instruções de uso - gbokit de extração dna ocheck ® - instruções de uso revisão bq-071-04 /...

Kit de Extração de DNA oCheck®

Instruções de Uso

Preparação individual (Cat. No. 515 040)

Para uso diagnóstico in vitroapenas por profissionais de Laboratório Revisão BQ-071-04 / Outubro 2018

Greiner Bio-One GmbH Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Germany Phone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience

IVD

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10°

30°

Kit de Extração DNA oCheck® - Instruções de UsoRevisão: BQ-071-04 / Outubro 2018

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GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS

en Batch code

Use by Consult Instruc-tions for Use

Catalog Number

Manufac-turer

In Vitro Diag-nostic Me-dical Device

Tempe-rature limitation

Contents sufficient for <n> tests

Danger Warning Warning Important Note

de Chargen-bezeich-nung

Mindes-tens haltbar bis

Vor Gebrauch Anwei-sung lesen

Katalog-nummer

Hersteller In-Vitro- Diagnos-tika Medi-zinprodukt

Tempera-turbegren-zung

Inhalt ausrei-chend für <n> Tests

Gefahr Achtung Achtung Wichtiger Hinweis

fr No de lot Date limite de conser-vation jusqu’au

Lire les in-structions avant utilisation

Numéro de réfé-rence

Fabricant Produit médi-cal de diagnostic in-vitro

Limite de tempéra-ture

Contenu suffisant pour <n> tests

Danger Attention Attention Note im-portante

es Código de lote

A utilizar preferib-lemente antes de

Antes de usar, lea las instruccio-nes

Número de catálo-go

Fabri-cante

Producto medicinal de diagnósti-ca in vitro

Limitación de tempera-tura

Contenido suficiente para <n> ensayos

Peligro Atención Atención Nota im-portante

it Codice del lotto

Da utilizzare entro e non oltre

Leggere le istruzi-oni prima dell’uso

Numero catalogo

Produt-tore

Dispositivo medico- diagnosti-co in-vitro

Limitazio-ne tempe-ratura

Contenuto sufficiente per test <n>

Pericolo Attenzi-one

Attenzi-one

Nota im-portante

pt Código do lote

A utilizar preferi-velmente antes de

Antes de usar, leia as instruções

Número do item

Fabri-cante

Producto medicinal de diagnósti-co in vitro

Limitação de tempera-tura

Conteúdo suficiente para <n> ensaios

Perigo Atenção Atenção Aviso im-portante

nl Lot nummer

Tenminste houdbaar tot

Gebruik-saanwij-zing lezen

Catalo-gusnum-mer

Fabrikant In vitro diag-nostisch medisch product

Tempera-tuurbeper-king

Voldoen-de inhoud voor <n> tests

Gevaar Waar-schuwing

Waar-schuwing

Belangri-jke op-merking

da Lotnum-mer

Anvendes senest

Læs brugsan-visningen

Katalog-nummer

Producent In vitro meskdicin doag-nose-apparat

Tempera-turbegra-ensær

Indehol-der nok til <n> test

Fare Advarsel Advarsel Vigtig henvis-ning

sv Lot nummer

Sista för-bruknings-dag

Läs bruk-sanvisnin-gen före använd-ning

Katalog-nummer

Tillverkare In vitro- medicinsk doag-nostisk apparatur

Tempe-ratur-be-gränsning

Innehållet räcker till <n> tester

Fara Varning Varning Viktigt medde-lande

pl Kod partii Termin zydatności

Przed użyciem przeczytać instrukcję

Numer katalo-gowy

Producent Diag-nostykain vitroProdukt yw

Ograni-czenie tempera-tury

Zawartość wystarcza na <n> testów

Niebez-pieczeńs-two

Uwaga Uwaga Ważne

no batch nr. holdbar til Les bruksan-visning før bruk

katalog-nummer

produsent in vitro-di-agnostisk medisinsk utstyr

tempe-raturbe-grensning

Innhold tilstrekke-lig for <n> tester

Fare Obs Obs Viktig merknad

el κωδικός παρτίδας

το λιγότερο διατηρείται

πριν την χρήση διαβάστε τις οδηγίες

Αριθμός Καταλόγου

Παραγωγός In vitro διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα

περιoριoμός θερμοκραο ίας

Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ

ΚΊΝΔΥΝΟΣ ΠΡΟΣΟΧΉ ΠΡΟΣΟΧΉ Σημαντική υπόδειξη

tr Parti kodu Son kullanma tarihi:

Kullanma-dan önce talimatı okuyun

Katalog numarası

Üretici firma

In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü

Sıcaklık sınırlaması

İçeriği <n> test için yeter-lidir

Tehlikeli Dikkat Dikkat Önemli Not

!


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ÍNDICE

1. CONTEÚDO DO KIT ................................................................................................... 42. CONSUMÍVEIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIO .................................................. 53. TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO ...................................................................... 64. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA ............................................................................... 65. DESCARTE DE RESÍDUOS ....................................................................................... 76. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 86.1 Finalidade...............................................................................................................................................86.2 Uso inadequado ....................................................................................................................................86.3 Material da amostra...............................................................................................................................9

6.3.1 Para PapilloCheck®............................................................................................................. .96.3.2 Para PelvoCheck® CT/NG ...................................................................................................96.3.3 Para ParoCheck® .................................................................................................................9

6.4 Princípios básicos da purificação do DNA .......................................................................................107. INSTRUÇÕES PARA O FLUXO DE TRABALHO oCheck® ......................................117.1 Instruções gerais ................................................................................................................................ 117.2 Separação das salas ........................................................................................................................... 117.3 Cuidados e precauções ......................................................................................................................12

7.3.1 Prevenção da contaminação ..............................................................................................127.3.2 Precauções gerais ..............................................................................................................127.3.3 Segurança no trabalho .......................................................................................................13

8. PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO........................................................................... 148.1 Preparação das soluções de trabalho e condições de armazenamento .......................................148.2 Preparação das amostras...................................................................................................................15

8.2.1 Preparação das amostras para PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk .......................158.2.2 Preparação de amostras de esfregaço vaginal e cervical para PelvoCheck® CT/NG .......158.2.3 Preparação de amostras individuais de urina para PelvoCheck® CT/NG .........................168.2.4 Preparação de pool de amostras de urina para PelvoCheck® CT/NG ..............................168.2.5 Preparação de amostra para ParoCheck® ........................................................................16

8.3 Protocolo padrão .................................................................................................................................168.3.1 Preparação ........................................................................................................................168.3.2 Pré-lise ...............................................................................................................................178.3.3 Lise .....................................................................................................................................178.3.4 Ajuste das condições de ligação do DNA ..........................................................................178.3.5 Ligação do DNA .................................................................................................................178.3.6 Lavagem das Colunas Spin ..............................................................................................188.3.7 Secagem das Colunas Spin ...............................................................................................188.3.8 Eluição do DNA ...................................................................................................................18

9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS .............................................................................. 1910. ASSISTÊNCIA TÉCNICA .......................................................................................... 2011. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ................................................................ 2012. PROTOCOLOS CURTOS ......................................................................................... 21


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1. CONTEÚDO DO KIT

Kit de Extração De DNA oCheck® Nome Volume/Unidades

Tampão L1 20 ml

Tampão L2 12 ml

Reagente L3 3 ml

Tampão W1 30 ml

Tampão W2 (concentrado) 25 ml

Tampão E 13 ml

Proteinase K (liofilizada) 30 mg

Tampão da Proteinase PKB 1.8 ml

Carreador RNA (liofilizado) 0.3 mg

Colunas Spin 50

Tubos de Coleta 250

Etiqueta para o Tampão L4 1

Instruções para o download das Instruções de Uso 1

BUF L1

BUF L2

REAG L3

BUF W1

BUF W2

BUF E

BUF L4

Proteinase K

Carreador RNA

Colunas Spin

Tubo de Coleta

Proteinase BUF PKB

Importador e distribuidor: Greiner Bio-One Brasil Produtos Médicos Hospitalares Ltda.Av. Affonso Pansan, 1967 - Vila Bertini - CEP.13.473-620 - Americana - SP

FONE - (0xx) (19)-3468-9600 FAX - (0xx)(19)-3468-9601CNPJ 71.957.310/0001-47 – site: www.gbo.com

Responsável Técnico: Dra. Nádia Camila Gennaro Alves - CRF-SP n° 32.272

Registro ANVISA/MS Nº 10290310066

Informações de uso do produto, solicitar via e-mail: [email protected]


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2. CONSUMÍVEIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS

Consumíveiss Greiner Bio-One Cat. No. Quantidade

Kit de Extração de DNA oCheck® 515 040 50 testes

Ponteiras estéreis com filtro, livre de DNase e RNase para micropipetas

Ponteiras com filtro de 0,5-10 µl Ponteiras com filtro de 0,5-20 µl Ponteiras com filtro de 10-100 µlPonteiras com filtro de 10-200 µlPonteiras com filtro de 100-1000 µl

765 288774 288772 288739 288750 288

9696969660

Consumíveis adicionais necessários

Tubos de reação de 1,5 ou 2,0 ml livre de DNAse e RNAse com tampa de segurança ou tampa de rosca para os passos de lise

Etanol p.a. ≥ 99.8 %

Luvas descartáveis

Equipamentos adicionais necessários

Microcentrífuga adequada para tubos de reação de 1,5 ou 2,0 ml e 11.000 g

Agitador (Vortex)

Bloco de aquecimento, banho-maria ou termomisturador com capacidade para tubos de reação de 1,5 ou 2,0 ml paraincubação a 70 °C e 56 °C

Micropipetas diversas entre 1-1000 μl

Descarte de resíduos

Timer

Se o DNA for extraído a partir de uma amostra de pool de urina para a análise com PelvoCheck® CT/NG, consulte o documento “Protocolo de suporte para amostras de pool de urina PelvoCheck® CT/NG" para obter informações sobre consumíveis e equipamentos adicionais necessários.


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3. TRANSPORTE E ARMAZENAMENTOO armazenamento e o envio do Kit de Extração de DNA oCheck® ocorre entre 10-30 °C. Armazenamento de soluções prontas para uso de trabalho, ver na seção 8.1.

4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇAO Kit de extração DNA oCheck® é exclusivamente de uso laboratorial, não deve ser utilizado comomedicamento, produto doméstico ou para outras finalidades. O uso do produto deve ser realizadoexclusivamente por profissionais, tais como técnicos ou médicos treinados em técnicas de biologiamolecular.

Informação regulatória:Embalagem de acordo com o regulamento CE n°1272/2008: misturas prejudiciais classificadas nas seguintes categorias: toxicidade aguda, oral (categoria 4), irritação da pele (categoria 2), irritação ocular (categoria 2), líquidos inflamáveis (categoria 3), toxicidade específica para órgãos-alvo – exposição única, não devem ser rotulados com H e P até 125 ml. Isso se aplica a todos os componentes do Kit de Extração de DNA oCheck®, com exceção da Proteinase K (lyo). De acordo com o regulamento CE n° 1272/2008, os pacotes internos devem ser rotulados apenas com símbolo (s) e identificação do produto.

Componentedo kitQuantidade desubstânciaperigosa

Classificaçãode acordo como Regulamento (EC) No 1272/2008

Pictogra-ma GHS epalavras de aviso

Requisitos para perigos e precauções

Proteinase K (lyo.), 30 mg (CAS No. 39450-01-6)

Irritação da pele (categoria 2)

Sensibilização da pele(categoria 1A/1B) Irritação dos olhos(categoria 2) Sensibilização respiratór-ia (categoria 1A/1B) Toxicidade específica para órgãos-alvo - exposição única (categoria 3)

H315H317H319H334

H335

P261P305+P351+P338

P342+P311

Causa irritação na pele.Pode causar reações alérgicas napele.Provoca irritação séria nos olhos.Pode causar alergia ou sintomasde asma ou dificuldades respiratóri-as, se inalado. Pode causar irritação respiratória.Evite respirar poeira. Utilizar luvas/óculos de proteçãoSE NOS OLHOS: lavar cuidadosamente com água por vários minutos. Remova as lentes de contato, se presentes e fáceis de retirar. Continue enxaguando. Se forem sentidos sintomas respi-ratórios: Chamar um CENTRODE INTOXICAÇÃO ou médico.

Tampão L2, 12 ml (cloreto deguanidina, 50-66%, CAS No. 50-01-1)

Toxicidade oral aguda(Categoria 4) Irritação na pele(categoria 2) Irritação nos olhos(categoria 2)

H302H315H319P280

Perigoso se ingerido.Causa irritação na pele.Provoca irritação séria nos olhos.Usar luvas de proteção / proteçãovestuário / proteção para osolhos / proteção facial.

PERIGO

ATENÇÃO

! Utilizar sempre um avental de laboratório apropriado, luvas descartáveis, óculos de segurança e seguir asinstruções de segurança descritas nessa seção e na seção 7.3.


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Kit componentQuantityHazardouscontent

Classificaçãode acordo como Regulamento (EC) No 1272/2008

Pictogra-ma GHS epalavras de aviso

Requisitos para perigos e precauções

Tampão W1, 30 ml (cloreto deguanidina, 36-50%, CAS No. 50-01-1; 2-propanol, 20-50%, CAS No. 67-63-0)

Toxicidade oral aguda(Categoria 4) Irritação na pele(categoria 2) Irritação nos olhos(categoria 2) Líquidos inflamáveis(categoria 3)

H302H315H319H226P280

Perigoso se ingerido.Causa irritação na pele.Provoca irritação séria nos olhos.Líquido e vapor inflamáveis. Usar luvas de proteção / proteçãovestuário / proteção para os olhos / proteção facial.

A versão atualizada da Folha de Dados de Segurança para este produto pode ser obtida através dowebsite da Greiner Bio-One: www.gbo.com/bioscience/biochips_download

5. DESCARTE DE RESÍDUOSO cloreto de guanidina nos Tampões L2 e W1 podem formar compostos altamente reativos quando combinado com água sanitária. A água sanitária ou as soluções ácidas não devem ser adicionadas diretamente aos resíduos da preparação da amostra.

A contaminação de resíduos líquidos com material infeccioso residual é altamente improvável, mas não pode ser completamente excluída. Portanto, os resíduos líquidos devem ser considerados infecciosos, manipulados e eliminados de acordo com os regulamentos locais de segurança. Por favor, siga cuidadosamente as diretrizes federais, estatais e locais para a eliminação dosresíduos.

ATENÇÃO


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6. INTRODUÇÃO

6.1 Finalidade

O Kit de Extração de DNA oCheck® (Greiner Bio-One; Cat. Nº. 515 040) é um kit para diagnóstico in vitro e se destina à preparação de DNA a partir de amostras humanas para serem analisadas com testes da linha de produtos oCheck®.

• PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Cat. No. 465 060)• PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One; Cat. No. 505 060)• PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Cat. No. 504 002)• ParoCheck® (Greiner Bio-One; Cat. No. 460 010, 460 020, 460 110, 460 120 )

O Kit de Extração de DNA oCheck® preenche os requisitos da Diretiva de Dispositivos Médicos de Diagnóstico In Vitro (98/79/CE), e desta forma apresenta a marca da conformidade CE.O produto se destina para uso APENAS por profissionais, tais como técnicos e médicos treinados nas técnicas de biologia molecular.

6.2 Uso Inadequado

O Kit de Extração de DNA oCheck® NÃO se destina a ser utilizado com CarnoCheck® (Greiner Bio-One) ou qualquer produto que não faça parte da linha de produtos oCheck®.


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6.3 Material da amostra

6.3.1 Para PapilloCheck®

Para aplicação com o PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Cat. No. 465 060) e PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One; Cat. N.º 505 060), o Kit de Extração de DNA oCheck® foi projetado e testado para extrair DNA genômico viral e humano de esfregaços cervicais coletados com um dos seguintes sistemas de coleta de amostras:

• PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One; Cat. No. 465 070)• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, USA)• SurepathTM (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)• STMTM (Qiagen, Hilden, Germany)

6.3.2 Para PelvoCheck® CT/NG

Para a aplicação com o PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Cat. N.º 504 002), o Kit de Extração de DNA oCheck® foi validado para a extração de DNA genômico e bacteriano humano a partir de amostras de urina humana e esfregaços vaginais e cervicais utilizando os seguintes sistemas de coleta:

Para amostras de urina:• Kit de coleta SAFE PelvoCheck® (Greiner Bio-One; Cat. No. 453 100)• Kit de coleta STRAW PelvoCheck® (Greiner Bio-One; Cat. No. 453 101)

Para amostras de esfregaço vaginal e cervical: • Tubo de coleta com o meio de transporte do Kit de Coleta PapilloCheck® (Greiner Bio-One;

Cat. No. 465 070) e, se aplicável, • Copan CLASSIQSwab (Copan Flock Technologies; Cat. No. 16460KS01)

Como material de amostra, amostras de urina individuais ou até um pool de 5 amostras individuaispodem ser usadas para análise. O protocolo padrão na seção 8.3 destina-se a extração de amostrasindividuais. Se o DNA for extraído a partir de um pool de urina com PelvoCheck® CT / NG, consulteo documento "Protocolo de suporte para pool de amostras de urina para PelvoCheck® CT / NG".

6.3.3 Para ParoCheck®

Para a aplicação com o ParoCheck® (Greiner Bio-One; Cat. No. 460 010, 460 020, 460 110, 460 120) o Kit de Extração de DNA oCheck® foi validado para extração de DNA bacteriano a partir de amostras de placas subgingivais coletadas com o

• Kit de Coleta ParoCheck® (Greiner Bio- One; Cat No. 460 070)

Outros sistemas de coleta de amostra não foram validados e não podem ser utilizados com o Kit de Extração de DNA oCheck®.


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6.4 Princípios básicos da purificação do DNA

O Kit de Extração de DNA oCheck® é designado para a purificação de DNA genômico viral, bacteriano e humano a partir de amostras de origem humana. A amostra é lisada rapidamente e eficientemente através da adição de Proteinase K e Tampão L1. O tampão de lise e o etanol criam condições apropriadas para a ligação dos ácidos nucléicos à membrana de sílica das Colunas de Ligação.Para amostras de pool de urina o passo de lise é realizado sem o Tampão L1. As condições apropriadas de lise são alcançadas utilizando o Meio de Coleta PelvoCheck®.O carreador de RNA melhora a ligação e a recuperação do DNA genômico viral e bacteriano de baixa concentração. Os contaminantes (potenciais inibidores de PCR), tais como sais, metabolitos e componentes celulares macromoleculares solúveis, são retirados durante os passos de lavagem com tampões de lavagem. O DNA genômico viral, bacteriano e humano puro é finalmente eluído sob condições de baixa força iônica em um tampão de eluição ligeiramente alcalino. Após a purificação, o DNA está numa solução adequada para análise direta com ensaios realizados com a linha de produtos oCheck®.


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7. INSTRUÇÕES PARA FLUXO DE TRABALHO oCheck®

7.1 Instruções Gerais

Ao implementar técnicas de última geração utilizadas na biologia molecular em um laboratório, as seguintes instruções devem ser consideradas para garantir a máxima segurança para funcionários do laboratório e resultados de alta qualidade.

A execução de técnicas de biologia molecular, como extração de DNA, amplificação e detecção de produtos de amplificação, necessita de pessoas adequadamente qualificadas. Além disso, um fluxo de trabalho limpo e bem estruturado é necessário para evitar resultados errados, como os que ocorrem devido à degradação do DNA ou contaminação por produtos de amplificação. Para garantir isso, é necessário separar as áreas de extração, amplificação e detecção conforme descrito no Capítulo 7.2.

Cada área deve ser equipada com equipamentos separados, consumíveis, aventais e luvas. Nunca transfira aventais, luvas ou equipamentos de uma área distinta para outra.

7.2 Separação das salas

A Figura 1 mostra um exemplo de como um laboratório pode ser separado em 3 seções distintas. Uma apenas se utiliza para a extração de DNA, outra para a preparação e realização de reações de PCR e a última destina-se a hibridização e análise. Cada sala será utilizada exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada, para evitar a contaminação de amostras. A utilização de cores pode ser vantajosa para evitar a troca acidental de equipamento e consumíveis entre as áreas.

Não se deve trocar nem equipamento nem consumíveis entre as diferentes salas de laboratório e espaços.Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e têm de ser consideradas.

Figura 1: Separação de salas no fluxo de trabalho oCheck®

Sala 1: extração de DNA; Sala 2: preparação de reação e divisão de PCR da mistura de reação numa bancada limpa; espaço separado para a adição do DNA eluído; Sala 3: hibridização e análise

Sala 1 Sala 2 Sala 3


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Todo o procedimento da extração de DNA com o Kit de Extração DNA oCheck® deve ser realizado na sala 1, a sala de extração de DNA. Após sair desta sala, é necessário trocar de avental. Dentro do fluxo de trabalho oCheck®, a extração de DNA é o processo mais sensível a contaminação, por isso é essencial que se cumpram rigorosamente as instruções contidas neste documento. Além disso, devem cumprir-se as orientações de prevenção de contaminação descritas no capítulo 7.3.1.

Na sala 2, prepara-se e divide-se a mistura de reação de PCR numa bancada limpa. A adição do DNA extraído na sala 1 deve ser realizada num espaço separado dentro da sala 2. Após sair desta sala, é necessário trocar de avental.

Na terceira sala de laboratório, ocorre a reação de hibridização e realizam-se os passos de lavagem. Na sala 3, também está instalado o CheckScanner™ em conjunto com o Software CheckReport™ para a análise final de ensaios da linha de produtos oCheck®.

7.3 Cuidados e Precauções

7.3.1 Prevenção da contaminação

• Aventais de laboratório devem ser utilizados durante todo o procedimento e diferentes conjuntos de aventais de laboratório são necessários para cada sala do laboratório.

• Luvas devem ser frequentemente trocadas, principalmente durante a manipulação das• amostras.• Limpeza do laboratório: o local de trabalho deve ser descontaminado antes e após o trabalho

com uma solução de limpeza apropriada.• Tubos de reação: nunca toque no interior da tampa do tubo de reação. Para evitar contaminação

cruzada, abra um tubo de cada vez. Para evitar contaminação, utilize tubos de reação com tampa de segurança ou tampa com rosca para os passos de lise.

• Pipetar amostras: devem ser utilizadas ponteiras com filtro apropriadas para micropipetas (estéreis, livres de DNase, RNase e DNA humano). As ponteiras das pipetas devem ser sempre trocadas entre transferências de líquidos.

7.3.2 Precauções gerais

• No momento da chegada, verifique se os componentes do Kit de Extração de DNA oCheck® têm danos. Se um dos componentes estiver danificado (por ex. frascos de tampão), contate o seu distribuidor local Greiner Bio-One. Não utilize componentes do kit danificados, pois a sua utilização pode levar a um fraco desempenho do kit de extração.

• Não utilize reagentes fora do prazo de validade.• Não utilize o Kit de Extração de DNA oCheck® após o prazo de validade.• Não misture reagentes de diferentes lotes.• Utilize apenas equipamentos/reagentes fornecidos com o kit e os recomendados pelo fabricante.• É necessária uma calibração/verificação regular das pipetas, do banho-maria e do bloco de

aquecimento.• A pipetagem de quantidades pequenas de líquido na gama do microlitro é um desafio. Portanto,

tenha cuidado para pipetar com micropipetas com a maior precisão possível.• Todos os passos da centrifugação devem ser realizados à temperatura ambiente (18-25 °C).• Reagentes não utilizados e resíduos devem ser descartados de acordo com as normativas

federais e estaduais.


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7.3.3 Segurança no trabalho

• Este kit é de uso exclusivo para diagnóstico in vitro e só deve ser utilizado por pessoas treinadas em procedimentos laboratoriais para diagnóstico in vitro.

• Nunca pipetar soluções com a boca.• Não comer, beber, fumar ou aplicar produtos cosméticos nas áreas de trabalho.• Tomar cuidado ao manipular amostras biológicas contendo materiais humanos potencialmente

infecciosos. Para minimizar o risco de infecção por material potencialmente infeccioso, recomenda-se trabalhar em capela de fluxo laminar. Manipular e descartar todas as amostras biológicas como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos. Evitar o contato direto com as amostras biológicas assim como respingos ou pulverizações. Usar sempre avental de laboratório, luvas e óculos de proteção ao trabalhar com amostras humanas.

• Lavar as mãos cuidadosamente após manipular amostras e reagentes.• A versão atualizada da Folha de Dados de Segurança para este produto pode ser obtida através

do website da Greiner Bio-One: www.gbo.com/bioscience/biochips_download


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8. PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO

8.1 Preparação das soluções de trabalho e condições de armazenamento

Todos os componentes do kit devem ser armazenados a temperatura ambiente (10-30 °C) e estão estáveis durante dois anos após a data de fabricação. Para as condições de armazenamento de cada componente do kit durante o uso, veja abaixo:

Antes de iniciar o protocolo com o Kit de Extração de DNA oCheck®, prepare as seguintes soluções:

1. Solução de Proteinase K: antes de utilizar o kit pela primeira vez, adicione 1,35 ml de Tampão de Proteinase (PKB) para dissolver a Proteinase K liofilizada. Divida a solução em alíquotas e conserve a -20 ºC por até 6 meses. Não volte a congelar.

2. Tampão W2: adicione 100 ml de etanol (p.a. ≥ 99,8%) ao Tampão W2 concentrado. Assinale a data atual no rótulo do frasco. O Tampão W2 está estável à temperatura ambiente (18-25 °C) até um ano.

3. Tampão L4: transfira o Tampão L2 para o Reagente L3 completamente e misture bem. Rotule o frasco com a etiqueta L4 fornecida com o kit. Assinale a data atual no rótulo do frasco. O Tampão L4 resultante está estável por até um ano à temperatura ambiente (18-25 °C).

4. Solução de Carreadora de RNA: adicione 900 μl de Tampão L1 para dissolver o Carreador de RNA liofilizada. Distribua o Carreador de RNA dissolvido em alíquotas. Conserve a solução de Carreador de RNA dissolvida a -20 °C por até 8 meses. Não volte a congelar! Uma vez descongelados, os frascos usados devem ser eliminados.

Durante a conservação, especialmente a baixas temperaturas, pode formar-se um precipitado branco nos Tampões L1, L2, ou L4. Esses precipitados podem dissolver-se facilmente incubando o frasco a 50-70 °C antes da utilização.


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8.2 Preparação das amostras

Sempre misture as amostras agitando com vortex antes de pipetar a amostra no primeiro tubo de reação.

8.2.1 Preparação das amostras para PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk

As amostras de esfregaços cervicais humanos que são coletadas em• Kit de Coleta PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Cat.-No. 465 070)• Meio de Coleta PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA USA)podem ser processadas diretamente.

As amostras de esfregaços cervicais que são coletadas em• Meio de Coleta SurepathTM (BD, Franklin Lakes, NJ USA) mtêm de ser lavadas antes da

utilização: centrifugar 250 μl da amostra durante 5 minutos a 11.000 g e ressuspenda o pellet em 250 μl de água destilada.

As amostras de esfregaços cervicais que são coletadas em• Meio de Coleta STMTM (Qiagen, Hilden, Germany) devem ser diluídas com água destilada:

100 μl da amostra + 150 μl de água destilada.

Regra geral, se a amostra do esfregaço cervical for muito concentrada e já estiver agregada, tem de ser diluída e homogeneizada antes de se iniciar a extração!

¯ Pipetar 250 μl da solução de amostra para um tubo de reação de 1,5 ml ou 2 ml. Para evitar contaminação, utilize tubos de reação com tampa de segurança ou com tampa de rosca para os passos de lise. Recomenda-se que valide todo o processo de isolamento de DNA de cada ciclo de extração de DNA utilizando um controle de amostra negativo.

8.2.2 Preparação de amostras de esfregaço vaginal e cervical para PelvoCheck® CT/NG

As amostras de esfregaço vaginal e cervical que são coletadas em• Kit de Coleta PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Cat.-No. 465 070) podem ser processadas diretamente.

¯ Pipetar 250 μl da amostra para um tubo de reação de 1,5 ml ou 2 ml. Recomenda-se que utilize tubos de reação com tampa de segurança ou tampa com rosca para os passos de lise. Para validar a extração de DNA, deve utilizar-se um controle de amostra negativo para cada ciclo de extração.

16Kit de Extração DNA oCheck® - Instruções de UsoRevisão: BQ-071-04 / Outubro 2018

PROTOCOLO

CURTO

Extração de DNA

Sala 1


8.2.3 Preparação de amostras individuais de urina para PelvoCheck® CT/NG

As amostras de urina que são coletadas em:• Kit de Coleta SAFE PelvoCheck® (Greiner Bio-One; Cat. No. 453 100)• Kit de Coleta STRAW PelvoCheck® (Greiner Bio-One; Cat. No. 453 101)podem ser processadas diretamente.

¯ Pipetar 250 μl da amostra para um tubo de reação de 1,5 ml ou 2 ml. Recomenda-se que utilize tubos de reação com tampa de segurança ou tampa com rosca para os passos de lise. Para validar a extração de DNA, deve utilizar-se um controle de amostra negativo para cada ciclo de extração.

8.2.4 Preparação de pool de amostra de urina PelvoCheck® CT/NG

Para a preparação da amostra de um pool de amostras de urina, consulte o documento: "Protocolo de suporte para o pool de amostras de urina para PelvoCheck® CT / NG".

8.2.5 Preparação de amostra para ParoCheck®

Para a preparação da amostra de amostras de placas subgingivais, consulte o documento: "Protocolo de suporte para extração de DNA de amostras subgingivais com o Kit de Extração de DNA oCheck®

(Cat No. 515 040) para mais Análise com ParoCheck®".

Os protocolos de suporte estão disponíveis separadamente em:www.greinerbioone.com/biochips_download

8.3 Protocolo padrão

O protocolo padrão destina-se a extração de:• amostras de esfregaço cervical• amostras de esfregaço vaginal• amostras de urina individuais

Para a extração de: • amostras de um pool de urina consulte o documento: "Protocolo de suporte para o pool de

amostras de urina para PelvoCheck® CT/NG”.

Para extração de:• amostras de placas subgingivais, consulte o documento: "Protocolo de suporte para extração

de DNA de amostras subgingivais com o Kit de Extração de DNA oCheck® (Cat No. 515 040) para mais Análise com ParoCheck®".

Os protocolos de suporte estão disponíveis separadamente em:www.greinerbioone.com/biochips_download

8.3.1 Preparação

¯ Verifique se a centrífuga está regulada à temperatura ambiente (18-25 °C). ¯ Prepare as amostras de acordo com o capítulo 8.2. ¯ Regule os blocos de aquecimento ou o banho-maria para 56 °C e 70 °C, respectivamente. ¯ Antes da eluição, incube o Tampão E de eluição a 70 °C. ¯ Certifique-se de que as soluções para análise foram preparadas de acordo com o capítulo 8.1.


PROTOCOLO

CURTO

Extração de DNA

Sala 1


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8.3.2 Pré-lise

¯ Adicione 80 μl de Tampão L1. ¯ Adicione 2,4 μl de solução de Carreador de RNA preparada. ¯ Adicione 20 μl de solução de Proteinase K.

Feche a tampa e misture brevemente com o agitador vortex de impulso. ¯ Incube a 56°C durante pelo menos 30 minutos. Agite as amostras utilizando um termo mixer a 650

rpm. Se utilizar um bloco de aquecimento ou banho-maria, agite ocasionalmente as amostras com o agitador ao longo do período de incubação.

Se forem processadas várias amostras, a Proteinase K, o Tampão L1 e o Carreador de RNA devem ser pré misturados diretamente antes da utilização. Nunca misture o Tampão L1 e a Proteinase K por mais de 10-15 minutos antes de adicionar a amostra. A Proteinase K tem tendência para auto-digestão no Tampão L1 sem substrato.

8.3.3 Lise

¯ Centrifugue brevemente o tubo de reação para remover gotas do interior da tampa.¯ Adicione 250 μl de Tampão L4.¯ Feche a tampa e misture com o agitador durante 10 segundos.¯ lncube a 70 ºC durante 15 minutos.

Feche bem a tampa dos tubos de reação para evitar a abertura acidental das tampas.

8.3.4 Ajuste das condições de ligação do DNA

¯ Centrifugue brevemente o tubo de reação para remover gotas do interior da tampa.¯ Adicione 300 μl de etanol (p.a. ≥ 99,8 %) à amostra.¯ Feche de imediatamente a tampa e misture cuidadosamente com o agitador durante 15 segundos.¯ Centrifugue brevemente o tubo de reação para remover gotas do interior da tampa.

8.3.5 Ligação do DNA

Para evitar a contaminação: coloque luvas novas antes deste passo!

¯ Para cada amostra, coloque uma Coluna Spin em Tubo de Coleta. ¯ Pipete cuidadosamente 450 μl dos lisados para a Coluna Spin e centrifugue a 11.000 g durante

1 minuto à temperatura ambiente. Não elimine o resto do lisado! ¯ Elimine o Tubo de Coleta contendo o filtrado.


PROTOCOLO

CURTO

Extração de DNA

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¯ Prepare novos Tubos de Coleta e coloque as Colunas Spin em no vos Tubos de Coleta.¯ Pipete o resto de 450 μl do lisado para a Coluna Spin.¯ Centrifugue a 11.000 g durante 1 minuto à temperatura ambiente.


¯ Elimine o Tubos de Coleta com o filtrado e coloque as Colunas Spin em um novo Tubos de Coleta.

8.3.6 Lavagem das Colunas Spin

¯ Adicione 500 μl de Tampão W1 na Coluna Spin.¯ Centrifugue a 11.000 g durante 1 minuto à temperatura ambiente.¯ Elimine o Tubo de Coleta com o filtrado e coloque a Coluna Spin em um novo Tubo de Coleta.¯ Adicione 600 μl de Tampão W2 na Coluna Spin.¯ Centrifugue a 11.000 g durante 1 minuto à temperatura ambiente.¯ Elimine o Tubo de Coleta com o filtrado e coloque a Coluna Spin em um novo Tubo de Coleta.

8.3.7 Secagem das Colunas Spin

¯ Centrifugue a 11.000 g durante 1 minuto para secar a membrana completamente.

Este passo é necessário para eliminar vestígios de etanol. O etanol no Tampão W2 inibe reações enzimáticas edeve ser removido completamente antes da eluição do DNA.

8.3.8 Eluição do DNA

Utilize Tampão E pré-aquecido (70 °C)!

Para evitar uma perda de temperatura durante os passos de pipetagem, recomenda-se encher os tubos dereação de 1,5 ou 2,0 ml com um máximo de 1300 μl de Tampão E (suficiente para n = 12 amostras).


¯ Coloque a Coluna Spin em um novo tubo de reação de 1,5 ml. ¯ Adicione 100 μl de Tampão E pré-aquecido (70 °C) no centro da membrana na Coluna Spin. ¯ Feche a tampa e incube à temperatura ambiente durante 1 minuto. ¯ Centrifugue a 11.000 g durante 1 minuto.

Armazene o DNA extraído -20 °C.Para efetuar mais uma análise com ensaios realizados com a linha de produtos oCheck® consulte aslnstruções de Utilização respectivas (PapilloCheck®, PapilloCheck® high-risk e PelvoCheck® CT/NG).


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9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS

Problema e causa Comentários e Sugestões

ZERO OU BAIXO RENDIMENTO DE DNA

Lise Incompleta

Números insuficientes de células na amostra

Reagentes não usados corretamente

Diluição não ideal do DNA das colunas

• Amostras não homogeneizadas completamente e misturadas com solução L1/ Proteinase K. A mistura tem que ser colocada em vortex imediatamente depois da adição de solução L1.

• Para amostras de urina PelvoCheck®: se o controle da amostra do PelvoCheck® falhar, é possível que a amostra de urina esteja muito diluída. Isso pode ser devido ao fato de:1. nenhuma amostra de urina de primeiro vazio foi coletada; 2. o volume de urina coletado foi muito grande (> 30 ml) 3. armazenamento e / ou transporte incorreto da amostra. Neste caso, é necessária uma nova coleta da amostra de urina

• Redução de atividade de Proteinase K: Dividir a proteinase K diluída em alíquotas e armazenar a -20°C por até 6 meses. Não recongelar as alíquotas individuais.

• Preparar soluções L3, W2 e a solução de proteinase K de acordo com a seção 8.1.• Adicionar etanol aos lisados antes de carregá-los nas colunas

• Pré aquecer a Tampão E a 70°C antes da diluição. Aplicar o Tampão E diretamente no centro da membrana sílica.

COLUNAS ENTUPIDAS

Lise Incompleta

Reagentes não usados corretamente

• Amostras não homogeneizadas completamente e misturadas com solução L1/ Proteinase K. A mistura tem que ser colocada em vortex imediatamente depois da adição de solução L1.

• Redução de atividade de Proteinase K: Dividir a proteinase K diluída em alíquotas e armazenar a -20°C por até 6 meses. Não recongelar as alíquotas individuais.

• Preparar soluções L3, W2 e a solução de proteinase K de acordo com a seção 8.1.• Adicionar etanol aos lisados antes de carregá-los nas colunas.

DESEMPENHO NÃO IDEAL DO DNA EM REAÇÕES ENZIMÁTICAS

Excesso de etanol e sal

Contaminação do DNA por substâncias inibidoras

• Certifique-se de centrifugar por pelo menos 1 minuto a 11000 g para que remova toda a solução W2 etanoica antes da diluição do DNA. Se por qualquer razão o nível de solução W2 tiver alcançado a saída da coluna após a secagem, repita a centrifugação.

• Não resfriar a solução W2 antes do uso. Solução fria não removerá o sal de maneira efetiva. Equilibre a solução W2 em temperatura ambiente antes do uso.

• Repetir a extração de DNA a partir da amostra original.


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10. ASSISTÊNCIA TÉCNICAA Greiner Bio-One dispõe de um Departamento de Assistência Técnica com cientistas experientes,com conhecimentos práticos e teóricos em biologia molecular e produtos oCheck®. Se você tiver alguma dúvida ou tiver alguma dificuldade em relação aos produtos oCheck®, não hesite em contactar a Greiner Bio-One diretamente via e-mail [email protected] ou entre emcontato com distribuidor local da Greiner Bio-One.

11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHOO Kit de Extração DNA oCheck® é um acessório IVD para os ensaios da linha de produtos oCheck®.O desempenho analítico e específico do kit de extração DNA oCheck® foi testado em combinaçãocom ensaios relevantes. Os dados estão disponíveis mediante solicitação.


PROTOCOLO

CURTO

Extração de DNA

Sala 112. PROTOCOLOS CURTOS

O protocolo curto destina-se a extração de amostras individuais para PapilloCheck®, PapilloCheck® high-risk e PelvoCheck® CT/NG. Se o DNA for extraído a partir de um pool de amostras de urina para o ensaiocom PelvoCheck® CT/NG ou amostras de placas subgingivais para ParoCheck®,por favor consultar os respectivos protocolos de suporte disponíveis em www.greinerbioone.com/biochips_download

1. PREPARAÇÃO ¯ Checar se a centrífuga está configurada para temperatura (18-25 °C) ¯ Preparar as soluções de trabalho de acordo com a seção 8.1 ¯ Configurar o bloco de aquecimento ou banho maria para 56 °C e 70 °C ¯ Pré aquecer o tampão de Eluição E a 70 °C ¯ Preparar as amostras de acordo com a seção 8.2 ¯ Pipetar 250 μl de amostra em um tubo de reação de 1.5 ou 2.0 ml

2. PRÉ-LISE ¯ 80 μl Tampão L1 ¯ 2.4 μl Carreador de RNA ¯ 20 μl Proteinase K ¯ Agitar brevemente! ¯ 56 °C durante pelo menos 30 minutos ¯ Centrifugar brevemente!

3. LISE ¯ 250 μl Tampão L4 ¯ Agitar brevemente! ¯ 70 °C por 15 minutos ¯ Centrifugar brevemente!

4. AJUSTE DAS CONDIÇÕES LIGAÇÃO DNA ¯ 300 μl etanol ¯ Agitar brevemente! ¯ Centrifugar brevemente!


PROTOCOLO

CURTO

Extração de DNA

Sala 1

5. LIGAÇÃO DO DNA ¯ Preparar as Colunas Spin ¯ 450 μl lisado ¯ 1 minuto a 11.000 g ¯ 450 μl lisado ¯ 1 minuto a 11.000 g

6. LAVAGEM DAS COLUNAS SPIN ¯ 500 μl Tampão W1 ¯ 1 minuto a 11.000 g ¯ 600 μl Tampão W2 ¯ 1 minuto a 11.000 g

7. SECAGEM DAS COLUNAS SPIN

¯ Centrifugar 1 minuto a 11.000 g

8. ELUIÇÃO DO DNA ¯ 100 μl Tampão E (pré aquecido 70 °C) ¯ 1 minuto a temperature ambiente (18-25 °C) ¯ 1 minuto a 11.000 g

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