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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Mestrado em Biologia Parasitária

ESTUDO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE UMA LIGNANA TETRAIDROFURÂNICA ISOLADA DE Piper solmsianum C.DC. SOBRE A

MOSCA VAREJEIRA Chrysomya megacephala (Fabricius 1794) (Diptera: Calliphoridae)

CAMILA DINIZ RIBEIRO NOGUEIRA

Rio de Janeiro

2007

TESE MBP–IOC C.D.R. NOGUEIRA 2007

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Nogueira, Camila Diniz Ribeiro

Estudo da atividade biológica de uma lignana tetraidrofurânica isolada de Piper solmsianum C.DC. sobre a mosca varejeira Chrysomya megacephala (Fabricius 1794) (Diptera: Calliphoridae) / Camila Diniz Ribeiro Nogueira.- Rio de Janeiro: IOC/ FIOCRUZ, 2007.

xii+106 p.: il. Orientador: Rubens Pinto de Mello e Marise Maleck de Oliveira Cabral. Dissertação (Mestrado) – IOC/FIOCRUZ. Bibliografia.

1. Grandisina. 2. Chrysomya megacephala. 3. Desenvolvimento pós-embrionário. 4. Modelagem molecular. 5. Produtos naturais. I. Instituto Oswaldo Cruz. II. Título.

i


DEPARTAMENTO DE ENTOMOLOGIA

Pós-graduação em Biologia Parasitária

Mestrado em Biologia Parasitária

CAMILA DINIZ RIBEIRO NOGUEIRA

Estudo da atividade biológica de uma lignana tetraidrofurânica isolada de Piper solmsianum C.DC. sobre a mosca varejeira Chrysomya megacephala (Fabricius 1794) (Diptera: Calliphoridae)

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz

como parte dos requisitos para obtenção do título de

Mestre em Biologia Parasitária.

Orientador: Prof. Dr. Rubens Pinto de Mello

Co-orientador: Prof. Drª. Marise Maleck de Oliveira Cabral

RIO DE JANEIRO

2007

ii


DEPARTAMENTO DE ENTOMOLOGIA

Pós-graduação em Biologia Parasitária

Mestrado Profissional em Biologia Parasitária

AUTOR: CAMILA DINIZ RIBEIRO NOGUEIRA

ESTUDO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE UMA LIGNANA

TETRAIDROFURÂNICA ISOLADA DE Piper solmsianum C.DC. SOBRE A MOSCA

VAREJEIRA Chrysomya megacephala (Fabricius 1794)

(Diptera: Calliphoridae)

ORIENTADORES: Prof. Dr. Rubens Pinto de Mello e

Profª Drª Marise Maleck de Oliveira Cabral

Aprovada em: 10/08/07

EXAMINADORES:

1º Examinador/Presidente:_____________________Prof. Dr. Anthony Érico Guimarães/IOC

2º Examinador:___________________________________Prof. Dr. Massuo Jorge Kato/USP

3º Examinador: ______________________________ Prof. Dr. José Bento Pereira Lima /IOC

1º Examinador Suplente:____________Profª Drª Maria Renata de Mello Bonfanti Borin/UFF

2º Examinador Suplente: __________________Prof. Dr.Cícero Brasileiro de Mello Neto/UFF

2007

iii

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à memória de minha tia,

Sônia Morais Diniz, como exemplo de

força, coragem e sabedoria.

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus orientadores de todo coração: a orientadora Drª. Marise Maleck de

Oliveira Cabral e ao orientador Dr. Rubens Pinto de Mello ambos do Laboratório de Diptera

do Departamento de Entomologia da FIOCRUZ/IOC principalmente pela credibilidade

depositada em meu desenvolvimento. Á ela, por tudo que aprendi neste tempo, pela

experiência de vida e por me mostrar dificuldades em mim que eu não reconhecia me fazendo

entender que tudo é possível quando existe compreensão, tolerância, amor e dedicação, que

juntos sempre podemos fazer melhor; e à ele pelos conhecimentos recebidos, conselhos e

auxílio por várias ocasiões.

Agradeço a todos do Laboratório de Diptera da FIOCRUZ/IOC por me acolherem com

carinho, pela convivência e reciprocidade. Em especial ao Dr. Anthony Érico Guimarães

chefe do Laboratório de Diptera do Departamento de Entomologia da FIOCRUZ/IOC por

abrir os caminhos para meu crescimento, e as companheiras diárias, Ana Carolina Leite,

Juliana Narciso e Renata de Oliveira, pela amizade verdadeira, pela alta generosidade,

atenção, conversas e principalmente por toda ajuda oferecida e pelas muitas vezes que

cederam em prol da minha necessidade.

Agradeço a todos do Laboratório de Biologia e Controle de Insetos Vetores, o técnico Izaías,

estagiários, alunos, mestres, doutores e chefes pelo espaço de trabalho, contribuição e boa

vontade nas horas em que precisei.

Agradeço a todos que colaboraram tecnicamente na configuração deste trabalho ou na sua

metodologia, entre eles: Taíssa Maleck, pela elaboração dos desenhos esquemáticos; Celma

Marinho, pela ajuda nas coletas dos insetos; Colégio Pedro II, pelo local cedido para a

manutenção das colônias; Prof. Marco Antônio S. Souza, pela realização dos cálculos da

modelagem molecular; Drª. Suzete Gomes, pela preocupação e interesse no meu

adiantamento; Dr. Massuo Kato, por me dar suporte na criação deste trabalho através da

substância cedida; a Drª. Maria Renata Borin e ao Dr. Otto R. Gottlieb pelos valiosos

ensinamentos que favoreceram meu engrandecimento profissional.

Agradeço, a todos os familiares em especial meus pais, irmãos e tias e a todos meus amigos

pelo apoio, confiança, entendimento, consideração e amor em todos os momentos, fazendo do

meu percurso um caminho mais fácil e sereno de ser seguido. Sou grata pelo incentivo e

coragem que me deram para sempre continuar caminhando.

Enfim, agradeço àqueles que de alguma forma estiveram envolvidos com este trabalho e não

foram mencionados diretamente aqui, contudo não foram esquecidos.

v

ÍNDICE

RESUMO/ABSTRACT......................................................................................................xi/xii

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. ..1

1.1. Estruturas de Lignóides ............................................................................................... .....3

1.2. Bioatividades de Lignóides em Insetos .......................................................................... ..7

1.2.1. Estruturas/Atividade .................................................................................................... ...28

1.3. Grandisina .......................................................................................................................29

1.4. Inseto modelo: Chrysomya megacephala (Fabricius 1794)(Diptera: Calliphoridae) ......31

1.4.1. Distribuição geográfica ..................................................................................................32

1.4.2. Habitats.......................................................................................... .................................33

1.4.3. Desenvolvimento............................................................................................................34

1.4.4. Sistema endócrino envolvido no processo da muda....................................................... 35

1.4.5. Importância médico-sanitária e ecológica ......................................................................40

1.4.6. Controle ..........................................................................................................................41

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................43

3. METODOLOGIA...............................................................................................................44

3.1. Lignana: Grandisina .........................................................................................................44

3.1.1: Preparo da amostra .........................................................................................................45

3.2. Inseto: Chrysomya megacephala ......................................................................................45

3.3. Bioensaios......................................................................................................... ................46

3.3.1. Tratamento tópico nas larvas em jejum..........................................................................47

3.3.2. Tratamento tópico nos ovos............................................................................................47

3.3.3. Tratamento nas larvas.....................................................................................................48

3.3.4. Tratamento via oral das larvas........................................................................................48

3.3.5. Acompanhamento das fases de desenvolvimento pós-embrionário ...............................48

3.4. Análises Estatísticas.........................................................................................................49

3.5. Modelagem Molecular.....................................................................................................49

4. RESULTADOS ...................................................................................................................51

4.1. Estrutura/Atividade ........................................................................................................51

4.2. Bioensaios ........................................................................................................................61

4.4. Modelagem Molecular.....................................................................................................75

5. DISCUSSÃO .......................................................................................................................79

6. CONCLUSÃO.....................................................................................................................83

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................84

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.2.1: Tipos de esqueletos de lignanas bioativas em insetos ........................................9

Tabela 1.2.1.1.: Caracterização em grupos das diferentes atividades biológicas de lignóides

encontradas em insetos .......................................................................................................... ...28

Tabela 4.2.1.A: Duração em dias do desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya

megacephala tratadas com grandisina por uso tópico nas larvas (L1) em jejum.....................63

Tabela 4.2.1.B: Viabilidade (%) do desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya

megacephala tratadas com grandisina por uso tópico nas larvas (L1) em jejum.....................63

Tabela 4.2.1.C: Peso larval (mg), tamanho dos adultos (mm) e razão sexual de Chrysomya

megacephala tratadas com grandisina por uso tópico nas larvas (L1) em jejum....................64


megacephala tratadas com grandisina por uso tópico sobre as larvas (L1) em jejum .............65


megacephala tratadas com grandisina por uso tópico sobre as larvas (L1) em jejum. ............65


megacephala tratadas com grandisina por uso tópico sobre as larvas (L1) em jejum .............66


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/mg) por uso tópico sobre a massa de ovos ....67


megacephala tratadas com grandisina (100µg/mg) por uso tópico sobre a massa de ovos .....67


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/mg) por uso tópico sobre a massa de ovos ....68


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/µL) por uso tópico sobre as larvas em jejum.69






megacephala tratadas com grandisina (100 µg/µL) por uso tópico sobre as larvas (L1) .......71





vii

Tabela 4.2.6.A: Peso larval (mg), tamanho dos adultos (mm) e razão sexual de Chrysomya



megacephala tratadas com grandisina (100 µg/mL) por uso oral na dieta das larvas (L1) ....73


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/mL) por uso oral na dieta das larvas (L1) .....74

Tabela 4.4.1.: Valores referentes ao calor de formação (Hf), potencial de ionização (EV) e

polaridade (Debye) das moléculas ecdisona e grandisina ........................................................75

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1.1: Subtipos de esqueletos de lignóides do tipo 8. 8` com atividades em insetos .... ..5

Figura 1.1.2: Subtipos de esqueletos de lignóides com atividades em insetos......................... ..6

Figura 1.3.1: Grandisina, substância isolada de Piper solmsianum ........................................30

Figura 1.3.2: Piper solmsianum (folha)....................................................................................30

Figura 1.3.3: Piper solmsianum (fruto) ....................................................................................30

Figura 1.4.1.: Chrysomya megacephala ...................................................................................31

Figura 1.4.4.1.: Esquema representando o controle endócrino do processo de muda..............38

Figura 1.4.4.2: Esquema representando as fases do ciclo de desenvolvimento de moscas......39

Figura 3.1.1: Cristais de grandisina ..........................................................................................44

Figura 3.2.1: Armadilha utilizada na captura das moscas. .......................................................45

Figura 4.1.1: Número de lignóides distribuídos de acordo com a bioatividade em insetos .....53

Figura 4.1.2.A,B: Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto

químico com atividade em insetos ...........................................................................................54


químico relacionados a alimentação e atividade repelente em insetos.....................................55


químico com efeito tóxico sobre os insetos..............................................................................56


químico com atividade de inibição do crescimento sobre os insetos .......................................57


químico que interferem sobre o desenvolvimento dos insetos .................................................58


químico com atividade de inibição da diurese em insetos........................................................59

Figura 4.1.8.A,B. Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto

químico que com atividade de inibição da monooxigenase microssomal intestinal ................60

Figura 4.2.1: Curva do número de larvas por intervalo de peso, no tratamento tópico com

grandisina nas larvas em jejum.................................................................................................64




grandisina sobre a massa de ovos .............................................................................................68



ix


grandisina nas larvas.................................................................................................................72

Figura 4.2.6: Curva do número de larvas por intervalo de peso, no tratamento oral com

grandisina das larvas.................................................................................................................74

Figura 4.4.1: Estrutura modelada da grandisina .......................................................................76

Figura 4.4.2: Estrutura modelada da ecdisona..........................................................................76

Figura 4.4.3: Análise comparativa entre as distâncias de grupamentos ativos de ecdisona (1) e

grandisina (2)............................................................................................................................78

x

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS

A°= ângstrons 13C= ressonância magnética nuclear de Carbono 13.

CA= corpora alata

CC= corpora cardíaca

CNS= células neurosecretoras do cérebro

DE50= dose efetiva em 50%

EC= ecdisona

EV= potencial de ionização

F1, F2, F3= gerações (1ª, 2ª e 3ª etc.)

GP= glândulas protorácicas 1H= ressonância magnética nuclear de próton

Hf= calor de formação

HJ= hormônio juvenil

IPCC= painel intergovernacional sobre mudanças no clima

IPM= intervalo pós-mortem

L1, L2, L3= estágios larvais das moscas

ONU= Organização das Nações Unidas

pH= potencial de hidrogênio

PF= ponto de fusão

PTTH= hormônio protoracicotrópico

RS= razão sexual

DP= desvio padrão

URA= umidade relativa do ar

UV= luz ultravioleta

IV= intervalo de variação

X = média

χ2= método do quiquadrado

xi


RESUMO

Este estudo propôs verificar os efeitos de grandisina, uma lignana isolada de Piper solmsianum (Piperaceae) sobre o crescimento e desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya megacephala, e a toxidade sobre as larvas da mosca varejeira. A substância foi testada por tratamento tópico sobre larvas L1 (com e sem restrição de alimento), sobre a massa de ovos e adicionada à dieta larval. Grandisina mostrou interferência sobre o desenvolvimento pós-embrionário de C. megacephala marcando sua eficiência pelo efeito tóxico (~30%) sobre ovos e larvas de C. megacephala quando utilizada por uso tópico sobre a massa de ovos e larvas (L1) em jejum, ambos na concentração de 100µg/µL. De acordo com os lignóides descritos na literatura, as moléculas foram avaliadas quanto ao tipo de esqueleto químico frente às atividades biológicas encontradas em insetos e a maioria deles mostrou toxidade, seguido das atividades de inibição da alimentação, repelência, inibição do crescimento e alteração no desenvolvimento em insetos, predominando os tipos 8.8’ e 8.5’ e os subtipos 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7`; 8.8’, 9.O.9’ e 8.5’, 7.O.4’ de lignóides descritos. A substância alvo foi analisada quanto as possíveis interações moleculares frente à ecdisona, utilizando como instrumento a modelagem molecular. A lignana grandisina quando comparada a ecdisona mostrou correlações espaciais e volumes moleculares semelhantes, porém não mostrou os mesmos mecanismos de interação, mas indicou que a superfície de contato de ambas as moléculas são compatíveis com os mesmos receptores. A toxidade demonstrada pela grandisina sobre os ovos e larvas de C. megacephala foi o mais efetivo resultado deste estudo, embora outros aspectos do desenvolvimento deste modelo experimental devam ser analisados, a fim de avaliar a potencialidade de grandisina frente à descoberta de inseticidas e controladores do desenvolvimento em insetos.

xii


ABSTRACT

The aim of this study was to verify the effects of grandisin, a lignan isolated from Piper solmsianum (Piperaceae), on the growth and post-embryonic development of Chrysomya megacephala, and the toxicity on blowfly’s larvae. The substance was tested in topic treatment on larvae L1 (without and with abstinence from food), treatment on egg mass and added on larvae diet. This lignan showed interference on the post-embryonic development cycle of C. megacephala. The tested substance marked its efficiency for the toxic effect (~30%) on eggs and larvae of C. megacephala when used by topical use on the mass of eggs and larvae (L1) without feeding. In accordance with lignoids described in literature, chemical structures of lignoids had their biological activities evaluated in insects and its majority evidenced toxic effects, followed by antifeedants and repellent activity, inhibition of growth and alteration of development in insects, predominating the types 8.8’; 8.5’ and the subtypes 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’; 8.8’, 9.O.9’; 8.5’, 7.O.4’. The target lignan was measured regarding possible molecular interactions using molecular modelling. Grandisin as compared to ecdisone showed spatial correlations and similar molecular volumes, but it doesn’t secure that both components interact in the same way, however it does indicate that these molecules could have contact surfaces compatible with the same receptors. The most effective result of this study was the toxicity demonstrated by grandisin on the eggs and larvae of C. megacephala, meanwhile other aspects of the development of this experimental model must be analyzed in order to evaluate the capability of grandisin front of the discovery of insecticides and drivers of development in insects.

1

1.INTRODUÇÃO

A diversidade estrutural química, a alta variabilidade intraespecífica e a ocorrência

restrita são as características mais impressionantes do metabolismo secundário de plantas e

descrito por Gottlieb (1996) como metabolismo especial. A diversificação de produtos

naturais pode ser resultante da adaptação do metabolismo secundário à contínua mudança do

meio ambiente (Hartmann 1996).

Segundo Strasburguer et al. (1994) os compostos secundários são substâncias

ecologicamente eficazes e os compostos primários, substâncias fisiologicamente eficazes, já

que o metabolismo secundário é dispensável para o crescimento e desenvolvimento da planta,

porém indispensável para a sobrevivência das espécies (Hartmann 1996). A grande maioria

dos compostos secundários é produzida via rotas biogenéticas básicas, gerando um ou alguns

metabólitos chave, a partir do qual numerosos derivados são formados por simples

transformação enzimática. Este segundo nível de metabólitos chave é posteriormente

diversificado por específica hidroxilação, esterificação, O-metilação, desidrogenação,

fenoloxidação, glicosilação etc (Hartmann 1996). Estão reunidos em 3 grupos maiores

segundo as substâncias químicas que constituem: compostos fenólicos (taninos, cumarinas,

flavonóides, fenóis, quinonas, xantonas, lignanas), compostos nitrogenados (alcalóides,

glicosídeos cianogenéticos, glucosilatos) e terpenos (terpenóides) (Ramos et al. 1998;

Hartmann 1996).

A maioria dos compostos secundários é originária de plantas, e toda a variedade de

tipos destes produtos tem uma grande e importante função, ditada pela evolução, que é manter

a total integridade da planta contra competidores, predadores e patógenos. Eles são

usualmente classificados de acordo com suas estruturas químicas em diferentes classes. A

enorme variedade de estruturas químicas encontradas determina o número infinito de sinais

que são requeridos para manter a complexidade de diferentes ecossistemas presentes na

natureza (Luckner 1972; Janzen 1973; Swain 1974, 1977).

Muitos produtos naturais têm sido isolados e mostraram afetar o desenvolvimento de

insetos, mas em muitos poucos casos o preciso modo de ação é conhecido. Com o aumento do

interesse na identificação do sítio específico de ação dos agentes, os quais poderiam ser

usados como compostos direcionados para o desenvolvimento de novos agentes controladores

de insetos, as plantas têm sido importante fonte de tais compostos (Dinan et al. 1996).

Em nível ecológico é evidente a interação entre plantas-fungos (Stoessl 1966), planta-

planta (Gutterman et al. 1980; Lavie et al. 1974; Stevens et al. 1992) e planta-inseto (Bowers

2

1968). O alcance de interações químicas específicas entre plantas e insetos é muito extenso e

complexo, refletindo a diversidade de sua co-adaptação (Harmatha e Dinan 2003).

Plantas são selecionadas para a produção de compostos químicos secundários em

resposta a alimentação dos herbívoros. Ao longo do tempo, as plantas tornam-se mais tóxicas

e os herbívoros mais especializados. Também, as plantas que desenvolvem novas defesas

entram em uma nova zona adaptativa e se submetem as diversificações filogenéticas (Ehrlich

e Raven 1964). O mesmo acontece aos herbívoros que desenvolvem novos mecanismos de

desarmamento. Isto é então chamado de escape e radiação (Thompson 1994), e deve ser

enormemente responsável por dirigir o processo co-evolucionário.

Devido à pressão seletiva exercida pelo ataque de herbívoros poder ser forte ou fraca,

eles podem não ser os principais causadores do aparecimento e manutenção dos aleloquímicos

em plantas. Entretanto, estes compostos determinam basicamente o padrão bioquímico das

plantas através do qual os herbívoros conseguem distinguir entre plantas hospedeiras e não

hospedeiras (Jermy 1984).

A fantástica variedade e complexidade de metabólitos especiais biossintetizados pelas

plantas teria se formado e evoluído como mecanismo de defesa desses vegetais às condições

ambientais ricas em microorganismos, insetos, animais e também às condições de adaptação e

regulação (Reinbothe et al. 1990). A maioria das classes desses compostos possui mais de

uma função defensiva e estes compostos são capazes de afetar igualmente outras plantas e

organismos dependendo do nível de variação de translocação e destoxificação dos mesmos

(Swain 1977). Assim, intervêm em relações de competição com outras plantas, atuando como

agentes alelopáticos, e contra invasões de fungos, bactérias e vírus; em relações de

mutualismo como atração de polinizadores e dispersores, como moléculas portadoras de

informação relacionadas com possíveis funções defensivas, como proteção contra radiação

ultravioleta e dessecação, como reserva de nitrogênio e outras (Ramos et al. 1998).

Estas substâncias específicas de plantas atuam no comportamento dos insetos

(Nakanishi 1980), e podem interferir na regulação do crescimento, inibindo a alimentação,

com atividade repelente, inseticida e sinergista dentre outras (Fales et al. 1970; Cabral 1999;

Harmatha e Dinan 2003). E, os insetos por sua vez, utilizam estas substâncias, como sinais

para reconhecimento de abrigo, alimentação e oviposição (Nakanishi 1980). Como observado

acima, o isolamento de produtos naturais extraídos de plantas é crucial para a descoberta de

novos tipos de compostos ativos, propiciando estudos para a compreensão dos processos de

desenvolvimento em insetos.

3

1.1. Estruturas de Lignóides

Lignóides são micromoléculas cujo esqueleto é formado exclusivamente, ou

adicionalmente a outros grupos, pelo grupo fenilpropânico (C6-C3)n, e sendo restrito a poucas

unidades, 1, 2, 3 etc. Sua ocorrência na natureza se limita a plantas vasculares que possuem o

tecido enriquecido por ligninas, macromoléculas dotadas de um esqueleto em (C6-C3)n. A

biossíntese tanto dos lignóides como das ligninas envolve os metabólitos primários finais da

via metabólica do chiquimato: ácidos cinâmicos→ álcoois cinamílicos→ propenilfenóis +

alifenóis. A grande maioria dos lignóides pertence ao grupo das lignanas, derivadas pela

condensação oxidativa de álcoois cinamílicos entre si ou com ácidos cinâmicos, e das

neolignanas, derivadas pela condensação oxidativa de alifenóis e de propenilfenóis entre si ou

cruzada. Os carbonos-y das cadeias em C3 são, por isto, oxigenados nas lignanas e isentos de

oxigenação nas neolignanas (Gottlieb et al. 1989; Gottlieb e Yoshida 1984; Gottlieb 1972).

Como dito anteriormente, lignanas acompanham ligninas em todas as plantas vasculares:

Pteridophyta, Gymnospermae e Angiospermae, especialmente angiospermas. Neolignanas,

apesar de mais diversas em estrutura química são menos numerosas que as lignanas, menos

estáveis e são obviamente mais específicas e restritas a certas famílias de plantas (Hartmann

1996; Umezawa 2000).

Um sistema de nomenclatura proposto por Gottlieb e Yoshida (1989), envolve,

inicialmente, a numeração das unidades precursoras C6-C3 de 1 a 9 e 1’a 9’. Estes números

são então transferidos para as posições análogas dos dímeros. Com isso estariam

caracterizados tipos (acoplamento principal) e subtipos (acoplamento secundário) de

esqueletos. A representação gráfica dos tipos e subtipos estruturais de lignóides ilustra a

grande variedade estrutural de dímeros C6-C3 que ocorrem na natureza (Figuras 1.1.1.-1.1.2.).

Na definição dos tipos, somente as ligações C-C são consideradas. Ligações C-O-C

caracterizam tipos apenas nos casos em que constituem a única conexão entre as duas

unidades. Usualmente, ligações C-O-C definem os subtipos.

De acordo com os autores Whiting (1985) e Ayres e Loike (1990) as lignanas são

dímeros de fenilpropanóides, onde as unidades de fenilpropanos são ligadas pelo carbono

central (C8) de suas cadeias laterais e todos os outros tipos de ligações formam estruturas

chamadas neolignanas.

As lignanas de cada subgrupo variam substancialmente quanto ao nível de oxidação

tanto no anel aromático quanto nas cadeias laterais de propil, variando também no padrão de

substituição e na estrutura química do esqueleto básico carbônico (Ayres e Loike 1990;

Umezawa 2003).

4

Durante a última década, avanços significantes foram feitos na química e biossíntese

das lignanas (Umezawa 1997; Lewis e Davin 1999; Umezawa 2001), adicionalmente, a

diversidade estrutural, enantiomérica, e biossintética exibida, assim como sua diversa

distribuição filogenética (Umezawa 2001).

Esta classe de substância química tem atraído muito interesse ao longo dos anos

devido sua ampla ocorrência na natureza, principalmente no reino vegetal e também por seu

largo espectro de efeitos biológicos (MacRae e Towers 1984). Muito se conhece sobre os

efeitos de lignanas nos diferentes organismos, incluindo o homem, em níveis moleculares,

fisiológicos, enzimáticos, farmacológicos e até clínicos. Entretanto, não é muito conhecido o

seu papel e função na sua produção pelas plantas. Em nível ecológico, possuem um papel

importante na interação de plantas com outros organismos e na proteção das plantas contra

danos físicos (Hartmann 1996).

5

O

O

8.8', 7.O.9', 9.O.7'

8.8', 9.O.9'

o

8.8', 6.7', 9.O.9'

8.8', 2.2'

o

8.8', 7.O.7'

8.8'

o

o

8.8', 7.O.9'

o

8.8', 2.7', 9.O.9'

OR

RO

RO

RO

Figura 1.1.1.: Subtipos de esqueletos de lignóides do tipo 8.8’ com atividades em insetos, adaptado de Gottlieb e Yoshida 1989.

6

5.5'

o

OR

8.5', 7.O.4'

1.5', 2.2'

o

OR

8.3', 7.O.4'

o

OR

OR

8.1', 7.O.6'

Figura 1.1.2.: Subtipos de esqueletos de lignóides com atividades em insetos, adaptado de Gottlieb e Yoshida 1989.

7

1.2. Bioatividades de Lignóides em Insetos

O primeiro relato sobre a atividade de lignóides contra insetos ocorreu em 1942, e

consistiu na ação sinergística das lignanas sesamina, asarinina e pinoresinol com inseticidas

piretróides (Haller et al. 1942 a, b). Considerando as lignanas sesamina e sesamolina, ambas

demonstraram atividade de hormônio juvenil em insetos (Bowers 1968; Casida 1970). Desde

1970, muitas lignanas têm sido relatadas por possuírem atividade reguladora da alimentação

(Wada e Munakata 1970). Além disso, a sesamina quando aplicada a testes de alimentação

exibiu alta atividade antialimentar e leve inibição do crescimento contra a larva de 4º estágio

larval de Spilarctia oblicua (Walker 1858) (Lepidoptera: Arctiidae) (Srivastava et al. 2001). A

substância β-peltatina A metil-éter foi tóxica quando testada na dieta, tanto em larvas de

Musca domestica (Linnaeus 1758) (Diptera: Muscidae) quanto na traça das frutas, a mariposa

Cydia pomonella (Linnaeus 1758) (Lepidoptera: Tertricidae) (Russel et al. 1976). As lignanas

lactonas iateína e cubebina, e estruturalmente fenilpropanóides e fenólicos, exibiram

diferentes níveis de atividade antialimentar contra insetos considerados pestes de armazéns,

como os adultos de Sitophilus granarius (Linnaeus) (Coleoptera: Curculionidae) e Tribolium

confusum (Du Val 1868) (Coleoptera: Tenebrionidae), e as larvas de T. confusum e

Trogoderma granarium (Everts 1898) (Coleoptera: Dermestidae) (Harmatha e Nawrot 1984,

2002). A lignana epi-magnolina A isolada da Magnolia fargesii (Finet e Gagnep. 1915)

(Magnoliaceae) demonstrou atividade inibidora do crescimento em larvas de Drosophila

melanogaster (Bridges 1925) (Diptera: Drosophilidae) em concentrações maiores que

1mg/mL-1 na dieta (Miyazawa et al. 1994) e o acetato de lariciresinol teve apenas moderada

atividade antialimentar com acentuada toxidade contra Spodoptera littoralis (Boisd.)

(Lepidoptera: Noctuidae) e Lymantria dispar (Linnaeus 1758) (Lepidoptera: Lymantriidae)

(Brader et al. 1998). Podofilotoxina também foi tóxica para larvas e adultos de D.

melanogaster (Miyazawa et al. 1999). Xu et al. (2002) encontraram diferentes níveis de

toxicidade quando eles testaram uma variedade de derivados da podofilotoxina em larvas de

5º estágio de Pieris rapae (Linnaeus 1758) (Lepidoptera: Pieridae). As neolignanas também

vêm demonstrando toxidade em larvas de insetos, como eupomatenóide-6, eupomatenóide-5 e

conocarpano encontradas nas folhas de Piper decurrens C.DC., 1866 (Piperaceae) e testadas

contra o mosquito Aedes atropalpus (Coquillett) (Diptera: Culicidae) apresentando

significativa toxicidade larval (Chauret et al. 1996). Com atividade sobre o ciclo de

desenvolvimento dos insetos, a licarina A e machilusina induziram atividade inibidora do

crescimento contra larvas de Spodoptera litura (Fabricius 1775) (Lepidoptera: Noctuidae)

(González-Coloma et al. 1994). Suplementos do ácido nor-dihidroguaiarético (NDGA), um

8

potente agente redutor e antioxidante, quando incluído no meio axênico larval ou na dieta dos

mosquitos adultos de Aedes aegypti (Linnaeus 1762) (Diptera: Culicidae) aumentou o tempo

de vida dos insetos adultos (Richie et al. 1986) e a longevidade dos adultos de

D. melanogaster (Miquel e Johnson 1975). A neolignana burchelina isolada de Aniba

burchelli Kostern apresentou atividade antidiurética em ninfas de Rhodnius prolixus (Stal

1859) e de Triatoma infestans (Klug 1834) (Cabral et al. 2001, 2000a, 2000b). Estes

hemípteros infectados com Trypanosoma cruzi (Carlos Chagas 1909) e tratados oralmente

com burchelina e NDGA (neolignanas), tiveram a população de parasitos enormemente

reduzidos. As quantidades de formas infectantes (tripomastigotas metacíclicos) do parasito

estavam reduzidas, e nenhum deste protozoário foi encontrado na urina e fezes do hospedeiro

invertebrado (Cabral et al. 1998a, 1998b, 2001).

Estudos biodirecionados utilizando extração das sementes da planta Melia azedarach

(Linnaeus) (Meliaceae), conhecida como cinamomo, resultou no isolamento de um triterpeno

inédito, cinamol (Kelecom et al. 1996), e quatro lignanas isoladas pela primeira vez de M.

azedarach como: pinoresinol, bis-epi-pinoresinol, um hemicetal e um diácido (Cabral et al.

1995) que demonstraram efetiva atividade sobre R. prolixus, inseto hematófago (Hemiptera-

Reduviidae) e seu hospedeiro intermediário T. cruzi causador da Doença de Chagas (Cabral et

al. 1995, 1996, 1999; Garcia et al. 2000).

Diversas são as atividades biológicas dos lignóides aqui mencionadas (Tabela 1.2.1.),

tanto em insetos como em seus patógenos, mas as informações da literatura existentes até o

momento ainda não definem a especificidade destas lignanas e neolignanas quanto à atividade

exercida e o seu mecanismo de ação sobre os diferentes insetos testados.

Estudos com scrinning de lignóides em dípteros demostraram redução da viabilidade

larval e alteração no peso das moscas de C. megacephala (Cabral et al. 2007). A fim de

verificar a interferência de lignanas sobre o desenvolvimento pós-embrionário de dípteros

muscoides, propôs-se neste estudo avaliar a ação de grandisina sobre C. megacephala

utilizando como metodologia: bioensaios com o modelo experimental “moscas das latrinas”

(Diptera: Calliphoridae), análise dos tipos e subtipos de lignóides já descritos na literatura e,

modelagem molecular na comparação estrutural de grandisina vs. ecdisona a fim de buscar

uma possível correlação estrutura-bioatividade.

- 9 -

OH

OH

HO

HO

o

o

oo

OHOH

Tabela 1.2.1.: Tipos de esqueletos de lignanas bioativas em insetos.

Subtipo 1: 8.8’

Nome (n=2) Atividades Insetos Referências Estruturas

NDGA

Aumento da longevidade

Alteração no ciclo de

desenvolvimento

Antimuda

Aedes aegypti

Drosophyla melanogaster

Rhodnius prolixus

R. prolixus

Richie et al. 1986

Miquel e Johnson 1975

Cabral et al. 2000a,

Cabral et al. 2000a, Garcia

et al. 2000

Di-hidrocubebina

Inibição da alimentação Tribolium confusum,

Sitophiluis granarium,

Trogoderma granarium

Harmatha e Nawrot 1984,

2002

- 10 -

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o

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o

O

Subtipo 2: 8.8’, 9.O.9’


Hibalactona

Sinergista de piretróides Sitophilus oryzae Yamashita et al. 1961

Savinina

Sinergista de piretróides ______ Matsubara 1972 apud

Harmatha e Dinan 2003

Taiwanina



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- 11 -

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Matairesinol

Sinergista ______ Kerr 1951 apud MacRae e

Towers 1984

4,4’-di-hidroxi-3,3’-

dimetoxi-9,9’-epoxilignana

Sinergista de piretróides ______ Hanuman et al. 1986

para-benzolactona

Inibição da alimentação Spodoptera litura Wada e Munakata 1970

Hinokinina

Sinergista de piretróides

Inibição da alimentação

M. domestica

T. confusum,

S. granarium,

T. granarium

Haller et al. 1942


2002

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- 12 -

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Tracheloside


T. confusum,

S. granarium,

T. granarium


2002

Carthamoside


T. confusum,

S. granarium,

T. granarium


2002

Iateina


T. confusum,

S. granarium,

T. granarium


2002

Iateindiol


T. confusum,

S. granarium,

T. granarium


2002

- 13 -

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OMe

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Br

Br

Tribromoiateina


T. confusum,

S. granarium,

T. granarium


2002

Desoxi-cubebina


T. confusum,

S. granarium,

T. granarium


2002

Cubebina


Inibição da monooxigenase

microssomal intestinal

Inibição do crescimento

Coptotermis formosanus

Peridroma saucia

Ostrinia nubilalis

Peridroma saucia

Kreckova et al. 1988 apud


Nawrot et al. 1991

Bernard et al. 1989

Nawrot et al. 1991

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- 14 -

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Subtipo 3: 8.8’, 7.O.7’


Machilusina

Inibição do crescimento S. litura González-Coloma et al.

1994

Grandisina

Redução do peso

Redução da viabilidade

larval

Chrysomya megacephala Cabral et al. 2007b

Subtipo 4: 8.8’, 7.O.9’


Lariciresinol

Inibição moderada da

alimentação

Toxidade moderada

Spodoptera littoralis

Lymantria dispar Brader et al. 1998

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- 15 -

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Olivil

Estimulante da alimentação Dyscerus perforatus Kadowacki et al. 2003

Subtipo 5: 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’


Iangambina

Inibição do ciclo de

desenvolvimento

Inibição da oviposição


Alteração morfológica

Redução do peso

C. megacephala Cabral et al. 2007a,b

Epi-iangambina



O. nubilalis Bernard et al. 1989

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- 16 -

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Diaiangambina

Inibição da alimentação T. confusum


2002

Epi-aschantina


T. confusum

Harmatha e Nawrot

1984, 2002

Eudesmina

Atividade repelente

Tóxica


S. litura

Anticarsia gemmatalis

Matsui et al. 1975

Nascimento et al. 2004

OMe

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o

- 17 -

Epi-eudesmina

Atividade repelente S. litura Matsui et al. 1975

Sesamina




Tóxica



desenvolvimento

Spirlactia oblicua

Musca domestica

Bombyx mori, Oncopeltus

fasciatus

M. domestica

B. mori

A. gemmatalis

R. prolixus

Srivastava et al. 2001

Haller et al.1942

Bowers 1968

Casida 1970

Kamikado et al. 1975d

Nascimento et al. 2004

Cabral et al. 2000a

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- 18 -

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Sesamolina

Atividade de HJ




O. fasciatus

M. domestica

M. domestica

O. nubilalis

Bowers 1968

Casida 1970

Gersdorff et al. 1954

Bernard et al. 1989

Asarinina


M. domestica Haller et al. 1942

Pinoresinol


Antimuda

Tóxica

Alteração do ciclo de

desenvolvimento


M. domestica

R. prolixus, O. fasciatus

O. fasciatus

R. prolixus

Fórmica excetoides

Haller et al. 1942

Cabral et al 1999, 2000a,

Garcia et al. 2000

Cabral et al 1999

Cabral et al 2000a

Schroeder et al. 2006

o

o

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o

o

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- 19 -

7’-epi-sesartemina

Tóxica Ae. aegypti Solis et al. 2005

Kobusina


B. mori Kamikado et al. 1975d

Epi-magnolina A

Inibição do crescimento D. melanogaster Miyazawa et al. 1994

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- 20 -

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Paulownina



Acetato de leptostachiol

Inseticida Culex pipiens palens

Ae. aegypti

Ocheratatos togoi

Park et al. 2005

Haedoxana

Inseticida M. domestica Yamauchi e Taniguchi

1991, 1992a,b

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- 21 -

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Subtipo 6: 8.8’, 6.7’, 9.O.9’


Desoxi-picropodofilotoxina


Inseticida


Pieris rapae

M. domestica

Gao et al. 2004

Russel et al. 1976

Podofilotoxina


Inseticida

Antimuda

Antidiurética


Tóxica

T. confusum,

S. granarium,

T. granarium

P. saucia

D. melanogaster

P. rapae

R. prolixus

P. saucia

D. melanogaster

Ae. aegypti

R. prolixus


2002

Nawrot et al. 1991

Miyazawa et al. 1999

Xu et al. 2002


Garcia et al. 2000

Nawrot et al. 1991

Miyazawa et al. 1999

Berenbaum 1989 apud

Nawrot et al. 1991


- 22 -

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Alteração no envelope

nuclear de espermatídio

Culex nigripes

Garcia et al. 2000

Siau et al. 1993

Desoxi-podofilotoxina


Inseticida


P. rapae

Culex pipiens molestus

P. rapae

M. domestica

Gao et al. 2004

Kozawa et al. 1982

Gao et al. 2004

Russel et al. 1976

β-peltatina A


Tóxico

M. domestica

Cydia pomonella

M. domestica

MacRae e Towers 1984

Russel et al. 1976

Tsugacetal

Toxidade moderada Ae. aegypti He et al. 1997a

- 23 -

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Subtipo 7: 8.8’, 2.7’, 9.O.9’


Helioxantina

Toxidade moderada Ae. aegypti He et al. 1997b

Subtipo 8: 8.8’, 2.2’


Gomisina B

Inseticida D. melanogaster Miyazawa et al 1998

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- 24 -

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Gomisina N

Inseticida D. melanogaster Miyazawa et al 1998

Subtipo 9: 5.5’


Magnolol



Tóxica

Callosamia angulifera

C. promethea

Callosamia angulifera

C. promethea

Papilio troilus

P. palamedes

Ae. aegypti

Johnson et al. 1996,1999

Johnson et al. 1996,1999

Nitao et al. 1992

Nitao et al. 1990, 1992

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OH

- 25 -

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Subtipo 10: 8.5’, 7.O.4’


Conocarpano

Toxicidade larval Aedes atropalpus Chauret et al. 1996

Licarina A



desenvolvimento

Antidiurético moderado

Tóxica

S. litura

R. prolixus

R. prolixus

R. prolixus

González-Coloma et al.

1994

Cabral et al. 2000a

Eupomatenóide-5

Toxicidade larval Ae. atropalpus Chauret et al. 1996

Eupomatenóide-6

Toxicidade larval Ae. atropalpus Chauret et al. 1996

o

OH

- 26 -

Decurrenal

Inseticida Ae. atropalpus Chauret et al. 1996

Subtipo 11: 1.5’, 2.2’


Asatona


Luehdorfia puziloi Honda et al. 1995 Chen et al. 1972

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Subtipo 12: 8.3’, 7.O.4’


Piperenona


S. litura Matsui et al 1975

Subtipo 13: 8.1’, 7.O.6’


Burchelina


(leve)

Antidiurética


desenvolvimento


Redução do peso

Triatoma infestans,

R. prolixus

R. prolixus, T. infestans

R. prolixus

C. megacephala

Cabral et al. 2001, 2000a

Garcia et al. 2000

Cabral et al. 2000b, 2001

Cabral et al. 2000a

Cabral et al. 2007b

o

o

o

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O

- 28 -

1.2.1. Estrutura/Atividade

Com a finalidade de determinar tendências gerais da relação estrutura química

/atividade biológica de lignóides foram realizadas coleta de dados através de consulta

bibliográfica etnofarmacológica de algumas revisões (Ayres e Loike 1990; MacRae e Towers

1984; Gottlieb e Yoshida 1984, 1990; Harmatha e Dinan 2003; Umezawa 2003; Garcia e

Azambuja 2004) e complementadas através dos sites de busca: Bireme (Lilacs, Medline,

Biblioteca Cochrane, Scielo), Google acadêmico, Science direct, Scopus, Isiknowledge e

EBSCo Host Electronic Journals Service de pesquisa para atualização até o período de

fevereiro de 2006. Estes dados foram quantificados, interpretados e analisados. Os lignóides

bioativos (n=53) foram classificados segundo o critério de tipo e subtipo de esqueleto químico

da molécula. As substâncias caracterizadas foram reunidas em grupos (n=6) principais de

bioatividade, de acordo com a descrição da tabela abaixo.

Tabela 1.2.1.1.: Caracterização em grupos das diferentes atividades biológicas de lignóides

encontradas em insetos.

Grupos principais das atividades biológicas Descrição das atividades biológicas de

lignóides encontradas em insetos

Grupo 1: Alimentação e repelência

Antialimentar, repelente e estimulante da

alimentação.

Grupo 2: Efeitos tóxicos Larvicida e/ou ovicida; efeito inseticida e

sinergista de inseticida.

Grupo 3: Inibição do crescimento Antimuda, atividade hormonal (Hormônio

Juvenil e Ecdisona), anti-reprodutiva.

Grupo 4: Alteração no desenvolvimento

Alteração no peso, tamanho, ciclo de

desenvolvimento, longevidade e deformação

morfológica.

Grupo 5: Inibição da diurese Inibição da excreção (antidiurética).

Grupo 6: Inibição da monooxigenase


Inibição da monooxigenase microssomal

intestinal.

Alguns lignóides apresentam mais de uma atividade biológica e, portanto estão presentes em

mais de um grupo. Os tipos de esqueleto foram determinados de acordo com a numeração

- 29 -

biossintética de Gottlieb e Yoshida (1989). Os lignóides avaliados no presente trabalho se

restringiram às amostras descritas e disponíveis na literatura.

1.3. Grandisina

Grandisina (Figura 1.3.1.) pertence à classe das lignanas, da via biossintética do

chiquimato, que tem como característica o esqueleto carbônico com duas unidades n-

propilbenzênicas (C6-C3) ligadas pelo carbono β em suas cadeias laterais C3 (Gottlieb 1977;

1991).

Esta lignana tetraidrofurânica foi descrita como sendo o principal metabólito

secundário das folhas de Piper solmsianum C.DC. (Figura 1.3.2. e 1.3.3.), uma planta

endêmica da Mata Atlântica (Martins et al. 2003) e isolada pela primeira vez de Litsea

grandis (Lauraceae) (Holloway e Sheinmann 1974) e posteriormente de Virola surinamensis

(Miristicaceae), Cryptocarya crassinervia (Lauraceae) (Saad e Soepadamo 1991), Piper

polysyporum (Piperaceae) (Ma et al. 1991), Magnolia denudata (Magnoliaceae) (Kuroyanagi

et al. 2000), Aglaia leptantha (Meliaceae) (Greger et al. 2000), Rhaphidophora decursiva

(Araceae) (Zhang et al. 2001) e Virola pavonis (Myristicaceae) (Ferri e Barata 2001).

A espécie pertence à família Piperaceae, na qual o gênero Piper é representante de mais de

700 espécies. Plantas dessa família são amplamente distribuídas e comumente usadas nas

regiões tropicais e subtropicais como medicamentos, pimenta, temperos e agentes

controladores de pestes. Suas espécies são importantes componentes da vegetação secundária.

De acordo com a sua importância econômica, medicinal e ecológica, um grande número de

espécies tem sido fitoquimicamente investigadas, devido à fonte potencial de compostos

químicos bioativos contra pestes de insetos (Schultes e Raffauf 1990; Su e Horvat 1981).

Muitas lignanas e neolignanas foram isoladas de diferentes espécies de Piper (Sengupta e Ray

1987; Parmar et al. 1997, 1998; Jensen et al. 1993; Kato e Furlan 2007). Os dados

disponíveis sobre a composição química de piperáceas demonstram a potencialidade de seus

metabólitos quanto à bioatividade (Matsui e Munakata 1975; Da Silva et al. 2002; Dyer et al.

2003; Lago et al. 2004).

Estudos realizados nas inflorescências e raízes de Piper solmsianum C.DC.

demonstraram a presença de outros derivados análogos da grandisina que estão sendo

avaliados frente às formas tripomastigotas de Trypanossoma cruzi (Martins et al. 2003) já que

demonstrou ser o produto natural in vitro mais potente contra a forma tripomastigota do T.

cruzi, causando 100% de lise no parasito sem danos aos eritrócitos (Lopes et al. 1998).

- 30 -

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OMe

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Figura 1.3.1.: Grandisina, substância isolada de Piper solmsianum.

Fotos: Massuo J. Kato (IQ/USP).

Figura 1.3.2.: Piper solmsianum (folha) Figura 1.3.3.: Piper solmsianum (fruto)

- 31 -

1.4. Inseto modelo: Chrysomya megacephala (Fabricius 1794) (Diptera: Calliphoridae).

O gênero Chrysomya (Robineau-Desvoidy) pertence à família Calliphoridae,

subfamília Chrysominae.

Chrysomya megacephala (Figura 1.4.1.) foi alcunhada de vários nomes relacionados

aos nichos tróficos ocupados por suas larvas e adultos ou devido às cores metálicas de seu

exoesqueleto. Foi chamada de “Greenbottle fly” ou “Bluebottle”, devido à semelhança do

reflexo emitido pelo vidro das garrafas (Wijesundara 1957a, b); de “moscas das latrinas” pela

sua freqüência em locais com dejetos humanos sem proteção adequada; de moscas varejeiras

e “Indian Bazaar Bluebottle” (Prins 1979), observada sua freqüência em mercados de varejo e

feiras livres; de “Peste do peixe seco” no sudeste asiático, devido à capacidade de suas larvas

se alimentarem em carne de peixe salgado (Esser 1990), uma das principais fontes de proteína

animal das populações humanas locais; e de “Debulliaes” e “Laesidebull”, nomes palauenses

dados a esta espécie que se traduzem como “mosca do cemitério” (Olsen e Sidebotton 1990).

Figura 1.4.1.: Chrysomya megacephala.

É considerada uma espécie de médio a grande porte (4 a 16 mm) e com muitas cerdas

no corpo, fatores que contribuem para que seja um bom vetor mecânico de ovos e cistos de

parasitos (Mihályi 1967). Este muscóide apresenta como características morfológicas uma

cabeça bem desenvolvida de cor vermelha, tendo os machos diferenças nas dimensões dos

omatídeos (unidade visual do olho composto); tórax e abdomen compacto de coloração azul

ou verde metálico, algumas vezes acobreado ou de cor púrpura; asas hialinas com uma série

de pelos delicados no remígio dorsalmente; espiráculos torácicos e pernas enegrecidas e

calípteras torácicas cobertas de pêlos dorsalmente. A larva de 3° instar apresenta formato de

cunha com fortes ganchos bucais na extremidade anterior, estigmas respiratórios posteriores

- 32 -

convergentes para o botão espiracular; anel peritremático rompido na face interna (Serra

Freire e Mello 2006).

1.4.1. Distribuição Geográfica

A espécie deste gênero é originária do Velho Mundo, sendo amplamente distribuída

nas regiões Oriental, Etiópica e Australiana. Há três espécies do gênero Chrysomya nas

Américas: C. megacephala (Fabricius 1794), C. putoria (Wiedemann 1818) e C. albiceps

(Wiedemann 1819) que foram provavelmente introduzidas no litoral sul do Brasil por volta de

1975-1976 (Guimarães et al. 1978, 1979), por portugueses refugiados da África, e oriundos de

Angola e Moçambique. A primeira constatação no Novo Mundo foi de C. putoria em

Curitiba, Paraná que posteriormente foi reportada nas cidades de São Paulo e Campinas

acompanhada de C. albiceps e C. megacephala, sendo que esta última também foi encontrada

na cidade de Santos (Imbiriba 1977). A distribuição original de C. megacephala era restrita as

áreas quentes das regiões Oriental e Australasiana, assim como o leste Paleártico

(Baumgartner 1984). Já se propagou para a Argentina, Paraguai, Venezuela e sul do México,

onde foi coletada em 1986 (Baumgartner 1988). Ela também é encontrada em muitas ilhas

afrotropicais, do Caribe e do Pacífico, incluindo o Hawaii (Bohart e Gressitt 1951) e ilhas

Canárias (Baez e Kurahashi 1981). Expandiu seu alcance para África, se estabelecendo no sul

da áfrica, Madagascar, Senegal, Ghana e provavelmente Angola (Prins 1982; Prado e

Guimarães 1982; Peris 1987). Posteriormente C. megacephala foi descoberta na Califórnia

(Poorbaugh 1989; Bennett 1989), Los Angeles, Ilhas Palau e Texas confirmando sua

propagação para o norte da América (Olsen e Sidebottom 1990; Wells 1991). Estas espécies

possuem grande adaptação a novos ambientes, dispersão rápida e ainda continuam a expandir-

se (Prado e Guimarães 1982). A expansão da distribuição geográfica deste grupo tem

preocupado especialistas em saúde pública e entomólogos (Gagné 1981; Laurence 1981). No

Brasil, a Chrysomya megacephala encontra-se amplamente distribuída por todo país e vem

competindo e deslocando espécies autóctones de seus nichos originais (Guimarães et al. 1979;

Prado e Guimarães 1982).

O rápido processo de colonização dos califorídeos ocorrido tanto no Novo Mundo

quanto no Velho Mundo foi devido a uma colonização antrópica, fato este calcado na natureza

intrinsecamente ligada às condições sanitárias geradas pela população humana (d`Almeida e

Lopes 1983). Segundo dados fornecidos pelos cientistas do Painel Intergovernacional sobre

mudanças do clima (IPCC), que assessora a ONU sobre as mudanças climáticas, a

temperatura do planeta deve se elevar (Tautz 2002), favorecendo a ocupação desses dípteros

- 33 -

em longitudes maiores e acelerando seu ciclo de vida e assim incrementando sua taxa de

produção biológica. Um dos meios de controle para estas populações de muscóides seria a

redução da oferta de alimento. Porém, resultados estatísticos realizados pelo Fundo Mundial

para a natureza, mostram que, em 2025, a população humana chegará a oito bilhões de

habitantes, aumentando muito os bolsões de miséria, e conseqüentemente a oferta de alimento

para esses dípteros (Barbosa et al. 2004).

1.4.2. Habitats

Califorídeos são ecologicamente diversos e ocupam vários habitats, assim como se

desenvolvem em vários substratos, sendo C. megacephala uma espécie saprófaga, é

comumente encontrada sobre fezes, carcaças de animais, vísceras, e restos de comida

(Greenberg 1971, 1973; Guimarães et al. 1979; Zumpt 1965). De acordo com Prado e

Guimarães (1982), C. megacephala é uma espécie de mosca varejeira que prefere o ambiente

urbano e apesar de ser uma espécie exótica, atingiu rapidamente todo território nacional. Foi

encontrada em 100% das bancas de pescado de feiras livres da cidade de São Paulo

(Furlanetto et al. 1984), em aterro sanitário de Goiânia (GO) (Ferreira e Lacerda 1993), em

Manaus (AM) (Paraluppi e Castellon 1993) e Corumbá (MS) (Campos e Barros 1995).

Segundo dÀlmeida e Almeida (1998), esta espécie mostrou-se bastante freqüente no Rio de

Janeiro, criando-se com mais facilidade na área urbana do que rural ou florestal. Sua

ocorrência na cidade do Rio de Janeiro (RJ) foi citada em praia (dÀlmeida 1993), em aterro

sanitário na região metropolitana da cidade (dÀlmeida et al. 1991) e no Jardim Zoológico

(Oliveira et al. 1999). A sua elevada prevalência, tanto em áreas urbanas como rural, em

relação às outras espécies, aumenta os riscos para Saúde Pública (Valgode et al. 1998).

Assim como outros insetos que invadiram as cidades, C. megacephala tem

demonstrado um alto grau de sinantropia e tendências endofílicas, associado a sua alta

densidade populacional natural. Entre os fatores que interferem na sua distribuição a higiene

é o mais importante deles, sendo que a proximidade das construções em locais com grandes

aglomerações humanas, torna-se um agravante. Sua manutenção em áreas urbanas é

favorecida pelo grande volume de material orgânico produzido e à proximidade dos aterros

sanitários mantidos em precárias condições. No Brasil, este aspecto é evidenciado em grandes

cidades, onde as diferenças sociais são muitas, há o descuido com saneamento básico, o

destino do lixo é negligenciado e o número de favelas é grande propiciando o

desenvolvimento destes insetos (Greenberg 1971; Linhares 1981; dÀlmeida 1992; Carvalho

et al 2003)

- 34 -

1.4.3. Desenvolvimento

Os dípteros muscóides são considerados holometábolos quanto ao tipo de

desenvolvimento, em que o seu ciclo de vida vai desde ovo, passando por três instares larvais,

em seguida pelo estágio de pupa até chegar no indivíduo adulto (Chapman 1998).

O desenvolvimento de insetos é afetado por muitos fatores, particularmente pelas

condições ambientais (Gomes et al. 2006) Os fatores bióticos e abióticos são responsáveis

pela flutuação e composição das populações de muscóides sinantrópicos (Nuorteva 1963;

Dajoz 1983).

Em populações naturais de moscas varejeiras, os adultos se dispersam na busca por

substratos para postura de ovos e alimentação (Hanski 1987). Esser (1990) constatou que a

ovipostura de C. megacephala é iniciada por um estímulo químico, estímulo este vindo

através de um feromônio liberado pelas fêmeas durante a ovipostura, que estaria associado

com a presença de ovos recentemente depositados. Assim sendo as fêmeas preferem depositar

ovos em substratos já contendo outros ovos, caracterizando uma ovipostura agregada.

Entretanto é possível que os odores liberados pela dieta à base de ingredientes naturais

pútridos, como amônia e outros gases, estimulem a alimentação e favoreçam o

comportamento gregário das larvas (Kennedy e Both 1951; Milward-de-Azevedo et al. 1995).

Segundo Godbrod e Goff (1990) a agregação de larvas de C. megacephala com a conseqüente

produção de secreção de enzimas salivares e proteolíticas, aumentaria a eficiência do processo

de alimentação e, por conseguinte, aceleraria a taxa de desenvolvimento larval. Por outro

lado, aglomerações larvais muito grandes podem prejudicar o processo de alimentação. A

quantidade de alimento consumido pelas larvas irá determinar o tamanho dos adultos o qual

está relacionado à fecundidade das fêmeas, onde, as fêmeas maiores colocam mais ovos que

as menores (Kamal 1958; Goodbrod e Goff 1990).

A história de vida das moscas varejeiras é caracterizada pelas gerações que ocupam

recursos discretos e incompletos, e a fecundidade, o tamanho e a sobrevivência dos adultos

são modulados pela densidade de condições que afetam o estágio larval (Godoy et al. 1996).

O principal período de limitação de recursos alimentares em moscas-varejeiras ocorre no

estágio larval, em que as larvas competem por alimento e cada uma procura ingerir o máximo

de alimento no menor intervalo de tempo possível, antes da completa exaustão dos recursos

(Goodbrod e Goff 1990). Fatores nutricionais têm a mais importante posição no ambiente

controlador da atividade neuroendócrina. Durante o estágio larval nunca ocorre o início da

secreção de cutícula e pupação antes que tenham se alimentado por determinado período, e

obtido a quantidade mínima necessária de água e alimento nutritivo requerido (Sláma 1978).

- 35 -

Uma das maiores características que definem as moscas varejeiras, é o requerimento de

substratos rico em proteínas, no qual a larva pode completar seu desenvolvimento (Stevens

2003).

O fator mais importante que permite o desenvolvimento do inseto até a emergência do

adulto é representado pelo período obrigatório de alimentação larval seguindo a ecdise para o

terceiro instar (Zdárek e Sláma 1972; Saunders e Bee 1995). A existência deste período, bem

como as relações entre o tamanho mínimo do adulto e a eficiência larval na utilização do

alimento são aspectos importantes a serem considerados (Von Zuben 1998).

1.4.4. Sistema endócrino envolvido no processo da muda

O processo da muda e a determinação do caráter morfológico são induzidos pelo

hormônio protorácicotrópico (PTTH), neuropeptídeo sintetizado pelas células neurosecretoras

do cérebro (CNS), pelo hormônio juvenil (HJ) um sesquiterpenóide sintetizado pelo corpus

allatum (CA), e pelo hormônio ecdisona (EC) um esteróide produzido pelas glândulas

protorácicas (GP) (Gilbert et al. 1980; Riddiford 1994). O PTTH é liberado em resposta a

estímulos condicionados aos fatores nutricionais e transportado pelo axônio terminal do órgão

neuro-hemal, a corpora cardíaca (CC), que lança este hormônio na hemolinfa, onde por sua

vez vai ativar as GP a sintetizarem e secretarem a ecdisona. No tecido periférico a EC é

convertida em ecdisterona (20-hidróxi-ecdisona), que é a forma ativa do hormônio (Svboda et

al. 1975). O CA é regulado por neurohormônios do cérebro que estimulam ou inibem a

produção do HJ, são neuropeptídeos denominados alatotropina e alatostatina respectivamente

(Figura 1.4.4.1.).

O termo ecdisona é usado para se referir aos ecdisteróides naturais que causam a muda

e a metamorfose, primariamente α-ecdisona e seu metabólito 20-hidroxiecdisona (Riddiford et

al. 2001). O hormônio ecdisona induz e coordena a ecdise, mas o caráter da muda é

determinado pelo HJ. Na presença do HJ, não há mudança na forma, e na ausência do HJ, a

ecdisona causa a troca na expressão de genes necessária para a metamorfose, primeiro para a

pupa, e então para o adulto. O Hormônio juvenil, entretanto previne a ação de troca da

ecdisona mantendo o “estatus quo” durante a muda (Williams 1961). Contudo, na ausência

total deste, os insetos seriam encaminhados para uma metamorfose precoce e letal, ou seriam

esterilizados, ou ambos (Bowers 1984). Dipteros expressam além do HJ III, uma outra

variante, o HJ III bis-epóxido (Richard et al. 1989b).

- 36 -

Em ciclorrafos, em especial moscas varejeiras, a alimentação estimula a liberação de

hormônios reguladores do ciclo de desenvolvimento nos instares larvais e do ciclo

reprodutivo em adultos (Zdárek e Sláma 1972).

Normalmente a larva que alcançou o tamanho crítico e está comprometida com a

metamorfose, continua a se alimentar. O principal período que envolve o tamanho crítico é

referido como a fase de alimentação obrigatória, absolutamente essencial para o investimento

na metamorfose, enquanto que o período subseqüente de alimentação, denominado fase

facultativa de alimentação, o consumo de alimento continua, porém não é mais essencial para

o comprometimento da larva com o processo de metamorfose. No final deste período ocorre

uma mudança no comportamento da larva, parando de se alimentar e abandonando o

alimento, e mesmo em presença de comida adicional, ela a rejeita (Denlinger e Zdarek 1994)

(Figura 1.4.4.2.).

A metamorfose ocorre com o início da fase de pupariação (pré-pupa), que compreende

3 etapas: pré-pupa propriamente dita, pupa criptocefálica, pupa fanerocefálica. Na etapa de

pré-pupa a mosca ainda está desenvolvendo seu último estágio larval (L3), é o momento em

que se torna imóvel, contraída e possui uma cutícula fortemente esclerotizada e escurecida

(Denlinger e Zdarek 1994). O próximo passo compreende a apólise larval-pupal, fase em que

ocorre a separação da nova cutícula pupal da antiga cutícula larval marcando o estágio pupal

criptocefálico, o corpo continua em forma larval, os apêndices estão indiferenciados e a

cabeça invaginada (cabeça escondida). Esta etapa é seguida pelo estágio pupal fanerocefálico

(cabeça visível) ocorrendo rápida eversão da cabeça, expansão dos apêndices torácicos e

formação da linha traqueal larval (Denlinger e Zdarek 1994) (Figura 1.4.4.2.). Para que os

ecdisteróides atuem perfeitamente é necessário um nível baixo de HJ. Os ecdisteróides que se

mantinham em níveis basais, com o abandono das larvas (L3) e início da pupariação

aumentam seus níveis observando-se o primeiro pico durante a fase de formação do

puparium; um segundo pico na fase de pré-pupa e um terceiro pico na fase inicial de pupa. Na

fase de abandono das larvas (L3) o HJ ativa a produção das esterases, enzimas que degradam

o HJ, passando pelo cérebro durante o estágio pré-pupal (Rauschenbach 1991). Warren et al

(2006), Riddiford (1993), Truman e Riddiford (1999) demonstram picos de 20-

hidroxiecdisona, um em cada muda larval e três durante o último estágio larval (pupariação,

fase fanerocefálica, desenvolvimento do adulto). Portanto o sucesso da muda depende da

presença e ausência dos hormônios envolvidos em momentos críticos.

Em moscas, as cutículas antigas do terceiro instar e da pupa não são trocadas antes da

emergência do adulto, mas a maioria dos atributos comportamentais da ecdise podem ser

observados na hora da pupação (Zdarek 1987).

- 37 -

A morfogênese pupal acontece durante a fase de pharate pupal. O desenvolvimento das

estruturas pupais ocorre a partir dos discos imaginais em três passos: primeiro os discos

evaginam, evertem e se desdobram para produzir os formatos gerais das estruturas do adulto

nos quais irão se diferenciar; no segundo passo os discos evaginados inflam com a hemolinfa,

etapa dependente de contrações peristálticas da musculatura abdominal que gera uma pressão

na hemocele; e finalmente no último passo as estruturas infladas se expandem para dar o

formato pupal definitivo, quando os componentes internos específicos vão se diferenciar em

órgãos adultos. Os movimentos do abdômen parecem ser indispensáveis para “extricação”

(desemaranhar, desdobrar, libertar) da linha traqueal larval dos espiráculos e para o rearranjo

interno dos órgãos dentro na nova cutícula expandida (Zdarek 1987; Denlinger e Zdarek

1994).

- 38 -

Figura 1.4.4.1.: Esquema representando o controle endócrino do processo de muda em insetos

(A), adaptado de Rembold (1980), e o anel glandular em diptera (B) adaptado de Chapman

(1998). CNS = células neurosecretoras do cérebro; CA = corpora alata; GP = glândula

protorácica; CC = corpora cardíaca.

aorta

- 39 -

Ecdise Cessação Apólise Ecdise Apólise Eclosão do da larval-pupal pupal pupal-adulto do 3° instar alimentação adulto Cometimento pupariação

Figura 1.4.4.2.: Esquema representando as fases do ciclo de desenvolvimento de moscas,

adaptado de Denlinger e Zdarek (1994).

Fase de alimentação

obrigatória facultativa

Fase de abandono

Pré-pupa

Pupa criptocefálica

Pupa fanerocefálica

Pharate de

adulto Adulto

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1.4.5. Importância médico-sanitária e ecológica

C. megacephala possui uma importante função nos processos de polinização

(Anderson et al. 1982; Hu et al. 1995; Castañeda Vildózola et al. 1999; Raju e Ezradanam

2002; Souza-Silva et al. 2001), decomposição (Greenberg 1971, 1973) e, vem atuando no

campo da entomologia forense, indicando, por exemplo, o intervalo de tempo entre a morte e

a descoberta do cadáver, referido como intervalo pós-mortem (IPM) e outras circunstâncias de

interesse para as investigações sobre o crime (Sukontason et al. 2003), como a maneira da

morte, investigações sobre drogas relacionadas com a morte e o movimento do corpo de uma

localidade a outra (Lord 1990). Entretanto, a aplicação do método entomológico requer

conhecimento extensivo de fatores mecânicos e ambientais que podem interferir com o

processo de colonização, tempo de desenvolvimento e decomposição dos corpos pelos insetos

(Oliveira-Costa e Mello-Patiu 2004).

Moscas adultas podem carrear patógenos humanos via liberação mecânica a partir de

seu exoesqueleto, deposição fecal e regurgitação (vômito) a partir do tubo digestivo,

aumentando as chances de contaminação dos alimentos (Greenberg 1973). Esta espécie tem,

portanto grande importância sócio-econômica e médico-sanitária, já que pode transmitir

variados agentes etiológicos, como: enterovírus (Poliovirus, Coxsackie vírus), bactérias

entéricas (Salmonella sp., Shiguella sp. e outras), esporos de fungos, cistos de protozoários

(Toxoplasma gondii, Entamoeba hystolitica) e ovos e larvas de helmintos (Ascaris sp.,

Toxocaris sp., Toxocara sp., Trichuris sp., Capillaria sp., Oxiurídeos, Tricostrongilídeos,

Acantocephala, Taeniidae) (Furlanetto et al. 1984; Greenberg 1971, 1988; Kuhlhorn 1983;

Queiroz et al. 1999; Sulaiman et al. 1988, 1989; Lawson e Gemmell 1990; Oliveira et al.

2002), além de causar miíases secundárias facultativas em humanos e animais (Guimarães et

al. 1983; Guimarães e Papavero 1999; Hall e Wall 1995; Zumpt 1965), tornando-se de grande

importância em saúde pública.

Do ponto de vista epidemiológico, C. megacephala causa preocupação, dada sua

capacidade de dispersão, densidade populacional, diversificação, hábito alimentar e,

principalmente, pelo fato de transportar patógenos (Greenberg 1971).

- 41 -

1.4.6. Controle

Inseticidas químicos possuem um papel fundamental no manejo integrado de pragas

devido aos seus efeitos no controle de populações de moscas adultas (Sukontason et al. 2005).

Um número de inseticidas tem sido usado no controle de moscas, principalmente aqueles do

grupo químico dos piretróides e organosfosforados (Whitehead 1998). O uso contínuo ou

periódico destes inseticidas em áreas de agricultura pode resultar no desenvolvimento de

resistência não só para a praga alvo como também para os outros animais. Portanto, o

monitoramento da susceptibilidade de moscas adultas a inseticidas é necessário para o uso

efetivo dos mesmos (Sukontason et al. 2005). Uma das alternativas para o controle destes

insetos é o uso de "Reguladores do crescimento" (Cyromazine, Diflubenzuron,

Diacilhidrazinas) os quais afetam as moscas sem nenhum dano tóxico para seus inimigos

naturais. Devido a sua segurança e extrema facilidade em seu uso, estes produtos foram

desenvolvidos para agir contra larvas de moscas causando morte larval ou deformação pupal,

apesar de populações de moscas resistentes já terem sido encontradas (Silva et al. 2000; Pinto

e Prado 2001).

Apesar do uso de inseticidas químicos ter sido, sobretudo reportado para o controle de

moscas, outros métodos de controle que resultam na diminuição residual para os humanos,

animais e ambiente devem ser investigados (Sukontason et al. 2004). Por exemplo, o controle

biológico de moscas, com o uso de microhimenópteros parasitóides (Pteromalidae), vem ao

encontro da busca por alternativas eficientes e ecológicas, por ser um método seguro, de fácil

manuseio e baixo custo. Sua utilização e comercialização já são uma realidade no ambiente

rural de muitos países e, no Brasil, muitos destes inimigos naturais já foram relatados,

parasitando moscas. Entretanto, não se conhece nenhuma pesquisa realizada em ambiente

urbano a fim de verificar a interferência das modificações provocadas pela urbanização e

destruição de áreas verdes na diversidade de inimigos naturais (Carvalho et al. 2003, 2004,

2005; Milward-de Azevedo et al. 2004; Moretti e Ribeiro 2006). A eficiência do emprego de

pteromalídeos é periodicamente confirmada, entretanto a criação em larga escala de

microhimenópteros exige o aperfeiçoamento de técnicas que viabilizem a sua produção

contínua (Morgan et al. 1976; Morgan 1980; Geden et al. 1992; Gibson et al. 2000).

Interesses foram demonstrados para o uso de Bacillus thuringiensis Berlinier no

controle de moscas das latrinas (Carlberg et al 1991), sendo as β-exotoxinas os agentes ativos.

Devido à ação não específica destas toxinas (Levinson et al. 1990), seu uso geralmente não é

permitido.

- 42 -

Bioinseticidas originados de compostos naturais de plantas (Sukontason et al. 2004)

podem servir como alternativas adequadas para os sintéticos do futuro, já que são

relativamente seguros, degradáveis e prontamente avaliáveis em muitas partes do mundo.

Recentemente tem sido demonstrado interesse por plantas da família Piperaceae porque

contém princípios inseticidas (Scott et al. 2002, 2003, 2004, 2005; Dyer et al. 2003;

Mackinnon et al. 1997). Produtos naturais extraídos de plantas vêm sendo testados sobre o

desenvolvimento de dípteros muscóides, como: o nor-diterpeno lactona, nagilactona C que

mostrou atividade inseticida sobre M. domestica e L. cuprina em níveis subletais (Russel et al.

1972b; Gerard et al. 1997); toxinas com atividade pronunciada contra larvas de M. domestica

existem em espécies de Pococarpus (Podocarpaceae) (Russel et al. 1972b), Libocedrus

bidwillii (Cupressaceae) (Russel et al. 1976), e em L. laxifolius, três espécies de Phyllocladus

(Podocarpaceae) e Libocedrus plumosa (Cupressaceae) (Singh et al. 1978); fitoecdisonas (20-

hidroecdisona, 5,20-diidroxi-ecdisona e dacristerona) promoveram mortalidade larval em M

domestica quando adicionados a uma dieta de aminoácidos (Singh et al. 1982). Ponasterona A

isolada de Phyllocladus trichomanoides e dyshomoerythrina isolada de Lagarostrobos

colensoi (Podocarpaceae), foram tóxicas para M. domestica (Singh et al. 1978; Riddiford

1970) e L. cuprina (Bloor et al. 1996). Withanolideos extraídos da Salpichroa origanifolia

(Solanaceae) denominados salpichrolideos, demonstraram atividade tóxica contra larvas da M.

domestica, inibindo seu desenvolvimento (Mareggiani et al. 2000). O óleo essencial das

folhas de Piper betle (Piperaceae) mostrou um potente efeito larvicida contra C. megacephala

(Kumarasinghe et al. 2002). O monoterpeno eucaliptol demonstrou atividade inseticida contra

machos e fêmeas de M. domestica e C. megacephala, reduzindo a sobrevida de moscas

tratadas. Mostrando também um efeito larvicida moderado para M. domestica e baixo para

C. megacephala, reduzindo a viabilidade de emergência dos adultos de M. domestica

(Sukontason et al. 2004).

Baseado na origem e atividades de tais compostos é possível que eles sejam mais

espécie - específicos (seletivos), menos susceptíveis ao desenvolvimento de resistência

quando comparado aos praguicidas sintéticos usados normalmente e toxicologicamente mais

aceitáveis. Portanto, o desenvolvimento de inseticidas naturais ou biológicos ajudará a

diminuir os efeitos negativos associados aos inseticidas químicos (Gerard et al. 1997; Lamiri

et al. 2001; Sukontason et al. 2004).

- 43 -

2. OBJETIVOS

2.1. Comparar os tipos e subtipos de lignóides descritos na literatura e testados, até o

momento, em insetos buscando a possibilidade de correlacionar diferentes apectos estruturais.

2.2. Avaliar o potencial da lignana tetraidrofurânica grandisina quanto à toxidade e sobre o

crescimento e desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya megacephala.

2.3. Avaliar o muscóide Chrysomya megacephala, modelo experimental no estudo sobre

bioatividade de produtos naturais extraídos de plantas em dípteros.

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3. METODOLOGIA

3.1. Lignana: Grandisina

A lignana grandisina (Figura 3.1.1.) foi obtida por extração fitoquímica no Laboratório

de Química de Produtos Naturais do Instituto de Química da Universidade de São Paulo

(USP)/SP e cedida pelo Prof. Dr. Massuo Jorge Kato.

As folhas de Piper solmsianum foram coletadas no Núcleo de Picinguaba (Municipio

de Ubatuba), secos em estufa a uma temperatura de 50oC±2oC e moídos num moinho de facas

Tigre até a granulometria de 4 mesh. O pó obtido (70g) foi macerado a 25 ± 5oC com cloreto

de metileno por 24 horas. A destilação do solvente da solução, a pressão reduzida a uma

temperatura de 30oC ± 3oC; resultou em um resíduo de 2,84 g ± 0,2g.

Uma quantidade definida (60mg) do extrato bruto foi diluída em cloreto de metileno e

aplicado (aproximadamente 20mg em cada uma) em 3 placas cromatográficas preparativas de

sílica com indicador PF 254nm. Foi utilizado como solvente de eluição a mistura

hexano/acetato de etila (20%). Através da luz UV 254nm foram observadas 2 manchas, as

quais foram separadas, e filtradas com acetato de etila em funil de placa sinterizada. Após a

evaporação do solvente obteve-se 12,8mg de cristais de grandisina (Figura 3.1.1). A

substância foi identificada através dos dados de ressonância magnética nuclear de 1H e de 13C

(Martins et al. 2000).

Foto: Massuo J. Kato (IQ/USP).

Figura 3.1.1.: Cristais de grandisina extraídos fitoquimicamente das folhas de

Piper solmsianum.

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3.1.2.Preparo da amostra:

A substância pura foi dissolvida primeiramente em acetona em diferentes

concentrações e posteriormente diluída em solução de NaCl 0.15M para os bioensaios.

3.2. Inseto: Chrysomya megacephala

As colônias foram estabelecidas a partir de adultos de C. megacephala, coletados no

Município de Seropédica, RJ. e mantidas no Laboratório de Biologia e Controle de Insetos

Vetores onde foram realizados os experimentos. O estabelecimento e a manutenção das

colônias seguiram a metodologia preconizada por Queiroz e Milward-de-Azevedo (1991).

Os adultos nativos foram coletados com rede entomológica ou armadilha (Figura

3.2.1.), utilizando como atrativo carne ou peixe em decomposição. Com a utilização da rede

entomológica apenas um recipiente com o material em decomposição, foi suficiente para a

captura. Com relação à armadilha ela foi construída com duas partes superpostas, ambas

correspondentes as extremidades de uma garrafa plástica de refrigerante, sendo que na parte

inferior foram feitos orifícios para a passagem das moscas e foi onde se colocou a isca. No

topo desta foi colocada uma peça em forma de funil correspondente a parte superior da

garrafa, com a abertura menor voltada pra cima. Envolvendo o funil e parte da lata, acoplou-

se um saco plástico, cuja remoção permite a captura das moscas coletadas. Em seguida, foram

transferidos para gaiolas de madeira e transportados até o Laboratório de Biologia.

Figura 3.2.1.: Armadilha utilizada na captura das moscas.

- 46 -

Como substrato para ovipostura, foi utilizado carne bovina em decomposição. Após a

postura, as massas de ovos foram coletadas e transferidas para uma dieta que consistia de

carne em início de decomposição. Esta dieta foi colocada em recipientes de plástico com

capacidade de 250mL que foram introduzidos em outros recipientes de plástico com

capacidade para 500mL, contendo vermiculita (substrato mineral) para maximizar a pupação.

Este último recipiente foi tampado com tecido de náilon, preso nas bordas com elástico. Após

alguns dias as larvas abandonam espontaneamente a dieta, para estes recipientes contendo

vermiculita, para a fase de pupação e emergência dos adultos. Estes adultos recém emergidos

foram transferidos para novas gaiolas, onde receberam água e açúcar durante uma semana, e

no oitavo dia recebeu uma dieta à base de proteína animal por um período de quatro dias, a

fim de estimular a oogênese. Esta dieta foi re-oferecida após uma semana, com o objetivo de

padronizar o início da fase de ovipostura. Desta maneira, a partir dos exemplares parentais

foram obtidas as gerações F1 e as outras gerações (F2-F5), com as quais foram realizados os

experimentos.

3.3. Bioensaios

Foram utilizadas diferentes concentrações da lignana grandisina (1µg-300µg), na

busca da dose-resposta. A grandisina foi testada inicialmente por uso tópico nas larvas em

jejum, a fim de encontrar a concentração correspondente a 50% de mortalidade (DL50). A

partir da concentração estipulada de 100µg os tratamentos foram realizados por diferentes

tratamentos: aplicação tópica na massa de ovos; nas larvas em jejum; nas larvas sem restrição

de alimento (sem período de jejum); e adicionada à dieta.

O tratamento tópico nos ovos consistiu na aplicação da grandisina sobre a massa de

ovos. O tratamento tópico nas larvas consistiu da aplicação da lignana grandisina diretamente

sobre o corpo das neolarvas (L1), imediatamente após a eclosão das mesmas. No tratamento

realizado nas larvas com restrição de alimento (jejum), somente após 45 minutos do

tratamento tópico lhes foi oferecido o alimento, e nos bioensaios em larvas com dieta normal,

as larvas receberam dieta de carne imediatamente após a aplicação tópica da substância. No

tratamento oral a lignana foi adicionada e misturada à dieta artificial (base de leite) das

moscas (1g/larva) conforme metodologia de Mendonça et al. (2004).

- 47 -

3.3.1. Tratamento tópico nas larvas em jejum:

As massas de ovos foram coletadas a partir de moscas oriundas de uma colônia do

laboratório, e transferidas para placas de Petri (9,0 cm x 2,0 cm) previamente forradas com

papel de filtro umedecido com solução salina (pH 7,2) (1,0 mL) sem oferecimento de carne.

Imediatamente após a eclosão, as neolarvas (L1) foram retiradas desta preparação com o

auxílio de um pincel fino (número 0) e transferidas em grupos de 25 – 30 larvas para um

recipiente onde receberam o tratamento tópico. A substância foi aplicada (1µL/larva) sobre

cada grupo teste nas concentrações de 1µg/µL-300µg/µL, e posteriormente na concentração

de 100µg/µL.

Após 45 minutos do tratamento tópico, as larvas/grupo foram transferidas para a dieta

à base de carne bovina em início de decomposição considerando-se a relação de 1g

dieta/larva. No grupo controle com acetona as larvas/grupo receberam o tratamento com

aplicação de acetona: NaCl (1:4) (1µL/larva); no grupo controle (larvas/grupo) as larvas não

receberam o tratamento mas tiveram o tempo de espera determinado para o recebimento da

dieta, e no grupo testemunho (larvas/grupo) as larvas recém-eclodidas ou neolarvas (L1)

foram transferidas diretamente para a dieta normal sem tempo de espera. Todos os

experimentos foram realizados em triplicatas.

3.3.2. Tratamento tópico nos ovos:

As massas de ovos foram coletadas a partir de moscas oriundas de uma colônia do

laboratório, pesadas e transferidas para placas de Petri (9,0 cm x 2,0 cm) previamente forradas

com papel de filtro umedecido com solução salina de insetos (pH 7,2) (1,0 mL). A substância

foi aplicada em 1µL/mg de massa de ovos correspondendo a 30 mg de massa de ovos/grupo,

na concentração de 100µg/mg de massa de ovos. As larvas recém-eclodidas ou neolarvas (L1)

deste tratamento foram transferidas para a dieta à base de carne bovina em início de

decomposição considerando-se a relação de 1g dieta/larva para pupar e emergir. O grupo

controle-acetona recebeu aplicação de acetona: NaCl (1:4) (1µL/mg de massa de ovos) sobre

os ovos e o grupo controle normal não recebeu o tratamento. Todos os experimentos foram

realizados em triplicatas.

- 48 -

3.3.3. Tratamento tópico nas larvas:

As massas de ovos a partir de moscas oriundas da colônia do laboratório foram

coletadas e transferidas para placas de Petri (9,0 cm x 2,0 cm) previamente forradas com

papel de filtro umedecido com solução salina (pH 7,2) (1,0 mL) contendo aproximadamente

1g de carne. Após a eclosão dos ovos, as larvas L1 foram retiradas desta preparação com o

auxílio de um pincel fino (número 0) e transferidas em grupos de 25-30 larvas para um novo

recipiente onde receberam o tratamento tópico. A substância foi aplicada (1µL/larva) sobre

cada grupo teste contendo 25-30 larvas, na concentração de 100µg/µL. Após o tratamento, as

larvas (25-30 larvas/grupo x 3) foram transferidas para a dieta à base de carne bovina em

início de decomposição considerando-se a relação de 1g dieta/larva. No grupo controle com

acetona as larvas (25-30 larvas/grupo x 3) receberam o tratamento apenas com a aplicação de

acetona: NaCl (1:4) (1µL/larva) e no grupo controle (larvas/grupo) as larvas recém-eclodidas

foram transferidas diretamente para a dieta normal. Todos os experimentos foram realizados

em triplicatas.

3.3.4. Tratamento oral:

As massas de ovos foram coletadas a partir de moscas de uma colônia do laboratório,

pesadas e transferidas para recipientes previamente preparados contendo dieta artificial de

leite já acrescida da substância (grupos testes), da acetona (grupo controle com acetona) e da

dieta normal (grupo controle) para a eclosão das larvas. A substância foi testada na

concentração de 100µg/mL de alimento, sempre considerando a relação de 1g dieta/larva.

Todos os experimentos foram realizados em triplicatas.

3.3.5. Acompanhamento das fases de desenvolvimento pós-embrionário

Em todos os tratamentos (tópico na massa de ovos, tópico nas larvas e oral), as larvas

maduras L3, após abandono da dieta, foram coletadas, pesadas e acondicionadas

individualmente em tubos de ensaio, contendo vermiculita e fechados com algodão hidrófobo,

para a pupação e a emergência dos adultos.

Após a emergência, os adultos foram sexados, os seus tamanhos aproximadamente calculados

medindo-se a tíbia média direita, e levados agrupados por grupo teste e controle para as

gaiolas de madeira revestida com tela de nylon transparente (30 cm x 30 cm x 30 cm). A

alimentação dos adultos foi semelhante à provida durante a etapa anterior ao início do

- 49 -

experimento. Estes alimentos, trocados diariamente, foram assegurados, sem interrupção, a

partir do primeiro dia pós-emergência. As moscas foram observadas quanto à viabilidade

larval, pupal e de neolarva a adulto, período de duração das fases do desenvolvimento pós-

embrionário, peso larval, mortalidade e razão sexual. Todas as fases experimentais foram

observadas e controladas diariamente durante todo o seu período de vida. Todos os

experimentos foram realizados em condições de laboratório, em câmara climatizada regulada

à temperatura de 27±1oC, 60±10% URA e sem controle de luz.

3.4. Análises Estatísticas

Os resultados foram analisados através da análise de variância (ANOVA), teste do χ2,

pelo teste de Tukey.

3.5. Modelagem Molecular

A modelagem molecular foi realizada pelo Prof. Msc. Marco Antônio Soares Souza,

Laboratório de Ciências Exatas e da Natureza/CECETEN, Universidade Severino Sombra.

A disponibilidade de programas computacionais de química e os bancos de dados em

rede são, atualmente, ferramentas fundamentais para a descoberta e planejamento de

fármacos. Estas informações permitem uma análise rápida da atividade biológica versus

propriedades físico-químicas de uma série de moléculas de interesse. Novos agentes

terapêuticos podem ser desenvolvidos pela análise de dados teóricos de estrutura-atividade de

forma tridimensional, obtido por técnicas recentes de modelagem molecular (Wermuth et al.

1998). Modelagem molecular é a investigação das estruturas e das propriedades moleculares

pelo uso de química computacional e técnicas de visualização gráfica, visando fornecer uma

representação tridimensional, sob um dado conjunto de circunstâncias (Sant` Anna 2002). O

planejamento de fármacos auxiliado pelo computador permite a investigação das interações

químicas de um ligante com o seu receptor e exploração de fatores estruturais relacionados ao

efeito biológico (Wermuth et al. 1998).

Utilizando a modelagem molecular como ferramenta, a molécula da lignana grandisina

foi avaliada frente à estrutura molecular do hormônio responsável pela muda em insetos, a

ecdisona, e seus grupamentos ativos foram comparados a fim de verificar a correlação de suas

estruturas frente à atividade biológica demonstrada pela grandisina em C. megacephala. Os

cálculos teóricos, envolvendo a ecdisona e, desenvolvidos neste trabalho, foram realizados

utilizando-se o método semi-empírico PM3, programa MOPAC (versão 6.0). Os gradientes

- 50 -

obtidos para os compostos estudados ficaram todos abaixo de 0,2 kcal/(rad ou Å). A criação

das matrizes para realização dos cálculos, bem como a comparação de correlações estéricas,

foram efetuadas utilizando-se o programa PCMODEL PARA WINDOWS (versão 5.1). O

tratamento gráfico das estruturas, bem como as análises visuais pertinentes às distâncias

interatômicas e forças intermoleculares, foi realizado através do programa Raswin Molecular

Graphics (versão 2.6). As palavras - chave utilizadas para otimização da estrutura no MOPAV

foram as seguintes: PM3, PRECISE, NOLOG, NOINTER, GRAD e EF HESS=1.

- 51 -

4. RESULTADOS

4.1. Estrutura/Atividade

As lignanas e neolignanas que vêm apresentando atividades biológicas em insetos

estão aqui representadas por cinqüenta e três (53) lignóides classificados em seis (6) tipos de

esqueletos principais distribuídos em treze (13) subtipos. As bioatividades encontradas foram

agrupadas em seis (6) principais grupos (Figura 4.1.1.). Os dados mostram que os lignóides na

sua maioria encontram-se relacionados ao efeito tóxico (33) e a alimentação (inibindo ou

estimulando) e atividade repelente (25) (Figura 4.1.1). Seguidos da atividade de inibição do

crescimento (18) e alteração no desenvolvimento (14) (Figura 4.1.1). As demais atividades,

como: inibição da excreção (3) e da monooxigenase microssomal intestinal (3), estão

representadas por um número reduzido de lignóides testados (Figura 4.1.1). A partir dos seis

tipos de esqueleto de lignóides (8.8’; 8.5’; 5.5’; 1.5’; 8.3’; 8.1’) descritos e ensaiados em

insetos prevalecem treze (13) subtipos de esqueleto químico. Os tipos mais representativos

relacionados à atividade sobre os insetos destacam-se pelos subtipos 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’

(36%); 8.8’, 9.O.9’ (32%); 8.8’, 6.7’, 9.O.9’ (11%) e o subtipo 8.5’, 7.O.4’ (11%) (Figuras

4.1.2. A, B). Quanto ao tipo de esqueleto observa-se que 84% dos lignóides que interferem na

alimentação e na atividade repelente pertencem à estrutura química do tipo 8.8` (Figuras

4.1.3. A), e o seu subtipo estrutural 8.8’, 9.O.9’ (43%) é o mais representativo, seguido dos

subtipos 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’(29%) e 8.8’, 6.7’, 9.O.9’(14%) (Figura 4.1.3. B).

As atividades que envolvem algum tipo de toxidade (larval, inseticida etc.) estão

representadas pelo esqueleto 8.8’ (82%) e pelo 8.5’ (15%) (Figura 4.1.4. A). O subtipo de 8.8’

que representa esta atividade é principalmente 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’(41%); 8.8’, 9.O.9’ (22%);

8.8’, 6.7’, 9.O.9’ (22%) e os demais 15.% distribuídos pelos quatro demais subtipos (Figura

4.1.4. B).

Os lignóides com algum efeito sobre o crescimento de insetos, agindo direta ou

indiretamente sobre os sistemas hormonais (hormônio juvenil e ecdisona) envolvidos no

processo de inibição do crescimento, antimuda, ecdise e reprodução, demonstram uma

preferência pelo tipo químico 8.8’ (84%). Há nesta atividade presença de 44% do subtipo

8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’ e 25% do subtipo 8.8’, 6.7’, 9.O.9’ (Figura 4.1.5. A, B) contra 16% da

soma dos tipos 8.5’, 8.1’ e 5.5’ representado neste item pelas neolignanas licarina A,

burchelina e magnolol. Quanto à interferência deste tipo de substâncias sobre o peso,

longevidade, ciclo de desenvolvimento e deformações morfológicas, todos envolvendo os

- 52 -

processos gerais de desenvolvimento dos insetos observam-se os mesmos subtipos que

interferem sobre a inibição do crescimento, como: 8.8’ (79%) com 64% do subtipo 8.8’,

7.O.9’, 9.O.7’ e de 21% dos tipos 8.5’ e 8.1’ pelas neolignanas licarina A e burchelina (Figura

4.1.6. A, B).

Os lignóides que apresentam atividade antidiurética em insetos distribuem-se entre os

tipos 8.8’ (subtipo 8.8’, 6.7’, 9.O.9’) (33%) representados por podofilotoxina (lignana)

(Figura 4.1.7. A, B) que demonstrou efeito antidiurético, e pelos tipos 8.5’ (33%) e 8.1’ (33%)

(Figura 4.1.7. A) pelas neolignanas (licarina A e burchelina) que possuem atividade inibitória

da excreção em triatomíneos.

Dentre as substâncias (cubebina, epi-iangambina, sesamolina) envolvidas na inibição

da monooxigenase microssomal intestinal, são unicamente representadas pelo tipo 8.8’ e seus

subtipos 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’ e 8.8’, 9.O.9’ nas proporções de 67% e 33%, impossibilitando

descrever a especificidade do esqueleto 8.8’ nesta atividade (Figuras 4.1.8. A e 4.1.8. B).

Com relação à bioatividade em insetos, os lignóides analisados até o momento se

caracterizam principalmente pelas atividades de inibição da alimentação e ação repelente,

inibição do crescimento, alteração no desenvolvimento, e tóxica. O tipo de esqueleto químico

relacionado às atividades acima descritas é bem representado pelo tipo estrutural 8.8’ e seu

subtipo 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’.

- 53 -

0

5

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 5 6

Grupos de atividades em insetos

Núm

ero

de lig

nóid

es

Figura 4.1.1.: Número de lignóides (n=53) distribuídos de acordo com a bioatividade em insetos. Grupos de atividades (n=6). Grupo 1- Alimentação e atividade repelente Grupo 2- Efeitos tóxicos Grupo 3- Inibição do crescimento Grupo 4- Alteração no desenvolvimento Grupo 5- Inibição da diurese Grupo 6- Inibição da monooxigenase microssomal intestinal

1

- 54 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.5` 5.5` 1.5` 8.3` 8.1`

Tipos

Lig

nóid

es (%

)

0

10

20

30

40

50

8.8`, 7

.O.9`, 9.O.7`

8.8`, 9

.O.9`

8.8`, 6

.7`, 9.O.9`

8.8`, 2

.2`

8.8`, 7

.O.7`

8.8`

8.8`, 7

.O.9`

8.8`, 2

.7`, 9.O.9`

8.5`, 7

.O.4`

5.5`, 5

.5`

1.5`, 2

.2`

8.3`, 7

.O.4`

8.1`, 7

.O.6`

Subtipos

Lig

nóid

es (%

)

Figuras 4.1.2.A e 4.1.2.B: Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto químico com atividade em insetos, e tratados neste estudo. Total de lignóides (n=53); total de esqueletos (n=13); total de tipos 8.8’ (n=8).

2A

2B

- 55 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.5` 5.5` 1.5` 8.3` 8.1`

Tipos de estruturas

Lig

nóid

es c

om

inib

ição d

a a

lim

enta

ção e

ativid

ade r

epele

nte

/estim

ula

nte

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.8`,

9.O.9`

8.8`,

7.O.7`

8.8`,

7.O.9`

8.8`,

7.O.9`,

9.O.7`

8.8`,

6.7`,

9.O.9`

8.8`,

2.7`,

9.O.9`

8.8`, 2.2`

Subtipos

Estr

utu

ras d

o tip

o 8

.8' (%

)

Figuras 4.1.3.A e 4.1.3.B: Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto químico relacionados a alimentação e atividade repelente. Total de lignóides (n=53); total de esqueletos (n=13); total de tipo 8.8’ (n=8).

3A

3B

- 56 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.5` 5.5` 1.5` 8.3` 8.1`

Tipos de estruturas

Lig

nóid

es c

om

efe

itos tóxic

os (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.8`,

9.O.9`

8.8`,

7.O.7`

8.8`,

7.O.9`

8.8`,

7.O.9`,

9.O.7`

8.8`, 6.7`,

9.O.9`

8.8`, 2.7`,

9.O.9`

8.8`, 2.2`

Subtipos

Estr

utu

ras d

o tip

o 8

.8' (%

)

Figuras 4.1.4.A e 4.1.4.B: Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto químico com efeito tóxico sobre os insetos. Total de lignóides (n=53); total de esqueletos (n=13); total de tipo 8.8’ (n=8).

4B

4A

- 57 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.5` 5.5` 1.5` 8.3` 8.1`

Tipos de estruturas

Lig

nóid

es c

om

ativid

ade d

e

inib

ição d

o c

rescim

ento

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.8`,

9.O.9`

8.8`,

7.O.7`

8.8`,

7.O.9`

8.8`,

7.O.9`,

9.O.7`

8.8`, 6.7`,

9.O.9`

8.8`, 2.7`,

9.O.9`

8.8`, 2.2`

Subtipos

Estr

utu

ras d

o tip

o 8

.8' (%

)

Figuras 4.1.5.A e 4.1.5.B: Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto químico com atividade de inibição do crescimento sobre os insetos. Total de lignóides (n=53); total de esqueletos (n=13); total de tipo 8.8’ (n=8).

5A

5B

- 58 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.5` 5.5` 1.5` 8.3` 8.1`

Tipos de estruturas

Lig

nóid

es c

om

ativid

ade d

e

altera

ção n

o d

esenvolv

imento

(%

)

Figuras 4.1.6.A e 4.1.6.B: Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto químico que interferem sobre o desenvolvimento dos insetos. Total de lignóides (n=53); total de esqueletos (n=13); total de tipo 8.8’ (n=8).

6A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.8`,

9.O.9`

8.8`,

7.O.7`

8.8`,

7.O.9`

8.8`,

7.O.9`,

9.O.7`

8.8`,

6.7`,

9.O.9`

8.8`,

2.7`,

9.O.9`

8.8`, 2.2`

Subtipos

Estr

utu

ras d

o tip

o 8

.8' (%

)

6B

- 59 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.5` 5.5` 1.5` 8.3` 8.1`

Tipos de estruturas

Lig

nóid

es c

om

ativid

ade d

e

inib

ição d

a d

iure

se (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.8`,

9.O.9`

8.8`,

7.O.7`

8.8`,

7.O.9`

8.8`,

7.O.9`,

9.O.7`

8.8`,

6.7`,

9.O.9`

8.8`,

2.7`,

9.O.9`

8.8`, 2.2`

Subtipos

Estr

utu

ras d

o tip

o 8

.8' (%

)

Figuras 4.1.7.A e 4.1.7.B: Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto químico com atividade de inibição da diurese em insetos. Total de lignóides (n=53); total de esqueletos (n=13); total de tipo 8.8’ (n=8).

7A

7B

- 60 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.5` 5.5` 1.5` 8.3` 8.1`

Tipos de estruturas

Lig

nóid

es c

om

ativid

ade d

e inib

ição d

a

monooxig

enase m

icro

ssom

al in

testinal (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8.8` 8.8`,

9.O.9`

8.8`,

7.O.7`

8.8`,

7.O.9`

8.8`,

7.O.9`,

9.O.7`

8.8`,

6.7`,

9.O.9`

8.8`,

2.7`,

9.O.9`

8.8`, 2.2`

Subtipos

Estr

utu

ras do tip

o 8

.8' (%

)

Figuras 4.1.8.A e 4.1.8.B: Percentual (%) de lignóides de acordo com o tipo e subtipo de esqueleto químico que com atividade de inibição da monooxigenase microssomal intestinal. Total de lignóides (n=53); total de esqueletos (n=13); total de tipo 8.8’ (n=8).

8A

8 B

- 61 -

4.2. Bioensaios

Os resultados referentes aos bioensaios realizados com grandisina com aplicação

tópica sobre as larvas de moscas com restrição de alimento (jejum) mostraram uma pequena

alteração na duração do período larval nas concentrações de 1µg/µL, 10µg/µL e 100µg/µL

quando comparados aos grupos controles (controle e testemunho), porém não significantes

quando analisados com o grupo-controle de acetona (Tabela 4.2.1.A). A grandisina mostrou

viabilidade larval de 64% nas concentrações de 10µg/µL (16 ± 0,0) e 100µg/µL (16 ± 1,0), e

uma viabilidade de emergência de 64% (16 ± 1,0) e 56% (14 ± 1,0) nas mesmas

concentrações respectivamente, utilizando o controle-acetona como referência padrão (Tabela

4.2.1.B). O peso larval permanece nos padrões normais em todos os grupos testes, apenas

diferindo do controle-testemunho (Tabela 4.2.1.C e Figura 4.2.1). O tratamento tópico sobre

as larvas em jejum não mostrou diferença quanto à duração do ciclo de desenvolvimento nas

concentrações acima das doses anteriormente realizadas (200µg/µL e 300µg/µL) e mantendo-

se na média observada dos grupos (Tabela 4.2.2.A). Este teste apresentou uma viabilidade

larval de ~60%, com uma redução de 24% a 25% nas concentrações de 200µg/µL e 300µg/µL

(Tabela 4.2.2.B). Estas concentrações não interferiram sobre o peso larval e tamanho dos

adultos (Tabela 4.2.2.C e Figura 4.2.2.). A lignana grandisina utilizada topicamente sobre as

neolarvas (L1) em jejum responde independente da concentração, com uma viabilidade

aparentemente constante em torno de 50% a 60% em C. megacephala.

A aplicação tópica (100µg/µL) sobre a massa de ovos reduziu em 30% a 33% a

eclosão dos ovos (39,0 ± 9,0) quando os resultados são comparados ao grupo acetona (67,6 ±

5,5). A viabilidade de emergência também se mostrou diminuída (28,3 ± 9,6) (Tabela 4.2.3.B)

quando comparada ao controle acrescido do solvente de diluição (acetona) da substância (54,6

± 7,0) e alterou (p<0,001) o período larval de C. megacephala (Tabela 4.2.3. A) em relação

aos grupos padrões. Este tratamento mostrou larvas maduras (L3) mais leves, com 4mg a 6mg

(p<0,01) menores que as larvas L3 do grupo controle e conseqüentemente moscas com o

tamanho reduzido em 0,15mm (p<0,05) quando comparadas aos controles (normal e de

acetona) (Tabela 4.2.3.C e Figura 4.2.3.).

A substância, novamente aplicada, sobre as larvas com restrição de alimento (jejum)

reduziu 32% a viabilidade larval (12,6 ± 3,2) e 31% a emergência dos adultos (11,3 ± 2,5)

quando comparada ao controle-acetona (20,6 ± 1,5/larval e 19 ± 2,0/neolarva-adulto) (Tabela

4.2.4.B). O efeito tóxico sobre as larvas L1 (Tabela 4.2.4.B) na concentração de 100µg/µL

confirma o resultado obtido com o bioensaio anterior utilizando a mesma concentração (vide

Tabela 4.2.1.B). A duração do período larval e do período pupa-adulto se desequilibram, mas

- 62 -

mantém o padrão referencial (Tabela 4.2.4 A). O peso das larvas maduras (L3) e o tamanho

dos adultos (Tabela 4.2.4.C e Figura 4.2.4.) mantiveram-se nos padrões normais.

As larvas sem restrição alimentar e que receberam a substância aplicada topicamente

mantiveram os padrões normais quanto à viabilidade larval (54%) e de emergência (51%)

quando comparadas ao controle- acetona (65%) (Tabela 4.2.5.B). O mesmo não interferiu no

período de desenvolvimento (Tabela 4.2.5.A), sobre o peso (60,61 mg) e o tamanho das

moscas (2,73 mm) (Tabela 4.2.5.C, Figura 4.2.5).

A lignana adicionada à dieta larval não alterou o período de desenvolvimento de

C. megacephala em nenhuma de suas fases (Tabela 4.2.6.A), e não interferiu sobre a

viabilidade larval e de emergência (Tabela 4.2.6.B). Este tratamento resultou em larvas

maduras (6mg) mais pesadas que o controle, embora não tenha alterado o tamanho dos

adultos (Tabela 4.2.6.C, Figura 4.2.6).

A distribuição de fêmeas em relação aos machos manteve-se equilibrada em torno de

40% - 50%, em todos os tratamentos, mostrando que a lignana não interferiu na razão sexual

das moscas (Tabelas 4.2: 1C– 6 C).

- 63 -


megacephala tratadas com grandisina por uso tópico nas larvas (L1) em jejum.

Estágio larval (dias)

Estágio pupal (dias)

Estágio neolarva-adulto

(dias)

X ± DP IV X ± DP IV X ± DP IV

Controle testemunho

3,0 ± 0,11a 3-4 4,69 ± 0,46a 4-5 7,69 ± 0,46a 7-8

Controle 4,0 ± 0,54b 3-5 5,35 ± 0,60b 4-6 8,35 ± 0,60b 7-9

Controle com acetona

4,1 ± 0,38b,d 4-5 4,66 ± 0,47***a 4-5 8,66 ± 0,47c* 8-9

1µg/µL 4,4± 0,53 ***c,d 4-6 4,79 ± 0,49*** a 4-6 8,79 ± 0,49***c 8-10

10µg/µL 4,1 ±0,39b,d 4-5 4,66 ± 0,47*** a 4-5 8,66 ± 0,47*c 8-9

100µg/µL 4,4 ± 0,50***d 4-5 4,70 ± 0,46***a 4-5 8,70 ± 0,46*c 8-9

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 25-30 larvas/grupo. IV= intervalo de variação. Os níveis de significância são representados por ***P<0,001; *P<0,05 vs. controle e testemunho.Teste de Tukey. X= média, DP= Desvio padrão. Letras diferentes (a, b, c, d) apresentam diferenças.



Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 25-30 larvas/grupo. Os níveis de significância são representados por ***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05 vs. controle e/ou testemunho; + p<0,05 vs. controle acetona. Teste do χ2 e Tukey. X = média, DP= desvio padrão. Letras diferentes (a, b, c) apresentam diferenças.

Estágio larval %

X ± DP

Estágio pupal %

X ± DP


% X ± DP

Controle testemunho 97 a

24,3 ± 1,1 100

24,3 ± 1,1 97 a

24,3 ± 1,1

Controle 87 a

21,6 ± 1,5 91

21,6 ± 2,3 79 b

19,6 ± 1,7

Controle com acetona 83 a

20,6 ± 1,1 92

20,6 ± 2,0 76 b

19 ± 2,6

1µg/µL 68* b 17 ± 2,6

96 17,0 ± 2,6

65*** b,c 16,3 ± 2,0

10µg/µL 64** b/+ 16 ± 0,0

100 16 ± 0,0

64*** b,c 16 ± 0,0

100µg/µL 64** b/+ 16 ± 1,0

88 16 ± 1,0

56*** c/+ 14 ± 1,0

- 64 -



Peso (mg) Tamanho (mm)

X ± DP IV X ± DP IV RS

Controle testemunho 59,8 ± 4,97a 44-72 2,63 ± 0,08a 2.5-2.8 0,44

Controle 53,6 ± 6,63***b 28-66 2,51 ± 0,07*b 2.4-2.6 0,63

Controle com acetona 52,6 ± 6,40***b 36-67 2,54 ± 0,08 a,b 2.4-2.7 0,48

1µg/µL 52,0 ± 4,87***b 36-64 2,54 ± 0,05 a,b 2.5-2.6 0,49

10µg/µL 52,5 ± 4,64***b 38-62 2,50 ± 0,08**b 2.4-2.6 0,48

100µg/µL 50,7 ± 5,35***b 41-62 2,59 ± 0,08 a,b 2.5-2.7 0,50

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 25-30 larvas/grupo. RS= razão sexual; IV= intervalo de variação. Os níveis de significância são representados por ***p<0,001; **p <0,01; *p<0,05 vs. controle e/ou testemunho. Teste de Tukey. X=média, DP= desvio padrão. Letras diferentes (a,b) apresentam diferenças.

0

10

20

30

40

50

<30 30-40 41-51 52-62 63-73 74-84 85-95 >95

Intervalos de peso (mg)

Quantidade d

e larv

as

Figura 4.2.1.: Curva do número de larvas por intervalo de peso, no tratamento tópico com

grandisina nas larvas em jejum.

Controle; Controle acetona; 1µg/µL; 10µg/µL; 100µg/µL.

- 65 -


megacephala tratadas com grandisina por uso tópico sobre as larvas (L1) em jejum.




(dias)


Controle testemunho

6,09 ± 1,13a 4-8 4,47 ± 0,94a 3-6 11,00 ± 0,34a 10-12

Controle 5,83 ± 1,12a 5-9 4,98 ± 0,53b* 4-6 11,25 ± 0,49a 11-13


6,11 ± 1,07a 5-8 4,70 ± 0,75a,b 3-6 11,23 ± 0,50b 11-13

200µg/µL 5,71 ± 0,94a 5-8 5,09 ± 0,52b** 4-6 11,33 ± 0,47b 11-12

300µg/µL 6,22 ± 1,05a 5-8 4,74 ± 0,86a,b 3-6 11,33 ± 0,55b 11-13

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 25–30 larvas/grupo. IV= intervalo de variação. X=média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por **p<0,01; *p<0,05 vs testemunho. Teste de Tukey. Letras diferentes (a,b) apresentam diferenças.



Estágio larval %

X ± DP

Estágio pupal %

X ± DP


% X ± DP

Controle testemunho 77 a

19,3 ± 2,0 62

19,3 ± 2,0 48

12 ± 3,4

Controle 93 b

23,3 ± 0,5 57

23,3 ± 0,5 53

13,3 ± 1,1

Controle com acetona 85 b

21,3 ± 1,5 47

21,3 ± 1,5 40

10,0 ± 1,0

200µg/µL 60***c/++ 15 ± 2,0

73 15 ± 2,0

44 11 ± 1,7

300µg/µL 61***a,c/++ 15 ± 1,1

59 15 ± 1,1

36 9 ± 1,0

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 25-30 larva/grupo. X= média; DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por ***p<0,001 vs. controle e/ou testemunho; ++ p<0,01 vs. controle acetona. Teste do χ2 e Tukey. Letras diferentes (a, b, c) apresentam diferenças.

- 66 -






Controle 64,15 ± 7,97a 28-77 2,68 ± 0,078a 2.5-2.8 0,50

Controle com acetona 63,4 ± 9,09a 26-77 2,74 ± 0,08a 2.6-2.9 0,60

200µg/µL 62,95 ± 9,66a 34-77 2,70 ± 0,08a 2.6-2.8 0,48

300µg/µL 63,56 ± 8,40a 42-77 2,71 ± 0,11a 2.5-2.9 0,59

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 25-30 larvas/grupo. RS= razão sexual; IV= intervalo de variação. Os níveis de significância são representados por p>0,05 (ns). Teste de Tukey. X= média, DP= desvio padrão. Letras iguais (a) apresentam semelhanças.

0

10

20

30

40

50

<30 30-40 41-51 52-62 63-73 74-84 85-95 >95


Quantidade d

e larv

as

Figura . 4.2.2.: Curva do número de larvas por intervalo de peso, no tratamento tópico com grandisina nas larvas em jejum.

Controle; Controle acetona; 200µg/µL; 300µg/µL.

- 67 -


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/mg) por uso tópico sobre a massa de ovos.




(dias)

Estágio ovo-adulto (dias)

X ± DP VI X ± DP IV X ± DP IV X ± DP IV

Controle 5,13 ± 0,40a 5-8 5,15 ± 0,36a 5-6 11,15 ± 0,36a 11-12 12,15 ± 0,36a 12-13


5,17 ± 0,44a 5-8 5,42 ± 0,53***b 5-8 11,42 ±0,53b*** 11-14 12,42 ± 0,53***b 12-15

grandisina 5,67 ±0,59 ***b /+++ 5-8 5,67 ± 0,56***b 5-8 11,67 ±0,56*** b 11-14 12,67 ± 0,56***b 12-15

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 mg de ovos/grupo =261 larvas/grupo. IV= intervalo de variação. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por ***p<0,001 vs. controle; +++p<0,001 vs. controle acetona. Teste de Tukey. Letras diferentes (a, b) apresentam diferenças. Tabela 4.2.3.B: Viabilidade (%) do desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya

megacephala tratadas com grandisina (100µg/mg) por uso tópico sobre a massa de ovos.

Estágio de ovo %

X ± DP

Estágio larval %

X ± DP

Estágio pupal %

X ± DP


% X ± DP

Estágio ovo-adulto

% X ± DP

Controle 81a

70 ± 3,7 81a

57,3 ± 3,7 91a

57,3 ± 3,7 74a

52 ± 6,0 60a

52 ± 6,0 Controle com acetona

78a 67,6 ± 5,5

87a 58,6 ± 8,7

93a 58,6 ± 8,7

80a 54,6 ± 7,0

62a 54,6 ± 7,0

grandisina 45**b/++ 39 ± 9,5

83*b/++ 32,3 ± 8,0

88*b/++ 32,3 ± 8,0

73*b/+ 28,3 ± 9,6

33*b/+ 28,3 ± 9,6

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 mg de massa de ovos/grupo =261 larvas/grupo. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por **p<0,01; *p<0,05 vs. controle; ++p<0,01; +p<0,05 vs. controle acetona. Teste do χ2 e Tukey. Letras diferentes (a, b) apresentam diferenças.

- 68 -


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/mg) por uso tópico sobre a massa de ovos.



Controle 74,11 ± 9,5a 40-94 2,9 ± 0,1a 2.7-3.1 0,46


grandisina 68,21 ± 11,41**b/++ 21-88 2,71± 0,07**b/+ 2.6-2.8 0,40

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 mg de massa de ovos/grupo. RS= razão sexual; IV= intervalo de variação. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por **p<0,01 vs. controle; ++p<0,01, +p<0,05 vs. controle-acetona. Teste de Tukey. Letras diferentes apresentam diferenças.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

<30 30-40 41-51 52-62 63-73 74-84 85-95 >95


Quantidade d

e larv

as

Figura 4.2.3.: Curva do número de larvas por intervalo de peso, no tratamento tópico com grandisina sobre a massa de ovos.

Controle; Controle acetona; 100µg/mg.

- 69 -


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/µL) por uso tópico sobre as larvas em jejum.




(dias)


Controle testemunho 4,21 ± 0,44a 4-6 3,93 ± 0,35a 3-5 9,10 ± 0,35a 9-11

Controle 4,54 ±0,53**/***b 4-6 3,81 ± 0,40a 3-4 9,30 ± 0,49a 9-10


4,57 ± 0,53***b 4-6 3,76 ± 0,47a 3-5 9,25 ± 0,43a 9-10

100µg/µL 4,92 ±0,36***c/++ 4-6 3,82 ± 0,39a 3-4 9,71 ± 0,51***b/+++ 9-11

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 25 –30 larvas/grupo. IV= intervalo de variação. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por **p<0,01/***p<0,001 vs. controle/testemunho; +++p<0,001; ++p<0,01 vs. controle acetona. Teste de Tukey. Letras diferentes (a, b, c) apresentam diferenças. Tabela 4.2.4.B: Viabilidade (%) do desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya


Estágio larval %

X ± DP

Estágio pupal %

X ± DP


% X ± DP

Controle testemunho 97 a 24,3 ± 0,5

94 24,3 ± 0,5

91a 22,6 ± 0,5

Controle 89a 22,3 ± 0,3

91 22,3 ± 0,3

81a 20,3 ± 4,6

Controle com acetona 83a 20,6 ± 1,5

92 20,6 ± 1,5

76a 19 ± 2,0

100µg/µL 51**b/+ 12,6 ± 3,2

92 12,6 ± 6,8

47**b/+ 11,3 ± 2,5

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 25 –30 larvas por grupo. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por **p<0,01 vs. controle/testemunho, +p<0,05 vs. controle acetona. Teste do χ2 e Tukey. Letras diferentes (a, b) apresentam diferenças.

- 70 -






Controle 71,52 ± 10,32a 41-88 2,74 ± 0,11a 2.6-2.9 0,64


100µg/µL 67,53 ± 10,70a 42-82 2,73 ± 0,13a 2.6-3.0 0,60

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata 25 –30 larvas por grupo. RS= razão sexual; IV= intervalo de variação. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por p>0.05 (ns). Teste de Tukey. Letras iguais apresentam semelhanças.

0

10

20

30

40

50

30-40 41-51 52-62 63-73 74-84 85-95 >95


Quantidade d

e larv

as


grandisina nas larvas em jejum.

Controle; Controle acetona; 100µg/µL.

- 71 -


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/µL) por uso tópico sobre as larvas (L1).




(dias)


Controle 3,01 ± 0,11a 3-4 3,26 ± 0,44a 3-4 7,26 ± 0,44a 7-8


3,12 ± 0,33a,b 3-4 3,15 ± 0,36a 3-4 7,15 ± 0,36a 7-8

grandisina 3,28 ± 0,57***b 3-6 3,34 ± 0,48a 3-4 7,34 ± 0,48a 7-8

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 larvas/grupo. IV= intervalo de variação. Os níveis de significância são representados por ***p<0,001 vs. controle. Teste de Tukey. X= média, DP= desvio padrão. Letras diferentes (a, b) apresentam diferenças. Tabela 4.2.5.B: Viabilidade (%) do desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya


Estágio larval %

X ± DP

Estágio pupal %

X ± DP


% X ± DP

Controle 88 a 26,3 ± 2,0

99 a 26,3 ± 2,0

87a 26,3 ± 2,0

Controle com acetona 65 a,b 20 ± 1,7

100 a 19,5 ± 2,1

65 a,b 19,5 ± 2,1

grandisina 54*b 16 ± 4,5

94 a 16 ± 4,5

51**b 15,3 ± 3,5

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 larvas por grupo. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por: **p<0,01; *p<0,05 vs. controle. Teste do χ2 e Tukey. Letras diferentes (a, b) apresentam diferenças.

- 72 -





Controle 67,94 ± 9,34a 30-83 2,73 ± 0,12a 2,6-2,9 0,56

Controle com acetona 58,41 ± 7,91b*** 47-77 2,70 ± 0,09a 2,5-2,8 0,77

grandisina 60,61 ± 9,90b*** 35-78 2,73 ± 0,10a 2,6-2,9 0,54

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 larvas por grupo. RS= razão sexual; IV= intervalo de variação. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por ***p<0,001 vs. controle. Teste de Tukey. Letras diferentes (a, b) apresentam diferenças.

0

10

20

30

40

50

<30 30-40 41-51 52-62 63-73 74-84 85-95 >95


Quantidade d

e larv

as


grandisina nas larvas.

Controle; Controle acetona; 100µg/µL.

- 73 -

Tabela 4.2.6.A: Duração em dias do desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya megacephala tratadas com grandisina (100 µg/µL) por uso oral na dieta das larvas (L1).




(dias)


Controle 4,55 ± 0,67a 4-7 4,43 ± 0,50a 4-5 9,43 ± 0,50a 9-10


4,81 ± 0,58a 4-6 4,69 ± 0,51a 4-6 9,69 ± 0,51a 9-11

grandisina 4,66 ± 0,47a 4-5 4,64 ± 0,48a 4-5 9,64 ± 0,48a 9-10

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 larvas/grupo. VI= intervalo de variação. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por p>0,05 (ns). Teste de Tukey. Letras iguais apresentam semelhanças.


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/mL) por uso oral na dieta das larvas (L1).

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 larvas/grupo. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por p>0,05 (ns). Teste do χ2 e Tukey. Letras iguais apresentam semelhanças.

Estágio larval %

X ± DP

Estágio pupal %

X ± DP


% X ± DP

Controle 67a 20 ± 2,8

93a 20 ± 2,8

62a 18,5 ± 2,1

Controle com acetona 49a 14,6 ± 2,0

95a 14,6 ± 2,0

47a 14,6 ± 3,0

grandisina 43a 13 ± 2,6

100a 13 ± 2,6

43a 13 ± 2,6

- 74 -


megacephala tratadas com grandisina (100 µg/mL) por uso oral na dieta das larvas (L1).



Controle 58,92 ± 10,64a 21-80 2,75 ± 0,11a 2,6-2,9 0,38

Controle com acetona 60,79 ± 9,99a,b 23-76 2,68 ± 0,11a 2,5-2,8 0,45

grandisina 65,48 ± 7,04**b 51-79 2,75 ± 0,053a 2,7-2,8 0,41

Os experimentos com C. megacephala foram realizados em triplicata com 30 larvas/grupo. RS= razão sexual; IV= intervalo de variação. X= média, DP= desvio padrão. Os níveis de significância são representados por **p<0,01 vs. controle. Teste de Tukey. Letras diferentes apresentam diferenças.

0

10

20

30

40

50

<30 30-40 41-51 52-62 63-73 74-84 85-95 >95


Quantidade d

e larv

as

Figura 4.2.6.: Curva do número de larvas por intervalo de peso, no tratamento oral com

grandisina das larvas.

Controle; Controle acetona; 100µg/mL.

- 75 -

4.4. Modelagem Molecular

A tabela 4.4.1. apresenta os valores de calor de formação (Hf), potencial de ionização

(EV) que indica a habilidade da molécula de sofrer adições nucleofílicas (p.ex.) e a polaridade

(Debye) das moléculas grandisina (Figura 4.4.1.) e ecdisona (Figura 4.4.2.).

Tabela 4.4.1.: Valores referentes ao calor de formação (Hf), potencial de ionização

(EV) e polaridade (Debye) das moléculas ecdisona e grandisina.

Hf

(kcalmol-1)

Potencial de

ionização

(EV)

Polaridade

(Debye)

Ecdisona -348.95 10.44 4.95

Grandisina -219.53 9.10 4.05

Estes valores teóricos calculados indicam que, em termos de reatividade, a ecdisona

apresenta um maior caráter reacional em função do seu maior potencial de ionização. As

polaridades apresentam valores próximos entre as moléculas, o que indica um caráter de

interação molecular global, mostrando uma forte correlação entre a ecdisona e a grandisina.

Este parâmetro é um forte indicativo da possibilidade da interação em sítios receptores

semelhantes entre a lignana e o hormônio da muda (Ec); no entanto, este dado ainda não pode

ser conclusivo, pois não foram considerados os efeitos estéricos e/ou as interações específicas

importantes como as ligações de hidrogênio e os dipolos localizados.

- 76 -

Figura 4.4.1.: Estrutura modelada da grandisina.

Figura 4.4.2.: Estrutura modelada da ecdisona.

- 77 -

Avaliando a natureza espacial das duas moléculas, de forma qualitativa (aspecto

importante), as correlações estéricas e as forças intermoleculares específicas, os volumes

moleculares calculados para a grandisina e para a ecdisona foram de 449 Å3 e 498 Å3

respectivamente, indicando que a superfície de contato de ambas as moléculas pode ser

compatível para uma mesma cavidade receptora, sendo a ecdisona ligeiramente maior em

termos de volume. Esta observação também permite supor que a grandisina pode acessar os

mesmos sítios de interação que a ecdisona.

Analisando as estruturas em termos das interações mais importantes, que seriam as

ligações de hidrogênio e interações dipolares pode-se observar que as distâncias entre os

grupamentos aptos a realizarem estas interações também são compatíveis (Figura 4.4.3). Na

primeira estrutura (ecdisona) observamos que a distância entre as duas hidroxilas mais

afastadas, aptas à realização de ligações de hidrogênio e/ou interações dipolares é de cerca de

12.89 Å (A). Comparando-se com a segunda estrutura (grandisina) observam-se duas

metoxilas, também capazes de realizar as mesmas interações, apresentando uma distância

semelhante entre elas, de 12.18 Å (A´).

Em (B) observa-se duas hidroxilas vizinhas com distanciamento de 2.92 Å em

comparação a (B´) em que as duas metoxilas estão distantes cerca de 2.80 Å.

Em (C) e (C´) os mesmos grupamentos no outro extremo da estrutura também

apresentam correlações espaciais interessantes estando às distâncias estimadas entre 2.80 Å e

2.70 Å, respectivamente.

E, comparando à distância entre uma carbonila e uma hidroxila na ecdisona (D), com o

que corresponde à distância entre a função éter na grandisina e a metoxila mais próxima (D´),

observa-se que ambas possuem a mesma distância (5.56 Ă e 5.66 Ă) respectivamente (Figura

4.4.3.).

- 78 -

Figura 4.4.3.: Análise comparativa entre as distâncias de grupamentos ativos de ecdisona (1) e

grandisina (2).

O

MeO

MeO

OMe

OMe

OMe

OMe Grandisina

A* A*

C* B*

D*

HO

OH

OHOH

OH

HO

HO

C* A*

D*

B*

A*

Ecdisona

- 79 -

5. DISCUSSÃO

Neste estudo, utilizando a lignana tetraidrofurânica grandisina (8.8’,7.O.7’) extraída de P.

solmsianum, sobre o C. megacephala, diptera experimental, pode-se observar que a substância

aplicada na dieta das larvas não apresentou atividade antialimentar. Atividade antialimentar

vem sendo demonstrada por lignóides pertencentes aos tipos/subtipos 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’ e

8.8’, 9.O.9’ em Tribolium confusum, Sitophiluis granarium, Trogoderma granarium,

Coptotermis formosanus, Peridroma saucia entre outros (Harmatha e Nawrot 1984, 2002;

Kreckova et al. 1988; Nawrot et al. 1991). A atividade parece estar distribuída em quase todos

os esqueletos químicos dos lignóides no que se refere à alimentação, não sendo, portanto um

referencial para esta bioatividade.

A toxicidade da grandisina foi obtida com tratamento tópico sobre larvas recém eclodidas em

jejum, resultando no índice de 20% a 30% de mortalidade, e conseqüentemente reduzindo a

viabilidade larval de C. megacephala. Sukontason et al. (2004a) utilizando um

monoterpenóide, eucaliptol, demonstraram por método de imersão de larvas de terceiro

estágio a DL50 = 642 µg/µL para larvas de C. megacephala e DL50 = 101 µg/µL para M.

domestica. A mesma substância mostrou uma DL50 = 221µg/mosca fêmea e DL50 = 197

µg/mosca/macho quando o tratamento foi realizado por uso tópico no abdômen das moscas

adultas (Sukontason et al. 2004a). A toxicidade de eucaliptol foi obtida somente quando

utilizada em concentrações acima de 100 µg/µL. Índices de mortalidades foram observados β-

peltatina-A metil-éter (8.8’, 6.7’, 9.O.9’) (98%) e desoxipodofilotoxina (8.8’, 6.7’, 9.O.9’)

(33%), ambos na concentração de 100ppm, sobre mosca doméstica (Diptera) (Russel et al.

1976). Estudos com lignóides em Aedes, apresentaram atividade larvicida (100%) para Ae.

atropalpus utilizando eupomatenóide-6, eupomatenóide-5, conocarpano (subtipo 8.5’,7.O.4’)

na concentração de 10 µg/mL (Chauret et al. 1996) e grandisina DL50= 71 µg/mL para Ae.

aegypti (Cabral et al. in press). Tratamento tópico com podofilotoxina (8.8’, 6.7’, 9.O.9’)

resultou na mortalidade larval (DL50= 24 µg/mL dieta) e adultos (DL50= 22 µg/µL tópico) de

Drosophila melanogaster (Miyazawa et al. 1999), larvas de Ae. aegypti na concentração de 5

ppm (Berenbaum 1989).

Não houve inibição do crescimento de C. megacephala submetida aos tratamentos

com grandisina (8.8’,7.O.7’) mas apenas uma interferência de 20% a 29% quando a

substância foi aplicada sobre as larvas (L1) em jejum. As larvas tratadas, e que abandonaram

o alimento, conseguiram chegar à fase de pupa e a emergência. Estudos com moscas

varejeiras utilizando a neolignana iangambina (8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’) e burchelina (8.1’, 7.O.6’)

tiveram redução em torno de 30% da viabilidade larval e de emergência na concentração de

- 80 -

100 µg/µL (Cabral et al. 2007b). Epi-magnolina A (8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’) isolada de Magnolia

fargesii em concentrações maiores de 1mg/mL-1 (tratamento na dieta) reduziu o crescimento

larval em D. melanogaster (Miyazawa et al. 1994), assim como licarina A (8.5’, 7.O.4’) e

machilusina (8.8’, 7.O.7’) inibiu o crescimento de larvas em Spodoptera litura (González-

Coloma et al. 1994). Russel et al. (1976) observaram a mesma atividade com a lignana

desoxi-picropodofilina (8.8’, 6.7’, 9.O.7’) na concentração de 100ppm em mosca domestica.

Observa-se que tanto machilusina como desoxi-picropodofilina possuem o grupo

metilenodioxi podendo assim ser o responsável pela atividade.

O tratamento tópico (100 ppm) sobre a massa de ovos de C. megacephala foi o mais

eficiente, interferindo em todas as fases do crescimento do inseto: inibição da eclosão das

larvas (30-33%), aumento do período do desenvolvimento, redução do peso larval em 4mg e

do tamanho dos adultos em menos 0,15mm. Este fato é corroborado com Cabral et al. (2007b)

em bioensaios com C. megacephala tratadas com iangambina (8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’),

burchelina (8.1’, 7.O.6’) e grandisina (8.8’, 7.O.7’) mostrando que o peso larval de C.

megacephala foi reduzido em 4mg a 9mg. O peso larval é um fator importante para a

emergência, sendo necessário um peso mínimo de 38mg a 40mg para a larva madura (L3).

Estes pesos variam de acordo com a espécie, sendo observado em Chrysomya albiceps

(Wiedemann 1819) um mínimo necessário para pupar de 42 mg (Queiroz e Milward-de-

Azevedo 1991) e C. rufifacies (Macquart 1843) 40,2 mg (Levot et al. 1979). Alguns dípteros

necrófagos são melhores adaptados para pupar mesmo com peso abaixo do previsto estimado

para outras espécies. Isto pode ser uma estratégia para minimizar os efeitos deletérios da

competição (Hanski 1987). Como exemplo Calliphora erythrocephala (Meigen 1826),

mostrou peso 12% abaixo do mínimo crítico para pupar e sem demonstrar danos sobre a

emergência. Em outra espécie simpátrica estes valores variaram em 21% e 29% sem

demonstrar competição na colônia de insetos (Williams e Richardson 1983).

A longevidade das moscas tratadas em nosso estudo manteve-se em 60-75 dias

mesmos padrões encontrados por Wijesundara (1957a, b); Esser (1991) e Milward-de-

Azevedo (1995), embora Gabre et al. (2005) tenham demonstrado uma longevidade média de

25 dias para adultos de C. megacephala. Contudo, suplementos da neolignana NDGA (ácido

nor-dihidroguaiarético) (8.8’) colocadas em meio axênio larval ou na dieta dos adultos

aumentou o tempo de vida dos adultos de Ae. aegypti (Richie et al. 1986) e de D.

melanogaster (Miquel e Johnson 1975). Sukontason et. al. (2004a) demonstraram que o

tratamento topico com o monoterpenóide eucaliptol (50µg/µL-450 µg/µL) reduz a sobrevida

de adultos de M. domestica e C. megacephala.

- 81 -

Neste estudo, não foi observada alteração morfológica dos adultos nos tratamentos

com grandisina (8.8’, 7.O.7’). As larvas (L3) de C. megacephala quando tratadas com óleo

de eucalipto (902 µg/µL) apresentaram alteração ultraestrutural na superfície do corpo

(tegumento) (Sukontason et al. 2004b) e moscas adultas tiveram a coloração do corpo

modificada quando as larvas (L3) receberam tratamento com iangambina (8.8’, 7.O.9’,

9.O.7’) (100µg/µL) (Cabral et al. 2007 a).

O efeito mais significativo observado no tratamento de grandisina sobre C.

megacephala foi com relação à toxicidade sobre os ovos e as larvas (que ainda não tinham o

seu metabolismo neuro-endócrino ativado pela alimentação) de C. megacephala. A larvas

(com alimentação normal) que receberam tratamento tópico com grandisina não mostraram

alterações significativas sobre o desenvolvimento pós-embrionário, demonstrando que não há

uma interferência da grandisina sobre os hormônios responsáveis pelo desenvolvimento das

moscas. Esta proposta poderá ser corroborada com os ensaios preliminares da modelagem

molecular quando compara a lignana grandisina e a ecdisona, frente a interações moleculares.

Os volumes moleculares das duas moléculas mesmo muito próximos não indicaram

com precisão se a grandisina apresenta exatamente os mesmos mecanismos de interação, com

um eventual sítio receptor da ecdisona podendo competir com os mesmos receptores e

impedindo a ação da ecdisona. No entanto, os resultados mostram importantes correlações

espaciais, associadas às polaridades calculadas, bem como os volumes moleculares de ambas

as estruturas.

Em relação à estrutura- atividade, a presença de substituintes polares, especialmente os

grupamentos hidroxi e glicosil, geralmente reduzem a atividade de lignanas, já os

substituintes não polares tendem a aumentar a atividade. O fato de uma ampla variedade de

estruturas serem efetivas como inibidoras da alimentação indicam que vários mecanismos

diferentes estão envolvidos e, apenas alguns compostos relacionados podem ser comparados

(Nawrot e Harmatha 1994; Harmatha e Nawrot 2002). Espera-se uma relação definida entre a

estrutura de fenilpropanóides baseada em produtos naturais de plantas e atividade repelente,

quando se considera a população ou espécies de herbívoros (Lane e Kubanek 2006).

Analisando lignóides repelentes, Kubanek et al. (2000) sugeriram que a presença de

hidroxilação aril poderia estar relacionada com o aumento da repelência. E, os mesmos

autores reportam que alguns lignóides repelentes não possuem grupos metilenodioxi,

indicando que talvez este substituinte não esteja envolvido para com esta atividade. Em

contraste, Harmatha e Nawrot (2002) sugeriram que tais grupamentos são importantes na

efetiva atividade repelente contra insetos. Segundo Lane e Kubanek (2006) as partes alil e

metoxi contribuem para a inibição alimentar; e a interrupção da metade lactona reduz esta

- 82 -

atividade. Neste estudo, os bioensaios por via oral com grandisina não apresentaram inibição

da alimentação e repelência das moscas. Este resultado indica que a ausência do grupo

metilenodioxi na grandisina possa ser o responsável pela não atividade antialimentar e

repelente, corroborando assim com Harmatha e Nawrot (2002).

Outros estudos demonstraram que o grupo metilenodioxi é o responsável pela inibição

das oxidases de função mista, como o sistema enzimático que é responsável pela oxidação e

inativação da maioria das toxinas (Casida 1970) e por isso teria importância na atividade

sinergista de inseticidas; contudo existem lignanas, como matairesinol, que não possuem tal

substituinte, mas tem esta atividade descrita (Kerr 1951). Grandisina não possui o grupamento

metilenodioxi e não apresentou atividade sinergística de inseticida quando testada junto ao

piretróide deltametrina (dados não citados). Estes testes continuam em andamento.

Este estudo priorizou analisar os efeitos da lignana grandisina sobre C. megacephala

essencialmente baseado nos bioensaios e, na análise das atividades biológicas em insetos vs.

os tipos de esqueleto dos lignóides disponíveis na literatura.

Assim, propõe-se futuramente avaliar o padrão dos substituintes (ex: oxigenação) dos

anéis aromáticos dos lignóides que apresentam bioatividade em insetos, a fim de correlacionar

a estrutura molecular das substâncias com a bioatividade exercida sobre os dípteros

muscóides.

- 83 -

6. CONCLUSÃO

O principal metabólito secundário das folhas de Piper solmsianum, grandisina com o tipo

estrutural 8.8’, 7.O.7’, marcou sua atividade pelo efeito tóxico sobre ovos e larvas de C.

megacephala quando utilizada por uso tópico sobre a massa de ovos e larvas (L1) em jejum.

A lignana grandisina com o tipo estrutural 8.8’, 7.O.7’, mostrou-se como um novo

representante quanto à atividade tóxica, na relação estrutura-atividade biológica, até então

apenas descritas pelos subtipos 8.8’, 7.O.9’, 9.O.7’ e 8.8’, 6.7’, 9.O.9’. A grandisina não

interferiu sobre a metamorfose de C. megacephala, sugerindo tratar-se da não interação

molecular da lignana vs. hormônio da muda. A lignana alterou a duração do período de

crescimento, o peso larval e o tamanho do adulto. Desta maneira, é necessário verificar todos

os aspectos fisiológicos relativos a este díptero muscóide, a fim de avaliar a potencialidade de

grandisina frente à descoberta de inseticidas e controladores do desenvolvimento em insetos.

- 84 -

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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“Encontramo-nos, porém, à frente do amor de que todos somos necessitados, assim como o vegetal, diante do apoio da Natureza. A planta não se cria sem ar, não medra sem sol, não dispensa o auxílio da terra e não prospera sem água, mas deve produzir por si mesma.”

Francisco Cândido Xavier.

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