instituto tecnolÓgico de tuxtla gutiÉrrez reporte de
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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE
TUXTLA GUTIÉRREZ
REPORTE DE:
RESIDENCIA PROFESIONAL
INGENIERÍA BIOQUÍIMICA
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y ARTES DE CHIAPAS
“AISLAMIENTO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS DE BEBIDAS TRADICIONALES FERMENTADAS”
PRESENTA: ARTURO ALBERTO VELÁZQUEZ LÓPEZ
ASESOR INTERNO: DRA. PATRICIA GUADALUPE SÁNCHEZ ITURBE
ASESOR EXTERNO: MSc. GILBER VELA GUTIÉRREZ.
TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS A DE SEPTIEMBRE DEL 2013
2
ÍNDICE
CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN……………………………………………………. 5
CAPÍTULO II JUSTIFICACIÓN………………………………………………….... 6
CAPÍTULO III OBJETIVO……………………………………………………….... 7
3.1 Objetivos particulares…………………………………………………...… 7
CAPÍTULO IV CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DONDE SE DESARROLLO EL
PROYECTO………………………………………………………………………..…. 7
4.1 Historia de UNICACH………………………………………………………..…. 7
4.2 Misión…………………………………………………………………….…………. 8
4.3 Visión………………………………………………………………………….…….. 8
4.4 Localización………………………………………………………….………... 8
4.4.1 Instalaciones y ubicación……………………………..…………….…. 10
CAPITULO V PROBLEMAS A RESOLVER…………………………………….. 10
CAPITULO VI ALCANCES Y LIMITACIONES………………………………... 10
CAPITULO VII FUNDAMENTO TEÓRICO…………………………………….. 11
7.1 Pozol……….…………………………………..……………………………….... 11
7.2 Atole de elote……………………………………………..………..………........ 11
7.3 Descripción……………………………………………………………………….. 11
7.4 El suero lácteo……………………………………………………………………12
7.4.1 Tipos de sueros……………………………………………………….13
7.4.2 Composición y naturales del suero…………………………….…..13
7.4.3 Carbohidratos en el suero lácteo………………………………….14
7.5 Cultivos iniciadores…………..…………………………….…..……………... 14
7.5.1 Las bacterias acido lácticas………………………..................... 15
7.5.1.1 Producción de ácido…………………………………...…. 16
7.5.1.2 Actividad proteolítica…………………………..………... 17
7.5.1.3 Producción de aromas…………………………………… 17
7.5.1.4 Producción de gas…………………………………..…… 20
7.5.1.5 Producción de sustancias inhibidoras………….…….. 20
7.5 Usos tecnológicos de las bacterias acido lácticas…………,,,…………. 20
7,6 Compuestos antimicrobianos producidos por bacterias ácido lácticas..21
3
7.7 Probioticos……………………………………………………………….....21
CAPITULO VIII PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES
REALIZADAS……………………………………………………. 24
8.1 Material……………………………………………………..…..…….…….. 24
8.1.1 Elección de las zonas de muestro…………………….…………24
8.2 Preparación de las muestras….……………………………..………..… 24
8.3 Reactivación de la cepa Streptococcus thermophylus y Lactobacillus
bulgaris ……………………………………………………………………….. 25
8.4 Análisis microbiológico.......................................................... 25
8.5 Bacterias ácido lácticas………………………………………..…….…...26
8.6 Selección y purificación de BAL…………………………………..……..…. 26
8.6.1 Tinción de Gram………………………………………….…….…...26
8.6.2 Prueba de la catalasa………………………………………………..26
8.6.3 Prueba de la oxidasa………………………………………….……..26
8.7 Cinética microbiana en leche PRADEL y suero lácteo.……....………... 27
8.8 Evaluación de las propiedades in vitro …………………………………….. 28
8.9 Prueba API 50 CHL……………………………………………………………29
8.10 Proceso de elaboración de la bebida……………………………………...31
8.11 Determinaciones bromatológicas de suero lácteo………………………31
8.12 Análisis microbiológicos………………………………………………………32
CAPITULO IX RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………… 33
9.1 Cinética microbiana en leche………….…………………………….….. 35
9.2 Cinética microbiana en suero lácteo……………………………………...40
9.3 Prueba de probióticos in vitro…………………………………………… 43
9.4 Bromatología de la bebida elaborada…………………………………….47
9.5 Análisis microbiológico………………………………………………….47
CAPITULO X CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES…………….. …48
CAPITULO XI REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………… 48
ANEXOS…………………………………………………………………………….53
LISTA DE TABLAS
Tabla1. Contenido nutricional del pozol. 12
Tabla 2. Tipos de suero 13
Tabla 3 Componentes de los tipos de suero 13
4
Tabla4. Efectos identificados y los probables mecanismos subyacentes
de los probióticos. 20
Tabla 5. Procedencias de las muestras a analizar. 22
Tabla 6.Sustratos ensayados mediante la galería API50CHL®. 28
Tabla 7.Resultados de los parámetros cinéticos. 36
Tabla 8. Parámetros cinéticos de las cepas seleccionadas 41
Tabla 9. Porcentaje de tolerancia a pH de las cepas seleccionadas 41
Tabla 10. Bromatología de la bebida elaborada. 45
Tabla 11. Especificaciones de producto lácteo combinado 45
Tabla 12. Resultado de análisis microbiológico 45
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Localización de la universidad. 9
Figura 2. Localización de la zona de trabajo .
Figura 3. Ruta homofermentativa de utilización de lactosa de las bacterias del ácido láctico 18
Figura 4. Ruta heterofermentativa de utilización de lactosa de las bacterias del ácido láctico. 18
Figura 5. Diluciones con agua estéril. 25
Figura 6. Procedimiento del método peso seco 30
Figura 7. Interpretación visual de los resultados obtenidos con API50CHL® 31
Figura 8. Resultados de la tinción de Gram a cada una de las cepas utilizadas 34
Figura 9. Gram (+ ), streptococcus thermophylus y Lactobacllus bulgaris 34
Figura 10. Gram (+) , Lactobacillus casei 34
Figura 11. Formación de burbujas en la cepa 5 34
Figura 12. Formación de burbujas en la cepa 7 34
Figura 13. Cinética microbiana de bacterias acido lácticas en leche. 35
Figura 14. Cinética microbiana de bacterias acido lácticas en leche 36
Figura 15. Cinetica microbiana de bacterias acido lácticas en leche 36
Figura 16. Aumento del porcentaje de acido láctico 36
Figura 17.Porcentaje de acido láctico de las cepas aisladas 37
Figura 18. Porcentaje de acido láctico de la cepa control y Lactobacillus casei. 38
Figura 19. Disminución de pH durante la fermentación 38
Figura 20. Disminucion de pH durante la fermentación 39
Figura 21. Disminución de pH de la cepa control. 39
Figura 22. Cinética microbiana en suero lácteo. 40
Figura 23. Cinética microbiana en suero lácteo de las cepas control 41
Figura 24. Disminución de pH de las cepas seleccionadas 41
Figura 25. Disminución de pH de cepas control 42
Figura 26. Aumento de porcentaje de acidez de las bacterias acido lácticas 42
Figura 27. Resistencia a sales biliares 44
Figura 28. Resistencia a cambios de temperatura 45
Figura 29. Resistencia a diferentes concentraciones de NaCl. 46
5
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
El proceso de la fermentación es uno de los conocimientos más antiguos de la humanidad. En
México, país de grandes contrastes, tradiciones y gran diversidad cultural y biológica, se
encuentran alimentos muy variados, entre ellos, los alimentos fermentados tradicionales que se
consumen hoy en día y que complementan la dieta de forma importante (Ulloa, 1987).
Las bebidas y los alimentos indígenas fermentados han sido de gran importancia en la vida diaria
y ceremonial de numerosos grupos indígenas de México desde la época prehispánica hasta la
actual. Los alimentos o bebidas fermentadas son aquellos en que una etapa esencial de su
procesamiento se debe al crecimiento y la actividad de microorganismos (hay fermentaciones
lácticas, acéticas, alcohólicas y mixtas, entre otras) (Owens, 1993).
Los estudios microbiológicos de estas bebidas indican que contienen gran cantidad de
microorganismos benéficos como las bacterias lácticas, que son las primeras en desarrollarse y
que están presentes durante todo el proceso. Ellas son las responsables de la acidificación de la
masa (llega a tener un valor de pH cercano a 4), ya que producen ácido láctico, el que imparte un
sabor fresco y agradable al producto; de ellas destacan las amilolíticas (como Lactobacillus
acidophilus y L. crispatus)(Díaz, 1999). Estas bacterias convierten el almidón del nixtamal – su
principal carbohidrato- en ácidos, a diferencia de las que se encuentran en alimentos similares
hechos con maíz o productos lácteos fermentados como el yogurt que aprovechan la lactosa, que
es el azúcar de la leche.
Desde hace muchos siglos, los microorganismos probióticos han sido utilizados de forma
empírica, en la producción de alimentos como por ejemplo diversos productos lácticos y
vegetales fermentados (Chukeatirote, 2003). Estos alimentos aportan características
organolépticas, en base a la presencia de determinados microorganismos.
En los últimos años se ha mostrado un interés específico sobre estos microorganismos debido a
que su utilización puede mejorar la salud y prevenir enfermedades (Felley et al., 2001; Reid,
2008).
Antiguamente los alimentos se conservaban mediante un proceso de secado o de fermentación
natural entre otros. Los hombres aprendieron a producir la gran mayoría de alimentos
fermentados, como cerveza, vino, aceitunas, etc.
Aunque el consumo de alimentos en muchos países, sea todavía una cuestión de supervivencia,
cada vez más, se incrementa el número de consumidores que se preocupan por los aspectos
saludables de los alimentos. Como consecuencia de este hecho, se han ido introduciendo en el
mercado una amplia variedad de alimentos a los que se les atribuye efectos que les confieren un
gran atractivo comercial.
6
CAPÍTULO II
JUSTIFICACIÓN
En la actualidad la mayor parte de países tropicales donde los productos lácteos son difíciles para
almacenar, los alimentos ricos en almidón (maíz, sorgo,etc.) son la base de la dieta diaria. En el
sureste de México y Guatemala, usan el maíz como base para la dieta diaria y se prepara una
masa del maíz tradicional llamado pozol. La masa resultante se suspende en el agua y bebida
diariamente como una bebida refrescante. Una amplia variedad de microorganismos, incluso
hongos, levaduras, bacterias acido lácticas (BAL) tienen proliferación en este tipo de masas a
base de maíz (Zea mays)(Díaz et. al,1999).
El interés de la comunidad científica en las bacterias acido lácticas a partir de los productos de
elaboración artesanal, se debe al potencial uso que presentan en la industria alimentaria donde se
emplean ampliamente para realizar los procesos de fermentación. Sin embargo la adición de estos
microorganismos tiene diferentes propósitos. Esto no sólo proporciona el característico sabor
amargo de los productos lácteos fermentados, como el yogurt, sino que también disminuye
el pH y con ello previene el crecimiento de otros organismos nocivos. Por lo tanto, son
beneficiosas para la salud, previniendo infecciones gastrointestinales. Las cepas de los géneros
Lactobacillus y Bifidobacterium, son las bacterias probióticas más utilizadas (Pascual, 2000).
Los cultivos de bacterias probióticas tienen por objeto ayudar a que los organismos de la flora
intestinal se restablezcan. A veces son recomendados por los médicos, y, más frecuentemente,
por dietistas, después de un tratamiento con antibióticos o como parte de la recuperación
intestinal de la candidiasis (Pascual, 2000).
Por lo anterior, el presente estudio tiene el propósito de aislar bacterias acido lácticas de las
bebidas fermentadas típicas Chiapanecas (pozol y atole agrio), para comprobar su posible
caracterización como probiótico para su adición a una bebida a base de lacto suero.
7
CAPÍTULO III
OBJETIVO
Aislar bacterias acido lácticas de bebidas tradicionales del estado de Chiapas, de los
municipios: Tuxtla Gutiérrez y Venustiano Carranza; para su caracterización como probióticos y
elaboración de bebida a base de lactosuero.
3.1 objetivos específicos
Identificar mediante pruebas bioquímicas: Catalasa, oxidasa y tinción de Gram para las
cepas aisladas del pozol y atole agrio.
Determinar los parámetros cinéticos de crecimiento de las cepas aisladas, utilizando leche
PRADEL ® y lactosuero.
Confirmar las características de bacterias probióticas de las cepas aisladas.
CAPÍTULO IV
CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA EN DONDE SE DESARROLLO EL PROYECTO
4.1 Historia UNICACH
La Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas es una institución centenaria en el acontecer del
estado de Chiapas cuyos antecedentes se remontan al año de 1826 cuando el primer gobernador
del Estado de Chiapas, Manuel José de Rojas, decreta la fundación de la Universidad Nacional y
Literaria de Chiapas que en 1881 por decreto del Congreso Local primero cambia su nombre a
Instituto Científico y Literario de Chiapas y, posteriormente, en el mismo año se transforma en
Instituto de Ciencias y Artes de Chiapas que en el año de 1995 se convierte en nuestra hoy
Universidad de Ciencias y Artes del Estado de Chiapas.
La Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas en los últimos diez años ha estado inmersa en un
profundo proceso de transformación cuyos rasgos característicos son su ampliación,
diversificación y complejidad que muestran en la actualidad una universidad distinta cualitativa y
cuantitativamente a la que se tenía al final de la década de los noventa del siglo pasado.
En el año 2000 se da un parteaguas en la breve historia de nuestra Universidad que tuvo su
detonador en la aprobación por el H. Congreso del Estado Libre y Soberano de Chiapas de la Ley
Orgánica que le concede su autonomía, la cual sustentó las bases para un programa ambicioso de
regionalización como rasgo distintivo de la nueva etapa que inauguraba la nueva Ley Orgánica.
A lo largo de los últimos diez años la Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas ha tenido un
desarrollo que muestra avances y logros que se han sustentado en un sólido proceso de
planeación a través de dos ejercicios de planeación permanentes.
8
El primer ejercicio de planeación es el relativo a los procesos de discusión, aprobación, puesta en
marcha y seguimiento de los Planes de Desarrollo Institucional, de manera especial los
correspondientes a los periodos 2002-2006 y 2006-2010, el primero que se construyó después de
la crisis que vivió nuestra institución en la segunda mitad del año 2001 y el segundo que termina
su vigencia en el presente año
4.2 Misión
Formar profesionales calificados en las áreas científicas, humanísticas y técnicas, conocedores de
la diversidad cultural y ambiental de la región y del país, comprometidos con la mejora continua
y el desarrollo sustentable. Con un enfoque educativo centrado en el aprendizaje, la universidad
desarrolla la investigación, la extensión y la difusión del conocimiento para mejorar la calidad de
vida de la sociedad chiapaneca.
4.3 Visión
La Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas está posicionada con un fuerte reconocimiento
social en la región por la pertinencia de su oferta académica, sustentada en programas educativos
reconocidos por su buena calidad, cuerpos académicos consolidados, que cultivan líneas de
generación y aplicación del conocimiento, y que logran una fuerte vinculación con el sector
social, basada en un permanente programa de mejora continua; asimismo, se reconoce por sus
procesos administrativos y de apoyo académico certificados, por la actualización constante de su
normatividad y por la infraestructura adecuada a sus necesidades.
4.4 Localización
Libramiento Norte Poniente 1150, Ciudad Universitaria, Col. Lajas Maciel,
Tuxtla Gutiérrez, Chiapas; el mapa de localización de la Institución y del área del trabajo se
muestran en a figura 1 y 2, respectivamente.
9
Figura 1. Localización de la universidad
4.4.1 Instalaciones y ubicación
Figura 2. Localización de la zona de trabajo
Edificio 7 Clínica de
nutrición, Laboratorio de
análisis clínicos y de
investigación. Laboratorio de
microbiología y
bioquímica de los
alimentos
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CAPÍTULO V
PROBLEMAS A RESOLVER
Aislar bacterias del atol agrio y pozol bebidas típicas en el estado de Chiapas para ser
adicionadas en otras bebidas a base de lactosuero.
Comprobacion de probióticos de las bacterias aisladas de las bebidas.
Utilizar el lactosuero para la elaboración de bebidas probioticas, que actualmente casi en
su totalidad este residuo agroindustrial es considerado como contaminante..
Realizar la cinética microbiana de las cepas aisladas en leche para observar su
comportamiento en leche PRADEL ® y lactosuero.
CAPÍTULO VI
ALCANCES Y LIMITACIONES
El proyecto pretende realizar el aislamiento de bacterias acido lácticas (BAL) de bebidas
fermentadas típicas del estado de Chiapas, comparándolas con una cepa comercial Lactobacillus
casei y otra cepa para la preparación de yogurth Streptoccocus thermophilus y Lactobacillus
bulgaris en cuanto a su crecimiento microbiano y con estos resultados obtenidos determinar con
pruebas la existencia de probióticos en este aislamiento
La mayor limitación que se puede encontrar en la realización de este estudio de Bacterias
Ácido Lácticas, es la insuficiente cantidad de reactivos para las diferentes pruebas que se
desarrollaran durante el lapso de 16 semanas (4 meses), esto, para obtener la mayor cantidad de
datos sobre estas cepas aisladas.
Otra limitación de igual importancia es el hecho de que al momento de llevar a cabo las
cinéticas ce crecimiento la universidad nos dio un tiempo determinado tiempo de salida,
alrededor de las 22 horas (10 p.m.) , y por lo tanto algunos puntos del crecimiento no se llevaron
a cabo. También es importante mencionar que otro factor a considerar es que la cantidad de
materiales de laboratorio fueron insuficientes para llevar a cabo las diferentes pruebas en el
desarrollo de este proyecto, por ejemplo, en la realización de la prueba API 50.
11
CAPÍTULO VII
FUNDAMENTO TEÓRICO
7.1 Pozol
El pozol es un alimento elaborado con maíz cocido para nixtamal y después molido, en húmedo
para formar una masa. Se le puede agregar cacao tostado sin cáscara y también molido. La pasta
se mezcla después con agua. También puede agregársele chile amash y sal. Es un buen
energético. Esta masa o pozol se lleva envuelta en hoja de plátano en viajes cortos, para ser usada
en el almuerzo, en lugares como Tabasco y Chiapas. En algunas partes se le llama pushcagua. Se
le llama así por extensión a un alimento que se lleva envuelto (Santamaría, 1992).
En los estados del Sur, por ejemplo a Oaxaca, se encuentra que en La Chinantla se prepara pozol,
con hueso de mamey asado y molido, lo que le da un tono almendrado. Se le pone canela y
azúcar, y se envuelve en las hojas de un árbol conocido en Chiapas como pozol agrio. Pero
además, hay pozol hecho con cacao o con pataste, que es como se le llama a un cacao silvestre. Si
estas pastas o masas se fermentan, aumentan sus cualidades nutritivas, pues aunados a los valores
alimenticios propios del maíz y el cacao, el proceso de fermentación del primero incrementa la
presencia de aminoácidos (lisina, triptófano), así como de vitaminas como la niacina y la
riboflavina (Santamaría, 1992).
En el mismo Chipas o en Tabasco, los campesinos suelen llevar en sus caminatas una jícara para
hacer el pozol, mezclado con agua. Así resisten duras jornadas de trabajo al rayo del sol. El
chorote tabasqueño está dentro de esta familia de bebidas. Se prepara en frío con maíz cocido,
granos de cacao tostado y molido. Suele endulzarse con miel o azúcar. Puede añadirse pulpa de
coco o, como hacían los antiguos mexicanos, diversos chiles tostados y molidos (Barros, 2011).
7.2 Atole de maíz
En la época primitiva, cuando el hombre todavía era nómada, no conocía el barro pero realizaba
la actividad de moler granos de maíz y cocinarlos. Lo realizaba de una forma complicada, pero
ingeniosa para su tiempo. Utilizaban canastas de tejido muy cerrado en las cuales depositaban
granos de maíz triturados y agua, calentaban piedras en una hoguera y cuando estaban ardiendo,
colocándolas una tras otra en la mezcla de maíz hasta que se cocinaba por completo (Escamilla &
Escamilla, 2007).
Algunas crónicas refieren que esta bebida fue un alimento del gusto de emperadores y que hasta
el mismo Moctezuma lo saboreaba endulzado con miel. Como en el caso de muchos alimentos, la
mezcla de culturas produjo una gran variedad de atoles con frutas, especias y granos (Cardona,
2007).
7.3 Descripción
El maíz es un cultivo muy remoto de unos 7000 años de antigüedad, de origen indio que se
cultivaba por las zonas de México y América Central. Hoy día su cultivo está muy difuminado
12
por todo el resto de países y en especial en toda Europa donde ocupa una posición muy elevada.
EEUU es otro de los países que destaca por su alta concentración en el cultivo de maíz.
Su origen no está muy claro pero se considera que pertenece a un cultivo de la zona de
México, pues sus hallazgos más antiguos se encontraron allí. En la tabla , se puede observar la
composición nutrimental del pozol blanco.
Tabla 1. Contenido nutricional del pozol
(Serrano, et al. 1999)
En la mayoría de los países tropicales donde los productos lácteos son difíciles de almacenar,
productos de alimentación almidonados (la yuca, el maíz, el sorgo, etc.) es la base de la dieta
diaria. Para mejorar las posibilidades de almacenaje, procesos tradicionales que usan
fermentaciones espontáneas han sido desarrollados durante los siglos. En el sureste de México y
Guatemala, Indios y mestizos usan el maíz como base de la dieta diaria y se prepara una masa de
maíz tradicional fermentado llamado pozol y atole. Las mazorcas de maíz blanco son
descascaradas, y los granos son cocinados en la presencia de cal y lavados para quitar los
pericarpios (Escamilla & Escamilla, 2007).
Los granos son entonces toscamente molidos y posteriormente formada en pelotas, se envuelve
en hojas de plátano, para permitir su fermentación a temperatura ambiente durante 2 a 7 o más
días. Después de la fermentación la masa es suspendida en el agua y bebida diariamente como
una bebida refrescante. Una amplia variedad de microorganismos, incluyendo hongos, levaduras,
las bacterias acido lácticas (BAL), y no BAL, han sido aisladas de esta fermentación espontánea.
Para demostrar el papel de estos organismos (en particular BAL) en la producción de pozol y
atole, es esencial cuantificar los grupos de predominación de organismos e investigar la dinámica
de la comunidad total (Nabil & Ampe, 2000).
7.4 El suero lácteo
El suero es la fase acuosa de la leche, obtenida por medio de acidificación, aplicación de calor o
coagulación enzimática. Su apariencia es opaca y de coloración verde-amarilla (Badui, 1977).
Representa el 80-90% del volumen total de la leche que entra en el procesamiento del queso, y
contiene alrededor del 50% de los nutrientes de la leche origninal (Industria Alimenticia,1992).
Valor nutritivo
Grasa total 0.32 g
Carbohidratos 3.71 g
Proteína 0.72 g
Vitamina A 0
Calcio 24 mg
Hierro 0.3 mg
13
7.4.1 Tipos de suero
La producción mundial de queso se ha incrementado en los últimos años, y con ello la del suero.
Por ello es importante clasificar el mismo para un mejor aprovechamiento.
Dependiendo del origen del suero de la leche, el tipo de queso, y las variaciones del proceso, el
tipo de suero será diferente. Una de las clasificaciones está en función de su acidez (Tabla 2):
Tabla 2. Tipos de suero
Tipo de suero Acidez titulable pH
Suero dulce 0.10 – 0.20% 5.8-6.6
Suero medianamente
ácido
0.20 – 0.40% 5.0- 5.8
Suero ácido 0.40-0.60% 4.0-5.0
(Wisconsin Center for Dairy. 2002)
Los suero ácidos y dulces pueden ser condensados, secados, fermentados, deslactosados,
desmineralizados y desproteinados. Utilizando tecnologías como la ultrafiltración, osmosis
inversa, intercambio de iones y electrodiálisis. Además, la preparación de formulaciones para
niños recién nacidos, ha sido un negocio rentable a nivel mundial (Wisconsin Center for Dairy
Research,2002).
7.4.2 Composición y naturaleza del suero
La composición, tanto del suero y como de sus subproductos, es dependiente de las condiciones
de las condiciones de producción de queso. En la tabla 3, se puede observar una composición
generalizada de estos productos
Tabla 3. Componentes de los tipos de suero
Componente Suero
dulce
fluido
Suero
ácido
fluido
Suero ácido
concentrado
Suero
dulce en
polvo
Suero
ácido en
polvo
Sólidos
totales
6.35% 6.5 60 86.5 86
Humedad 86.95 86.61 33.5 3.5 4
Grasa 0.5 0.04 0.6 0.8 0.6
Proteína
total
0.8 0.75 7.6 10.1 10.5
Lactosa 4.85 4.9 20 6 6.4
Cenizas 0.5 0.8 8.2 6.3 9.8
Acido
láctico
0.05 0.4 0.1 0.2 4.2
(Wisconsin Center for Dairy. 2002)
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7.4.3 Carbohidratos en el suero lácteo
La lactosa es el componente mayoritario de la materia seca de la leche. Otros azúcares también
están presentes, pero en cantidades vestigiales. Se rata generalmente de poliósidos, que contiene
fucosa y glúcidos nitrogenados. El contenido de lactosa en el suero, es de 4.5 – 5% m/v. En el
proceso de fabricación de los quesos, un 95% de la lactosa se pierde en el lactosuero (Furtado,
1999).
La hidrólisis enzimática también es posible. Algunas levaduras y numerosas bacterias poseen una
lactasa que pueden provocarla. La evolución más frecuente, y a la vez, más importante, es su
transformacón en ácido láctico, llevada a cabo por las bacterias lácticas (Spreer, 1991).
C12H22O11H2O 4CH3-CH.CH-COOH
Lactosa Ácido láctico
Según el tipo de microorganismos presentes, la lactsa sufrirá fermentaciones diferentes productos
secundarios.
7.5 Cultivos iniciadores
Las fermentaciones alimentarias, cuyo origen parece situarse en Oriente, datan de tiempos
prehistóricos y representan una de las técnicas de conservación de alimentos más antiguas que
existen. La fermentación supone la transformación microbiana de un producto mediante el
catabolismo de los carbohidratos, proceso en el que se forman ácidos orgánicos, alcoholes y/o
CO2. Este proceso origina una modificación de las características organolépticas de las materias
primas, obteniéndose una amplia gama de productos fermentados como el yogur, queso,
mantequilla, embutidos, encurtidos, productos de panadería y diversas bebidas fermentadas ( Jay,
et al., 2005).
Son microorganismos inoculados (Lactobacillus acidophilus, Leuconostoc cremoris,
Streptococcus termophilus, Lactobacillus bulgaris) en productos alimenticios, con el objetivo de
reemplazar la flora microbiana endógena de la materia prima, para mejorar los procesos de
fermentación y desarrollar procesos metabólicos deseados que resulten en compuestos
generadores de sabor, aroma o textura. Las funciones esenciales por las que se utilizan los
cultivos pueden resumirse de la siguiente forma (Frazier, 1993) :
• Producción de acido láctico, la acumulación de este compuesto proporciona un típico
sabor y olor a acido durante la fabricación de leches fermentadas.
• Producción de componentes volátiles como diacetilo y acetaldehído que contribuyen al
sabor y aroma de productos lácteos.
• Produccion de compuestos con capacidad antimicrobiana proviniendo el crecimiento de
patógenos y otros microorganismos alterantes de los alimentos.
15
De acuerdo con el número y tipo de cepas presentes, los cultivos iniciadores se clasifican en las
siguientes categorías (Cogan , 1996).
• Cultivo de cepa única, formado por una cepa de una determinada especie.
• Cultivo definido múltiple, formado por varias cepas conocidas de una especie determinada.
• Cultivo definido mixto, formado por varias cepas conocidas de distintas especies.
• Cultivo indefinido o artesano, formado por numerosas especies y cepas, total o parcialmente
desconocidas.
7.5.1 Las bacterias del ácido láctico (BAL)
Las bacterias lácticas o bacterias del ácido láctico (BAL) tienen en común la producción de dicho
ácido como producto mayoritario del catabolismo de los azúcares. Son microorganismos Gram
positivos, generalmente inmóviles, no esporulados, no pigmentados y no reductores de nitrato.
Tampoco licuan la gelatina, no producen indol ni ácido sulfhídrico a partir de aminoácidos.
Debido a su limitada capacidad biosintética, son muy exigentes nutricionalmente y requieren
factores de crecimiento complejos que incluyen aminoácidos, vitaminas, purinas y pirimidinas
(Dellaglio et al., 1994).
Estos microorganismos son anaerobios aero-tolerantes ya que, aunque en general carecen de
catalasa, poseen otras peroxidasas y superóxido-dismutasa que permiten el crecimiento en
condiciones de aerobiosis .
Las BAL carecen del ciclo de Krebs, por lo que la generación de ATP ocurre mediante la
fermentación de carbohidratos y compuestos relacionados, acoplada a fosforilación a nivel de
sustrato. Entre los sustratos fermentables por las BAL se encuentran los azúcares
(monosacáridos, disacáridos y polisacáridos), los polialcoholes, el citrato y algún aminoácido
(arginina) (Madigan, 2004).
Este grupo comprende bacterias de los géneros Lactococcus, Vagococcus, Leuconostoc,
Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus,
Weissella y Carnobacterium. Aunque filogenéticamente alejados de las BAL, otros tipos
bacterianos como son los géneros Micrococcus, Brevibacterium, Propionibacterium y
Bifidobacterium también participan en la elaboración de alimentos fermentados. Las BAL están
incluidas dentro del grupo de microorganismos “seguros” o GRAS (generally recognized as safe),
lo que implica que pueden utilizarse para la elaboración de productos alimentarios (Axelsson,
2004).
El hábitat de estas especies es variado. Muchas aparecen asociadas a material vegetal. Otras
forman parte de la microbiota normal del hombre y animales, encontrándose en los tractos
respiratorio, intestinal y genitourinario, donde pueden ejercer un papel beneficioso al antagonizar
la colonización por patógenos, mejorar la digestibilidad de algunos alimentos y actuar como
coadyuvantes inmunológicos (Grant, 1998).
16
7.5.1.1 Producción de ácido
La lactosa es el azúcar mayoritario de la leche (4.2-5%) y su metabolismo en las BAL ha sido
estudiado con detalle. En la mayoría de las especies del género Lactococcus y algunos
Lactobacillus, la lactosa es fosforilada durante su paso a través de la membrana por medio del
sistema enzimático PEP/fosfotransferasa. La lactosa-6-P es hidrolizada por la acción de la fosfo–
β-galactosidasa a glucosa, que sigue la vía glucolítica, y galactosa-6-P, que se metaboliza por la
vía de la tagatosa-6-fosfato. En la figura 3 se puede observar el desarrollo de esta ruta (Axelsson,
2004)
En el género Leuconostoc y en la mayoría de las especies de Lactobacillus, el transporte de la
lactosa se realiza mediante una permeasa específica. La lactosa penetra en la célula a expensas de
la fuerza protón-motriz (Poolman, 1993), donde es hidrolizada por la β-galactosidasa a galactosa
y glucosa.
En función de los enzimas utilizados y de los productos resultantes de la fermentación se
distinguen dos vías principales:
Vía homofermentativa, propia de los géneros Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus,
Pediococcus y de especies de Lactobacillus de los grupos I y II. Metabolizan la glucosa a
piruvato por la ruta glicolítica o de Embden-Meyerhof-Parnas (figura 3), obteniéndose ácido
láctico como producto mayoritario de la fermentación. La producción de este ácido como único
producto metabólico tiene lugar solamente en condiciones de exceso de fuente de carbono
(glucosa o lactosa). Cuando ésta se encuentra en condiciones limitantes y en anaerobiosis, o
cuando el azúcar fermentado es la galactosa, tiene lugar la fermentación heteroláctica o ácido
mixta (Thomas et al., 1979; Fordyce et al., 1984) disminuyendo la producción de láctico y
produciéndose un aumento en los niveles de fórmico, acético y etanol (fig. 2.1). En condiciones
de aerobiosis los productos acumulados son principalmente láctico, acético y pirúvico debido a la
inhibición por el oxígeno del enzima piruvato-formato-liasa (Abee, et al., 1982).
Vía heterofermentativa, propia del género Leuconostoc y de especies del género Lactobacillus del
grupo III. La fermentación de la glucosa tiene lugar por la ruta de la fosfocetolasa, siendo éste el
enzima clave de la misma. Los productos originados por esta vía son ácido láctico, CO2 y
cantidades variables de acético y etanol como se puede observar en la figura 4.
El crecimiento de las bacterias con este tipo de metabolismo se ve favorecido en condiciones de
aerobiosis ya que la regeneración de NAD+ consumido en la oxidación de la glucosa se realiza
utilizando el oxígeno del medio como aceptor de electrones, lo que permite desviar el acetil-CoA
hacia la síntesis de acético y generar una molécula extra de ATP (Stiles, et al., 1997).
17
7.5.1.2 Actividad proteolítica
El sistema proteolítico de la mayor parte de las bacterias lácticas consta de una única
proteinasa extracelular con actividad caseinolítica, diversos transportadores de aminoácidos,
transportadores de di- y tripéptidos y un transportador de oligopéptidos. El sistema se completa
con aminopeptidasas y endopeptidasas intracelulares que intervienen en el último paso de la
degradación liberándose los aminoácidos esenciales para el desarrollo de las BAL.
La degradación de las proteínas de la leche constituye uno de los principales procesos
durante la maduración de los quesos, interviniendo en la textura final del producto como
consecuencia de la degradación de la trama proteica del coágulo (De Jong, 1978), así como en el
desarrollo de aromas y sabores por la liberación de péptidos y aminoácidos a partir de la caseína
de la leche, que actúan como precursores del aroma (Thomas y Pritchard, 1987).
7.5.1.3 Producción de aromas
Las bacterias del ácido láctico contribuyen al desarrollo del aroma de los productos fermentados
mediante la producción de determinados compuestos (alcoholes, cetonas o ésteres) que actúan
modificando las características organolépticas del producto. Así, la producción de diacetilo es
necesaria para un correcto desarrollo del aroma en productos como la mantequilla y algunos
quesos y leches fermentadas, mientras que el acetaldehído es el principal responsable del aroma
del yogur (Vedamuthu, 1994). Otros volátiles como el ácido acético o las metilcetonas también
intervienen en el desarrollo de aromas en diferentes variedades de quesos (Barron et al., 2005).
18
Figura 3. Ruta homofermentativa de utilización de lactosa de las bacterias del ácido láctico.
19
Figura 4. Ruta heterofermentativa de utilización de lactosa de las bacterias del ácido láctico.
Como se menciona anteriormente, la actividad proteolítica de algunas de estas especies
(principalmente Lactococcus y Lactobacillus) también contribuye al desarrollo de aromas y
sabores por efecto de la degradación de las proteínas de la cuajada en péptidos y aminoácidos
durante el proceso de maduración. Los aminoácidos actúan como sustratos en reacciones de
transaminación, deshidrogenación, descarboxilación y reducción, produciendo una gran variedad
de compuestos aromáticos como el ácido fenilacético, metanotiol, dimetildisulfuro, 3-
metilbutirato, 3-metilbutanal, 3-metilbutanol, 2-metil-1-propanal o 2-metilbutanal, entre otros
(Marilley, 2004).
20
7.5.1.4 Producción de gas
La producción de CO2
es especialmente relevante en microorganismos
heterofermentativos como producto de la fermentación de azúcares. No obstante, también existe
producción en especies homofermentativas como consecuencia del metabolismo del citrato.
Esta actividad es deseable en quesos de pasta “abierta” y en quesos azules donde es necesaria la
presencia de cavidades aireadas para permitir el desarrollo de los mohos (Chamba et al., 1994).
7.5.1.5 Producción de sustancias inhibidoras
El papel principal de las bacterias lácticas es provocar un aumento de la acidez como
consecuencia de la producción de ácidos. La consecuente disminución del pH tiene un efecto
inhibidor sobre el crecimiento de microorganismos patógenos o alterantes en el producto, ya que
muy pocas bacterias son capaces de crecer en los niveles de pH alcanzados por la acción de las
BAL.
Además, algunas bacterias lácticas son capaces de producir bacteriocinas. Estos
compuestos son péptidos de síntesis ribosomal que inhiben el crecimiento de otros
microorganismos y no producen la muerte de la cepa productora. Su papel biotecnológico en la
industria alimentaria es relevante, puesto que muchas presentan un amplio espectro de actividad
frente a microorganismos patógenos y alterantes, y se utilizan como bioconservantes. Las
bacteriocinas se clasifican en tres grupos (Klaenhammer, 1988)
• Clase I (antibióticos). Son péptidos pequeños (<5 kDa), termoestables y que presentan
aminoácidos inusuales en su composición, que se originan por modificaciones postraduccionales.
En función de su carga y conformación estructural, se subdividen en dos tipos, A y B, al primero
de los cuales pertenece la bacteriocina más conocida, que es la nisina.
• Clase II (No antibióticos). Péptidos con un tamaño inferior a 15 kDa, termoestables y que no
contienen aminoácidos modificados en su estructura primaria. Se subdivide en las clases IIa
(péptidos activos frente a Listeria), IIb (formadas por dos péptidos diferentes) y IIc (no incluidas
en ninguna de las anteriores).
• Clase III. Proteínas de más de 15 kDa que están constituidas por aminoácidos no
modificados y que son sensibles al calor.
Las bacterias lácticas también pueden sintetizar en menor cantidad otras sustancias con
efecto inhibitorio, como el peróxido de hidrógeno, CO2, diacetilo y productos de reacciones
secundarias como el hipotiocianato o el tiocianato (Lindgren , 1990).
7.5 Usos tecnológicos de las bacterias acido lácticas
Las BAL son utilizadas ampliamente en la industria para realizar procesos de fermentación en un
gran número de productos de origen animal o vegetal. Sin embargo la adicion de eestos
microorganismos tiene diferentes propósitos. Los generos BAL más empleados son: Latobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc y Strptococcus (Champagne, 1998)
21
7. 6 Compuestos antimicrobianos producidos por bacterias acido lácticas
El efecto antimicrobiano primario ejercido por BAL es la producción del ácido láctico y de la
reducción del pH (Daeschel 1989). Además, este proceso reduce la cantidad de carbohidratos
disponibles produciendo compuestos antimicrobianos que se pueden clasificar como moléculas
de bajo peso molecular, siendo las mas comunes el ácido láctico (C3H6O3), acético (C2H4O2) y
propionico (C3H6O2), peróxido de hidrogeno (H2O2), dióxido de carbono (CO2), diacetilo
(C4H6O2), acetaldehído (C2H4O); y moléculas de alto peso molecular denominadas bacteriocinas
y algunos componentes sin caracterizar (Piard et al., 1991).
7.7 PROBIÓTICOS
La historia de los probioticos y las propiedades benéficas de los cultivos microbianos vivos en
productos lacteos fermentados se conocen desde hace varios siglos (Lourens,2001).
En 1907 el biólogo ucranico y premio Nóbel, Elie Metchnikoff sentó las bases para el desarrollo
del término probiótico y el fenómeno relacionado denominado probiosis. LA probiosis puede
definirse como el efecto benéfico del consumo de productos lácteos con cultivos microbianos
viables. En 2003 Reid acuñó la última definición para describir probióticos, definiéndoles como
“microorganismos vivos que cuando se suministran en cantidades adecuadas confieren beneficios
sobre la salud en el anfitrión”.
Los efectos benéficos (Tabla 2 ) están expresados ya sea directamente por la interacción vivos
con el huésped, o bien, indirectamente como resultados de la ingestión de los metabolitos
microbianos producidos durante el proceso de fermentación (Stanton et al,2005)
Varios géneros de bacterias lácticas han sido identificados con beneficios a la salud. Aunque la
mayor parte de los probióticos pertenecen al género, hay también otras especies de lso géneros
Lactococcus y Enterococcus considerados como probióticos (Grant y Salminen, 1998)). Para que
un microorganismo sea considerado como un adjunto dietético, es valioso que ejerza una
influencia positiva y cumplir ciertos criterios. Las características más importantes de un
probiótico son:
Debe pertenece a la microflora de un tracto digestivo sano (humano)
Sobrevivir la vía digestiva superior
Ser capaz de sobrevivir y desarrollar en el intestino
Producir efectos benéficos una vez adherido al intestino
Seguro para consumo humano
Producción de sustancias antimicrobianas como bacteriocinas
Adhesión a células humanas intestinales y colonización
22
Tabla 4. Efectos identificados y los probables mecanismos subyacentes de los probióticos
BENEFICIOS TRASTORNOS MECANISMOS
PROPUESTOS
Confort digestivo Síndrome del colon irritable,
síntomas en el tracto
gastrointestinal en general
(estreñimiento, diarrea no patógena,
hinchazón, flatulencias, calambres,
mal aliento de origen digestivo)
Alteración de la población o
de la activad de la miclofora
intestinal.
Intolerancia a la lactosa Liberación de lactasa
microbiana en el intestino
delgado
Defensa Alergia (eczema atípico, alergia a la
leche y poliartritis reumatoide)
Translocación, efecto
barrera.
Cariogenecidad Modificación de la
población, de la actividad de
la microflora oral o de su
capacidad para adherirse a
los dientes.
Carcinogenicidad, mutagenicidad,
tumor.
Absorción del mutageno,
estimulación inmunitaria,
inhibición de la producción
carcinógena de la microflora
intestinal
Diarreas asociadas a los
antibióticos. Diarreas por
Rotavirus, colitis por C. difficile,
diarreas por Helicobacter pylori.
Exclusión competitiva,
translocación/efecto barrera,
respuesta inmunitaria
favorable.
Actividad antipatógena
Inmunomodulacion (estado
inmunitario, respuesta a las
vacunas)
Interacción con las células
inmunitarias o los receptores
celulares susceptibles de
provocar un aumento de la
actividad de fagocitosis de
los glóbulos blancos.
Inflamación intestina, colitis
ulcerosa, enfermedad de Crohn,
pouchitis
Ponderación de la respuesta
inmunitaria
Crecimiento excesivo de las
bacterias intestinales
Actividad antimicrobiana,
exclusión competitiva
Otros Reducción de la colesterolemia Desconjugación de los
ácidos biliares
Endotocema asociada a una cirrosis Inhibición de la producción
de endotoxinas por la
microflora intestinal
23
Hipertensión Componentes celulares o
péptidos procedentes de la
fermentación, que actúan
como inhibidores de la
enzima de conversión de la
angiotensima
Cálculos renales Alteración de la flora
digestiva susceptible de
influenciar la degradación
del oxalato
Fuente: Adaptada de Corthier 2004.
Las ventajas de las probióticos para los probióticos han dado lugar al concepto de simbióticos, en
el cual probióticos y prebióticos son usados en combinación. Las adiciones vivas microbianas
(probióticos) pueden ser usadas en la conjunción de desarrollo de los probióticos (ej. Un
fructoologosacarido o galactooligosacarido en conjunción con cepas de Bifidobacteirum,
Lactobacillus con lactitol). Se ha propuesto que esta combinación podría mejorar
considerablemente la supervivencia de probióticos, así como ofrecer ventajas de equilibrio
microecológico de la microflora intestinal (Gibson, 2004)
24
CAPITULO VIII
PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS.
8. 1Material
8.1.1 Elección de las zonas de muestreo
Con el fin de poder aislar cepas de posibles probióticos, se eligieron para la toma de muestras dos
zonas del estado de Chiapas, zonas donde todavía existen poblaciones indígenas que se
autoabastecen y son independientes.
La población chiapaneca, es de origen multiétnico, multicultural y mestizo, de importante
sustrato indígena a la cual se han sumado ascendencias europeas, africanas y asiáticas.
Se manifiesta la coexistencia de alrededor de 15 etnias, de las cuales siete se encuentran
distribuidos al norte del estado de Chiapas y los restantes en el sureste (Guerrero, 1997).
Se analizaron un total de 4 muestras de pozol elaborados de manera artesanal y 4 muestras de
atole (tanto masa como producto), procedente en su mayoría del Estado de Chiapas como se
describe en la tabla 3:
Tabla 5. Procedencias de las muestras a analizar
Código Muestras Procedencia
01-A Pozol blanco Tuxtla Gutiérrez
02-B Pozol blanco Venustiano Carranza
03-C Pozol de cacao Tuxtla Gutiérrez
04-D Pozol de cacao Venustiano Carranza
05-E Atole agrio Tuxtla Gutiérrez
06-F Atole agrio Venustiano Carranza
07-G Masa de atole Tuxtla Gutiérrez
08-H Masa de atole Venustiano Carranza
Dichos productos se compraron en unidades en mercados locales de la ciudad de Tuxtla Gutiérrez
y se transportaron en bolsas de plásticos estériles al laboratorio de Análisis clínicos y de
investigación en las clínicas de nutrición de la Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas,
donde se llevó a cabo su análisis microbiológico el cual se realizó en las 2 h posteriores a su
llegada al centro.
8.2 Preparación de las muestras
La masa se boleó a mano sobre una mesa de madera (Pozol blanco, pozol de cacao y masa de
atole), utilizando guantes de latex para este proceso; se envolvieron en hojas de plátano
extendidas. Las unidades (pequeñas bolas) de Pozol blanco, pozol de cacao y masa de atole
25
fueron colocadas en nuevas bolsas de plástico, cubiertas en hojas de plátano e incubados en
28±1°C y 4±1 °C por 5 días para la fermentación.
Las Muestras fueron tomadas del interior cada unidad de análisis en todas las etapas de
preparación, así como las almacenadas. Se utilizó una unidad diferente en cada muestreo.
8.3 Reactivación de la cepa Streptococcus thermophylus y Lactobacillus bulgaris
La cepa de Streptococcus thermophylus y Lactobacillus bulgaris se encontraba liofilizada, se
activó en 450 ml de leche entera, incubando a 37± 2°C en aerobiosis de 5 a 6 horas hasta que el
porcentaje de acido láctico resultará 0.7%, para su posterior siembra en agar MRS; basada en la
metodología de Cruz (2011).
8.4 Análisis microbiológico
Para realizar el análisis microbiológico, inicialmente se realizaron diluciones de cada una de las
muestras. Para ello, se pesaron 10 g de la muestra en una bolsa estéril y se suspendieron en 90
mL (Dilución 10-1
) de solución diluyente agua esterilizada, tal y como indica la NOM-110-
SSA1-1994.
Posteriormente, se realizaron las diluciones subsecuentes mediante la transferencia de 1 mL de
cada dilución a un tubo de ensayo que contenía 9 mL de agua estéril, hasta obtener la dilución 10-
6 (figura 5).
Figura 5. Diluciones con agua estéril.
Por técnica de vaciado se utilizaron las diluciones 10-4
, 10-5
y 10-6
en agar MRS y se procedió a
contar colonias con morfología típica de BAL.
26
El análisis microbiológico que se realizaron a las muestras descritas, fue el siguiente:
8.5 Bacterias ácido lácticas (basado en la NOM-092-SSA1-1994)
Para el recuento de BAL se inoculó por siembra en superficie 100 μl de las diluciones apropiadas
en agar MRS (Difco, USA). Las placas inoculadas se incubaron a 30ºC durante 24 h. La siembra
se realizó por duplicado y los resultados microbiológicos se expresaron como Log ufc/g.
8.6 Selección y purificación de bacterias ácido lácticas (Peñaflor & Guerrero, 2007)
Una vez realizado el recuento de las placas de MRS se seleccionaron diez colonias (que
presentaron la morfología típica de las BAL) y posteriormente se subcultivaron por estría
cruzada en placas de petri que contenían agar MRS, se incubaron a 30ºC durante 48 horas.
Se realizaron cuatro sub cultivos mediante estría en agar MRS e incubando a 30°C durante 48 h,
con la finalidad de aislar y purificar las cepas. Peñaflor y Guerrero (2007) mencionan para
comprobar que las cepas correspondían a BAL, se realizará tinción de Gram, prueba de catalasa y
prueba de oxidasa tal y como se describen a continuación:
8.6.1 Tinción de Gram:
Se colocó una gota de agua sobre un portaobjetos, se extendió con la ayuda de un asa la colonia
de BAL, mezclando uniformemente con el agua. Se fijó la muestra a la flama adicionándole una
solución de cristal violeta que la cubriera, dejándola reaccionar por 1 min, se eliminó el exceso
para añadirle lugol (1min). Posteriormente se decoloro con una solución de alcohol.acetona
durante 20 s, se lavó con agua destilada y se añadió safranina (1min), eliminando el exceso de
esta con agua destilada, secando finalmente la muestra al aire. Se observó al microscopia
características como tipo de tinción y morfología (INCB, 1993).
8.6.2 Prueba de la catalasa:
Se tomó con el asa estéril una colonia de cultivo de 18 a 24 horas de incubación. Se colocó la
colonia directamente sobre un portaobjetos sin añadir agua agregándole una gota de H2O2. La
interpretación se realizó observando que no existiera formación de burbujas par considerarlas
catalasa negativa, siendo esta una características propia de las BAL (INCB, 1993).
8.6.3 Prueba de la oxidasa:
Se adicionó sobre una colonia del microorganismo unas gotas del reactivo para oxidasa
(clorohidrato u oxalato de tetrametil-p--fenilendiamina al 1%) y se observó si la colonia cambió
de color a azul, se esperó 1 min, la presencia de éste color señaló la positividad de la prueba, si
esto no ocurriera se le consideraría oxidasa negativo (INCB, 1993).
27
8.7 Cinética microbiana en leche Pradel® y suero lácteo.
Una vez realizadas las pruebas bioquímicas anteriores, para determinar el crecimiento de las
cepas; se preparan los materiales a utilizar en el desarrollo experimental: en 450 ml de leche
PRADEL, se inocularon de 3 a 4 asadas de cada una de las cepas a utilizar (Aisladas del pozol
blanco, cacao, atole, masa de atole, Lactobacillus casei, Streptoccocus termhopylus). Los
parámetros a medir, cada dos horas (Olivera, 2011), son los siguientes:
a) Metodología para determinación de peso seco (Olivera, 2011):
Se tomaron muestras de 5 ml de la solución inicial y se colocaron en 3 tubos de ensayos
previamente pesados.
Los tubos de ensayo se centrifugaron a 4,000 rpm, por un tiempo de 10 minutos.
Se pesó cada tubo de ensayo en la balanza analítica y se anotó los pesos.
Posteriormente, los tubos se colocaron en una estufa, a una temperatura de 105 °C por un
tiempo promedio de 3 horas.
Pasado el tiempo, se anotan los pesos y luego se obtuvo el promedio.
Figura 6. Procedimiento del método peso seco
Las ecuaciones que se determinaran son:
b) Metodología para determinación de pH
28
Para la determinación de pH se necesitara un pH-metro , una solución amortizado a pH4 y
solución amortizado a pH 7. Este parámetro se determinó cada dos horas durante 30 horas de
crecimiento (Peech,1995).
c) Metodología para determinación de ácido láctico (García & Ochoa, 1987)
Se tomaron muestras de 10 ml (leche y suero lácteo) y se colocaron en matraces
erlenmeyer de 125 ml.
Se adicionó a los matraces 1ml de solución fenolftaleína (10 gotas aproximadamente) y se
homogenizó.
Posteriormente se procedió a la titulación con NaOH 0.1 N, hasta la aparición de color
rosa pálido que permanezca por unos 30 segundos.
Leer en la bureta la cantidad de hidróxido de sodio gastado para neutralizar la leche y con este
dato encontrar la acidez en ° D, sabiendo que: cada ml de hidróxido de sodio gastado nos indica
10°D de acidez. Esta determinación al igual que las demás mencionadas anteriormente se
monitoreó cada dos horas durante 30 horas de crecimiento.
8.8 Evaluación de propiedades probióticos in vitro
A una concentración conocida de inoculo de cada uno de los microorganismos se le realizaron las
siguientes pruebas:
a) Tolerancia a cambio de pH: Para determinar la resistencia a condiciones acidificantes ,se
evaluaron las cepas mediante el cambio de pH de los agares en cajas petri a diferentes valores, 4,
5.6, 7 (incubación a 37 °C durante 24 hrs), ajustando el pH con acido cítrico 0.1M y 1 M; la
sobrevivencia y resistencia se comprobó al comparar el conteo de microorganismos viables del
inoculo, con las células sobrevivientes después de la incubación a diferentes valores de pH
(Zavaglia et al., 1998); el porcentaje de resistencia fue calculado por la siguiente ecuación
(Kociubinski & De Antoni, 1999):
% R pH = [(UFC/mL) MRS pH x 100] / (UFC/mL) MRS (inoculo)
Se estableció como criterio de selección escoger aquellas cepas que resistieron el pH por encima
del 50 % y se les realizó las siguientes pruebas probióticas.
b) Tolerancia a sales biliares: el ensayo fue realizado a diferentes concentraciones de sales 0,05,
0,1, 0,15 y 0,3 % p/v ajustado el pH =7 con HCI 5% (incubación a 37 °C durante 24 hrs); al cabo
de este tiempo la sobrevivencia y resistencia a sales biliares se comprobó con el conteo de
microorganismos viables del inoculo (UFC/ml) (Brizuela, 2003; Rubio et al., 2008, Rondón et
al., 2008; Avila et al., 2010). COMO SE HIZO?
c) Tolerancia a cambios de temperatura: fueron probadas diferentes temperaturas, 28, 37 y 43
°C, durante 24 hrs; la sobrevivencia y resistencia a estas temperaturas se comprobó mediante la
determinación del número de células viables (UFC) (Rubio et al., 2008, Rondón et al., 2008;
Ávila et al., 2010).
29
d) Tolerancia a altas concentraciones de NaCl: la prueba se realizó utilizando caldos MRS,
Malta, Nutritivo y diferentes concentraciones de NaCl, 2, 4, 7 y 10 % p/v, (incubación a 37 °C
durante 24 hrs); finalizado el tiempo se determino el crecimiento a altas concentraciones de NaCl
mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 600 nm a 0 y 24 hrs.
e) Prueba de antagonismo: esta prueba fue realizada contra Salmonella sp pertenecientes al
banco de cepas del laboratorio estatal, las cuales se sembraron en forma masiva en agar Mueller
hinton; en la superficie de estos se colocaron tres discos impregnados con los microorganismos
de ensayo; se introdujeron en la nevera durante 30 minutos (T = 15 °C) y después se incubaron a
37 °C durante 48 hrs. La acción antagónica se evidencio por la presencia de halos de inhibición y
crecimiento alrededor de los discos. (Leiva et al., 2004).
f) Capacidad de crecimiento: las cepas que resistieron la presencia de sales biliares, acidez se
cultivaron en 30 ml de caldo MRS, Malta, Nutritivo y fueron incubadas a 37 °C durante 24 y 48
hrs; el crecimiento se comprobó mediante la determinación del número de células viables (UFC)
y se determinó el porcentaje (Laurencio et al., 2002; Rondón et al., 2008).
8.9 Prueba API 50 CHL
Inoculación de las galerías
Es necesario disponer de un cultivo axénico. Se realiza la suspensión en el medio diluyente
suministrado con el API50CHL® y se distribuye el contenido en todos los tubos de la galería. Se
llena la cúpula de cada tubo con parafina estéril para garantizar la anaerobiosis. Se incuban las
galerías a 37 ºC durante 48 horas y posteriormente se realiza la lectura de las pruebas.
En la Tabla núm.7, se indican los componentes activos ensayados en la galería API50CHL®.
30
Tabla 6. Sustratos ensayados mediante la galería API50CHL®.
31
Figura 7. Interpretación visual de los resultados obtenidos con API50CHL®
8.10 Proceso de elaboración de la bebida
Se tomaron 150 ml de suero de leche previamente pasteurizado y se inoculó con colonias aisladas
de pozol blanco, pozol de cacao y Lactobacillus casei para llevar a cabo el proceso de
fermentación se incubaron a 35±2°C durante 48 horas, transcurrido el tiempo se le determinó el
pH (potenciómetro HANNA®, modelo HI 208, México), tiempo en el que se alcanzó la cantidad
de ufc/ml requerida según la NOM-181-SCFI-2010 para considerarse una bebida probiótica;
análisis que se efectuó mediante el recuento de UFC/ml en la bebida empleando la técnica de
dilución y vaciado en placas que contenían agar M.R.S. para Lactobacillus mediante el
procedimiento establecido en la NOM-113-SSA1-1994.
La bebida fermentada con la cantidad mínima requerida de bacterias probióticas, se le adicionó
mermelada de piña con coco (40°Bx); la mezcla se efectuó en una relación de 30% en 70% de
suero lácteo.
8.11 Determinaciones bromatológicas
La bromatología del suero lácteo como la bebida elaborada se llevo a cabo de acuerdo a la NOM-
155-SCFI-2002. Se realizó la determinación de proteína cruda, sólidos totales, lactosa, densidad,
pH, acidez y cantidad de grasa. La cantidad de grasa se determinó mediante la fórmula de
Ritchman.
Donde: L: lectura de densidad obtenida con el lactodensímetro
G: porcentaje de grasa
32
8.12 Análisis microbiológicos.
El análisis microbiológico se realizo de acuerdo a las Normas Oficiales: NOM-092-SSA-1994
para cuenta de bacterias en placa, NOM-111-SSA1-1994 método para la cuenta de mohos y
levaduras en alimentos, NOM-112-SSA1-1994 determinación de bacterias coliformes. Técnica
del número más probable, NOM-115-SSA1-1994 método para la determinación de
Staphylococcus aureus en alimentos.
33
CAPITULO IX
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con la realización de este proyecto se realizo el aislamiento de 8 cepas de bacterias acido
lácticas, a cada una se realizó 3 pruebas bioquímicas para indagar si las cepas obtenidas se encuentran
puras y si corresponden a BAL(Figura 8):
Tinción de Gram:
Cepas Tuxtla Gutiérrez Venustiano Carranza
Cepa 1. Pozol blanco a
temperatura ambiente.
Cepa 2. Pozol blanco a
temperatura de refrigeración
Cepa 3. Pozol de cacao a
temperatura ambiente
Cepa 4. Pozol de cacao a
temperatura de congelación
34
Cepa 5. Atole agrio
Cepa 6. Masa de atole agrio
Figura 8. Resultados de la tinción de Gram a cada una de las cepas utilizadas
En la figura 8, se muestra las tinciones de cada una de las cepas, de la cepa 1 a la cepa 4 se
obtuvieron Gram (+) (tinción de azul) característico de las BAL, mientras que las cepas de atole
agrio dio resultados negativos, es decir, dieron gram (–) (tinción roja), tal y como se muestra en
la figura 9 y 10.
Para determinar si la cepa es pura se realizo la prueba de catalasa obteniendo los resultados que se
presentan en la figura 11 y 12.
En la mayoría de las cepas se obtuvo un resultado negativo característicos de las bacterias ácido lácticas,
con excepción a las cepas correspondientes al atole agrio y masa de atole agrio.
Figura 12. Formación de burbujas en la cepa 7 Figura 11. Formación de burbujas en la cepa 5
Figura 9. Gram (+ ), streptococcus thermophylus y
Lactobacllus bulgaris.
Figura 10. Gram (+) , Lactobacillus casei
35
De las cepas anteriores las que tienen resultados negativos, es decir, que no son característicos de las
bacterias acido lácticas son las bacterias del atole agrio y la masa de atole agrio.
Para estar seguros de la pureza de las cepas mencionadas con anterioridad se realizó la prueba
bioquímica de la oxidasa dando en su mayoría resultados negativos, es decir el reactivo adicionado no
tiño de color a la colonia con excepción de las colonias de las cepas de atole y masa de atole agrio.
Por lo anterior se descarto las cepas de atole y masa de atole agrio debido a que los resultados de las
pruebas bioquímicas no fueron característicos de las bacterias acido lácticas.
9.1 Cinética microbiana
Una vez aisladas las bacterias acido lácticas de las diferentes muestras se prosiguió a realizar la cinética
microbiana de cada cepa observando el comportamiento de cada una en leche, siguiendo como base la
cepa de Streptoccocus y Lactobacillus bulgaris, los resultados se muestran en las figuras 13 y 14:
Figura 13. Cinética microbiana de bacterias acido lácticas en leche.
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0 5 10 15 20 25 30 35
g/l
Tiempo (horas)
Cepa 1 Tuxtla
Cepa 1 Carranza
Cepa 2 Tuxtla
Cepa 2 Carranza
36
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0 5 10 15 20 25 30 35
g/l
Tiempo (horas)
cepa 3 Tuxtla
Cepa 3 Carranza
Cepa 4 Tuxtla
Cepa 4 Carranza
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 5 10 15 20 25 30 35
g/l
Tiempo (horas)
Lactobacillus casei shirota
Strepto-Lactobacillus
Figura 14. Cinética microbiana de bacterias acido lácticas en leche.
Figura 15. Cinética microbiana de bacterias acido lácticas en leche.
En la figura 13 y 14, se presentan las curvas de crecimiento de las cepas aisladas de bacterias acido
lácticas en leche PRADEL. Se observa que la concentración máxima en la FIGURA 13 es de 0.0402 g/l
correspondiente a la cepa 2, al igual que a la cepa 1 con 0.0378 g/l. Se observaron las fases de
37
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35
%A
cid
o la
ctic
o
Tiempo (horas)
Cepa 3 Tuxtla
Cepa 3 Carranza
Cepa 4 Tuxtla
Cepa 4 Carranza
-5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40
%A
cid
o la
ctic
o
Tiempo (horas)
Cepa 1 Tuxtla
Cepa 1 Carranza
Cepa 2 Tuxtla
Cepa 2 Carranza
crecimiento: La fase de latencia corresponde de 0 a 8 horas, la fase exponencial de 8 a 12 horas, la fase
máxima o estacionaria de 12 a 19 horas, mientras que la fase de muerte se presenta de 20 horas en
adelante. Estas cepas comparadas con la cepa guía (Streptococcus y Lactobacillus bulgaris) marca una
diferencia en la fase estacionaria dando como resultado esta de 20 horas a 25 horas dejando a la fase de
muerte después de las 25 horas.
Para la cepa de Lactobacillus casei se necesitan alrededor de 40 horas para observar el comportamiento
completo ( Stramer, 2006).
La acidez, determinada como cantidad de acido láctico durante el proceso de fermentación se muestra
en las figuras de la 15 a la 17.
Figura 16. Aumento del porcentaje de acido láctico
Figura 17.Porcentaje de acido láctico de las cepas aisladas
38
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40
%A
cid
o la
ctic
o
Tiempo (horas)
Strepto- lactobacillus
Lactobacillus casei shirota
6
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
0 5 10 15 20 25 30 35
ph
Tiempo (horas)
Cepa 1 Tuxtla
Cepa 1 Carranza
Cepa 2 Tuxtla
Cepa 2 Carranza
La cantidad de acido láctico producido durante el crecimiento de las bacterias acido lácticas es
correspondiente a la biomasa producida en el lapso de 30 horas. Se observa que en la cepa control
hubo una producción máxima de 0.765% de acido láctico; de las cepas aisladas las que tuvieron
mejor producción de acido láctico fueron: Cepa 2 (Pozol blanco Carranza) y cepa 5 (pozol de
cacao Tuxtla), con una producción de 0.28% y 0.32% respectivamente.
La variación de pH durante la fermentación se muestra en las figuras 18 y 19.
Figura 19. Disminución de pH durante la fermentación
Figura 18. Porcentaje de acido láctico de la cepa control y lactobacillus casei.
39
5.9
6
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
0 10 20 30 40
ph
Tiempo (horas)
Cepa 3 Tuxtla
Cepa 3 Carranza
Cepa 4 Tuxtla
Cepa 4 Carranza
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20 25 30 35
ph
Tiempo (horas)
Strepto-Lactobacillus
Lactobacillus casei shirota
Figura 20. Disminución de pH durante la fermentación
Figura 21. Disminución de pH de la cepa control.
La disminución de pH, como se observa, está relacionado con la producción de acido láctico, a
mayor producción de acido láctica mayor disminución de pH. Si hay mayor producción de pH
entonces la proliferación de bacterias patógenas será menor, debido a que no son resistentes a los
cambios de pH.
Los parámetros cinéticos de las diferentes cepas evaluadas se describen en la tabla 5.
40
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 5 10 15 20 25 30 35
g/l
Horas
Cepa 1 Tuxtla
cepa 2 Carranza
Cepa 3 Tuxtla
Cepa 4 Carranza
Tabla 7. Resultados de los parámetros cinéticos.
Cepa Velocidad de crecimiento
(h-1)
Tiempo de duplicación (h)
BA1 Tuxtla 0.0523 13.127
BA2 Carranza 0.044 15.611
BR1 Tuxtla 0.0311 22.87
BR2 Carranza 0.0571 12.13
CA1 Tuxtla 0.0464 14.930
CA2 Carranza 0.0582 11.90
CR1 Tuxtla 0.0233 29.74
CR2 Carranza 0.0812 18.53
ST 0.0419 16.54
YK 0.0623 11.12
En la tabla anterior se muestran la velocidad de crecimiento de cada cepa usada, al igual que el
tiempo de duplicación; con lo cual podemos decir que el mejor comportamiento son las cepas de
pozol blanco a temperatura ambiente y las cepas de pozol de cacao a temperatura ambiente; con
este criterio se procedió a realizar la cinética en suero lácteo, se muestra en la figura 19 y figura
20.
Figura 22. Cinética microbiana en suero lácteo.
41
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 10 20 30 40
g/l
Horas
Streptococcus- Lactobacillus
Lactobacillus casei
4
4.2
4.4
4.6
4.8
5
5.2
0 5 10 15 20 25 30 35
pH
Horas
Cepa 1 Tuxtla
Cepa 2 Carranza
Cepa 3 Tuxtla
Cepa 4 Carranza
Figura 23. Cinética microbiana en suero lácteo de las cepas control
Se observa en las figuras anteriores (19 y 20) la fase exponencial o de crecimiento comienza
desde las 10 horas, mientras que la fase de muerte entre las 20 y 25 horas.
La variación de pH durante la fermentación se muestra en las figuras 18 y 19.
Figura 24. Disminución de pH de las cepas seleccionadas
42
4
4.2
4.4
4.6
4.8
5
5.2
0 10 20 30 40
pH
Horas
Lactobacillus casei
Streptococcus-Lactobacillus
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 10 20 30 40
g/l
Horas
Lactobacillus casei
Streptococcus-Lactobacillus
Figura 25. Disminución de pH de cepas control
Figura 26. Aumento de porcentaje de acidez de las bacterias acido lácticas
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 5 10 15 20 25 30 35
g/l
Horas
Cepa 1 Tuxtla
Cepa 2 Carranza
Cepa 3 Tuxtla
Cepa 4 Carranza
43
La disminución de pH, como se observa, está relacionado con la producción de acido láctico, a
mayor producción de acido láctica mayor disminución de pH. Si hay mayor producción de pH
entonces la proliferación de bacterias patógenas será menor, debido a que no son resistentes a los
cambios de pH.
Los parámetros cinéticos de las diferentes cepas evaluadas se describen en la tabla 6.
Tabla 8. Parámetros cinéticos de las cepas seleccionadas
Cepa Velocidad de crecimiento
(h-1)
Tiempo de duplicación (h)
BA1 0.0597 11.6501
BA2 0.0543 12.7651
CA1 0.0695 9.97334073
CA2 0.0367 18.8868442
Streptococcus - Lactobacillus 0.0584 11.8689586
Lactobacillus casei 0.09 7.70163534
Prueba de probióticos invitro.
a) Tolerancia a cambio de pH
De las cepas evaluadas solo 2: Cepa blanco ambiente y cacao ambiente ; resistieron la mayoría de
los cambios de pH durante 24 hrs, aunque se evidencio una disminución porcentual de
crecimiento en las 4 cepas. Sin embargo a pH= 4, se presentó mayor porcentaje de crecimiento
entre las cepas aisladas de pozol blanco y de cacao lo cual indica la supervivencia en condiciones
de acidez; mientras que a pH= 5,6 disminuyo un poco pero también se mantuvo estable el
crecimiento (Tabla 7); por lo tanto estas cepas fueron seleccionadas para realizar las pruebas de
resistencia a sales biliares.
Tabla 9. Porcentaje de tolerancia a pH de las cepas seleccionadas
pH 4 5 6
CEPA BA % 55 88 95
CEPA CA % 55 80 90
CEPA BR % 15 20 80
CEPA CR % 10 15 40
Los lactobacillus son generalmente más resistentes a las condiciones ácidas que otras bacterias
lácticas, siendo capaces de crecer hasta un pH de 4, esta resistencia les permite seguir creciendo
durante las fermentaciones lácticas naturales, aún cuando el pH haya caído tanto, que otras
bacterias lácticas ya no puedan crecer (Chamba et al., 1994).
b) Tolerancia de sales biliares
44
0
100
200
300
400
500
600
0.05 0.1 0.15 0.3 U
FC (
1x1
05
) Concentracion de sales biliares(%)
CA
0
20
40
60
80
100
120
0.05 0.1 0.15 0.3
UFC
(1
x10
5)
Concentracion de sales biliares(%)
BR
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0.05 0.1 0.15 0.3
UFC
(1
x10
5)
Concentracion de sales biliares(%)
CR
Se observó que las cepas seleccionadas son capace de tolerar el rango de las concentraciones de
sales biliares experimentadas como se observa en la figura _; estadísticamente en las cepas
seleccionadas se presenta un efecto significativo en el crecimiento a medida que aumenta la
concentración de sales biliares. De acuerdo a los resultados obtenidos se puede decir , que las
cepas seleccionadas nativas son microorganismos capaces de sobrevivir a concentraciones de
sales biliares desde 0.05% hasta 0.3% (p/v).
Figura 27. Resistencia a sales biliares
Las bacterias ácido lácticas del género Lactobacillus, son capaces de producir la enzima conocida
como sal biliar hidrolasa (SBH), que cataliza la hidrólisis de las sales biliares conjugadas con
glicina y taurina. Esta desconjugación pudiera ocurrir en la fase estacionaria del crecimiento
bacteriano, ya que la actividad de la SBH se incrementa al disminuir el pH por producción de
gran cantidad de ácidos orgánicos. Las diferencias en la tolerancia al tránsito gastrointestinal
también pueden deberse a las diferencias existentes en la estructura de la pared celular de las
distintas especies y géneros bacterianos (Dellagio et al., 1994).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0.05 0.1 0.15 0.3
UFC
(1
x10
5)
Concentracion de sales biliares(%)
BA
45
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
28 37 43
UFC
(1
x10
5)
Temperatura (°C)
BA
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
28 37 43 U
FC (
1x1
05
)
Temperatura (°C)
CA
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
28 37 43
UFC
(1
x10
5)
Temperatura (°C)
BR
0
0.5
1
1.5
2
2.5
28 37 43
UFC
(1
x10
5)
Temperatura (°C)
CR
c) Tolerancia a cambios de temperatura
La mayoría de las cepas seleccionadas toleraron las temperaturas de 28, 37 y 43 °C durante 24
hora; estadísticamente hay diferencia significativa, lo cual evidencia el efecto de la temperatura
sobre el crecimiento de cada una de las cepas; la temperatura de 37°C fue la que mostro mejores
resultados para las cepas seleccionadas, a 43°C hubó crecimiento óptimo de las cepas BA y CA
como se muestra en la figura 25.
Figura 28. Resistencia a cambios de temperatura
La temperatura es uno de los factores más importantes que afectan al crecimiento y supervivencia
de los microorganismos, varía entre los diferentes géneros y reflejan el rango de temperatura
óptima de su habitad natural; a medida que se eleva la temperatura, las reacciones químicas y
enzimáticas son más rápidas y el crecimiento se acelera, hasta el punto en que tienen lugar las
reacciones de inactivación (Dellagio et al., 1994).
d) Tolerancia a altas concentraciones de NaCl
Se observó que a mayor concentración de NaCl existe un efecto significativo en el crecimiento de
las cepas; siendo notable el crecimiento en 2 y 4% y muy bajo al 7% y 10% p/v de NaCl (Figura
27).
46
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
2 4 7 10
UFC
(1
x10
5)
Porcentaje de NaCl
BA
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
2 4 7 10
UFC
(1
x10
5)
Porcentaje de NaCl
CA
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
2 4 7 10
UFC
(1
x10
5)
Porcentaje de NaCl
BR
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
2 4 7 10
UFC
(1
x10
5)
Porcentaje de NaCl
CR
Figura 29. Resistencia a diferentes concentraciones de NaCl.
La mayoría de las bacterias son relativamente insensibles a las variaciones de la presión
osmótica, y se adaptan a cambios fuertes en la concentración de solutos del medio, porque poseen
una pared celular mecánicamente rígida. Basados en lo anterior, se deduce que las cepas nativas
tienen cierta capacidad de acondicionarse ante determinadas concentraciones de sales, siendo 7%
la máxima condición de salinidad tolerada hipertónicamente.
e) Prueba de antagonismo
La prueba de antagonismo frente al patógeno, demostró que la cepas CR y BR no producen
sustancias antimicrobianas que puedan difundirse al medio y sean capaces de contrarrestar in
vitro el crecimiento de los patógenos evaluados.
Las cepas CA y BA si produjo halos de inhibición de 1mm frente al patógeno, lo cual pueden
deberse a la producción de sustancias inhibitorias; se ha reportado que este género se caracteriza
por la producción de bacteriocinas además del ácido láctico (Dellagio et al; 1994).
f) Prueba de crecimiento
Las pruebas de crecimiento se realizaron anteriormente en las cinéticas de crecimiento dando un
resultado de colonias mayor a 106
UFC/ml.
47
Elaboración de la bebida (Bromatología)
De acuerdo a la NOM-155-SCFI- 2002 se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 8):
Tabla 10. Bromatología de la bebida elaborada.
Características Suero de queso Cepa pozol
cacao Cepa pozol
blanco Lactobacillus
casei
Acidez% 0.18+- 0.1 0.57 0.6 0.6
pH 6+- 0.01 4.8 4.5 4.3
Lactosa % 4.7 1.375 1.11764706 1.21686747
Sólidos totales 6.4 17.80754393 12.7334542 17.9821429
Proteína 14.6 15.9 15.5 15.1
Densidad 1.025 1.028 1.028 1.028
Grasa 1.2 1.67011798 18.2827869 18.1249758
De acuerdo a la norma anterior podemos compara las características obtenidas con el apartado 7.7
(NOM-155-SCFI-2002) como se muestra en la tabla 9:
Tabla 11. Especificaciones de producto lácteo combinado
Especificaciones Producto lácteo
Proteínas propias 15 mín.
Grasa Lo declarado en la etiqueta
Análisis microbiológicos.
Tabla 12. Resultados de los análisis microbiológicos
De acuerdo a las Normas Oficiales mexicanas la bebida es aceptable debido a que no hubo
presencia de Sthaphylococcus aureus, la cual es la bacteria patógena importante.
Bebida elaborada con Lactobacillus
casei
Mohos y levaduras <10 ufc/g
Coliformes totales 0 ufc/g
Sthaphylococcus 0 ufc/g
Bebida elaborada con cepa de BAL de
pozol blanco
Mohos y levaduras <10 ufc/g
Coliformes totales 10 ufc/g
Sthaphylococcus 0 ufc/g
Bebida elaborada con cepa de BAL de
pozol de cacao
Mohos y levaduras <10 ufc/g
Coliformes totales 10 ufc/g
Sthaphylococcus 0 ufc/g
48
CAPITULO X
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Entre los medios de cultivo ensayados para el aislamiento de bacterias acido lácticas a
partir del pozol blanco y pozol de cacao, el de elección es MRS pH 6,8.
La fermentación de las masas de pozol durante 9 días en hojas de plátano dio resultados
positivos en el crecimiento de BAL.
El mayor crecimiento en leche de BAL se encontraron en las masas de pozol blanco y
pozol de cacao fermentadas a temperatura ambiente (28 °C).
La mejor inhibición a la proliferación de otras bacterias se observa en las cepas cuyo pH
fue de 5 a 5.5 debido al bajo pH.
Las pruebas bioquímicas en las colonias del atole de maíz fueron negativos debido a que
fue elaborado de manera muy artesanal sin cuidado de su fermentación y su posible
adición de cal.
Las cepas probioticas para la elaboración de la bebida deben de resistir pH menores a 5, al
igual que una concentración (máxima 7%) de NaCl; sobre todo su resistencia a sales
biliares, ya que el cuerpo humano contiene estos componentes mencionados. Deben de
tener el efecto antagonico con las bacterias patógenas debido a la producción de ácido
láctico y por ende la reducción del pH.
El suero lácteo dulce, derivado de la producción del queso fresco, es un vehículo
adecuado para la supervivcencia de bacterias ácido lácticas, pues permite mantener una
población superior a los 106 UFC/ml. La lactosa de la muestra analizada disminuye un
0.6-0.7 % en el proceso de la fermentación.
La pasteurización lenta (63°C por 30 min) fue adecuada para obtener una mejor calidad
en la bebida realizada, al igual que la adición de la mermelada.
En el transcurso del proyecto se observaron algunos detalles que son de gran importancia para el
tipo de estudio que se realizo, a continuación haremos mención de estos:
Para una mejor interpretación de resultados es importante realizar las pruebas de
fermentación en caldo MRS, al igual que la realización de la prueba API 50 CHL.
Tener una campana de extracción para la realización de la prueba antagónica.
Realizar un estudio sensorial para la aceptación de la bebida al público en general
49
CAPITULO XI
BIBLIOGRAFIA
A
Abee K., Takahashi S., Yamada T. (1982). Involvement of oxygen-sensitive pyruvate formate
lyase in mixed acid fermentation by Streptococcus mutans under strictly anaerobic conditions.
New York: Journal of Bacteriology. Pag. 175-182.
Ávila, J., Ávila, M., Tovar, B., Brizuela, M., Perazzo & Hernández, H. (2010). Capacidad
probiótica de cepas del género Lactobacillus extraídas del tracto intestinal de animales de granja.
Revista Científica Universidad de Zulia-Venezuela, 20(2),161-169.
B
Barron, L. J. R., Redondo, Y., Flanagan, C. E., Pérez-Elortondo, F. J., Albisu, M.; Nájera, A. I.,
Renovales, M. & Fernández-García, E. (2005). Comparison of the volatile composition and
sensory characteristics of Spanish PDO cheeses manufactured from ewes’ raw milk and animal
rennet. EEUU: International Dairy Journal 15, 371-382.
Barros, Cristina. (2011). Pozol, popo, champurrado, México: Revista digital universitaria, 2-18.
Ben Omar, N. & Ampe, F. (2000). Microbial community dynamics during production of the
Mexican fermented maize dough pozol. EEUU: Appl Environ Microbiol, 5-10.
Bridson. (1998). Manual Oxoid. England:OXOID.
Brizuela, M. (2003). Selección de cepas de bacterias ácido lácticas para la obtención de un
preparado con propiedades probióticas y su evaluación en cerdos. Tesis Doctoral. ICIDCA,
Cuba. p.101.
C
CARDONA, G. (2007). Delicias Vegetarianas de México. México: Editorial PAX.
Chamba, J. F., Duong, C., Fazel, A. & Prost, F. (1994). Selección de bacterias lácticas. H. de
Roissart y F. M. Luquet, 499-521.
Champagne, C.P. (1998). Efectos de la penicilina en leche acidificada y antibiótico residual.
México: J. Food Prot., 1636 -1643.
Chukeatirote E. (2003). Potential use of probiotics. Songklanakarin Journal of Science
Technology. New York, 275-282.
Cogan, T.M. & Jordan, K.N. (1994). Metabolism of Leuconostoc bacteria. J. Dairy Sci.
Corthier, C.. (2004). Los beneficios de los probióticos para la salud. México, Danone Vitapole
Nutritopics, 1-14.
Cruz Pio, L.E. (2011). Caracterizacion probiótica de una cepa nativa, aislada de queso de
elaboración artesanal. (Tesis inédita). Universidad Nacional Mayor de San Marcos.Perú.
50
D
Dellaglio, F., de Roissard, H., Torriani, S., Curk, M. C. & Janssens, D. (1994). Caractériscas
genérales de bactérias lacticas. Francia : F. M.
Diaz, G., Ruiz, F., Morlon-Ouyot, J.& Wacher, C. (1999). Diversidad de bacterias amilolíticas
del Pozol. Memorias del VIII Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería/ IV Congreso
Latinoamericano de Biotecnología y Bioingeniería.
E
Escamilla, M., & Escamilla, M. G. (2007). Los alimentos fermentados que comían nuestros
abuelos. Revista de la Academia Mexicana de la Ciencia, 58(2), 75-84.
F
Felley, C.P., Corthesy-Theulaz, I., Rivero , J.L., Sipponene P., Kaufmann B.P., Wiesel P.H.,
Brassart D., Pfeifer A., Blum A.L. & Michetti P. (2001). Favourable effect of acidified milk on
Helicobacter gastritis in man. European Journal of Gastroenterology and Hepatology. EE UU,
25-29.
Fordyce, A. M., Crow, V. L. & Thomas, T. D. (1984). Regulation and product formation during
glucose or lactose limitation in non-growing cells of Streptococcus lactis. Applied and
Environmental Microbiology, 48, 332-337.
Frazier, W.C. & Wethoff, D.C. (1993). Microbiología de los alimentos. México: Ed. Acribia.
G
Guerrero A. (1997). Atlas de México. México: Instituto Cultural de Aguascalientes.
Gibson, G. R.(2004). From probiotics to prebiotics and a healthy digestive system. J. Food Sci.,
69 (5), M141-M143.
Grant, C. & Salminen, S.(1998). The potential of Propionibacterium spp. as probiotics. En: Lactic
acid bacteria: microbiology and functional aspects. New York, EE UU: Salminen, S., von Wright,
A.
I
INCB (1993). Manual INCB. New york: United Nation Office, 1993.
K
Klaenhammer, T. R. (1988) . Bacteriocins of lactic acid bacteria. New York: Biochimie, 337-349.
Kociubinskik, G., Pérez, P. & De Antoni, G. (1999). Screening of bile resistance and bile of
precipitation in lactic acid bacteria and bifidobacteria. Journal of Food Protection, 62, 905- 912.
L
Laurencio, M., Pérez, M., Piad, R., Milián, G., Rondón, A. J., Amigo, S., Bocourt, R., Savón, L.
& Díaz, M. (2002). Determinación del contenido de bacterias ácido lácticas y Bacillus del tracto
51
gastrointestinal de pollos de ceba y obtención de una mezcla de Exclusión Competitiva. Rev.
Cubana Ciencia Avícola, 26, 17-22.
Leiva, S., M. Yañez, L. Zaror, H. Rodríguez & H. García-Quintana. (2004). Actividad
antimicrobiana de Actinomycetales aislados desde ambientes acuáticos de sur de Chile. Rev.
Med. Chile, 132, 151-159.
Lindgren, S. E. & Dobrogosz, W. J. (1990). Actividades antagónicas de bacterias acido lácticas
en alimentos fermentados. México: FEMS Microbiology Review, 149-164.
M
Marilley, L. & Casey, M. G.(2004). Flavours of cheese products: metabolic pathways, analytical
tools and identification of producing strains. EEUU: International Journal of Food Microbiology,
90, 139-159.
O
Owens, D. (1993). Alimentos fermentados tradicionales: Generalidades y perspectivas en
Alimentos Fermentados Indígenas de México. UNAM.
P
Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para
alimentos y bebidas. Madrid, España: Ed. Díaz de Santos.
Peech, M . (1965). Hydrogen ion activity, Methods of Soil Analysis, Part 2.New York: In C.A.
Black.
Piard, J.C.; Desmazeaud, M. (1991). Factores de inhibición de las bacterias acido lácticas y
catabolismo de productos terminados.México: Edit. PAX, 525- 541.
Poolman, B. (1993). Energy transduction in lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Reviews 12,
125-148.
R
Reid G. (2008). How science will help shape future clinical applications of probiotics. Clinical
Infectious Diseases, 10(3), 35-46.
Rondón, A. J., Samaniego, L. M., Bocourt, R., Rodríguez, S., Milián, G., Ranilla, M. J.,
Laurencio, M. & Pérez, M. (2008). Aislamiento, identificación y caracterización parcial de las
propiedades probióticas de cepas de lactobacillus sp. Procedentes del tracto gastrointestinal de
pollos de ceba. Rev.Somenta, 6(1), 56-63.
Rubio M, A., Hernández E, M., Aguirre R, A. & Poutou P.R. (2008). Identificación preliminar in
vitro de propiedades probióticas en cepas de S. cerevisiae .Revista MVZ Córdoba, 13 (1), 1157-
1169.
S
Santamaría, Francisco J. (1992). Diccionario de mexicanismos. México: Editorial Porrúa, 350.
52
Serrano, L. & González A. (1999). Industrialización de una bebida fermentada a partir del maíz.
Universidad Autónoma de México, 18-20.
Stamer, M. E.(1997). Taxonomía de bacterias acido lácticas. USA: Food microbiol, 13(2).
Stanton, C., Ross, P., Fitzgerald, G. F. & Van Sinceren, D. (2005). Fermented functional foods
based on probiotics and their biogenic metabolites. EEUU: Curr. Opin. Biotech, 198-203.
T
Thomas, T. D., Ellwood, D. C. & Longyear, V. M. C. (1979). Change from homo- to heterolactic
fermentation by Streptococcus lactis resulting from glucose limitation in anaerobic chemostat
cultures. Journal of Bacteriology ,138, 109-117.
Thomas, T. D. & Pritchard, G. G. (1987). Proteolytic enzymes of dairy starter cultures. EEUU:
FEMS Microbiology Reviews, 46, 245-268.
U
Ulloa M., Herrera T. & Lappe P.(1987). Fermentaciones tradicionales indígenas de México. INI.
Serie de investigaciones sociales, 16, 77.
Z
Zavaglia, A. G., Kociubinski, G., Pérez, P. & De Antoni, G. (1998). Isolation and
characterization of Bifidobacterium strains for probiotic formulation. EEUU: Journal Food
Protectio, 865-873.
CAPITULO X. ANEXOS
53
PH-metro (Calibración del instrumento).
Prender el instrumento y dejarlo calentar por unos minutos. Tomar la temperatura de las
soluciones y ajustar el control manual a este valor.
Insertar los o el electrodo combinado en una de las soluciones tampón y cambiar el interruptor
para leer pH. Ajustar el control de estandarización hasta que la aguja marque el pH
correspondiente.
Pase a “neutral”.
Remueva el electrodo, lávelos con agua destilada, séquelos con papel (toallin) y colóquelos
dentro de un pequeño beaker que contiene un poco de la segunda solución de calibración. Cambie
botón a “pH” y si la aguja no coincide exactamente con el segundo pH ajuste el control de
pendiente (“Slope”) hasta que se obtiene la lectura correcta.
Pase a “neutral”, remueva los electrodos, enjuáguelos con agua destilada, séquelos, colóquelos en
la primera solución tampón y confirme la lectura correcta; si no repita el proceso de calibración.
Medición de acidez
Mida 10 ml de la muestra, después páselo a un vaso de precipitado de 50 ml. Sigue la medición
directa del potencial de hidrogeno.
Al final lavar los electrodos, entre una determinación y otra determinación. (PEECH, 1995)
Sustancias para determinación de acidez.
La solución de etanol al 70% (v/v), se prepara así:
Medir con una pipeta 730 mls de alcohol de 96°
Medir 270 mls de agua destilada
Mezclar los dos líquidos
La solución de fenolftaleína al 0,01 % (m/v) en etanol al 70% (v/v) se prepara así:
Pesar 1 gramos de fenolftaleina
Colocarlos en un recipiente limpio y seco
Agregar alcohol al 70% hasta completar 100 ml
Disolver perfectamente
Tomar 1 ml de esa solución y agregar 9 ml de alcohol
Tomar 1 ml de esa solución y completar con alcohol hasta 100 ml
Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 N
54
El hidróxido de sodio es llamado vulgarmente soda caústica, Es un cuerpo sólido, blanco, muy
soluble en agua y en alcohol. Es una base muy enérgica y corrosiva de las sustancias orgánicas.
Se emplea en la fabricación de jabones duros, del vidrio, en la obtención de colorantes.
Para preparar la solución de hidróxido de sodio se procede así
a. Pesar 4 gr de NaOH, reactivo puro (en perlas)
b. Colocarlos en un recipiente limpio y seco.
c. Agregar agua destilada para disolverlo hasta completar un litro.
Colonias comunes de bacterias acido lácticas
Colonias BAL
Prueba de antagonismo
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Cepa BAL proveniente del pozol blanco
Cepa BAL proveniente del pozol cacao