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INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA
FASES CROMATOGRAFICAS Y APLICACIONES
Curso Química Analítica Cualitativa
Jorge Yáñez S
Depto. de Química Analítica e Inorgánica Facultad de Ciencias Químicas
Universidad de Concepción
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FASES ESTACIONARIAS Y FASES MÓVILES EN CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA • La fase estacionaria requiere materiales estables que no reaccionen con la fase móvil o
que no sufra un deterioro por el paso o condiciones químicas de ésta. - resistencia mecánica (presión, flujo, temperatura) - resistencia química (pH, oxidantes) • Para cumplir estas características se usan materiales relativamente inertes como fase
estacionaria. • La fase estacionaria está constituida generalmente por dos componentes:
- soporte mecánico de llamado relleno - fase ligada
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a) Soporte mecánico de llamado relleno - Características importantes del soporte son: - tamaño de grano (generalmente muy pequeño, 5 - 100µ) - regularidad de tamaño (poca dispersión de tamaño), - tamaño de poro (son generalmente porosos) - regularidad de su forma. - Soportes más frecuentes:
♦ Gel de sílice o sílica g el (SiO2 n H2O) ♦ Alúmica (Al2O3 n H2O) ♦ Celulosa ♦ Poliestireno con grupos funcionales
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- Gel de sílice o sílica gel (SiO2 n H2O) ♦ Es el más usado que presenta en su superficie grupos ligantes Si-O-H. ♦ La sílice cumple con todas las características de estabilidad mecánica y química. ♦ Generalmente se usan partículas muy pequeñas de sílice (3 - 100 µm de diámetro), las
que se clasifican según su estructura en:
ü Partículas Porosas ü Partículas Peliculares ü Mallas monolítica:
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Partículas porosas regulares e irregulares y no porosas o peliculares.
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- Alúmica (Al2O3 n H2O) - También presenta grupos ligantes del tipo Al-O-H. - El tipo de cromatografía en que más se usa este tipo de fase estacionaria (sílice y
alúmina) es en la cromatografía de adsorción - Los grupos funcionales hidroxilos (OH-) sirven para establecer uniones débiles del tipo
dopolo-dipolo, puentes hidrógeno y uniones tipo con los solutos y de esta forma se produce la adsorción de moléculas sobre la fase estacionaria.
- Celulosa
Se usa como soporte pero es menos frecuente por su menor estabilidad a condiciones drásticas.
- Poliestireno con grupos funcionales
Grupos carboxílicos, sulfonatos (aniónicos) y grupos áminos (positivos).
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b) Fase ligada - En la cromatografía de reparto líquido - líquido (separación por solubilidad) se une
químicamente una fase líquida a la superficie de las partículas de relleno (sílica o alúmina).
- En este caso el relleno actúa como soporte físico de la fase líquida que está ligada. - Esta fase ligada es en escencia la verdadera fase estacionaria que interacciona física y
químicamente con los solutos. - La fase ligada son grupos químicos determinados que pueden unirse químicamente al
soporte según la ecuación general: Ejemplo: CH3 CH3 -HCl Si-OH + Cl - Si - R ------------- Si - O - Si - R CH3 CH3 soporte fase ligada Fase estacionaria ligada
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Las fases ligadas se dividen por su grado de polaridad en: - Polares - Poco Polares - Apolares Tabla 1. Fases ligadas más comunes en cromatografía líquida R - Polares R - Apolares comunes (CH2)3-NH2 (amino) (CH2)17- CH3 (octadecilo) (CH2)3- CN (ciano) (CH2)7 - CH3 (octilo)
(CH2)3- OCH (OH) CH2OH (diol) (CH2)3- CH3 (Butilo) (CH2) - CH3 (Etilo) (CH2)3- C6H11 (hexilo) (CH2)3- C6H5 (fenilo)
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- Cuando la fase estacionaria presenta grupos apolares y la fase móvil es un solvente
polar o poco polar se habla de: - HPLC en fase reversa o cromatografía en fase reversa (abreviado como RP-HPLC, del
inglés Reverse Phase HPLC). - Cuando la fase móvil es menos polar que la fase estacionaria se habla de
cromatografía en fase normal.
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Fases Móviles más comunes en Cromatografía líquida Solventes químicos con las siguientes características: - ser de alta pureza, ya que generalmente las impurezas dañan o inactivar sitios activos
de la fase estacionaria - ser un buen disolvente para los compuestos a separar (para no producir
precipitaciones dentro del sistema) - no reaccionar con los solutos - estar libre de gases para no producir volumen muerto por aparición de burbujas en el
sistema, y también debe poseer características físicas y químicas definidas como: - polaridad - pH - temperatura - fuerza iónica
- propiedades ópticas que puedan afectar la detección de los solutos
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Fases Móviles más usadas:
Solvente ε° (para la alúmina) Solvente ε° (para la alúmina) Fluoroalcanos -0.25 diclorometano 0.42
n-pentano 0.00 tetrahidrofurano 0.45
i-octano 0.01 1,2-dicloroetano 0.49
n-heptano 0.01 2-butanona 0.51
n-decano 0.04 acetona 0.56
ciclohexano 0.04 dioxano 0.56
ciclopentano 0.05 acetato de etilo 0.58
disulfuro de carbono 0.15 acetato de metilo 0.60
tetracloruro de carbono 0.18 1-pentanol 0.61
1-cloropentano 0.26 dimetilsulfóxido 0.62
eter isopropilico 0.28 anilina 0.62
cloruro de isopropilo 0.29 nitrometano 0.64
tolueno 0.29 acetonitrilo 0.65
1-cloropropano 0.30 piridina 0.71
clorobenceno 0.30 2-propanol 0.82
benceno 0.32 etanol 0.88
bromoetano 0.37 metanol 0.95
eter dietilico 0.38 1,2-etanodiol 1.11
cloroformo 0.40 acido acetico Largo
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1. Mezclas de solventes en F.M. - Los solventes son usados generalmente en mezcla para conseguir así una fase móvil de
polaridad definida.
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Por ejemplo: Fase móvil constituida por metanol y agua, la polaridad de esta mezcla aumenta a medida que se incrementa la proporción de agua y vice versa.
Otras características como el pH son reguladas utilizando tampones en su composición química.
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- Elución isocrática (1 solo solvente) Ø Si para la elución de los compuestos separados en una columna o en capa fina se usa un
solo solvente como fase móvil durante toda la elución. - Elución en gradiente Ø Si la elución se realiza con una mezcla de solventes y la composición de la mezcla se
varía durante la elución, se habla de elución con gradiente de solventes. Ø La elución con gradiente puede ser dinaria (dos solventes), terciaria (tres solventes) y
cuaternaria (cuatro solventes). Ø La elución en gradiente se utiliza preferentemente para aumentar la velocidad de
elución de los compuestos retenidos en la fase estacionaria.
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Ejemplo de elusión en gradiente e isocrática
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Cómo seleccionar el tipo de cromatografía a usar para una separación Ø Basarse en las características físico-químicas de los analitos: - peso molecular - la solubilidad - carga iónica - acidez Ø Con estos datos se debe también seleccionar la fase móvil y la fase estacionaria a
utilizar.
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fase ligada: C1 - C18
Cromatografí a en fase reversa
solubles en solventesapolares y/o poco polares
C6 - CHCl3
fase ligada: sí lice, ciano, amino, diol
Cromatografí a en fase normal
solubles en solventes demayor polaridadCHCl3 o CH3OH
soluble en solvente orgá nico
fase ligada: ciano, amino, diol
Cromatografí a en fase normal0
Cromatografí a en fase reversa
No ió nico
Cromatografí a de intercambio ió nico
ió nico
soluble en agua
peso molecular < 1000
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fase ligada: C4 - C8 - C18
Cromatografí a en fase reversa
Tamañ o molecularmenor a 30 nm
Cromatografí a de exclusió n molecular
Tamañ o molecularmenor a 30 nm
soluble en solvente orgá nico
fase ligada: C4 - C8 - C18
fenilo o poliester
Cromatografí a en fase reversa
Tamañ o molecularmenor a 30 nm
Cromatografí a de exclusió n molecular
Tamañ o molecularmenor a 30 - 400 nm
No ió nico
Cromatografí a de intercambio ió nico
ió nico
soluble en agua
peso molecular > 1000
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Configuración general de un sistema de cromatografía líquida de alta eficiencia
(HPLC)
Los componentes modulares de un cromatógrafo de HPLC son:
Ø Una bomba de alta presión Ø Recipientes de la fase móvil (uno o más solventes) Ø Una unidad de gradiente Ø Válvula de inyección de la muestra Ø Un detector que permite identificar la salida de los solutos separados. Ø Un registrador gráfico de las señales del detector
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pre-columna columna
Horno Termostatizado(optativo)
F l o w r a t e : 2 m L / m i n
carrier
Sistema de Elución conGradiente (optativo)
Sistema de Inyeccion
válvula
Probe 9 200 µL
autosampler (optativo)
Soluciones de Elución (1 ó más)
Bomba HPLC(isocrática)
Flowrate: 2 mL/min
Sistema de Detección
integrador(optativo)
Sistema de Presentaciónde Señales y
cuantificación de datos
UV-VIS
Conductividad
Fluorescencia
Refractométrico
Electroquímico
Polarimétrico
computador consoftware
Sistema de Separación
Sistema de Columnas
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Ejemplos de distintas columnas utilizadas en HPLC
20 cm
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EJEMPLOS DE SEPARACIONES UTILIZANDO HPLC 1.- Separación de alcanos lineales mediante cromatografía de reparto Sólo se puede considerar el número de carbonos como característica diferenciadora para una separación cromatográfica. A continuación se presenta la separación de alcanos lineales (C5 hasta C17) en una muestra sintética. Ø Condiciones de la separación cromatográfica Cromatografía de reparto en fase reversa (RP-HPLC) Fase móvil metanol 100% (poco polar) Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno sílica gel con fase ligada C18
ó octadesilo (ODS) Detector UV-VIS (los alcanos absorben luz en el rango ultravioleta, 215nm) Mientras más larga la cadena carbonada del alcano, mayor tiempo permanecerá éste en la fase estacionaria apolar (C18, octadecilo) y su tiempo de retención será mayor.
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2.- Separación de fenilalcanos mediante cromatografía de reparto En sus características químicas, los fenilalcanos son prácticamente iguales. La interacción con la fase móvil y la fase estacionaria es del mismo tipo y sólo se puede considerar el número de carbonos de la cadena unida al fenilo como característica diferenciadora para una separación cromatográfica. A continuación se presenta la separación de los fenil alcanos (fenil-C0 hasta fenil-C5) en una muestra sintética. Ø Condiciones de la separación cromatográfica Cromatografía de reparto en fase reversa (RP-HPLC) Fase móvil metanol 100% (poco polar) Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno sílica gel recubierta por
grupos ligados octadesilo o C18 (ODS) Detector UV-VIS (todos los compuestos cíclicos absorben luz en el rango ultravioleta, alrededor de 254nm)
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Si se quisiera disminuir el tiempo de análisis y acortar los tiempos de retención, se podría disminuir la polaridad de la fase móvil, agregando por ejemplo acetonitrilo (metanol/acetonitrilo = 50/50%v/v).
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3.- Separación de anilinas (colorantes) mediante cromatografía de adsorción En sus características químicas, las anilinas (o-, m- y p-nitronanilina) son prácticamente iguales. La interacción con la fase móvil y la fase estacionaria es del mismo tipo, pero se puede considerar la diferencia de la interacción dipolo-dipolo de los 3 ordenamientos estructurales de las anilinas y la fase estacionaria como principio para una separación. A continuación se presenta la separación de las o-, m- y p-nitronanilinas en una muestra sintética. Condiciones : Cromatografía de adsorción en sílica gel Fase móvil heptano/tetrahidrofurano (87/13%v/v), apolar Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno sílica gel Detector UV-VIS (todos los compuestos cíclicos absorben luz en el rango ultravioleta, alrededor de 254nm). Interacción dipolo-dipolo de anilinas y fase estacionaria (sílica gel). Interacción óptima menor débil
OH
NO2
H2N
OH
NO2
H2N
OH
H2N NO2
OH OHOH
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Cromatograma de esta separación:
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4.- Separación de proteinas de diferente peso molecular (tamaño) mediante permeación o filtración en gel Las proteinas pueden ser separadas en base a su tamaño mediante una fase estacionaria que posee retículos de tamaño determinado en donde son incluidas las proteinas durante su paso por la columna. A continuación se presenta la separación de proteinas ovoalbúmina, quimotripsinógeno A, citocromo C y lisozima. Condiciones de la separación Cromatografía de filtración en gel o exclusión por tamaño Fase móvil buffer fosfato pH 7 Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno polieter hidroxilado con
tamaño de partícula de 10 µm y poros de 130 A (rango de pesos moleculares a separar 500-80.000 Daltons)
Detector UV-VIS (todos las proteinas absorben luz en el rango ultravioleta, alrededor de 214nm)
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Cromatograma de esta separación:
Peak de identificación Peso Molecular 1.- Tiroglobulina 660000
2.- Serino albúmina de bovino 67000 3.- B-Lactoglobulina 35000
4.- Mioglobina 17000 5.- Citocromo C 13000 6.- Tetraglicina 216
Columna: PE TSK G2000SW 7,5 mm x 30 cm (x2) Fase Móvil: NaCl 0.3 M en buffer fosfáto 0.1 M, pH 7.0
Velocidad de elusión: 0.5 mL/min.
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5.- Separación de cationes por cromatografía de intercambio iónico Los cationes pueden ser separados en base a su carga y tamaño mediante una fase estacionaria que posee grupos aniónicos en los cuales se produce la interacción de cargas. A continuación se presenta la separación de cationes Li+, Na+, NH4
+, K+, Mg++, Sr++, Ba++ en una muestra sintética. Condiciones de la separación Cromatografía de intercambio iónico Fase móvil ácido ftálico 10 mM, tampón tris pH 5 (tris-hidroximetil
aminometano) Fase estacionaria columna cerrada con resina de intercambio catiónico (grupos
sulfonatos) Detector conductividad eléctrica
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Resina de intercambio catiónico (sulfonatos)
Cromatogramas: