Ion Ion AmpliSeqAmpliSeqTMTMデータ解析データ解析基礎基礎～～次世代シーケンサによる変異検出～次世代シーケンサによる変異検出～

ライフテクノロジーズジャパンライフテクノロジーズジャパンライフテクノロジーズジャパンライフテクノロジーズジャパンテクニカルサポートテクニカルサポートテクニカルサポートテクニカルサポートOct 2013

アジェンダアジェンダアジェンダアジェンダ

• Ion Torrent データ解析概略

• Torrent Variant Caller

－変異の検出

－実行手順

－パラメータの設定

－実行結果

• リファレンスとターゲット領域の登録• Ion Reporter

－変異の絞り込みとアノテーション

• 補足

2

3

Ion Torrentデータ解析概略

ターゲットリシーケンスターゲットリシーケンスターゲットリシーケンスターゲットリシーケンス

ゲノム（リファレンス配列）

�ターゲットターゲットターゲットターゲット領域領域領域領域－ゲノム全体ではなく、特定領域のみ

�手法手法手法手法－ PCR増幅系 ⇒ Ion AmpliSeq™

－キャプチャ系

�利点利点利点利点－－－－必要な領域だけシーケンス可能－レアバリアント検出可能性が高まる

ゲノムゲノムゲノムゲノム上上上上のののの特定部分特定部分特定部分特定部分にマッピングにマッピングにマッピングにマッピング4

変異変異変異変異のののの検出検出検出検出

5

Ion Torrent データデータデータデータ解析概要解析概要解析概要解析概要

リアルタイムリアルタイムリアルタイムリアルタイム転送転送転送転送生生生生データをデータをデータをデータを自動転送自動転送自動転送自動転送

データデータデータデータ確認確認確認確認やややや出力出力出力出力データのデータのデータのデータの確認確認確認確認

おおおお使使使使いのいのいのいのPC上上上上からからからから結果結果結果結果をダウンロードをダウンロードをダウンロードをダウンロード

基本的基本的基本的基本的なななな解析解析解析解析

ベースコールベースコールベースコールベースコール

マッピングマッピングマッピングマッピング

変異解析変異解析変異解析変異解析

プラグインによるプラグインによるプラグインによるプラグインによる解析解析解析解析

Ion Reporter™変異解析変異解析変異解析変異解析アノテーションアノテーションアノテーションアノテーション

Torrent Suite Software Ver 4.X

5

GATTGACCTCTTTTCGGTTAACGAAGAAGTCGGTTCATC

69,0,101,0,0,89,0,100,10,64,103,0,201,220,5,4,90,0,0,203,0,100,99,116,114,0,0,19,203,1,9,0,97,0,114,0,0,118

Torrent Suite Data Analysis Flow

Incorporation for

1 Flow (DAT)Incorporation over

many flows (DAT) Raw signals per flow (WELLS)

0.1 1.2 0.3 2.1 0.1 0.20.2 2.1 3.1 0.0 0.1 1.20.0 0.0 3.2 1.4 0.1 1.3

BAM

Base Calling

Signal Processing

SFFFASTQ

VCF

Unmapped BAM file with processed

incorporation signals

Alignment

Variant Call6

Torrent Variant Caller ： 変異の検出

7

Torrent Variant Caller変異検出変異検出変異検出変異検出とアリルとアリルとアリルとアリル頻度頻度頻度頻度のののの定量化定量化定量化定量化をををを簡便簡便簡便簡便にににに実施実施実施実施

• 簡単に設定・実行が可能

• 検索やソートができる変異の一覧表

• ワンクリックでの結果ファイル出力と

ゲノムビューアへリンク

• 生殖細胞（Germ Line）/体細胞（Somatic）の指定が可能

• カスタマイズしたパラメータを保存・再利用が可能

8

9

Torrent Variant Caller：：：：変異変異変異変異のののの検出検出検出検出

リファレンスリファレンスリファレンスリファレンスDNA

リードリードリードリードDNA(BAMファイルファイルファイルファイル)

T

TGGGGGTGGGG

T/G バリアントとしてバリアントとしてバリアントとしてバリアントとして検出検出検出検出（（（（VCFファイルファイルファイルファイル、、、、エクセルファイルエクセルファイルエクセルファイルエクセルファイル））））

Torrent Variant Caller・クオリティ・クオリティ・クオリティ・クオリティ・アリル・アリル・アリル・アリル頻度頻度頻度頻度・ストランドバイアス・ストランドバイアス・ストランドバイアス・ストランドバイアス

Torrent Variant Caller ： 実行手順

10

(1) レポート画面の下の方にあるSelect Plugins To Runボタンをクリック

(2)インストールされているプラグインのリストから、variantCallerをクリック

Torrent Variant Caller：：：：手動実行手動実行手動実行手動実行

11

(1) 歯車マーク＞Pluginsをクリック

(2) Autorunのチェックボックス□にチェック✔を入れると、全てのランについてラン終了後に

指定したプラグインが自動実行される

Torrent Variant Caller：：：：毎毎毎毎ランランランラン自動実行設定自動実行設定自動実行設定自動実行設定

12

自動実行

(1) PLANタブから、新しくランの設定を行うアプリケーションを選択

(2) Pluginsタブのインストールされているプラグインのリストから、variantCallerをチェック

Torrent Variant Caller：：：：プランプランプランプラン毎毎毎毎のののの実行実行実行実行

(3)画面下に現れる設定項目を入力

13

(1) Dataタブのランデータの右にある歯車マークから、Reanalyzeを選択

(2)インストールされているプラグインのリストから、variantCallerを選択し、Start Analysisクリック

Torrent Variant Caller：：：：再解析時再解析時再解析時再解析時のののの実行実行実行実行

“サムネイルのみ”のチェックをはずす※Protonの場合

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Torrent Variant Caller ： パラメータの設定

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(1) VariantCallerのパラメータを設定 （手動実行時の例）

ライブラリーのライブラリーのライブラリーのライブラリーの種類種類種類種類をををを指定指定指定指定・Full Genome

・Ion AmpliSeq

・Ion TargetSeq

Germ Line

1倍体又は2倍体の生殖細胞系の変異を検出Somatic

体細胞変異を想定して頻度の低いものも検出High Stringency

厳しい条件で変異を検出LowStringency

緩い条件でより多くの変異を検出

Torrent Variant Caller：：：：パラメータのパラメータのパラメータのパラメータの設定設定設定設定（（（（１１１１））））

16

ターゲットターゲットターゲットターゲット領域領域領域領域のののの指定指定指定指定

HotSpot領域領域領域領域のののの指定指定指定指定

最新最新最新最新またはまたはまたはまたは保存済保存済保存済保存済のパラメータセットをアップロードのパラメータセットをアップロードのパラメータセットをアップロードのパラメータセットをアップロード可能可能可能可能

（（（（Jsonファイルファイルファイルファイル形式形式形式形式））））

ターゲットターゲットターゲットターゲット領域以外領域以外領域以外領域以外のトリムのトリムのトリムのトリム

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• “Germ Line” または “Somatic”の選択が可能

Germ Line / Somaticのののの選択選択選択選択オプションオプションオプションオプション

【Germ Line】

アリル頻度の高い（20%以上の）変異を検出する場合

－ Recommended coverage is 100x – 200x coverage min

【Somatic】

アリル頻度の低い（20%以下の）変異を検出する場合

－ Recommended coverage is 500x coverage min

• “High Stringency” または “LowStringency”の選択が可能

【High Stringency】厳しい条件で変異を検出

【LowStringency】緩い条件でより多くの変異を検出

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パラメータファイルのアップロードパラメータファイルのアップロードパラメータファイルのアップロードパラメータファイルのアップロード

・ダウンロード・ダウンロード・ダウンロード・ダウンロード

・・・・VariantCallerのパラメータのパラメータのパラメータのパラメータ設定画面設定画面設定画面設定画面からからからから、、、、Jsonファイルをアップロードファイルをアップロードファイルをアップロードファイルをアップロード

※※※※アップロードアップロードアップロードアップロード完了後完了後完了後完了後、、、、自動的自動的自動的自動的にににに““““Custom””””がががが選択選択選択選択されるされるされるされる。。。。

① VariantCaller結果レポートの“Parameters File”からJsonファイルをダウンロード

② “AmpliSeqDesigner”から、Panelの情報としてJsonファイルをダウンロード

[http://ampliseq.com]

ご使用のPC

(2) VariantCallerの詳細なパラメータを設定可能

(3) Submitボタンをクリックして処理のスタート

Torrent Variant Caller：：：：パラメータのパラメータのパラメータのパラメータの設定設定設定設定（（（（２２２２））））

カーソルを合わせるとパラメータ変数の説明を表示

より詳細なパラメータ設定

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Torrent Variant Caller ： 実行結果

20

Torrent Variant Caller：：：：レポートレポートレポートレポート

バーコード毎のVCFファイル、

変異の一覧エクセルファイルを

取得可能変異の一覧を表示

21

VCFファイル、変異の一覧エクセル

ファイルを取得可能

Torrent Variant Caller：：：：結果結果結果結果のののの参照参照参照参照（（（（１１１１））））

22

(1)解析解析解析解析にににに使用使用使用使用したしたしたしたBEDファイルやファイルやファイルやファイルや設定設定設定設定したパラメータをしたパラメータをしたパラメータをしたパラメータを記述記述記述記述したファイルをダウンロードしたファイルをダウンロードしたファイルをダウンロードしたファイルをダウンロード可能可能可能可能

(2)マッピングマッピングマッピングマッピング結果結果結果結果ののののBAMファイルやファイルやファイルやファイルや変異検出結果変異検出結果変異検出結果変異検出結果ののののVCFファイルをダウンロードファイルをダウンロードファイルをダウンロードファイルをダウンロード可能可能可能可能

(3) VariantCallerバージョンバージョンバージョンバージョン3.6のののの形式形式形式形式でででで結果結果結果結果をををを表示表示表示表示

解析結果ファイルのダウンロード用リンク

(1)

(2)

(3)

Torrent Variant Caller：：：：結果結果結果結果のののの参照参照参照参照（（（（２２２２））））

ローカスのSNPの情報 SNPの種類SNPの頻度

閲覧情報の切り替えが可能

23

様々な条件で検索・絞り込みが可能

SNP検出箇所(vcfファイルから)

遺伝子情報(IGVに予め登録されているリファレンスの場合)

マウスでポイントすると、詳細情報を表示

アラインメント(bamファイルから)

Torrent Variant Caller：：：： IGVによるによるによるによる表示例表示例表示例表示例

24

25

リファレンスとターゲット領域の登録

リファレンスのリファレンスのリファレンスのリファレンスの登録登録登録登録Torrent BrowerのReferencesタブから、リファレンスの登録が可能（FASTA形式）

⇒ リファレンスを登録すると、シーケンサ本体でリファレンスの選択が可能になる。

26

登録されたリファレンス

Add Reference Sequenceをクリックして登録

リファレンスのリファレンスのリファレンスのリファレンスの登録登録登録登録とととと注意事項注意事項注意事項注意事項

主主主主なななな注意点注意点注意点注意点(1)染色体別の複数ファイルとなっている場合は、マルチFASTA形式の1ファイルにマージする必要あり

(2) 2GBまでのアップロード容量制限→ Zipファイルでもアップロード可能 （１つのFASTAファイルのみ）

・TorrentServerがインターネットに接続されている場合、以下のリファレンスのダウンロード＆自動登録が可能

・・・・mm10（（（（マウスマウスマウスマウス））））・・・・hg19（（（（ヒトヒトヒトヒト））））・・・・AmpliseqRNA用用用用hg19リファレンスリファレンスリファレンスリファレンス

27

Get Ion Referenceをクリック

ターゲットターゲットターゲットターゲット領域領域領域領域のののの指定指定指定指定：：：：２２２２種類種類種類種類ののののBEDファイルファイルファイルファイル

28

• Browser Extensible Data file (.bed)

– 解析の領域を指定するために必要

– 染色体上の位置情報を持つ

– UCSC Genome Browserで作成 (http://genome.ucsc.edu/)

Guide for TargetSeq™ Custom Enrichment Kit Orders (PN:4471870)参照

• Target Regions BED file • Hot Spot Regions BED file

C TReference

ポジション Target ID 遺伝子名 ポジション COSMIC ID* アノテーション

*COSMIC:Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)

ターゲットターゲットターゲットターゲット領域領域領域領域のののの登録登録登録登録（（（（１１１１－－－－１１１１））））

Torrent BrowerのReferencesタブから、各リファレンス上で解析の対象にする領域を登録することが可能。AmpliSeq Cancer Panelに関しては、下記のAmpliseq Designer

のサイトからBEDファイルをダウンロード。https://www.ampliseq.com/

⇒ Panelsタブから、既成のパネル情報の表示・取得が可能

(1) Torrent BrowserのReferenceタブで、ターゲット領域を登録したいリファレンス名をクリック

(2) Upload BED filesをクリック

(1)対応対応対応対応するリファレンスするリファレンスするリファレンスするリファレンス名名名名をクリックをクリックをクリックをクリック

(2) ををををクリッククリッククリッククリック

29

ターゲットターゲットターゲットターゲット領域領域領域領域のののの登録登録登録登録（（（（１１１１－－－－２２２２））））下記の２種類のBEDファイルを登録可能

�Target Regions:

プラグイン等で解析する対象領域を定義

�Hotspot Regions:

既知の変異の情報を含むBEDファイルを登録し、VariantCallerが検出した変異にアノテーションを付けて出力

(3) Hotspot Regionsを登録する場合は、Hotspotをチェック

(4) アップロードするBEDファイル指定

(5) Uploadボタンをクリック

(3)(4)

(5)

30

ターゲットターゲットターゲットターゲット領域領域領域領域のののの登録登録登録登録（（（（２２２２））））(1) Torrent BrowerのReferencesタブから、”Target Regions”または”Hotspots”を選択し、

Add Target Regionsをクリック

(2) BEDファイルの選択

(3) 紐付けるReferenceを選択

(4) Upload Target Regions File をクリック

31

(1)

(2)

(3)

(4)

Ion Reporter : 変異の絞り込みとアノテーション

32

Ion Reporter™ Software

• シーケンサとのダイレクトな統合• データの作成から、変異のアノテーションまでをカバー• バイオインフォマティシャンが不要な簡便なGUI

• ニーズに合わせて、ローカル(Local)版とクラウド(Hosted)版を提供

マッピングマッピングマッピングマッピング～～～～変異解析変異解析変異解析変異解析～～～～アノテーションアノテーションアノテーションアノテーション～～～～レポートレポートレポートレポート作成作成作成作成

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• 単一サンプルの解析– リファレンス配列との相違

• ペアサンプル解析– 二つのサンプル間の変異箇所の差異と共通性

• 癌の体細胞変異ペアサンプル解析– 正常細胞と共通する変異を除外して、癌細胞特異的な変異を抽出

• 遺伝性疾患のトリオ解析– 家族内の変異解析

• CNV （Copy Number Variation）解析

– 単一サンプル/ペアサンプルのCNVの検出

• 16Sメタゲノム解析

– 細菌の属/種レベルでの分類

Ion Reporter™がががが対象対象対象対象にするにするにするにする解析解析解析解析

34

P Value

Gene Symbol

Location

Functional Impact

Scores

SIFT

Poly-Phen

Grantham

結果結果結果結果のののの参照参照参照参照とととと絞絞絞絞りりりり込込込込みみみみ

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Minor Allele Frequency

Gene Ontology

OMIM

COSMIC

Oncomine

Variant Database

Variant Type

Zygosity

20種類以上種類以上種類以上種類以上のアノテーションのアノテーションのアノテーションのアノテーションIngenuityとのとのとのとの連携連携連携連携サービスサービスサービスサービス

補足

36

Ion AmpliSeq™ によるによるによるによる変異解析例変異解析例変異解析例変異解析例

http://ioncommunity.lifetechnologies.com/

プレイス ＞ UserGroupJapan ＞ アプリケーションノート

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“IonCommunity”にてアプリケーションノートとして紹介

www.lifetechnologies.com/seminarsjpwww.lifetechnologies.com/seminarsjp

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Technical Support

Call 0120-477-392

jptech@lifetech.com

営業時間：午前9時から午後6時まで

The Chip is the Machine™

ご不明な点がございましたらご不明な点がございましたら弊社テクニカルサポートまで弊社テクニカルサポートまでお問い合わせくださいお問い合わせください

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diagnostic use.

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MS 3 digital is a registered trademark of IKA Werke GMBH & Co.

TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc.

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