This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Isolierung und Strukturuntersuchungen an der Ribonuclease T2 aus Aspergillus oryzae, I. Isolation and Structure Investigations on the Ribonuclease T2 from Aspergillus oryzae, I.

A. Klemer*, H.-M. Künnemeyer und H. Matern Organisch-Chemisches Institut der Universität Münster, Orleans-Ring 23, D-4400 Münster

Z. Naturforsch. 3 6 b , 1163-1168 (1981); eingegangen am 9. Februar 1981

Aspergillus oryzae, Ribonuclease T2 From aspergillus oryzae extracts via 100 g preparations each 80 mg pure ribonuclease T2

were obtained. The enzyme contains 1 6 - 1 7 % carbohydrate (12 -13% neutralsugars and 4 % glucosamine). G. c. analysis results mannose, glucose, fucose, glucosamine, galactose and xylose in ratio 1 4 : 8 : 6 : 6 : 4 : 1 . Proteolytic degradation of the enzyme gave a glyco-peptide with a uniform heteropolysaccharide containing the total carbohydrate amount.

Einleitung In Aspergillus oryzae findet man die Ribonucleat-

3'-guanylooligonucleotid-hydrolase (EC 3.1.4.8; R-Nase Ti) und die zu untersuchende Ribonucleat-3'-oligonucleotid-hydrolase (EC 3.1.4.23; R-Nase T2). Während erstere ein reines Protein ist, gehört die R-Nase T2 zur Gruppe der Glykoproteine. Sie zeigt im Gegensatz zu anderen Ribonucleasen eine ano-male Kinetik. Der Mechanismus der Reaktion wurde ausführlich erforscht [1, 2]. Weitere Untersuchun-gen sollen klären, inwieweit der Saccharid-Teil mit dieser Anomalie in Zusammenhang steht. Hierzu ist es notwendig, die Zusammensetzung der Kohlen-hydrat-Komponente, die Zahl der Saccharidketten, die Bindungsregion am Protein und schließlich die Struktur der Saccharidketten festzustellen. Über erste Ergebnisse berichtet die vorliegende Arbeit.

Zur Kohlenhydrat-Komponente der R-Nase T2 ist erst wenig bekannt. Erste Untersuchungen wur-den in den 60-iger Jahren vorgenommen [3, 4]. Danach besitzt die R-Nase T2 einen Kohlenhydrat-gehalt von 12-15%. Durch Ionenaustauscher-chromatographie ließ sich die R-Nase T2 in die Komponenten A und B zerlegen, die sich bei sonst gleichem biochemischen Verhalten in der Zu-sammensetzung des Kohlenhydrat-Teils unterschei-den. In der A-Komponente wurden hauptsächlich Mannose und Glucose gefunden, in der B-Kompo-nente Mannose und Galactose.

Ergebnisse und Diskussion 1. Isolierung des Enzyms

Zur Isolierung der R-Nase T2 aus Aspergillus oryzae stand ein Verfahren zur Verfügung [2, 3], das das hochgereinigte Enzym in Form der A- und B-Komponente liefert. Da es jedoch nur zur Ge-winnung sehr kleiner Mengen geeignet ist, mußte es zunächst für unsere vorgesehenen Arbeiten auf grö-ßere (8-fache) Ansätze umgestaltet werden. Die

Enzymkonzentrat gelöst in 0,01 M Phosphatpuffer pH = 3,5, zentrifugiert

r Lösung

Trennung an Phosphocellulose im batch-Verfahren

Fraktionierung I Chromatographie an I D E A E -Cellulose

Fraktionierung I Chromatographie an | Phosphocellulose

Fraktionierung Gelfiltration an Sephadex G-50 superfine

Fraktionierung Gelfiltration an Sephadex G-25 superfine

Fraktionierimg

Sediment verworfen

Gefriertrocknung

Schema 1. Isolierung der R-Nase T2 und Elutionsdia-gramme (Abb. 1).

UV-Absorp-tion Enzym -Qktivität

UV-Absorp-tion Enzym aktivität

Elutionsdiagramm an Phosphocellulose

UV-Absorp-tion — Enzym-Qktivität

Elutionsdiagramm an Sephadex G-25 superfine Abb. 1.

dabei auftretenden Entsalzungsprobleme lösten wir auf folgende Art (s. Schema 1).

Auf die am Anfang des Verfahrens stehende Säure-fällung von Fremdprotein winde verzichtet. Statt dessen wurde die R-Nase T2 aus der Phosphatpuffer-lösung des Enzymkonzentrates* direkt an Phospho-cellulose nach dem „batch"-Verfahren adsorbiert und abgetrennt. Die desorbierten Anteile wurden dann ohne vorherige Entsalzung einer DEAE-Cellulose-Gradientenchromatographie unterworfen, weiter an Phosphocellulose, Sephadex G 50 und G 25 gereinigt und erst im letzten Schritt gleich-zeitig entsalzt. Zur Unterdrückung des hierbei auf-tretenden „tailing" erwies sich Pyridinacetat als

ungeeignet. Gute Erfolge wurden jedoch mit 10-proz. Ethanol erzielt.

Die Austestung der R-Nase T2-haltigen Fraktio-nen erfolgte wie im o.a. Verfahren nach der UV-Absorption und der Enzymaktivität. In keinem Fall konnten wir jedoch bei unseren Trennungs-gängen eine Aufspaltung der R-Nase T2 in die Komponenten A und B beobachten. Eine zur Kon-trolle durchgeführte Isolierung nach dem bekannten Verfahren mit den dort angegebenen Mengen lieferte das gleiche Ergebnis. Offensichtlich war also in dem uns zur Verfügung stehenden Rohmaterial nur eine R-Nase T2-Komponente enthalten. Die Aktivität unserer R-Nase To betrug vor der Gefriertrocknung bezogen auf Up (c) als Substrat 380^400 Ui/mg, die Ausbeute ca. 80 mg je 100 g Ausgangsmaterial.

2. Der Aminosäure- und Glucosamingehalt Zur Kenntnis wurden Proben des Enzyms in 6 N

HCl bei 110 °C nach unterschiedlicher Hydrolysen-dauer im Aminosäure-Analysator untersucht. Wie die Tab. I, linke Spalte, zeigt, finden wir nach 16-stdg. Hydrolyse im Gegensatz zu Uchida [3] 4 % Glucosamin, die Aminosäure werte stehen in guter Übereinstimmung mit den Literaturwerten [3]. Sie entsprechen einem Proteingehalt des Enzyms von rd. 85%. (Das Fehlen des Aminozuckers in Uchidas Analyse ist sehr wahrscheinlich auf die Zerstörung während der 32-72-stdg. Hydrolyse zu-rückzuführen (vgl. [5]). Hierfür spricht auch der hohe NH3-Wert in der Analyse.)

Tab. I. Aminosäure- und Glucosamingehalt (MolVer-hältnis bezogen auf Asp = 1 0 ) der R-Nase T 2 und des daraus erhaltenen Glykopeptids nach 16-stdg. Hydro-lyse mit 2 N H 2 S 0 4 bei 110 °C.

Aminosäuren R-Nase T2 Glykopeptid

Lys 3,0 -His 1,36 -Arg 2,0 -Asp 10,0 10,0 Thr 4,83 2,56 Ser 6,7 4,99 Glu 7,2 3,5 Pro 5,0 3,65 Gly 7,9 3,5 Ala 5,7 2,19 Val 2,5 (0,63) lie 3,0 (0,58) Leu 4,8 (0,58) Tyr 2,7 Phe 2,9

Glucosamin 1,9 16,98

Elutionsdiagramm an DEAE-Cellulose

3. Der Neutralzuckergehalt Zunächst wurden die optimalen Hydrolysen-

bedingungen des Kohlenhydrat-Teils an Hand von Testuntersuchungen am Kohlenhydratanalysator ermittelt. Es zeigte sich, daß die bisher gewählten Bedingungen [3] nicht ausreichten. Erst nach 15-stdg. Hydrolyse mit 2 N H2S04 bei 100 °C und nachfolgend 24 h bei Raumtemperatur waren keine Di- und Oligosaccharide mehr vorhanden.

Die Analyse des erhaltenen Monosaccharidge-misches am Kohlenhydrat-Analysator (nach Ent-fernen von Aminosäuren und Glucosamin durch Mischbettaustauscherchromatographie) ergab Man-nose, Glucose, Fucose, Galactose und sehr wenig Xylose im Gesamtgehalt von 12%. Auf dieser Basis wählten wir für die quantitative Analyse die gas-chromatographische Bestimmung der Monosaccha-

Mannose Galaktose G1UC086 Man Gal: Glc

46250 12063 31752 3,83 1 2,63 63034 18737 36723 3,36 1 1,96 78355 23428 43247 3,34 1 1,85 57466 17443 32610 3,29 1 1,87 29184 9406 17170 3,10 1 1,83 28748 7268 16572 3,96 1 2,28

m = 3,48 1 2,07

ride in Form der zugehörenden Alditacetate, wobei wir in Anlehnung an bekannte Verfahren [6] ent-sprechend Schema 2 vorgingen.

Das Gaschromatogramm enthielt eindeutige Peaks, die Mannose, Glucose, Galactose sowie einer sehr geringen Menge Xylose zuzuordnen waren. Nicht zu bestimmen war der Fucosegehalt, da an fast gleicher Stelle ein nicht näher identifiziertes Nichtkohlenhydrat-Abbauprodukt auftrat. Wir konnten jedoch den exakten Fucosewert, ausgehend von dem proteolytisch abgebauten Enzym, nach gleicher Methode ermitteln. Als Gesamtkohlen-hydratgehalt wurden ca. 13% gefunden.

Unter Berücksichtigung des Glucosaminwertes von 4 % sind die erhaltenen Resultate am besten mit einer Verteilung von Mannose, Glucose, Fucose, Glu-cosamin, Galactose und Xylose, wie 14 :8 :6 :6 :4 :1 zu vereinbaren.

4. Die Anzahl der Saccharid-Ketten und Bindungsregion

Zur weiteren Kenntnis der Struktur des Enzyms und insbesondere der Bindungsregion zwischen Kohlenhydrat und Proteincore wurde die R-Nase T2 mehrfach mit gereinigter Pronase P abgebaut. Die nachfolgende Sephadex G-50-Chromatographie lie-ferte nur eine Glykopeptidfraktion, die den gesam-ten Kohlenhydrat-Teil des Enzyms enthielt. Auch an Sephadex G-25 erwies sich dieses Glykopeptid als einheitlich, wobei aus dem Gang der Trennung auf eine Molmasse von ca. 5000 zu schließen ist.

Da die Molmasse des intakten Enzyms mit einem Kohlenhydratgehalt von ca. 17% 36,200 beträgt, liegt demnach der gesamte Saccharid-Teil in einem einzigen Block vor, wie auch an einer Reihe anderer Ribonucleasen aus tierischem Material festgestellt wurde [7].

In Tab. I sind die Aminosäure- und Glucosamin-Werte des Enzyms und des daraus durch enzyma-tischen Abbau erhaltenen Glykopeptids gegenüber-gestellt.

Aus dem Vergleich geht deutlich die starke Zu-nahme des Glykopeptids an Glucosamin hervor, Lys, His und Arg wurden vollständig, Val, lie und Leu weitgehend abgespalten. Dieser Befund läßt auf einen Glucosamin-Asparagin-Bindungstyp schlie-ßen.

Der Beweis wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen erbracht.

a) Es wurde die reduktive Spaltung des Glyko-peptids in alkalischem Bereich mit Natrium-Bor-hydrid mit nachfolgender saurer Hydrolyse nach bekannter Methode [8] vorgenommen.

Im Aminospektrum des erhaltenen Hydrolysats waren die erwarteten Folgeprodukte des als Säure-amid gebundenen Glucosamins: Glucosamimitol und sehr wenig Mannosaminitol (entstanden durch par-tielle Epimerisierung während der Reaktionsfolge) deutlich nachzuweisen. Zusätzlich liegt jedoch ein erheblicher Teil des Glucosamins (etwa 3/4 der ur-sprünglichen Menge) unverändert vor. Unter Be-rücksichtigung der gefundenen 4 % = 6 Glucosamin-Reste müßten demnach 5 in der Polysaccharidkette in normaler Bindung lokalisiert sein.

b) Der zweite unabhängige Beweis für den Bin-dungstyp wurde durch den Nachweis des bei der partiellen sauren Hydrolyse des Glykopeptids zu erwartenden Strukturelementes 4-N-(2-Acetamido-2-desoxy-ß-D-glucopyranosyl)-L-asparagin [9, 15] erbracht. Das Spaltstück ließ sich einwandfrei am Aminosäure-Analysator an Hand des Testspek-trums der im Handel erhältlichen authentischen Substanz und durch Zumischen identifizieien. Die Retentionszeit betrug in beiden Fällen 27,5 min.

Insgesamt legen diese Befunde unter Berück-sichtigung der Neutralzuckeranalyse nahe, daß die Kohlenhydratkette dem N-Acetyllactosamintyp mit dem Mannose-haltigen Kernstück nach dem allgemeinen Schema [9, 10] wie Abb. 2 zeigt, ange-hört.

Nicht unterzubringen ist der hohe Glucosegehalt. Ob dieser auf eingeschleppte Glucose aufgrund der verwendeten Sephadexgele oder Phosphocellulose zurückzuführen ist, wird sich ebenso wie weitere Aussagen zur Struktur der Saccharidkette durch eine Methylierungsanalyse klären lassen, mit der wir uns z.Zt. befassen.

Nicht erfolgreich verliefen Versuche zur Sequenz-ermittlung der Peptidkomponente des proteolytisch abgebauten Enzyms nach Edman [11, 12]. Die zu erwartenden Phenylthiohydantoin-Derivate ließen sich an Hand von Testsubstanzen dünnschicht-chromatographisch nicht oder nur unzuverlässig nachweisen. Vermutlich wird die Reaktion durch den großen Kohlenhydrat-Rest stark behindert.

Beschreibung der Versuche Material und Methoden

Geräte: Für die automatische Aminosäurenanalyse wurde das Gerät Unichrom 4231 der Fa. Beckman, München, benutzt. Für Kohlenhydrat-Bestimmun-gen verwendeten wir einen automatischen Kohlen-hydratanalysator der Fa. Technicon, Bad Vilbel. Die gaschromatographischen Analysen wurden an einem System F 22 der Fa. Perkin-Elmer mit einem Minigrator der Fa. Spectra-Physics, Darmstadt, durchgeführt. Zur Gefriertrocknung benutzten wir eine Anlage der Fa. Christ, Osterode/Harz. Enzyma-tische Aktivitätsbestimmungen erfolgten an einem Shimadzu Double beam-Spektrophotometer. Die halbautomatischen Fraktionierungen wurden mit einer Geräteeinheit Uvicord II bzw. III der Fa. LKB, Schweden, registriert.

Chemikalien: Das Enzymkonzentrat aus Asper-gillus oryzae erhielten wir von der Fa. Luitpold, München, die Pronase P von Calbiochem, Luzern, die Chromatographiegele von Pharmacia, Freiburg, die Austauscherharze von Serva, Heidelberg, und die Säulenmaterialien für die Gaschromatographie von der Fa. WGA, Griesheim-Hessen. Die übrigen verwendeten Chemikalien waren Produkte der Fa. Merck, Darmstadt. Die als Vergleichssubstanzen benötigten Per-acetate der Zuckeralkohole wurden nach bekannten Vorschriften synthetisiert [6].

Analytische Methoden (A) 1. Aminosäuren wurden am automatischen

Aminosäureanalysator nach 15-stdg. Hydrolyse in 6 N HCl bei 110 °C bestimmt.

S A ,

(Gal—• N A c - G l c ),

Man

Man — NAc-Glc NAc-Glc

Man

--*Asn

2. Zur Kohlenhydralhestimmmxg wurden 2 mg R-Nase T2 mit 2 ml 2 N H 2 S0 4 15 h bei 100 °C und 24 h bei Raumtemperatur hydrolysiert. Nach Ver-dünnen mit Wasser wurde zur Neutralisation und zur Entfernung der Aminosäuren und Aminozucker über einen Mischbettaustauscher aus Kationen-austauscher 1 x 8 cm Dowex 50 W X 8, H+-Form, 200-400 mesh und Anionenaustauscher 1 x 8 cm Dowex 1 x 2 Cl--Form, 200-400 mesh, gegeben. Es wurde mit ca. 40 ml Wasser eluiert, eingedampft und der Rückstand am Kohlenhydratanalysator untersucht.

Die kohlenhydrathaltigen Fraktionen der gel-chromatographischen Trennungen wurden nach der Orcin-Schwefelsäure-Methode identifiziert.

Chromatographische Methoden Gelchromatographie an Sephadex-Molekularsie-

ben erfolgte nach einem halbautomatischen Ver-fahren an Pharmacia Chromatographiesäulen. Es wurden die Dextrangele G-25 superfine und G-50 superfine verwendet.

Austauscherchromatographie wurde an Phospho-cellulose P I und DEAE-Cellulose DE 32 der Fa. Whatman, Maidstone, durchgeführt. Gaschromato-graphie wurde an dem oben beschriebenen Gerät unter Verwendung einer Glassäule, 0,2 x 200 cm (3% OV 225 auf Chromosorb WAW-DMCS, mesh 100-120), durchgeführt.

Isolierung der Ribonuclease T2 100 g Enzjankonzentrat wurden in 11 0,01 M

Phosphatpuffer pH 3,5 weitgehend gelöst und ein Rückstand durch Zentrifugation entfernt. In das Zentrifugat wurden dreimal je 150 ml Phospho-cellulosesuspension eingerührt. Die abfiltrierte Phos-phocellulose wurde in 1 1 0,01 M Phosphatpuffer pH 8,0 aufgenommen und nach einer Stunde wieder-um abfiltriert. Das Filtrat wurde auf eine DE 32-Säule, 4 X 20 cm, pH 8,0, gegeben. Durch Anwen-dung eines pH-Salzgradienten, 0,01 M Phosphat pH 8,0, 0,15 M Phosphat/0,15 N NaCl pH 4,0, wur-den die adsorbierten Proteine fraktioniert desor-biert. Die R-Nasehaltigen Fraktionen wurden durch Tests nach bekannten Verfahren mit Cp(c) identi-fiziert, vereinigt, auf pH 3,5 titriert und auf eine Phosphocellulosesäule, 2 X 15 cm, Phosphatpuffer 0,01 M pH 3,5, gegeben. Die Elution erfolgte durch einen pH/Salzgradienten von 0,01 M/pH 3,5 auf 0,15 M/pH 8,0. Die enzymhaltigen Fraktionen wur-den auf ca. 5 ml eingeengt, auf eine G-50 superfine Säule 3 X 100 cm aufgetragen und mit 0,2 M Acetat-puffer pH 5,2 eluiert. Die aktiven Fraktionen wur-den durch Gelchromatographie an G-25 superfine durch Elution mit 10-proz. Ethanol entsalzt und gefriergetrocknet. Ausb. 60-80 mg.

Proteinabbau Enzymatischer Abbau mit Pronase P

150 mg der R-Nase T2 wurden mit 7,5 mg gereinig-ter Pronase P [13] (45000 U/g) 48 h bei 37 °C (0,05 M Ca-Ac-Puffer pH 7,4) inkubiert. Nach beendetem Abbau wurde kurzzeitig auf 100 °C erhitzt, zentri-fugiert und die klare Lösung über Sephadex G 50 superfine, 3 X 100 cm, gegeben. Das Austesten des Eluats geschah mit dem analytischen Teil des Kohlenhydratanalysators.

Die kohlenhydrathaltigen Fraktionen werden über G-25 superfine entsalzt und gefriergetrocknet.

Bestimmung der Neutralzucker als Alditacetate 5 mg R-Nase T2 wurden, wie unter (A) 2. ange-

geben, mit 5 ml 2 N H2SO4 hydrolysiert und von Aminosäuren und Glucosamin befreit. Die wäßrige Lösung wurde auf 10 ml eingeengt und mit 10 mg NaBH4 in 0 ,5ml I N NH4OH reduziert. Nach 5-stdg. Stehen bei Raumtemperatur wurde über-schüssiges Reagenz durch Zugabe von Eisessig zer-stört und die entstandene Borsäure durch minde-stens fünfmaliges Abdampfen mit absol. Methanol entfernt. Der trockene Rückstand wurde zur Per-acetylierung mit 1 ml Acetanhydrid versetzt und 3 h bei 100 °C umgesetzt. Die Alditacetate wurden mit Chloroform extrahiert und gaschromatogra-phisch analysiert. Die Identifizierung erfolgte durch Vergleich mit authentischen Proben.

Untersuchungen zur Bindungsregion Zur Untersuchung der Bindungsregion wurde der

Aminosäurengehalt des Hydrolysats des nativen Enzyms mit dem des enzymatisch abgebauten ver-glichen.

Reduktion des Glykopeptids [8] 0,5 mg des Glykopeptids wurden in 0,5 ml 0,2 M

NaOH-Lösung mit 0,1 M NaBH4 gelöst, für 8 h bei 100 °C gehalten, wobei nach jeweils 2 h weitere 0,2 ml NaOH/NaBH4-Lösung zugegeben wurden. Die Aufarbeitung erfolgte wie in [8] beschrieben.

Der Rückstand wurde nach (A) 2. hydrolysiert und im Aminosäureanalysator untersucht.

Die Testsubstanzen 2-Amino-2-desoxy-glucit und -mannit wurden nach bekannter Methode [14] ge-wonnen.

Partielle Hydrolyse des Glykopeptids 0,5 mg Glykopeptid wurden nach der Methode [15]

mit 5 ml 2 N HCl hydrolysiert, aufgearbeitet und im Aminosäureanalysator untersucht.

Wir danken dem Minister für Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit.

[1] P. M. Kaiser, L. Bonacker, H. Witzel und A. Holy, Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 366, 143 (1975).

[2] W . Ribbing, Diplomarbeit, Universität Münster 1974.

[3] T. Uchida, J. Biochem. 60, 115 (1966). [4] G. W . Rushizky und H. A. Sober, J. Biol. Chem.

238, 371 (1963). [5] F. Downs und W. Pigman, Methods Carbohydr.

Chem. 7, 244 (1976). [6] J. Albersheim, D. J. Nevins, P. D. English und

A. Karr, Carbohydr. Res. 5, 340 (1967). [7] J. J. Beintema, W. Gaastra, A. J. Scheffer und

G. W. WeUing, Eur. J. Biochem. 63, 441 (1976). [8] R. D. Marshall und A. Neubörger, Methods

Carbohydr. Chem. 7, 212 (1976). [9] J. Montreuil, Pure Appl. Chem. 42, 431 (1975).

[10] L. Dorland, J. Haverkamp, J. F. G. Vlietgenthart, B. Fournet, G. Strecker, G. Spik, J. Montreuil, K. Schmid und J. P. Binette, FEBS Lett. 89, 149 (1978).

[11] P. Edmann und A. Henschen, Mol. Biol. Biochem. Biophys. 8, 232 (1975).

[12] G. Pataki, Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptidchemie, S. 181, W. DeGruyter, Berlin 1966.

[13] J. Scocca und Y. C. Lee, J. Biol. Chem. 244, 4852 (1969).

[14] P. D. Bragg und L. Hough, J. Chem. Soc. 1957, 4347.

[15] P. V. Wagh, I. Bornstein und R. J. Winzler, J. Biol. Chem. 244, 658 (1969).