Maria MercedesMartín Pedrosa

IIIIIUUtiNIVERSID4D COMPLUTENSE

ISOFORMASDE ARGINASA DE EVIYRNL4PRUAJASTRJ(L.) Ach.:

CARACTERIZACION Y REGULACION PORFENOLES

Directora:Prof Dra. DM. Maria EstrellaLegazGonzález

Titular de FisiologíaVegetal de la Facultad

de CienciasBiológicas

UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID

Facultad de Ciencias Biológicas

Departamento de Biologia Vegetal1

1993

UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID

Facultad de CienciasBiológicas

Departamentode Biología Vegetal 1

(Cátedrade Fisiología Vegetal)

ISOFORMAS DE ARGITNASA DE EVERJVL4 PRUNASTRJ(L) ¡Ich.:

CARACTERIZACION Y REGULACION POR FENOLES

MaríaMercedesMartín Pedrosa

Madrid, 1993

Trabajo realizado en ¡a Cátedra

Vegetal de la Facultad de Ciencias

de Fisiología

Biológicas.,

Universidad Complutense, que presenta para optar al

grado de Doctor en Ciencias Biológicas

Madrid, Junio de 1993

a’ -:

Edo: Maria Mercedes Martin Pedrosa

Conforme, la directora de la Tesis

yEdo: Prof Dra, María Estrella Legaz González

La entrada del sendero era una suerte de arco que llevaba a un túnellóbrego formado por dos árboles inclinados, demasiado viejos yahogados por la hiedra y los líquenes colgantes para tener más queunas pocas hojas ennegrecidas.

(J.R.R. Tolkien, Jt’iHobhit)

A mis padres y a Clara, con todo miamor,A Alfonso, Pili y Angel, por vuestrocauiflo y por estar siempre a mi lado.

La realización de esta Tesis Doctoral recoge el trabajo, tesón e ilusiones de otras personas

a las que no deseo ni debo olvidar.

En primer lugar, quiero agradecer a la Dra. M~ Estrella Estrella Legaz González, Prof

Titular de Fisiología Vegetal, la confianza que depositó en mí y la oportunidad ofrecida para

realizar esta Tesis Doctoral. Gracias por tu ayuda, tus desvelos, cuidados y enseñanzas para que

el trabajo saliese siempre adelante. Ojalá que la semilla que en su día sembraste haya dado los

frutos que esperabas.

Quiero agradecer al Prof Dr. Carlos Vicente Córdoba, Catedrático de Fisiología Vegetal,

no sólo sus acertados e inestimables comentarios aportados durante la realización de esta.

Memoria Doctoral, sino también el esifierzo y las ilusiones puestas en este trabajo durante estos

años, Gracias por escuchar mis interminables charlas, por tu ayuda, tus consejos y, cómo no, por

tus silencios.

También quiero agradecer a los Profs. Dr. José Gavilanes y Dra. Rosalía Rodríguez, del

Departamento de Bioquímica, la ayuda prestada en la realización de los análisis de aminoácidos de

las isoformas de arginasa, así como en su interpretación.

A Carlos y Estrella, por vuestros ánimos en los momentos diticiles, vuestras alegrías y,

sobretodo, por vuestra amistad.

también quiero recordar a Bernabé Bodas, por ayudarme a sobrellevar el sufrimiento del

cromatografista en este mundo. Gracias por tus explicaciones y por acudir en mi auxilio cuando

‘Berni’ o “Barbie’ me hacían sufrir.

A mis compañeros, a los que hoy están conmigo y a los que se frieron. A José Luis, Silvia,

Maria del Carmen, Elena, Adolfo, Luisa, Maria, Lourdes, Teresa, Aurelio y Raquel; gracias por

compartir conmigo el día a día del trabajo, las ilusiones y los sinsabores de la investigacion.

A Angel; gracias por acceder a todos nuestros deseos en la elaboración de esta Memoria

Doctoral y, sobre todo, por tu enorme paciencia; estas ya son las páginas definitivas.

Deseo también expresar mi gratitud a todas aquellas personas que de un modo u otro han

contribuido a la realización de esta Tesis Doctoral.

vi

ABREViATURAS

Ala AianinaArg ArgininaAsx Acído aspárticoo asparaginaCys Cisteinadi. DiámetrointernoDa DaltonDO DensidadópticaFC ElectroforesiscapilarGlx Acido glutamico o glutaminaGly Glicocolafis HistidinaH~PLC High performance liquid chromatography (Cromatografia líquida de alta resolución)Ile IsoleucinaKm Constante de Michaelis-MentenK01(ap) Constante de Michaelis-Menten aparente~L] Concentración de ligando libre en equilibrioLev Leucina[L]i Concentración inicial del ligando en su compartimento

Moles de ligando unido a la proteína¡4 Moles totales de ligando en su compartimentoLys LisinaMr MasamolecularMet MetioninaPhe Fenilalaninapl Punto isoeléctricoPro Prolina

Moles totales de proteínar Moles de ligando unido por molécula de proteína[Sa] Concentración de sustrato

Concentración de sustrato que produce el 50% de la velocidad máxima dereaccion

SDS Dodecil sulfato sódicoSer Serma‘1hr TreoninaTris Tri-hidroximetil-aminometanoTrp TriptófanoTyr TirosinaUAFE Unidades de absorbancia a fondo de escalaLIV Luz ultravioletayo Velocidad inicial de reacciónVal Valina~max Velocidad máxima de reacciónvmax(ap) Velocidad máxima de reacción aparenteVt Volumen total de la subcámaraV1.[L] Moles totales de ligando libre en ambas subcámaras

vii

INDICE

1.- INTRODUCCION,. .

1.1< CONCEPTO DE ISOFORMA E ISOENZIMA,

1.2.- ANALíTICA DE LA DETECCIONDE ISOFORMAS, 4

1.3<- ELECTROFORESISCAPILAR Y CROMATOGRAFíA LíQUIDA DE ALTARESOLUCIONEN EXCLUSION MOLECULAR, 6

1.4- ESTUDIO DE LAS INTERACCIONESLIGANDO-PROTEíNA, II

[.5.- ARGINASAS Y SUS ISOFORMAS, ¡2

1.6< CATABOLISMO DE LA ARGININA EN LIQUEÑES, 161.6.1 .- Arginasa y ornitina descarboxilasa 181.6.2.- La vía descarboxílativa de la argínina ¡91.6.3< La síntesis y translocación de poliaminas, 211.6.4. - La función de la arginasa segregable 221.6.5< Isoformas como factores de desarrollo o de regulación metabólica,,,,.. 26

lí>. MATERIAL Y MF.TODOS 30

11.1.- MATERIAL VEGETAL, 32

11.2. - CONDICIONESDE JNCUBACION, 32

11.3.- VALORACION DE LA ACTIVIDAD ARGINASA, 32

11.4.- VALORACION DE PROTEíNAS, 33

II 5.- PURIFICACIONDE LAS ISOFORMASDE LAS ISOFORMASDE ARGINASA, 3311.5.1.- isoformas [y II de arginasa 33

[.5. 1.1. - Obtención del extracto libre de células 3311 5.1.2 - Precipitación con sulfato amónico 3411.5.1.3< Adsorción sobre gel de fosfato cálcico 3411.5.1.4< Electroenfoque en columna 35

11.5.2< Isoforma III de argínasa 3611.5.2.1.- Obtención del extracto libre de células 3611.5.2.2< Precipitación con sulfato amónico 36II 5 2.3 - Adsorción sobre gel de fosfato cálcico 3611.5.2.4< Electroenfoque en columna 36

11.5.3< isoforma IV de arginasa 37II 5 3 1 - Obtención del extracto libre de células 371153 2 - Precipitación con sulfato amónico 3711 5 3.3 - Adsorción sobre gel de fosfato cálcico 37¡1.5 3 4 - Electroenfoque en columna 37

vi~ii

11.6< DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTR.ICO, 383811.6.1. - Mediante electroenfoque en columna3811.6.2.- Mediante electroforesis capilar

II.? - ANALISIS DE AMINOACIDOS, 39

11.8< DETERMINACION DEL PESO MOLECULAR DE LAS DIFERENTESISOFORMAS DE ARGINASA MEDIANTE CROMATOGRAFíA LíQUIDA DEALTA RESOLUCION (HPLC), 40

11.9. - CARACTERIZACION ESPECTROSCOPICA., 434311.9.1.- Espectros de absorción ultravioleta4311.9.2< Espectros de emisión de fluorescencia,

11.10<VALORACION DE FENOLESLIQUENICOS MEDIANTE HPLC, ,..,,.,.,,. 4411.10 1 - Extracciónde fenoles con diferentes mezclas de disolventesorgánicos, 44

1110 1 1 - A partir de talos 441110 1,2<A partir del medio de incubación 44

451110 1 .3 - A partir del extracto libre de células

l1.10.2< Estabilidad de los fenoles en disoluciones acuosas 4611.10.3<Espectrode absorción ultravioleta de fenoles liquénico 48II. 10.4< Valoración de fenoles liquénicos mediante HPLC 48

[1.11<CINETICA DE SATURACION EN AUSENCIA DE EFECTOR.ES, . 49

11.12<CINETICA DE SATURACION EN PRESENCIADE EFECTORESATRANORINA, ACIDO EVERNICO Y ACIDO USNICO, .. 50

II. 13 - DETERMINACION DE LA CONSTANTEDE MICHAELIS-MENTEN (Km) YLA VELOCIDAD MAXIMA (vmax) DELAS DIFERENTESISOFORMASDE

51ARGINASA

11.14<ESTUDIOSDE LIGAMIENTO, 5111.14.1<Preparación de la membranade diálisis, 5211.14.2<Célulasde diálisis 5211.14.3< Determinacióndel tiempo de equilibrio, 5211.14.4< Cálculo del ligando unido 5411.14.5 - Representaciones gráficas de los datos de ligamiento, . 5611.14.6< Análisis estadísticos y proceso de datos 57

111< RESULTADOS, .. . 58

III. l - PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE LAS DIFERENTESISOFORMASDE ARGINASA 59III 1.1 . - Purificación y caracterización de las isoformas 1 y II de arginasa,..... 60

III. 1.1 1< Determinación del punto isoeléctrico 611l[ 1.1 2- Composición de aminoácidos ...... 62III 1,1 3 - Determinación del peso molecular 63

ix

111. 1.2< Purificación y caracterización de la isoforma III de arginasa 64Iii. ¡ .2.1< Determinación del punto isocléctrico 65

66111.1 2.2< Composición de aminoácidosIII 1.2.3< Determinación del peso molecular 67

111. 1.3.- Purificación y caracterización de la isoforma IV de arginasa, 67111,1.3,1< Determinación del punto isoeléctrico 68fIl. 1 3 2 - Composición de aminoácidos 69IR. 133 - Determinación del peso molecular,.... 70

111.2< CARACTERíSTICASESPECTROSCOPICASDE LAS ISOFORMAS1, 111 Y IVDE ARGINASA, 121111.2,1.-Espectros de absorción ultravioleta 122111 2 2 - Espectros de fluorescencia 122

111.3< ANALISIS Y CUANTIFICACION DE ATRANORINA, ACIDO EVERNICO YACIDO USNICO ¡34111.3.1< Espectros de absorción ultravioleta 135111.3.2< Estabilidad en disoluciones tamponadas 135111.3.3< Separación y cuantificación mediante HPLC 136111.3.4< Valoración del contenido de fenoles en muestras de córtex, talo y medio de

incubación 137111.3.5< Valoración del contenido de fenoles solubles en el extracto libre de cédulas, . 138

111.4< EFECTODE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDADDE REACCION DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA EN AUSENCIA YPRESENCIADE EFECTORES 157

111.4.1< Sobre la isoforma 1 de arginasa ¡58Iii 4.2 - Sobre Ja isofornia III de arginasa 160III 4 3 - Sobre la isoforma IV de arginasa 161

111.5< EVALUACION DE LA COOPERATIVIDAD. ECUACION DE HILL 180

111.6. - LIGAMIENTO DE ATRANORINA, ACIDO EVERNJCO Y ACIDO USNICO ALAS ISOFORMAS 1,111 Y IV DE ARGINASA, 182111.6 1 - Ligamiento a la isoforma 1 183

111.6,1.1< Atranorina como ligando 183111 6 ¡ 2 - Acido evérnico como ligando 184111.6.1.3< Acido úsnico como ligando, 184

111.6.2.- Ligamiento a la isoforma III, . 185111.6.2.1< Atranorina como ligando 185111.6.2.2< Acido evérnico como ligando 185111.6,2,3< Acido úsnico como ligando, 186

111.6.3< Ligamiento a la isoforma IV, . 186111.6.3. 1< Atranorina como ligando, 186111.6.3.2< Acido evémico como ligando 187[¡1.6.3.3<Acido ósnico como ligando 187

x

111.7< EFECTO DEL LIGAMIENTO DE ATRANORINA, ACIDO EVERNICO YACIDO USNICO PRODUCIDOENLAS ISOFORMASDE ARGINASA 226111.7.1<[soforma1, . . 227LII 72- Isoforma 111, .. 227II] 7 3 - Isofornia IV, .. 228

¡Y- DISCUSION, 232

V< CONCLUSIONES, 253

VV BIBLLOGRAF¡A,.,... 262

xi

INDICE DE FIGURAS Y TABLAS

Esquema del catabolismo de arginina en Evernia prunastrí 17Figura 1 . - Ejemplar de E.prunaslr¡ 31Figura 2.- Diagrama de flujo de extracción de fenoles 47Tabla 1< Cantidad de efector en las mezclas de reacción utilizadas en la valoración de la

actividad arginasa 50Tabla II. - Representaciones gráficas para la determinación de Km y Vmax de las

isolbrmas de arginasa .. . , . 5153

Figura 3,- Esquema del equilibrio de diálisisTabla II]. - Representaciones gráficas de los datos del ligamiento 57Tabla 1V- Purificación de las isoformas 1 y II de arginasa 72Figura 4.- Purificación de las isoforroas í y 11 de arginasa mediante HPLC de exclusión

molecularFigura 5< Electroenfoque en columna de la isoforma ¡ de arginasa 75Figura 6.- Electroenfoque en columna de la isoforma II de arginasa 77Figura 7< Esquemas de capilares de sílice fundida 79Figura 8 - A.natomia interna de los capilares de sílice Ñndida 81Figura 9.- Electroforegramas de la isoforma 1 de arginasa 83Figura 10.- Rectas de calibrado en electroforesis capilar para las isoformas 1 y II

de arginasa 85Tabla V- Composición de aminoácidos de las isoformas 1 y II de arginasa 87Figura II . - Cromatograma de proteínas patrón separadas en I-IPLC de exclusión

molecular utilizando una columna TSK G5000 PWXL 88Figura 12< Cromatograma de proteínas patrón separadas en HPLC de exclusión

molecular utilizando dos columnas Zorbax-diol en serie, GF450-GF250 ...,.......... 90Tabla VI. - Eficiencia de las columnas TSK GSOOO PWXL y Zorbax-diol GF4SO-GF250,

analizada como número de platos teóricos 92.Figura 13< Cromatogramas de la isoforma Ide arginasa desnaturalizada, obtenidos

mediante I-IPLC de exclusión molecular utilizando dos columnas Zorbax-diolen serie, GF4SO-GF250 93

Figura 14<- Rectas de calibrado en HPLC de exclusión molecular para las isoformaslylldearginasa 95

Tabla VII.- Purificación de la isoforma III de argmasa 97Figura Ii- Purificación de la isoforma III de arginasa mediante I-IPLC de exclusión

molecular 98Figura 16< Electroenfoque en columna de la isoforma III de arginasa 100Figura ¡7< Electroforegramas de la isofonna III de arginasa 102Figura 18< Recta de calibrado en electroforesis capilar para la isoforma III de arginasa 104Tabla VIII.- Composición de aminoácidos de la isofornia III de arginasa 106Figura 19.- Rectas de calibrado en HIPLC de exclusión molecular para la isoforma III

de arginasa 107Tabla IX.- Purificación de la isoforma IV de arginasa 1 09Figura 20.- Purificación de la isoforma IV de arginasa mediante I-IIPLC de exclusión

molecular . 110Figura 21 . - Electroenfoque en columna de la isoforma IV de arginasa 112Figura 22.- Electroforegramas de la isoforma IV de arginasa 114Figura 23< Rectas de calibrado en electroforesis capilar para la isoforma IV de arginasa. . .116Tabla X< Composición de aminoácidos de la isoforma IV de arginasa ¡18

xii

Figura 24< Rectas de calibrado en HIPLC de exclusión molecular para la isoforma IVde arginasa 119

Figura 25.- Espectros de absorción ultravioleta de las isoformas 1, III y IV de arginasa. . , 124Figura 26< Espectro de emisión de fluorescencia de las isoformas 1, III y IV

de arginasa, excitando a 275 nm 126Figura 27.- Espectro de emisión de fluorescencia de las isoformas 1, III y IV de arginasa,

excitando a 295 nm 128Figura 28< Espectro de emisión de fluorescencia de las isoformas 1, III y IV de arginasa,

130excitando a 257 nm

Figura 29< Espectros de emisión y excitación simultánea de fluorescencia de lasisoformas 1, 111 y IV de arginasa 132

Figura 30< Espectros de absorción ultravioleta de atranorina, ácido evérnicoy ácido usnico 141

Figura 31.- Estabilidad de atranorina en disolución acuosa 143Figura 32< Estabilidad de ácido evérnico en disolución acuosa 145Figura 33.- Estabilidad de ácido úsnico en disolución acuosa 147Figura 34- Cromatogramas representativos de los fenoles de E. prunasirí ... 149Tabla XI. - Ecuaciones de las rectas de calibrado empleadas en la cuantificación

de fenoles 151Figura 35.- Variación de la cantidad de fenoles en función del tiempo de incubación

de los talos de E. prunastrí en L-arginina 40 mM 152Figura 36< Variación de la cantidad de fenoles en función del tiempo de incubación

de los talos de E. prunastr¡ en cicloheximida 40 gM .. 154Tabla XII. - Cantidad de fenoles endógenos en talos de E. prunastrí 156Figura 37.- Efecto de la concentración de L-arginina sobre la velocidad de reacción

de la isoforma 1 de arginasa en presencia y/o ausencia de efectores 163Figura 38< Representación de Eisenthal-Cornish-Bowden de la isoforma 1 de arginasa 165Figura 39.- Representación de Hanes de la isoforma 1 de arginasa en presencia

y/o ausencia de efectores 167Figura 40.- Efecto de la concentración de L-arginina sobre la velocidad de reacción

de la isoforma III de arginasa en presencia y/o ausencia de efectores 169Figura 4 1.- Representación de Hill de la isoforma III de arginasa en presencia

y/o ausencia de efectores 171Figura 42.- Efecto de la concentración de L-arginina sobre la velocidad de reacción

de la isoforma IV de arginasa en presencia y/o ausencia de efectores 173Figura 43.- Representación de Eisenthal-Cornish-Bowden de la isoforma IV de arginasa 1 75Figura 44< Representación de Hanes de la isoforma IV de arginasa en presencia

y/o ausencia de efectores 177Tabla XIII.- Constantes cinéticas de las isoformas 1, III y IV de arginasa 179Tabla XIV. - Ecuaciones de las rectas obtenidas mediante la representación

de Hill para la evaluación de la cooperatividad 181Tabla XV.- Tiempo para el equilibrio del ligando libre ¡89Figura 45< Ligamiento de atranorina a la isoforma 1 de arginasa. En (A),

representación directa; en (B), representación de dobles-inversas 190Figura 46< Ligamiento de atranorina a la isofonna 1 de arginasa. En (A),

representación de Scatchard; en (B), representación semi-logaritmica 192Figura 47< Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma ¡ de arginasa. En (A),

representación directa; en (B>, representación de dobles-inversas 194

xiii.

Figura 48.-

Figura 49<

Figura 50<

Figura 51 -

Figura 52<

Figura 53<

Figura 54 -

Figura SS-

Figura 56<

Figura 57<

Figura 58<

Figura 59<

Figura 60.-

Figura 61<

Figura 62<

Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma 1 de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (B), representación semi-logaritmica 196Ligamiento de ácido Osnico a la isoforma 1 de arginasa. En (A),representación directa; en (B), representación de dobles-inversas 198Ligamiento de ácido Osnico a la isoforma 1 de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (E), representación semi-logaritmica 200Ligamientode atranorina a [aisoforma III de arginasa. En (A),representación directa; en (B), representación de dobles-inversas 202Ligamiento de atranorina a la isoforma III de arginasa. En (A),representacion de Scatchard; en (B), representación semi-logaritmica 204Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma [U de arginasa. En (A),representación directa; en (B), representación de dobles-inversas 206Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma 111 de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (E), representación semi-logarítmica 208Ligamiento de ácido úsnico a la isoforma III de arginasa. En (A),representación directa; en (E>, representación de dobles-inversas 210Ligamiento de ácido úsnico a la isoforma III de arginasa. En <A).representación dc Scatchard; en (E), representación semi-logaritmica 212Ligamiento de atranorina a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación directa; en (E), representación de dobles-inversas 214Ligamiento de atranorina a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en <E), representación semi-logaritmíca 2 ¡6OLigamiento de ácido evérnico a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación directa; en (E>, representación de dobles-inversas 2 1 8Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (E), representación semi-logarítmica 220Ligamiento de ácido Osnico a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación directa; en (E), representación de dobles-inversas. .. 222Ligamiento de ácido úsnico a la isoforma IV de arginasa. En (A),representación de Scatchard; en (E), representación semi-logaritmica . . , 224

Tabla XVI< Formación dc distintos agregados de arginasa como consecuenciadel ligamiento 229

Figura 63< Cromatogramas de los distintos agregados de arginasa tras el ligamientodel efector. . , 230

Tabla XVI[< Conclusiones 257

U INTRODUCCION

2

LI.- CONCEPTO DE ISOFORMA E ISOENZIMA.

Las isoenzimas fueron definidas hace más de 30 años como sucesos interesantes,pero

raros, en los procesos de purificación de proteínas. El término isoenzima fue acuñado por

Markert y Ivioller (1959) como una definición operacional que agrupaba múltiples formas

enzimáticas con la misma especificidad de sustrato. Desde entonces, cientos de enzimas han sido

resueltas en formas moleculares varias, provocando controversias en el campo de la Genética y la

Evolución, Por otro lado, el estudio de las isoenzimas ha permitido ampliar el conocimiento de

mecanismos sofisticados de regulación metabólica en bacterias, plantas y animales.

Se definen como isoenzimas diversas formas de una proteína que catalizan la misma

reacción, pero que difieren ligeramente en su composición de aminoácidos o en su estructura. Por

ello, pueden separarse mediante electroforesis o cromatografla y pueden distinguirse al estudiar la

variación en la secuencia de sus aminoácidos o las diferencias en el segmento de los DNAs que las

codifican (Scandalios, 1974). Secundariamente, pueden encontrarse isoenzimas en el mismo o

diferente compartimento celular, en diferentes células o tejidos de un organismo, o bien pueden

ser producidas durante estados diferentes del desarrollo de un único individuo (Weeden, 1983).

Dos formas de una única enzima pueden ser originadas por mecanismos genéticos

(múltiples bel o múltiples genes) o por mecanismos post-traduccionales, siendo este último

procedimiento el más sencillo. Algunas de estas modificaciones post-traduccionales incluyen

glicosilaciones, proteolisis limitada, agregaciones, modificaciones covalentes de la cadena

polipeptidica (Cerft 1978; Gockel y Lebherz, 1981; Motojima y Sakaguchi, 1982; Sticher y

Jones, 1992>, etc. En el caso concreto de enzimas de origen vegeta], estas modificaciones

representan una importante fUente de variabilidad isoenzimática. Así, las isoenzimas de

aminopeptidasas, endopeptidasas y peroxidasas han sido estudiadas en profundidad muy

especialmente (Beevers, 1982).

El término isoenzima es, a menudo, utilizado libremente en un sentido operativo y se

tiende a aplicar a cualquier tipo de multiplicidad enzimática observada. Normalmente, desde la

primera sospecha de existencia de una isoenzima, es necesario realizar numerosas pruebas

3

experimentales para establecer claramente su naturaleza y origen. En este sentido, la

nomenclatura establecida por la IUPAC-IUB (1971) recomienda el uso restringido del término

isoenzima a productos de multiplicidad debidos a causas genéticas. Esto, por tanto, excluye todas

las múltiples formas originadas por modificaciones post-traduccionales, aunque muchas enzimas,

con un importante papel fisiológico y regulador, sufran estas últimas modificaciones (Newton y

Schwartz, 1980). De acuerdo con estas recomendaciones, las múltiples formas detectadas para

una enzima no pueden ser denominadas isoenzimas hasta haber demostrado que su origen se debe

a diversidad genética. Griff¡ths y Black (1987), tras estudiar las diferentes formas de fosfatasa

alcalina en suero humano, proponen el término isoforma para todas aquellas formas de una misma

enzima cuyo origen no está totalmente establecido o es claramente post-traduccional.

Antes del descubrimiento de las isoformas, las diferencias metabólicas entre diferentes

tejidos eran explicadas en términos de variación de la cantidad relativa de cada enzima, aunque

también se consideraban importantes, en este contexto, sucesos de permeabilidad,

compartimentación o concentración y modulación por diferentes metabolitos, La amplia

distribución de isoformas y el hecho de que aquellas difieran, no sólo en su distribución tisular.,

sino también en sus propiedades cinéticas, permitió a los enzimólogos establecer su papel

metabólico dependiendo más de la “calidad’ que de la ‘cantidad’ de la proteína. Uno de los

primeros y más claros ejemplos del papel de las isoformas fue su acción en la regulación

metabólica de una célula o tejido. Una única ruta metabólica debe, por definición, consistir en la

misma secuencia de reacciones enzimáticas. Sus características reguladoras pueden variar

fUertemente dependiendo de qué isoforma en particular actúe en cada paso. En una ruta bien

conocida, como es la glucolisis, nueve de las diez enzimas implicadas en la conversión de glucosa

en piruvato presentan isoformas o isoenzimas. Quizá uno de los hechos más importantes a este

respecto sea la existencia de diferentes isoenzimas (o isoformas) en un único tejido, lo cual

proporciona una complicación temporal adicional al hecho de la diferenciación (Rider y Taylor,

1980).

4

U.- ANALITICA DE LA DETECCION DE ISOFORMÁS

Las isoformas pueden diferir unas de otras en algunas de sus propiedades fisicas y

cinéticas, así como en su distribución tisular. Aunque algunas de sus propiedades puedan parecer

más relevantes que otras, cualquier diferencia o similitud, en términos metabólicos, resultará

importante para determinar su función fisiológica.

En el análisis de isoformas deben utilizarse métodos que no compliquen su separación

fisica. Así, los métodos basados en las características inmunológicas de la proteína pueden

aplicarse a mezclas o extractos parcialmente purificados. Goffner el al. (1992> mostraron las

relaciones inmunológicas entre dos isoformas de cinamilalcohol deshidrogenasa en un extracto

crudo obtenido de xilema de Eucal¡ptusgunñ o bien entre dichas isoformas parcialmente

purificadas. Sin embargo, la mayoría de los análisis requieren la separación de cada una de las

isoformas enzimáticamente activas. La purificación y caracterización de isoformas no difiere, en

principio, de los protocolos comunes de purificación de cualquier otra proteina. La única

precaución especifica consistiría en evitar concienzudamente la inactivación de alguna de las

isoformas. ya que dicha inactivación, de suceder, llevaria a la suposición errónea de su ausencia

(Botha y Turpin. 1990). Inicialmente, pueden separarse isoformas mediante técnicas que

discriminen entre sus propiedades fisicas, como puede ser la cromatografia por interacción

hidrofóbica (Gofiher ci al., 1992) o de intercambio jónico (Botha y Turpin, 1990). Si las

isoformas tienen una diferente localización subeelular, suele ser suficiente con un protocolo de

separación de cada uno de los orgánulos (Li etal., 1991).

Dado que la diferencia real entre isoformas se establece a nivel de su actividad específica

(vn~< y Km), pH óptimo de reacción, punto isoeléctrico, peso molecular y composición de

aminoácidos, una primera aproximación a la caracterización de diferentes formas enzimáticas debe

contemplar estos parámeo-os. Por ejemplo, una de las isoformas de fructosa- 1 ,6-bifosfatasa <le

Selenastrumm¡nutum essoluble en ácido y dependiente de un medio reductor para su actividad y

estabilidad a altas temperaturas (600C). Por ello, concentraciones suficientes de ditiotreitol (DTT)

deben estar en contacto con la enzima en todos los pasosde su purificación. Su pH óptimo es

5

cercano a la neutralidad y muestra ser cuatro veces más aun por su sustrato que la isoforma

insoluble en ácido, la cual posee características opuestas a la anterior (Botha y Turpin, 1990;

Turpin el a)?, 1990). También se han descrito diferencias a nivel de pH óptimo, constantes

cinéticas y localización celular (mitocondrial y citosólica) para isoformas de ATP sulfurilasa de

Englenagracilis, siendo la forma mitocondrial cuatro veces más aun por su sustrato que la

citosólica (Li el al., 1 99 1). Los autores relacionan estas diferencias con el metabolismo del alga,

pues la reducción del sulfato es mucho más activa en las mitocondrias. Sin embargo, hay

isoformas que no presentan diferencias en sus parámetros cinéticos, como es el caso de dos

descritas para la almidón sintasa, aisladas de embriones de guisante (Denyer y Smith, 1992).

Ambas poseen el mismo valor de pH óptimo, el mismo valor de Km para A.DPglucosa y

amilopectina, ambas son termolábiles y reconocidas por los mismos anticuerpos, pero difieren

claramente en su localización celular (soluble o ligada a gránulos) y en su peso molecular.

Junto con la caracterización cinética y la localización subcelular, el estudio electroforético

de isoformas es otro punto clave para su correcta determinación. La electroforesis es utilizada

para poner de manifiesto la existencia de varias formas enzimáticas, para valorar el pl de cada una

de esas formas y su peso molecular. El soporte utilizado es generalmente variado: almidón,

agarosa, acetato de celulosa o poliacrilamida son los más utilizados. Una práctica habitual en

estos estudios es el empleo de diferentes técnicas electroforéticas en el mismo análisis. Accorsi el

al. (1987) realizaron un estudio de las isoformas de fosfoglucomutasa de eritrocitos mediante

electroforesis en geles de almidón y electroenfoque en columna o en geles de poliacrilamida. En

todos los casos fueron identificadas cuatro isoformas de la enzima. Ya que la movilidad

electroforética en los geles de almidón es utilizada como un reflejo de las diferencias de pl de las

diferentes isoformas, las descritas para fosfoglucomutasa eran de carácter ácido, si bien las

pequeñas diferencias detectadas en los valores de pl (±0.3> fUeron atribuidas a diferencias entre

las técnicas utilizadas, Sticher y iones (1992) también emplearon el isoelectroenfoque en geles de

poliacrilamida para determinar el valor de pl de las diferentes isoformas de a-amilasa de

embriones de guisante, revelando el carácter ácido de todas ellas. Trudel el al (1989)

desarrollaron un sistema de electroenfoque bidiniensional en poliacrilamida para la detección de

6

isoformas ácidas y básicas de quitinasa de tabaco, de las cuales, Majeau el al. (1990) lograron

determinar 13 diferentes a partir de semillas de pepino, usando la misma técnica.

Otro punto a considerar en la determinación de isoformas de enzimas es la diferencia de

peso molecular que aquellas presentan entre sí. Habitualmente se emplea la electroforesis en geles

de poliacrilamida (PACE), con o sin agentes desnaturalizantes, como por ejemplo, dodecilsulfato

sódico (SI)S), o bien filtración a través de columnas de Sephadex para estimar el peso molecular

de las proteínas. Normalmente, el empleo de columnas de filtración produce una sobreestimación

del peso molecular de una isoforma panicular frente a SDS-PAGE. Las diferencias de peso

molecular entre formas monoméricas cubren un amplio rango, desde 3 kDa, aproximadamente,

para la forma CADI de la cinamilalcohol deshidrogenasa (O’Malley y Sederoff, 1990) a más de 10

kDa para las isoformas de ATP sulfitrilasa de E. racilis (Li el al., 1991), Las diferencias entre

isoformas se establecen usualmente por comparación entre los pesos moleculares obtenidos en

SDS-PAGE. Así, las dos isoformas de almidón sintasa analizadas por Denyer y Smith (1992)

difieren en 17 ld)a. Menores diferencias se obtienen para las isoformas de arginasa de higado de

ratón, 3 kDa aproximadamente (Spolarics y Bond, 1988).

La composición de aminoácidos proporciona una primera visión de la similitud entre

isoformas, si bien las homologías y las diferencias deben establecerse sobre la base de la secuencia

de aminoácidos. Algunos autores comparan los patrones polipeptidicos obtenidos en PACE tras

una proteolisis parcial (Borkovich y Weiss, 1987a; Gofiher el al., 1991) o un fraccionamiento

quimico (Lischwe y Ochs, 1982,) de las isoformas para establecer homologias.

L3- ELECTROFORESIS CAPILAR Y CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA

RESOLUCION EN EXCLUSION MOLECULAR

La estimación de los valores de pi y peso molecular de isoformas son dos criterios básicos

para su caracterización. El empleo de la electroforesis en geles de poliacrilamida para determinar

ambos parámetros require un largo periodo de tiempo, tanto para la preparación de los geles

como para el desarrollo de la separación y la posterior tinción de la muestra. El desarrollo de

.7

técnicas como la cromatografla líquida de alta resolución (IIPLC) para la separación de proteinas

y péptidos y la electroforesis capilar ofrecen la posibilidad de un análisis rápido, eficaz y altamente

sensible de proteinas frente a métodos tradicionales.

En la última década, la cromatografia líquida de alta resolución ha sido ampliamente usada

en el análisis y la purificación de las proteínas. Básicamente se han descrito tres diferentes

estrategias para lograr una buena separación. La primera se centra en mecanismos de intercambio

jónico: la proteina se comporta como un lón y su retención, resolución y detección se produce

gracias a su interacción, como tal ión, con la fase estacionaria (Vuan y Pietrzyk, 1990). La

segunda aproximación se realiza mediante columnas de fase reversa. El interés principal de este

procedimiento reside en la hidrofobicidad de la fase estacionaria, su estabilidad frente a posibles

hidrólisis proteicas, así como la estructura del poro de la matriz de sílice. Sin embargo, no hay

relación alguna entre la retención de la muestra en la columna y su peso molecular, por lo que la

separación se lleva a cabo sobre la base de la hidrofobicidad de la proteína (Davankov el al.,

1 990; Pedroso el c’l., 1 987). En la tercera estrategia, la cromatografia de exclusión molecular, la

más usada en el análisis y caracterización de proteínas, la separación se lleva a cabo de acuerdo

con el peso molecular de la muestra.

La cromatografia de permeación o filtración se estableció inicialmente con el uso de geles

formados por entrecruzamiento y unión de dextranos con epiclorhidrina (Sephadex). Sin

embargo, el proceso de preparación de estos geles no rinde matrices totalmente homogéneas, lo

que limita en gran medida la resolución de la columna (Warzecha e/al., 1990). Por el contrario, la

cromatografia de exclusión molecular emplea fases estacionarias generalmente rígidas, basadas en

resinas polirnéricas como el polimetracrilato, o bien en micropartículas de sílice que son estables

en fases acuosas para un intervalo de pH de 4 a 9. Mediante el uso de estas fases se logra una alta

resolución, eficacia y reproducibilidad frente a los sistemas tradicionales de filtración (Fallon cl

al., 1 987), además de permitir la recuperación de más del 90% de la muestra empleada.

La separación de muestras en 1-IPLC de exclusión molecular (SE-HPLC) requiere un

soporte inerte frente a interacciones iónicas, hidrofóbicas o de adsorción. Esto implica una

elección adecuada de la columna así como de la fase móvil para obtener la máxima eficacia

8

(Fallon el al., 1987; Wu el al,, 1989). La columna debe contener un relleno altamente hidrofilico,

como es el caso de las columnas TSK-PWXL o Zorbax-diol. La presencia de grupos residuales

carboxilo en la superficie de empaquetamiento para la primera y los grupos dialcohol para la

segunda dan como consecuencia una correcta relación entre los tiempos de retención obtenidos

para cada proteina y el peso molecular de la misma (Nagy, 1990). La fase móvil puede afectar a la

resolución a través de la interacción directa con la fase estacionaria y con el soluto. La

manipulación del ph y de la fUerza iónica del tampón utilizado como eluente evitará otras

interacciones indeseables (Ujházy e/al., 1989). Por otro lado, se recomienda el uso de columnas

cortas con un diámetro de partícula pequeño, pues éstas permiten operar con bajos valores de

flujo (0,3-1,0 mLmin-1), reduciendo el término de transferencia de masas, de gran importancia

para optimizar las separaciones de proteínas (Failon e/al., 1987; Yamamoto e/al., 1990).

I.~a posibilidad de incluir agentes fuertemente desnaturalizantes, como SDS al 0. 1~o o

cloruro de guanidina 6M en las fases móviles utilizadas en SE-HPLC, supone otra ventaja de esta

técnica. La adición de agentes desnaturalizantes reduce cualquier interacción química del soluto

con la fase estacionaria, elimina las interacciones hidrofóbicas y la proteina se comporta de forma

ideal. En el caso de proteínas formadas por varias subunidades, la combinación de fases

conteniendo SDS con la desnaturalización previa de la proteína nos permitirá calcular el peso

molecular del monómero. La comparación de este método con SDS-PAGE permite concluir,

razonablemente, que la cromatografla es más adecuada, sobre todo si se conocen previamente un

cierto número de propiedades de la proteína sujeto de la separación (Fallon el al., 1987).

La electroforesis es una poderosa herramienta para la separación de especies iónicas,

especialmente biopolímeros como proteínas y ácidos nucleicos. Durante los últimos cuarenta

años, electroforesis en papel, almidón, acetato de celulosa, agarosa o poliacrilamida han sido

empleadas para separar péptidos, proteínas y polinucleótidos. A pesar de su versatilidad y

utilidad, la realidad es que se trata de un método laborioso y relativamente lento.

Desde su descripción, en los años 30, la técnica electroforética ha experimentado

importantes avances. La electroforesis capilar zonal flie desarrollada por Mikkers el al. (1979)

para la separación de pequeños aniones como, por ejemplo, el anión cloruro, por detección

9

conductimétrica en un capilar de Teflon, de 200 ~imde diámetro interno. Jorgenson y Lukacs

(1981) realizaron detallados estudios en electroforesis capilar utilizando columnas de vidrio y

sílice fundida y acoplando sistemas de detección óptica. Algunos de sus primeros estudios con

mezclas de aminoácidos dansilados muestran eficacias de — 250.000 platos teóricos, empleando

voltajes de 300 Vcm-1 de capilar.

El diseño experimental para llevar a cabo una electroforesis capilar es relativamente

sencillo: un capilar cuyos extremos están sumergidos en un reservorio lleno de un electrolito y un

electrodo de alto voltaje. Cerca de uno de los extremos del capilar se construye una ventana

frente a la que se sitúa el detector, habitualmente espectrofotométrico en la zona ultravioleta

(Compton y Browlee, 1988; Lux el al, 1990). El capilar, lógicamente, representa la columna de

separación. Se trata, en general, de un capilar de sílice fundida cubierto de poliimida, lo que le

proporciona gran flexibilidad. La sílice fUndida posee una alta transparencia en el UV-visible y es,

por tanto, un material deseable para estos sistemas de detección. El desarrollo reciente de

columnas capilares ha representado un importante avance técnico en la electroforesis capilar zonal

(Ewin e/al, 1989; Gordon el al, 1988; Grossy Yeung, 1990; Grossman elal, 1989). La técnica

con columnas capilares es deseable por su automatización con datos de análisis a tiempo real. Las

cantidades de muestra usadas son del rango de nanolitros y el volumen de tampón usado suele

estar en el rango de los mililitros. El tampón, usado como electrolito, es estable dentro del capilar

frente a movimientos de convección o difUsión.

En general, las sustancias a separar, al encontrarse a un determinado pH, adquieren una

carga neta (positiva o negativa) en fUnción de la cual se desplazan a lo largo del capilar cuando se

aplica en éste una diferencia de potencial entre sus extremos. La carga de un pequeño péptído

puede ser estimada a partir de los valores de pKa de los aminoácidos individualmente

considerados y en función de la relación carga/masa se puede predecir su movilidad

electroforética en un electrolito determinado, Por el contrario, la movilidad electroforética en el

análisis de proteínas viene modificada por su hidrofobicidad, secuencia primaria o conformación

(Rickard el al., 1991). Además, la carga de una proteina puede variar en función del pl-> del

electrolito. Deyl el al. (1989)han estudiado la movilidad electroforética de proteinas de diferente

10

peso molecular en capilares de sílice sin tratar, con un rango de pH para el electrolito

comprendido entre 6,9 y 10.5, llegando a demostrar la existenca de una relación lineal entre

movilidad electroforética y pl.

Uno de los principales problemas en electroforesis capilar de proteinas usando capilares de

sílice sin tratar, es la adsorción de Ja proteína a través de sus cargas positivas a los grupos silanol

de la pared del capilar. Este mecanismo produce un ensachamiento de la banda, lo que se traduce

en una eficacia pobre. Lauer y MeManigilí (1986) propusieron realizar la separación de una

proteina con altos valores de pH del electrolito, de manera que proteína y paredes del capilar

presentasen cargas negativas. A valores de pH superiores a 8,0 se genera un fUerte flujo

electroosmótico (movimiento global del electrolito en el interior del capilar) que proporciona una

velocidad constante de migración. Esto facilita el avance de proteinas con fUerte carga negativa,

acortando así el tiempo de análisis (Chen el al., 1991). Chen el al. (1992) emplearon como

electrolito tampones de alta fUerza iónica (por ejemplo, tampón fosfato sódico 0,12 M) para

mejorar asi la eficacia en la separación de proteinas. En estas condiciones, la sal compite con la

proteína por los sitios de adsorción sobre la pared del capilar. La única limitación es la generación

de un efecto Joule intolerable para capilares con un diámetro interno superior a 75 gm. Otra

alternativa es eliminar las proteínas adsorbidas mediante el lavado del capilar con disoluciones

ácidas (ácido fosfórico) o básicas (hidróxido sódico) entre cada análisis, con objeto de restaurar

las condiciones iniciales del capilar (Zhu el al., 1990). El principal inconveniente de esta técnica es

el acortamiento de la vida media del capilar.

Las proteínas también pueden ser separadas en electroforesis capilar sobre la base de su

peso molecular, para lo cual se utilizan capilares rellenos de geles, como poliacrilamida (Hjerten e~

al., 1987; Widhalm el al., 1991). Estos geles, además de eliminar los efectos de carga en

superficie, introducen un nuevo factor, como es el tamaño del poro creado por el gel. Igualmente,

el empleo de geles de poliacrilamida con SDS como relleno de los capilares permite utilizar la

electroforesis capilar para el estudio de las proteínas en condiciones desnaturalizantes, de manera

similar a la electroforesis convencional con SDS (Cohen y Karger, 1987; Cohen el al., 1987;

Tsuji, 1991).

11

1.4.- ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES LIGANDO-PROTEINA

Una caracteristica común de la proteinas es que, de forma invariable, interaccionan

fisicamente con otras nrnléculas. Una proteina nunca actúa sola, sino que siempre actúa en un

entorno molecular heterogéneo. Por tanto, un punto de interés es caracterizar la interacción de la

proteína con esas otras moléculas.

Además de la interacción sustrato-enzima. que determina la función de esta última, pueden

encontrarse interacciones entre la enzima y moléculas reguladoras o efectoras que, de manera

habitual, son estructuralmente diferentes del sustrato o de los productos de reacción. Estos

efectores pueden activar o inhibir la enzima de diferentes maneras, competitiva., acompetitiva, no

competitiva o mixta, en función del sitio de unión del efector a la proteína (¡‘rice y Stevens,

1986).

Diferentes métodos permiten estudiar la unión de una molécula efectora a una enzima

Uno de estos métodos se basa en la medición de los cambios producidos en el espectro

ultravioleta de la enzima. Por ejemplo, la unión de Leu a a-isopropilmalato sintasa produce

cambios conformacionales detectables mediante variaciones en su espectro ultravioleta. Estas

variaciones se identifican como un cambio en la exposición de ciertos residuos aminoacídicos (Tyr

y Trp, principalmente) en la enzima (Teng-Leary y Kohlhaw, 1973). El ligamiento de sales biliares

a seroalbúmina de vaca se ha estudiado mediante fluorescencia y dicroismo circular. La unión de

las sales produce un descenso de la fluorescencia natural de la enzima a 350 nm, lo cual implica

que el ligamiento se produce en un entorno próximo a los residuos Trp de la proteína. Así mismo,

se han observado cambios en el espectro de dicroismo circular (Pico y Houssier, 1989). Esta

última técnica, junto con los espectros ultravioleta de la proteína, también se ha utilizado para

estudiar el ligamiento de varios efectores a la enzima indolamina-2,3-dioxigenasa (Sono, 1989),

Todas estas técnicas son indicativas de que existe unión efector-enzima, pero por sí

mismas no permiten cuantificar el número de moléculas efectoras que se unen a la proteína ni la

cinética de su unión. Este tipo de estudios se realiza habitualmente mediante equilibrio de diálisis.

Para ello, se utiliza un sistema bicameral, separadas ambas cámaras mediante una membrana

12

semipermeable. Un volumen conocido de una disolución de proteína, de concentración también

conocida, se sitúa a un lado de la membrana y al otro, un volumen conocido de una disolución de

ligando, de concentración también conocida. La cantidad de efector unido a la proteina se

determina, una vez alcanzadas las condiciones de equilibrio de diálisis, mediante la valoración del

efector libre (Klotz, 1989). Los datos obtenidos a partir de estos estudios se representan,

habitualmente, mediante gráficas de Scatchard (Scatchard, 1949). Cuando dicha representación

gráfica proporciona una linea recta, los sitios de unión por molécula de proteína se calculan como

el punto de intersección de dicha recta con el eje de abscisas. Sin embargo, numerosos casos

experimentales muestra un claro alejamiento de la linearidad, produciendo curvas cóncavo••

convexas, como ocurre para la unión del laurato a seroalbúmina de vaca (Pedersen el al,, 1986> o

bien curvas parabólicas, como en la unión de Leu a a-isopropilmalato sintasa (Teng-Leary y

Kohlhaw, 1973). En el primer caso, la forma cóncava se interpreta como existencia de

cooperatividad negativa en la unión mientras que en el segundo, la curvatura obtenida indicaria

cooperatividad positiva en el ligamiento. Los dos tipos de cooperatividad pueden ser mimetizados

por diferentes artefactos (Mendel el al, 1985; Ishida el al, 1988; Price y Stevens, 1986), por lo

que es habitual recurrir a varias, no solo a una, representaciones gráficas de los datos de

ligamiento que pongan de manifiesto estos posibles artefactos (Klotz, 1989>. De esta forma se

determinan tanto la existencia de cooperatividad real como el número de sitios de unión en la

proteína para la molécula efectora.

1.5.- ARGINASAS Y SUS ISOFORMAS

La arginasa, L-arginina amidinohidrolasa (EC. 3.5,3.1), está ampliamente distribuida en la

naturaleza. Fía sido particularmente estudiada en tejidos animales, en relación con la excreción de

nitrógeno y el ciclo de la urea. También se ha purificado y caracterizado en plantas, en sus

semillas y en muchos microorganismos.

En la formación de semillas de leguminosas, un suceso de capital importancia es la

acumulación de proteínas de almacenamiento, ricas en arginina, que serán la principal fuente <le

13

nitrógeno para el crecimiento del eje embrionario durante Ja germinación (Bewley y Black, 1983).

Esto implica una clara dependencia entre germinación y las enzimas del metabolismo de la

arginina. Por ejemplo, la actividad arginasa incrementa (Matsubara y Suzuki, 1984) o permanece

constante (De Ruiter y Kollófell, 1983) durante la germinación de semillas de soja y guisante,

respectivamente. Ya que los cotiledones y el eje embrionario son metabólicamente diferentes

durante el proceso, la enzima puede tener papeles metabólicos también diferentes. Pawashe y

Srivastava (¡987) describieron una actividad arginasa en semillas de garbanzo (ti¿cer ar¡el¡num)

que incrementa rápidamente en los cotiledones como respuesta a la movilización de las proteínas

ricas en arginina, mientras que dicha actividad desciende rápidamente en el eje embrionario

durante los primeros estadios del desarrollo.

Kang y Cho (1990) purificaron y caracterizaron esta enzima a partir de cotiledones de soja

((3/peine mcix). Su peso molecular era de 220 kDa, estimado por filtración a través de Sephadex

G-200. La electroforesis desnaturalizante de la proteína purificada dio una única banda de 55

kDa, lo que indicaba que la proteína estaba presente como un tetrámero. Su Km fue estimada en

83 mM, siendo activada por putrescina. La enzima resultó ser dependiente de Mn21 para

desarrollar su actividad, lo cual es una característica que se repite para todas las arginasas,

independientemente de la fuente, como podrían ser higado de rata (Kanyo el al., 1992) o las

arginasas codificadas por el plásmido TiCS8 de Agrobacíerizem (Shrell el al., 1989). La única

excepción conocida resultó ser la arginasa de Bac/Ibiscaldovelox (Patchett el al,, 1991). Aunque

la función del catión no está totalmente esclarecida, Green et al. (1990, 1991) sugirieron un doble

papel catalítico y estructural para el Mn2±respecto a la arginasa de Saccharoi’nyces cerevisicie.

Maggini el al, (1992) describieron una arginasa presente en hígado de rata, dependiente de Mn2+,

para cuyo sustrato mostraba una fuerte cooperatividad positiva (~o~ = 6,5 pM). Sin embargo, en

ausencia de Mn2~, la Km de la enzima aumentaba hasta 21 ~íM, lo que indicaría un importante

papel regulador del catión.

Soru (1983) estudió las propiedades químicas e inmunológicas de la arginasa de Bacillus

aníhracis y de Síaphyllococcus aureus, llegando a la conclusión de que desempeñaban funciones

distintas en sus respectivos organismos. En ái aureus se encontraron otras enzimas del ciclo de la

14

urea, no así en B. aníbracis. Respecto a esta última especie bacteriana, sus cepas patógenas eran

siempre encapsuladas y, además, mostraban una elevada actividad arginasa. Por el contrario, las

cepas no encapsuladas tenían niveles casi inapreciables de dicha actividad.

I?hodobacíer capsulo/ns posee una arginasa inducible por L-arginina y L-homoarginina

(Moreno-Vivían el al., 1992), dependiente de Mn2±pero fUertemente inhibida por Zn2±,Cu2±,

Cys y Orn. La enzima estaba formada por cuatro subunidades idénticas, de 3 1 kDa de peso

molecular. Su Km era de 16 mM, valor muy similar al obtenido para la arginasa de S. cerevisicie

(Creen el al., 1990). Sin embargo, la enzima de esta última especie era un trimero que se

encontraba formando un complejo con ornitina transcarbamilasa (Duong el al., 1986; Lisenstein

el al., 1986). La arginasa de levadura también mostró ser una enzima sujeta a inducción

nutricional por su sustrato (Whitnery y Magasaniki, 1973). Cooper el al. (1992), empleando

diferentes mutantes de 5. cerevisicie, demostraron la existencia de un control transcripcional de la

enzima por arginina. tinto en plantas como en microorganismos, la arginasa parece ser una

enzima inducible. También son inducibles las de higado de rata (Spolarics y Bond, 1988) e higado

humano (lkemoto ei~ al.. 1989). En Neurospora cra&~a, la arginasa está siempre presente en

cantidades significativas y es activada por liberación de arginina desde la vacuola (Weiss y Davis,

1977). A, este respecto. Borkovich y Weiss (1 987a) describieron un aumento de actividad de hasta

3 veces sobre los niveles basales de arginasa cuando el micelio crece en un medio con L-arginína

como única fuente de nitrógeno.

La estimación del peso molecular de las diferentes arginasas purificadas mediante filtración

por gel o electroforesis con SDS indican que todas ellas poseen una subunidad básica, cuyo peso

molecular oscila entre 30 kDa para la de hígado de rata a 55 kDa para la de soja. La enzima

nativa, a su vez, podrá estar formada por un número variable de subunidades, entre 3, para la de

hígado humano, y 7, para la de N. crassa Ikemoto et al. (1990) purificaron a homogeneidad una

arginasa de hígado humano a partir de cepas donadas de Escherichia colí. El peso molecular de

esta proteína fUe estimado en 35 kDa, no aislándose en ningún caso formas poliméricas. Los

autores concluyeron que este monómero debería ser la auténtica forma de arginasa, mientras que

15

dímeros, trímeros o tetrámeros detectados para la arginasa humana se debían a artefactos en el

proceso de purificación, que favorecerían la autoasociación de la enzima.

Se ha descrito con frecuencia la aparición de isoenzimas como mecanismo regulador de

ciertas rutas metabólicas. No se han descrito isoformas de arginasa en bulbos de Iris (Boutin,

1982), J>isumsatirum (Talory Stewart, 1981), en alcachofa(Wright el al., 1981)0 en soja (Kang

y Cho, 1990). Por el contrario, se han descrito isoformas de arginasa en microorganismos y

tejidos animales. Así, Borkovich y Weiss (1987a y b) describieron en N. craxw.¡ dos isoformas de

arginasa que diferían en su peso molecular (26,8 RDa y 31,7 RDa) y que estaban

inmunológicamente relacionadas con la arginasa de S. cerevisiae. El empleo de cepas de

Neurospora deficientes en arginasa puso de manifiesto que ambas formas eran codificadas o

reguladas por el mismo locus regulador, aga (Borkovich y Weiss, ]987b>.

La variación en las propiedades de las isoformas de arginasa durante el desarrollo ha sido

estudiada en tejidos fetales y adultos humanos, encontrando diferencias en sus propiedades

inmunológicas; sin embargo poseen idéntica Km, termoestabilidad, requerimiento de cationes para

su actividad y ambas son inhibidas por ornitina (Spector el al., 1982). En riñón de rata, Skrzypek-

Osiecka el al (1983) estudiaron dos isoenzimas de arginasa, j o citoplásmica y A2 o

mitocondrial, concentrando esta última el 98% de la actividad total. Las dos formas se

diferenciaban en sus propiedades inmunológicas y electroforéticas. Sin embargo, las arginasas de

hígado y eritrocito humano eran similares en cuanto a peso molecular y propiedades

inmunológicas (Ikemoto ci al., 1990).

Spolarics y Bond (1988) detectaron dos formas de arginasa en el citosol de células de

hígado de ratón que se diferenciaban en su peso molecular ( 35 RDa y 38 kDa, respectivamente) y

en su punto isoleléctrico (7,8 y 5,8). La proteolisis limitada con tripsina eliminaba un fragmento

de aproximadamente 3 kDa que no afectaba a la actividad o al pl de la isoforma. La composición

de aminoácidos de las dos formas era similar (— 87% de homologia) a las arginasas de hígado de

rata y humano. Los autores relacionaron la aparición de varias isoformas de diferente tamaño y

carga en hígado de rata con la fUnción de la enzima en diferentes rutas metabólicas: ciclo de la

urea, síntesis de prolina o ácido glutámico o síntesis de poliaininas, ya que estas rutas deberian ser

16

independientemente reguladas. La existencia de isoformas implica la posibilidad de regular

arginasa bajo diferentes condiciones fisiológicas o patológicas, ya que también se han detectado

cambios en estados iniciales de diabetes o hiperargininemia.

1.6.-CATABOLISMO DE LA ARGININA EN LIQUENES

Para los liquenes que contienen cianobiontes. glutamato y glutamina son los productos

primarios de asimilación del nitrógeno (Rai, 1988). Sin embargo, los liquenes que contienen un

alga verde acumulan grandes cantidades de arginina (Evernia prunasírí) mientras que otras

especies (Roce/la mon/agnel, (Jadoiña rang¡/érina, U. gracilis. Parmelia ¡mc/omm, 1>.

nepalensis) acumulan Glx y Asx como los más abundantes en el conjunto de aminoácidos libres

(Vicente y Legaz, 1988b). aunque el contenido en arginina suele ser también alto. La abundancia

relativa de cada uno de los aminoácidos de este conjunto está sometida a variaciones estacionales

(Legaze/a/., 1986).

A continuación se muestra un esquema sobre las diferentes rutas del catabolismo de

arginina en It. primas/rl.

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18

1.61.- Ar2¡nasa y oniltina descarboxilasa

.

Los estudios sobre el contenido en poliaminas de varias especies de líquenes indican que la

arginina es rápidamente metabolizada tras la hidratación del talo. La hidrólisis de arginina por

arginasa produce ornitina y urea. La enzima es inducida por su sustrato en 1<1 prunaslri en

oscuridad (Lega.z y Vicente, 1980), aunque también se detecta actividad tras la incubación en luz.

La adición de urea a los medios de cultivo previene, o disminuye, la inducción de arginasa

causada por el aminoácido. Una arginasa purificada 158 veces (peso molecular ¡ 80 kDa) muestra

un valor de K~1 para arginina de 0,2 mM. El pH óptimo de la reacción es bimaximal, con un pico

principal a pH 9.0 y un maxímo secundario a pH 6,5 (Legaz y Vicente, 1982). La urea se

comporta como un inhibidor competitivo de la enzima, con un valor de Ki de 2,58 mM, mientras

que la agmatina se comporta como inhibidor no competitivo, con una Ki de 21,54 mM. Ornitina y

putrescína son activadores de la enzima, mientras que la fuerte inhibición producida por urea debe

interpretarse como un mecanismo de retroinhibición que asegura una completa y efectiva

regulación de la actividad arginasa (Vicente y Legaz, 1983).

Una segunda forma de arginasa, ésta constitutiva, está presente en talos de E. prunastri.

La proteina, pre-existente e inactiva, es activada por la liberación de la arginina, probablemente

secuestrada en las vacuolas, al citosol tras la hidratación de los talos. La enzima ha sido purificada

920 veces a partir de talos incubados sobre cicloheximida para evitar la aparición de la forma

inducible. Su peso molecular es de 330 RDa. Las curvas de saturación por sustrato muestran una

cinética típicamente micaeliana con un valor de Km para arginina de 2,5 mM (Martin-Falquina y

Legaz, 1984). Ornitina, agmatina y putrescina se comportan como activadores no esenciales de la

enzima. Los valores de Ka aparente, estimados mediante la representación de Dixon, son 1,1 mM

para ornitina, 5,88 mM para agmatina y 2,7 mM para putrescina. La arginasa constitutiva, así

como la inducible, requieren específicamente Mn2±como cofactor, La contaminación con

arginasas bacterianas ha sido descartada en ambos casos, ya que incubaciones en presencia de

penicilina rebajan enormemente el número de bacterias vivas sin afectar la actividad arginasa

recuperable (Vicente y Legaz, 1 988a).

19

Los fenoles liquénicos mayoritarios en los extractos libres de células correspondientes a

cada una de las formas de arginasa descritas muestran ser activadores de sus correspondientes

arginasas en los rangos de concentración fisiológicos (Legaz, 199!). Dado que algunas de estas

activaciones producen un incremento aparente en el valor de h, por ejemplo, de 1,0 a 1,7 para la

arginasa de inducible, la hipótesis de diferentes formas poliméricas va tomando carta de

naturaleza, siendo posiblemente los fenoles accesibles a la enzima citosólica los responsables de

tal polimerización (Legaz, 1991).

Ornitina, uno de los productos de hidrólisis de arginina, puede ser posteriormente

descarboxilada para producir putrescina y urea. Escribano y Legaz (1984) encontraron actividad

ornitina descarboxilasa en talos de ¡ti prunasírí incubados sobre ornitina en oscuridad. La enzima

era también detectable cuando los talos se incubaban sobre tampón Tris-HCI, aunque la actividad

final desarrollada era 2,5 veces menor que la encontrada tras la incubación sobre el aminoácido.

La adición de cicloheximida 40 1tM a los talos cultivados sobre ornitina no anula la actividad

descarboxilasa. Sin embargo, cloranfenicol 0, 1 mM provoca una pérdida del 95% de la actividad

descarboxilasa. Por ello, los autores especulan acerca de la existencia de dos enzimas, una de

síntesis citosólica y otra organular. Aproximadamente el 80% de la actividad descarboxilasa total

depende de la proteína sintetizada en orgánulos.

1.6.2.- La vía descarboxilativa de la arilinina

.

Una vía alternativa a la hidrólisis de la arginina es su descarboxilación para producir

agmatina. Talos de E prunasírí incubados sobre arginina 40 mM en oscuridad desarrollan una

actividad arginina descarboxilasa inducible, aunque dicha actividad comienza a decrecer a las 4h

de incubación, Vicente y Legaz (1981) purificaron esta enzima 117 veces. Su pH óptimo es 7,1 y

su temperatura óptima, 260C. La masa molecular de esta proteína se ha estimado en 300 RDa. La

cinética de saturación por sustrato indica que se trata de una enzima micaeliana cuyo valor de Km

ha sido estimado en 12,5 mM para arginina. Por ello, a nivel de afininad por el sustrato, parece

más efectiva la vía hidrolitica que la descarboxilante. Putrescina y urea inhiben significativamente

20

la descarboxilasa, lo que sugiere un posible mecanismo regulador de actividad por retroinhibición.

La agmatina, que era un potente inhibidor de arginasa. sólo muestra en este caso una moderada

acción inhibitoria de la descarboxilasa.

La agmatina producida por descarboxilación de la arginasa puede ser hidrolizada por una

agmatina amidinohidrolasa para dar putrescina y urea. Una enzima purificada 485 veces de talos

de ¡tI prunaslri muestra un pu óptimo de 6,9, y temperaturas óptimas entre 350C y 400C, aunque

a 00C se mantiene un 6% de la actividad máxima de la preparación purificada, así como un 20% a

700C. La masa molecular de esta enzima ha sido estimada en 320 kDa. A partir de la

representación de Woolf, el valor de Km calculado para la agmatina es de 6,4 mM (Vicente y

Legaz, 1982). La enzima muestra especificidad por agmatina y no hidroliza arginina, ornitina o

putrescina. Estos últimos tres análogos se comportan como activadores de la hidrolasa para

concentraciones de agmatina menores de 14 mM, pero para valores más altos, los tres

compuestos se comportan como inhibidores de la enzima. La urea inhibe completamente la

actividad agmatina amidinohidrolasa.

La agmatina producida por acción de una arginina descarboxilasa puede ser también

convertida en N-carbamil putrescina por acción de una agmatina iminohidrolasa. Esta vía, que fue

descrita para plantas superiores como Hordeum vulgare, Zea mays and (Jlycine mcix, ha sido

también encontrada en talos de ¡ti prunas/rí incubados durante 2h en tampón Tris-HCI, No

obstante, la adición de arginina soporta un fuerte incremento de actividad hasta las 4h de

incubación. La aparición de actividad hidrolasa era dependiente de la síntesis actual de proteínas.

Tal hidrolasa fue purificada 34,5 veces, obteniéndose un valor de Km para agmatina de 0,8 mM.

La urea se comporta como un activador de la enzima mientras que arginina inhibe la hidrolasa

para concentraciones de agmatina superiores a 4 mM. Para concentraciones de sustrato inferiores

a 2 mM, arginina se comporta como un activador de la enzima (Legaz e/al., 1983).

21

1.6.3.- Síntesisy transiocación de poijaininas

.

Sobre la base de los pH óptimos para las enzimas clave del metabolismo biosintético de la

putrescina, se han establecido dos rutas principales, una alcalina. fungica, que parece ser

mayoritaria, y otra, neutra, alga! y minoritaria (Legaz, 1985, ¡991). 1’]. primas/rl sintetiza

putrescina, espermidina y espermina, siendo la espermidina el compuesto que se encuentra

siempre en mayores cantidades en talos recién recolectados. Valores ácidos de pH (5,5) producen

un descenso en la cantidad de putrescina y espermina tanto libres como conjugadas, mientras que

los niveles de espermidina permanecen prácticamente inalterados, al menos tras 8 Ii de incubación

de los talos a este pH. En estas condiciones, la putrescina es la única poliamina segregada a los

medios de incubación. Valores neutros de pH permiten tina lenta pero constante y significativa

producción de putrescina y favorecen la conjugación con macromoléculas tanto de putrescina

como de espermina. A estos valores de pH, la secreción de las tres poliaminas al medio es

promovida, principalmente como formas libres. Los niveles de poliaminas libres en talo

permanecen estables a valores de pH en el rango de la alcalinidad, mientras que disminuye

marcadamente la conjugación de putrescina y espermina a pequeñas moléculas. En estas

condiciones, la principal poliamina segregada a los medios de incubación resulta ser la

espermidina (Escribano, 1991).

Las poliaminas en líquenes parecen estar envueltas en la regulación del crecimiento del

talo, viabilidad de los fotobiontes y en la estabilidad del equilibrio de la simbiosis (Escribano y

Legaz. 1985; Legaz, 1985; Legaz el al., 1985). Aunque ambos simbiontes pueden sintetizar

putrescina (Legaz, 1985), sólo un 0.6% de la diamina total suministrada de forma exógena a talos

de E. pruna4lri es posteriormente localizada como putrescina libre en el ficobionte. Esto parece

indicar que las algas controlan el influjo de la poliamina quizá como un mecanismo de defensa

frente a los efectos tóxicos de la diamina sobre su metabolismo (Vicente y Legaz, 1983). Esto

está de acuerdo con la hipótesis según la cual la putrescina, cuando es producida por el

micobionte, o se mueve hacia él, va a ser conjugada en un alto porcentaje (Escribano and Lega.z,

1988). Por otra parte, se ha demostrado que cuando talos de It. prunaslr¡ son incubados en

22

medios líquidos a pH 5.0 (Legaz and Escribano, 1987), la putrescina diprotonada es atrapada en

la pared celular y allí puede ser, en parte, degradada a 1-pirrolina, antes de su entrada en la célula,

por acción de una diamino oxidasa segregable.

Recientemente se ha identificado y caracterizado parcialmente un sistema de transporte

para putrescina en talos de It. primas/rí midiendo el consumo de putrescina marcada

radiactivamente (Legaz e/ al,, 1 993a). La captación de la diamina muestra ser independiente de la

temperatura y alcanza su máximo valor para pH alcalinos. Los valores de Kni y vmax para el

transporte de putrescina en estas condiciones experimentales son 5.3 mM y 12.5 ~tmolir1,

respectivamente. No se ha observado ningún efecto sobre el transporte y la adsorción al tratar los

talos con algunos inhibidores metabólicos, como cianuro sódico y 2,4-dinitrofenol, así como con

el fungicida nistatina. Esto sugiere que la captación de putrescina es independiente de energía,

muy rápida y mediada por un transportador. La putrescina transportada queda principalmente

localizada en el citosol y airededor del 65% de la putrescina total captada se encuentra en las

células del micobionte.

De igual forma, se ha estudiado la posibilidad de competición de este sistema de

transporte con otros metabolitos. Los experimentos de competición para la captación incluyen

tanto transporte como adsorción sobre paredes celulares (Escribano e/al., 1993). En este sentido

espermidina y esperniina se comportan como inhibidores competitivos del sistema de transporte

de putrescina con valores de Ki de 1.55 mM y 1.34 mM, respectivamente. Los aminoácidos

básicos, como arginina, ornitina y lisina, no compiten por el mismo sitio de adsorción. La

putrescina captada no parece ser convertida eficientemente en otras poliaminas después de su

transporte. Estos resultados sugieren que la movilidad de putrescina dentro del talo está primada

hacia el micobionte.

L&4- La función de la arsinasa se2re2able

.

No existe, hasta la actualidad, ningún trabajo experimental que aporte resultados sobre

secreción macromolecular en liquenes en condiciones naturales. Sin embargo, la experimentación

23

llevada a cabo en condiciones de laboratorio, mediante la cual se intenta estudiar las

características bioquímicas de síntesis de material preferentememente enzimático. utiliza a menudo

cultivos de talo sobre medios líquidos durante cortos períodos de tiempo. En estas condiciones, se

ha observado secreción de algunas actividades enziniáticas, aunque el papel fisiológico que tal

secreción pueda tener es materia sujeto de controversia.

Cada vez son más las proteínas extracelulares que, tras su análisis bioquimico, aparecen

glicosiladas con una cantidad variable de carbohidratos unidos covalentemente a la secuencía

polipeptidica. La glicosilación primaria se realiza a su paso por la membrana del retículo

endoplásmico, topográficamente muy cerca del punto de unión del ribosoma a la membrana. La

síntesis del enlace covalente depende del reconocimiento de una secuencia particular de

aminoácidos. Las glicosilaciones subsecuentes son catalizadas por enzimas particuladas en la

membrana, siendo la secuencia final de monosacáridos, regida por la especificidad de cada enzima

por el nucleótido de azúcar y el aceptor. Detecciones citoquimicas del proceso completo

confirman que la formación del oligosacárido inicial ocurre en el retículo endoplásmico rugoso

mientras que las restantes adiciones se realizan al paso de la proteína por el resto de las

membranas y dentro de las vesículas de Colgi, que actuarán después como vesiculas secretoras

(Priest, 1987). La secreción de glicoproteinas debe ser mirada, entonces, como un mecanismo de

pinocitosis reversa (Winterburn y Phelps, 1972). Glicosilación como señal de secreción no sólo

afecta a proteínas enzimáticas. La existencia y función de proteínas glicosiladas, producidas por

los fotobiontes de E. prunas/rí y Pseudeverniafur¡uracea, que actúan como proteinas represoras

sin actividad enzimática conocida, ha sido recientemente demostrada (Pérez-Urria el al., 1 989a;

Rodríguez el aL, 1989).

En todos los casos, las enzimas segregadas por liquenes parecen ser formas modificadas

de una enzima inducible. Cuando se hacen flotar talos de ¡ti prnnas/ri sobre urea, la ureasa es

inducida y, después de esto, una parte de dicha ureasa es segregada al medio como una función

inversa de la cantidad de enzima retenida por el talo (Blanco e/ al., 1984; Vicente y Blanco,

1985). Cuando la producción de la enzima es inhibida por cicloheximida, un inhibidor de la

traducción en ribosomas SOS, la secreción de la enzima es inmediatamente anulada (Vicente y

24

Pérez-Urna. ¡989). La misma especie de liquen produce, al menos, dos formas de arginasa

cítosólica. siendo una de ellas constitutiva mientras que la otra se comporta como inducible por

arginina (Legaz y Vicente, 1982). Simultáneamente, se ha podido verificar la existencia de

actividad arginasa en los medios de incubación de los talos. Pues bien, el análisis del peso

molecular de la arginasa segregada indica claramente que la enzima inducible es la única forma

recuperada como enzima extracelular (Planelles y Legar., 1987). La enzima muestra ser una

glicoproteina que contiene 280 residuos de glucosa, 27 de fructosa y 85 de manosa por molécula

de proteína. El heteroglicopolimero tiene un peso molecular de 65 kDa (Planelles y Legaz, 1987)

por lo que el peso molecular de la glicoproteina se ha estimado en 245 RDa, El valor de Km para

esta enzima ha sido estimado en 1,5 mM para L-arginina, mientras que la de la enzima cítosólica

soluble es 0.2 mM. En este caso, la glicosilación implica una pérdida en la afinidad de la enzima

por su sustrato.

Es interesante describir que pueden establecerse buenas correlaciones entre el contenido

hídrico relativo del talo y la secreción de ureasa para dos especies diferentes de liquenes que

crecen sobre el mismo sustrato. Por ejemplo, (‘tararia niva/ls segrega mayor cantidad de ureasa

que la encontrada segregada de S/ereocaulon pascha/e, creciendo ambas sobre podzol. (‘ladonia

síellaris, creciendo sobre un suelo mineral, satura su talo alcanzando muy altos valores de

contenido hídrico relativo y segrega ureasa de forma continua. Por el contrario, (1,. rangi/eré’na no

segrega la enzima mientras que, paralelamente, necesita muy bajas cantidades de agua para

alcanzar la saturación del talo (Pérez-Urna el al., 1989).

Usando tres diferentes ecotipos de Xanlhor¡a parielmna, Rodriguez y Vicente (199!)

intentaron correlacionar secreción de ureasa con contenido relativo de agua después de una

inmersión durante 1 5 mm antes del suplemento de urea. De esta manera se estableció una relación

lineal entre ureasa segregada y contenido relativo de agua para los tres ecotipos usados (Legar y

Vicente, 1991). Por otra parte, la secreción de urea por talos de Mas/odia lesellata es

drásticamente abolida cuando la inmersión del talo se realiza en una mezcla de

agua:polietilenglicol (50:50, vii’). En estas circunstancias, el contenido hidrico relativo de los talos

es inferior al 40% del observado cuando dichos talos se sumergen en agua o en una disolución 40

25

mM de urea, relacionándose entonces la ausencia de secreción con la insaturación de agua del talo

en estas condiciones. Por todo ello, parece razonable relacionar secreción de ureasa con el estado

hídrico de los talos, siendo éste un reflejo de la cantidad de agua contenida por las células y en los

espacios intercelulares y concluir que la secreción seria una consecuencia del movimiento de las

enzimas en el talo, desde un simbionte a otro, saliendo la proteína de aquel a través del con/inuum

espacio intercelular hidratado-medio líquido externo (Vicente. 1990; Vicente y Legaz, 1988a).

La posibilidad de movimiento de enzimas entre simbiontes puede tener importantes

implicaciones metabólicas, aún sin excluir que ambos simbiontes puedan sintetizar la misma

enzima a tiempos de inducción diferentes (A.hmadjian, 1977; Vicente y Legar., 1 988b; Vicente y

Pérez-Urna, 1989>. también es particularmente interesante el que estas enzimas, de forma

transitoria (Vicente y Pérez-Urna, 1989) o permanente (Legaz y Vicente, 1989), puedan ser

localizadas en las paredes celulares de los ficobiontes. Las interacciones proteína-proteína en las

paredes celulares de los ficobiontes liquénicos han sido, desde antiguo, relacionadas con sistemas

de reconocimiento de ficobiontes compatibles <Lockhart et al., 1978; Bubrick e/ al., 198 1;

Bubnick e/al., 1982; Bubrick e/al., 1985). Ahora bien, existía un hecho particularmente curioso.

Cuando se usaba una proteína de reconocimiento, producida por el hongo de Y parieíñu,

marcada con un trazador fluorescente, sólo se unía a su Iicobionte compatible cuando éste

procedía de un cultivo axénico, nunca cuando había sido recientemente aislado del talo (Bubrick y

Galun ¡980). Una conducta semejante era observada para el ligamiento de lectinas comerciales

sobre diferentes especies de ficobiontes (Marx y Peveling, 1983) mantenidos en cultivo axénico

durante largos periodos. Esto parecía indicar que el receptor de pared era una glicoproteina,

inducida en cultivo y probablemente reprimida en el holobionte (Vicente y Legaz, 1992).

Recientemente. Molina el al. <1993) han demostrado que una lectina parcialmente purificada de

Y. paríelma, que contiene una arginasa glicosilada (susceptible de ser segregada), es capaz de

unirse a las paredes celulares de ficobiontes compatibles recientemente aislados del talo si son

mantenidos durante sólo 2h en una disolución de urea. Simultáneamente a la unión, tanto la

ureasa particulada en las paredes del alga, como una actividad arginasa detectada en la

preparación de lectina son completamente anuladas. Esto está de acuerdo con el hecho de que

26

muchas lectinas hayan sido identificadas como glicoproteinas con actividad enzimática (Shannon

and Hankins 1981 y lo que podría relacionarse con la hipótesis de que el verdadero papel de estas

lectinas no sería el de reconocimiento de especies compatibles (Lerouge el al. 1990), sino un

mecanismo de defensa de la planta frente a potenciales parásitos (Chrispeels and Raikhel 1991,

Franz 1990), incluidos, en el caso de los líquenes, los propios micobiontes (Ahmadjian 1987). La

putrescina ha sido claramente relacionada con el grado de infectividad fungica (Rajam e/al. 1985;

West y Wahers, 1989)> y en el caso de los líquenes, la arginasa fúngica segregable, cuando

penetra en ficobiontes aislados, desorganiza el cloroplasto y produce degradación de clorofilas en

paralelo al aumento del nivel de putrescina en el ticobionte (Molina y Vicente, 1993), cuyo

contenido natural es bajo, derivado de la via neutra del catabolismo de la arginina (Legaz, 1991).

Aún la posibilidad de interacción de esta arginasa segregable con los fenoles existe, dado

que muchos de ellos cristalizan de forma normal sobre las paredes celulares de los fotobiontes

liquenizados, como ha sido demostrado por Ahmadjian y Jacobs (1985) para (Isneasirigosa y por

Honegger (1986) para dilérentes especies de Parmeliacecie.

1.6.5.-Isoformascomo(actoresdedesarrolloo de reeulación metabólica

.

La situación metabólica descrita hasta este punto se revela como extraordinariamente

compleja. Por una parte, la mayoría de los liquenes son plantas adaptadas a condiciones de

extremada sequedad, por lo que la rehidratación de sus células y de sus espacios intercelulares

queda restringida a muy pocas horas, a veces incluso minutos, al día (Blum, 1973>. Esto

condiciona la solubilización de arginina, la inducción de arginasa y su secreción, a periodos de

tiempo muy restringidos. La sintesis y secreción de fenoles viene también condicionada por otro

factor externo, como es la densidad de flujo fotónico incidente sobre el córtex (Fahselt, 1981).

Quizá por ello, enzimas que juegan un papel decisivo en el metabolismo del nitrógeno y en el

mantenimiento del equilibrio simbiótico responden a las variaciones en las circunstancias

ambientales mediante la producción de isoformas (modificaciones post-traduccionales) antes que

de auténticos isoenzirnas (multiplicidad debido a causas genéticas), de acuerdo con Rider y Taylor

27

(1980>. En este sentido, la firmación de agregados poliméricos de ciertas enzimas, con la

consiguiente modulación de su actividad, parece ser un mecanismo rápido de adaptación

metabólica en líquenes (Vicente y Legaz, 1988a). A nivel genético, la opción de la represión

catabólica parece ser la preferida en los sistemas rápidos de regulación. El descenso en la

velocidad de respiración causada por la desecación, o el incremento en la intensidad de luz

recogida por el talo, puede aumenta el contenido celular en glucosa (Tapper, 1981), lo que

redunda en mecanismos de represión catabólica que afectan, tanto a arginasa y otros enzimas

biosintéticos de poliaminas (Legar. y Vicente, 199 Ib; Vicente y Legaz. ¡985), como a enzimas del

metabolismo de los fenoles (Herrero el al?, 1989; Legar. el aL, ¡992).

Las investigaciones acerca de las relaciones entre variabilidad alélica y genotípíca y los

factores externos, bióticos y abióticos, han sido realizadas frecuentemente utilizando diferentes

plantas (Anderson, 1991; Samuel e/al,, 1991) y animales (Gilbert y Richmond, 1982; Oakeshott

id al., 1982; David el al., 1989). No obstante, estas investigaciones han sido llevadas a cabo

utilizando especies de fácil reproducción en condiciones de laboratorio, en orden a realizar análisis

genéticos. Por esto, los líquenes han sido excluidos hasta ahora de este tipo de investigaciones, ya

que la batería enziniática está, salvo casos, localizada en ambos simbiontes (Fahselt, 1985; Legar.

y Vicente. 198 1; Vicente y Legar., 1 988b> y, además, porque ha sido imposible hasta la fecha

llevar a cabo experimentos de cruzamiento mendeliano usando especies de liquenes. Culberson el

al. (1988) intentaron resolver este problema por medio de hibridaciones entre algunas especies de

(‘ladonía en cultivos resintetizados y el análisis subsecuente de los fenoles producidos por el

híbrido. No obstante, el flujo genético no pudo ser más que supuesto. Alternativamente, el análisis

de los zimogramas obtenidos mediante el uso de técnicas electroforéticas produce información

isozimática de la que deriva algún conocimiento evolutivo <Gottlieb, ¡977). De esta forma,

Fahselt (1987) encontró diferencias genéticas estudiando parámetros electroforéticos para

esterasas y fosfatasas alcalinas que podrían ser explicados mediante recombinación meiótica entre

bel polimórficos en una determinada población.

Varios sistemas enzimáticos han sido estudiados mediante isoelectroenfoque en geles de

poliacrilamida (Hageman y Fahselt, lQSów Killias el al 1988; Skultz el cii?, 1990) en orden a

28

obtener información sobre variabilidad enzimática como una función de diferencias temporales

(Hageman y Fahselt, 1986a y b) y geográficas o climáticas (Fahselt, 1986). En relación con estas

últimas, se ha demostrado que el patrón de bandeo para una enzima particular puede ser único

para determinadas especies de liquenes (MacFarlane e, al., 1983; Kershaw el al,. 1983; Fahselt y

Hageman, 1983) mientras que se encontraba variabilidad suficientemente significativa entre

diferentes poblaciones de una sola especie de liquen geográficamente separadas (Hageman y

Fahselt, 1984, 1986a y b). Sin embargo, en ninguno de los casos descritos se ha investigado el

origen de las diferentes isoformas encontradas.

29

OBJETIVOS

Estudiar la multiplicidad de la arginasa de Jgí’erma primas/rl y caracterizar a nivel

bioquímico las diferentes isofornias

Dada la relación biogenésica entre actividad arginasa y síntesis de fenoles, determinar el

papel efector de estas moléculas y si existe especificidad de forma.

Aclarar el anterior punto, estudiar los mecanismos de regulación de arginasa por los

fenoles a nivel de actividad y de estructura.

Determinar las pautas de ligamiento del efector a la isoforma y los cambios

conforniacionales que ello conlleve.

A la vista de los resultados obtenidos, tratar de construir una hipótesis coherente y

comprobable que relacione la funcionalidad bioquímica con su proyección fisiológica.

II.- MA TERJAL 1’ METODOS

32

11.1.- MATERIAL VEGETAL

El material vegetal objeto del presente trabajo fue el lkíuen epifito l&i’ernia prunas/rí (L.)

Ach, recogido de la corteza de Quercus pyrenaiúa Lam. en Valsain (Segovia). Los talos, secos

en corriente de aire, se almacenaron en oscuridad a PC, hasta su utilización, durante un periodo

nunca superior a un mes. En la Figura 1 se muestra un ejemplar de esta especie.

11.2.- CONDICIONES DE INCUBACION

Muestras de 1,0 g de talo seco fueron sumergidas en 25 ml de disoluciones tamponadas

con Tris-HCI 0.1 M, pH 9,1 (Merck), conteniendo L-arginina 40 mM (Sigma Chem. Co.) o.

cuando se indique, cicloheximida 40 ~iM (Sigma Chem.Co,), y mantenidas en oscuridad a 260C

durante diferentes tiempos de incubación.

11.1— VALORACION DE LA ACTIVIDAD ARGINASA

La actividad arginasa se valoró mediante el método de Greenberg (1955), modificado por

Legazy Vicente(1980), incluyendo ureasa cristalina tipo 111 (Sigma Chem. Co.) en las mezclas de

reacción. Dichas mezclas contenían, en un volumen final de 3,0 mí: 10 gmoles <le tampón Tris-

HCI, pH 9, 1, para las muestras incubadas en L-arginina 40 mM o bien pH 6,5 para las muestras

que fueron incubadas en cicloheximida 40 pM; 0,5 jimoles de L-arginina; 7,5 pmoles de ácido

maléico; 5,0 ¡imoles de sulfato de manganeso; 33,8 mg de ureasa cristalina y 20,0 pg de proteína

liquénica.

Como control se Litilizaron las mismas mezclas de reacción en las cuales el sustrato

(L-arginina) era sustituido por igual volumen del tampón correspondiente.

La reacción se llevó a cabo a 300C y fue detenida tras 25 mm (tiempo determinado como

óptimo), mediante la adición de K2C03 saturado. Después se dejaron transcurrir 2 h para

completar la difusión del amonio formado y posterior fijación sobre H2504 0,02 N, según el

método de microdifusión de Conway (1962).

33

La valoración del amonio se llevó a cabo utilizando el reactivo de Nessler (Standard

Methods, 1955) midiendo el color desarrollado a 440 nm en un espectrofotómetro Zeiss PM-2.

La absorbancia así obtenida se transformó en jimoles de amonio mediante tina recta patrón

construida a partir de concentraciones crecientes de sulfato amónico químicamente puro.

Una unidad de actividad específica fue definida como 1.0 ¡imol de amonio producido por

mg de proteína y por minuto

11.4.- VALORACION DE PROTEíNAS

La valoración de proteínas, tanto en el extracto libre de células como en las distintas

fracciones del proceso de puriticación, se llevó a cabo mediante el método de Lowry et al. (1951).

El patrón fue en todos los casos seroalbúmina bovina de Sigma Chem.Co.

11.5.- PURIFICACION DE LAS ISOFORMAS DE ARCINASA

11.5.1.-Isoformas Iv II de ar~inasa

11.5 LI.- Obtención del extracto libre de células

Muestras de 50 g de talo seco se incubaron en 1 .250 ml de una disolución de L-arginina

40 mM. tamponada con Tris-HCI 10 mM, pH 9,1, durante 6 h, a 26’C en oscuridad.

Tras la incubación, los talos se lavaron con agua destilada y se secaron ligeramente con

papel de filtro, Después, se maceraron con acetona (15 ml por g de talo) durante 5 mm con objeto

de eliminar los fenoles corticales. Los homogeneizados fueron filtrados y los residuos se secaron

en corriente de aire. Una vez secos, fueron nuevamente macerados con tampón T’¡is-HCI lO mM,

pH 9,1 (12 ml por g de talo), conteniendo sulfato de manganeso 0,5 mM y ácido maléico 0.75

mM (Greenberg, 1955). Los homogeneizados se centrifugaron durante 20 mm a 24.000 x g en

una centriftiga Beckman J2-2 1 (rotor JA 21). Los sobrenadantes se recogieron y filtraron a través

de un filtro Millipore GS (0.22 ~tmde diámetro de poro>. La temperatura durante todo el proceso

34

fue de 40C. El filtrado se utilizó como extracto libre de células y en él se valoró la actividad

arginasa y la cantidad de proteínas, de acuerdo a lo descrito en los apartados 11.3 y 11.4,

respectivamente,

11.5.1.2.- Precipitación con sulfato amónico

El extracto libre de células se precipitó con sulfato amónico a distintos porcentajes de

saturación, entre el 10% y el 95O/~ (p/v). El sobrenandante del 85% resultó contener la mayor

parte de la actividad arginasa. La sal se fue disolviendo en condiciones de agitación suave con

protección de hielo fundente, Una vez disuelta completamente, el extracto se mantuvo dos horas

más en agitación para, posteriormente, ser almacenado durante un período no inferior a 2 h. Por

último, se centrifugó durante 1 h a 43.000 X gv

El precipitado obtenido tras la centrifugación fue resuspendido en un volumen igual al del

sobrenadante. Ambas fracciones, sobrenadante y precipitado, se dializaron frente a tampón

Tris-HCI lO mM, pH 9, 1, renovando el baño cada 4 h hasta la completa eliminación de sulfato

amónico (72 h aproximadamente). La temperatura durante todo el proceso fue de 40C.

En los extractos dializados se valoró la actividad arginasa y la cantidad de proteínas

(apartados 11.3 y 11.4, respectivamente).

¡¡.5.1.3.- Adsorción sobre gelde fosfato cálcico

De las dos fracciones resultantes de la precipitación con sulfato amónico, se escogió el

sobrenadante, por contener la mayor actividad arginasa.

La proteína del dializado fue adsorbida sobre gel de fosfato cálcico (Legget-Bailey, 1967)

preparado en tampón Tris-HCI 10 mM, pH 9,1, en la proporción de 100 mg de gel seco por cada

mg de proteína del extracto, mediante agitación fuerte durante 2 h. Posteriormente se centrifugó a

12.000 >< g durante 7 mm. El precipitado de esta centrifugación, que contenía la mayor parte de

la proteína, era resuspendido, mediante agitación, en tampón Tris-HCI 0,02 M, pH 9, 1. Tras 1 h

de agitación, se dejaba reposar y después se centrifugaba, en las mismas condiciones, con objeto

35

de desorber la proteína. El proceso se repitió sucesivas veces empleando molaridades crecientes

del mismo tampón (entre 0,04 M y 3,0 M), El sobrenadante de cada centrifugación era filtrado

por papel Whatman n0 1 y en él se valoraban tanto la actividad arginasa como la cantidad de

proteínas (apartados 11.3 y 11.4, respectivamente). La temperatura durante todo el proceso fue de

40C.

11.5.1.4.- Electroenfoque en columna

Las fracciones en las cuales se recuperó la mayor actividad arginasa fueron

electroenfocadas en una columna LKB 8100 de Pharmacia, El gradiente de pH se preparó con

anfolitas (Servalyte) al 1% (p/v) en un rango comprendido entre pH 3,5 y 10,0.

Para prevenir movimientos de convección no deseados o el mezclado de diferentes

fracciones de proteína próximas, el gradiente de pH se estabilizó con otro gradiente de densidad

de sacarosa. La muestra se introdujo al mismo tiempo que las disoluciones de llenado de la

columna, La temperatura fue de 40C y el voltaje aplicado de 1 .000V durante 48 h, tiempo al cabo

del cual, la muestra estaba electroenfocada (carga neta 0).

Se recogieron fracciones de 2,0 ml que fueron filtradas a través de una columna de

Sephadex 0-25 (40 mm de longitud X lO mm d. i.) (Pharmacia) con objeto de eliminar las

anfolitas presentes en cada fracción, así como el exceso de sacarosa. En cada una de las

fracciones filtradas~ se midió el pH y el contenido de proteínas. Aquellas fracciones que contenían

proteína fueron dializadas frente a tampón Tris-HCI 0,1 M, pH 9,1, durante 24 h para eliminar los

restos de anfolitas y sacarosa que pudiesen quedar y, posteriormente, se valoré en ellas la

actividad arginasa y la cantidad de proteínas, según lo descrito en los apartados 11.3. y 11.4.,

respectivamente.

36

1l.5.L- Isofornia 111 dc arginasa

11.5.2.1.- Obtención del extracto libre de células

Muestras de 50 g de talo seco se incubaron en 1.250 ml de una disolución de

cicloheximida 40 ¡iM. tamponada con Tris HCI- lo mM, pH 9.1, durante 16 h. a 260C en

oscuridad.

A partir de este momento, para la obtención del extracto libre de células se procedió de

igual manera a la descrita en el apartado 11.5,1.1.

11.5.2.2.- Precipitación con sulfato amónico

El extracto libre de células obtenido en el paso anterior, se precipitó con sulfato amonico a

distintos porcentajes de saturación, entre el 10% y el 95% (plv). El sobrenadante del 70% resultó

contener la mayor parte de la activadad arginasa. Para ello se procedió de forma idéntica a la

descrita en el apartado 11.5.1.2.. con la salvedad que el pH del tampón de diálisis fue de 6,5.

11.5.2.3.- Adsorción sobre gel de fosfato cálcico

El sobrenadante del sulfato amónico dializado, el cual contenía la mayor parte de la

actividad arginasa, fue utilizado para la adsorción de la proteína sobre gel de fosfato cálcico. El

procedimiento empleado fue idéntico al descrito en el apartado 11.5.1.3, En esta ocasión la

molaridad del tampón utilizada para desorber la proteína varió entre 0,02 M y 0,3 M.

11.5.24.- Electroenfoqee en columna

La fracción de la cual se desorbió la mayor actividad arginasa fue electroenfocada de

acuerdo a lo descrito en el apartado 11.5.1.4., con la salvedad que el pH del tampón de diálisis fue

de 6,5.

.37

11.53.-Isoforma IV de ar2inasa

11.5.3.1.-Obtención del extracto libre de células

Muestras de 50 g de talo seco se incubaron en 1.250 ml de una disolución de L-arginina

40 mM, tamponada con Tris-IICI lo mM, pH 9,1, durante 8 h. a 260C en oscuridad.

Al cabo de este tiempo se recogió el medio de incubación, se filtró a través de un filtro

Whatman n0 3 y se concentró a 300 ml. En este extracto se valoré la cantidad de proteínas y la

actividad arginasa. según lo descrito en los apartados ¡1.3 y 11.4, respectivamente.

11.5.3.2.- Precipitación con sulfato amónico

El filtrado obtenido fue precipitado con sulfato amónico a distintos porcentajes de

saturación, entre cl 10% y el 95% (p/v). El sobrenadante del 50% resulté contener la mayor parte

de la actividad arginasa. El procedimiento empleado fue el mismo que se describió en el apanado

11. 5. 1.2

11.5.3.3.-Adsorción sobregel de fosfato cálcico

La fracción que contenía la actividad arginasa mayoritaria (sobrenadante) fue adsorbida

sobre gel de fosfato cálcico de acuerdo a lo descrito en el apartado 11.5.1.3. La molaridad del

tampón empleado en la desorción varió entre 0,02 M y 0,3 M.

¡15.3.4.-Electroenfoqueen columna

El sobrenadante de mayor actividad arginasa, obtenido tras la desorción, fue

electroenfocado según lo descrito en el apartado 11.5,1.4.

38

11.6.- DETERMINACION DEI PUNTO ISOELECTRICO

¡1.6].- Mediante electroenfogne en columna

El punto isoeléctrico de cada una de las isoformas (1, 11, III y IV) de arginasa se determinó

mediante un electroenfoque en columna, idéntico al descrito en el apartado 11.5.1.4.

11.6.2.- Mediante electroforesis caDilar

El punto isoeléctrico de las cuatro isoformas de arginasa, obtenido mediante eletroenfoque

en columna, fue corroborado en electroforesis capilar.

El equipo utilizado fue un Spectraphoresis 500 de Spectra Physics, equipado con un

integrador SP 4290 (Spectra Pliysics), bajo las siguientes condiciones de análisis:

i) Caracteristicas del capilar: Tubo de sílice fundida,

recubierto de poliimida.

• diámetro interno: 75 ¡im

• diámetro externo: 190 ¡im

u) Longitud del capilar hasta la ventana de detección: 60 cm

iii) Electrolito: tampón borato sódico 25 mM, pH 9,0 ó bien

tampón borato sódico 15 mM, llevado a pH 7,1 con ácido

fosfórico 14.7 M.

lv) Temperatura: 300C.

y) Voltaje aplicado: 17 kV ó 25 kV

vi) Detección: UV-ton column’ a 200 nm.

vii) Tipo de inyección: Hidrodinámica durante 9 s.

viii) Volumen de inyección: 36 nl.

Las muestras fueron dializadas frente a agua-HPLC (tridestilada y filtrada a través de

filtros Millipore GS de 0,22 pm de diámetro de poro), llevadas a sequedad en corriente de

nitrógeno y resuspendidas nuevamente en tampón Tris-HCI 10 mM, pH 9,0 ó 7,1. según se

39

indique.

La determinación del punto isoeléctrico se llevó a cabo interpolando el valor obtenido de

movilidad electroforética (l’e) en una recta de calibrado construida con proteínas de punto

isoeléctrico conocido. Las proteínas utilizadas fueron: Mioglobina de caballo (pl 7,0), aldolasa de

conejo (pl 6,6), anhidrasa carbónica dc eritrocito de vaca (pl 5,9), alcohol deshidrogenasa de

levadura (pl 5,4) y tiroglobulina de vaca (pI 4,6) (todas ellas de Sigma Chem.Co.) y benzol (Carlo

Erba) como marcador neutro.

La movilidad electroforética viene definida como:

ye tj-i...~ en cm2 •s’~ y” - donde:

L longitud del capilar (cm)

t,,= tiempo de migración (s)

voltaje aplicado (V)

11.7.- ANALISIS DE AMINOACIDOS

Alícuotas (1 mi) de cada una de las cuatro isoformas de arginasa purificadas, se dializaron

frente a agua-HPLC durante 24 Ii con objeto de eliminar las sales procedentes del tampón en el

cual se hallaban disueltas. A continuación se liofilizaron y, después, se disolvieron en 0,2 ml de

HCI 6 N conteniendo fenol al O,í~ o (p/v) y 20 nmoEmh1 de nor-leucina como patrón interno. La

hidrólisis se llevó a cabo a l050C durante 24 h en ampollas herméticas (Gavilanes et al.. 1982).

Los hidrolizados se llevaron a sequedad, sometiéndolos después a dos lavados con 200 ¡il de agua

destilada, seguidos del correspondiente secado. Las muestras así obtenidas, fueron procesadas en

un analizador de aminoácidos Heckman System 6300 con un módulo de interfase analógica

(System GoId). La duración del análisis fue de 100 mm. Los residuos de Cys fueron determinados

como contenido en ácido cistéico, Para ello, antes de la hidrólisis, fue necesario oxidar la proteína

con ácido perfórmico (Hirs, 1967).

Para preparar el ácido perfórmico se tomaron cantidades de agua oxigenada de 30

40

volúmenes y ácido fórmico al 99% (y/y) en proporción 1:9, manteniéndose esta mezcla a 250C

durante 2,5 h. Transcurrido este tiempo se mantuvo a -1 00C durante 15 mm como mínimo,

La oxidación de la proteína se llevó a cabo disolviéndola en ácido fórmico al 99%, a una

concentración de 10-30 mgmh1. Para una cantidad de proteína inferior a 0,1 mg, se utilizaban

12,5 ¡il de ácido fórmico. La disolución se mantenía en un baño de hielo. Por cada mg de proteína

se añadia una alícuota de lOO ¡u de ácido perfórmico preparado, manteniéndola a -1 00C durante

2,5 h.

Por último, se procedió a la eliminación del ácido por liofilización, para lo cual se diluía la

muestra, al menos, 25-30 veces con agua destilada.

Posteriormente, la proteína se sometió a hidrólisis ácida durante 24 h, en las condiciones

ya descritas,

El Trp fue determinado espectrofotométricamente de acuerdo con el método de Beaven y

Holiday (1952). Se preparó una disolución de proteína en NaOH 0,1 N, cuya absorción a 280 nm

estuviera comprendida entre 0,2 N y 0,5 N. Se determinó la absorbancia de esta disolución a

294,4 y a 280 nm, calculándose el contenido en Trp a partir de la ecuacion:

0,592 XZSns.4 —0,263 X&ao,oMTyrIMTrp 0,263 XAnO.O —0,170 ><&9s.4

donde MTyr y MTrp son los moles de Tyr y Trp por mol de proteína, respectivamente. MTyr se

calculó a partir del análisis de aminoácidos de la proteína.

11.8.- DETERMINACION DEL PESO MOLECULAR DE LAS DIFERENTES

ISOFORMAS DE ARGINASA MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE

ALTA RESOLUCION (HPLC)

El peso molecular de las diferentes isoformas se determinó mediante HPLC a partir de las

enzimas purificadas obtenidas por electroenfoque en columna. Las isoformas nativas 1, II, III y IV

de arginasa fueron desnaturalizadas con dodecil sulfato sádico, SDS (Sigma Chem.Co.) al 1%

41

(plv) en presencia de [3-mercaptoetanol (Fluka) al 2,50 o (p/v). Las muestras se mantuvieron en

agua hirviendo durante 5 mm y después se filtraron por filtros de 0,45 gm de diámetro de poro

(Alltech) antes de ser inyectadas en la columna cromatográfica. Mediante mecanismos de

I-IPLC-exclusión molecular también se determinaron los pesos moleculares de las isoformas de

arginasa tras cl ligamiento a los diferentes efectores. El equipo empleado fue un cromatógrafo de

líquidos Spectra Physics compuesto por una bomba de gradiente ternario 51> 8800. un detector

UV-Vis sp 8490 y un inyector Rheodyne 7125 acoplado a un integrador SP 4290 también de

Spectra Physics. Las condiciones de análisis fueron las siguientes:

a) Columna TSK gel G5000 PWXL (Supelco).

i> Partícula: gel de vinilo-polimérico.

u> Diámetro de poro: iOOo A.

iii) Diámetro de partícula: 10 ¡m.

iv) Configuración de la columna:

• diámetro interno: 7,8 mm.

• longitud: 300 mm.

- Presión: 7 bares.

- Fase móvil: Tampón Tris-RU 75 mM, pH 9,1 ó 6,5.

- Flujo: 0,3 nibminI

- Temperatura: Ambiente.

- Volumen de inyección: 10 ¡il.

- Detector: 11V a 280 nm.

b) Columna Zorbax GF-450 (Du Pont).

i) Partícula: sílice esférica,

u) Modificación de la superficie: Zirconio.

iii) Fase estacionaria ligada: monocapa hidrofilica de

tipo diol.

iv) Diámetro de poro: 300 A.

y) Diámetro de partícula: 6 pm.

vi) Configuración de la columna:

42

• diámetro interno: 9,4 mm.

• longitud: 250 mm

Conectada en serie con la.

Columna: Zorbax GF-250 (Du Pont).

i> Particula: sílice esférica.

u) Modificación de la superficie: Zirconio.

iii) Fase estacionaria ligada: monocapa hidrofilica de

tipo dm1.

iv) Diámetro de poro: 150 A.

y) Diámetro de particula: 4-4,5 pm.

vi) Configuración de la columna:

• diámetro interno: 9,4 mm.

• longitud: 250 mm.

- Presión: 65 bares.

- Fase móvil: Tampón Tris-E-Rl 200 mM, pH 7,6 ó 9,1.

— Flujo’ 1 ¡nl mirr

- Temperatura: Ambiente.

- ‘volumen de inyección: 10 pl.

- l)etector: UV a 280 nm.

La configuración a) se utilizó en el análisis paralelo de los distintos pasos del proceso de

purificación y para determinar el peso molecular de la forma nativa de cada isoforma de arginasa.

La configuración b) se utilizó para determinar eJ peso molecular de las formas nativa y

desnaturalizada, También se empleó para calcular el peso molecular de los diferentes polímeros de

arginasa tras el ligamiento del fenol correspondiente. En los análisis de proteínas desnaturalizadas,

las columnas fueron equilibradas con fase móvil conteniendo SDS al 1% (plv).

El peso molecular se determinó interpolando el volumen relativo de elución obtenido

(Ve/Vo) en una recta de calibrado construida con proteínas de peso molecular conocido, Las

proteínas utilizadas fueron: Tiroglobulina de vaca (Mr%ÓO kDa); Apoferritina de bazo de caballo

(Mrz44O kDa); [3-amilasade batata (Mr~2OO kDa); Albúmina de huevo (Mr%7 kDa); Anhidrasa

43

carbónica de eritrocito de vaca (Mr~<2O kDa) y Citocromo cdc corazón de vaca (M~ 12,4 kDa).

11.9.- CARACTERIZACION ESPECTROSCOPICA

¡1.9. 1.- Espectros de absorción ultravioleta

La obtención del espectro ultravioleta de las distintas isoformas (1, III y IV) de arginasa se

llevó a cabo cii cubetas de cuarzo de 10 mm de paso óptico (Starna Ltd.), empleándose un

espectrofotómetro Varian, modelo DMS 90. La determinación se realizó con una disolución de

proteína de 42, 37 y 25 pginh1 para las isoformas 1, III y IV. respectivamente, en tampón Tris-

HCI lO mM. pH 9,1, para las isoformas 1 y IV, y pH 6,5 para la isoforma 111. Las muestras se

filtraron a través de filtros de 0,45 ¡m de diámetro de poro. Para sustraer la absorción de tampón,

se realizó una corrección de la línea base del espectro.

[¡.9.2.- EsDectros de emisión de fluorescencia

Estas medidas se hicieron en un espectrofluorímetro Kontron, modelo SFM 25, equipado

con un tbtomultiplicador de referencia. El equipo poseía una lámpara de xenon, con una rendija

de emisión y excitación de lO y 15 nm, respectivamente. Las cubetas de cuarzo, de 5 caras

pulimentadas, eran de JO mm de paso óptico (Starna Ltd.). Los análisis se realizaron a

temperatura ambiente y la concentración de proteína fue dc 42, 37 y 25 pgmh1 para las

isoformas 1. III y IV, respectivamente, en tampón Tris-1-ICI lO mM, pH 9,1, para las isoformas 1 y

IV, y pH 6,5 para la isoforma III. Todas las muestras se filtraron a través de filtros de 0,45 ¡m de

diámetro de poro, como paso previo a la realización de los espectros. Para sustraer la

fluorescencia del tampón se realizó una corrección de línea base.

Los espectros se registraron empleando alternativamente como longitud de onda de

excitación 257. 275 y 295 nm. Para realizar el espectro simultáneo de emisión y excitación se

eligió un rango de longitudes de onda comprendido entre 410 y 285 nin para la emisión y entre

330 y 205 nm para la excitacion.

44

ILIO.- VALOHACION DE FENOLES LIQUEN ICOS MEDIANTE IIPLC

11.10.1.-Extracción de Fenolescon diferentes mezclasde

disolventesor2ánicos

11.10.1.1.-A partir de talos

Muestras de 0,3 g de talo fueron incubadas en 7,5 ml de tampón Tris-HCI 10 mM. pH 9,1,

conteniendo L-arginina 40 mM o cicloheximida 40 ¡iM, a 260C en oscuridad. A diferentes

tiempos, las muestras fueron lavadas superficialmente durante 5 mm con 1 5 ml de acetona a

temperatura ambiente. La fase acetónica se filtró a través de papel Whatman n0 2, fue secada en

corriente de aire y el residuo seco se almacenó a -1 30C hasta su utilízacion.

Una vez eliminados los fenoles corticales, se procedió a extraer aquellos retenidos en el

talo mediante tres pasos. En primer lugar, los talos fueron macerados con 15 ml de éter

dietílico acetato de etilo (65:3 5, y/y) durante 15 mm. La fase orgánica se filtró a través de papel

Whatman n0 2 y se guardó. El residuo sólido se maceró con otros 15 ml de

cloroformo : acetonítrilo (60:40, y/y) durante 15 mm. La fase orgánica fue filtrada como la

anterior y guardada y el residuo sólido fue nuevamente macerado durante ¡5 mm con

cloroformo : acetonitrilo (60:40, y/y). La fase orgánica se filtró y guardó como las anteriores.

Este último residuo sólido se descartó y las fases orgánicas mezcladas se llevaron a sequedad en el

mismo tubo. El extracto orgánico seco se almacenó a -130C hasta su utilización.

1110.1.2.-A partir del medio de incubación

Los fenoles segregados al medio de incubación, procedentes de talos incubados en las

condiciones descritas en el apartado anterior, fueron extraídos mediante reparto con diferentes

mezclas de disolventes orgánicos de la manera que se describe a continuación,

A cada medio (entre 5 y 6 mí) , se añadieron 10 ml de éter dietílico : acetato de etilo

45

(65:35. y/y) y después se agité fuertemente durante 30 s. La fase orgánica se recuperé y la fase

acuosa del medio se utilizó para una segunda extracción con 10 ml de clorotbrmo : acetonitrilo

(60:40, y/y). Después de otros 30 s de agitación fuerte, se recuperó la fase orgánica y los fenoles

remanentes en el medio fueron nuevamente extraídos con lO ml de cloroformo : acetonitrilo

(60:40, y/y). Las tres fases orgánicas se recogieron en el mismo tubo y se llevaron a sequedad

bajo corriente de aire El residuo orgánico seco se alínacenó a -130C hasta su utilización.

IL1O.1.3.- A partir del extracto libre de células

Para la valoración de los fenoles liquénicos presentes en los extractos libres de células

procedentes de talos y medios de incubación, fragmentos de talo de 0,3 g de peso seco se hicieron

flotar en los medios descritos en el apartado 11.2 durante diferentes tiempos. El tiempo de

incubación fue aquel donde existía la mayor actividad de cada isoforma de arginasa:

i) 6 h para las isoformas 1 y 11, recogiendo el talo.

it) 16 h para la isoforma 111, recogiendo el talo.

iii) 8 h para la isoforma IV, recogiendo el medio de incubación.

El extracto libre de células se obtuvo según lo descrito en los apartados 11,5.1.1, 11,5.2.1 y

11.5.3.1, respectivamente, tras haber eliminado los fenoles corticales de acuerdo con el apartado

11. lO. 1. 1. Los fenoles presentes en los extractos fueron extraídos mediante reparto en fases

orgánicas, según lo descrito en el apartado II.lO.l.2. Una vez eliminados los fenoles corticales, en

el talo todavía se pueden localizar fenoles extracelulares. Estos fenoles se encuentran cristalizados

sobre las paredes del micobionte y del fotobionte y pueden disolverse parcialmente en el proceso

de obtención del extracto libre de células. Con objeto de valorar la contribución aproximada de

los fenoles extracelulares a dicho extracto, se procedió a retirar los fenoles corticales (apartado

11.10.1.1); macerando ligeramente los talos a continuación con 5 ml de éter etílico: acetato de

etilo (65:35, y/y) durante 2 mm. La fase orgánica se filtré a través de papel Whatman n0 2 y se

guardó. El residuo sólido se lavé con 5 ml de cloroformo: acetonitrilo (60:40, y/y) durante 2 mm

y la fase orgánica fue filtrada como la anterior. Las dos fases fueron mezcladas y llevadas a

sequedad en el mismo tubo. El residuo sólido se utilizó para obtener un extracto libre de células

46

según lo descrito en losapartados 11.5.1.1, 11.5.1.2.1 y 11.5.3.1, respectivamente.

En la Figura 2 se puede observar el diagrama de flujo explicativo del proceso de

extracción de los fenoles.

11.10.2.- Estabilidad de los fenoles en disoluciones acuosas

La estabilidad de los fenoles liquénicos en medios acuosos se estudió en disoluciones de

fenoles patrón comerciales: atranorina, ácido evérnico (Sigma Chem.Co.) y ácido úsnico

(Sarsintex) de concentración conocida; tamponados con Tris-HO 0,1 M, pH 9,1, o bien, pH 6,5.

Las disoluciones se mantuvieron en agitación constante 120 h en oscuridad a 260C. Durante este

tiempo, se tomaron alícuotas cada 24 h y en ellas se valoré la concentración remanente de fenol,

así como la de sus posibles productos de degradación, mediante HPLC.

OHC OH H,C OH

HO O CCC O COOCH.

H. CH.

Atranorina

OH CH.

14.C-.O O COO O COOH

CH. OH

Acido evérnico

Acido usnico

47

con 1 5 mleteretílico/acetatoetilo(65135,vA)

Iii trar por Whalniann’2

Macerari 5 mm5 ni1 dc

cl o,’olorn,<,!acetomtnlo<6(1/40. y/y)

Filtrar porWhatnnrnn’’2

Macerar1 5 ¡mucon 1 5 ml dcclOr<>t<MTflO/aCCt<),1,tflIO(60/4<).y/y)

FiltrarporWhatxnann”2

tI tul éteretiicc¡aeetatoetilo

Agitar 3<)

Reposar315 mm

o tul clorIor¡no/

(611/40, vN)

Agitar 30

Rej>osar3<) mio

lO ¡INI cIotoÍónuo/accíota1 ri.I e

(6<1/40. NC/VI

Reposar30 mm

Agitar 30

Fig. 2.- Diagrama de flujo de extracción de fenoles

48

11.10.3.-Espectrodeabsorciónultravioletade fenolesIiauénicos

La obtención del espectro ultravioleta de las distintas isoformas (1, III y IV) de arginasa se

llevó a cabo en cubetas de cuarzo de 10 mm de paso óptico (Starna Ltd.), empleándose un

espectrofotómetro Varian DMS 90. La determinación se realizó empleando una concentración de

0,1 mg~mh1 de atranorina, ácido evérnico y ácido úsnico, disuelta en una mezcla de agua: ácido

acético (99:1, v/v)/acetonitrilo (70/30, y/y). Las muestras se filtraron a través de filtros de 0.45

gm de diámetro de poro. Para sustraer la absorción de la fase móvil se realizó una corrección de

la línea base del espectro.

11.10.4.-Valoración de fenoleslionénicosmediante IIPLC

El análisis y cuantificación de sustancias liquénicas se llevó a cabo mediante HPLC, en un

cromatógrafo de líquidos Varian 5060, equipado con un integrador Vista CDS 401 (Varian), bajo

las siguientes condiciones de análisis:

i) Columna: Fase reversa, Nucleosil 5C8 (Scharlau)

• Diámetro de partícula: 5 ~.tm.

• Dimensiones: longitud: 125 mm,

u diámetro interno: 4 mm.

u) Fase móvil: Agua-HPLC : ácido acético (99: l,v/v)

/acetonitrilo (30/70, y/y).

iii) Flujo: 0,7 mbínin1.

iv) Temperatura: 26’C.

y) Presión: 60 atm.

vi) I)etector: Uy; - de O a 2,6 mm a 270 nm.

- de 2,6 mm a lO mm a 280 nm.

UAFE: 0,002.

vii) Volumen de inyección: lO ~d.

49

viii) Como patrón externo se utilizó ácido o-ftálico a una

concentración fija de 0,05 mgmh1, o el fenol que se

indique en cada caso (atranorina 0,02 mwmk1; ácido

evérnico 0,01 mgnik1).

La cuantificación de atranorina, ácido evérnico y ácido úsnico se llevó a cabo mediante la

interpolación de la respuesta del detector, en cuentas de área, en una recta de calibrado construida

con cada uno de los fenoles comerciales patrón indicados en el apartado 11.10.2.

¡LII.- CINETICA DE SATLJRACION EN AUSENCIA DE EFECTORES

El efecto de la concentración de sustrato (L-arginina) sobre las isoformas 1 (ya que las

isoformas 1 y II demostraron ser prácticamente iguales), III y IV de arginasa se estimó en

mezclas de reacción conteniendo enzima purificada y concentraciones crecientes de L-arginina

entre 1,0 y 9,0 mM, según la isoforma. Las mezclas de reacción, en un volumen final de 3 mi,

contenian: lO pmoles de tampón Tris-HCI (pH 9,1, para las muestras incubadas en L-arginina 40

mM o bien pH 6,5 para las ¡nuestras que fueron incubadas en cicloheximida 40 MM); 7,5 umoles

de ácido ¡naléico: 5,0 jamoles de sulfato de manganeso; 33,8 mg de ureasa cristalina; 20,0 ~.tgde

proteína liquénica y las siguientes concentraciones de sustrato:

- entre 0,5 y 3,5 pmol (isoforma 1)

entre 0.5 y 4,5 pmol (isoforma III)

- entre 0,5 y 4,5 pmol (isoforma IV)

Las mezclas se incubaron a 300C y la reacción fue detenida, tras 25 mm, mediante la

adición de K2C03 a saturación. Después se dejaron transcurrir 2 h para completar la difusión del

amonio formado y posterior fijación sobre F12S04 0,02 N, según el método de microdifusión de

Conway (1962).

Como control se prepararon mezclas de reacción en las cuales el sustrato era sustituido

por igual volumen de tampón al pH correspondiente en cada caso. La valoración cuantitativa del

amonio resultante se estimé de idéntica manera a lo descrito en el apartado 11.3.

50

11.12.- CINETICA DE SATURACION EN PRESENCIA DE EFECTORES:

ATRANORINA, ACIDO EVERNICO Y ACIDO tISNICO.

Para estudiar el efecto de la concentración de L-arginina sobre las isoformas 1. 111 y IV de

arginasa en presencia de los distintos efectores (a concentración fija) se incubaron mezclas de

reacción que contenían enzima purificado, efector y concentraciones variables de sustrato, Las

mezclas de reacción, en un volumen final de 3 mí, contenian: 5 gmoles de tampón Tris-1-ICI (pH

9,1 para las muestras incubadas en L-arginina 40 mM o bien pH 6,5 para las muestras incubadas

en cicloheximida 40 pM); 7,5 j.tmoles de ácido maléico; 5,0 gmoles de sulfato de manganeso;

33.8 mg de ureasa cristalina; 20,0 ~.tgde proteina liquénica y la concentración de efector que se

especifica en la Tabla 1:

TABLA 1

ISOFORMA DEARGIN AS A

EFEC TOR

ATRANORINA ACIDOEVERNICO

ACIIDO USNICO

0,10* 0,39 0,52

III 0.57 1.17 1,41

IV 5,06 3,46 3,82

* umol dc electorcii la mezcla dc reaccion

de reacción en las cuales el elector era

para las isoformas 1 y IV ó bien pH 6,5

Como control se utilizaron las mismas mezclas

sustituido por 60 Mmoíes de tampón Tris-HCI, pH 9.1,

para la isoforma III.

Tras 20 mm de preincubación enzima-elector a 300C. se añadió el sustrato (L-arginina) en

el rango de concentraciones especificada en el punto II. II. de este mismo apartado. Las mezclas

se mantuvieron otros 25 mm a 300C y tras este tiempo se detuvo la reacción añadiendo K2C03

saturado. La valoración cuantitativa del amonio resultante de la reacción se efectuó según lo

descrito en el apanado 11.3.

51

1I.t3.- DETERNIINAC[ON DE LA CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN (Km) Y LA

VKLOCIDAD MAXIMA ~~‘maODE LAS DIFERENTES ISOFORMAS DE

ARGINASA

Para el cálculo de K1~ y ~nNaxse eligieron las siguientes representaciones gráficas:

TABLA II

REPRESENTACIONGRAFICA

ORDENADAS (y) ABSCISAS (x)

Michaelis-Menten y0 [sa]

Hanes [s0]/v0 [sa]

Eisenthal-Cornish-Bowden

y

justificando, en cada caso, el empleo de una u otra.

La representación de Hill (log( )~ y0frente a log [so])se eligió, como primera

aproximación, para explicar la existencia de cooperatividad de las diferentes isoformas de

arginasa.

A partir de estas mismas representaciones gráficas se calcularon K~(ap) (1<¡u aparente, en

presencia del elector) y ví~ax(ap) (vniax aparente en presencia del efector).

11.14.-ESTUDIOS DE LIGAMIENTO

Con objeto de estimar la afinidad entre los distintos efectores (atranorina, ácido evérnico y

ácido úsnico) y la proteína (isoformas 1, III y IV de arginasa) se realizaron estudios de ligamiento

mediante el procedimiento clásico del equilibrio de diálisis,

.52

11.14.1.-Preparación de la membrana de diálisis

La membrana, de celulosa regenerada, suplementada en glicerol (Tubo Visking 27/32,

Serva), se cortó en trozos de 6,0 cm de diámetro y se calentó a 700C en agua destilada durante 1

hora. El proceso se repitió. Después se transfirió nuevamente a agua destilada y se mantuvo a

temperatura ambiente durante 10 h. Por último la membrana se dejó en tampón Tris-1-ICI 0,1 M,

pH 9,1 (para isoformas 1 y IV) o pH 6,5 (para la isoforma III) hasta su utilización (entre 20 y 24

11.14.2.- Células dediálisis

t.as células de diálisis, dos submitades (A y B) de metacrilato, se fabricaron

artesanalmente; admitiendo cada mitad exactamente 1,0 ml de volumen (Fig. 3). Ambas mitades

quedaron separadas por la membrana semipermeable y permanecieron herméticas, con objeto de

evitar alteraciones de volumen, una vez rellenas con la proteína y el ligando.

11.14.3.- Determinación del tiempo de equilibrio

Para determinar el tiempo de equilibrio se rellenaron las dos submitades (A y B) de las

células de diálisis con una disolución de concentración fija de proteína en A:

- 2.55 gM de isoforma ¡

- 1,42 gM de isoforma III

- 1.50 ~iMde isoforma IV

y la misma concentración de ligando (atranorina, ácido evérnico o ácido úsnico) en B. Se

prepararon 20 cámaras de la misma manera y éstas se pusieron en agitación lenta a temperatura

ambiente, recogiendo el ligando libre en equilibrio en las dos subcámaras tras 1-20 h en las

condiciones descritas. LI tiempo de equilibrio se definió como aquel después del cual la

concentración de ligando libre recuperado de ambas subeámaras era el mismo. Con objeto de

descartar la auto-asociación del ligando (atranorina, ácido evérnico o ácido úsnico) se determinó

el tiempo de equilibrio en ausencia de la proteína: en este caso la subcámara A se rellené con

53

QL

Figura 3.- Representación gráfica del principio del equilibrio de

diálisis. En el medio se encuentra la membrana de

diálisis que es permeable al ligando. L (atranorina,

ácido evérnico y ácido úsnico) pero no a la proteína. P

(isoformas 1, III y IV de arginasa).

54

tampón Tris-HCI 0,1 M, pH 9.1 o pH 6,5. El tiempo de equilibrio obtenido en estas condiciones

no difirió en más de una hora respecto al calculado en las otras condiciones.

La extracción del fenol se llevó a cabo según lo descrito en el apartado 11.10.1.3.,

valorándolo cuantitativamente mediante HPLC (apartado 11.9.3.).

11.14.4.-Cálculo del li2ando unido

Para cada subcámara A (subcámara de la proteína) y B (subcámara del ligando) se

realizaron los siguientes cálculos:

a) Subcámara de la proteína (A):

• Pt moles totales de proteína (la indicada en el apartado

11.14.3>

• ¡U concentración de ligando libre en equilibrio

• Vt[LI moles totales de ligando libre en ambas

subeámaras (el mismo en A y 8)

• L~ = moles de ligando unido a la proteina

Lt - Vt[LI

• r ~‘r moles de ligando unido por mol de proteina

b) Subcámara del ligando (B):

• [Lii concentración inicial del ligando en su

compartimento (FIM)

• Lt moles totales de ligando en su compartimento

• [U] concentración de ligando libre en equilibrio

• V< volumen total de la subcámara (1 mí)

Vt[LI moles totales de ligando libre en ambas

subcámaras (el mismo en A y B)

La preparación de concentraciones crecientes de ligando total requiere especial atención

ya que la solubilidad de los fenoles en disoluciones acuosas es muy baja y se puede correr el

riesgo de precipitación no deseada durante el equilibrio de diálisis. En el diagrama de flujo

55

siguiente se explica el proceso seguido de forma detallada.

Preparación de concentraciones crecientes de ligando total:

conccíígracionescrecientesdc ligandoen disolucioneslamponadascon iris—! ¡CI. (P~0 1 para isobitHa II e ¡t4Oléi’tlltt IV o pI1 6,5 para isolérmaiii deargínasa1

Agitación enoscuridada teníperníura ambiente

durairle24o 48 Ir

1~ii Itraci6,, a través de

ti ¡ (ros 0.45 k’ nl (dii meir dc polo)

1 ________________________________________________

1 uvecciondc 1) o~cii sistema HPI.C

4/Scí

U t>iflali vái’ica

(‘ter apartadou .104>

1~(1 IANiiI”It/AUION

SL4rtcc,owpa repartoen

faseor5anie¡I

~a ¡panado¡¡101.2)

4/Secado faseorgánicaen

caí rl c rile dc ai rc

51/Resuspeosión del ~ din, ci’ 0.2 mi

de firsemdvii agoa-Iii’I.C ácidoacético

(0<) i x) ~‘cctoníiríIo(30/70. y)

4/1,í”eceióri de ~0<¡í¡ii en

sistema¡¡PI (1

4/Separación ci’oniatográiica

ver apartado11.10.4)

4/CIJANTIIICACJON

2

a citan) iiica ci60 sin extracción previa da íes’’ 1 tadosalea)orios a tí ‘e la haíída cnanalogrófl ca esdc ira (tirale/a

distin la a la fasemdxii empleada ci el procesodesqaracón.

2 (‘¡í~mniític,ícióíí t<>t’iet’tíi

56

I.a cuantificación del ligando total ha de ser un paso previo al equilibrio de diálisis

y. en función del rendimiento obtenido en el proceso de preparación, calcular la concentración

inicial de ligando que estará en contacto con la proteína durante el proceso de ligamiento,

Transcurrido el tiempo necesario para la obtención de concentraciones iguales de ligando

libre (equilibrio) en las dos subcámaras (ver apartado 11,14.3), el proceso se detuvo extrayendo el

ligando libre de las subcámaras A y B y la proteina con ligando unido (en el caso que se indique)

de la subcámara A.

La extracción del ligando libre se realizó mediante reparto en fase orgánica (apartado

11.10.1.2> cuantificándolo por I-IPLC mediante interpolación del número de cuentas de área en la

recta de calibrado correspondiente.

La disolución conteniendo proteína con ligando unido se llevó a sequedad en corriente de

nitrógeno. El residuo seco se resuspendió en agua-HPLC (agua utilizada en la preparación de la

fase móvil para cromatografla de exclusión molecular) y se inyectó en la columna. cromatográfica

(configuración (b) del apartado 11.8 de Material y Métodos). El volumen de elución relativo de los

diferentes picos obtenidos se interpolé en la recta de calibrado correspondiente a las columnas

diol GF450-6F250 con objeto de calcular su peso molecular (Mr).

11.14.5.-Representacionesilráficas de los datosde li2amiento

La gráfica de saturación se obtuvo representando los moles totales de ligando unido (Lp)

frente al ligando total (Lt), obteniéndose una hipérbola.

Con objeto de estimar la respuesta biológica de la proteína al ligando elector, se eligieron

las siguientes representaciones gráficas (Tabla III), una vez alcanzada la correspondientc

saturación isoforma de arginasa/fenol.

57

TABLA III

REPRFSENTACIONGRÁFICA

ORDENADAS(y) ABSCISAS (x)

Dobles-inversas r [U 1

Logarítmica r log IL)

Scatchard rI[LJ y

El número de sitios de unión por molécula de proteína (n) se estimó como la inversa del

punto de corte con el eje de ordenadas en la representación de dobles inversas (Klotz y Hunston,

1971)

11.14.6.-Análisis estadísticosy procesodedatos

Con el conjunto de los valores obtenidos (n=3) para los diferentes ensayos, se calculó la

media aritmética (valor representado o dato numérico) y la desviación típica (indicada mediante

una barra para cada valor en las representaciones gráficas o por números en las tablas). El

coeficiente de variación media obtenida resultó ser 8,6% (oscilando entre valores del 1% y 20%).

Se procedio a estudiar la significación de los datos (nivel de significación del 95%)

mediante análisis de varianza o test de Newman-Keuls (paquete estadístico Kiwikstat 1.0, para

ordenadores IBM AT)

El ajuste de rectas fue realizado por el método de mínimos cuadrados. Se aplicó el test de

Student para comprobar que las pendientes eran significativamente diferentes.

Hl.- RESULTADOS

59

111.1.- I’URIFICACION Y CARACTERIZACION DE LAS DIFERENí’ES ISOFORMAS

DE ARGINASA

En este bloque se presentan las Figuras 4 a 24 y las

Tablas ¡VaX

60

Se detallarán en primer lugar las características particulares de cada isoforma y después se

analizarán las cualidades espectrofotométricas y espectrofluorimétricas de todas ellas en conjunto.

111.1~1.-Purificación y caracterizaciónde las isoI’ormas 1 y II de arainasa

Las isoformas 1 y II de arginasa han sido purificadas a partir de extractos libres de células

procedentes de talo de I’i. prunastrí tras su incubación en disoluciones tamponadas de L-arginina.

40 mM durante 6 h en oscuridad (apartado ¡¡.5 1.>. En la Tabla IV se muestran los resultados

obtenidos.

El extracto libre de células, concentrado a 150 ml de volumen, se precipitó con sulfato

amónico a distintos porcentajes de saturación; el sobrenadante correspondiente al 85% (p/v)

resultó contener la mayor actividad arginasa. Dicho sobrenadante se adsorbió sobre gel de fosfato

cálcico, eluyendo del mismo las isoformas 1 y LI con tampón Iris-HCI, pH 9,1, de molaridades 0,1

M y 2,0 M, respectivamente. Cada una de estas fracciones se concentró y fue electroenfocada,

como último paso en el proceso de purificación. Las isoformas 1 y II de arginasa fueron

purificadas 148 y 359 veces, con rendimientos del 4,5% y 1,80 o, respectivamente. Las fracciones

obtenidas del eiectroenfoque en columna se emplearon como fuente de proteína pura para los

estudios de caracterización cinética posterior.

El proceso de purificación se analizó de forma paralela en HPLC-exclusión molecular en

una columna TSK (1-5000 PWXL. La Figura 4 A-D muestra los resultados obtenidos. El

cromatograma correspondiente al extracto libre de células muestra 4 picos mayoritarios, los

cuales no se corresponden con proteína pura por la mera observación de su asimetría. El pico que

eluye a 31,54 mm representa la arginasa contaminada con otras proteínas. En la Figura 4 C y 4 D

se representan los cromatogramas procedentes de las arginasas 1 y II obtenidas tras desorción con

Tris-HCI 0,1 M y 2,0 M, pH 9,], respectivamente, del gel de fosfato cálcico. En C, los 3 picos

que eluyen tras 32 mm corresponden al tampón, el cual presenta una fuerte absorción a 280 nm

debido a su grupo amino (pK Tris = 8,1). Tras diálisis frente a agua-HPLC durante 2 h, no se

61

observan estos picos~; fenómeno que viene representado en la Figura 4 D. Los picos mayoritarios

en las Figuras 4 U y 4 1) representan el 99,9% y 99.000, respectivamente, de proteína inyectada.

IIJ.LI.l.- Determinación del punto isoeléctrico

El punto isoeléctrico (pl) de las isoformas 1 y II de arginasa fl~e determinado mediante

electroenfoque en columna y corroborado por electroforesis capilar.

En la Figura 5 se representa el electroenfoque correspondiente a la isoforma 1. De las dos

fracciones, cuya concentración de proteina fue superior a 10,0 ~igmL1, sólo aquella eluida a pH

5,86 presentaba actividad arginasa (112,9 unidades>. El pl de la isoforma ide arginasa es de 5,86.

El punto isoeléctrico de la isoforma 11 de arginasa es de 5,8, ya que a este pH eluye el

único pico con actividad arginasa (275,4 unidades) (Fig. 6).

La estimación del punto isoeléctrico mediante electroforesis capilar (FC) presenta la

ventaja, sobre el electroenfoque en columna convencional, de una muy superior eficacia (5.500

platos teóricos para el pico de la isoforma 1 de arginasa en FC frente a 15,0 platos teóricos en

electroenfoque en columna para el mismo pico) Por otro lado, al ser los picos tan eficaces es

posible separar proteinas de pí muy similar con una gran resolución. Sin embargo, la FC tiene la

desventaja de, al ser una técnica de microanálisis, admitir pequeños volúmenes y bajas.

concentraciones de muestra (volúmenes de inyección 36 nl) a inyectar en el capilar. El problema

se soslaya en parte empleando capilares de sílice de mayor diámetro interno, pero en éstos, la

disipación del calor producido por el efecto Joule es más dificil, requiriendo el aparato un mejor

sistema de refrigeración. En la Figura 7 A y B se representan los esquemas de capilares de sílice

fundido recubierto de poliimida con distinto diámetro interno, 75 y 50 um empleados en la

valoración de! pl de las isoformas de arginasa. A la vista de los electroforegramas de ambos

capilares, se eligió el capilar de sílice de 75 gm de diámetro interno con un recubrimiento externo

de 60 ~m de poliimida y una longitud de 60 cm (Fug. 7A). La vida media de utilización del capilar

es función de n1uchas variables: fuerza iónica del tampón empleado como electrolito, temperatura

y voltaje aplicados, naturaleza de la muestra, etc. Por ello, es conveniente evaluar e! estado del

62

capilar tras varios análisis con objeto de comprobar si sus características estructurales son las

iniciales. Al microscopio óptico se pueden observar las posibles alteraciones. En la Figura 8 se

representan algunas de ellas, donde la situación más grave (Ng. 8 1) es la ruptura del tubo interno

que ocasiona una interrupción automática de flujo, hecho que ocurre con más frecuencia en

capilares de 50 im (Ng. 7 B). La vida media de uso se estimó en aproximadamente lOO

inyecciones en los capilares de 75 ~m donde el diámetro total, contabilizado el recubrimiento

externo es de 190 M~

En la Figura 9 A se representa el electroforegrama correspondiente a la isoforma 1 de

arginasa obtenido a 300C y 25 kV de voltaje aplicado, empleando como electrolito tampón borato

sódico 15 mnMlácido fosfórico; pH 7,1. La arginasa ¡ eluye en estas condiciones a 6,85 mm con

carga negativa. Cuando el electrolito empleado es tampón borato sódico 25 mM, pH 9,0, a 300<?

y 17 kV de voltaje aplicado, la isoforma 1 eluye a 11,16 mm, con carga negativa también (Fig. 9

B).

El tiempo de retención se transformó en movilidad electroforética (Me ) según lo descrito

en el apartado 11.6.2 de Material y Métodos. La interpolación de Me en Ja correspondiente recta

de calibrado (Fig. ¡O A. a pH 7,1 y Fig. 10 B a pH 9,0) construida con proteínas de punto

isoeléctrico conocido dio valores de pl 5,3 y pl 4,5, respectivamente. El valor medio,.

pI 4,9, se eligió corno punto isoeléctrico determinado en electroforesis capilar.

La concentración de isoforma de arginasa 11 no fue suficiente como para deducir su pl en

FC ya que, como se ha comentado anteriormente, el volumen de inyección que admite el capilar

es muy pequeño y la concentración de proteína en ese volumen no era suficiente para detectar

pico significativo de altura superior a la relación señal/ruido del detector, No obstante, los

mejores electroforegramas obtenidos indicarian un pl alrededor de 5,0.

111.1.1.2.- Composición de aminoácidos

La composición de aminoácidos de las isoformas 1 y II de arginasa se estimó a partir de las

fracciones del electroenfoque en columna, mediante el análisis de los productos obtenidos por

63

hidrólisis ácida a 24 h. Los resultados se recogen en la Tabla V. Las dos isoformas poseen una

composición semejante, ya que el porcentaje de moles de la mayoria de los aminoácidos es

similar. Las mayores diferencias se encuentran en Ser, Glx, Gly, Leu y ~1yr.El porcentaje de

moles más elevado corresponde a los restos ácidos, Asx y Clx, que representan el 11,4 y el

16,6%, respectivamente, en la isoforma de arginasa 1 y el 10,4 y 11,7%, respectivamente, en la

isoforma II.

Otro aspecto a destacar de la composición de aminoácidos es la elevada proporción de

residuos con grupos polares, Ser y Gly, los cuales representan el ¡0,4% y 15,6%,

respectivamente, en la isot’orma 1 y el 6,5% y 11,7%, respectivamente, en la isoforma 11. La Cys

representa el 1,3% y 1,9%, respectivamente, en las isoformas 1 y 11. El número de residuos de l’rp

por cadena polipeptidica es de 1 en la isoforma 1 y de 3 en la isoforma II.

111.1.1.3.- Determinación del pesomolecular

El peso molecular de las isoformas 1 y ¡1 de arginasa nativas fue estimado mediante

exclusión molecular en HPLC utilizando dos tipos de columnas: a) una columna TSK G5000

PWXL y b) dos columnas en serie Zorbax-diol, según la configuración y condiciones de análisis

descritas en el apartado 11.8 de Material y Métodos. El peso molecular de las isoformas

desnaturalizadas con SDS al 1% (p/v) fue calculado utilizando sólo la configuración b)

equilibrando la columna con SDS al 1% (p/v). Las figuras II y 12 muestran los cromatogramas

de proteínas patrón de peso molecular conocido separadas en las columnas [SK a) y Zorbax-diol

b), respectivamente.

La columna 15K G5000 PWXL proporciona una mayor retención que las columnas

Zorbax-diol GF450-GF2SO, ya que la tiroglobulina (Mr6ÓO kDa) eluye a 22,5 mm y el

citocromo c (Mr 12,4 kDa) a 33,4 mm (Fig. II). Entre ambas proteínas, el tiempo de retención

es de 11,0 mm. Las mismas proteínas, tiroglobulina y citocromo c, eluyen a 14,3 mm y 23,3 mm,

respectivamente, en las columnas Zorbax-diol, lo cual indica que el tiempo de retención entre

ambas es de 9.0 mm (Fig. 12). Sin embargo, la eficacia de los picos es mayor en las columnas con

64

fase estacionaria de tipo diol, según se deduce del número de platos teóricos calculado para cada

columna (tabla VI).

Las fracciones del electroenfoque correspondientes a las isoformas 1 y II de arginasa

(Tabla IV y Figs. 5 y 6), fueron dializadas en agua-1-IPLC durante 2 h y después concentradas.

Las formas de arginasa nativa y la desnaturalizada con SDS al 1% (p/v) se inyectaron en las

columnas correspondientes. según lo descrito anteriormente. En la Figura 13 se muestran los

resultados obtenidos en las columnas Zorbax-diol 0F450-GF250. El pico mayoritario de SDS al

10/o (p/v) eluye a ¡4,4 mm, ya que forma una especie de lagregado micela? de elevado peso

molecular en la fase móvil (Fig. 13 A). La isoforma 1 de arginasa eluye tanto nativa (Hg. 13 B)

como desnaturalizada (Fig. 13 U) a 21,9 mm; los tres picos que eluyen antes que la proteína

corresponden a los distintos grados de agregación de la micela de SDS. El tiempo de retención de

la isoforma ¡1 de arginasa, tanto nativa como desnaturalizada, fue de 22,2 mm.

La interpolación de los valores del volumen de retención relativo de la isoforma 1 de

arginasa nativa (1,89> y de la isoforma 11 de arginasa nativa (1,91). obtenidos en la columna TSK

y los obtenidos en las columnas Zorbax-diol (1,77 y 1,79, respectivamente), en las rectas de

calibrado correspondientes (Figs. 14 A y 13, respectivamente>, permitió estimar el peso molecular

de las isoformas 1 y 11 de arginasa en 18,0 kDa y 16,0 kDa, respectivamente. Los volúmenes de

retención relativos de las isoformas 1 y U desnaturalizadas con SDS, obtenidas en las columnas

Zorbax-diol, fueron los mismos que los de las formas nativas. Las isoformas 1 y II de arginasa

están compuestas de una sola subunidad, según se deduce de su tratamiento con SDS.

111.1.2.- Purificación y caracterización de la isoforma III dearainasa

La isoforma III de arginasa tite purificada a partir de extractos libres de células

procedentes de talos de E. prunastrí tras su incubación en disoluciones tamponadas de

cicloheximida 40 MM durante 16 h en oscuridad (apartado 11.5.2.>. En la Fabla VII se muestran

los resultados obtenidos.

65

El extracto libre de células se concentró a 150 ml y se sometió a fraccionamiento con

diferentes porcentajes (p/v) de sulfato amónico, La mayor actividad arginasa se obtuvo en el

sobrenadante correspondiente al 70% (p/v) de saturación de la sal. Dicho sobrenadante se

adsorbió sobre gel de fosfato cálcico, eluyendo del mismo la mayor actividad arginasa con tampon

‘Iris-HUí 0, 1 6 M, pH 6,5 Esta fracción se concentró y fue electroenfocada en columna, como

último paso en el proceso de purificación. Del electroenfoque se obtuvieron dos fracciones con

actividad arginasa; una de ellas con actividad específica de 66,1 unidades y la otra con 11,2

unidades. A partir de este momento, se eligió la fracción de mayor actividad arginasa, a la cual se

denominó isoforma 111, para análisis posteriores. La isoforma III de arginasa se ha purificado 259

veces con un rendimiento del 2%.

Los distintos pasos del proceso de purificación fueron analizados paralelamente mediante

HPLC en una columna de exclusión molecular TSK 05000 PWXL. La Figura 15 A-U muestra los

resultados obtenidos. Los cromatogramas correspondientes al extracto libre de células (Fig. 15 A)

y al sobrenadante de sulfato amónico al 70% (p/v) (Fig. 15 13) muestran diferentes picos

correspondientes a distintas proteínas. En la Figura 15 C se muestra un pico mayoritario, el cual

representa el 95% aproximadamente, que eluye a 28,5 mm y corresponde a la isoforma [11de

arginasa; el pico que eluye a 38 mm corresponde al tampón contenido en la muestra.

111.1.2±-Determinación del punto isoeléctrico

El punto isoeléctrico (pl) de la isoforma III de arginasa fue determinado mediante

electroenfoque en columna y corroborado por EC.

En la Figura 16 se representa el electroenfoque de la fracción de arginasa de 66,1 unidades

de actividad obtenida tras desorción con tampón “l’ris-HCI 0,16 M, pH 6,5 del gel de fosfato

cálcico. Como puede observarse, se detectan tres fracciones cuya concentración de proteína oscila

entre 25,0 y 60,0 ~gmh1, pero sólo dos de ellas presentan actividad arginasa (66,1 unidades la

que eluye a pH 6,18 y 11,2 unidades la que eluye a pH 4,68). El valor de pH al que eluye la

66

fracción con mayor actividad arginasa fue estimado como pl de la isoforma 111 de arginasa (pl

— 6 18).

En la Figura 1 7 A y 13 se representan los electroforegramas correspondientes a la isoforma

111 de arginasa utilizando capilares de 75 pm de diámetro interno (Fig. 7 A), Cuando el electrolito

empleado es tampón borato sódico 15 mM/ácido fosfórico, pH 7.1, Ja temperatura 300C y el

voltaje 25 kV, la arginasa eluye a 6,33 mm (Fig. 17 A), lo que demuestra que está cargada

negativamente. Si el electrolito empleado como fase móvil es tampón borato sádico 25 mM, pH

9,0, a 300C y aplicando 17kV. el pico de arginasa eiuye a 10,33 mm (Hg. 1713). lo cual vuelve a

indicar que está cargada negativamente.

Los tiempos de retención, 6,33 mm y 10,33 mm se transformaron en Me’ en función de las

dimensiones del capilar (apartado 11.6.2 de Material y Métodos). La interpolación de la movilidad

electroforética en la correspondiente recta de calibrado a pH 7,1 (Fig. 18 A) y pH 9,0 (Fig. 18 B)

permite deducir un valor medio dep1 entre 5,0 (con electrolito a pH 7,1) y 5,7 (con electrolito a

pH 9,0). El valor de pl de la isoforma 111 de arginasa, detenninado mediante EC es de 5,35.

111.1.2.2.- Composición de aminoácidos

La composición de aminoácidos de la isoforma 111 de arginasa se estimó a partir de la

fracción del electroenfoque en columna que contenía mayor actividad (66,1 unidades), mediante el

análisis de los productos obtenidos por hidrólisis ácida a 24 h. Los resultados obtenidos se

recogen en la Tabla VIII. La enzima es rica en aminoácidos con grupos no polares, como son Ala

(~o moles 8,7), Val (% moles = 6,6) y Leu (% moles = 7,2), aminoácidos, por otra parte, típicos

de pre-proteina. La isoforma III de arginasa presenta menor proporción de residuos ácidos, Asx y

Glx, que las isoformas 1 y II. El contenido en Ser (6,6%) y Gly (11,2%) también es elevado

respecto a otros aminoácidos. La Cys representa el 2,7% del total. El número de residuos de ‘Frp

por cadena polipeptídica es de 9.

67

111.1.2.1-Determinación del pesomolecular

El peso molecula.r de la isoforma III de arginasa fue estimado mediante HPLC-exclusión

molecular utilizando dos tipos de columnas: a> una columna 15K G5000 PWXL y b) dos

columnas en serie Zorbax-diol GF450-GF250, según la configuración y condiciones de análisis

descritas en el apartado 11.8 de Material y Métodos. El peso molecular de la isoforma 111

desnaturalizada con SDS al 1% (p/v) tite calculado utilizando sólo la configuración b)..

equilibrando la columna con SDS al 1% (p/v).

La fracción del electroenfoque (Tabla VII y Fig. 16) de mayor actividad arginasa,

correspondiente a la isoforma 111, fue dializada frente a agua-HPLC durante 2 h y después

concentrada. La forma nativa y la enzima desnaturalizada con SDS al 1% (p/v) se inyectaron en

los dos sistemas de columnas descritos anteriormente. La interpolación del valor del volumen de

retención relativo de la arginasa nativa (1,71), obtenido en la columna 15K y el obtenido en las

columnas Zorbax-diol (1,70) en las rectas de calibrado correspondientes (Figuras 19 A y 13,

respectivamente), permitió estimar el peso molecular de la isoforma ¡U de arginasa en,

aproximadamente, 26.0 kDa. El peso molecular deducido de cada columna difiere en — 1,0 RDa.

El volumen de retención relativo de la isoforma III desnaturalizada con SDS, obtenido en las

columnas Zorbax-diol, fue el mismo que el de la forma nativa (1,68). La isoforma III de arginasa

está compuesta de una sola subunidad, según se deduce de su tratamiento con 51)5.

111.13.- Purificación y caracterización de la isoforma IV de ar2inasa

La isoforma IV de arginasa fue purificada a partir de extractos libres de células

procedentes de los medios de incubación de talos sumergidos en disoluciones tamponadas de

L-arginina 40 mM durante 8 h en oscuridad (apanado 11.5,3. de Material y Métodos). En la Tabla

IX se muestran los resultados obtenidos.

El extracto libre de células se concentró a 310 ml y se sometió a fraccionamiento con

sulfato amónico de diferente porcentaje de saturación, entre el 10% y el 95% (p/v). La mayor

68

actividad arginasa se observó en el sobrenadante correspondiente al 50% (p/v) de saturación de la

sal. Dicho sobrenadante se adsorbió sobre gel de fosfato cálcico, eluyendo del mismo la mayor

actividad arginasa con tampón Tris-HCI 0,14 M, pH 9,1. Esta fracción se concentró y fue

electroenfocada en columna, como último paso en el proceso de purificación. Del electroenfoque

en columna se obtuvieron tres fracciones con actividad arginasa: una de 26,2 unidades, otra de

9.6 unidades y otra dc 123.2 unidades. A partir de este punto, se eligió la Iraecion de mayor

actividad específica < 2 ~. 2 unidades). a la ctiaí se denomino isotornia l\ de an.zi nasa, ~nn~

íoí es =tna¡isís l)iclia aI’u¡nasa La sido purificada Oíd veces con un ¡endi m¡eíito del 5 (¡‘o.

aproximadamente

Los distintos pasos del proceso de purificación fueron analizados paralelamente mediante

HPLC en una columna de exclusión molecular TSK 65000 PWXL. La Figura 20 A-D muestra

los resultados obtenidos, Los cromatogramas correspondientes al extracto libre de células (Fig. 20

A) y al sobrenadante del 50% (p/v) de saturación de sulfato amónico (Fig. 20 13) muestran un

mayor número de picos que en las Figuras 4 A-B y 15 A-E, correspondientes a las isoformas ¡ y

III de arginasa, lo cual indicaría una gran secreción de proteinas al medio de incubación. En la

Figura 1 5 U se ¡nuestra el cromatograma correspondiente a la fracción de arginasa desorbida con

tampón Iris-HCI 0,14 M. pH 9,1, del gel de fosfato cálcico. En este caso, a diferencia de las

anteriores purificaciones, la pureza de esta fracción no es tan grande, ya que se pueden apreciar

claramente tres picos de tiempos de retención a 26,8, 29,55 y 29,85 mm, respectivamente, con

actividad arginasa. I’ras el electroenfoque, logra obtenerse la proteina pura, como demuestra el

cromatograma de la Figura 20 D, donde el pico en solitario que eluye a 29,85 mm representa el

99,9% frente al 32% del pico que eluye al mismo tiempo en la Fig. 20 C.

111.1.3.1.- Determinación del punto isoeléctrico

El punto isoeléctrico (pl) de la isoforma IV de arginasa fue determinado mediante

electroenfoque en columna y corroborado por EC.

69

En la Figura 2 1 se representa el electroenfoque de la fracción de arginasa de 68,9 unidades

de actividad <Tabla IX) obtenido tras desorción con tampón Tris-HUí 0,14 M, pH 9,1, del gel de

fosfato cálcico. Corno puede observarse, se obtienen tres fracciones de 26,2, 9,6 y 123,2 unidades

de actividad, cuya concentración de proteina oscila entre 25 y 65 ~gmh1. Estas tres fracciones

eluyen a pJ-l 8,3, 7.9 y 5,6, respectivamente. La fracción correspondiente a pH 5,6. valor que se

asimiló al pl, que presentaba la mayor activ¡dad arginasa. fue denominada isoforma IV.

eIl1j)leaiRh ise para los analisis poste! ioí’es

¡ 1 l:ís 1’ í~tíí as 1? A ~ [3 se representan los eleclroforegi’amas correspondientes a la

isoforma IV de arginasa utilizando capilares de 75 ~m de diámetro interno (Fig. 7 A). Cuando el

electrolito empleado corno fase móvil es tampón borato sódico [5 mM/ácido fosfórico, pR 7,1, a

30<’U y aplicando 25 kV de voltaje, la isoforma IV de arginasa eluye a 7,6 mm (Fig. 22 A), lo que

demuestra que está cargada negativamente. Si el electrolito utilizado es tampón borato sódico 25

mM, pH 9,0. a 3O~’C y con un voltaje de 17 kV, el pico de arginasa aparece a ¡0,5 mm (Fig. 22

13), lo que corrobora su carga negativa.

Los tiempos de retención, 7,6 mm y 10,5 mm, se transformaron en Me (apartado 11.6.2 de

Material y Métodos). La interpolación de la movilidad electroforética en la recta de calibrado a

pH 7,1 (Hg. 23 A) ya pH 9,0 (Hg. 23 13) permite determinar un valor de pl, en ambos casos, de

4,8 para la isotbrma IV de arginasa.

IILI.3.2.- Composicióndeaminoácidos

La composición de aminoácidos de la isoforma IV de arginasa se calculó a partir de la

fracción del electroenfoque en columna que poseía la mayor actividad (123,2 unidades), mediante

el análisis de los productos obtenidos por hidrólisis ácida a 24 h. Los resultados obtenidos se

recogen en la ‘Fabla X. La isoforma IV de arginasa es rica en aminoácidos ácidos, Glx y Asx, los

cuales representan el 14,9% y 11,6%, respectivamente, del contenido total. También presenta una

alta proporción de Ser (9,8%) y Gly (15,4%). Un aspecto a destacar de la composición

aminoacidica es la similitud que presenta con la isofornia 1 (‘Fabla V) ya que prácticamente no

‘70

existen diferencias. La Cys representa el 0,8% del total de aminoácidos. El número de residuos de

‘lrp por cadena polipeptídica se estimó entre 1 y 2.

111.1.3.3.- Determinación del pesomolecular

El peso molecular de la isoforma IV de arginasa nativa Fue estimado mediante HPLU-

exclus¡ori riiulecijlar itílízindo tíos tipos de columnas a) una columna ‘l’SK (1566(> l~W.\ 1, ~ b)

tíos columnas ~ SCI OS ha hax’Átíol (W’4504i1’25ú, segun la eonfigw aciOti ‘Y condiciones analisis

descritas en el apartado 11.8 de Material y Métodos, El peso molecular de la isoforma IV

desnaturalizada con SDS al 1% (p/v) fue calculado utilizando sólo la configuración b),

equilibrando la columna con SDS al 1% (p/v). La fracción del electroenfoque (Tabla IX y Fig. 21)

de mayor actividad arginasa, correspondiente a la isoforma IV, fue dializada en agua-HPLC

durante 2 Ii y después concentrada. Las formas nativa y desnaturalizada con SDS al 1% (plv) de

arginasa fueron inyectadas en las columnas correspondientes, según lo descrito anteriormente. La

interpolación del valor’ del volumen de retención relativo de la arginasa nativa (1,79), obtenido en

la columna TSK y el obtenido en las columnas Zorbax-diol (1,75), en las rectas de calibrado

correspondientes (Figs. 24 A y 13, respectivamente), permitió estimar el peso molecular de la

isoforma IV de arginasa en aproximadamente 20 kDa. El volumen de retención relativo de la

isoforma IV desnaturalizada con SDS, obtenido en las columnas Zorbax-diol fUe el mismo que el

de la forma nativa. La isoforma IV de arginasa está compuesta de una sola subunidad, según se

deduce de su tratamiento con SDS.

Llegados a este punto podemos suponer que las isoformas 1 y II de arginasa son la misma

proteína, según podemos deducir de su similitud en el punto isoeléctrico (pi = 5,83 y pl 5,86,

respectivamente) y en el peso molecular (Mr 18,0 RDa y Mr 16,0 kDa). El hecho de que

eluyan con diferente fuerza iónica (0,1 M la isoforma 1 y 2,0 M la isoforma II, de tampón Tris-

HCI, pH 9, 1) del gel de fosfato cálcico puede deberse a la microheterogeneidad derivada de

purificar las enzimas a partir de una amplia población de individuos no donados.

71

Desde este momento, nos referiremos siempre a las isoformas 1, III y IV de arginasa,

entendiendo que la 1 y II son la misma proteína. Los estudios espectroscópicos, así corno los que

se comentarán más adelante sobre ligamiento, se referirán a estas tres isoformas.

72

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.73

Figura 4.- (‘romatogramas obtenidos mediante HPLC de exclusión molecular en columna

‘[SIC 65000 PWXL, según las condiciones de análisis descritas en el apartado

11.8 de Material y Métodos, de las distintas fracciones del proceso de

purificación de las isoforma 1 y II de arginasa. En (A), extracto libre de

células; en (13), sobrenadante dializado del 85% (p/v) de saturación con sulfato

amónico~ en (C), fracción eluida con tampón ‘l’ris-HCI 0,1 M, pH 9,1, del gel

de fosfato cálcico y en (D), fracción eluida con tampón Tris-HCI 2,0 M, pH

9, 1 del gel de fosfato cálcico, Las flechas indican los picos identificado como

isoformas 1 y ¡1. i = inyección.

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75

Figura 5.- Electroenfoque en columna de la isoforma 1 de arginasa obtenida por desorción

del gel de fosfato cálcico con tampón Tris-HCI 0,1 M, pH 9,1. Proteinas (O),

pu (O). AL. indica actividad especifica expresada en unidades: la flecha

muestra el pl de la fracción correspondiente a la isoforma 1.

(o) lo — o-.oo

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A .E. . <0, Guie

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77

Figura 6 - Electroenfoque en columna de la isoforma II de arginasa obtenida por

desorción del gel de Fosfato cálcico con tampón 1ris-HCI 2.0 M, pI 1 9,1.

Proteínas (@), pH (O). A.E. indica actividad específica expresada en

unidades; la flecha muestra el pl de la fracción correspondiente a la

isotermaII.

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-79

Figura 7<- Representación esquemática de <A>, capilar de 75 ~tmde diámetro interno y

(8), capilar de 50 ~m de diámetro interno. Pl ~‘poliimida, S “ sílice fundida.

A

Pl -ctvnS 75 130 l9Opm

aPl

S _________________________________ 50 300 360

________________________ -c-a

SI

Figura 8.- Anatomía interna de los capilares de sílice fUndida vistos a microscopio óptico.

En (a) y (b) capilares de 75 m de diámetro interno; en (c-l), capilares de 50

pm de diámetro interno. En (a), capilar vacío intacto; en (b), corte correcto

del extremo; en (c), corte defectuoso que distorsiona la capa de poliimida; en

<d), aspecto del capilar lleno (flecha rellena) y vacío (flecha vacía); de (e> a

(k>, diferentes irregularidades de la pared interna del capilar; en (1), formación

de poro a través de la pared del capilar. Pl poliimida; S silice fundida. Las

fotogratias fueron tomadas con un sistema Nikon Labophot utilizando un

objetivo acromático 20x de apertura numérica 0,4 (Ref 160/O. 17,Nikon).

83

Figura 9- Electroforegramas de la isoforma 1 de arginasa obtenidos con tampón borato

sodico 15 mM/ácido fosfórico pH 7,1 (A> ó con tampón borato sódico 25

mM, pH 9,0 (B), como electrolito. La electroforesis se llevó a cabo en

capilares de sílice fundida de 75 pm de diámetro interno por 60 cm de longitud

<hasta la ventana de detección). La temperatura fue de 300C y el voltaje

aplicado fue de 25 kV en (A) y de 17 kV en (8). I..as flechas indican el pico

identificado como isoforma 1.

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0 4 8 12 16

Tiempo (mio)

85

Rectas de calibrado para la determinación del punto isoeléctrico en función de

la movilidad electroforética (Pe), constniidas con proteínas de pl conocido. 1.,a

separación de proteínas se obtuvo mediante electroforesis capilar, utilizando

como electrolito (A), tampón borato sódico 15 mM/ ácido fostbrico, pH 7,1, a

30<X’ y 25 kV; y -4,23 + 1,06x; r 0,96. En (8) - el electrolito fue tampón

borato sódico 25 mM, pH 9,0 a 300(7 y 17 kV; y ~3,9+ 0,75x : r 0,99. El

capilar de silice Fundida y 60 cm de longitud. 1 tiroglobulina (pl = 4,5):,

2 alcohol deshidrogenasa (pl s’.~ 5,4); 3 = anhidrasa carbónica (pi 5.9);

4 aldolasa (en A) (pl 6,6), mioglobina (en B) (pl 7,0); 5 benzol (pl

igual al del electrolito). Las [lechasindican la posición de la isoforma 1 de

arginasa (O) en las rectas de calibrado obtenidas a pH 7,1(A) y pH 9,0 <B).

Figura lO -

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37

¡‘abla 1/.- Composición de aminoácidos de las isoformas 1 y II de arginasa.

Isoforma 1 Isoforma II

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16

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4

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5

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* El número de residuos se expresa como el valor entero mas próximo, asumiendo un

** peso molecular de 18.000 y 16.000 Da para las isoformas 1 y II, respectivamente.Determinado como ácido cistéico.

***Determinado espectrofotométricamente por el método de Beaven-I’loliday.

88

Figura II.- (‘romatograma obtenido mediante HPLC de exclusión molecular de proteínas

patrón de peso molecular conocido. Columna TSK 05000 PWXL <300 mm x

7,8 rmn de di.). Fase móvil, tampón Tris-HUí 75 mM. pH 9,1; flujo 0,3

ml.m¡rv detección UV a 280 nm. ‘liroglobulina (Mr=ÓÓO kDa);

2 “ Apoferritina (Mr44O kDay 3 13-amilasa (M~200 kDa); 4 Albúmina

<Mr -67 kDa), 5 Anhidrasa carbónica (Mrz’29 k[)a) y 6 Citocromo e

(Mr’> ¡2,4 kDa)

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‘o“Aaej

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1.. ¡ ¡ ¡ ¡ A

0 10 20 30 40 50

tiempo <mm)

90

Figura 12.- (‘romatograma obtenido mediante HPLC de exclusión molecular de proteínas

patrón de peso molecular conocido. Columnas Zorbax (3F450-6F250 2 x

(250 mm x 9,4 mm di.). Fase móvil, tampón Tris-HCI 200 mM, pH 8,5; tiujo

1,0 nilmirn 1; detección Uy a 280 nnx. 1 Tiroglobulina (Mñ66O kDa);

2 = Apoferritina (Mñ44O kDa); 3 = 13-amilasa (M<200 kDa); 4 = Albúmina

(Mv67 kDa); 5 y’. Anhidrasa carbónica (Mñ29 kDa) y 6 = (‘itocromo c

6

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Tiempo (mio>

92

labia Vi.- Eficacia de las columnas TSK 05000 PWXL y Zorbax-diolcon Zorbax-diol UF 250, analizada como número de platoslos picos de tiroglobulina y citocromo c (númeroscroniatogramas de las Figuras II y 12. respectivamente).análisis descritas en el apartado 11.8, de Material y Métodos

(iF450 en serieteóricos (N) para

1 y 6 en losCondiciones de

Columna(s) Proteina

‘liroglobulina 107904 + 650‘lSK 05000 PWXL

Citocromo c 85,931 + 730

‘liroglobulina 163.592 + 593Zorbax (iF450-Zorbax (iF250

Citocromo c 108484 + 687

* N ¡tic calculado mediante Ja expresión ¡6

93

(‘ronlatogramas obtenidos mediante HPLC de exclusión molecular de SDS al

1% (Vv> (A), de la isoforma 1 de arginasa nativa (8) y desnaturalizada con

SOS al 1% (p/v) (Cl. Columnas Zorbax <3F450-6F250, 2 x (250 mm x 9,4

mm di.>; fase móvil . tampón Tris-HO 20<) mM, pH 8,5, conteniendo SDS al

1% (pA’); flujo 1 ml.niirr1; detección 13V a 280 nm. Las flechas rellenas

indican el pico identificado como isoforma 1 de arginasa y las flechas vacias el

agregado de SDS. ix inyeccion.

Figura 13 -

(-5ci

C •H o‘O E 4o-’AEt 4 0

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04

ci“A

ES-A

95

Figura 14 - Rectas de calibrado para la determinación del peso molecular en función del

volumen de elución relativo, construidas con proteínas de Mr conocida. La

separación de proteínas se obtuvo mediante I’IPLC de exclusión molecular,

según las condiciones de análisis descritas en el apanado 11.8 de Material y

Métodos. En (A), columna TSK G500() PWXL; y 6,49 - 8,65x; r 0,98. En

(B), dos columnas Zorbax-diol GF4SO-0F250, conectadas en serie; y 6,43 -

8,74x, r’~ 0.98. 1 = tiroglobulina (Mr 660 kDa);2 apoferritina (Mr 440

kl}a>; 3 13-amilasa (Mr 200 kDa); 4 albúmina de huevo(Mr 67 kfla);

5 anhidrasa carbónica (Mr uy 29 kDa); 6 citocromo c <Mr 12,4 kDa).Las

flechas indican la posición de las isoformas 1(0) y 11< .) de arginasa en las

rectas de calibrado

1 0(1 II

6,0

5,5

5,0

4, 5

4, 0

u II12

6,0

55

5, 0

4, 5

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97

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EJ

98

Cromatogramas obtenidos mediante HPLC de exclusión molecular en columna

‘[5K 65000 PWXL, según las condiciones de análisis descritas en el apartado

¡1.8 de Material y Métodos, de las distintas fracciones del proceso de

purificación de la isoforma III de arginasa. En (A), extracto libre de células; en

(8). sobrenadante dializado del 70% (p/v) de saturación con sulfato amónico y

en (C), fracción eluida con tampón i’ris-HCI 0,16 M, pH 6,5 del gel de fosfato

cálcico. Las flechas indican el pico identificado como isoforma III.

inyección

Figura 15<

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‘20

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1.00

Figura 16.- Electroenfoque en columna de la isoforma III de arginasa obtenida por

desorción del gel de fosfato cálcico con tampón Tris-H(’l 0,16 M, pH 6,5.

Proteinas (e), pH (O). A.E. indica actividad especitica expresada en

unidades; la flecha muestra el pl de la fi-acción correspondiente a la isoforma

III.

pH (O)

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‘o ‘-a.0 4,68.o..o st

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80

60

40

20

1~)

Ilud IZO (IB]

102

lilectroforegramasde la isoforma III de arginasaobtenidoscon tampónborato

sádico 15 mM/ácido fosfórico, pH 7,1 (A) o con tampón borato sádico25

mM, pH 90 (B), como electrolito. La electroforesisse llevé a cabo en

capilaresde sílicefundidade 75 pm de diámetrointernopor60 cm de longitud

<hasta la ventanade detección).La temperaturafue de 300C y el voltaje

aplicadofue de 25 kV en (A) y de 17 kV en (B). Las flechasindican el pico

identificadocomoisoformaIII.

Figura 17-

1 ¡ erri p ‘i ([ti i it

1 ¡

0 5 ~iO‘A

15 21)

ti amp iSP 5, 01

33

6

mi

tampón

9,1 7 mi rí

10,33 mm

it

¡ 1 1

o 4 8 12 16

1~04

Rectasde calibradoparala determinacióndel puntoisoeléctricoen función de

la movilidad electroforética(I’e)’ construidascon proleinasde pl conocido.La

separaciónde proteínasse obtuvo medianteelectroforesiscapilar, utilizando

comoelectrolito(A>, tampónboratosádico 15 mM! ácidofosfático,pH 7,1, a

30<t’ y 25 kV; y -4,23 + l,06x; r 0,96. En (8) , el electrolito fue tampón

boratosádico25 mM, pH 9,0 a 300C y 17 kV; y -3,9 + 0,75x ; r 0,99~ El

capilar, de sílice fundida y 60 cm de longitud. 1 tiroglobulina (pl 45)

2 alcohol deshidrogenasa(pl = 5,4): 3 anhidrasacarbónica(pl 5,9);

4 - aldolasa(en A) (pl 6,6), mioglobina<en B) (pl 7,0); 5 benzol (pl

igual al del electrolito).Lasflechasindican la posiciónde la isoforma III de

arginasa(O) en las rectasde calibradoobtenidasa pH 7,1(A) y pl-l 9,0 (II).

Figura 18.-

-3, 6A

—3,5 —

-3 4

4

—3 3 —

7L, .1

0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

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0W

Eo

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IX.. 8

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-3 4e

3

—3, 3

5

-3,2

7.1

0, 6 0, 7 0, 8 0, 9 1, 0

2 e

3 e e)e

4e

Qq pl

1.06

Tabla VIII.- Composiciónde aminoácidosdela isoformaIIIde arginasa

Aminoácido % moles Residuos*

(YS** 2,7 óASX 10,3 22

4,3 9

SER 6,6 ¡5

CLX 13,4 28

PRO 4,5 9

(iLY 11.2 29

ALA 8,7 18

VAL 6,6 14

MET 2,4 5

ILE 3,7 8

LEU 7,2 15

JYJ< 2,8 6

PIlE 3,1 7

1-JIS 2,1 5

[NS 5,3 II

ARG 4,7 lo

‘FRP * * * 9

* El número de residuossc expresacorno el valor entero más próximo

asumiendoun pesomolecularde 26.000 Da.** Determinadocomo ácido cistéico.

Determinadoespectrolotométricarnenteporel métododeBeavcn-Holiday

1. 07

Figura 19,- Rectasde calibradoparala determinacióndel pesomolecularen función del

volumen de elución relativo, construidascon proteínasde Mr conocida. La

separaciónde proteínasse obtuvo medianteHPLC de exclusión molecular,

segúnlas condicionesde análisis descritasen el apartado11.8 de Material y

Métodos.En (A), columnaTSK 05000 PWXL; y 6,49 - 8,65x; r 0,98, En

(B), doscolumnasZorbax-diol6F450-GF250,conectadasen serie;y = 6,43 -

8,74x; r — 098. 1 = tiroglobulina(M~ 660 kDa); 2 = apoferritina(Mr 440

kfla); 3 13-amilasa(Mr 200 kDa); 4 albúminade huevo(Mr~ 47 kl)ag 5

anhidrasacarbónica(Mr = 29 kDa); 6 citocromoc (Mr 12,4 kDa). Las

flechasindican la posiciónde la isoformaIii (O) de arginasaen las rectasde

calibrado.

0 0, 1 0,?

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5, 0

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cd6-

1 LO

(romatograrnasobtenidosmedianteHPLC de exclusiónmolecularen columna

TSK 65000 PWXL, segúnlas condicionesde análisisdescritasen el apartado

118. de Material y Métodos, de las distintas fracciones del proceso de

purificaciónde la isoformaIV de arginasa.En (A), extractolibre de células;en

(B), sobrenadantedializadodel 50% (p/v) de saturacióncon sulfato amónico;

en (U). fracción eluida con tampón Tris-HUí 0,14 M, pIl 9.1, del gel de

tbsfato cálcico; en (D), fi-acción eluida del electroenfoqueen columna a pH

5.5. Las flechasindicanel pico identificadocomoisoformaIV. i “inyección.

Figura20<

oOu-’

2ca

01---4

0E

O

0Wa-)

uO0WO-H

O

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0WO0WO‘--4

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2EQN

0W

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O

Ib 12

Figura 21.- Eiectroenfoqueen columna de la isoforma IV de arginasaobtenida por

desorcióndel gel de fosfato cálcico con tampón Iris-HUí 0.14 M, pH 9, 1.

Proteínas(e), pH (O). A.E. indica actividad específica expresadaen

unidades;Jaflecha muestrael pl de la fracción correspondientea la isoforma

lv.

pH (0)10

8 ~0ocfo-4-

¿ 2

5‘o

4 040 5-4..

2 0,05 e

0o

25 36 44 5? 60L It’

¡iluato (ml

3.4

Electrofo¡egramasde la isoformaIV dearginasaobtenidoscon tampónborato

sádico¡5 mM/ácidofosfóricopH 7,1(A) o con tampónboratosádico25 mM

ph 9,0 (B), comoelectrolito. La electroforesisse llevó a caboen capilaresde

sílice fundida de 75 pm de diámetrointerno por60 cm de longitud (hastala

ventanadedetección).La temperaturafue de 300C y el voltaje aplicadofue de

25 kV en (A) y de 17 kV en (13). Las tiechasindican el pico identificado como

isoformaIV

Figura22.-

1 ¡ empo (mi u)

A¡ ¡ 1

0 5 lO 1.5

U aun p

ciii (¡1

U mp ¿5n9,17 Ini [1

7,60 mirí

0 4 8 12 16

6

Sm ¡ Ii1. 0, 4

IP

1 1

Tiempo (mm)

1.. 1 6

Figura 23.- Rectasde calibradoparala determinacióndel puntoisoeléctricoen funciónde

la movilidadelectroforética(Pet construidascon proteinasde pl conocido.

la separaciónde proteínasse obtuvo medianteelectroforesiscapilar,

utilizando como etectrolito (A) tampón borato sádico 15 mM! ácido

fostiSrico, pH 7,1, a 300C y 25 kV; y -4,23+ l,06x; r -v 0.96. En (B) , el

electrolito fue tampónborato sádico25 mM, pH 9,0 a 300C y ¡7 kV: y”

-3,9 + 0,75x ; r 0,99. El capilar, de sílice fundida y 60 cm de longitud.

tiroglobulina (pI 4.5): 2 alcohol deshidrogenasa(pl 5,4);

3 —. anhidrasacarbónica(pI 5,9); 4 = aldolasa (en A) (pl = 6,6),

mioglobina (en B) (pl = 7,0); 5 = benzol (pl al del electrolito). Las

flechasindican la posiciónde la isoformaIV de arginasa(O ) en las rectas

de calibradoobtenidasa pH 7,1(A) y pH 9,0 (B).

e

3,5 — o- P’4 8

-3,4

3,3 e

)

7.1 fi

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0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

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—3,2 —

.1

0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

3

4e

1.

4

iog pl

11.8

‘labIa X~ Composiciónde aminoácidosde la isoforma IV de arginasa.

Arnifloacidos

(‘Y 5t ‘1’

ASX

IHR

2~ moles Residuos*

0,8

¡1,6 18

96,0

SER

61. X

9,8

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‘5

23

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5

9

3

3

2

7

4

1 RP * * * 2

* El número de residuos se expresaconio el valor

molecuiardc 18.000Da.**

Determinadocomoácidocistéico.tL)eterni¡nadoespectrofotométricamentepor el métodode E3caven-J-{olidav.

enteromi~s próximo. asumiendoun peso

.1 .1. 9

Rectasde calibradoparala determinacióndel pesomolecularen función del

volumen de elución relativo, construidascon proteínasde Mr conocida. La

separaciónde proteínasse obtuvo medianteHPLU de exclusión molecular,

segúnlas condicionesde análisisdescritasen el apanado¡1.8 de Material y

Métodos. En (A), columna15K (35000PWXL; y = 6,49 - 8,65x; r” 0,98. En

(8), doscolumnasZorbax-diol GF450-GF250,conectadasen serie;y” 6,43 -

8,74x; r xx 0.98. 1 “tiroglobulina (Mr 660 kDa); 2 apoferritina(Mr = 440

kDa), 3 - B-aniilasa(Mr “ 200 kDa);4” albúminade huevo (Mr” 67 kDa); 5

= anhidrasacarbónica(Mr 29 kDa); 6 “ citocronio ~ (Mr “ 12,4 kDa). Las

flechasindican la posiciónde la isoforma IV (O) de arginasaen las rectasde

calibrado.

Figura 24.-

.109 1-1 1.~

6 0

55

‘lb , O

45

4, (1

I oq tir

¿.0

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O O,t 0,2 0,3

ioq V 1Ve (lb

121

¡ff2.- CARACTERISTICAS ESPECTROSCOPICASDE LAS ISOFORMAS 1, 111 Y IV

DE ARO INASA

En estebloquesepresentanlas Figuras25 a 29

122

lIl.2.l.— Espectros de absorción ultravioleta

Los espectrosde absorciónde las isoformas 1, III y IV de arginasaen el rango de

longitudesde onda del ultravioleta(190-340nm) semuestranen la Figura 25. En ellos sepuede

observarun máximocentradoa 215-278nm paralastres isoformas.Estemáximo de absorciónse

encuentraligeramentedesplazadohacia longitudes de onda inferiores al valor que posee el

maxímo en el espectro(le absorciondel lrp libre. Ello indica la existenciade iyr (ver ~lablas\.T

VII y Y), cuyaabsoicionmáximasc encuentraa 277 nm

Otro aspectoa destacaresJa existenciade una discretaabsorcióna partir de los 3 lO nm,

hechoque podríareflejaruna ciertatendenciaa la agregaciónde las proteínas.

11L2.2.- Espectrosde fluorescencia

1.~os espectrosde emisión de fluorescenciade las isoformas 1, III y IV de arginasa,

excitandoa diferenteslongitudesde ondasemuestranen las Figuras26, 27 y 28.

Uuandola longitud de onda de excitaciónes de 275 nm (Fig. 26), es decir, excitando

simultáneamente¡Vr y irp, los espectrosde emisiónde las tres isoformasde arginasapresentan

dosmáximos,uno centradoa 342-346nm y otro a 305 nm. Debedestacarsela emisióna 288-290

nm que presentala isoforma¡II de arginasa.

Uuandola muestraseexcitacon luz de longitud de onda de 295 nm (Fig. 27), esdecir,

analizandoexclusivamentela contribuciónde Trp. se detectaun máximo de emisión a 351 nm y

un hombroa416 nm en la isoforma1. Las isoformasIII y IV tambiénemitenfluorescenciaa351

nm, pero su máximo principal seencuentraa 331 nm; se puedetambiénobservarotro máximo

secundarioa 397-401mu.

Al analizarla contribuciónde la Phe al espectrode emisiónde fluorescencia,excitandoa

257 nm (hg. 28), seobservaquelas tres isoformasde arginasapresentanun máximo de emisión

en el entornode 345-350 nm. Las isoformas1 y IV poseenotro máximo secundariode emisión a

290-300 nm, perola isoforma111 no lo posee.

123

En la Figura 29 se recogeel espectrode emisión y excitación simultáneas(espectro

— — h, —síncronicoo smerosean’)de las isoformas1. III y IV. Las tres presentanun máximo de emisión

principal alrededorde los 3 55-356nm y un máximo de emisión secundarioen la zonade los 305-

307 nm, quela isoformaIII no posee.

24

Figura 25.— Espectros de absorción ultravioleta de: 42 jíg-mh1 de isoforma ¡ (A); 37

~Ág-mU’de isoforma III (u) y 25 ~ig-mh1 de isoforma IV (e) de arg~nasa,

disueltasen tampón Tris-HUí 10 mM. pH 9,1 (isoformas 1 y IV) o pH 6.5

<isotorniaIII).

fi fi ~.j.

275 -2 781’

1 1 1

190 215 240 265 290 3[5 340

275—278275-278

u

0,1;’ o

o 1. 0 5

0, 090

0 075

0, 060

0 045

0, 030

cf)a;

-u-u--4

2

o

O

O , (11 .5

ci)

>~ (nrn)

L26

Figura 26<- Espectrode emisión de fluorescenciade: 42 ~igmk1 de isoforma 1 <@); 37

gg.rnh1 de isoforma III (u) y 25 pg.ntL1 de isoforma IV (A) de arginasa,

disueltasen tampón Tris-HUí lO mM, pH 9,1 (isoformas 1 y IV) o pH 6,5

(isoformnaIII) Longitud de ondade excitación275 nm.

80

70

(O

500~- ¡

-Ho

1)o

a;1-aOO

u-

4 ci)

3 ci)

20

255u

—5 ¡/j/A)

¡-uA

!xj[/7e

.1. ci)

O 1 1 L.. ~.J ¡

3451

u m.

e

440 415 390 365 340 315 290

>. (ini)

].28

Figura27- Espectrode emisión de fluorescenciade: 42 pgmh1 de

~g-mL1 de isoforma III (u) y 25 pg-mh1 de isoforma IV

disueltasen tampón Tris-HUí lO mM, pH 9,1 (isoformas

(isoformaIII) Longitud de ondade excitación295 nm.

isoforma 1 (@); 37

(A) de arginasa.

1 y IV) o pH 6,5

80

7(1

e; <j

IB)

4-0u

7/— u

u

y’401

1-. 7¿-A

¡A

20

lo

(.1

397

¡•U\%53

6/7e

e,’e—,

.1 1.. u 1 u

3M1u

351

u

ji

351

1(U

-‘-4(--5E

a)(2cf)a;

o

‘-9u-

331

1

1A

7/7

e

44-0 415 390 365 340 315 290

A(¡ím )

130

Figura 28.- Espectrode emisión de fluorescenciade: 42 pg-mh1 de isoforma 1 (@); 37

pg-mh1 de isoforma III (u) y 25 ~ig-mL1 de isoforma IV (A) de arginasa,

disueltasen tampón Tris-HUí lO mM, pH 9,1 (isoformas ¡ y IV) o pH 6,5

(isot’ornia III). l.Jongitudde ondade excitación257nm.

¿0 —

3491

50 u-

40 -

40?

(n yo A~A

a;

~ 30 i(--5a;a;

u‘---1LL kj

2(1

¡-ci)

0315 290

345 302

y/C9 90

—e

A—

¿7A1 u

440 415 390 365 340

2. (nín)

132

Figura 29.— Espectrosde emisión y excitación simultáneos de fluorescencia de las

isoformas1(e), III (u) y IV (A) de arginasadisueltasen tampón Tris-HUí

10 mM. pH 9j (isoformas1 y IV) o pH 6,5 (isoformaIII).

7<)

1

it)

5(1 -

-a--4

a-) 4<)

ci<--5

<-9a;6-1

oE,

‘—A

u- 30

~ ‘~

L A U2<) “A

lO - )0

A ( ¡~iniiex

1

e

1’

e4

330 305 280 255 230 20$

41<) 385 360 335 310 285 2. em (íim)

134

IILI- ANALISIS Y CUANTIFICACION DE ATRANORINA, ACIDO EVERNICO Y

ÁCIDO USNICO

En estebloquese presentanlas Figuras30 a 36 y las

TablasXl y XII

2.35

111.3±-Espectrosde absorción ultravioleta

Los espectrosde absorciónde los fenolesatranoririay ácidosevérnico y úsnico, en el

rangode longitudesde ondadel ultravioleta(210-350nm), serecogenen las Figuras30 A-U.

En todos ellosseobservaun máximoalrededorde 270-280nm, que se correspondecon el

máximo de absorciónde los compuestosaromáticos.La atranorina(Fig. 30 A) presentaun

máximo a los 280 nm; el ácido evérnico(Eig 30 13) absorbea los 210 nm, mientrasque el ácido

úsnico (Fig. 30 U) presentael máximoa 280 nm.

A la vista de estosresultadosse eligieron las longitudesde ondade máximaabsorciónde

cadafenol en los análisisde HPLU.

HiL3.2.- Estabilidad en disolucionestaniponadas

La estabilidadde unadisolución de atranorina(0,5 mg-mí-1) en tampónTris-HUí 0,1 M,

pH 9,1 y pH 6,5. semuestraen las Figuras31 A y B, respectivamente.La atranorina,a la citada

concentración,tardaen disolversepor completo48 ti, independientementedel pH. Entre las 48 ti

y las 120 h, la cantidadde atranorinaque sedetectaes la misma, lo cual indica que no se está

degradandoo convirtiendoen otrosproductos.

La estabilidadde unadisolución de ácido evérnico(0,2 mg-mV1) en tampónTris-HUí 0,1

M, pH 9, y 6.5, semuestraen las Figuras32 Ay 13, respectivamente.

Cuandoel pH de la disolución es9,1 (Fig. 32 A), la cantidadde ácidoevérnico,registrada

como cuentasde área,descienderápidamentedurantelas 24 primerashorashastaalcanzarun

tercio de la cantidadinicial. A estetiempo sedetectanácidosorselínico y evernínico,productos

de degradacióndel ácidoevernico. La cantidadde ácidoorselínicodesciendea partir de las 72 ti,

momentoen el cual seempiezaa detectarorcinol, productode degradacióndel ácidoorselinico.

El ácidoevernínicono se degrada,al menoshastalas 120 h de análisis.

Uuandola disolución se hacea pH 6,5 (Fig. 32 13), la estabilidaddel ácido evérnicoes

mayor. Los ácidosorselinico y evernínicotambiénse detectana partir de las 6 primerashoras

136

pero en menorcantidadquea pH 9, 1. El ácidoevórnico sedegradaa partir de las 24 h, pero no

apareceorcinol en cantidaddetectable,al menosdurantelas ¡20 h de análisis.

En las Figuras 33 A y E se muestrala estabilidaddel ácido úsnieo (0,3 mg-mí-1) en

disolucionestamponadascon Tris-HUí 0,1 M a pH 9,1 (Fig. 33 A) y pH 6,5 (Fig. 33 B). La

máximasolubilidad del ácido úsnicose alcanzaa tiemposmayores(48 h) a pH 6,5 que a pH 9,1

(24 h). A partir de entonces,el ácido úsnico no parece degradarsey es estable, como lo

demuestrael hechode no observarni aparición deproductosde degradaciónni variaciónen su

cantidad.

111.33.-Seuaracióny cuantificaciónmedianteHPLC

Los fenolesextraidosdel córtex,del talo y del medio de incubación,segúnlo descritoen

el apartado11.10. 1 de Material y Métodos,procedentesde talosincubadosen L-arginina40 mM

durantediferentestiemposen oscuridad,fueron analizadospor HPLU. La separaciónse realizóen

fasereversa,empleandounacolumnaNucleosil 5C8, en las condicionesde análisisdescritasen el

apartado11.10.4.

Las Figuras34 A-U muestrancromatogramassignificativos. El análisisdura6 mm, ya que

a estetiempo ha eluido el ácidoúsnico(cuandoestápresente),último fenol en aparecerdebido a

la menor polaridad que presentaen comparacióncon la atranorinay los ácidos orselínico,

everninicoy evérnico, La proporciónde cada pico varía en relación a la procedenciade la

muestra.

La cuantificaciónde la atranorinay los ácidos evérnico y tisnico se realizó mediante

interpolaciónde los valoresde cuentasde áreaobtenidosen una rectade calibradoconstruidacon

concentracionescrecientesde cadapatrón. Se eligió el rangode linearidaddel detectoren todos

los casos.Las rectasde calibradoque representancuentasde áreaen función de la concentración

fueron ajustadaspor minimos cuadradosy utilizadasen la cuantificaciónde los fenoles. Estas

rectasde calibrado semuestranen la TablaXI.

137

111.3.4.-Valoración del contenido de fenolesen muestras de córtex. talo y medio de

incubación

Con objeto de relacionarel contenidode fenolesy la máximaactividadde cadaisoforma

de arginasa,se estudió la variación temporalde atranorinay ácidosevérnico y úsnico en función

de las condicionesde incubación. El análisis se realizó a tres niveles: valorandolos fenoles

presentesen el córtex, en el talo (una vezeliminadoslos corticales)y los disueltosen los medios

de incubación,segúnlo descritoen los apartados11.10.1.1y 111012.

En la Figura35 se muestranlos resultadosde la variación temporalde fenolesen muestras

de talo incubadasen L-arginina 40 mM tamponadascon Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1. El ácido

evérnico y la atranorinarepresentanel 70% y el 30%, respectivamente,de los fenoles totales

extraídosdel córtexen ausenciade cualquiertratamiento.La cantidadde ácidoúsnico aumenta

progresivamentedesdeel comienzode la incubación,mientrasque el contenidode ácidoevérnico

disminuyeen la misma medidaen el córtex(Fig. 35 A-U).

En el talo (Figs. 35 D-F), la atranorinaes,sin embargo,el fenol queseencuentraen mayor

cantidad;el ácido evérnicoapareceen trazasy de ácido úsnicosedetectanvaloresalrededorde

2,5 mg-g-1 de talo seco.

En el medio (Figs. 35 0-1) sedisuelveprincipalmenteel ácido evérnico, cuyo contenido

alcanzaaproximadamentelos 12,5 mg-g1 de talo seco entre las 4 ti y 8 h de incubación.La

atranorina sólo se deteeta a tiempos cortos y el contenido en ácido úsnico aumenta

progresivamentedesdelas lO h de incubaciónde los talos.

Cuando éstos son incubadosen disoluciones de cicloheximida 40 uM, en medios

tamponadoscon Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1, el patrón de distribución de los fenoles, en los

diferentes extractos, es muy distinto al obtenido cuando hay L-arginina en el medio. Los

resultadospuedenobservarseen las Figuras36 A-I.

En el córtex (Figs. 36 A-U) se puedendetectarcantidadesapreciablesde atranorinay

ácidoúsnicoqueoscilanentre8 y 30 mg-g 1 de talo seco. El contenidode ácido evérnicoesalgo

138

mayor,alrededorde 40 mg-g’ de talo seco,exceptoa las 2 ti de incubación,cuandose detectan

unos 140 mg-g1 de talo seco.

La cantidadde fenoles(atranorinay ácido úsnico) detectadaen talo (Figs. 36 E y F) en

muestrasincubadasen presenciadel inhibidor de la traducciónes semejantea la de aquellas

incubadasen L-arginina. El contenidode ácido evérnicoen el talo (Hg. 36 D) es, sin embargo,

mayory puedenapreciarsedosmáximosa4 y 10 h deincubación.

Atranorinay ácidosevémicoy úsnico se solubilizanen menorcantidaden el medio (Figs.

36 G-I) que en el casoanterior (Figs. 35 G-I) como puedeapreciarsepor la diferenciade escala

gráfica.

El ácido úsnico es el fenol detectadoen mayor cantidaden el medio de incubación. Su

contenidooscilaentre0,1 y 0,3 mg-g-1 de talo seco.

111.35.-Valoración del contenido de fenolessolublesen el extracto libre de células

La solubilidad de los fenoles en disolucionesacuosases muy baja aunque,como se ha

señalado,variaen fUnción del pH (Figs. 31,32y 33). Uomo unaprimeraaproximación,se caleuló

la cantidadde atranorina,ácidoevérnicoy ácidoúsnicoque se solubiliza en los extractoslibres de

célulasprocedentesde muestrasde talo a los tiemposen que se detectala máximaactividadde

cadaisoformade arginasa.Estosson:

i) Máxima actividadde la isoforma1 de arginasa:talo incubado6 h en L-arginina

40 mM tamponadacon Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1.

u) Máxima actividad de la isoforma III de arginasa: talo incubado 16 ti en

cicloheximida40 pM tamponadacon Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1.

iii) Máxima actividad de la isoforma IV de arginasa: medio de incubación

procedentede talos incubados8 h en L-arginina 40 mM tamponadacon

Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1.

La cantidadde cadafenol detectadaen estascondicionespuede serun indicativo de la

concentraciónaccesiblea la proteínay, en principio, aquellacapaz de ejercerun determinado

139

efectofisiológico. La extracciónse realizó segúnlo descritoen el apartado11.10.1.3.de Material

y Métodos. Los resultadosobtenidosse muestranen la Tabla XII. En las condicionesde máxima

actividadde la isoforma1 de arginasa(i) sedetectan0,19 nmol de atranorina,0,75 nmol de ácido

evérnicoy 1,0 nmol de ácidoúsnico.Estascantidadesson mayoresen las condicionesde máxima

actividad de la isoformaIII de arginasa(u), ya que se detectan1,1 nmol de atranorina,2,3 nmol

de ácido evérnico y 2,7 nmol de ácido úsnico. En las condicionesde máxima actividad de la

isoformaIV de arginasa(iii), el extractolibre de célulascontiene5,4 nmol de atranorina,3,7 amol

de ácidoevéinico y 4,0 nmol de ácidoúsnico. Todos los valoresvienenexpresadospor g de peso

de talo seco.

Fin estepunto convienepuntualizarque los fenoles liquénicos están localizadosen tres

posicionesespecificas:

a) Fenoles corticales, exocelulares,cristalizadossobre las hifas que forman el

córtex, en donde actúana modo de pantallapara filtrar densidadesde flujo fotónico no lesivas

paralas algas.

b) Fenolesintratalinosque, a su vez, puedenestarcristalizadossobrelas paredes

celulares,tanto del fotobionte como del micobionte, o puedenestar localizadosen el interior

celular, solubilizados en el citosol, tanto de las algas como del hongo. Sólo en esta última

localizaciónpodrátenerefectofisiológico sobrelas enzimascitosólicas.

La estimaciónde la concentraciónde fenoles en los extractoslibres de célulaspuededar

una ideaaproximadade la concentraciónde fenolesintracelulares,aunqueno exacta,dado que

partede los fenolesparietalespuedendisolverseduranteel procesode preparación.Porello, se ha

estimado la concentraciónde fenolescorticales(apartado11.10.1 de Material y Métodos) y

fenoles intracelularespor comparacióna la encontradaen los extractoslibres de células. La

concentraciónde fenoles en córtex resultó ser aproximadamente47 veces superior, y la de

medulares1,9 vecesinferior a la del extractolibre de células.Por ello, para estimarla acción de

los diferentesefectoressobrela hipotéticacooperatividadde unaisoformacon el sustrato,se han

utilizado concentracionesde fenol aproximadamentemitad de las encontradasen los extractos

140

libres de células paralas isoformas1 y III talmas,y prácticamenteigual a la encontradaen los

mediosde cultivo parala isoformaIV, segregable,segúnseespecificaenlas Tablas 1 y XII.

141

Figura 30.- Espectrosde absorciónultravioleta de atranorina(A), ácido evérnico (8) y

ácido usnico (U) preparados en agua-HPLC:ácido acético (99: l,v/v)

¡acetonitrilo (30/70,v/v). La concentraciónempleadafue de 0,1 mg-mL1.

DO. densidadóptica.

1) . 0.ci), 7

0, 5

0, .3

(1, ~l.

ci)

34(1 300

1) (1ci), 7

0, 5

0 3

o , .1.

o

260 220 340 300 260A ( orn

300 260 220

A 250 rA\ A

A ~

A

1~A

A~

1 1 ¡ U

—e--R r

27<)

A> ¡

¡e

e

- e!-e-Sr

U ¡ 1 1 ¡

220

-c -~ 280

u

¡u

- 1~~u

.340

2. (orn)

1.43

Estabilidadde unadisolución de atranorina(0,5mg-mV1) en tampónTris-RU!

0,1 M a pH 9,1 (A) y pH 6,5 (13) en fUnción del tiempo en oscuridad. La

cuantificaciónde atranorinase llevó a cabo medianteHPLC utilizando una

columna de fase reversa Nucleosil 5U8 en las condiciones de análisis

especificadasen el apanado11.10.4 de Materialy Métodos.

Figura3! -

9 (1

1.,

1,5

1 , (1

0, 5

o

‘oo-9

-5<

9,6- , <1

.1 , 5

¡-,(1

0, 5

o

0 24 48 72 96 120

2<-

‘rE,

a;r<-0

<E,4-..E,

E,a.)

0 24 48 72 96 120

1 i em <lb (fi

145

Figura 32< Estabilidad de una disolución de ácidoevérnico(0,2 nig.nih1) (•) en tampón

Tris-RU! 01 M a pH 9,1 (A) y pH 6,5 (B) en función del tiempo en

oscuridad.La cuantificaciónde atranorinase llevó a cabo medianteHPLU

utilizandounacolumnade fasereversaNucleosilSUS en las condicionesde

análisisespecificadasen el apartado11.10.4 de Material y Métodos. (O),

ácidoevernínico;( ), ácidoorselinico,(±),orcinol.

A---o---

o- --o

9-o

-o’

o.4-

+

1 .200

1.100

1 . (1 0 <)

900

800

H1 700

24- 48 72 96 120

o300 2

UDcfciQl

aUD

200

UDci

Y

100 ~ui

o

o

o

2, 2 1(16 Le

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ot

¡It-1

o2UD2cfej(/)

e>400

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3(1(1 ~

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200<-si

1.00o

0

1=0

e

o

-5<

‘E,2)

‘pi

a;

-oLa

(E,40

2a;2

(-4

e

‘oo‘-9

y

(E,a;6-4

‘CE,a;

U)

<E,4.)

2ciO

a-)

1. (10

8<1

6<)

40

20

<1

20

1,5

1. , 0

0, 5

o0 24 48 72 96 120

Ti empo (fi)

147

Figura 33<- Estabilidadde una disoluciónde ácido úsnico(0,3 mg-mí-1)en tampónTris-

HUí 0,1 M a pH 9,1(A) y pH 6,5 (B) en función del tiempo en oscuridad.La

cuantificaciónde ácidoúsnico se llevó a cabomedianteITIPLU utilizandouna

columna de fase reversa Nucleosil SUS en las condiciones de análisis

especificadasen el apartado11.10.4de Materialy Métodos.

A

¿

u

0 24 48 72 96 120

2 , <1

1. 5

‘ci)

<1, 5

‘oo‘-9y

(.1

(E,2)

ej‘pi

a;

<‘9

(E,42

a;2

a--)

2 ,

1,5

¡ , <1

0, 5

O(1 24 48 72 96 120

TLempo (fi)

149

Figura 34.- Uromatogramasrepresentativosde los fenolesde LI prz¡na~tri obtenido a

partir de diferentesmuestras,según lo descrito en el apartado 11.10.1 de

Material y Métodos. En (A) , córtexobtenido de talos incubados¡6 E en 1..—

arginina 40 mM; en (13), talo incubado2 E en L-arginina 40 mM; en (U),

medio obtenidode talosincubados6 E en L-arginina 4OmM. La separaciónse

realizó en HPLU utilizando una columnaNucleosil 5U8 de fase reversaen las

condicionesde análisisdescritasen el apanado11.10.4 de Materialy Métodos.

1, ácido orselinico; 2, ácido everninico;3, ácido evérnico; 4, atranorina,5,

ácidoúsnico. i “inyección.

A B e1~

j

jI

4

3

1 -1 1 -3

ci) 3 6 9 0

3

.1 A £

o

tit A A

.3 6 9 36 9

fi empo (mi n)

151

Tabla NL- Ecuacionesde las rectasde calibrado, ajustadaspor mínimos cuadrados,empleadasen la cuantificaciónde atranorina,ácidoevémicoy ácidoúsnicoseparadosmedianteHPLU en una columna Nucleosil SUS de fase reversaen las condicionesdescritasen el apartado11.10.4. de Materialy Métodos.

Fenol Ecuaciónde la rectade calibraciónindirecta*

Atranorina(con ácidoevérnico0,01 mg-mb1 y - 0,039+ 0,55 x; r = 0,99

como patrónexterno)

Acido evérnico(con atranoñna0,02 mg-mH y = - 0,196+ 3,66 x; r = 0,98

como patrónexterno)

Acido úsnico(con ácidoevérnico0,01 mgmh’ y = - 0,377+ 2,34 x; r = 0,97

como patrónexterno)

(?alibraciónreteridaal patrónexterno

152

Figura35< Variación de la cantidadde ácidoevémico(e), atranorina(A) y ácidoúsnico

(u) en función del tiempo de incubaciónde talos de E. prunas-iri, en tampón

Iris-HUí 0,! M, pH 9,1, conteniendoL-arginina 40 mM. En (A,B y U),

fenolesdel córtex; en (D,E y F), fenoles de talo una vez extraídoslos del

eórtexy en (G,H e 1), fenolesen el medio de incubación.

E A

e‘\~ ¿4

~~•¡t I\

4 is 2 6

o

(1

(> 4 8 1? 16

12, SI—1 (3 ci)

7, 5

5,0

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1.)

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10,0

7,5

5

2,

B

¡ 1 ¡

0 4 8 12 16

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A

A- \ 1AA~ ~ _

12 5

1. 0 , O

7,5

5, 0

2,5

<1

ci) 4 8 12 16

[.2, 5

1.0, 0 —

7, 5

5, (1

25

o0 4- 8 1.2 16

1ci) 4 8 12 16

0 4 8 1.2 16

12 5

1 ci> o

75

5, ci)

2,5

o0 4 8 12 16

32

e24

16

8

<.1

c

- II-MU~~U Uu-. 1’

IrlE 1u-u

12, 5o

-H(E,4)

1 0, ci)

75

5, 0—9o22)

E

2, 5

(1

F

U•.. U.U 1•~

4? ,.5

1 ci> (1

75

3,0

2,5

o e()

12

10

7,

5

2,

o4- 8 12 16

¡1 cm ~io (fi)

154

Figura 36< Variación de la cantidadde ácidoevérnico(e), atranorina(A) y ácidoúsnico

(a) en función del tiempo de incubaciónde talos de E. primas-/rl, en tampón

Tris-HUí 0,1 M, pH 9,1, conteniendocicloheximida40 gM. En (A,B y U).

fenolesdel córtex; en (D,E y F), fenolesde talo una vez extraídoslos del

córtexy en ((31-1 e 1), fenolesen el medio de incubación.

(5<)

1. 2 (.3

8<>

4<.>

ci)

(34 81716 (34 8121.6 <14 81216

6

4.

2

o

E

A A A A

LúL=L~

6

4

(1

1A?—

Q/j. 81716 0481216 0481216

G

•tedz’e. ¡ej

(1

ci)

ci) ,.l.

ci) 4 8 12 >6

o‘—9pi

4-)

-9 4.

-5

1.

ci)

--4oE:

2-5

rE

(1, 3

(1 2

ci.) , 1

1)

0 4 8 12 16 0 4 8 12 16

tiempo (fi)

156

Tabla XIL- Cantidadde fenolesendógenosdetectadaen los extractoslibres de células(medio de incubación) de talos de fil prunastrí incubados en lascondicionesde máximaactividadde cadaisoformade arginasa.

Isoformadearginasa

Condicionesde máximaactividad*

Fenol(nmol-w1 pesoseco)

atranorina ácidoevérnico acidoúsnico

6k

en L—arginina 40 mM

019+0020 075+0008 100+0030

Hl 16ken cicloheximida40 uM 110 + 0015 226 + 0007 272 + 0020

IV Shen L-arginina4omM 537±0012 367 + 0008 405 + 0030

* Detallesenapartado11101.3 de Materialy Métodos

157

HL4.- EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD

I)E REACCION DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA EN AtJSENCIA Y

PRESENCIA DE EFECTORES

En estebloquese presentanlas Figuras37 a 44 y la

TablaXIII

158

La caracterizacióncinética de una enzimaincluye habitualmentela determinaciónde su

velocidadmáxima (vmax) de reaccióny de su constantede Michaelis-Menten(Km) para cada

sustrato.Estos datos resultanmuy útiles a la hora de comparardiferentesisoformas, Por otro

lado, la presenciade uno o varios efectorespuedemodificar la cinéticade la enzima,pudiéndose

comportaréstos como activadoreso inhibidores. Los cambios producidospor el efector se

puedenobservara nivel de vmax y Km, encontrándosediferente tipo de acción sobre cada

soforma

Ya que existen variaciones del contenido de fenoles en las condiciones de máxima

actividad de cada isoforma particular, se trató de ligar estos dos hechos estudiando el

comportamientocinéticode cadaisoformaen presenciay/o ausenciade efector.

ILLtL- Sobre la isoforma ide arginasa

La estimaciónde velocidad de reacción de la isoforma 1 frente a concentraciones

crecientesde sustrato(L-arginina) serealizó segúnlo descritoen los apartados11.11. y 1112. En

la Figura37 semuestranLos resultadosobtenidos.

La variación de la velocidadde reacciónen función de la concentraciónde sustratose

puedeasimilara una hipérbola,lo cual demuestraque la isoforma1 es una enzima micaeliana,A

partir de concentracionesde L-arginina superioresa6 mM sepuedeapreciaruna Ligera inhibición

por excesode sustrato.El valorde Km. estimado a partir de estarepresentacióndirecta,es de 1,5

mM y el de vmaxde 2~49 pmolesde anlonio-miv1.

La representacióndirectade los datos, concentraciónde sustratofrente a velocidad de

reacción, es el mejor sistema para calcular Km y vmax, ya que no es necesario hacer

transformacionesdc los resultadosexperimentalesque distorsionanlos posibleserrorescometidos

en las medidas.Una variaciónde la representacióndirectade Michaelis-Mentenesla sugeridapor

Eisenthal-Uornish-Bowden,dondeKm y vmax vienen definidascomo la media de las diferentes

interseccionesobtenidasal representarlas rectasformadaspor los pares(yo, [si:>.La manerade

representarlos datos es la siguiente:cadavalor de velocidad se dibuja en el eje de ordenadas

159

(vmax) y los correspondientesvaloresnegativosde sustrato(-[S]) sedibujan en el eje de abcisas

(Km). Los dos puntosse unenextrapolandola línea en el espaciovmax e Km. En la Figura 38 se

muestraestarepresentación,obtenidaa partir de los resultadosde velocidad de reacciónde la

isoforma 1 de arginasa.Los valoresde Km y vmax que se obtienenson4,9 mM y 5,25 MmoIes de

amonio- mirr respectivamente.

La representaciónde dobles recíprocasde Lineweaver-I3urk es la más utilizada; sin

embargo,produceimportantesdesviacionesde los valoresde Km y Vmax, ya que los posibles

errorescometidosen las medidasafectanen mayor grado a las doblesinversasde velocidady

concentraciónde sustrato.

La tercerarepresentaciónelegida parael cálculo de los valoresde Km y vmax fUe la de

Hanes,una transformaciónde los datosdirectosen la que se eligen los pares[S]-v<y1/[SJ.Los

resultadosobtenidosse muestranen la Figura 39. El valor de Km obtenido fUe de 1,25 mM y el

de vrnax de 2,79 pmolesde amonio-mirA.

El efectode la atranorinay los ácidosevérnicoy úsnico sobrela velocidadde reacciónde

la isoforma ¡ de arginasasemuestranen las Figuras37 A-U (representacióndirecta)y 39 A-U

(representaciónde Hanes).La concentraciónfija de cadaefector, utilizada en este estudio,es la

que sedetallaen la Tabla [de Materialy Métodos(apartado11.12).

La atranorina 33,3 nM (Figs. 37 A y 39 A) se comporta como un activador no

competitivo.Los valoresde Km y vmax de la isoforma1 varian en presenciadel efector y, según

la representaciónde Hanes(Fig. 39 A), los valores estimados son: Km(ap) 1,1 mM y

vmax(ap) 6,64 utmolesde amonio-rniiv1.

El ácidoevérnico 130,0 nM (Figs. 37 B y 39 13) produceuna pequeñaactivacióny podría

tratarsede un activadormixto. El valor de Km(ap) de la isoforma 1 en presenciadel efectores

0,68 mM segúnla representaciónde Hanes(Fig. 39 B); el valor de vntax(ap)que se obtienees de

2,75 pmoles de amonio-mirA.

A diferenciade la aciranorinay el ácidoevérnico,el ácidoúsnico ¡73,3 nM (Figs. 37 U y

39 U) se comportacomo un inhibidor competitivo de la isoforma1 de arginasa.Los valoresde

160

Km(ap) y vmax(ap)en presenciadel efectorobtenidosapartir de la representaciónde Hanes(Fig.

39 U> son de 3,4 mM y 3,32 umolesde amonio-mint,respectivamente.

111.4.2.-Sobrela isoforma111 de ar2inasa

La estimaciónde la velocidad de reacciónde la isoformaHl frente a concentraciones

crecientesde sustrato(L-arginina) serealizó segúnlo descritoen los apanados11.11. y 11.12 En

la Figura 40 semuestranlos resultadosobtenidos.

La variación de la velocidad de reacciónen fUnción de la concentraciónde sustrato

muestrauna cinética sigmoidal, caracteristicade enzimasalostéricas.A concentracionesde L—

arginina superioresa 7 mM seapreciauna ligera inhibición por excesode sustrato.El valor de

So,S (zy Km), estimadoa partir de estarepresentacióndirecta,es de 4,5 mM y el de vmax de 2,12

jimoles de amonio-mm-1

La representaciónde Hill (Fig41) enfrentando log(~v~) log [s], normalmente

utilizada en los análisis de cinéticasde tipo alostérico,da valoresde pendientede las rectas

ajustadaspor mínimoscuadradossuperioresa uno. Uomo sediscutiráampliamente,estaseriaJa

primerapruebasobreexistenciade cooperatividadpositivaenel ligamientodel sustrato.

EL efectode la atranorinay [osácidosevérnicoy úsnico sobrela velocidadde reacciónde

la isoforma111 de arginasasemuestranen las Figuras40 A-U (representacióndirecta)y 41 A-U

(representaciónde Hill). La concentraciónfija de cadaefector, utilizadaen esteestudio,es la que

se detallaen la ‘-labIa 1 de Material y Métodos(apartado11.12). Los tres fenoles:atranorina190

nM, ácidoevérnico390,0 nM y ácidoúsnico 470 nM, se comportancomo inhibidores,ya que la

velocidadde reacciónde La isoforma 111 de arginasadisminuyeen su presencia.Los valoresde

S0 5(ap) son: 4) mM en presenciade atranorina;4,4 mM en presenciade ácidoevémicoy 4,5

mM en presenciade ácido úsnico(TablaXIII).

161

111.4.1— Sobre1» isoformaIV de ar2inasa

La estimaciónde la velocidad de reacciónde la isoforma IV frente a concentraciones

crecientesde sustrato(L.arginina)serealizó segúnlo descritoen los apartadosliii. y 11.12. Fn

la Figura42 semuestranlos resultadosobtenidos.

La variación de la velocidadde reacciónen fUnción de la concentraciónde sustratose

puedeasimilar a una hipérbola, lo cual demuestraque la isoforma Iii es una enzima micaeliana.

En estecaso,a diferenciade los anteriores(Figs. 37 y 40), no seapreciainhibición por excesode

sustratoen cl rango de concentracionesensayadas.El valor de K1~, estimado a partir de esta

representacióndirecta,es de 4,45 mM y el de vmaxde 3,0 imolesde amonio-mirr

En la Figura 43 se muestrala representaciónde Eisenthal-Uornish-Bowdenobtenidaa

partir de los resultadosde velocidadde reacción.Los valoresde Km y Vmax que se obtienenson

4,0 mM y 4,7 íimoles de amonio-muy1,respectivamente.Los valoresde Km y vmax obtenidos

mediantela representaciónde Hanes(Fig. 44) frieron: Km = 3,0 mM y vmax = 4,2 ~imolesde

amonio-muy

El efectode la atranorinay los ácidosevérnicoy úsnicosobrela velocidadde reacciónde

la isoforma IV de arginasasemuestranen las Figuras42 A-U (representacióndirecta)y 44 A-U

(representaciónde Banes). La concentraciónfija de cadaefector,utilizada en esteestudio,es la

que sedetallaen la Tabla1 de Materialy Métodos(apartado11.12).

La atranorina1,69 mM secomportacomo un activadormixto (Figs 42 A y 44 A). Los

valoresde Km y vmax de la isoformaIV varíanen presenciadel efector y, segúnla representación

de Hanes(Fig. 44 A). los valoresestimadosson Km(ap> = 0,96 mM y vmax(ap)= 3,95 timoles de

amonio-muy

El ácidoevérnico LIS mM (Figs. 4213y 4413) y el ácidoúsnico 1,27 mM (Figs. 42 U y

44 U) se comportancomo inhibidoresno competitivosde la isoformaIV. Los valoresde Km(ap)

que seobtienena partir de la representaciónde Hanes(Figs. 4413y C) son 3,16 xnN4 y 3,05 mM,

respectivamente.Los valoresde vmadap)de la misma representaciónson 3,69 y 3,39 gmoiesde

amonio-miw , respectivamente.

162

En la Tabla XIII seespecificanlos valoresde Km y vmaxen ausenciay presenciade cada

efector.obtenidasde cadauna de las distintasrepresentacionesgráficas.

1.63

Efecto de la concentraciónde L-arginina(O) sobreJa velocidadde reacciónde

la isoforma 1 de arginasaa una concentraciónde 13 gg-mV1. En (A). en

presenciade atranorina33,3 nM (e); en (13), en presenciade ácido evérnico

130,0nM (@)y en (U), en presenciade ácidoúsnico 173,3 nM (e).

Figura 37.-

<7

~lb

fi.

3

1

<1‘-9

2---A

E

.4 ~1¿

--.9

E(E,

‘--AoE ci)

03

2

(1

ci)

JL—drgi iii na (mM)

2 4- 6 8

165

Figura 38.- Representaciónde Eisenthal-Uornish-Bowdenparala determinaciónde Km Y

vmax de la isoforma1 de arginasa.

yUd X

*

y[U¿IX

(y )Ci)

*k

U’(1 0 1< m

167

Representaciónde Hanessobrela variación de la velocidadde reacciónde la

isoforma1 de arginasa(13 ~g-.mh1)(O) en función de la concentraciónde L-

arginina, y = 0,45 + 0,36x; r = 0,97. En (A), en presenciade atranorina33,3

nM (@>, y 0,17 +0,15x; r = 0,99; en (B), en presenciade ácido evérnico

130,0 nM (e), y = 0,25 = 0,36x; r = 0,99; y en (U), en presenciade ácido

Osnico 73,3 nM (@),y 1,02 = 0,30x; r 0,96.

Figura 39<

‘--4

E

‘-—1

o--9

o(7

(U

‘-9

5<

2.

o

rE,E:

--9st . oi.-. .>

(E,

-J

L—arqi ni. na (mM

.4 -2 <1 2 4- 6 8

169

Figura 40< Efecto de la concentraciónde L-arginina(O) sobrela velocidadde reacciónde

la isoforma [II de arginasaa una concentraciónde 93 ~igmL1. En (A), en

presenciade atranorina190 nM (e); en (13), en presenciade ácido evérnico

390,0nM (@) y en (U), en presenciade ácidoúsnico470,0nM (@).

4 6

(1,3

~, 2

ci) 1

(1

0,3

(1, 2

ci> .1

o

0, 3

0, 2

0, J.

ti)

1.0

2,5

2 , ci)

1.. , 5

1, ci)

(1, 5

2,5

2 , O

.1,5

1., 0

ci), 5

o

2,5

2 1)

8

—4

E:

E

o-H

oECE,

cfoE

A

— oo

e - e--..

—a.0 aN

o a

o

o

(1 ,—9—j-

e~-•e---oa. a.

o

.1 5

.1. , (.1

ci), 5

(.1

(1

o

-y 8

L—arqtni na (m M>

171

Figura 41- Representaciónde Hill sobrela variación de la velocidad de reacciónde la

isoformaIII de arginasa(93 pg-m11) (O) en fUnción de la concentraciónde

L-arginina. En (A), en presenciade atranorina 190 nM (e); en (B), en

presenciade ácido evérnico 390,0 nm (•) y en (U), en presenciadc ácido

úsnico470 nrn (@).

A

o

st0

‘-9

o

-5<

(E,

E

3

2

<.1

-y—A?

(1

—y

~1

2

.1

ci.)

o

o

B

~11.

0,? 0,4

o

c

ci> 2 ci) 4 0

2

3

—o.

0,? (1,4 ci)

7-,0

[,(1

1 oc; L— dr ~3 ni na (mM

173

Figura42< Efectode la concentraciónde L-arginina(O) sobrela velocidadde reacciónde

la isoforma IV de arginasaa una concentraciónde 6 pg-mh1. En (A), en

presenciade atranorina1,69 mM (@); en (B), en presenciade ácido evérnico

1,15 mM (@)y en (U), en presenciade ácido úsnico 1,27 mM(S).

A

e

e—j—--—- e —

-- - o~O 0

e.. --oA.-.

O—

‘A

x0 ji

a

.-zzz

-o-o--

- e—o—e

— - 0-e.——a

1 .

2 4 6 8

c

.10

4

3

-y

-9

--.9E

o--40oE(E,

—9oE

o

(1

4

-y

()

4

3

2

tI)

()

L—drqhii naj (rnt’l)

175

Figura 43< Representaciónde Eisentbal-Uornish-Bowdenparala determinaciónde Km Y

Vinax de la isoformaIV de arginasa.

yHl dX

YIII ¿1 X

(y )o it

1< 1k

m ji)

177

Representaciónde Hanessobrela variaciónde la velocidadde reacciónde la

isoforma IV de arginasa(6 ~g-mh1)(O) en función de la concentracióndc L-

arginina, y 0,72 + 0,24x; r 0,98. En (A), en presenciade atranorina1,69

mM (@), y 0,24 ±0,25x; r = 0,99; en (B), en presenciade ácido evérnico

1,15 mM (@), y 0,86 + 0,27x; r 0,99; y en (U), en presenciade ácido

úsnico 1,27 mM (e), y = 0,90±0,29x; r = 0,98.

Figura 44<

2-‘9

a+

2

E(E,

E

E

(U

2

-‘-A Ost >

(E,

-J

—4 —2 (1 2 4 6 8 [0

(m 1-1)L—ar-qt í~ii n ¿.1

17

9

-t‘o‘o

o’

‘no

’t4-

04

r-.C

AIr.

04

o3—

.—o

.—

rRtE3-.

‘o-

—

<9

Eo

—e->

o~-<

O;

o’

e

oo

it

ItO

’0

4

—-t

—

eou

oUDUD

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o‘oorl04

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Ir.o-’CA—.

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O—

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o,O-E:3-j~

o-ee->UD8-e->e>OUDUDe-eoUDUDoO-s‘UDo-aaoO2‘e’)

eo-aOUDUDUDUDoUDUD3-

encie-)-UD3—COeneUDoOciUDeene’)A—.O

-a

;3—ene’)UDe’)

A)

-ee)UD-ci-6e’)

Eenci—

ee).0ocienciUDCOA—ci

e)-eA

-encieoo<-4-oC

A

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CC

Oe’)ee-)ene)UDcienUDoQA-cici

UDUDUDUD

~-.22

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E

-oe)5UDe’)4

)3—aO

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D

oC

Ce-e

e->a

-e-e

..3

-oUD

‘-.

—4

4

enO

a‘-~

~o.

**

180

¡JIS- EVALUACION DE LA COOPERATIVIDAD. ECUACION DE HILL

En estebloquesepresentala TablaXIV

181

En algunasenzimas,la presenciade efectoresmodifica el patrónde unión al sustrato,bien

facilitándola (cooperatividadpositiva), bien dificultando dicha unión (cooperatividadnegativa)-

Con objeto de evaluarestaposiblecooperatividadseeligió la representaciónde Hill. En la Tabla

XIV se muestranlas ecuacionesde las rectas,ajustadaspor mínimos cuadrados,resultantesde la

representacionde los resultadoslog~ VO) frente a log [L-arginina]de las tres isoformas,1,

III y IV, de arginasa,en ausenciay presenciade los tres efectores(atranorinay ácidosevérnicoy

úsnico).

Como puedeobservarse,el valor de ItA, pendientede la recta, es menor de 1,5 en las

rectascorrespondientesa las isoformas1 y IV. Estapendienteadquiereun valorde 4,4 en la recta

correspondientea la isoformade arginasa111.

Las pendientesde las rectasque correspondena la isoforma1 en presenciade efectoresno

se modifica sustancialmenterespectoa aquellaobtenidaen su ausencia.Las pendientesde las

rectasque correspondena la isoforma III son 3,75 en presenciade ácido evérnico; 5,15 en

presenciade atranorinay 5,74 en presenciade ácidoúsnico.

Las pendientesde las rectascorrespondientesa la isoforma IV no varianen presenciade

ácidoevérniconi de ácidoúsnico(1,25 y 1,20, respectivamente),pero en presenciade atranorina

adquiereun valor de 1,94. Estosvaloreshande compararsecon la pendienteobtenidaen ausencia

de efector,igual a l,24.

iSla

‘labia XIXk- Ecuacionesde las rectas, ajustadaspor mínimos cuadrados,obtenidasmediantela representaciónde Hill, parala evaluaciónde la cooperatividadde las isoformas 1, III y IV de arginasaen presenciay/o ausenciadeeféctores.

1 soforí na

Ecuaciónde la recta

dearginasa

Sin efectoi Uon efector

- 0,358 Y 0,42*x

Atranorina(pM) Acido evérnico(pM) Acido úsnico(pM)

y - 0,45 + l,55x y -0,33+ l,65x y -0,49±0,93xr=0.98 r=0,98 r0,97 mO,98

111 y>’ -2.67± 4,40x y = -3,41 + 5,15x y = - 1,88±3,75x y -3,34+ 5,74xr=0,96 r=0,99 r=C,97 r=0,95

[V y~’—O,68± 1,24x yz~-O,79±],94x y-O,55+ l,25x y=-O,52+ l,20xr=099 r=0,98 r=0,97 r=0,97

* EL valor de la pendiente.ti (constantede Hill). da una ideadel grado de coeper-atixidad.Para valores

dcli — 1. no hay cooperatividad.(Fersht,1985)

182

11L6.— LIGAMIENTO DE ATRANORINA, ÁCIDO EVERrNICO Y ÁCIDO USNICO A

LAS ISOFORMAS 1, III Y IV DE ARGINASA

En estebloquesepresentanlas Figuras 45 a 62 Y la

TablaXV

183

La unión de una moléculade efectora una proteínaes el primer pasode su regulación.

Con objeto de analizaresteposiblefenómeno,serealizaronestudiosde ligamiento medianteel

métodotradicionalde equilibrio de diálisis, descritoen el apanado11. 14 de Material y Métodos.

Parala elaboraciónde los resultadosseeligieron diferentesrepresentacionesgráficas.

IIL&L- Lisamiento a la isoforma 1

Parapoderdeterminarla unión efector-proteinaesindispensableconocer,en primerlugar,

el tiempo necesariopara que el ligando libre se encuentreen equilibrio. En la Tabla XV se

recogenestosresultados.El tiempo requeridoparadetectaratranorinalibre en equilibrio entrelas

dossubcámarasde diálisis esde 6 h, el del ácido evérnicode 4,5 Fi y el del ácido úsnicode 14 b.

Los tiempos de equilibrio no varian en función de la isoforma de arginasa,siendoel mismo en

todos los casos.

111.61.1.-Atranorina como ligando

La cinética de saturación del ligamiento (ligando unido frente a ligando total) de

atranonnasemuestraen la Figura 45 A. La saturaciónde los sitios de la isoforma1 seobtiene a

partir de los 0,1 jimoles de atranorinatotal. En la Figura 45 B se muestrala representaciónde

dobles inversas( r’ frente a [L]1) de los resultadosdel ligamiento de atranorina.Los puntos

obtenidosse puedenajustara una curvaexponencial.La inversadel punto de cortecon el eje de

ordenadas,igual a 4,0, proporcionael número aproximadode sitos de unión que posee la

proteínaparael efector. Por tanto, el númerode sitios de unión paraatranorinaen la isoforma1

de arginasaescuatropormoléculade proteína.

La representaciónde Scatchard(r/[L] frentea r) del ligamientode atranorinase muestra

en la Figura 46 A. Los puntos obtenidosno puedenasimilarsea una recta, hecho que sera

explicadoposteriormente,sino que seajustanaunaparábola.

184

La representaciónsemilogaritmica(r frentea log [efector]) permiteobtenerun espaciado

uniforme de los resultados,lo que facilita la valoración del número de sitios de unión por

moléculade proteína,hechoque, en otrotipo de representaciones.puedequedarenmascarado.La

representaciónsemilogaritmicadel ligamiento de atranorinaa la isoforma 1 se muestraen la

Figura46 8. El númerode sitios de unión pormoléculade proteína,estimadopor intersecciónen

el ejede ordenadasdel nivel de saturación,es de — 4 0

IH.ÓAZ- Acido evérnicocomoligando

La cinética de saturacióndel ligamientode ácidoevérnicoa la isoforma1 se muestraen la

Figura 47 A Uomo puedeobservarse,dichasaturaciónseproducea partir de 0,05 timoles de

ácidoevérnicototal, En la Figura47 13 semuestrala representaciónde doblesinversas,El número

de sitios de unión por moléculade proteina,estimadoen estacurva exponencial,esde — 4 0 La

representaciónde Scatchardse muestraen la Figura 48 A. Uomo puedeobservarse,existe

igualmenteun alejamientode la linearidaden los puntos. La representaciónsemilogarítmicadel

ligamiento del ácidoevérnicoa la isoforma1 se muestraen la Figura48 B. El númerode sitios de

unión por moléculade proteinaseestimóentre4 y 5.

111.613.-Acido úsnicocomo ligando

La cinética de saturacióndel ligamiento de ácido úsnicoa la isoforma 1 de arginasase

muestraen la Figura 49 A. La saturaciónse producea partir dc 0,05 límoles de ácidoúsnico

total. En la Figura49 B se muestrala representaciónde doblesinversas.Lacurvaexponencialque

seobtieneal ajustarlos puntosproporcionaun valor estimadode 10 sitios de unión por molécula

de proteína.En la representaciónde Scatchard(Fig. 50 A), los puntosseajustancasi a unarectay

no a una parábola,como ocurre con el ligamientode atranorinay ácido evérnico. El punto de

cortecon el eje de abcisasda un númerode sitios de unión parael ácidoúsnicopor moléculade

isoforma1 — 10,0. Estevalor tambiénconcuerdacon el obtenidoa partir de la representación

185

semilogaritmica(Fig. 50 13). También debe resaltarseen este punto que el ácido úsnico es

inhibidor competitivo de la isoforma 1 de arginasa,es decir compite con la L-arginina por el

centroactivo de la proteina<TablaXIII).

lI1.62.- Ligamiento a la isoforma III

1W62,I- Atranorina como ligando

La Figura 5 1 A muestrala cinéticade saturacióndel ligamiento de atranorinaa la isoforma

111 de arginasa.Los sitios de unión en la proteínasesaturana partir de 0,07 pmolesde atranorina

total. Sin embargo,paravaloressuperioresde ligando total, puedeverseuna disminuciónde la

cantidad de atranorina unida. Este fenómeno también se observa en la representación

semilogarítmica(Fig. 52 B). En la representaciónde dobles inversas(Fig 5 1 B), los puntos se

puedenajustara una cunaexponencial,cuya inversadel punto de corteen el ejede ordenadasda

un valor de 26 sitios de unión por molécula de enzima. O, lo que es lo mismo, una alta

inespecificidadde unión. La representaciónde Scatchardsemuestraen la Figura 52 A. En este

casose puedeobservarunaclaradesviaciónde la linearidadde los puntos.Estospodrianajustarse

bien a una parábolao, como se intentaexpresarcon la línea discontinua,a un posible ciclo de

— —AV

histéresis

1W62.L-Acido evérnicocomoligando

La cinéticade saturacióndel ligamientode ácidoevérnico a la isoforma111 de arginasase

muestraen la Figura 53 A. La cinética, queeshiperbólica,muestrala saturacióna partir de 0,075

pmolesde ácidoevérnicototal. En la Figura 53 13 semuestrala representaciónde doblesinversas.

La curvaexponencialque seobtieneen el ajustede los puntosproporcionaun valor estimadode

8 sitios de unión pormoléculade proteína. En la representaciónde Scatchard(Fig. 54 A), los

puntos se alejan de la linearidad,ajustándosea una parábola.El valor del númerode sitios de

186

union del ácido evérnico a la isoforma III de arginasa,obtenido mediantela representación

sernilogaritmica,da un valor de 6 (Fig 54 B), algo menor que el obtenido a partir de la

representaciónde doblesinversas(rr’8).

111.6.2.1-Acido úsnicocomo ligando

La Figura 55 A muestrala cinética de saturacióndel ligamiento del ácido úsnico a la

isoforma111 de arginasa.Los sitios de unión de la proteínase saturana partir de 0,14 pmolesde

ácido úsnico total. En la representaciónde dobles inversas(Fig. 55 13), el ajustede los puntos

coincide con una curva exponencialcuya inversa del punto de corte con el eje de ordenadas

permite estimar en 26 el númeroaproximado de sitios de unión por moléculade proteína. Es

decir, en estecaso existe una alta inespecificidadde unión. En la representaciónde Scatchard

(Hg. 56 A) los puntos se puedenajustara una parábola, tal como ocurre en los casosdel

ligamiento del ácidoevérnico a la isoformaIII. El númerode sitios de unión parael ácido úsnico

por moléculade isoforma III es de — 28 según se deducede los resultadosobtenidosen la

representaciónsemilogaritmica.

11L63- Ligamiento a la isoforma 1V

111.63.1.-Atranorina como ligando

La cinética de saturacióndel ligamiento de atranorinaa la isoforma IV de arginasase

muestraen la Figura 57 A. Uomo puedeobservarse,dichasaturaciónse producea partir de 0,18

gmolesde atranorinatotal. En la Figura 57 B se muestrala representaciónde doblesinversas.El

númerode sitios de unión para atranorinaes de — 23, lo que nuevamentedemuestrauna alta

inespecificidaden la unión. La representaciónde Scatchardse muestraen la Figura 58 A. Uomo

puede observarse, existe igualmente un alejamiento de la linearidad en los puntos. La

187

representaciónsemilogaritmicadel ligamientode la atranorinaa la isoformaIV se muestraen la

Figura 58 B. El númerode sitios de unión pormoléculadeproteínaseestimóen 16.

111.63.2.-Ácido evérnicocomo ligando

La figura 59 A muestrala cinética de saturacióndel ligamiento de ácido evérnico a la

isoformaIV de arginasa.Los sitios de unión en la proteínasesaturanapartir de 0,015 pmolesde

ácido evérnicototal. Sin embargo,como ocurreen el ligamientode atranorinaa la isoforma III

(Fig. 51 A), paravaloresdel ligando total superioresa 0,015 jimoles, existe un descensode la

cantidad de ácido evérnico ligado. Este fenómeno también se observa en la representación

semilogaritmica(l-lg. 60 13>. En la representaciónde dobles inversas(Fig. 59 13) los puntos se

puedenajustara unacurvaexponencialcuya inversadel punto de corteen el eje de ordenadasda

un valor de 5 sitios de unión por moléculade enzima. La representaciónde Scatchardse

muestraen la Figura60 A. En estecasose puedeobservarunaclaradesviaciónde la linearidaden

los puntos. Estos podríanajustarsea una parábola o, según se muestracon la representación

discontinua,a un posible ‘ciclo de histéresis.Recordemosque el ácido evémicoactua como

inhibidor no competitivode la isoformaIV, mientrasque se comportacomo activadormixto de la

isoforma1 (TablaXIII),

111.63.3.-Ácido úsnicocomo ligando

La Figura 6 1 A muestrala cinética de saturacióndel ligamiento del ácido úsnico a la

isoformaIV de arginasa.Los sitios de unión de la proteínaparaesteefectorsesaturana partir de

0,075 pmolesde ácidoúsnico total. En la representaciónde doblesinversas(Fig. 61 B) el ajuste

de los puntos coincidecon una curva exponencialcuya inversa del punto de corte en el eje de

ordenadaspermiteestimaren — 32 el númerode sitios o, lo que es lo mismo, vuelvea existir una

altísima inespecificidaden la unión. En la representaciónde Scatchard(Fig. 62 A), los puntosse

puedenajustara unaparábola.El númerode sitios de unión parael ácidoúsnicopor moléculade

188

isoenzimaIV es de — 24. segúnse deducede los resultadosobtenidosen la representación

semilogaritmica(Fig. 62 13).

sou-

-roc

‘oso

Cl

o’

0(0

-tIt

CC

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0O

’O

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00

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04

It—

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00

0—

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4Ú

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’O

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000006

6o’6

55

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00

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u--t

u-u-

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ococ

00

00

00

00

00

00

00

04

It0

00

ItIt

-tO

’It

oc0

4oc

‘“‘04

Cl

00

t0

4‘It

O’

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00

40

4u-

00

0oc

00

00

0—

0

‘OIt

-yO

r’t

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40

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~-04(0

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189

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ce

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e,

cici

oE8COE‘ItooOEen-U

Do-aao-eeceCOoEoe’->

EIto¡

oo<.1-é-o)4

)o-oOo-aeclCOoEoe-)Eoc

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¡oe-CC

CC3--CCEUDC

Cce3—

-nUDC

C

e->o-ae’->A.rC

a—’

EE

ce3—UDC

CCC3--,

UDC

C

00

o’-.-

190

Figura45< Ligamientode atranorinaa la isoforma1 de arginasaa una concentración2,55

~íM.En (A), representacióndirecta; en (B), representaciónde dobles-inversas

dondeel alustede la curvaexponencialesy = O,25.e28-2~> X ; r = 0,89.

—loE

Gr

2

A--.-o2a<--4

4-)

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(1,0!?

(3 008

, It) ~

a

L — <~ trinor.I. JI<iIU

3

2

0, 02 0, (14 0, o~

0,025 U, 05(1 0,075 0,100 0,125

.1.

CE,

2--4

ooCE,

42

CE,

42

o-

U. A

ee

e

-e-c

e

e

-R

(1

0 , 08

—.1

(1, .1 0

1 (— 1 —- Uy- 1 fl nr i 1<I (ji??

192

Figura 46< Ligamientode atranorinaa la isoforma1 de arginasaa unaconcentración2,55

Um. En (A>, representaciónde Scawhard; en (B), representacionserni—

logaritn1ica.

0, (36

(3. (34

<¾ (32

(3

(3 2 4

r a iranori ria

.1. , (3 .1. , 5

ti

/1’> ti

ioq LI mg a trariori na

2-

CE,

---4

3--.-o

CE,

U..4~)

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4->o-

CG

-M‘—4o‘-0U.40

It

A• e

e

•1. e—e

U. W

42o-

GrCG

2---4U.o

CE,

U.42CG

U.

4, 5

.3, 5

25

[‘5

0, 5

(3

8

e

e

ee.

e-II

(1 0, 5 2,0 2,5

II>

194

Figura 47.- Ligamiento de ácidoevérnicoa la isoforma1 de arginasaa una concentración

de 2,55 ÁM. En (A), representacióndirecta; en (B), representaciónde dobles-

inversasdondeel ajustede la curvaexponencialesy = 0,23 e4’~ X ; r = 0,93.

(3, (3~oE2-

Gr

2 0,02--4

-‘ 1)

1)

(1, 0.1(~2

CE,

¡ ¡

a-J o

(3 0,020 0. 040 0, 06(3 0, 08(3

L oc • cvéx-nE co~ ( [lm()i )t

ti

Groo

-‘-4

51-.-

‘o0>do

(-5CE,

A—

42

o-

rl

—-4

(3

0, 2

L j —j (pF-í

A

0, 05 1 jipi el

e

exe

ee

(1 0, 4 04.6 1) 8

xv loe. evernicoj — 1.

196

Figura 48- Ligamiento de ácidoevérnicoa la isoforma1 de arginasaa una concentración

2,55 pM. En (A), representaciónde Scatchard,en (13), representaciónsemi-

logaritmica.

2-.

0,4 A

ee- -

‘¾ ¡ O

o-lo~ 1< (1,? e(5

e e-—~<~ e e

‘Co ¡ do

do 10.~) ()

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<OCE, - 0 1 3 5

r dO. everfijeo II->U. K-± (3 ti

tú 5

o-

Gr

(o-‘--4

.3U.

‘0

Co

Co

CG l¡ ¡

U. ()

(.1

(pH)

0,5 ].$) 1,5 .

loq JLJ u-. Iog J¿ic. everriicoj

198

Figura 49.- Ligamiento de ácidoúsnico a la isoforma1 de arginasaa una concentración

2,55 pM En (A), representacióndirecta; en (13), representaciónde dobles—

inversasdondeel ajustede la curvaexponenciales y -= 0,11. e4-76 X ~ 0,92.

(1, (.1 3

--4

o _______

E2-

(1, (3?o.

oej

Qn

(1, (3e-oCG

Gr-2

(5 0, 025 0, (>50 0, 075 (1, ]. (30 0,125

L u ac • ¿gui CO~ (riPio1U

(3, 6>

1), 5

GroCO

0,42Qn

‘2

0 3CG

42o-

0,?

—4

1-.-

(ji,’

(1

A

___ e ¡— e ~ e -~ A

U,(>87rrno1

ee

1

0 06 (3, 2 0, 3 (3, 4 0, 5 0, 6 0, 7 0, 8

yzj ac. (isr¡i oc —.1 (¡fil —i

200

Figura 50.- Ligamiento de ácidoúsnico a la isoforma1 de arginasaa una concentración

2,55 MM. En (A>, representaciónde Scatchard;en (B). representaciónsemi—

logar¡tmica.

It 8

U de. USflIC() IP

A

1—

ti

1,5 2,0

.3

—A

0.~

4-’

o-

o co‘~o ---~

-,-~ 2

2 QnQn ‘(o

4- -t‘E,

ee

e

e

U. .2

-,

8

4-5o-

O-o

Qn‘(o

COCE,

4.

U.

(ji(ji 0,5 .1 0

Log xv l.oq jac. ¿sraico[ (¡i(’l)

202

Figura 5 1.. Ligamiento de atranorinaa la isoforma III de arginasaa una concentración

1,42 MM. En (A), representacióndirecta; en (13), representaciónde dobles--

inversasdondeel ajustea la curvaexponenciales y 0,04. e3938N; r = 0,96~

(1, 020

(3, 025 (1, (3.5(3

~ tiran un ¡LI

(3,075 0, 10(1

u1)

(3 (3, (32 0, 04 0, 06 0, 08

—l( ~‘í4 )

---1oEo-

(3 (>1 5Gr

(3. (31 (1

(3 (1(15

A

e

e

eey

CE,

---1

£1

4-)

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.2

CE,

o

U.o

U.rE,U.

42

-E,

4-5o-

rl

—4.

1-

,

<.1

(ji

(10

Gr

(1, 7 5

(ji — 5 0

(1, 2 5U.

(ji

¿‘Uranon jia

204

Figura 52.- Ligamiento de atranorinaa la isoforma 111 de arginasaa una concentración

1,42 pM. En (A), representaciónde Scatchard;en (13), representaciónsemi-

logaritmica.

—4

4 8 12 16

xx atrapar i Ha IP1~> <~

0 0, 5 1, 0 1, 5

(3, /4

42

o-

‘-unici:

-—-4U.

0CE,

U.-4-5

‘E,

en

U.

enU.

42CE,

(3 , 2

o

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U. .~J

16

12a

O-CE,

U.O

OU.

4-)

CG

U.

12

‘9

4

6

e—¡ e

e

¡e

e

¡0

(ji

Ít>q jL — .10(1 a Uraliar ¡ (111-1)

206

Figura 53.- Ligamiento de ácido evémico

concentración 1,42 uM. En

representaciónde dobles-inversas

=0,l3.e~144~;r =0,96.

a la

(A),

donde

isoforma III de arginasa a

representación directa; en

el ajustea la curvaexponencial

una

(13),

esy

0¶03 A

E2-

e--— e----O (ji (32 —

A¿ 0, 045~ el

‘doe

CO

(ji, (jij —

(-3CE, e

Gr

.2 (3 _______________________________

(3 0,025 (3,0.5<) (1, (375 0,10(3

U ( yL cx a~• <2Veriri cO~~ 3W .) 3,

3 8Gr

O(5’ e

U.‘00 (2

do

(-5CE,

42 eo-

II

‘----4e

U.(3

<) 0, 05 0, 10 0,] 5 0,20 (1,25

LI1 ¡¿‘e. everrIÍco (pF§1

208

Figura 54.- -Ligamientode ácido evérnico a la isofornia III de arginasa a una

concentración 1,42 pM. En (A), representaciónde Scatchard;en (8).

representaciónsemi-logaritmica.

<ji, 5

0, 14

(1

(ji, -)

O , 1

O

r xx d~ cvernl Co

8

e>

.2,-2.

O

¡PL

0 (~ji,5 1~,0 1,5 2,0

Joq U

———4

ir

a(o

-‘--42

U.‘do

-ACo

ni

U. .2

42

o-

GrO

(o-itaU.

‘GO

ni

(.1 2 4 6 8

-42

o-

Gr(-1

COnR

a-4

‘do0>CO

CO

ni

xx ioq ¡¿‘O OV¿tHl Co J (pl’1)

210

Figura 55< Ligamientode ácidoúsnico a la isoformaIII de arginasaa unaconcentración

1,42 MM. En (A), representacióndirecta; en (B), representaciónde dobles--

inversasdondeel ajustea la curvaexponencialesy = 0,04. e’3- II ~ r = 0,85.

1), <) 4

L y-udc • usniti

e {J~ ~111fl0 1 )

0 0,05 0,1<) 0,15 0,20

‘—4

(1, 03

a-

t1~)

-J

U, 0?

o , ~j ¡

CV

00 (3, 04 0, 08 0, ¡ 2 0, ] 6

a-a

0

1<

4-)o-

ji

0, 3

0,?

0, 1

o

IL )

212

Figura 56< Ligamiento de ácidoúsnico a la isoformaIII de arginasaa una concentración

1,42 jíM. En (A), representaciónde Scatcbard; en (B), representación

semilogarítmica.

21~

u,

.4 Jo

“o

‘o

~1O

4-,

o-

a

“o

“o

2 0

.3 <~)

9

0, <;

0, 3

o.3. 0 2 (.1 30

U dO. [ASPI 0<) /Pe

(3 0,5 t,0 1,5 2,0 2,5

A

e

ee

6

ee

e

e

e e

¡cg jL 1 log Jac. ésíiico (1iM)

214

Figura 57.- Ligamiento de

1,50 jiM. En

dobles-inversas

r~ 0,98.

atranorinaa la isoforma IV de arginasaa una concentración

(A), representacióndirecta; en (B), representaciónde

dondeel ajustede la curva exponencialesy = 0,04e71’70X;

(1,025

U • 02 u

<¼(>15

0 ¡ (1

a- (1, 0(15

(.1

0, 06 0, ¡2 0 18 0,24

a tiranor 1 lidAh

U. 01 0, (12

ni>

0, 04

—1.-z cl tranorina —1

--4

E

‘-4

01

4-4

rl

h Ae — e

e A0, 1 9~iLírnol

e

e

e’‘e¡ e

(.)

1,5

.1,2

0~rla

oarl

4-,a

4-)o-

IP

0, 9

(..), 6

<1,3

()

II. 1~-’

(.1 0 3 0, 05

216

Figura 58.- Ligamiento de atranorinaa la isoforma IV de arginasaa una concentración

1,50 iM. En (A), representaciónde Scatchard;en (B), representaciónsemi-

logarítmica.

a-U, 1;?

r .. a tranur’ Ita1’ ~‘

1,0 1,5 2,0 2 5

o-

a-“o

‘-4aa09

4-,

“o

01

4—)

01

U ,U9

U, 0<;

(1, 0 3

uo

t4 -J

4 8 ¡2 16

16

4-)o-

o-01

aa01

4-2

Ir

‘-4

.1 2

5

4

8

2e

e

e

ou 0, 5

1 vg LI ] cg Jatraricrina (pH

218

Figura 59.- Ligamiento de ácido evérnico a la isoforma IV de arginasa a una

concentración 3,50 jtM. En (A), representaciónde Scatchard; en (B),

representaciónsen-u-logarítmica.

u, uU¿—4

Ea-

u, <>040~

•‘-4

a~1,

1,>

U, UU2

Ir

-2 uU 0, (>1 0, (12 0, 03 (1, (14

L

3 , O

24)

a

‘0

O3 (1

o01~ 0,6

o-

II (1, (Ir

—4

0,2

o0, 4(1 0, 1 0,2 0 3

¡ 1~ -. j <¡e • (=verni (re ( ——I

220

Figura 60.- Ligamiento de ácido evérnico a Ja isoforma IV de arginasa a una

concentración 1,50 1M. En (A), representaciónde Scatcbard; en (B),

representaciónsemi-Iogaritmica.

2, (1O

U

(1 ,

, 2

u

(.1 1

u - ac. evcnío.Jcc

0, 5

11. 3

IP

LS.1,0

Ae

e’Ue

SL-

42o- --

CVa0 2

[-4

a

‘1) 0

COo

o01

O -J

e

O-,o-

CVao

O‘0

0

(001

4, 5

¾5

.3, (1

2, 5

8

e~.-e.e -.

‘Ae

¡e

e

ee

lOtj LI [cg Iac. evern¡ e c¡ (pH>

222

Figura 6k- Ligamientode ácido ósnicoa la isoformaIV de arginasaa una concentración

1,50 pM. En (A), representacióndirecta; en (B), representaciónde dobles-

inversasdondeel ajustede la curvaexponencialesy = 0,03 e26-53OC; r = 0,95.

u, uq—4

o

u, u3

CVoci

“-4

<) (>11-o .

01 U u¡IP

—j

u0,025 0,050 0, (>75 U, [00 0,125

L —.i<’ • usr~ ~ti

11 U)

a0~)

-4

a“o

‘E,.3 ,

(O

014-;

o- (1,5

Ir

(0 00 0, 1 5

e u sni e c

0, 05 0, 1.0

—I

224

Figura 62< Ligamiento de ácidoósnico a la isoformaIV de arginasaa una concentración

1,50 pM En (A), representaciónde Scatchard;en (8), representacionserni-

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226

111.7.-EFECTO DEL LIGAMIEI~TO DE ATRANORINA, ACIDO EVERNICO Y ÁCIDO

USNICO PRODUCIDO EN LAS ISOFORMAS DE ARGINASA

En estese presentanla Figura63 y la Tabla XVI

227

111.7.1.-Isoforma 1

El ligamiento de atranorina,ácido evérnico y ácido úsnico a la isoforma 1 de arginasa

producE:agregaciónde la proteínanativa, segúnpuedeobservarseen los resultadosexpuestosen

la Tabla XVI. ParaconfeccionarestaTabla, seeligió una de las concentracionesde efectorque

produciasaturaciónde los sitiosde unión enla proteína.

La atranorina108,0 pM (0,108 pmot en la subeámarade ligando, como se deducede la

Fig. 45 A) promuevela dimerización,ya que se detectaun agregadode aproximadamente39

kDa, el cual representaun 9,2%. De la forma nativa de la proteína,quedaun 68% despuésdel

ligamientoy apareceun terceragregadode aproximadamente30 kDa queno se sabea qué puede

corresponder.

El ligamiento de ácidoevérnico 5 1,0 pM (0,051 pmol en la subcámarade ligando, como

sededucede la Fig. 47 A) produceagregaciónde la isoforma1 a dímero,trimero, tetrámeroy un

polímero de aproximadarnentre9 unidades (Mr — J 60 kDa). La forma nativa, tras la

polimerización,representael 50% de la proteína.

El ácidoúsnico 87,0 pM (0,087pmo] en la subeámarade ligando, como se deducede la

Fig. 49 A) produceagregaciónen el 20% de la proteínanativa y aparecendímeros, trímerosy

hexámeros.

111.7.2.-Isoforma111

El ligamiento de atranorina,ácido evérnico y ácido úsnico a la isoforma III de arginasa

produceagregaciónde la proteínaen diferentesproporciones,segúnel ligando efector (Tabla

XV]).

La atranorina71,0 pM (0,071 gmol en la subeámaradel ligando, como se deducede la

Fig. 5 1 A) agregala proteínaa dímeroy trimero pero,en estecaso,tras el ligamientoapareceuna

forma de peso molecularaproximadamente19 ki)a, inferior al pesomolecular de la proteína

nativa (26 kDa).

228

El ácido evérnico45,0 ~M (0,045 pmol en la subcámaradel ligando, como sededucede

la Ng. 53 A) producelas mismasformasde agregadoquela atranorina.

El ácidoúsnico 77,0 1iM (0,077gmol en Jasubeámaradel ligando, como se deducede la

Fig. 55 A) ocasionaagregaciónde la isoforma111 de arginasaal dímeroexclusivamente(Mr 57

kDa). Se detectaun 61% de otra forma de pesomolecularinferior a la proteínanativa (Mr 18

kDa).

111.7.3.-IsoformaIV

SobreJaisoformaIV de arginasa,el ligamiento de atranorina198,0 pM (0,198 ~moíen la

subeámaradel ligando, como se deducede la Fig. 57 A) polimeriza la proteína a dimerosy

trimerosquedando,trasla unión, aproximadamenteun 90%de la formanativa.

El ácidoevérnico 23,0 ~tM(0,023 iLmol en la subcámaradel ligando, como sededucede

la Ng. 59 A> produce diferentes grados de agregación: dímeros, trímeros, hexámerosy

undecámeros.

EJ ácidoúsnico 87,0 ~tM(0,087iimol en la subeámaradel ligando, como sededucede la

PÁg. 61 A) agregala forma nativa al dímeros,trimeros, tetrámerosy un polímero de 13 unidades

(Mrt2óO kDa)querepresentaaproximadamenteel 3% de la proteínanativa.

La actividadarginasade los diferentesagregadosno ha sido anaiizada,dado el carácter

microanaliticodel métodode HPLC-exclusiónmolecularempleado.

En la Figura 63 A-C se muestrantres cromatogramasrepresentativosdel efecto de

agregaciónocasionadoen las isoformas1, III y IV nativasde arginasa,tras eJ ligamiento de los

distintosefectores.

22

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230

Figura 63< (?romatogramasobtenidosmedianteHPLC de exclusiónmolecular de los

distintos agregadosde arginasatras el ligamiento del efector. En (A>,

agregadosde la isoforma1 en presenciade 87 ninoies de ácido úsnico; en

(B), agregadosde la isoformaIII en presenciade 71 nmolesde atranorinay

en (C), agregadosde Ja isoforma IV en presenciade 23 nmolesde ácido

evérnico. Las flechasindican el pico identificado como monómero(forma

nativa).

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IV.- DISCUSION

233

Los últimos pasosde Ja vía de la sintesisy el catabolismode argininaen vegetalesson

similaresa los que seproducenen mamiferosy bacterias(De Ruitery Kollófel, 1982). Morae/al.

(1965)propusieronuna clasificaciónde los organismosen ureotélicoso uricotélicos,en ifinción

de la producciónde ureao ácidoúrico; clasificaciónque tambiénadoptaronparalas arginasasde

dichos organismos.Sin embargo,se ha descritoactividadarginasaen plantasde soja (Kang y

Cho, 1990), especieque carecedel ciclo del ácidoúrico. La importanciade dicha actividaden

estetipo de organismosradicaría,en última instancia,en la producciónde ornitina parala síntesis

de poliaminas,segúnproponenPohjanpeltoy Hóltta, 1983).

En el presentetrabajose handescritoy caracterizadocuatroisoformasde arginasa(1,11,111

y IV). si bien la isoforma 1 y la II son la misma, según se deducede su similitud en el punto

isoeléctrico (Figs. 5 y 6), en el pesomolecular(Fig. 14) y en la composiciónde aminoácidos

(Tabla y). Tambiénsehan descritoisoformasde arginasaen higadode ratón (1-lerfeid y Rapen

1976; Spolarisy Bond, 1988; Tarrabél al?, 1974) y en IV. crassa (Borkovichy Weis, 1987a)que

difieren en sus propiedadescatalíticas,molecularese inmunológicas.Las isoformas1 y IV de E.

prunastr¡ son induciblesporL-arginina, a] igual que las arginasasde E. cok (Crabeeleta!., 1975)

y Lac/obacillz¡sladis (Ananyan, 1981). La isoforma III es preexistentey posiblementeseactive

tras la liberación de arginina vacuolizada,segúndescribieronMartín-Falquinay Legaz (1984).

También sehan descritoarginasasconstitutivasen IV crassa (Weiss y Davis, 1973, 1977) y en

levaduras(Cybis y Davis, ¡975),

La isoforma IV de arginasaposee un resto glícosiladocompuestode 280 residuosde

glucosa,27 de fructosay 85 dc manosa(Planellesy Legaz, 1987). La proteínaessegregableal

igual quela arginasade ratón(Spolarisy Bond, 1988).

En las isoformas1, III y IV de arginasapredominanlos aminoácidosácidos(Tablas V,

VIII y X). Las isoformas 1 y II presentan,sin embargo,ciertas diferenciasa nivel de los

234

aminoácidosbásicos y aquellos con radicalesno polares. Al copurificar las dos proteínas,las

diferenciasencontradaspodríandebersea la microheterogeneidadobtenidaal purificarías a partir

de una variadapoblaciónde individuos. La isoforma IV no presentadiferenciassignificativasen

su composiciónde aminoácidosrespectoa la isoforma1. Ya que la isoforma IV de It? primas/rl

sólo se segregaen condicionesde inducción nutricional, probablementese trate de la misma

proteínaquela isoforma1. Blancoe/ al (1984)y Pérez-Urnay Vicente (i989) tambiéndescriben

secreciónde ureasaen E. prunastri. La isoformaIII presentaclarasdiferenciasen la composición

aminoacídicafrentea las isoformas¡ y IV. Poseeuna menorproporciónde aminoácidosácidosy

de aquelloscon grupospolares; sin embargo,tiene abundanciade aminoácidoscon gruposno

polares(Tabla VIII), lo cual indica una menoracidezde la proteínay, probablemente,una alta

tendenciaa la hidrofobicidadde la cadenapolipeptidica.La composiciónde aminoácidosde las

isoformasde arginasade E. primas/rl no guardarelacióncon la de otros organismoscomo rata,

pollo o cerdo(lkemoto, ¡989).

El punto isoeléctríco.estimadomedianteelectroforesiscapilar, de la isoforma1, alrededor

de 4,9 (Fig. 10), eJ de la isoformaIII, alrededorde 5,3 (Fig. 18) y el de la isoformaIV, alrededor

de 4,8 (Fig. 23), corrobora que se trata de proteínasde carácterácido. Wright el al. (1981)

describieronuna arginasaácidade alcachofacon pl de 5,3, estimadomedianteelectroenfoqueen

columna. Dichosautoresobservarondiferencias,aunqueno significativas,en la determinacióndel

pl, yaque el valor estimadoporelectroforesisen gel de poliacnilamidaoscilabaentre5,0 y 5,9. El

pl de las isoformasde arginasade E. pnmavtri difiere segúnel método empleado.Así, el valor

para la isoforma1 es de 5,86, estimadopor electroenfoque(Fig. 5), el de la isoformaIII de 6,18

(Mg. 16> y el de la isofonna IV de 5,6 (Mg. 21), valores algo diferentesa los obtenidospor

electroforesis capilar. Ya que la eficiencia del sistema capilar es muy superior a la del

electroenfoqueen columna,en lo que serefiere a la separaciónde picos, el valor elegido de pl de

las isoformasde arginasaeseJ determinadomedianteelectroforesiscapilar. La heterogeneidadde

cargatambiénfue descritapor Spoiaricsy Bond (1988) en dos subunidadesde arginasa(una de

35 kDa y otra de 38 kDa) de hígadode ratón. Ambassubunidadesconteníanproteínasbásicas

(rango de pI 7,8-9,1) y proteínasácidas(rango de pl 5,8-6,4) cuya multiplicidad de carga

235

constituiaunavariantede la mismaproteína.

El significado de haberdetectadotres isoformasde arginasacon distinta carga podría

llevar a pensaren su distintainteraccióncon la membranacelularo con otrasenzimas,incluso con

la función de la enzimaen diferentesrutasmetabólicas.En 1< prunastrí, la enzimaproporciona

ornitína y urea.Estosintermediarios,a su vez,conducena rutas(biosíntesisde poliaminasy ciclo

de la urea,respectivamente)cuyasfuncionespuedenestarreguladasde forma independiente.

En otro ordende funciones,Stichery iones(1992)detectarondosgruposde isoformasde

a-amilasadiferenciablesen su punto isoeléctrico,en capasde aleuronade cebada:las isoformas

de alto pl (4,90 y 4,72) y las de bajo pí (4,64 y 4,56). Las cuatro isoformastenían diferente

localizaciónsubcelu¡ary, a su vez, las de pl 4,72 y 4,56 eran formas segregablesal medio de

incubación.En E prunas¡ri, la isoformaIV de arginasa,segregableal medio, tambiéntieneun pl

ligeramenteinferior (5,6 ó 4,8, segúnla técnicautilizada)que la isoforma1 (pfrS,866 49>.

Los espectrosde absorciónultravioletade las tres isoformaspresentanun máximo a 275-

278 nm (hg. 25), es decir, ligeramentedesplazadohacialongitudesde onda inferiores al máximo

de absorcióndel ‘i’rp libre (280nm) (Campbelly Dwek, 1984). Estoindicala existenciade Tyr en

la cadenapolipeptídica. El espectrode absorciónultravioleta de la arginasade S. cerev¡siae

presentaun máximoa 278 nm, lo cual indica el dominio del Trp en su cadenapolipeptídica(Green

el al., 1990), ademásJaabsorbanciadecaea partir de 300 nm. Sin embargo,en el espectrode las

arginasasde E. prunasíri se puedeobservaruna discreta absorbanciaa longitudes de onda

superioresa 310 nm. Estehecho reflejauna tendenciaa la agregaciónpor partede las enzimas,

fenómenodescrito para otras proteínas, como por ejemplo el alergeno principal del olivo

(Lauzurica¿aal?, 1988; Wheelerel al?,1987).

Los espectrosde emisiónde fluorescencia(Figs. 26, 27 y 28) seobtuvieronsobrela base

de la fluorescencianatural de los anillos aromáticosde algunosaminoácidos.Cuandose excita

con una longitud de onda de 295 nm (Fig. 27), es decir, analizando exclusivamentela

contribución del Trp, se detectaun máximo alrededorde 350-352 nm. Dicho máximo se

encuentramuy próximo al del Trp libre (350nm) (Campbell y Dwek, 1984), lo cual indicarlaque

el Trp sesitúa en un entornobastanteaccesible.Una situación similar se describeparalos dos

236

residuosde Trp presentesen la albúminabovina(Pico y Houssier,1989).Los cambiosproducidos

en la fluorescenciade estos ‘Lp son utilizados por los autorespara estudiarla unión de sales

biliaresa la albúmina; dichaunión setraduceen un ‘atrapamiento”de la fluorescencia.Oreenel

a/, (1991) observaronque la intensidadde fluorescenciade laarginasade S. cerev.rs¡ae,excitando

a 295 nm, incrementabael 100%yel máximosedesplazabade 337 a 352 nm cuandoquelabanel

Zn2±por diálisis, en comparacióncon la holoenzima.En E. prunavlri, no seha demostradoque

la arginasaposeaZn24 como ión asociado,pero llama la atenciónel hechode observarel pico de

máximaemisión de fluorescenciaa 352 nm en las tres isoformas,idénticalongitud de onda a la

queemitela arginasade levaduraen ausenciade Zn2+.

La excitacióny emisión simultáneas,espectrosincrónico,a diferenteslongitudesde onda

(Fig. 29), muestrados máximos de emisión. El principal, a 355 nm, pone de manifiesto la

contribuciónde los Trp, el segundomáximo, centradoentre305-307nm, indica la presenciade

Tyr. El máximo de fluorescenciadel aminoácidolibre es 303 nm (Carnpbell y Dwek, 1984). El

segundomáximo estáausenteen la isoforma Hl de arginasa,lo que indicaria que éstapresenta

unaaccesibilidaddiferentea los residuosde Tyr. Sin embargo,la isoformaIII poseeun máximo a

288 nm, correspondientea la fluorescenciade la Phe. El máximo de fluorescenciadel aminoácido

libre es 282 nm (Campbelly Dwek, 1984). En S. cerevisiaeel máximo de emisión a 377 nm y el

de excitacióna284 nm, seencuentranalejadosde los máximosdel Trp, esdecir, el aminoácidose

encuentraenun entornobastantehidrofóbico(Greenel al, 1990).

De los resultadosobtenidosa partir de los espectrosde absorcióny de emisión de

fluorescencia,sedesprendequelas tresisoformasde arginasapresentanunaalta homología.

La arginasaha sido descrita,generalmente,comouna enzimaoligomérica,compuestapor

un númerovariablede subunidades,entretres y ocho, en función del organismodel que seaísle.

Así, la arginasade hígadode ratasedescribiócomo un trimero o un tetrámero( Aguirre y Kashe,

1983; Gargantay Bond, 1986; Hirhs-Kolb y Greenberg,1968).La arginasade 5. cerevisiaeesun

trímero (Oreen el al., 1990) y la de soja un tetrámero(Kang y Cho, 1990). Sin embargo,la

arginasade A’. erasway la de Bach/as/¡chenf/brmispresentanun mayor númerode subunidades,

7 y 8, respectivamente(Borkovich y Weiss, 1987b). Por otra parte, la subunidadmonomérica

237

tieneun pesomolecular,determinadopor electroforesisen SDS, queoscilaentre33 kDa, la de 1?.

licheniform¡s, y 55 kDa, la de soja.

El pesomolecularde las distintas isoformasde arginasade E. prunastr¡ fue calculado

medianteHPLC en columnasde exclusiónmolecular,técnicaque permite obteneruna eficacia

media por pico de 100.000 platosteóricos(Tabla VI). Las isoformas1 y II tienen un peso

molecularde 18 kDa y 16 kDa, respectivamente,la isoformaIII de 26 kDa y la isoformaIV de

arginasade 20 kDa (Figs. 14, 19 y 24), valoresinferioresa los descritosparaotrasarginasas.El

análisis en presenciade SDS (Fig. 13) demostróque se trata de formas monoméricas;no se

detectaronoligómeros en ningún caso. Los pesosmoleculares,calculadosmedianteexclusión

molceular en Sephadex6200, de estasmismasarginasasfueron 1 80 kDa para la isoforma 1

(Legazy Vicente, 1980); 330 kDa parala isoformaIII (Martín-Falquinay Legaz, 1984)y 245

kDa para la isoformaIV (Planellesy Legaz, 1987); esdecir, setrataría,al menos,de decámeros

segúnel valor de pesomoleculardel monómeroestimadopor HPLC.

Esta discrepanciaen los valores de peso molecular, calculadospor distintas técnicas,

podríaexplicarsesi existieraautoasociaciónde las moléculasde arginasaduranteel procesode

filtración en Sephadex,fenómenosemejanteal descritopor Ikemotoel al. (1990).Dichosautores

purificaron arginasa,de higadoy eritrocito humano,con un valor de pesomolecularaproximado

de 100 kDa; sin embargo,cuandoexpresabanla arginasade hígadohumanoen E. aili, el peso

molecularque obteníande laproteínapurificadaerade 35 kDa, esdecir, el monómero.Ikemoto

e/ al. (1990)concluyeronque la arginasanativa era un monómeroy el aparentepolimorfismo de

las moléculas de arginasapodría estar causadopor autoasociacióno incluso modificación

proteoliticaduranteel procesode purificación.EstefenómenotambiénÑeobservadopor Totani

(1973)al purificar la arginasade hígadode cerdo.

Las isoformas1 y IV de arginasano sólo poseenuna composiciónde aminoácidosmuy

semejantee igual valor de pI (4,9 y 4,8) sino tambiénun pesomolecularmuy semejante(18 kDa

la isoforma1 y 20 kDa la isoformaIV) (Figs. 14 y 24). La diferenciade 2 kfla de pesomolecular

se debeal restoglicosídico,el cual representael 10% del pesode la proteína.La composiciónde

esteresiduo, determinadapor Planelles y Legaz (1987), es de 280 restosde glucosa,27 de

238

fructosa y 85 de manosa.El resto glicosídicode las proteínassegregablesoscila entre el 5 y el

40% del peso de la glicoproteina,segúnproponenGoocheey Monica (1990), y puedetener

implicacionesen su actividadbiológica específica(actividadporgramo de glicoproteina). En it?

primas/rl, ambasisoformasson activas,pero la forma segregablees unas3 vecesmenosafin por

su sustratoquela isoforma1 de arginasa(Tabla MII). Estefenómenode pérdidade actividades

bien conocido en las hormonas glicoproteicascomo, por ejemplo, la tirotropina, donde la

completadesglicosilaciónsuponeuna pérdidade actividad (Baenzigery Green, 1988; Sairam,

1989).

La isoforma III de arginasaes de mayor tamañoque la 1 y la IV (26 kDa) y rica en

aminoácidos característicosde pre-proteinas.Existen varias explicaciones posibles a esta

heterogeneidad.En primer lugar, las diferenciasde pesomolecularentredosisoformaspuedenser

la consecuenciade unaproteolisispost-traduccional,hechoquevieneavaladoporlos altosniveles

de Met detectados(unasdos vecessuperioresen la isoforma111 respectoa la 1). Stichery Jones

(1992) también definieron modificaciones post-traduccionaiesque afectabana la carga de

diferentes isoformasde a-amilasa.Al igual que ocurre con la pérdida de actividad biológica

debidoa la desglicosilación,una diferenciade 8 kDa en el pesomolecularrepercutea nivel de la

Km, haciendo3 vecesmenosafin por la L-arginina a la isoforma III que a la 1. Estesignificado

reguladorde la arginasain vivo, consecuenciade las variacionesde tamaño,ha sido descritopor

Messenguyy Dubois(1983)en Las arginasasde levaduras,Aguirre y Kasche(1983)encontraron

diferenciasde 5 kDa entresubunidadesde arginasade hígadode rata; la proteolisisñu vñrode la

proteínademostróque estefragmentono era esencialparala actividad enzimática.Resultados

similares encontraronSpolaricksy Bond (1988) en Las arginasasde ratón y Cronin y Tipton

(1985) en la fosfofrutoquinasade Tripanosoma brucei brucel. Burkovich y Weiss (198%)

detectarondosformasde arginasa,de 36 y 4] kDa, respectivasmente,en IV. crassa.Los estudios

de transcripciónin vi/ro indicaron que ambasformas procedíande rnRNA5 diferentes. Dichos

autoresapuntabanla posibleexistenciade promotoresalternativospara la transcripción,de tal

maneraque el pooi de argininapermitierauna mayor expresiónde uno de los promotores.Este

fenómenotambiénocurreen la invertasade levaduras(Perimanel al., 1984) y en la glutamina

239

sintetasade E? coli (Reitzery Magasanik,1985).

Los valoresde Km y vmax resultanmuy útiles cuandose trata de comparardiferentes

isoformas. La determinación de estos parámetrosse puede realizar mediante diferentes

representacionesgráficas,sin olvidar quela interpretaciónde estosvaloresdebeser independiente

del método por el cual se calculendichos parámetros.La representacióndirecta de los datos

pareceserel mejor sistemaparacalcular Km y vmax (1-lenderson,1992). En estemismo grupo

entrala representaciónde Eisenthal-Cornish-Bowden,puesemplealos pares(y0 [So]).obtenidos

directamente.Asumiendosiempreque la medidade la concentraciónde sustratotiene un error

próximoo igual a ‘cero, los posibleserroresexperimentalesse introducenen la valoraciónde la

velocidad de reacción. La representaciónde Lineweaver-Burk, aún siendo la más utilizada,

produceerroresimportantesen la determinaciónde parámetroscinéticos,debidoprincipalmentea

la desviaciónde la linearidad,consecuenciade las transformacionesmatemáticasde los datos.En

la representaciónde Eadie-Hofsteetambiénse puedenencontrardesviacionesde la lineañdad

interpretadas,en muchoscasoserróneamente,como cooperatividadde la enzimapor su sustrato.

En el caso que nos ocupa, no se ha elegidoni la representaciónde Lineweaver-Burkni la de

Eadie-Hofsteepor las razonesexpuestasanteriormente,máxime cuando la isoforma Il[ de

arginasaexhibecooperatividaden la unión de L-arginina(Fig.40).

Las isoformas1 y IV de arginasason enzimasmicaelianas(Figs. 37 y 42). El valor de Km

de la isoforma 1 es 1.5 mM y el de la isoformaIV de 4,45 mM; ambosobtenidosa partir de la

representacióndirecta, Esto indica quela isoforma1 estres vecesmásafin por su sustratoque la

isoformaIV. Sin embargo,al compararlos valoresde Km obtenidosmediantela representación

de Eisenthal-Comnish-Bowden(Figs. 38 y 43), 4,9 mM para la isoforma ¡ y 4,0 m.M para la

isoformaIV, el razonamientoanteriorno seríaválido. En estecaso,el valor de 4,9 mM, calculado

parala isoforma1, esmuy alto debidoa quela enzimapresentaunaligera inhibición porexcesode

sustrato. Cuando esto sucede, la representaciónde Eisenthal-Comish-Bowdenno resulta

conveniente(Henderson,1992).

En el presentetrabajose optó por una tercerarepresentacióngráfica, la de Hanes,que

corroborala credibilidad de los valoresobtenidosa partir de la representacióndirecta, ya que

240

ambosejes son independientes.El valor de Km de la isoforma1 de arginasa,obtenidoa partir de

estarepresentaciónes de 1,25 mM (Mg. 39) y el de la isoformaIV de 3,0 mM (Fig. 44). Dichos

valoresconfirman lo propuestoanteriormente:la isoforma1 es aproximadamentetres vecesmás

afin por la arginínaque la isoformaIV. Arginasaspurificadasa partir de otros organismostienen

valoresde Km algosuperiores.Es el casode la proteínade S. cerevisiae(Km 1 5,7 mM) ( Kang

y Cho, 1990), la de alcachofa(Km entre 8,0 y 18 m.M) (Wright el al., 1981) y la arginasadc

hígadode rata(Km entre 1,7 y 18 mM) (Gargantay Bond, 1986).

Aún siendomenorel valor de Km de la isoforma1 que el de la IV, la velocidadmáximade

éstaúltima esmayor (TablaXHI).

La isoformaIII de arginasa,a diferenciade la 1 y la IV, exhibeuna cinética sigmoidal,

típicade enzimasalostéricas(Fig. 40), lo cual implica la existenciade cooperatividadpositiva en

la unión de su sustrato.Este resultadose confirma al compararel valor del coeficientede Hill

(h) — 4 (Mg. 41 y TablaXIV).

La arginasade hígado de rata muestradiferentescinéticasen función no sólo de la

concentraciónde sustrato (arginina), sino de cofactor (Mn2±).A concentracionesde arginína

alrededorde 1 mM, tanto en presenciacomo en ausenciade Mn2±30 uM, la enzima exhibe

cinética micaeliana,pero su Km varia de 0,94 mM (en presenciade Mn2+) a 1,58 mM (en

ausenciade Mn2±).Sin embargo,en el rangode concentraciónentre5 y 35 uM de arginina, la

argininapasade sermicaeliana,convalor de Km 14,4 pM (en ausenciade Mn2±).a alostérica,

con ~ 6,5 ~iMy un coeficientede Hill = 2, lo que demuestrasu cooperatividaden la unión

del sustrato(Maggini ci al., 1992). Es posibleque la isoformaIII de arginasaexhibieradiferente

cinéticavariandola concentraciónde Mn2+, aunqueestaconductano ha sido comprobada,ya

quela concentraciónde cofactorutilizadaha sido la mismaen todoslos casos.

Carvajal e/ al. (1982) refirieron cambios de cinéticas hiperbólicas a sigmoidales

producidaspor diferentesgradosde asociaciónde las subunidadesde arginasade hígadohumano

en función del pH. La arginasaconstitutiva de E. prunastri, aislada y purificada por Martín-

Falquinay Legaz(1984)no mostrabacooperatividaden la unión sustrato,posiblementedebidoa

un grado de asociaciónde las subunidadesdistinto al encontradoen el presentetrabajo, como

241

podríasospecharsede su elevadopesomolecular,estimadoen 330 kDa. Tambiénesposibleque

se trate de una “falsa cooperatividad.Tipton (1992) define como ‘falsa cooperatividad” la

reflejada como consecuenciade la lenta asociación-disociaciónde vanas subunidadesde una

enzima. Estefenómenotambiénha sido observadoen la GTPciclohidrolasa1 de higadode rata

(Hatakeyama¿aal. 1989).Porotra parte,la riquezaen aminoácidosno polaresde la isoformaIII

de arginasa<Tabla VIII), permitiría la formación de un núcleo hidrofóbico, base para dicha

asociación, El valor de ~ (concentraciónde sustratoque produceel 50% de la velocidad

máxima)es4,5 mM (TablaXIII), lo queindicaríaque la enzima escuatro vecesmenosafin por

L-arginina que la isoforma1. En estecaso,además,el valor de vmax = 2,12 ~molesde amonio.

miw1 es el menorobtenidoen comparaciónconlas otrasisoformas.

Una conclusióngeneralizadasobre cinéticassigmoidales,asumeque el alosterismose

produceen enzimasoligoméricas(Pricey Stevens,1986),pero esteno es el caso.Tambiénpuede

ocurnr en proteínascon varios sitios de unión parael sustrato(Merkler y Schramm,1990). Se

han descritocinéticasalostéricasdebidasa interaccionesproteína-proteínaque conllevancambios

en la estructuraterciaria y cuaternaria;esel casodescrito parala asociacióndel inhibidor de la

subtilisina a la subtilisinao de la arginina a la ornitina carbamil transferasa(Janin y Chothia,

1990), Esta última posibilidad queda descartadaal tratarse de isoformas purificadas como

monómeros.

Otra diferenciasignificativaentrelas tresisoformasde arginasaesla regulaciónquesobre

ellas ejercen los fenoles atranorina,ácido evérnico y ácido úsnico. Antes de comentarestos

efectossedebenmatizarunaseriede detalles.

En primer lugar, comentarque la determinaciónde los fenoles,en general, no resulta

problemática,siemprey cuandotenganuna alta solubilidaden agua.Es el casodel resorcinolo el

catecol.Risnery Cash<1990) extrajeroncompuestosfenólicos,a partir de muestrasde humode

cigarrillo, utilizando disolucionesacuosasde ácido acéticoal 1% (y/y). Guissey Bertru (1987)

propusieronun sistemade extracciónque consisteen ácido acéticoy óxido de éter, lo que

suponíauna ventajasobreel anterior. En amboscasosseempleabauna columnade fasereversa

en I-IPLC, detectandolos compuestosa280 nm ó 254 nm. Ambosmétodosson másrápidos y la

242

sensibilidadobtenidamayor que en los descritospor Coutis ci al. (1979)y Nanní el al? (1988),

utilizandocromatografiade gases.

Los fenolesde E. pi-unas/rl tienen muy bajasolubilidad en agua,por lo que el empleo de

fasesacuosasen su extracciónno resultaadecuado.El métodode extracciónque se describeen el

presentetrabajo tiene grandesventajassobreotros utilizadoshastael momento.En primer lugar,

se proponeuna mezcla de fases orgánicasextractivas que tiene en cuenta la naturalezay

propiedadesquímicas de las funciones presentesen los fenoles liquénicos. La mezcla de

cloroformo/ acetonitrilo/ éter dietilico¡ acetatode etilo, recuperahastael 99% de los fenoles

contenidosen muestrasacuosas(Fig. 2). En segundolugar, la elución isocráticade la fasemóvil

es menoscompleja y más rápida en comparacióncon las elucionesen gradientecomo, por

ejemplo, la sugeridapor Murphy y Brad-Stutte(¡983) en el análisis de los ácidosbenzoicoy

cinámico.En tercerlugar, deberesaltarsela ventajaquesuponela detecciónde cadasustanciaa la

longitud de ondade su máximaabsorción.En la detecciónde los fenolesde E. prunastrí se ha

empleadoun cambio de longitud de onda temporal en función del tiempo de retenciónde los

compuestos.La detecciónde atranorina,ácidoevérnicoy ácidoúsnico a 254 nm de longitud de

ondafija fija (Legazy Vicente, 1983),puedellevar a resultadosequivocados,debidoa la menor

absorbanciaque presentanestoscompuestosrespectoa otras longitudesde onda. Stracket al.

(1979)tambiéndetectaronfenolesde diferentenaturalezaa 254 nm,

La sensibilidaddel métodode detecciónpropuestopermitecuantificarfenolesen el rango

de nmoles,resultadoésteque sólo seobteníautilizando complejosprotocolosde derivatizacióny

posteriordetecciónfluorimétrica(Ogany Katz, 1981),

El fraccionamientodel talo que sepropone,permiteobservarla localizaciónmayoritaria

de cadauno de los fenoles.Los talos incubadosen argininaretienenprincipalmenteatranorinay

ácido úsnico, siendo el ácido evérnico el que se segregaal medio en mayor proporción. Una

primera aproximación seria suponerque la atranorinay el ácido úsnico fueran los fenoles

responsablesde la regulaciónde la actividadde la isoforma1, mientrasqueel ácidoevérnicoseria

el responsablede la regulaciónde la isoformaIV. Sin embargo,la cantidadde fenol solubilizado

en el extracto libre de células y el medio de incubación difiere de la detectadaen talo, esta

243

cantidadesdel ordende un millón de vecesinferior. Por tanto, la ideaanteriorde regulaciónde la

actividadde las isoformasde arginasaen función de la cantidadde fenol detectadaen talo o en

medio no esválida, debiéndoseestudiarel efecto reguladoren fUnción de la cantidadde efector

accesiblea la enzima. La mayor cantidadde fenoles solubilizados se detectaen el medio de

incubación,por lo que seriala isoformaIV de arginasala regulablepormayoresconcentraciones

de efector (Tabla XII), No hay contradicciónentreesteresultadoy la baja solubilidad de los

fenolesen agua,ya quevaloresalcalinosde pH incrementansu solubilidad,asícomo la formación

de quelatos(Rundel, 1978).

La baja cantidadde fenoles encontradaen los extractoslibres de células se debe a que

éstoscristalizanen los espaciosintercelularessobrelas paredesdel alga (Ahmadjian y Jacobs,

1985;Avalosy Vicente, 1987; Honegger,1986; Legazy Vicente, 1989). Estosfenoles,junto con

los depositadosen el córtex (Fig. 35 A-U) no tendríanefecto reguladorsignificativo sobrelas

isoformasde arginasa,ya queno estánsolubilizados.

El patrónde distribución de los fenolesen talosincubadosen cicloheximida(Fig. 36 A-U)

es muy diferente al anterior. Los fenolesque se detectanen mayor cantidadson los ácidos

evérnico y úsnico,siendoéstos,a su vez, los que se solubilizan en mayor medidaen el extracto

libre de células(TablaXII>.

Los fenolesestándescritoscomo potentesreguladoresde variasactividadesenzimáticas.

Aunque habitualmentesedescribencomo inhibidores (Planaset al., 1981; Ravisee/ al., 1980),

algunasveces se comportancomo activadores.Estefenómenose ha descritopara la actividad

lacasa de Agar/cus bisporus y Pleoro/usostrea/us (Giovannozi-Sernanniy Luna, 1981). La

activación o inactivación,en general, dependede la concentraciónde efector utilizada. Así, la

arginasa inducible purificada por Legaz y Vicente (1982) es activada por atranorina a

concentracionescomprendidas entre 1 y 8 pM, pero resulta completamenteinhibida a

concentracionessuperioresa 12 aM. El ácido evérnico inactiva totalmente a la enzima a

concentracionessuperioresa 16 pM (Legazy Vicente, 1983).

La isoforma1 de arginasa,asimilable a la enzimainducible de Legaz y Vicente (1982),es

activadapor atranorina33,3 nM, fenol que secomportacomo un activadorno competitivo, es

244

decir,no compitecon el sustratopor el centroactivo de la proteína.El ácidoevérnico 130 nM es

un activadormixto de La isoforma1, mientrasque el ácidoúsnico ¡73,3 nm se comportacomo un

inhibidor competitivo,Puedeentoncesafirmarseque,en general,bajasconcentracionesde fenoles

producenactivación,mientrasquelas altasconcentracionesocasionanel efecto contrario.

La isoformaIII de arginasaes inhibida por los tres fenolesa concentracionesque oscilan

entre0,10 y 0,47 aM (Fig. 40). La arginasapre-existente,descritapor Martín-Falguinay Legaz

(1984),asimilablea la isoformaIII, resultabaactivadapor mezclasde fenolesa concentraciones

superioresa6 1.0v! de atranorina,19 jM de ácidoevérnicoy 200 1.iM de ácidoúsnico.

Los ácido evérnico (1,15 mM) y úsnico (1,27 mM) se comportancomo inhibidores no

competitivos de la isoformaIV de arginasa,mientrasque la atranorina1,69 mM es un activador

mixto. La argínasasegregable,descritapor Planellesy Legaz(1987),asimilablea la isoformaIV,

era activadapor ácidoúsnico en el rangode concentracionescomprendidasentre20 y 120 jM,

diez vecesinferioresa las ensayadasen el presenteestudio.

No obstante,la concentraciónde fenol solubilizadaen el extracto libre de célulasy por

tanto accesible,en principio, a la enzima,va a dependerdel pH del medio en cadamomento

(Legazel al., 1 993b), por lo que siempreesconvenientecuantificarel fenol, previo al ensayode

efección¡u vitro, Otragranvariaciónquepuedeobservarseen la cantidadde fenolesesla debida

a las condicionesambientales(Legazel al., 1986),las cualesa su vezvariandependiendono sólo

de la estación del alio sino de otros muchísimosfactorescomo pluviosidad, densidadde flujo

fotónico,temperatura,etc..

Los estudios de ligamiento contribuyen en gran medida al conocimiento de las

interaccionesentre una proteína y sus efectores. Los resultados obtenidos se presentan

habitualmentecomo cinéticasde Scatchard(1949),a partir de las cualesseestableceel númerode

sitios de unión para el efectory sus características.Sin embargo,es muy dificil obtenerestas

conclusionesa partir de una sola representacióngráfica (Pedersenel al., 1986; Klotz, 1989;

Munson y Rodbard, 1980). Por ello, en el estudio que se presenta,se han elegido otras tres

representacionesgráficas la directade ligamiento, la de dobles-inversasy la semi-logaritmica

(TablaIII>.

245

Las representacionesdirectasde los datosdel ligamiento de atranorina,ácido evérnico y

ácido úsnicoa cadaunade las isoformasde arginasamuestran,aún siendocinéticashiperbólicas,

una cierta tendenciaa la sigmoicidad (Figs. 45, 47, 51. 53, 57, 59 y 61), a excepcióndel

ligamiento del ácido úsnico a las isoformas1 y III (Figs. 49 y 55, respectivamente)claramente

hiperbólicas. Price y Dwek 0982) proponen la existenciade cooperatividadpositiva como

explicacióna estosperfiles de la gráficade saturacion.

Tambiénpuedeobservarseque el nivel de saturaciónde sitios en la proteínaesdiferente

segúnla isoforma de la que se trate. Asi, las isoformas 1 y IV necesitanmayor cantidad de

atranorina(aproximadamenteel doble) que la isoforma111 paralograr la saturación(Figs. 45 A,

Sí A y 57 A), E] comportamientode las proteínasfrente al ácido evérnicoesmuy diferente. La

isoformaIV saturasus sitios de unión parael efectora menorcantidadde ligando (entre 3 y 5

vecesmenos)quelas isoformas¡ y III (Figs. 47 A, 53 A y 59 A). Por el contrario, la saturación

del númerode sitios para el ácidoúsnico (Figs. 49 A, 55 A y 61 A) seproducea cantidadesde

ligando casi dos veces superioresen la isoforma 111 que en las isoformas1 y IV. La principal

diferenciaentrelas isoformas1 y IV respectoa la III estribaen que las primerasnecesitanmayor

cantidadde atranorinaque de otrosefectoresparasaturarsus sitios, mientrasque la isoformaIII

requieremayorcantidadde úsnicoquede otrosefectoresparaalcanzarla saturación.

Los datos del ligamientoutilizadosen la representaciónde dobles-inversasse ajustan,en

todoslos casos,a unacurva exponencial(Figs. 45 B, 47 B, 49 E, 51 B, 53 E, 55 E, 57 E, 59 E y

61 B), hechoque indica la existenciade un claro patrónde cooperatividadpositivaparala unión

de los tres fenolesa las tres isoformasde arginasa,segúnproponeNeet (1980). Este tipo de

representaciónpermiterealizar una primeraaproximaciónal númerode sitios de ligamiento (n)

parael efectorpor moléculade proteína,comodefinieronKlotz y Hunston(1971).

246

ISOFORMADEARGINASA

NUMERO DE SITIOS DE UNION PARA EL EFECTORPOR MOLECULA DEPROTEíNA

EFECTORATRANORINA AC. EVERNICO AC. USNICO

1 4 4 10*IIIIV

26 8 2623 5 32

*Valoressupcrwrcsa 10 indican inespccificidadencl ligamiento (KIeV 1989)

La isoforma1 es la que liga los efectorescon unamayor especificidad,sólo posee4 sitios

de unión para la atranorinay otros 4 para el ácido evérnico por molécula de proteína. La

semejanzaentrela isoforma1 y la IV radicaen su especificidadparaligar ácidoevérnico,pero la

diferencia entre ambasproteínasestribaen que la isoforma IV pierde La especificidaden el

ligamiento de atranorinay ácido úsnico. La isoforma III presentauna mayor semejanzacon la

isoforma IV que con la 1, ya que III Y IV ligan ácido evérnico de forma específica,pero

atranorinay ácidoúsnicode manerainespecifica.

No obstante,Klotz (1989)apuntala posibilidad de obtenerconclusioneserróneasa partir

de la representaciónde dobles-inversasde los datosde ligamiento,debidoa la fuertecompresión

que sufrenéstosen las proximidadesdel eje de ordenadas,El proponedeterminarel númerode

sitios de unión a partir de la representaciónsemi-logaritmica.Nosotrosestamosde acuerdocon

Klotz (1989),ya que en estetipo de representaciónse obtienendosclarasventajas.En primer

lugar, existe un espaciadouniforme de los datosy , en segundolugar, se puedeobservaruna

plataformade saturacióninequívocaa partir de la cual sepuedecalcularel númerode sitios de

ligamiento.

Los valoresque seobtienenmedianteestarepresentación(Figs. 46 B, 48 E, 50 13, 52 2,

54 13, 56 2, 58 B, 60 13 y 62 2) son prácticamenteiguales a los obtenidos mediantela

representaciónde dobles-inversas.La única variaciónen el númerode sitios es la obtenidaen el

ligamiento de atranorinaa las isoformasIII y IV (Figs. 52 y 58). Dondeantesaparecian26 y 23

sitios, respectivamente,ahorason aproximadamente13 y 15 los sitios de unión parael ligando.

En cualquiercaso,un valor superiora lO sitios lo único que indica esunaalta inespecificidadde

247

ligamiento proteina-efector.No obstante,estadiferencia de valores podría debersea que la

enzima se está saturandoen realidad a niveles inferiores de ligando a los que indica la

representacióndirecta, según propone Pedersenel al? (1986). Honoré y Brodersen (1983)

determinaron II sitios de unión para el diflunisal (fármaco antiinflamatorio) a la albúmina,no

lograndosaturarla proteínaa los niveles de fármaco utilizados, por lo que el númerode sitios

propuestoresultó sererróneo. En nuestro caso estono sucede,ya que siemprese obtieneuna

curvade saturaciónprevia.

La literaturamuestrala representaciónde Scatchardcomo la habitual en el estudio del

ligamiento, Cuando la representaciónproporcionauna línea recta, esto se interpretacomo la

unión de un ligando homogéneoa sitios idénticose independientes.Sin embargo,existencinéticas

de ligamiento donde los datos se alejan de la linearidad. En las tres isoformasde arginasase

observaestecomportamientoparael ligamiento de cualquierefector(Figs. 46 A, 48 A, 52 A, 54

A, 56 A, 58 A, 60 A y 62 A), donde los datossepuedenajustara curvas cóncavo-convexas,

excepto la que muestrala unión del ácidoúsnico a la isoforma1 (Fig. 50). Estetipo de curvasse

consideraindicativo de cooperatividadpositiva en la unión del ligando a la proteína(Price y

Stevens,1986). Es decir, se puedeconcluirque existeninteraccionesentrelos diferentessitios de

tal manera que la afinidad de cada sitio cambia con la ocupaciónde los otros y en estas

condicionesse podríadeterminarmásde una constantede ligamientoparacadauno de los sitios

(Klotz y Hunston,1977)

La cooperatividadpositivase puedemimetizarpor variosartefactos,comoporejemploes

la heterogeneidaddel ligando. Mendel et al. (1985) observaronesteefecto en el ligamiento de

receptoresde superficiecelulara lipoproteinas.El efectosedebíaaquelas lipoproteinasse aislan

generalmentecomo mezclasheterogéneasde partículasde varios tamañosy características.De

acuerdocon los mismosautoresse debeentendercomo ligando heterogéneoa una mezclade

ligandosque tienendistinta afinidad por el receptor(proteína)o bienun ligando con impurezas

químicas. En el caso que nos ocupa, la existenciade cooperatividadpositiva definida en el

ligamiento de atranorina y ácidos evérnico y úsnico a las isoformas de arginasano esta

mimetizada por el empleo de ligandos heterogéneos.Se han utilizado fenoles (ligandos)

248

comercialesde pureza— 99,8%,comprobadamedianteanálisisen 1-IPLC utilizando columnasde

fasereversa.Otro artefactoque puedemimetizar la cooperatividadpositivaes la autoasociación

del ligando (Ishidael al., 1 988). Estaposibilidad puedeserdescartadasi el tiempo requeridopor

los fenolesparaalcanzarel equilibrio de diálisis en presenciao ausenciade la proteínano difiere

en másde 2 h (Pedersene/al.,1986), lo cual se satisfaceen nuestrocaso.

Otra posibleexplicaciónde los resultadosobtenidosen las representacionesde Scatchard

estaríarelacionadacon los cambiosen el pesomolecularde las isoformas,debidosa la reacción

asociación-disociaciónde las proteínasen presenciadel fenol. Diversosautores(Ainslie e/ al,

1972; OFagain el al, 1982) hablan de una ‘cinética transitoria lenta’ para apoyar la

cooperatividadmostradaen el ligamiento de efectores a enzimasmonoméricas,caso de las

isoformas1, III y IV de arginasa.Estacinéticaconsistiríaen una reacciónde isomerizacióno bien

en una asociación-disociaciónde la proteína.Un mecanismode estetipo fUe descritopara la

glutamatodeshidrogenasa(Friedeny Colman, 1967). En un principio,estosautoresestablecieron

unacorrelaciónentrelos cambiosde pesomolecularde la enzimay la activación o inhibición por

nucleótidosde purina(GTPy GDP), de tal maneraqueel polímero eraactivo y el monómeroera

relativamenteinactivo. Sin embargo,los resultadoscinéticosy de ligamiento, les permitieron

concluirque el GTPy el GDP seuníanmenosa la formapoliméricaque a la monomérica.Existía

una fUerte cooperatividadpositiva a valoresaltosde concentraciónde proteína,pero esteefecto

era menor a concentracionesde proteínainferiores a 0,01 mg’mk1. Esto se debíaa que en el

primer caso la concentraciónde proteína era mayor que la constantede disociación para el

efector. La representaciónde Scatchardde los datosde ligamientode atranorinaala isoformaHl

de arginasa(Fig 52 A) resultaespecialmentediscutible. Si bien los puntosse puedenaproximara

una curva cóncavo-convexa,señalábamosen el punto 111.6.2.1. de Resultadosque otra

posibilidad seriaajustarlosa un ‘ciclo de histéresis.Dicho de otro modo, la isoformaIII muestra

una muy lenta respuestade asociación-disociacióna los cambiosde concentraciónde atranorina.

Estehechovieneavaladoporel perfil de la curva semi-logaritmica(Fig. 52 B), dondese observa

un descensode la cantidadde atranorinaligada a partir de concentracionesde efector libre

superioresa 1,8 gíM. Convienetambiénresaltarla consecuenciaque el ligamientode atranorina

249

produceen la isoformaIII en comparacióncon los otros efectoresen las distintasisoformas..Es

el único caso en que sólo se observaun 2% de formaspoliméricasrespectoa la proteínanativa

(Fig. 63). Podríamos,entonces,definir el comportamientode la isoformaIII de arginasacomo

histeréticoen su unión a la atranorina,segúnla definición propuestapor Neet y Ainslie (1980)

paraestetipo de respuestas.Un comportamientosimilar ocurreen el ligamiento de ácidoevémico

a la isoformaIV (Fig. 60 A) aunque,en estecaso,sehacemenospatenteel ciclo de histéresis.La

glucosidasade calia de azúcartambiénsecomportacomohisteréticaen su interaccióncon Mn2±

(Legazel al., 1991).

Las isoformas1 y IV de E? pi-unas/rl no muestrancooperatividaden la unión del sustrato,

como se desprendede sus cinéticasmicaelianas(Figs. 37 y 42) y del coeficientede Hill (h) (Tabla

XIV). Es sólo en presenciade efectorescuandoseobservala cooperatividadpositiva. Teng-Leary

y Kohlhaw (1973) describieron una situación similar en la a-isopropilmalato sintasa de

Sa/montillatyphimurium. La enzima exhibia cooperatividadpositiva para el ligamiento de Leu

(retroinhibidor)pero no parael ligamiento del sustrato,lo que permitíadeducirque estabasujeta

a un equilibrio de asociación-disociacióndeterminadopor el efector.

La isoformaHl de arginasamuestrauna clara cooperatividadparala unión del sustrato

como sepuedededucirde su cinéticasigmoidal (Fig. 40) y del valor del coeficientede Hill (Tabla

XIV). De los datos del ligamiento también se desprendeque la isoforma III presenta

cooperaiividadpositivaen el ligamientode atranorinay ácidosevérnicoy úsnico.

La única excepciónde ligamiento con cooperatividadpositiva la presentael ácido úsnico

en su unión a la isoforma1 de arginasa(Fig. 50 A). La representaciónde dobles-inversas(Fig. 50

13) y la semi-logaritmica(Ng. 51 B) confinnanuna unión inespecificaal estimaren 10 el número

de sitios de ligamiento;sin embargo,la cinéticade Scatchardno da una curvacóncavo-convexa

(Fig. Sí A). Hay dos posiblesexplicaciones,una seria que en la isoforma 1 no se produjera

reacciónde asociación-disociaciónen presenciade ácido úsnico o que todas las formas de

proteina mostraranla misma afinidad por el efector. También convienedestacarque la única

inhibición competitivade cualquierisoformaesla producidaporácidoúsnicosobreLa isofroma1

(Tabla XIII)

250

Se han propuestovarios modelosparaexplicar las cinéticascooperativasde las enzimas.

En general, todos ellos se centran en las interacciones entre subunidadesde enzimas

oligoméricas.Sinembargo,cuandose trata de enzimasmonoméricas,como es el caso que nos

ocupa, todosapuntana la existenciade asociaciones-disociacionesde la enzima(Ainslie el al,

1972; Meunierel al., 1974), hecho que se confirma por las cinéticascóncavo-convexasde la

representaciónde Scatchard.

Ricard el al. (1974) proponenun nuevo concepto,el de “transición con memoria,para

explicar el alejamiento del comportamientomicaeliano en algunasenzimas monomerícas.El

conceptose basaen la existenciade dos formas conformacionalesdistintas de la enzima en

equilibrio y no a un mecanismode transiciónlentacorno el descritoporOFagainel al, (1982). La

explicaciónde Ricardel al? (1974),no obstante,no esválida parala isoformaIII de arginasa,ya

que su teoríaimplica cooperatividada nivel cinético,pero queno se manifiestaen los estudiosde

ligamiento.La isoformaIII muestracooperatividadtantoa nivel cinéticocomoen el ligamientode

efectores.

La reacciónde asociación-disociaciónes muy importanteen la regulaciónde la actividad

enzimática,ya que cadauna de las formas presentadiferenteafinidad por el efector. También

resultanecesarioconocerqué proporciónde cadauna de las formas enzimáticasexisteparauna

concentracióndada de efector Frieden y Colman (1967) estudiaronlos cambios de peso

molecularocurridos en la a-isopropilmalatosintasapromovidospor el ligamiento de Leu y

concluyeronque existía un claro predominio de especiesdiméricas frente a monómerosy

tetrámeros,aunqueno llegarona determinarla proporciónde monómeroy polímerosexistentea

cadaconcentraciónde efector.En nuestrocaso,se ha podido calcular la proporciónde formas

monoméricay poliméricas,estimandolos pesosmolecularesde cadaisoformade arginasatras el

ligamiento del efector a diferentesconcentraciones(Tabla XVI). En todos los casos, puede

observarseun claro predominiode la forma nativa sobrelas poliméricas,tras el ligamiento. Los

tipos de agregadosque sucedencon mayor frecuenciason los dímerosy los trímeros, si bien el

tipo de agregaciónes fUnción de tres variables: isoformade arginasa,naturalezadel efector y

concentracióndel mismo(Tabla XVI y Fig. 63).

251

En términos generaies,la unión de ácido evérnico a las isoformas 1 y 11] de arginasa

proporcionalos mayoresnivelesde polimerización,encontrandoúnicamenteun 49,97y 19,24%

de las formasnativas,respectivamente.Parala isoformaIV el menor porcentajede forma nativa

aparececuandose liga acido úsnicoa la proteína.En todos los casos,la atranorinaproducelos

menoresnivelesde polimerización,así comolos oligómerosde menornúmerode subunidades.

El agregadode mayor tamañoencontradoparala isoforma1 correspondea un nonámero,

obtenido tras el ligamiento de ácido evérnico a esta isoforma; el oligómero representasólo un

0,11%de la proteínatotal. Porotra parte,sedetectaun tridecámerotrasla unión de ácidoúsnico

a la isoformaIV, el cual representaun 3, ] 7% de la proteínatotal.

La isoforma III no presenta,en ningún caso, agregadosmayores que trímeros; sin

embargo,no sólo se detectanpolímeros, sino que también picos correspondientesa un peso

molecularinferior ( y 19 kDa) al de la forma nativa de la isoforma Hl. La proporciónde estos

picos oscila entreel 7 y el 67% de la proteínatotal eluida del sistemade HPLC. Además,este

pesomoleculares similar al estimado para la isoforma 1 de arginasa.Este hecho implica que,

posiblemente,el auténticomonómerode arginasaen it? pi-unas/rl poseaun pesomolecularde 18

kDa. La aparición de estaforma tras el ligamiento de atranorina,ácidoevémicoo ácido úsnicoa

la isoforma III estaría induciendo un cambio en la estructuracuaternariade la proteína,

permitiendosu disociaciónen unaformade menortamaño,

La proyecciónfisiológica que puedantenerla existenciay producciónde las diferentes

isoformas,previamentedescritas,esde dificil evaluación.Parasituar estepunto de la discusión,

habríaque hacerlas siguientesprecisiones:

a) En It? prunastri, los sistemasde carboxilaciónque utilizan dióxido de carbono

atmosférico producen primariamentehidratos de carbono, mientras que el producido por

descarboxilacionesinternas,singularmentepor hidrólisis de urea, va a ser empleadoen la síntesis

de fenoles(Blancoe/ al., 1984),principalmenteácidoevérnico.Sobreestabase,la modulaciónde

la actividasdarginasase relacionacon el nivel de ácidoevémicoa través de la activaciónde sus

enzimassubsidiarias~ureasay ornitina descarboxilasa.Hay que hacernotar que, sobrela basedel

número de sitios de unión del ácido evérnico, como ligando, a las diferentes isoformas de

252

arginasa,estefenolesel únicoque muestraespecificidadde ligamiento,siendoactivadormixto de

la isoforma e inhibidor de las isoformasIII y IV. Por tanto, en una secuencia,posiblemente

fungica(Vicentey Legaz, ¡992),descritacomo

- Acetil CoA carboxilasa

Arginina C02 —> - orselinatosíntasa —> Acido cvérnico—> Ornitina...t>

- Orsclinatodépsidohidrolasa1 Argiinsu

2 Orniúnadescaxboxilas&i

el fenol reguladasu nivel como activadorde la isoforma 1 o retroinhibidorde la isoformaIII,

primandounarelaciónu otrasegúnla necesidadfisiológica.

El CO2 producidoporhidrólisis de la ureaes,preferentementealgal, lo cual no invalida la

hipótesisde retroinhibicióndado que cantidadesdiscretasde ácidoevémicopuedenencontrarse

en el citoplasmadel ficobionte.

b) El papel de una isoforma segregablede arginasaes dudoso. Aunque puede

esperarseque un liquen epifito encuentrearginina exógenaen su sustrato, es dificilmente

imaginableque los fenolespuedanactuarcomo efectoresextratalinosde arginasa.Seriamás fácil

consideraresta isoforma como una señal fúngica de tipo parasitario (Molina ej al,, 1993),

segregadaa los espaciosintercelularescomounafunciónexclusivadel estadode rehidratacióndel

talo (Legaz y Vicente, 1991a; Vicente, 1990). En los espaciosintercelulares,los principales

efectoresserianaquellosfenolesque son retenidospor las paredescelulares,principalmenteácido

úsnico(Ahmadjiany Jacobs,1985; Honegger,1986),queactúacomo inhibidor de la enzima.

c) Tantosobrela basede unaarginasacomo efectorde parasitismofiángico, como

sobrela posiblemultiplicidad de formasde una solaenzimaen funciónde su sitio de producción,

la apariciónde isoformasde arginasay el cambio en sus propiedades,podría serun mero reflejo

de estadosdiferentesde desarrollo,Algo semejantefije, ya hace20 años, sugeridopor Martin

(1973) al demostrarque la invertasaexocelularde Parmelia caperata era fundamentalmente

distinta, tanto en su peso molecularcomo en sus propiedadescinéticas, de la sistetizadapor

micobiontey ficobionte aislados.

1<- CONCLUSIONES

254

It Se han purificado cuatro isoformas de arginasade talos de L’vernia prunastrí. Las

denominadasisoformas1 y II sonintratalinas,induciblespor arginina,y han sido purificadas148 y

359 veces,con recuperacionesdel 4,5% y 1,8%, respectivamente.La isoforma III, también

intratalina,constitutiva,ha sido purificada259 vecescon unarecuperacióndel 2,0%.La isoforma

IV, glicosilada,inducible y segregableha sido purificada616 vecescon un rendimientodel 5,6%.

2”. Se han determinadolos pl de las cuatro isoformas, purificadas a homogeneidadpor

electroenfoqueen columnay por electroforesiscapilar. Los valoresde pl obtenidospor el primer

procedimiento,fueron 5,86, 5,83, 6,18 y 5,60 paralas isoformas1, 11, III y IV, respectivamente.

La separaciónpor electroforesiscapilarfue desarrolladaa dos valoresdistintosde pH, 7, 1 y 9,0,

tomándosecomo valor de pl la media de los dos valoresobtenidos.Estasmediasfueron 4,90,

5,00, 5,38 y 4,80 paralasisoformas1, II, III y IV, respectivamente.

3” El análisisde aminoácidosde las cuatroisoformas indica quelas isoformas1, II y IV son

ricas en Asx, Glx, Sery Gly, conteniendode uno a tres residuosTrp por molécula.En cambio, la

isoforma111 esrica en aminoácidosno polares,como Ala, Val y Leu, conteniendonueveresiduos

Trp pormolécula.

4k’. El peso molecular de las diferentes isoformas de arginasa fue estimado por

HPLC-exclusiónmolecular,usandodosconfiguracionesde columna: una columna15K 65000

PWXL o dos columnasZorbax-diol en serie,GF450-GF250.Los valoresobtenidosfueron de lO

kDa parala isoforma1,16 kDaparala 11, 26 k.Da parala 111 y 20 kDaparala IV, siendotodas

ellasmonomé~cas.

5” Sobrelos datosprecedentes,puedeconcluirseque las isoformas1 y U son muy similares,

asi como la IV, salvo que, en esteúltimo caso, la proteínainducible ha sido segregada.Según

Planelles y Legaz (1987) la isoforma IV está glicosilada. La isoforma III, constitutiva, es

fundamentalmentediferentede las inducibles.

255

6< ‘[‘odas las isoformaspresentanun máximode absorciónen el ultravioletade 275-278nm,

queindica la presenciade Tyr

En el espectrosimultáneode excitación-emisiónde fluorescencia,todas las isoformas

presentanun máximo de emisión a 355 nni. La isoformaIV presentaun máximo adicionala 305

nm. Utilizando luces monocromáticasde excitaciónde 257 nm, 275 nm ó 295 nm, se obtienen

maximosde emisión entre345 y 349 nm, 342-346nm y 351 nm, respectivamente.Al excitar la

isoformaHl con luz de 275 nm, apareceotro máximo secundariode emisión a 288 nm, indicativo

de Phe

8”. Los tres fenolesmayoritariosde It? pi-unas/rl hansido eficientementeseparadosporHPLC

de fase reversa,usandouna columna Nucleosil 5C8 y como fasemóvil acetonitrilo:agua:acético,

isocrático.La detecciónfue llevadaa cabousandoun detectorde longitud de ondavariable,a 280

nm para atranorínay ácido úsnico y a 270 nm para el ácido evérnico, coincidentescon sus

máximosespectrosde absorcion.

9”. Medianteprotocolosde extraccióndiferencia]y análisisporHPLC, sehandeterminadolas

concentracionesaproximadasde los tres fenoles que pueden tener accesoa las diferentes

isoformasde arginasa,paraprocederal estudiode supapelcomoefectoresenzimáticos.

10”. Lasisoformas1 y II de arginasason enzimasmicaelianas,convaloresde Km paraarginina

de 1,25 mM y 3,0 mM, respectivamente,determinadospor el procedimientográfico de Hanes,

aunquetambién se calculó de la representacióndirecta [5] frente a V0, y de acuerdocon el

procedimientode Eisenthal-Cornish-Bowden.La isoformaHl muestrauna cinéticasigmoidal de

saturaciónporsustrato,indicativade alosterismo,con un valor ~o,s paraargininade 4,5 mM.

256

Los diferentesfenolesmuestranejerceraccionesdistintassobrelas diferentesisoformasa

las concentracionesde efector ensayadas,La isoforma 1 sufre activación no competitiva por

atranorina,activación mixta por ácido evérnico e inhibición competitivapor ácido úsnico. La

isoforma III es inhibida por los tres fenoles.Atranorinase comportacomo activadormixto y los

ácidosevérnicoy úsnicocomoinhibidoresno competitivosde la isoformaIV.

12” La unión del sustrato.arginina,a las isoformas1 y IV serealizasin cooperatividad,dada

su naturalezamicaelianaque proporcionaun valor de coeficientede Hill cercanoa la unidad. La

unión de los diferentesefectoresno alteró sensiblementeestaconducta, salvo la unión de la

atranorinaa la isoformaIV, que aumentael valor de h a 2. La unión de la argininaa la isoforma

III se lleva, sin embargo,a cabocon un gradode cooperatividad(h) de 4,4, siendosensiblemente

incrementadopor atranorinay ácidoúsnicoy débilmenterebajadoporácidoevérnico.

l3~’ La estimacióndel númerode sitios de unión pormoléculade proteina(n) de cadauno de

los ligandos(efectores)a las distintasisoformasde arginasaindica que sólo el ácidoevérnicoes

capazde unirse a sitios especificosen las tres isoformas,sobrela basedel bajo númerode sitios

de unión, que han sido estimadosen 4, 8 y 5 paralas isoformas1, III y IV, respectivamente.El

ligamiento de la atranorina a la isoforma 1 también se lleva a cabo por 4 sitios de unión

específicos.Sin embargo,estamismaatranorinase liga inespecíficamentea las isoformasIII y IV,

por 26 y 23 sitios de unión, respectivamente.El ácido úsnico actúa como ligando inespecífico

paralas tres isoformas,con 10 sitios de unión parala isoforma1, 26 parala III y 32 parala IV.

14” Se ha calculadola proporciónde formasmonoméricasy poliméricastrasel ligamiento de

los efectores.En todos los casos,predominala forma nativa sobrelas poliméricas.Los tipos de

agregadosqueaparecencon mayorfrecuenciason dímerosy trímeros.

257

Paraun mayor seguimientode las conclusiones,seadjuntala Tabla XVII, resumende los

datosnuméricosque lasjustifican.

1.- PURIFICACION DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA

ISOFORMA

1

II

III

IV

VECES

148

359

259

616

RENDIMIENTO (%)

4,5

1,8

2

5,6

2.- PUNTO ISOELECTRICO DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA

ISOFORMA pl porelectroenfoque

en columna

5,86

5,83

6,18

5,60

3.- COMPOSICION DE AMINOÁCIDOS DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA

ISOFORMA AMINOACIDOS(n0 de residuos)

Ricasen Asx, Cix, Sery Gly

3

Rica en no pohresAla, Val y Leu 9

1-2

pI porE.C.

pH7

5,33

pH9

II

III

IV

4,50 4,9

5,70

4,80

5,07

4,80

5,38

4,80

Trp

II

III

IV Ricaen Asx, Glx, Sery Gly

258

4.- PESO MOLECULAR ESTIMADO EN HPLC POR EXCLUSION

MOLECULAR DE LOS ISOFORMAS DE ARGINASA

1 SOFORMA COLUMNA COLUMNAS

TSK 65000PWXL ZORBAX-DIOL GF4SO-GF250

l8

11

III

IV

18

16

26,5

20

ib

26

20

Todasson monómeros

5.- ABSORCION UV DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA

ISOFORMA

1.11

IV

MAX. ABSORBANCIA

275-278

275-278

275-278

6.- EMISION DE FLUORESCENCIA DE LAS ISOFORMAS DE ARGiNASA

1 SOFORMA MAX. EMISION ESPECTROSIMULTANEOFLUORESCENCIA

(EXCITACION 275) (EXCITA ION 295) (EXCITACION 257)

346. 305

345, 305, 288III

351, hombro 416

331, 351, 397-401

349, 302

349

355

355IV 337, 306 331, 351, 401 345, 290 355, 305

259

>7.- ABSORCION LV DE FENOLES

FENOL

ATRA.NORINA

ACIDO EVERNICO

ACIDO USNICO

MAXIMO ABSORBANCIA

280

270

280

HPLC fasereversa;columnaNucleosil5C8, isocrático 1 ml>min1 y fasemóvil agua ácido

acético(99:1, v/v)/acetonitrilo(30:70, y/y).

9.- CONSTANTES CINETICAS DE LAS ISOFORMAS DE ARGINASA

Vmax

(pmol amoniomin’)

1 sofornia

Directo

Km

(nál)

1,5 2,49

1 Eisenthal-Cornish-Bowden

Hanes

III Directo

Directo

IV Eisenthal-Cornish-Bowden

8.- SEPARACION DE FENOLES

4,9

1,25

5,25

2,79

2,12

3,0

4,7

4,45

4,0Hanes 3,0 4,2

260

10.- VARIACION DE LAS CONSTANTES CINETICAS EN PRESENCIA DE

FENOLES (Km (ap) Vmax(ap))

Atranorina

“lo

activador

no competitivo

4,90

inhibidor

0,96

activador

mixto

Ac. evémico

0,68

activador

mixto

4,40

inhibidor

3,16

inhibidor

no competitivo

vmpx

Ac. úsnico Atranorin

a

6,643.40

inhibidor

competitivo

4,50

inhibidor

3,05

inhibidor

no competitivo

0,12

3,95

(apjfitmol_amoníomiiv1)

Ac. evémico Ac, úsnico

2,75

0,06

3,69

3,32

0,25

3,39

II.- COEFICIENTE DE HILL (b)

Isoforma En ausenciade efector

III

lv

1,42

4,40

1,24

ALranorina

1,55

5,15

1,94

En presenciade efector

Ácido evérnico

1,65

3,75

1,25

Aedo Osnico

0,93

5,74

1,20

Isoforma

III

IV

261

12.- NUMERO DE SITIOS DE UNION DE LOS DISTINTOS LIGANDOS A LAS

ISOFORMAS DE ARGINASA

Númerositios (n)*

Atranorina Acido evérnico Acido úsnico

4

26

23

4

8

5

1.0

26

32

* Estimadode la representaciónde dobles-inversasde los datosde ligamiento

13.- EFECTO DEL LIGAMIENTO DE LOS FENOLES A LAS ISOFORMAS DE

ARGINASA

Polimerizaciones a dimeros y trimeros principalmente,

Isoforma

III

IV

Vi- BIBLIOGRZ4FLI

263

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