istruzione operativa campionamento superfici e … campionamenti 2014/io 7-01... · microbiologia...

ISTRUZIONE OPERATIVA

CAMPIONAMENTO SUPERFICI ED ATTREZZATURE

IO 07-01 REVISIONE: N° 07 del 10/04/13

MARE. A srl.

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07.doc

REVISIONE NUMERO

DATA

REDATTA DA SUPLAB (firma)

VERIFICATA DA DIR

(firma)

APPROVATA DA RAQ

(firma)

PARAGRAFO REVISIONATO

NUMERO

MOTIVO

00 15-01-09

Prima emissione

01 20-07-10

F

Distribuzione e presa visione

02

28-01-11 Inserimento campionamento su

carcasse 03

08-04-11 C Inserimento diluizioni e numero di piastre per

tipologia di campionamento,

specifiche di campionamento e

gestione della prova in bianco

04

27/03/12 C Inserimento caratterizzazione

superfici in fase di campionamento, e puntualizzazione

preparazione tampone spugna o panno

05

12/04/12 C Inserimento specifico diluente neutralizzante utilizzato di routine e

puntualizzazione preparazione tampone

spugna o panno, caratterizzazione

superfici, gestione trasporto, analisi e


CAMPIONAMENTO SUPERFICI E ATTREZZATURE




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07.doc

semine

REVISIONE NUMERO

DATA

REDATTA DA SUPLAB (firma)

VERIFICATA DA DIR

(firma)

APPROVATA DA RAQ

(firma)

PARAGRAFO REVISIONATO

NUMERO

MOTIVO

06 12-11-12

4

Integrazione caratterizzazione

superficie campionata e indicazioni tecniche di

prelievo

07 10-04-13

4 Specificato

campionamento con tampone




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07.doc

INDICE

1. SCOPO....................................................................................................................................................... 4 2. CAMPO DI APPLICAZIONE ................................................................................................................... 4 3 DEFINIZIONI.............................................................................................................................................. 4 4. MODALITA' .............................................................................................................................................. 4 Allegato 1 Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali Metodi orizzontali per tecniche di campionamento da superfici usando dischi da contatto e tamponi.................................................................................................................................................4 Allegato 2 Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali -Campionamento carcasse per analisi microbiologiche...............4 5. RESPONSABILITA’.................................................................................................................................. 4 6. ARCHIVIAZIONE..................................................................................................................................... 4 7. ALLEGATI................................................................................................................................................. 5 8. RIFERIMENTI ......................................................................................................................................... 22 9. DISTRIBUZIONE E PRESA VISIONE .................................................................................................. 22




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07.doc 1. SCOPO

Scopo della presente istruzione operativa è quello di consentire all'operatore di effettuare il prelievo da superfici e attrezzature in modo da ottenere un campione attendibile per la successiva analisi in laboratorio. 2. CAMPO DI APPLICAZIONE

Prelievo superfici e attrezzature effettuato sia dal cliente sia dall’operatore del laboratorio MARE.A. .3 DEFINIZIONI

Campionamento: procedura definita secondo cui una parte di sostanze, materiale o prodotto è prelevata per fornire, per le prove o per le tarature, un campione rappresentativo della totalità. Un campionamento può essere ugualmente richiesta da specifiche appropriate secondo cui una sostanza, materiale o prodotto sono sottoposti a prove o tarature. In certi casi il campione può non essere rappresentativo ma determinato dalla sua disponibilità. (Norma UNI EN ISO 17025:2005 § 5.7.1 nota1. Ambiente: ogni oggetto in contatto con l’alimento o rappresentante una fonte di contaminazione o ricontaminazione, per esempio materiali, locali, operatori. (ISO 18593:2004) Vedi definizioni riportate negli allegati 1 e 2. 4. MODALITA'

Vedi quanto descritto nei seguenti allegati Allegato 1 Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali Metodi orizzontali per tecniche di

campionamento da superfici usando dischi da contatto e tamponi

Allegato 2 Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali -Campionamento carcasse per analisi microbiologiche. 5. RESPONSABILITA’

E' responsabilità dell'operatore (idoneamente informato) effettuare il campionamento come riportato nella seguente istruzione operativa. 6. ARCHIVIAZIONE

La copia magnetica di questa IO è archiviata su supporto informatico; l’originale cartaceo della presente IO è archiviato nell’Archivio Qualità Il responsabile dell’archiviazione della procedura in uso è il RAQ che gestisce l’Archivio Qualità.




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07.doc 7. ALLEGATI

7.1 ALLEGATO 1 1. OGGETTO

Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali - Metodi orizzontali per tecniche di

campionamento da superfici usando dischi da contatto e tamponi. (ISO 18593:2004)

2.INTRODUZIONE Può essere importante determinare la presenza , o il numero di microrganismi possibili, sulle superfici di utensili, superfici di lavoro e altra attrezzatura in contatto con il cibo, per stimare il livello di contaminazione durante la produzione o l’efficacia dei protocolli di pulizia e di disinfezione. I metodi orizzontali descritti in questo Standard Internazionale riguardano un metodo di contatto su una superficie usando dischi da contatto (o Dip-Slide) e/o un metodo con tampone. Il metodo con disco da contatto è applicabile solo alle superfici piane, mentre il metodo con tampone può essere usato per tutti i tipi di superficie. Per il campionamento su superfici larghe (>100 cm2) si possono usare CLOTHS sterili o spugne. Questo metodo alternativo è utile per la stima della carica microbica delle superfici. I risultati sono spesso presentati come indicatori di igiene basati sul numero di unità formanti colonia (UFC) per centimetro quadrato presente sulla superficie di analisi. 3. PRINCIPIO 3.1 A causa del fatto che questi metodi non sono quantitativamente certi o riproducibili, i risultati dovrebbero essere usati solo in una “analisi di tendenza”. 3.2 Un disco da contatto o una slide riempito con un terreno ad Agar adatto è premuto contro la superficie che deve essere testata. Dopo incubazione, una stima della contaminazione superficiale è ottenuta dalla conta del numero delle colonie sviluppate. 3.3 Usando il metodo con tampone , una specifica area della superficie da esaminare viene contrassegnato (es. con una TEMPLATE”) e poi pulito. I tamponi in stick sono rotti in una provetta o in una bottiglia contenente una diluizione sterile o un liquido neutralizzante e mescolato a mano. Se la superficie è inumidita con un panno sterile (pulito) o una spugna, il dispositivo di campionamento viene conservato in un volume noto di un liquido di diluizione (es. 100ml per 100 cm2). In laboratorio la sospensione iniziale e, se necessario, le ulteriori diluizioni decimali sono usate per determinare il numero di microrganismi usando le procedure descritte nei metodi per la conta dei (gruppi di ) microrganismi che devono essere cercati. Nota – Il tempo e la temperatura di incubazione dipendono dal tipo di microrganismo che deve essere rilevato. 3.4 Per i terreni selettivi, possono essere eseguiti dei test di conferma appropriati. Il numero delle unità formanti colonia di microrganismi specifici per centimetro quadrato o per tampone è calcolato a partire dal numero di colonie (confermate).




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07.doc 3.5 Dopo il campionamento, la superficie viene pulita e disinfettata, se necessario, per evitare che tracce di nutrienti risultino rimaste dalla procedura di campionamento sulla superficie campionata. 4. TERRENI DI COLTURA E LIQUIDO DI DILUIZIONE Nota – Per ulteriori informazioni, vedere gli Standard Internazionali attinenti per i microrganismi bersaglio che devono essere rilevati o contati. 4.1 Liquido neutralizzante In generale, la base per il liquido neutralizzante è l’acqua peptonata, o il sale peptonato, o qualsiasi altro diluente appropriato (come quarter-strength della soluzione di Ringer, tampone fosfato a pH 7,5, soluzione peptonata a 1g/l). Nei casi in cui sono previsti residui di disinfettanti, dovranno essere aggiunti appropriati neutralizzatori al liquido di diluizione e al terreno usato sui dischi di contatto per prevenire qualsiasi effetto inibitorio dei disinfettanti sulla crescita dei microrganismi. 5. APPARECCHIATURA E VETRERIA Per requisiti generali, vedere ISO 7218. Strumentazione usa e getta è un’ alternativa accettabile alla vetreria riutilizzabile se ha simili caratteristiche. Dispositivi usuali di laboratorio microbiologico e in particolare i seguenti. 5.1 piastre da contatto, piastre di plastica con diametro di 65 mm, riempite con un volume stabilito di terreno ad agar (scelto a seconda del meccanismo bersaglio), fatte apposta per campionare superfici. Le piastre variano in diametro o superficie, in accordo con il tipo di superficie che deve essere campionata. L’agar deve formare un menisco convesso con la piastra. Nota – E’ possibile anche usare qualsiasi altro meccanismo (terreno nutritivo in un contenitore flessibile o rigido) che è in grado di stare in contatto con la superficie che deve essere testata, come un dipslide (5.2). 5.2 Dipslide, sintetico DIPSLIDE (tra 7 e 10 cm2), in cui uno o entrambi i lati sono coperti con uno strato di terreno di crescita solido (scelto in accordo con il microrganismo bersaglio). Nota – Diversi terreni di crescita sono disponibili in accordo con il microrganismo(i) cercato. 5.3 Tamponi, bastoncini che si possono rompere, con tampone di cotone o materiale sintetico (come alginato o rayon) contenuto in una provetta o in una busta.




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07.doc Il tampone deve essere spostato individualmente e sterilizzato. Deve essere documentato che il materiale usato sia libero da sostanze inibitorie. Nota – Per alcuni tipi di superficie, i residui di cotone possono contaminare le parti interne di queste superfici dopo campionamento. 5.4 Panni, materiale in tessuto sterile, pulito , libero da sostanze antimicrobiche, confezionato singolarmente in buste di plastica sterili, usato per il campionamento di ampie superfici (≥ 100 cm2). 5.5 Spugne, quadrati sterili, puliti di spugna piana, liberi da sostanze antimicrobiche, confezionati singolarmente in buste di plastica sterili usato per il campionamento di ampie superfici (≥ 100 cm2). 5.6 Contenitori, come bottiglie, provette o beute, adatte per la sterilizzazione e la conservazione dei terreni di coltura. 5.7 Borse frigo, isolate, capaci di mantenere i campioni a bassa temperatura durante il trasporto al laboratorio. 5.8 Pipette graduate, che hanno ampie aperture e una capacità nominale di 1 ml, graduate in divisioni da 0,1 ml, o pipette automatiche da 100 µl e 1000 µl . 5.9 Mixer, per miscelare liquidi nelle provette delle colture. 5.10 Omogeneizzatore peristaltico o omogeneizzatore con agitazione orizzontale, con borse di plastica sterili per preparare la sospensione iniziale attraverso un movimento peristaltico (omogeneizzatore peristaltico) o un movimento di vibrazione (omogeneizzatore con agitazione orizzontale). 5.11 Piastre Petri, fatte di plastica di diametro 65 mm. 5.12 pH-metro, con divisione pari a 0,01 unità di pH a 25°C ± 1°C, con accuratezza di 0,1 unità di pH. 5.13 Mascherina, fatta di un materiale resistente alla corrosione (es. una struttura di acciaio inossidabile che acclude su un’area da 20 a 100 cm2) facile da pulire e sterilizzabile, oppure mascherine in carta monouso. 6. TECNICHE DI CAMPIONAMENTO 6.1 Generale E' importante che il laboratorio riceva un campione che sia rappresentativo della superficie testata e che non sia stato cambiato durante il trasporto e lo stoccaggio oppure da residui di disinfettanti.




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07.doc I disinfettanti sono generalmente formulati per una disinfezione il cui tempo di contatto va da 5 a 15 minuti. Attendere per un periodo di tempo in accordo con le indicazioni sul disinfettante prima di analizzare la superficie con tamponi o dischi da contatto, per valutare l'efficacia del programma di pulizia e disinfezione ( o altrimenti secondo le indicazioni sul disinfettante). Non può essere prescritto un neutralizzatore appropriato per tutte le situazioni. Generalmente, sorbitano monooleato (30 g/l) e la lecitina (3 g/l) sono utili per neutralizzare i residui di disinfettanti assorbiti (es. composti quaternari dell’ammonio, anfoteri). Il sodio tiosolfato (5 g/l) è un buon neutralizzatore per i prodotti alogenati. Nel caso di disinfettanti perossidati, può essere usata come neutralizzatore la catalasi e la perossidasi. Una unità di questi enzimi catalizza la decomposizione di una µmol di perossido di idrogeno al minuto a 25°C e a pH 7,0 ± 0,2. Un numero di neutralizzatori disinfettanti sono raccomandati in EN 1276[1], EN 1650[2], EN 13697[3] e EN 13704 [4]. I componenti di un neutralizzatore che può essere usato nella maggior parte delle situazioni sono espressi in Tabella 1. Preparare una soluzione di peptone (1g/l) e di cloruro di sodio (8,5 g/l), distribuire in provette o bottiglie e sterilizzare per 15 minuti a 121° C.

Tabella 1 – Neutralizzatore che può essere usato nella maggior parte delle situazioni

Durante il campionamento viene utilizza come diluente acqua peptonata salina (APS) con aggiunta di Lecitina secondo i quantitativi indicati in tabella 1. In caso di necessità specifiche con presenza di prodotti alogenati, il laboratorio utilizza la soluzione di APS con Tiosolfato di sodio. 6.2 Metodo con piastra da contatto Dopo averlo rimosso dai contenitori di trasporto, premere la superficie di agar della piastra da contatto o il DIPSLIDE con la mano ferma e senza movimenti laterali contro al superficie di analisi. Dalla letteratura è noto che i risultati ottimali per le piastre da contatto si ottengono con un tempo di contatto di 10 secondi e una pressione ottenuta con una massa di 500 g. Chiudere le piastre o i DIPSLIDE immediatamente dopo l’inoculazione e rimetterli in un contenitore da trasporto. Per ogni punto di prelievo utilizzare, una unica superficie di agar della piastra da contatto o DIPSLIDE specifica per la prova in esame. Per la prova in bianco viene utilizzato una piastra da contatto o DIPSLIDE dello stesso tipo di quelli utilizzati per il campionamento, il quale seguirà tutto il percorso che va dal trasporto, campionamento,

Componente Conc. Sorbitano monooleato (Polysorbato 80) 30 g/l Lecitina 3 g/l Tiosolfato di sodio 5 g/l L- Istidina 1 g/l Saponina 30 g/l




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07.doc incubazione e lettura in base agli Standard Internazionali attinenti per i microrganismi bersaglio che devono essere rilevati o contati, senza prevederne l’utilizzo per il prelievo. 6.3 Metodo del tampone o del PANNO/spugna 6.3.1 Metodo del tampone Rimuovere il tampone dalla sua provetta di trasporto sterile e inumidire la punta immergendola in una provetta contenente il liquido di diluizione. Premere la punta del tampone contro le pareti della provetta per rimuovere l’acqua in eccesso. Porre la punta del tampone sulla superficie da analizzare e strisciare un’area stimata da circa 20 a 100 cm2 ruotando il tampone tra il pollice e l’indice in due direzioni perpendicolarmente l’una all’altra. Mettere il tampone di nuovo nella sua provetta di trasporto e versare dentro tutto il liquido diluizione della provetta utilizzata per inumidire il tampone stesso e richiudere. Per ogni punto di prelievo utilizzare, un singolo tampone inumidito e strisciato come descritto precedentemente. Per la prova in bianco utilizzare una provetta con un tampone dello stesso tipo di quelli utilizzati per il campionamento immerso in 10 ml di APS all’interno di una provetta, il quale seguirà tutto il percorso che va dal trasporto, campionamento, semina sul terreno, incubazione e lettura in base agli Standard Internazionali attinenti per i microrganismi bersaglio che devono essere rilevati o contati, senza prevederne l’utilizzo per il prelievo. 6.3.2 Metodo del panno /spugna Aprire la borsa di plastica o il contenitore con il panno o la spugna. Inumidire il panno o la spugna con l’aggiunta di tutto il diluente (10 ml). Nel caso di superfici umide, questo non è necessario. Rimuovere asetticamente il panno o la spugna con pinze sterili o con la mano con un guanto sterile. La mano con il guanto che effettua il prelievo deve venire a contatto esclusivamente con il panno o spugna per lo specifico punto di prelivo. Campionare la superficie scelta in due direzioni perpendicolari, cambiando la faccia del panno o della spugna. Rimettere il panno o la spugna nel sacchetto di plastica e chiuderlo in modo che non avvenga alcuna perdita. Sia il panno sia la spugna al momento delle analisi devono essere ancora umidi.




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07.doc Per ogni punto di prelievo utilizzare un singolo panno/spugna inumidito e strisciato come descritto precedentemente. Per la prova in bianco utilizzare un panno o spugna dello stesso tipo di quelli utilizzati per il campionamento immerso in 10 ml di APS all’interno di un sacchetto, il quale seguirà tutto il percorso che va dal trasporto, campionamento e processo analitico in base agli Standard Internazionali attinenti per i microrganismi bersaglio che devono essere rilevati o contati, senza prevederne l’utilizzo per il prelievo. 6.4 Caratterizzazione superfici campionate Compilare la scheda prelievo, trasporto e ricevimento Mod. 7/06 indicando nel campo “descrizione campione” le caratteristiche della superficie campionata, specificando “sanificata/sanificate” o “ sanificata/sanificate no” e scrivere, solo se presente, “presenza di liquido sulle o sulla superficie campionata”. Nella caratterizzazione della superficie campionata possiamo avere 4 diverse situazioni: A) Nella fase di campionamento vengono campionate come da routine del laboratorio 10 cm2 con le DIPSLIDE (piastra da contatto) e 100 cm2 utilizzando i metodi swab e spugne abrasive. Il tecnico indica sempre nella scheda prelievo, trasporto e ricevimento MOD 7/06, nel campo imballaggio sia il tampone utilizzato sia la superficie campionata. B)Nei casi in cui non sia esattamente specificabile l’area di campionamento, indicare nel campo descrizione campione “superficie campionata seguita dall’area prelevata e dall’avverbio circa” come riportato nel seguente esempio (superficie campionata 1m2 circa), nel campo imballaggio indicare solo il tipo di tampone utilizzato. C)Quando nella fase di campionamento non sia possibile definire neanche approssimativamente l’area di campionamento identificare il punto di prelievo nel campo descrizione campione come “tampone su seguito dall’indicazione del punto di campionamento”, esempio (tampone su maniglia frigorifero) omettendo l’indicazione nel punto di prelievo e indicando nel campo imballaggio solo il tipo di tampone utilizzato. D)Nei casi cui sia esattamente specificabile l’area di campionamento, ma diversa dalla routine di laboratorio, indicare nel campo descrizione campione “superficie campionata seguita dall’area prelevata” come riportato nel seguente esempio (superficie campionata 1m2) e nel campo imballaggio indicare solo il tipo di tampone utilizzato. Le istruzioni indicate in questo paragrafo vengono utilizzate sia alla ricezione campione in laboratorio durante la compilazione della Scheda ricezione e gestione campione sia al ritiro campione presso la sede indicata dal Cliente, specificando la figura che ha eseguito il campionamento se cliente o terza parte.




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07.doc Nei casi B, C e D vengono eseguite solo le analisi qualitative, e il risultato è espresso in presente/assente per tampone 7. TRASPORTO Trasportare i campioni prelevati con il tampone, preferibilmente nell’arco di 4 ore, e conservarli ad un temperatura tra 1° C a 4° C. I tamponi devono essere analizzati il prima possibile e comunque non più tardi delle 24 ore dal prelievo, come descritto al punto 8. 8. PROCEDURA 8.1 Metodo della piastra da contatto Incubare le piastre da contatto o i DIPSLIDES a seconda del tipo di microrganismo che deve essere contato (vedere nota al punto 4). Il metodo della piastra da contatto non deve essere usato per la rilevazione specifica di microrganismi patogeni. 8.2 Metodo del tampone (inclusi il panno e la spugna) Miscelare completamente i contenuti delle provette contenenti i tamponi usando un mixer (5.9) per 30 secondi, regolando la velocità in modo che la parete della provetta sia bagnata fino ad un’altezza di 2-3 cm sotto la parte superiore. Aggiungere ai sacchetti di plastica contenenti i panni o le spugne una quantità di liquido di diluizione o di liquido neutralizzante (4.1) in base alla grandezza dell’area analizzata (es. 100ml per 100 cm2). Poi trattare il contenuto dei sacchetti in un omogeneizzatore peristaltico (5.10) per 1 minuto, oppure un omogeneizzatore con movimenti orizzontali (5.10) per 30 secondi. Tutto questo rappresenta la sospensione iniziale. Se ci si aspetta un numero elevato di microrganismi, preparare ulteriori diluizioni decimali in modo da ottenere un numero contabile di colonie (vedere ISO 6887-1). Data la tipologia di superficie campionata (superfici sanificate)e i limiti di contaminazione, per i metodi in cui è previsto il conteggio seminare in una piastra 1 ml della sospensione iniziale e in un’altra piastra 1 ml della diluizione -1 per le semine per inclusione. Per le semine mediante spatolamento utilizzare 3 piastre per la sospensione iniziale e seminare in una piastra 0.3 ml, nell’altra 0,3 ml e nella rimanente 0.4 ml, stesso procedimento applicarlo alla diluizione -1.




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07.doc In casi diversi dalle superfici sanificate le diluizioni possono variare e vengono concordate da TL, SUPLAB e Dir. In accordo con i metodi di numerazione usati (vedere gli Standard Internazionali appropriati) inoculare in singolo la piastra di terreno previsto dalla norma. Capovolgere le piastre ed incubarle alla temperatura e per il tempo adeguato ad ogni terreno. Come alternativa al metodo descritto sopra, è possibile usare la tecnica della GOCCIA. Iniziando dalla diluizione più alta, usare pipette sterili per trasferire aliquote di 0,05 ml delle sospensioni iniziali (tamponi, panni o spugne) e delle ulteriori diluizioni in settori appropriati del terreno di coltura segnato sulla parte inferiore della piastre( in doppio usando le stesse diluizioni per piastre differenti). Ogni piastra precedentemente asciutta può essere usata per gocce di non più di sei differenti diluizioni. Tenere le piastre orizzontalmente (coperchio in su) fino a che la superficie non è asciugata. Se il metodo del tampone è usato per rilevare la presenza di microrganismi specifici (Listeria monocytogenes o Salmonella spp.) l’area analizzata deve essere almeno 100 cm2 e preferibilmente circa 1000 cm2. Trasferire il tampone, panno o spugna nel terreno di arricchimento appropriato e miscelare bene. Salvo differenti accordi concordati da TL, SUPLAB e Dir, per i metodi quantitativi per le Enterobatteriaceae e la Conta di microrganismi a 30°C utilizzare per il prelievo il metodo della piastra DIPSLIDE, mentre per la ricerca di Salmonella spp. e Listeria monocytogenes utilizzare il metodo con le spugne abrasive. Per gli altri parametri quantitativi utilizzare il metodo dei tamponi swab. Per quanto concerne le superfici campionate, i tecnici di laboratorio prelevano di routine 10 cm 2 con il metodo DIPSLIDE e 100 cm2 utilizzando i metodi swab e spugne abrasive. Salvo diverse esigenze specifiche concordate con TL, SUPLAB e Dir 8.3 Conta e rilevazione delle colonie 8.3.1 Metodo della piastra da contatto Contare il numero di colonie tipiche sulla piastra o DIPSLIDE direttamente dopo il tempo di incubazione specifico e confermare quelle , se necessario, in accordo con il microrganismo(i) cercato. 8.3.2 Metodo del tampone (incluso panno e spugna) Contare le colonie in ogni piastra e confermare quelle, se necessario, in accordo con il microrganismo cercato. 8.3.3 Metodo della piastra GOCCIA Contare il numero delle colonie target alle diluizioni rese da 5 e 50 colonie.




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07.doc 8.3.4 Procedure di arricchimento Dopo il pre-arricchimento, seguire le istruzioni in accordo con il microrganismo cercato. 9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI E CALCOLO Attenzione- Poiché il metodo della piastra da contatto e quello del tampone/spugna non danno in genere lo stesso risultato, è necessario stabilire nel rapporto quale metodo è stato usato. 9.1 Metodo della piastra da contatto Dividere il numero delle colonie caratteristiche per l’area della piastra. Riportare il conto come numero di unità formanti colonia (UFC) per centimetro quadrato di superficie. 9.2 Metodo del tampone (incluso panno e spugna) 9.2.1 Calcolare il numero di unità formanti colonia (UFC) per millilitro di sospensione iniziale, come descritto nello Standard Internazionale attinente. 9.2.2 Calcolare il numero di UFC per centimetro quadrato di superficie analizzata, NS, usando la formula : NS = N x F x D A dove N è il numero di UFC in 1 ml di liquido di diluizione (o neutralizzante); F è la quantità, in millilitri, di liquido di diluizione( o neutralizzante) nella provetta o nel sacchetto; A è la superficie analizzata , in centimetri quadrati; D è il reciproco della diluizione usata; 9.2.3 Per il metodo delle gocce, calcolare il numero, N, di UFC per millilitro di liquido di sospensione , usando la formula: N = Σ C V( n1+ 0,1 n2)d Dove




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07.doc Σ C è la somma delle colonie contate in tutte le gocce considerate da due diluizioni successive , almeno una delle quali contiene 5 colonie; V è il volume dell’inoculo applicato in ogni goccia (in questo caso 50 µl); n1 è il numero di gocce considerate alla prima diluizione; n2 è il numero di gocce considerate alla seconda diluizione; d è il fattore di diluizione corrispondente alla prima diluizione considerata; Per ottenere la conta per centimetro quadrato di superficie usare la formula: NS = N x F A dove F è il volume in millilitri, del liquido di diluizione (o liquido neutralizzante) nella provetta o nel sacchetto; A è l’area di cui si è fatto il tampone in centimetri quadrati. 9.2.4 Se l’area di cui è stato fatto il tampone non è definita, per calcolare il numero di UFC per ogni tampone, NSW, usare la formula: NSW = N x F x D Quando vengono usati metodi semi-quantitativi, i risultati ottenuti in UFC per centimetro quadrato di superficie possono essere dati come cosiddetti segni d’igiene. Dal momento che questi segni possono variare ampiamente in base alle superfici esaminate, è raccomandabile che siano stabiliti e accordati tra le parti interessate.

1. Nel caso di procedure di arricchimento, riportare il microrganismo target come rilevato o non rilevato nell’area tamponata, o per tampone se l’area non è nota.

10 BIBLIOGRAFIA

[1] EN 1276:1997, Disinfettanti chimici e antisettici – Analisi di sospensioni quantitative per la valutazione dell’attività battericida di disinfettanti chimici e antisettici usati nelle aree alimentari, industriali domestiche e istituzionali- Metodi di analisi e requisiti (fase 2, passaggio 1). [2] EN 1650:1997, Disinfettanti chimici e antisettici – Analisi di sospensioni quantitative per la valutazione dell’attività fungicida di disinfettanti chimici e antisettici usati nelle aree alimentari, industriali domestiche e istituzionali- Metodi di analisi e requisiti (fase 2, passaggio 1).




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07.doc [3] EN 13697:2001, Disinfettanti chimici e antisettici – Analisi di superfici non porose per la valutazione dell’attività battericida e/o fungicida di disinfettanti chimici e antisettici usati nelle aree alimentari, industriali domestiche e istituzionali- Metodi di analisi e requisiti senza azione meccanica (fase 2, passaggio 2). [4] EN 13704:2002, Disinfettanti chimici e antisettici – Analisi di sospensioni quantitative per la valutazione dell’attività sporicida di disinfettanti chimici usati nelle aree alimentari, industriali domestiche e istituzionali- Metodi di analisi e requisiti (fase 2, passaggio 1). [5] ISO 8261, Latte e latticini- guida generale alla preparazione di campioni per le analisi, delle sospensioni iniziali e delle diluizioni decimali per analisi microbiologiche. [6] ISO/TS 11133-1 , Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali- Linee guida alla preparazione e alla produzione di terreni di coltura- Parte 1: Linee guida generali sulla certezza della qualità della preparazione dei terreni di coltura in laboratorio. 7.2 ALLEGATO 2 Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali -Campionamento delle carcasse per analisi microbiologiche. (ISO 17604:2003) Procedure di campionamento Possono essere usati o il metodo distruttivo o il metodo non distruttivo. Evitare effetti negativi sul valore della carcassa è il vincolo principale per l’utilizzo del metodo distruttivo. Il metodo non distruttivo consente di prendere in esame aree più ampie. Piccole aree mirate di comprovata presenza di maggior contaminazione possono essere esaminate sia con metodo distruttivo sia con metodo non distruttivo. Il laboratorio al fine di mantenere intatte le carcasse effettua il metodo del campionamento non distruttivo Frequenza di campionamento Il numero e frequenze di campionamento sono disciplinate da: -pratiche di macellazione di ogni animale -la progettazione di programmi di controllo del rischio -volumi di produzione --stato di epidemiologia della regione da cui è originario l’animale Nel caso di processo di controllo, il numero e frequenze di campionamento saranno rapportate al livello igienico del mattatoio Nel caso di allerta per patogeni, il numero dei campioni, i siti sulle carcasse, e la frequenza dovrebbero essere proporzionate al fine di aumentare le probabilità di isolare i patogeni ricercati




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07.doc Punti di campionamento Ogni carcassa deve avere la stessa probabilità di essere selezionata per il campionamento I punti di campionamento nel macello devono riferirsi alla pratica di macellazione utilizzata Essi devono essere individuati sulla base del controllo del rischio, e attraverso l’identificazione delle aree problematiche lungo il processo. Esempio di punti di controllo: -dopo il passaggio nella macchina di spazzolatura delle carcasse (suino) -dopo il passaggio delle carcasse nella macchina di lavaggio (suino) -dopo scuoiamento (depilazione) bovini, ovini, caprini, selvaggina allevati in cattività e altri -dopo eviscerazione - nella stanza di raffreddamento, non meno di 12 ore dopo la macellazione

Il Regolamento (CE) N° 1441/2007 della commissione del 5 dicembre 2007 che modifica il regolamento (CE) n. 2073/2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari, indica la fase dopo la macellazione ma prima del raffreddamento per ovini, bovini, caprini, suini ed equini, il punto, per valutare l’igiene di processo, mentre per il pollame tacchini e broilers, dopo il raffreddamento Rilevazione dei microrganismi patogeni Per la determinazione dei microrganismi devono essere seguiti i seguenti punti di campionamento: -immediatamente prima del raffreddamento -nella stanza di raffreddamento, non meno di 12 ore dopo la macellazione Siti di campionamento

Nel controllo di processo, la scelta dei siti di campionamento (punti sulle carcasse) dipende dalle pratiche di macellazione e dai differenti animali.(Vedi figure A1-A2-A3). I siti di campionamento indicati non sono obbligatori. E’ importante una scelta coerente dei siti di campionamento nel tempo. Di solito è preferibile aumentare il numero di carcasse campionate o il numero di siti per carcassa. Per la determinazione dei microrganismi patogeni, la scelta dei siti di campionamento (punti sulle carcasse) dipende dalle pratiche di macellazione e dai differenti animali.

Lo scopo è quello di esaminare i siti con la più alta prevalenza di contaminazione. I siti di campionamento indicati in tabella A.1. E’ importante una scelta coerente dei siti di campionamento nel tempo. Di solito è preferibile aumentare il numero di carcasse campionate o il numero di siti per carcassa. Il campionamento di piccole aree mirate con la più alta prevalenza di contaminazione, può ottenere lo stesso risultati di programmi di sorveglianza con zone di campionamento più ampie.




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07.doc Tabella A.1 Siti più costantemente contaminati da un elevato numero di microrganismi

Maialea Bovinoa Agnelloa

Parte distale dell'arto posteriore (zampetto) 1a Punta di petto (2) Addome fianco (3)

Parte laterale dell'arto posteriore (2) Costola anteriore (3) Torace, laterale (4)

Addome, laterale (pancia) (3) Fianco (4) Sella (6) Metà regione dorsale (4) Fianco inguine (6) Petto, laterale (7)

Addome parte mediale (10) Gerretto posteriore, laterale (8)

a Il numero indica i siti di campionamento nelle figure A1, A2 e A3

Figura A1-Maiale: Esempi siti di campionamento

a) Laterale b) Mediale




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07.doc

Figura A2-Bovino: Esempi siti di campionamento

Figura A3-Agnello: Esempi siti di campionamento






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07.doc Siti consigliati dal Decreto n.257 del 2 novembre 2006 concernente le linee guida per l’applicazione del regolamento CE 2073/2005 Regione Marche

Bovini: collo, punta di petto, pancia e “scamone punto 7 figura A2” Ovini e caprini: pancia, costato, punta del petto e petto Suini: lombo, “guanciale punto 7 figura A1”, faccia mediale della coscia (prosciutto) e pancetta Cavallo: pancia, punta di petto, lombo e scamone Metodo non distruttivo –tampone secco e umido Reagenti 10 ml di Acqua peptonata salina in provetta. Materiali e strumenti Tamponi di cotone Delimitatori sterili Guanti sterili Prelievo campioni

Per ciascun punto o sito di prelievo, inumidire un tampone in una provetta contenente 10 ml di acqua peptonata salina, quindi, aiutandosi con un delimitatore o mascherina, tamponare tutta l’area oggetto del prelievo pari a 100 cm2 . Strofinare premendo il tampone su tutta la superficie, spostandosi orizzontalmente e ruotando il tampone in modo che tutta la superficie dello stesso giunga a contatto con la carcassa. Inserire il tampone nel diluente utilizzato per bagnare il tampone, poi, con un secondo tampone perfettamente asciutto, campionare di nuovo la zona come precedentemente descritto e inserire anche il secondo tampone nello stesso contenitore dov’ è stato posto precedentemente il primo. Per ogni punto di campionamento è utilizzato un delimitatore diverso. Per la prova in bianco utilizzare una provetta con un tampone dello stesso tipo di quelli utilizzati per il campionamento immerso in 10 ml di APS all’interno di una provetta, il quale seguirà tutto il percorso che va dal trasporto, campionamento, semina sul terreno, incubazione e lettura in base agli Standard Internazionali attinenti per i microrganismi bersaglio che devono essere rilevati o contati, senza prevederne l’utilizzo per il prelievo. Metodo non distruttivo –spugnette Reagenti




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07.doc Acqua peptonata salina (15 ml nel sacchetto con la spugna, e 10 ml in provetta) Materiali e strumenti Spugna sterile (priva di sostanze inibenti) in sacchetto in plastica sterile Delimitatori sterili con area interna di 100 cm2 Guanti sterili Prelievo campioni

Prendere il sacchetto contenete la spugna, con addizionato, sterilmente il diluente in quantità sufficiente ad imbibire la spugna “15 ml acqua peptonata salina” Massaggiare con guanti sterili, dall’esterno del sacchetto la spugnetta in modo tale che non rimanga del liquido in eccesso; e quindi, indossando guanti sterili, aprire il sacchetto e prelevare la spugna per il campionamento. Aiutandosi con il delimitatore pressare l’area oggetto del prelievo e strofinare la spugna 10 volte in senso orizzontale e 10 volte in senso verticale. Per ogni punto di campionamento è utilizzato un delimitatore diverso. Al termine dell’operazione riporre la spugnetta nello stesso sacchetto ed addizionare il restante diluente 10 ml, contenuto in una provetta, per una quantità complessiva totale di 25 ml. Per la prova in bianco utilizzare una spugna dello stesso tipo di quelli utilizzati per il campionamento immerso in 25 ml di Acqua peptonata salina all’interno di un sacchetto, il quale seguirà tutto il percorso che va dal trasporto, campionamento e processo analitico in base agli Standard Internazionali attinenti per i microrganismi bersaglio che devono essere rilevati o contati, senza prevederne l’utilizzo per il prelievo. Norme per il campionamento e per la preparazione dei campioni da analizzare in base al regolamento (CE) N. 1441/2007 della Commissione del 5 dicembre 2007 che modifica il regolamento (CE) n. 2073/2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari, Capitolo 3 Quando si procede al campionamento per la ricerca di enterobatteriaceae e il conteggio di colonie aerobiche, i prelievi sono effettuati in quattro siti (punti di prelievo) di ogni carcassa. Con il metodo non distruttivo descritto in questa IO, l’area campione deve essere di 100 cm2 (50 cm2 per le carcasse di piccoli ruminanti) per sito di campionamento. Per la ricerca di Salmonella deve essere utilizzato il metodo della spugna abrasiva, vanno selezionate più aree (siti o punti di prelievo) e l’area totale deve essere almeno di 400 cm2. Quando i campioni sono prelevati sulle carcasse da diversi siti, prima di essere esaminati devono venire aggregati. Salvo differenti accordi da TL, SUPLAB e Dir, utilizzare per il campionamento dei metodi quantitativi il prelievo con tampone swab.




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07.doc Stoccaggio e trasporto dei campioni Trasportare i campioni nei contenitori isotermici con all’interno piastre eutettiche o una scatola di ghiaccio fondente tritato fresco. Non permettere che i campioni si congelino o entrino a contatto diretto con le piastre o il ghiaccio. I campioni vengono analizzati entro 1 ora dal campionamento o conservati a 2°C +/-2°C per un massimo di 24 ore. Inoculo e Incubazione Prima dell’inoculo i campioni prelevati sulle carcasse da diversi siti devono essere aggregati in un unico sacchetto stomacher senza retina e diluiti in base alla superficie totale di prelievo per costituire la soluzione iniziale. Vedi esempi tabella A3 Tabella A3: Esempi applicativi analisi su carcasse

Metodo di prova

N. siti di prelievo

per carcassa

Area totale di campionamento

N. tamponi aggregati e totale liquido di diluente

per campionamento

Diluente da aggiungere al

campione aggregato

Soluzione iniziale, rapporto sup.campionata/diluente totale

ISO 17604:2003 + ISO 21528-2: 2004 Enterobatteriaceae

4 4 siti da 100 cm2 totale 400 cm2

8 tamponi - totale 40 ml diluente

360 ml acqua peptonata salina

400 cm2/400ml

ISO 17604:2003 + ISO 4833:2004

Conta di microrganismi a 30°C


8 tamponi - totale 40 ml diluente


400 cm2/400ml

ISO 17604:2003 + UNI EN ISO 6579:2008

Salmonella spp.


4 spugne – totale diluente 100 ml

300 ml di acqua peptonata tamponata

400 cm2/400ml





400 cm2/400ml

ISO 17604:2003 + ISO 4833:2004

Conta di microrganismi a

30°C.



300 ml di acqua peptonata salina

400 cm2/400ml

Trattare la soluzione iniziale prima dell’inoculo, in agitatore peristaltico per 1 minuti Se il prelievo viene eseguito solo su un sito della carcassa pari ad una superficie totale di prelievo di 100 cm2 , in questo caso non dovendo aggregare i campioni, versare i diluenti e i tamponi o spugne all’interno di un sacchetto stomacher, aggiungere un volume appropriato di diluente apposito (vedere Standard




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07.doc Internazionali appropriati), per il metodo con tamponi swab 90 ml, mentre per il metodo con spugna abrasiva 75 ml e trattare in agitatore peristaltico per 1 minuto. La soluzione iniziale così preparata costituisce il campione di prova tal quale. Per le determinazioni qualitative seminare la soluzione iniziale in accordo con i metodi usati (vedere gli Standard Internazionali appropriati) Per le determinazioni quantitative in base al metodo utilizzato (vedere gli Standard Internazionali appropriati) seminare in singolo la soluzione iniziale e le diverse diluizioni indicate in tabella A.4 Tabella A.4: Metodi di prova e soluzioni da seminare Metodo di prova Diluizioni da seminare*


Soluzione iniziale, -1,-2,

ISO 17604:2003 + ISO 4833:2004 Conta di microrganismi a 30°C

Soluzione iniziale, -1,-2, -3

Le diluizioni possono variare e vengono concordate da TL, SUPLAB e Dir. 8. RIFERIMENTI

PRO 07 “Gestione Campioni da Sottoporre ad Analisi” ISO 6887-1, Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali- Preparazione dei campioni di analisi, sospensione iniziale e diluizioni decimali per analisi microbiologiche – Parte 1: regole generali per la preparazione della sospensione iniziale e delle diluizioni decimali. ISO 7218, Microbiologia degli alimenti e dei mangimi animali – Regole generali per analisi microbiologiche Norme riportate nel punto 10, lettera D. ISO 18593:2004 ISO 17604:2003 9. DISTRIBUZIONE E PRESA VISIONE

La distribuzione e presa visione del presente documento viene fatta mediate il Mod. DOC-01 “Modulo distribuzione e Presa visione dei documenti

istruzione operativa campionamento superfici e … campionamenti 2014/io 7-01... · microbiologia...

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