= 0,993
VP
(g/
100g
)
VR (g/100g)
VP = 1 + 0,98 VR
Carboidrato
LV = 3
B.4 Amostras de Trigo
Os resultados obtidos da construção dos modelos de calibração e validação
para as amostras de trigo estão apresentados na Figura 16 e nas Tabelas 19 e 20.
Figura 16 : Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos
(VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o
conjunto de amostras de trigo.
Para todos os modelos propostos para as amostras de trigo, o número de
variáveis latentes foi igual a 4 (valor energético e teor de proteína) ou 3 (teor de
carboidrato). Quanto menor o número de variáveis latentes, mais simples é o
modelo estabelecido.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
74
Em todos os casos, os coeficientes lineares das equações matemáticas que
correlacionam o valor de referência com o valor previsto na calibração foram
maiores do que 0,9. Já os coeficientes angulares das equações foram
percentualmente baixos em relação aos valores de referência, o que confirma que
os modelos são adequados.
Outras informações sobre os modelos estão apresentados na Tabela 19,
através das figuras de mérito dos mesmos.
Tabela 19 : Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as amostras
de trigo, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de
proteína.
Figuras de Mérito Parâmetros
VE TC TP
SÊN 0,0099a 0,0116b 0,0164b
γγγγ 3,70c 4,31d 6,09d
γ γ γ γ -1 0,27a 0,23b 0,16b
RMSEP 6,85c 4,58d 1,79d
RMSEC 2,43c 1,42d 0,55d
LOD 0,89c 0,77d 0,34d
LOQ 2,70c 2,32d 1,64d
tBias 0,130 0,184 0,195 a(100g/kcal)
b(100g/g)
c(kcal/100g)
d(g/100g)
tTabelado = 2,04
Para todos os parâmetros, os limites de quantificação obtidos para os
modelos foram inferiores aos valores determinados pelos métodos convencionais.
Em todos os casos o tBias foi menor do que o tTabelado, o que significa que o
ruído não foi significativo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
75
Para as amostras selecionadas aleatoriamente para serem externas, os
valores previstos estão apresentados na Tabela 20.
Tabela 20 : Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os
parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos
entre VR e VP para as amostras de trigo.
Parâmetro Amostra VR VP Er (%)
VE
(kcal/100g)
WH4 359,2 364,2 1,4
WH6 352,5 366,2 3,9
WH7 355,5 362,7 2,0
TP
(g/100g)
WH4 14,4 13,8 -4,2
WH6 12,9 12,0 -7,0
WH7 12,60 13,30 5,56
TC
(g/100g)
WH4 70,8 70,2 -0,9
WH6 72,5 73,7 1,7
WH7 73,0 71,8 -1,6
O maior erro obtido pela previsão externa das amostras de trigo foi de
|7,0%|, o que permite afirmar que os valores previstos se enquadram dentro do
exigido atualmente pela ANVISA.
Para todas as classes de alimentos, foi possível realizar validação externa
das amostras com baixos erros de previsão, tornando o método proposto (aliança
entre FRX e calibração multivariada) adequado para quantificação de VE, TC e TP
de amostras derivadas de vegetais.
Os erros de previsão obtidos para as amostras externas foram inferiores ao
permitido atualmente (20%) pela ANVISA, o que faz do método proposto uma
RESULTADOS E DISCUSSÃO
76
alternativa aos métodos convencionais para a quantificação do valor energético e
teores de proteína e carboidrato.
A inclusão de novas amostras aos modelos propostos deve favorecer a
previsão de amostras com parâmetros (VE, TC e TP) maiores ou menores aos
utilizados neste trabalho. Criar modelos de calibração com faixas mais amplas dos
parâmetros de interesse expandiria a aplicação da proposta.
IV. 2. 1. FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X – RELAÇÃO CUSTO-
BENEFÍCIO
Após constatar que o desempenho analítico (erro das medidas) permite que
o método proposto seja utilizado para obter valor energético e teores de
carboidrato e proteína, conforme legislação vigente, foi feito um estudo
relacionando custo, tempo para as análises e resíduo líquido gerado.
Este estudo envolveu uma estimativa do custo para realizar os métodos
convencionais e o proposto na quantificação dos parâmetros de interesse deste
trabalho, por replicata (Tabela 21). Esta estimativa foi baseada nos menores
preços de reagentes e equipamentos obtidos em cotações com 3 empresas
especializadas, não sendo computados os gastos com vidraria e cadinhos, por
serem estes instrumentos comumente encontrados em laboratório de pesquisa,
desenvolvimento e controle de qualidade. Também não foi incluído o custo com
água destilada e nitrogênio líquido, que é utilizado no equipamento de EDXRF
para resfriamento do detector.
Para a estimativa do tempo, levou-se em consideração desde o preparo das
amostras e soluções até a obtenção final dos dados. Neste caso, porém, não foi
computado o tempo destinado para cálculos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
77
Tabela 21 : Estimativa do custo e do tempo necessários para a obtenção dos
parâmetros estudados pelos métodos convencionais e proposto e da quantidade de
resíduo líquido gerado pelos métodos.
Parâmetro Custo (R$) Tempo (min) Resíduo Líquido Gerado (mL)
Convencionais Proposto Convencionais Proposto Convencionais Proposto
VE 12.100,00 79.000,00 1580 2 175 0
TP 7.050,00 79.000,00 270 2 115 0
TC 12.100,00 79.000,00 1580 2 175 0
Na Tabela 21 é possível verificar que o custo das análises, em termos de
reagentes e equipamentos, é maior para o método proposto para todos os
parâmetros analisados. Em todos os casos, o custo maior das análises provém
dos equipamentos (principalmente o destilador Kjeldahl para os métodos
convencionais e o EDXRF para o método proposto), sendo o valor referente aos
reagentes torna-se significante apenas para situações envolvendo análise de
muitas amostras. Como a aquisição dos equipamentos se dá apenas uma vez, as
análises subsequentes são mais baratas.
Sendo assim, o que faz com que haja esta diferença nos custos das
análises entre os métodos convencionais e proposto é o EDXRF, cujo custo
aproximado é de US$ 35.000,00 (R$ 79.000,00). A aplicação deste equipamento,
no entanto, é muito vasta - como descrita na introdução deste trabalho - ao
contrário do destilador Kjeldahl, que é usado apenas para quantificar proteínas.
Paralelamente, a quantidade de resíduos gerados pelos métodos
convencionais é maior e seu tratamento envolve um custo a ser levado em
consideração, além de problemas ecológicos.
Quanto ao tempo das análises, é possível verificar pela Tabela 21 que o
método proposto é muito mais rápido, fato de grande interesse para os
laboratórios de rotina de uma maneira geral.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
78
Cabe ressaltar que a técnica de fluorescência de raios X permite realizar
quantificações do conteúdo inorgânico das amostras analisadas, informações que
também são exigidas na rotulagem dos alimentos, ampliando as vantagens da
aplicação do método proposto em laboratórios de rotina.
CONCLUSÃO
79
VV –– CCOONNCCLLUUSSÃÃOO
“Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz somente até onde os outros
foram” (Alexandre Graham Bell)
CONCLUSÃO
81
V. 1. CONCLUSÃO
Os resultados permitiram verificar a potencialidade da aplicação da técnica
de Fluorescência de Raios X aliada à Quimiometria para se determinar o valor
energético e os teores de carboidratos e proteínas em amostras de extratos e
farinhas de vegetais para consumo humano.
O tempo reduzido de análise e a não necessidade de uso de solventes
tornam o método proposto uma alternativa a ser considerada em substituição aos
métodos convencionais de análise empregados atualmente, principalmente em
laboratórios industriais e de rotina. Além disso, os erros de previsão externa foram
inferiores ao exigido atualmente (20%) pela Agência Nacional de Vigilância
Sanitária, o que reforça a aplicação da proposta.
Cabe ressaltar, porém, que o método depende da matriz das amostras e,
portanto, houve necessidade de separá-las em função da origem. Outro aspecto a
ser considerado é a baixa sensibilidade do método, uma vez que amostras com
valores nulos ou próximos de zero não podem ser modeladas para o respectivo
parâmetro. Em relação a este último aspecto, um novo modelo construído com um
número maior de amostras com estas características (valores baixos dos
parâmetros) deve amenizar esta deficiência.
PERSPECTIVAS
83
VVII –– PPEERRSSPPEECCTTIIVVAASS
“Não importa o tamanho do circo, mas a graça do palhaço” (José Augusto da Col)
PERSPECTIVAS
85
VI. 1. PERSPECTIVAS
Como perspectivas para a continuação do trabalho, podem ser construídos
novos modelo de calibração envolvendo mais amostras de farinhas de mandioca e
de milho com baixos teores de proteína. Também poderia ser verificada a
possibilidade de calibração e validação de outros parâmetros, como fibra alimentar
e gorduras, relacionados às amostras estudadas.
Além disso, os espectros de FRX podem ser fonte de outras informações
exigidas nos rótulos dos alimentos, como teores de cálcio, ferro, sódio, etc.
Os resultados promissores permitem supor que o método proposto possa
ser estendido para outros tipos de alimentos. Este fato está sendo comprovado
através de outros trabalhos realizados por integrantes do GERX sobre a
orientação da professora Maria Izabel M. S. Bueno, além de um trabalho de pós-
doc em desenvolvimento com apoio financeiro do CNPq.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
87
VVIIII –– RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
89
VII. 1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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supplements”, Toxicology 2006, 221, 44–49.
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vegetais”, Dissertação de Mestrado, Instituto de Química – UNICAMP, 2007.
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families of plants by x ray spectrometry”, X ray Spectrom. 2006, 35, 257-260.
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através de membranas líquidas hidrofóbicas em tempo real”, Tese de doutorado,
Instituto de Química – UNICAMP, 2000.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária (acesso em 24/maio/2008).
http://e-legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=9059; RDC 360 de
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AOAC International: Gaithersburg, 1996.
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