iv curso de verão em biologia molecular e genômica...
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Elisa Beatriz Prestes
IV Curso de Verão em Biologia Molecular e Genômica 05/02/2013
Clonagem
• Isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas
• Origem do termo: cada colônia bacteriana é um clone
• Tecnologia do DNA recombinante
Produção de proteínas em larga escala
Construção de bibliotecas genômicas e de cDNA
Clonagem molecular
Duas etapas principais
1. Ligação do fragmento de DNA em um plasmídeo DNA
recombinante
2. Introdução do DNA recombinante numa célula hospedeira compatível: transformação
INSERTO VETOR
Enzimas de restrição
• Capacidade de clivar DNA em regiões específicas
• Palindrômicas
• 1973 enzimas com extremidades coesivas
Ligação do inserto no vetor
Digestão e ligação
Vetor de clonagem
Clivagem com endonuclease de restrição
Ligação pela ligase
Fragmento de DNA a ser clonado
DNA recombinante
Ligação do inserto no vetor
Vetor de clonagem – Plasmídeo
Todo plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve ter:
• Origem de replicação (Ori)
• Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)
• Resistência a antibiótico (Amp, Kan, etc.)
*Extra: gene da β-galactosidase (lacZ)
Ligação do inserto no vetor
Bactéria
DNA recombinante
Transformação em células competentes
Células competentes
• Células bacterianas quimicamente modificadas para receberem o DNA recombinante
+ + + + + + + +
+ + + + + + + +
Ca2+ competentes Eletrocompetentes
+ + + + + + + +
+ + + + + + + +
Transformação
Seleção de colônias
Resistência a antibiótico
Expressão de β-galactosidase
• Fragmento de DNA é inserido no meio do gene lacZ
Ampicilina
Amp + X-gal + IPTG
β-gal: degrada polissacarídeos
X-gal: substrato cromogênico forma
precipitado azul quando há atividade de β-gal
IPTG: indutor da atividade de β-gal
X
Transformação
Toothpick e “PCR de colônia”
Técnicas de screening
Toothpick tamanho do inserto
PCR de colônia “identidade” do inserto
Transformação
Inserto Primer F
Primer R
~500pb
~1kb
Toothpick e “PCR de colônia”
Transformação
Transformação X Transfecção
Vetores de clonagem
Por que não transformar DNA linear?
TIPOS DE VETORES MAIS POPULARES
• Plasmídeos (mais comuns) – até 20kb
• Fago lambda – até 25kb
• Cosmídeos – 35 a 45kb
Plasmídeos
• Plasmídeos presentes em grande número de cópias
• Regiões:
- Origem (ColE1, f1)
- Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)
- Gene de resistência a antibiótico
Fago λ
• Empacotamento in vitro eficiência 10% sítio cos
• Infecção E. coli eficiência 100%
Genes da lisogenia
DNA de interesse
Vetores de substituição
Vetores de inserção
Cosmídeos
• Plasmídeos com um fragmento de DNA do fago λ sítio cos
• Utilizam sistema de empacotamento in vitro do fago λ
• Tornam-se circulares na célula hospedeira
• Permitem clonagem de genes maiores – 35 a 45kb
Vetores de expressão
• Plasmídeo cujo inserto deverá ser expresso numa proteína
• Amplamente utilizados na pesquisa e em terapias atuais
http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o
Obrigada!