instituto politÉcnico nacional...el presente trabajo se llevó a cabo en el departamento de...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos Departamento de Biotecnología
CULTIVO in vitro DE Jatropha curcas PARA LA OBTENCIÓN DE CURCINA
TESIS
Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos
PRESENTA
Melissa Eugenia Guadalupe Bermejo Cruz
Directores de tesis Dra. Silvia Evangelista Lozano
Dra. Alma Leticia Martínez Ayala
Yautepec de Zaragoza, Morelos; Noviembre 2010
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El presente trabajo se llevó a cabo en el Departamento de Biotecnología del Centro
de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la
dirección de la Dra. Silvia Evangelista Lozano y Dra. Alma Leticia Martínez Ayala. Así
también parte de este trabajo se desarrollo en el Laboratorio de Cultivo de Células y
Tejidos Vegetales, Proteínas y Laboratorio del Centro de Investigación en
Biotecnología Aplicada. La investigación fue realizada con el financiamiento
económico de de la beca CONACYT (registro: 267716), la Secretaría de
Investigación y Posgrado del Instituto Politécnico Nacional (SIP) con el proyecto:
Propagación ex e in vitro y respuesta a fertilización de plantas con importancia
económica: ornamental, frutícola e industrial (2010-0024) y por el Consejo Nacional
de Ciencia y Tecnología con el proyecto: Diversidad de Jatropha curcas L.
Conservación y propagación (71480).
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AGRADECIMIENTOS
Mi más sincero agradecimiento a mis directoras de tesis, Dra. Silvia Evangelista Lozano y Dra. Alma
Leticia Martínez Ayala por su apoyo, confianza, paciencia y orientación para la elaboración del
trabajo de tesis y de investigación. Gracias por creer en mí.
A los integrantes de mi comité evaluador, M. en B. Ada María Ríos Cortés, Dra. Martha L. Arenas
Ocampo, Dra. Edith Agama Acevedo y Dr. Antonio Jiménez Aparicio por toda su orientación y apoyo
en la revisión de este trabajo.
A la Lic. en Nut. Antonia De Jesús Sánchez y Lic. en Nut.. Sandra Luz Escobar por su orientación en
las técnicas de cultivo in vitro y su amistad.
Al M. en C. Roberto Briones Martínez por su apoyo en el fraccionamiento de proteínas, así como a la
M. en C. Isabel Cortés Vázquez, por haberme permitido trabajar en el laboratorio de Enzimas
vegetales.
Al Dr. Andrés Cruz Hernández por su apoyo y orientación en las técnicas de electroforesis
desnaturalizante de proteínas, al igual que a la Dra. Alma Angélica del Villar por permitirme trabajar en
el laboratorio de Biología Molecular.
A Rita Martínez y María Luisa Corona su amistad y colaboración durante la estancia en el CEPROBI.
Al Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CEPROBI) y Centro de Investigación en Biotecnología
Aplicada (CIBA), por abrirme las puertas de sus instalaciones y permitir realizar la Maestría.
A amigos y compañeros Maribel, Jann, Eva, Erika, Fandy, Lupita, Dulce, Lety, Carmen, Argelia, Edith,
Raúl, César, Carlos, Jorge, Chayito, Karo, Nadia, Jaime, Humberto, Gilberto, Cuauhtemoc, Paul,
Jacqueline, Janette, Ray, Margarito, Mónica Hernández, Isra, Vero R., Mario, Fer, Gus, Ricardo, Viri,
Emmanuel Lupita Salcedo, Elvirita, Yemi, Maricela, Don Gil, Tessy.
A la Lic. Elvia Sosa, Vanessa Yanez, Sarita Bahena, personal de informática y biblioteca y UTEC, por
las atenciones brindadas durante la Maestría.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo recibido como becario y a los
proyectos SIP 2010-0024: Propagación ex e in vitro y respuesta a fertilización de plantas con
importancia económica: ornamental, frutícola e industrial y CONACYT-CONAFOR: Diversidad de
Jatropha curcas L. Conservación y Propagación (71480).
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DEDICATORIAS
A DIOS Por ser mí apoyo espiritual en todo momento
A QUIENES ESTÁN SIEMPRE CONMIGO A PESAR DE LA DISTANCIA
MIS PADRES Por darme alas y enseñarme a usarlas
Por su amor, entrega, confianza, paciencia, consejos y sacrificios
YAYO Y PI Por ser mí apoyo… porque juntos hemos hecho de cada paso lo mejor de lo
vivido
MARIANA Y DOMINIKA Ustedes son mi alegría… mi motor…!!
MIS ABUELITOS, TÍOS Y PRIMOS
A MIS AMIGOS
MARIBEL Por las mejores horas del té y felices no cumpleaños… TQM Mary!!
ASOCIACIÓN VIPERINA, A.C., ASOCIADOS Y NO ASOCIADOS
KARO, NADYS, JANN, KARY, VERO P., OSCAR, SAÚL, CARLOS, LETY,
MICH, YADIS, JAIME, DULCINEA, LAU, CHAYIS, LUIS Por su amistad, apoyo, confianza, consejos, cariño, risas, llantos y todos los
momentos que compartimos… porque más que amigos hicimos una familia..!!
YASSER Y SANTI Por sus palabras de ánimo y consejos
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i
Resumen
La curcina es una proteína inactivadora de ribosomas tipo I con interés farmacéutico
por su actividad antitumoral. Este metabolito ha sido aislado de forma ex vitro en
semilla, hoja y tallo de Jatropha curcas L. de genotipos tóxicos y no tóxicos, mientras
que en material cultivado in vitro no ha sido reportada. La propagación de J. curcas
mediante cultivo de células y tejidos vegetales representa una alternativa para la
obtención de esta proteína. Por lo que el objetivo de este trabajo fue establecer las
condiciones in vitro para la inducción de brotes y callos, así como identificar la
presencia de curcina en el material in vitro obtenido. Se estableció un sistema de
desinfestación de explantes de segmentos nodales de tallo con solución jabonosa,
tween 20 al 1% e hipoclorito de sodio al 1%. El cultivo in vitro se estableció en medio
semisólido de Murashige y Skoog (MS) con AIB (0, 0.1, 0.25 y 0.5 mg·L-1) combinado
con BAP (0, 0.1, 0.25 y 0.5mg·L-1), con lo que se obtuvo callos friables en el
tratamiento AIB 0.5 mg·L-1 + BAP 0.25 mg·L-1 a los 21 días de incubación en el 100%
de los explantes. La brotación se presentó en todos los tratamientos, obteniéndose
plántulas completas y brotes múltiples, siendo el mejor AIB (0.1, 0.5 mg·L-1 + BAP
0.25 mg·L-1). Se evaluó la cinética de crecimiento celular del callo resultando un
tiempo de duplicación celular de 6.64 días y una velocidad específica de crecimiento
de 0.151 d-1. Se prepararon extractos de las muestras en búfer salino de fosfatos a
pH 7.2, los cuales fueron fraccionados por cromatografía de exclusión molecular. Los
perfiles de elución molecular de los extractos mostraron dos picos para los extractos
de plántulas in vitro y tres picos para los de callo. De las fracciones resultantes, así
como de los extractos crudos de material in vitro se cuantificó la concentración de
proteína cruda por el método del ácido bicinconínico. De estas fracciones y extractos
crudos se realizaron los perfiles electroforéticos para identificar bandas de 28-32 kDa
las cuales podrían corresponder a la curcina.
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ii
Abstract
The curcin is a ribosome inactivating protein type I with pharmaceutical interest for its
antitumor activity. This metabolite has been isolated in seed, leaf and stem of
Jatropha curcas L. of toxic and nontoxic genotypes, while in vitro material has not
been reported. The propagation of J curcas using cell and plant tissue culture is an
alternative for the production of this protein. So the aim of this study was to
establishment in vitro conditions for induction of shoots and callus, and identify the
presence of curcin in the material obtained in vitro. A system for disinfecting stem
nodal explants with soap solution, 1% Tween 20 and sodium hypochlorite 1%. In vitro
culture was established in semisolid Murashige and Skoog (MS) with IBA (0, 0.1, 0.25
and 0.5 mg·L-1) combined with BAP (0, 0.1, 0.25 and 0.5 mg·L-1). Friable callus were
obtained in the treatments IBA 0.5 mg·L-1+ BAP 0.25 mg·L-1at 21 days of incubation
in 100% of the explants. Sprouting occurred in all treatments, obtaining seedlings and
shoot multiplication, being the best AIB (0.1, 0.5 mg·L-1+ BAP 0.25 mg·L-1). Cell
growth kinetics of callus was evaluated, resulting a cell doubling time of 6.64 days
and a specific growth rate of 0.151 d-1. Extracts from samples were prepared in
phosphate buffer saline at pH 7.2, which were fractionated by size exclusion
chromatography. Were obtained two peaks for the extracts of seedlings in vitro and
three peaks for callus. From the resulting fractions and extracts of material in vitro
was quantified the crude protein concentration by bicinchoninic acid method. Of these
fractions and crude extracts were performed electrophoretic profiles to identify bands
of 28-32 kDa which could correspond to the curcin.
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iii
ÍNDICE
Resumen ....................................................................................................................... i
Abstract ........................................................................................................................ ii
ÍNDICE ........................................................................................................................ iii
ÍNDICE DE CUADROS ................................................................................................ v
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. vi
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOGÍA ........................................................... viii
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1
2. REVISIÓN DE LA LITERATURA ............................................................................. 3
2.1. Planta en estudio, Jatropha curcas L. ............................................................... 3
2.2. Clasificación taxonómica y botánica ................................................................. 4
2.3. Proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs) ................................................... 5
2.3.1. Clasificación y mecanismo de acción de las proteínas inactivadoras de ribosomas ............................................................................................................. 6
2.4. Importancia farmacéutica de la curcina y otras RIPs de obtenidas de diversas
plantas ..................................................................................................................... 9
2.5. Cultivos de células y tejidos vegetales ............................................................ 11
2.5.1. Reguladores de crecimiento vegetal ........................................................ 13
2.5.2. Obtención de brotes y callos .................................................................... 14
2.6. Métodos de análisis de las proteínas inactivadoras de ribosomas ................. 15
2.6.1. Métodos de separación y purificación de las proteínas inactivadoras de ribosomas ........................................................................................................... 16
2.6.2. Cuantificación de las proteínas inactivadoras de ribosomas .................... 17
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 19
4. OBJETIVOS .......................................................................................................... 20
4.1. Objetivo general .............................................................................................. 20
4.2. Objetivos particulares ..................................................................................... 20
5. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 21
5.1. Obtención de material biológico ...................................................................... 21
5.2. Desinfestación de explantes ........................................................................... 22
5.3. Medio de cultivo .............................................................................................. 23
5.4. Inducción de brotes y callo ............................................................................. 23
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iv
5.5. Cinética de crecimiento y tamaño de los callos .............................................. 25
5.6. Obtención de extractos y de las fracciones proteicas ..................................... 26
5.7. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico ................. 27
5.8. Identificación de pesos moleculares de las proteínas por SDS-PAGE ........... 29
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 31
6.1. Establecimiento del cultivo in vitro de J. curcas .............................................. 31
6.1.1. Inducción de brotes .................................................................................. 31
6.1.2. Inducción de callo..................................................................................... 35
6.1.3. Cinética de crecimiento y aumento de tamaño de las células desdiferenciadas ................................................................................................ 39
6.2. Obtención de extractos y fracciones proteicas ............................................... 44
6.3. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico ................. 49
6.4. Electroforesis de los extractos y fracciones proteicas de J. curcas ................ 50
7. CONCLUSIONES .................................................................................................. 53
8. PERSPECTIVAS ................................................................................................... 54
9. LITERATURA CITADA .......................................................................................... 55
ANEXOS ................................................................................................................... 60
ANEXO 1. Solución fungicida aplicada a las plantas de Jatropha curcas en
invernadero ............................................................................................................ 60
ANEXO 2. Ficha técnica del Agromil PLUS® ........................................................ 61
ANEXO 3. Ficha técnica del hipoclorito de sodio ................................................... 62
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ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Descripción taxonómica de la planta Jatropha curcas L 4
Cuadro 2. Clasificación y abreviaturas de los RCV 14
Cuadro 3. Simbología para identificación del tamaño, consistencia
y color del callo
24
Cuadro 4. Recta de estándares de BSA 28
Cuadro 5. Número de brotes inducidos por explante en cada tratamiento 33
Cuadro 6. Características de los callos en los diferentes tratamientos 36
Cuadro 7. Concentración de proteína en los extractos y fracciones 49
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vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Clasificación de las RIPs según su estructura 7
Figura 2. Sitio de ruptura de las RIPs en el dominio S/R universal
conservado
9
Figura 3. Diagrama experimental para el establecimiento de cultivo in
vitro de J. curcas.
22
Figura 4. Explantes bajo condiciones controladas en cámara de cultivo 24
Figura 5. Diagrama experimental para la obtención de extractos,
fraccionamiento y cuantificación de proteínas de extractos de
J. curcas
26
Figura 6. Soluciones estándar de BSA para cuantificación de proteínas 28
Figura 7. Recta de estándares de BSA 29
Figura 8. a) explantes de segmentos nodales, b) inducción de callo, c)
multibrotación
31
Figura 9. Brotación de los explantes de J. curcas a partir de tallos con un
solo nudo
32
Figura 10. Brotación múltiple y callo de J. curcas a partir del mismo
explante
34
Figura 11. Subcultivo de callos: a) callo verde y friable, b) inicio de
necrosis, c) necrosis completa del callo
38
Figura 12. Tratamiento de callos con antioxidantes: a) L-cisteína, b)
carbón activado
38
Figura 13. Crecimiento radial de los callos de J. curcas medidos cada 5
días: a) día 20, b) día 25, c) día 30, d) día 35, e) día 40, f) día
45
40
Figura 14. Velocidad de crecimiento radial de callos de J. curcas 41
Figura 15. Cinética de crecimiento en base a PF de callos de J. curcas 42
Figura 16. Cinética de crecimiento en base a PS de callos de J. curcas 43
Figura 17. Perfil de elución de la cromatografía por exclusión molecular 44
-
vii
de extractos proteicos de planta in vitro de J. curcas (3.0x30)
Figura 18. Perfil de elución de la cromatografía por exclusión molecular
de extractos proteicos de planta in vitro de J. curcas
45
Figura 19. Perfil de elución de la cromatografía por exclusión molecular
de extractos proteicos de callo de J. curcas
46
Figura 20. Perfil de elución de la cromatografía por exclusión molecular
de extractos proteicos de croton
47
Figura 21. Perfil de elución de la cromatografía por exclusión molecular
de extractos proteicos de semillas de J. curcas
47
Figura 22. Comparación del perfil de elución cromatográfica de la plántula
in vitro y callo de J. curcas con los controles positivos
48
Figura 23. Patrones electroforéticos desnaturalizantes (SDA-PAGE) de
extractos proteicos de: M) Marcador molecular, 1) Plántula in
vitro de J. curcas, 2) Callo de J. curcas, 3) croton, 4) semilla J.
curcas)
51
Figura 24. Patrones electroforéticos desnaturalizantes (SDA-PAGE) de
las fracciones proteicas 31-42 de: M) Marcador molecular, 1)
Plántula in vitro de J. curcas, 2) Callo de J. curcas, 3) croton, 4)
semilla J. curcas
52
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viii
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOGÍA
µ Velocidad especifica de crecimiento
µg·ml-1 Microgramo sobre mililitro
µl Microlitros
Longitud de onda
2,4-D 2,4- diclofenoxiacético (auxina).
ABA Ácido abscísico
AG3 Ácido giberélico
AIA Ácido 3-indolacético
AIB Ácido indolbutírico (Auxina).
ANA Ácido naftalenacético (Auxina).
ARNr Ácido ribonucleico ribosomal
BAP 6-bencilaminopurina (Citocinina).
BCA Ácido bicinconínico
BSA Suero de albúmina de bovino
CCTV Cultivo de células y tejidos vegetales
d-1 1·días
F Friable
IC50 Concentración media inhibitoria máxima de una sustancia.
kDa Kilodaltones
klx Kiloluxes
m Pendiente de la recta
mA Miliamperes
mg·100 g-1 Miligramo sobre 100 gramos
mg·L-1 Miligramos sobre litro
ml·L-1 Mililitros sobre litro
mM Milimolar
MS Murashige y Skoog, 1962
NF No friable
NI No inducido
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ix
nM Nanomolar
nmol·L-1 Nanomol sobre litro
oC Grados centígrados
PBS Búfer salino de fosfatos
PF Peso fresco
pI Punto isoeléctrico
PS Peso seco
RCV Reguladores de crecimiento vegetal
RIP Proteína Inactivadora de Ribosomas.
rpm Revoluciones por minuto
tdc Tiempo de duplicación celular
TDZ Tidiazuron.
Ton·ha-1·año Toneladas por hectárea anual
V Volts
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1
1. INTRODUCCIÓN
México es centro de origen de la Jatropha curcas L., Euphorbiacea con potencial
industrial y medicinal. La J. curcas al igual que la mayoría de las plantas desarrolla
metabolitos que utilizan como mecanismo de defensa cuando se encuentran bajo
condiciones de estrés biótico o abiótico, para protegerse de condiciones que afectan
su crecimiento y producción (Heller, 1996; Makkar y col., 1998; Martínez, 2006).
Uno de estos compuestos de defensa química presentes en J. curcas, es la curcina,
que pertenece al grupo de proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs), las cuales
pueden ser inducidas bajo condiciones de sequía, temperatura o infecciones fúngicas
entre otros factores (Huang y col., 2008). La curcina, RIPs tipo I, es una proteína de
interés por su actividad antiviral y antifúngica, pero sobre todo por su actividad
enzimática de N-glicosidasa, la cual inhibe la síntesis de proteínas, evitando de esta
forma la producción de células neoplásicas (Lin y col., 2003).
La actividad antitumoral de la curcina, podría ser aprovechada para la construcción
de inmunotoxinas, las cuales son sustancias tóxicas que ligadas a un anticuerpo se
unen a las células cancerosas y las destruye, por lo que son ampliamente aplicadas
en tratamientos contra el cáncer gástrico, hepatoma humano y carcinomas, entre
otros. Las ventajas que presenta la curcina sobre otras RIPs utilizadas en
quimioterapias, como es el caso de la ricina, lufina, saporina y tricosatina, es que ha
demostrado tener mayor eficiencia antitumoral en comparación con las RIPs
mencionadas anteriormente, ya que inhiben la síntesis de proteínas de células
neoplásicas a concentraciones de 0.19 nmol·L-1, mientras que la saporina y
tricosantina son eficientes a concentraciones de 0.5 nmol·L-1y 0.32 nmol·L-1
respectivamente; además de que su citotoxicidad sobre células normales solamente
se presenta a muy altas concentraciones, no causando efecto mayor en células no
dañadas (Park y col., 2004, Huang y col., 2008).
Puesto que sólo en México se han encontrado variedades no tóxicas de J. curcas y
que son escasos los estudios realizados sobre cultivos in vitro de esta especie, una
alternativa para su propagación es la utilización de técnicas de cultivo de células y
tejidos vegetales (CCTV) que presentan las ventajas de obtener plantas con las
mismas características de la planta madre, y disminuir enfermedades en la especie
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2
mediante el control de factores físicos como intensidad de luz, temperatura,
fotoperíodo, humedad, cantidad de nutrientes, todo esto bajo condiciones estériles
que hacen más factible la manipulación de la especie. Asimismo la producción y/o
inhibición de metabolitos es otra ventaja del CCTV. Debido a que las investigaciones
reportadas sobre la presencia de curcina han sido en material tóxico y ex vitro
(semillas, hoja y tallo) de J. curcas, este trabajo plantea el establecimiento de cultivos
in vitro del genotipo no tóxico a partir de explantes de segmentos nodales, hoja y
peciolo, en medio semisólido, para determinar si en los cultivos obtenidos, están
presentes proteínas con pesos moleculares de 28-32 kDa las cuales podrían
corresponder a curcina (Lin y col., 2010). La presencia de proteínas con pesos
moleculares de interés, serían la pauta para la producción a futuro de curcina en
material in vitro y en consecuencia, el aprovechamiento de su actividad antitumoral
para la construcción de inmunotoxinas.
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2. REVISIÓN DE LA LITERATURA
2.1. Planta en estudio, Jatropha curcas L.
El género Jatropha pertenece a la tribu Joannesieae de las Crotonoideae en la
familia de las Euphorbiaceae, una de las más grandes y diversas de México. La
palabra Jatropha se deriva del griego “iátros” que significa doctor y “trophe” que
significa alimento, siendo Linnaeus quien dió el primer nombre a la J. curcas,
concordando con la nomenclatura binomial de “especie-planta”.
La J. curcas tiene diversos usos medicinales y alimentarios, se considera nativa de
México y países de América Central, muestra un crecimiento rápido en regiones
tropicales así como en áreas pedregosas, poco fértiles y con bajo contenido de
nutrientes, con temperaturas entre 18 º y 34 ºC. Es una planta suculenta que emite
sus hojas en estación seca, por lo que está más adaptada suelos áridos y
semiáridos, y debido a su capacidad de adaptación hoy en día es cultivada en
diversas partes del mundo (Heller, 1996; Makkar y Becker, 1999).
Su periodo productivo es de 40 años o más; el rendimiento de las semillas depende
de las condiciones climáticas y del suelo, éste va de 0.5 a 10 Ton·ha-1·año-1, las
cuales se obtienen desde los primeros nueve a 10 meses de haberlas cultivado
(Becker y Makkar, 2008).
Sólo en México se han encontrado tanto genotipos tóxicos como no tóxicos; se
localizan, en forma silvestre, en los estados de Sonora, Sinaloa, Oaxaca, Quintana
Roo, Yucatán, Tamaulipas, Puebla, Veracruz y Morelos, Chiapas, Durango, Estado
de México, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Nayarit, San Luis Potosí, Sinaloa,
Tabasco, Zacatecas. Comúnmente es llamada piñón mexicano, piñoncillo sikilté,
pomolchéche, ni-in, quahayohuachtli y kakal-che entre otros (Makkar y col., 1998;
Martínez-Herrera, 2006).
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4
2.2. Clasificación taxonómica y botánica
La Jatropha curcas L., en una Euforbiaceae, que tiene como uno de los centros de
origen México, otros sinónimos para esta planta son Curcas purgans, Ricinos
americanus, Castiglionia lobata, Jatropha edulis, Jatropha acerifolia, Ricinos jarak,
Curcas adansoni, Curcas indica, Jatropha yucatanensis y Curcas curcas (L) (Cuadro
1).
Cuadro 1. Descripción taxonómica de la planta Jatropha curcas L.
Reino
Subreino
Plantae
Tracheobionta
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Rosidae
Orden Euphorbiales
Familia Euphorbiaceae
Género Jatropha
Especie Jatropha curcas
Nombre científico Jatropha curcas L.
Fuente Heller (1996)
La J. curcas es una planta arbórea con corteza escamosa, mide entre 3-8 metros de
altura y 14 -18 cm de diámetro (tronco). Las ramas contienen látex blanquecino con
sabor, miden de 3-5 cm de diámetro y son de color verde claro-grisáceo. Las hojas
son alternas con tres lóbulos cortos y peciolados, miden 6 cm de longitud y 15 cm de
ancho.
Es una planta monógama con flores unisexuales de color amarillas o amarillo –
verdosas, donde se lleva a cabo el proceso de polinización durante la noche, debido
a que durante ésta, la planta produce un olor dulce (Heller, 1996; Judd y col., 2008).
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5
El fruto es una cápsula de 4-5 cm de longitud y 3-4 cm de ancho; en su interior
contiene de tres a cuatro semillas, las cuales son blancas y presentan testa oscura
de forma elipsoidal, de 2 cm de largo aproximadamente y 0.75 de ancho, su peso
constituye un 65% de la masa total de la semilla. (Heller, 1996; Makkar y Becker,
1999; Sujatha y col., 2005).
2.3. Proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs)
Las plantas están constantemente expuestas a condiciones de estrés biótico y/o
abiótico, lo cual causa alteraciones en su desarrollo y crecimiento.
Como respuesta a estas condiciones sintetizan y acumulan compuestos que tienen
un papel importante en su mecanismo de adaptación fisiológica, entre estos
metabolitos se encuentran las proteínas inactivadoras de ribosomas, mejor
conocidas como RIPs, las cuales forman parte de un mecanismo de defensa química
de las plantas, al inactivar los ribosomas y de esta forma inhibir la síntesis de
proteínas (Nielsen y Boston, 2001).
Las RIPs pertenecen a un grupo de enzimas citotóxicas, N-glicosidasas que se
caracterizan por que actúan sobre un sustrato específico, como son los nucleótidos
para romper los enlaces N-C (Park y col., 2004).
La activación del mecanismo enzimático de las RIPs puede ser inducido por la
presencia de ácido jasmónico o ácido abscísico producidos por diferentes factores o
condiciones de estrés a los que se expone la planta como heridas, condiciones de
sequía, altas y bajas temperatura, concentración elevada de sales en el suelo o por
el ataque de virus, hongos u otros patógenos (Nielsen y Boston, 2001; Wei y col.,
2005).
Se deduce que se localizan extracelularmente, por lo que se ha propuesto que son
enzimas atrapadas en la matriz de la pared celular y que entran al citoplasma por
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mecanismos de transporte transmembranal, junto con el agente patógeno que pueda
causar la infección (Park y col., 2002; Wei y col., 2005).
Algunas RIPs poseen un dominio proteico que les permite atravesar las membranas
celulares al reconocer y unirse a receptores de membranas plasmáticas y de esta
forma entrar al citosol donde inhiben la síntesis de proteínas (Girbes, 2000).
2.3.1. Clasificación y mecanismo de acción de las proteínas inactivadoras de
ribosomas
Las RIPs se dividen en tres tipos (Figura 1), según su estructura y genes
correspondientes:
RIPs tipo I: presentan una sola cadena polipeptídica con actividad enzimática
y pueden inhibir la síntesis de proteínas en células libres; tienen un peso
molecular entre 24-30 kDa, además de la estructura común, se han
identificado proteínas que se construyen de dos cadenas polipetídicas unidas
por interacciones no covalentes, algunas RIPs tipo I pueden o no unirse a
carbohidratos.
RIPs tipo II: constan de una cadena con actividad catalítica (cadena A) ligada
a una lectina específica (cadena B) que puede estar unida a un azúcar (D-
galactosa) o a la superficie de otra célula, muchas RIPs de este tipo pueden
ser proteínas heterodiméricas altamente tóxicas. Generalmente las cadenas A
y B que las componen están unidas por puentes disulfuro. Este tipo de
proteínas poseen un dominio proteico que les permite atravesar las
membranas celulares al reconocer y unirse a receptores de membranas
plasmáticas, y de esta forma entran al citosol, donde inhiben la síntesis de
proteínas (Girbes, 2000).
RIPs tipo III: se tienen pocos estudios, se sabe que difiere de la tipo I y II en
su lectina y actividad enzimática, en este grupo se clasifican aquellas
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proteínas que están relacionadas estructural y evolutivamente con proteínas
60-kDa inductoras de jasmonatos, conocidas como (JIP60).
En cuanto a la actividad de las RIPs tipo II y III, sólo se tiene conocimiento de su
actividad antitumoral, a diferencia de las RIPs tipo I que presentan también
actividad antifúngica y antiviral (Lin y col., 2003; Park y col., 2004; Xu y Liu, 2004;
Luo y col., 2007).
Adaptado de Xu y Liu (2004).
Figura 1. Clasificación de las RIPs según su estructura.
Diferentes RIPs han sido aisladas en 50 especies de plantas, pertenecientes a 17
familias, entre ellas Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Poaceae, y Cariophyllaceae
(Sharma y col., 2004). Estudios en Jatropha curcas y otras especies como Croton
tiglium, Gelonium multiflorum, Manihot palmate y Manihot utulissima, pertenecientes
a la familia de las Euphorbiaceaes, han demostrado la presencia de RIPs tipo I
(Heller, 1996; Lin y col., 2003). El papel de defensa podría ser la razón por la que las
RIPs se sinteticen y acumulen en diferentes partes de las plantas como semillas,
raíz, bulbos, hojas, tallo y flores (Bolognesi y col., 2002; Corrado y col., 2008). Para
obtener mayor información acerca del comportamiento enzimático de las RIPs, se
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han realizado diversos estudios en Arabidopsis thaliana y en plantas transgénicas de
tabaco (Nicotiana tabacum), en las que se ha demostrado la actividad antifúngica,
antibacteriana y antitumoral de dichas proteínas en células procariotas como
eucariotas. La actividad antitumoral de algunas RIPs ha sido evaluada sobre células
hepáticas, gástricas y carcinomas entre otras (Park y col., 2004; Sharma y col., 2004;
Huang y col., 2008).
Las RIPs con actividad anticancerígena o actividad N-glicosidasa también son
denominadas ARNr N-glicosidasas (Sharma y col., 2004). Por la actividad de N-
glicosi-dasa se rompe enzimáticamente el enlace N-glicosídico de una adenosina del
ARN interrumpiendo la traducción de proteínas (Benito y col., 1995; Luo y col., 2007).
Actúan en la etapa de elongación de las cadenas polipeptìdicas interrumpiendo los
factores de elongación I y II de los ribosomas, deteniendo así la síntesis de proteínas
en el paso de la traslocación. Pita y col. (2004), establecieron que los aminoácidos
responsables de la actividad N-glicosidasa en la ricina, RIP aislada de Ricinus
communis, son el ácido glutámico en la posición 177 (Glu177) y la arginina en la
posición 180 (Arg180). Por su parte Monzingo y Robertus (1992) propusieron un
mecanismo de acción molecular en el que la ruptura del enlace entre el nitrógeno N-9
de la adenina y el carbono C-1´ de la ribosa del RNAr se vería facilitada gracias a la
protonación del nitrógeno N-3 por el resto Arg18. Además de la ricina (Ricinus
comunis), el mecanismo de acción de las RIPs, ha sido estudiado en otras proteínas
de este tipo como la ME (Mirabilis expansa) y Cinnamomin (Cinnamomum
camphora), en los que se ha demostrado que la N-glicosidasa, específicamente
rompe el enlace glicosídico N-C de una adenosina de una posición específica del
dominio universal conservado sarcina/ricina (dominio S/R): A4324, mientras que la
sarcina hidroliza el enlace fosfodiéster entre la guanosina 4325 y la adenosina 4326,
evitando así la síntesis de proteínas en células dañadas, los estudios mencionados
se han llevado a cabo en ribosomas de ratas (Figura 2) (Xu y Liu, 2004; Huang y col.,
2008).
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Figura 2. Sitio de ruptura de las RIPs en el dominio S/R universal conservado.
2.4. Importancia farmacéutica de la curcina y otras RIPs de obtenidas de
diversas plantas
Las actividades antifúngica, antiviral y antitumoral que presentan las RIPs, les
confieren un potencial en la industria farmacéutica. En cuanto a su actividad antiviral,
es bien conocida desde 1925 por estudios realizados por Duggar y Armostrong en
Mirabilis jalapa citado por Huang y col. (2008). Entre las RIPs que han demostrado
promover la destrucción viral, pueden mencionarse la agrostina, gelonina,
momordina, saporina (Saponaria officinalis), al igual que otras RIPs encontradas en
experimentos realizados en plantas transgénicas como la PAP (aislada de la
Phytolacca americana y Phytolacca insularis) y una RIP proveniente de la Dianthus
cariophyllus, denominada diantina. RIPs importantes por su actividad antifúngica y
antibacterial han sido aisladas en Mirabilis jalapa L. y Mirabilis expansa (MAP),
Hipsina (Hypsizigus marmoreus), Liofilina (Lyophillum shimeji).
Se ha demostrado que la compartamentalización de las RIPs ocurre en la pared
celular y que posteriormente a la infección por patógenos ya sea a nivel citosólico o
en alguna región extracelular, éstas se dirigen al sitio de ataque para evitar el
crecimiento del microorganismo (Park y col., 2004).
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La ricina (Ricinus communis), tricosantina (Trichosanthes kirilowii) y la curcina
(Jatropha curcas) presentan además de la actividad antifúngica y antiviral, actividad
anticancerígena (Park y col., 2002; Vepachedu y col., 2003; Sikriwal y col., 2008);
otra RIP encontrada con importancia farmacéutica ha sido la lufina aislada de la
Luffin cylindrica, la cual también posee actividad glicosídica o anticancerígena
(Bolognesi y col., 2002).
En semillas maduras de J. curcas ha sido aislada y clonada la RIP tipo I conocida
como curcina, la cual ha reportado pesos moleculares entre 28.1-32 kDa y pI de
8.54. Han sido pocos los estudios realizados sobre la expresión del gen de la curcina
en hojas, tallo y raíz de J. curcas; sin embargo, se ha demostrado que también en
estas partes de la planta se encuentra presente, no obstante la mayor concentración
de proteína cruda (117.35 mg·100g-1) ha sido encontrada en semillas donde se ha
estudiado que una concentración de 0.19 nmol·L-1 provoca actividad inhibitoria de la
traducción celular (Qin y col., 2009; Lin y col., 2010).
La curcina es considerada una toxolbúmina con actividad N-glicosidasa; por lo que
la curcina puede inhibir la síntesis de proteínas en células cancerígenas (Lin y col.,
2003), y por lo tanto, podría ser utilizada para el desarrollo de inmunotoxinas, que
son sustancias tóxicas ligadas a un anticuerpo que se une a las células cancerosas y
las destruye eliminando células dañinas, neoplásicas, inmunocompetentes y células
parasíticas; estas características puede convertirlos en posibles agentes terapéuticos
importantes para su aplicación en el tratamiento de diversos tipos de cáncer y
enfermedades autoinmunes (Lin y col., 2003; Corrado y col., 2008).
Actualmente las RIPs con actividad antitumoral más utilizadas en tratamientos contra
el cáncer son la ricina y la tricosantina, seguidas por la saporina, luffun A, luffina B,
nigrina y ebulitina (α, β, γ), las cuales presentan dicha actividad a concentraciones
entre 0.32-4.0 nmol·L-1, sin embargo la importancia del estudio de la curcina se basa
en experimentos realizados por Lin y col. (2003), en los que demostraron que la
actividad de esta RIP para inhibir la síntesis de proteínas en células cancerígenas
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podría ser más eficiente, pues presentó actividad antitumoral a bajas
concentraciónes (0.19 nmol·L-1) en comparación con la ricina, luffina B y la
tricosantina ante una concentración media inhibitoria máxima (IC50) en diferentes
tipos de células malignas (cáncer gástrico, línea celular de mieloma de ratón,
hepatoma humano y líneas celulares de carcinoma).
Además la curcina presenta otra ventaja sobre las RIPs mencionadas anteriormente,
pues solo tiene efecto adverso o citotóxico sobre células sanas cuando se presentan
en altas concentraciones, a diferencia de la ricina, luffina B y tricosantina que son
altamente tóxicas también para células intactas, aun en bajas concentraciones
(Benito y col, 1995; Lin y col., 2003).
Estudios realizados por Wei y col. (2005), han demostrado que en semillas tiernas de
J. curcas expuestas a estrés por sequía, cambios de temperatura e infecciones
fúngicas se expresa un precursor de la curcina denominado curcina 2 el cual es
específico para semillas tiernas en crecimiento bajo las condiciones mencionadas. La
curcina 2 tiene muchas similitudes con la curcina, ya que la curcina 2 contiene
residuos con segmentos de 42 aminoácidos en N-terminal para el péptido base de
señalización, el cual es similar al péptido de señalización de la curcina en un 98%.
Los nucleótidos de la curcina 2 son idénticos en un 83% a los nucleótidos de la
curcina. La curcina 2 tiene un peso molecular de 30.1 kDa el cual es cercano al peso
molecular de la curcina que se expresa en una banda de 32 kDa. Se ha comprobado
que la curcina 2 también posee actividad antiviral, antifúngica y antitumoral, y se
supone que al igual que la curcina y otras RIPs tiene un rol de defensa ante cualquier
tipo de estrés (Wei y col., 2005).
2.5. Cultivos de células y tejidos vegetales
En los últimos años, se ha puesto especial interés en el establecimiento in vitro de
diversas plantas para la producción de compuestos de interés o la obtención de
cultivos más resistentes a los diferentes factores del medio ambiente, éste es el caso
de la J. curcas, que actualmente es una especie de particular atención, debido al
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potencial industrial que representa. Sin embargo, son escasas y recientes las
investigaciones sobre el cultivo de células vegetales aplicada a esta planta (Banerjee
y Shrivastava, 2008), de la cual puede aislarse la curcina, proteína con aplicación
farmacéutica.
Hasta el momento los estudios en los que se ha aislado y purificado la curcina han
sido in vivo y en genotipos tóxicos, por lo que no hay datos de obtención de dicha
proteína in vitro, sin embargo, el uso de la biotecnología vegetal y de sus técnicas de
CCTV presentan la ventaja de poder optimizar las condiciones ambientales, en lo
que se refiere a factores físicos, nutricionales y hormonales, para la obtención y
aislamiento del metabolito de interés y a la vez propagar ejemplares no tóxicos de J.
curcas que sólo están presentes en el país.
El CCTV involucra diferentes técnicas de cultivo de material vegetal como
protoplastos, células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas técnicas
de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo y
aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas, gracias a la totipotencia,
que es la capacidad de generar un individuo completamente idéntico a la célula
madre el cual tiene la misma información genética y la misma función (Kieran y col.,
1997; Rodríguez, 2007). El CCTV además ha sido utilizado de manera ventajosa
para obtener un mayor conocimiento sobre la fisiología, bioquímica y genética
vegetal. Permite la manipulación de variables físicas y químicas, es independiente de
factores ambientales, es posible identificar y producir metabolitos de uso industrial
con mayor calidad, rendimiento y en menor tiempo, así como conocer la ruta de
síntesis bioquímicas (Pérez-Molphe y col., 1999; Gómez, 2005; Rosas, 2007).
El CCTV consiste llevar el material vegetal in vivo a un medio de cultivo estéril
estableciendo las condiciones óptimas bajo las cuales se va a desarrollar el tejido o
metabolito de interés, por lo que se deben tomar en cuenta factores físicos como
intensidad de luz, temperatura, fotoperíodo, humedad y nutrientes entre otros (Dixon,
1991; Rodríguez de la O, 2007).
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2.5.1. Reguladores de crecimiento vegetal
Es importante recalcar el uso de reguladores de crecimiento vegetal (RCV), que son
sustancias orgánicas que a bajas concentraciones influyen en los procesos
fisiológicos de las plantas, regulando el crecimiento, desarrollo o metabolismo de la
planta, células o tejidos vegetales (Dixon, 1991; Frankenberg y Arshad, 1995). Entre
los reguladores de crecimiento vegetal (Cuadro 2) se pueden mencionar los
siguientes:
Auxinas: son compuestos derivados del triptófano, junto con las citocininas
promueven la inducción y establecimiento de callo. Otras de sus funciones son
aumentar el crecimiento de los tallos, promover la división celular en el
cambium vascular y la diferenciación del xilema secundario, estimular la
formación de raíces adventicias, inhibir la elongación de raíces y estimular el
desarrollo de frutos y la floración en algunas especies.
Citocininas: son compuestos derivados de la adenina y junto con las auxinas
promueven la división celular y crecimiento.
Giberelinas: el ácido giberélico participa en el rompimiento de la dormancia de
semillas y brotes, estimula la elongación de hojas, incrementa el crecimiento
de tallos y promueve el desarrollo de los frutos.
Ácido abscísico: es antagónico de las auxinas, citocininas y giberelinas,
puesto que inhibe el crecimiento y división celular; induce tolerancia al estrés
hídrico, y el cierre de estomas.
Otros RCV menos utilizados son el etileno, los brasinoesteroides, el ácido jasmónico,
ácido salicílico, y ácido nítrico (Dixon, 1991; García, 2007).
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Cuadro 2. Clasificación y abreviaturas de los RCV
Grupo de los RCV Compuesto Abreviaturas
Auxinas
Ácido 3-indolbutírico AIB
Ácido α-naftalenacetico ANA
Ácido 3-indolacético AIA
Ácido 2,4-diclofenoxiacético 2,4-D
Citocininas
6-bencilaminopurina BAP
Cinetina 6-KT
Zeatina Z
Giberelinas Ácido giberélico AG3
Ácido abscísico Ácido abscísico ABA
2.5.2. Obtención de brotes y callos
Mediante el CCTV es posible obtener brotes y callo a partir de explantes. El callo es
una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a
una masa de células (callo), la cual bajo las condiciones adecuadas de luz,
temperatura y nutrientes es capaz de generar órganos o embriones somáticos. El
cultivo de callos puede derivarse de una variedad de órganos de la planta (raíz, tallo,
hoja), usados como explantes y colocados en un medio sólido o semisólido;
generalmente se utiliza el medio MS (Murashige and Skoog, 1962), (Dixon, 1991). La
biotecnología vegetal permite además monitorear el aumento de masa celular
mediante curvas de crecimiento, así como obtener una mayor cantidad y calidad del
compuesto que se desea, siempre y cuando se establezcan las condiciones
adecuadas.
Banerjee y Shrivastava (2008) realizaron cultivos in vitro de J. curcas en los que se
obtuvieron multiples brotes, a partir de explantes nodales para la propagación de
esta especie, utilizando como reguladores de crecimiento diferentes combinaciones
de BAP/AIB/ANA.
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Otros trabajos son los de Wei y col. (2004), en el que reportaron la producción de
brotes a partir de epicotilos, a los 15 días en medio MS, y teniendo como reguladores
IBA 0.5-1.5 mg·L-1 en combinación con BAP 0.1-1.0 mg·L-1. En este mismo trabajo se
reportó la regeneración de raíces, así como la obtención de callos con la
combinación AIB 1.0 mg·L-1 y BAP 0.5 mg·L-1.
Estudios de cultivo in vitro de J. curcas demuestran que las condiciones de cultivo, el
tipo de explante y los resultados obtenidos para la obtención de órganos o células
desdiferenciadas pueden variar, en la misma especie si son de diferente
procedencia. Tal es el caso de López-Hernández y col. (2008) quienes trabajaron
con J. curcas de diferente procedencia (africana y cubana) utilizando tres explantes
diferentes (hoja, pecíolo e inflorescencias). Los RCV utilizados fueron BAP y 2,4-D
por separado en ambas muestras a distintas concentraciones en el genotipo cubano
se obtuvo un 100% de callos a partir de pecíolo a las concentraciones de BAP 0.5 y
1.5 mg·L-1 y 50% de callos provenientes de explantes de hoja a los 30 días de cultivo.
En cuanto al genotipo africano presentó el mayor rendimiento de callos a partir de
explanes de hoja a concentraciones de 2,4-D 0.5, 1 y 2 mg·L-1, igualmente a los 30
días de cultivo.
2.6. Métodos de análisis de las proteínas inactivadoras de ribosomas
Existen diferentes métodos para extraer, identificar, cuantificar, purificar y medir la
actividad de las RIPs. Los métodos más utilizados para su extracción, han sido la
congelación con nitrógeno líquido y posteriormente la extracción con búfer salino de
fosfatos (PBS) a pH entre 7-7.5.
En cuanto a la separación e identificación de las proteínas inactivadoras de
ribosomas se han utilizado técnicas de electroforesis desnaturalizante, conocida
como SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis), el
cual es un método que permite la comparación y caracterización de proteínas y que
se basa principalmente en la separación por pesos moleculares.
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Otras técnicas de identificación y cuantificación de RIPs, es el análisis de Western
blot y por cromatografía líquida acoplada a espectro de masas LC/MS (Vivanco y
col., 1999; Park y col., 2002).
Actualmente se conocen varios métodos para determinar la actividad de las RIPs,
entre los más conocidos se puede mencionar la fijación de células dañinas al retículo
de ribosomas del conejo; determinación cuantitativa por HPLC del reactivo de
cloroacetaldehído material liberado por las RIPs; medición directa de H-adenina
liberado por las RIPs y análisis por electroforesis (SDS-PAGE) de algunas bases de
28S ARN (Luo y col., 2007).
2.6.1. Métodos de separación y purificación de las proteínas
inactivadoras de ribosomas
En cuanto a la separación y purificación de proteínas los métodos más utilizados han
sido cromatografía en columna (Schroeder, 1968), la cual consiste en el
fraccionamiento por el paso de las proteínas a través de una fase sólida y porosa, y
arrastre por una fase móvil líquida, y sus diversas variantes como:
Cromatografía de intercambio iónico: en la cual la fase sólida posee carga, por
lo que la asociación entre las proteínas y la fase sólida depende del pH y la
fuerza iónica de la solución de arrastre (fase móvil).
Filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño: separa la proteína
de acuerdo al tamaño de las moléculas, reteniendo las partículas pequeñas. El
método se basa en que las proteínas de mayor tamaño pasan con mayor
rapidez por la fase estacionaria (compuesta por un polímero con poros
uniformes y de tamaño determinado) mientras que las moléculas de menor
tamaño son retenidas a través de dichos poros. Este método de separación es
utilizado en la purificación de RIPs (Schroeder, 1968; Lin y col., 2010).
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Cromatografía de afinidad: las proteínas se separan por su capacidad de
unirse aun ligando. Las proteína de interés se une específicamente a un
ligando que previamente se ha unido a la matriz, eluyéndose el resto de las
proteínas a través de la columna. Finalmente la proteína de interés se libera
utilizando un ligando o compuesto capaz de romper la interacción ligando-
proteína.
Cromatografía hidrofóbica: se trata de un método similar al de intercambio
iónico, con la única diferencia de que la fase estacionaria es apolar
(hidrofóbica), es decir, la proteína se pega al soporte por aminoácidos
apolares, cuanto más residuos de este tipo tenga en su superficie, más apolar
será, más se retendrá en la columna y se eluirá más tarde. En este caso a
elución se realiza aumentando la apolaridad de fase móvil.
2.6.2. Cuantificación de las proteínas inactivadoras de ribosomas
Respecto a la cuantificación de RIPs, se ha reportado el uso de cromatografía líquida
de alta resolución, HPLC, en Mirabilis jalapa (Bolognesi y col., 2002; Vepachedu y
col., 2003). Sin embargo, los métodos colorimétricos son ampliamente utilizados en
la cuantificación de proteínas, entre los que pueden mencionarse los siguientes
(Bollag y Edelstein, 1991).
Ensayo de Bradford: se basa en el acoplamiento del colorante con la proteína
y se determina colorimétricamente, existe una relación directa entre el
desarrollo del color y la concentración de proteínas, es más factible, rápido,
sensible , ya que es poca la cantidad de proteína que se sacrifica en el
ensayo, pues aplica para soluciones que contienen entre 25-200 µg·ml-1,
además es económico y eficiente, y ha sido utilizado en la cuantificación de
diversas RIPs como ME (Mirabilis expansa), TRIP (Nicotiana tabacum) y
Cinnamomin (Cinnamomum camphora) (Park y col., 2002; Vepachedu y col.,
2003; Sharma y col., 2004).
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Ensayo de Lowry: se fundamenta en la asociación de dos reacciones
complementarias que son las de Biuret y Folin-Ciocalteu. Su rango de
sensibilidad es de 5-100 µg·ml-1, sin embargo presenta la desventaja de que
es inestable en presencia de ciertos reactivos, además a la interferencia de
otras sustancias que podrían estar presentes en las muestras.
Método del ácido bicinconínico (BCA): el cual se basa en la formación de un
complejo Cu+2-proteína bajo condiciones alcalinas, seguido de la reducción del
Cu+2 a Cu+1. No hay reportes del uso de este método en RIPs, sin embargo es
utilizado en la cuantificación de proteínas debido a que presenta las ventajas
de obtener un producto estable, hay menor interferencia de sustancias
comparado con el método de Lowry y es más sensible pues cuantifica entre
10-200 µg·ml-1, hasta microensayos que cuantifican de 0.5-10 µg·ml-1.
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3. JUSTIFICACIÓN
La J. curcas, es una Euphorbiaceae con importancia industrial y medicinal, por lo que
su cultivo se ha extendido a diferentes partes del mundo; sin embargo, sólo en
México se han encontrado genotipos no tóxicos de esta planta (Makkar y col., 1998)
y debido a que son escasos los estudios realizados sobre cultivos in vitro de esta
especie, una alternativa para la propagación de plantaciones de J. curcas no tóxicas
así como la obtención de curcina es la utilización de las técnicas de CCTV que hacen
posible la obtención de plantas con las mismas características de la planta madre
bajo condiciones asépticas y controlando factores como intensidad de luz,
temperatura, fotoperíodo, humedad, cantidad de nutrientes que hacen más factible la
manipulación de la especie (Soomro y Memon, 2007).
Además la J. curcas al igual que muchas plantas desarrollan metabolitos que utilizan
como mecanismo de defensa contra factores bióticos y abióticos del medio ambiente,
tal es el caso de la curcina, RIP de interés por su actividad antitumoral, que puede
ser aplicada en tratamientos contra el cáncer, utilizándola en la construcción de
inmunotoxinas (Park y col., 2002; Luo y col., 2007; Huang y col., 2008). Esta proteína
ha sido aislada en material ex vitro como son hoja, tallo y semillas maduras (Lin y
col., 2010), sin embargo no hay reportes de su aislamiento en células
desdiferenciadas y plantas in vitro, por lo que la biotecnología vegetal podrías ser
una alternativa para la obtención de curcina en material no tóxico de J. curcas.
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4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general Establecer las condiciones de cultivo in vitro de Jatropha curcas L. para promover la
brotación e inducción a callo y determinar si en dichos cultivos se encuentra la
proteína curcina.
4.2. Objetivos particulares
1. Establecer cultivos in vitro en medio semisólido de Jatropha curcas L. e
inducir la brotación y la formación de callo.
2. Realizar cinéticas de crecimiento en callo de Jatropha curcas L. con el
tratamiento seleccionado.
3. Identificar la presencia de curcina en el material in vitro.
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5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Obtención de material biológico
Para la producción de brotes e inducción de callo (Figura 3) se utilizaron explantes
(hoja, nodal y peciolo) de J. curcas, provenientes de plantas en maceta, mantenidas
en condiciones de invernadero bajo cubierta en el Centro de Desarrollo de Productos
Bióticos – IPN, ubicado en Yautepec de Zaragoza, Morelos.
Previamente a la utilización de los explantes, las plantas de J. curcas, se sometieron
a un tratamiento fitosanitario (Anexo 1) siendo fumigadas cada 7 días por la mañana,
como tratamiento preventivo, ya que durante los meses de Agosto-Noviembre los
cambios drásticos de humedad y temperatura ocasionan ambientes propicios para la
producción de algunos organismos entre ellos los hongos.
Para aumentar el follaje en las plantas, se aplicó una solución de Agromil PLUS® (1
ml·L-1) cada 7 días, como biorregulador complejo de desarrollo vegetal, compuesto
por diferentes fitohormonas y vitaminas (Anexo 2).
La aplicación de la mezcla de fungicidas así como la solución del regulador para
desarrollo vegetal se realizó por las mañanas (10:00 am) ya que es menor la
intensidad luminosa que llega a las plantas y por lo tanto sus estomas están abiertos
favoreciendo una mejor absorción de los componentes.
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Figura 3. Diagrama experimental para el establecimiento de cultivo in vitro de J.
curcas.
5.2. Desinfestación de explantes
Se utilizaron explantes de tallo con un solo nudo (1.5 cm), segmentos de hoja (área
1.0 cm2) y peciolo (1 cm), cortadas de plantas conservadas en el invernadero, fueron
trasladados al laboratorio en una charola con agua para evitar su deshidratación. Los
explantes se lavaron con solución jabonosa al 1% y agua de la llave para romper la
tensión superficial, posteriormente se llevó a cabo un segundo lavado con solución
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tween 20 (Bio-Rad) al 1% durante 5 min con agitación constante, realizando
después lavados con agua destilada para remover la capa de grasa de los tejidos
vegetales y permitir una mejor penetración de la solución desinfectante.
Los explantes fueron puestos en una solución de hipoclorito de sodio (Cloralex®) al
1% (v/v) por 25 min, agitando periódicamente para un mejor contacto de la solución
con los explantes. Se enjuagaron con agua destilada estéril y fueron puestos en
solución de etanol al 80% por 20 s. El manejo se realizó bajo condiciones estériles en
una campana de flujo laminar (ALDER) (Dixon, 1991).
5.3. Medio de cultivo
Los explantes de tallo se sembraron en medio MS (Murashige and Skoog, 1962) al
100%, adicionando 30 g·L-1 de sacarosa. Los RCV utilizados para inducir la
formación a callo y brotación fue la combinación de la citocinina 6-bencilaminopurina
(BAP) y la auxina ácido indolbutírico (AIB), puesto que citados RCV son adecuados
para la inducción de callo y brote en Euphorbiaceas y otras familias (Dixon, 1991),
ambas a concentraciones de (0, 0.1, 0.25, 0.5 mg·L-1), y Phytagel® (SIGMA) (2.2 g·L-
1) como agente gelificante, los medios se ajustaron a un pH de 5.8 con NaOH y HCl
1N y 0.1 N, según se requirió. Finalmente se esterilizó en una autoclave (AESA CV
250) a 121°C (1.06 kg·cm-2) por 20 min.
De las plántulas obtenidas, así como del las de invernadero se tomaron hojas (1 cm2)
que fueron sembrados en medio MS al 50% utilizando como reguladores de
crecimiento la combinación de AIB (0.1 mg·L-1) y BAP (0.5 mg·L-1) con TDZ (0.5 y 1
mg·L-1), ANA y 2,4-D (0.5, 1.mg·L-1) ajustando a un pH de 5.7 (Soomro y Memon,
2007; Misra y col., 2010)
5.4. Inducción de brotes y callo
Para el cultivo de brotes y callo, se utilizaron frascos de vidrio de 90 ml de capacidad
con sellado semihermético, conteniendo 20 ml del medio de cultivo MS semisólido
estéril para evitar la contaminación de los cultivos. Las condiciones de incubación
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para los explantes en la cámara de cultivo (Figura 4) fueron: 25± 2°C, con un
fotoperiodo de 16 h luz / 8 h oscuridad (4.89 klx).
Figura 4. Explantes bajo condiciones controladas en cámara de cultivo.
Se realizaron subcultivos de los brotes cada 15 días y de 20 días para los callos,
incubándose en las mismas condiciones (Rodríguez, 2007). Se evaluó el número de
brotes por explante y formación de callo. Los callos obtenidos se evaluaron tomando
en cuenta el tamaño (ancho, cm), color (evaluación visual, callos verdes o cafés), así
como la consistencia del mismo (friable y no friable), para lo cual se utilizó la
siguiente simbología:
Cuadro 3. Simbología para identificación del tamaño, consistencia y color del callo
Tamaño del callo Símbolo No inducido NI
Pequeño + Mediano ++ Grande +++
Consistencia Friable F
No friable NF
Color Verde Café
V C
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5.5. Cinética de crecimiento y tamaño de los callos
La cinética de crecimiento se realizó de acuerdo al método propuesto por Stepan-
Sarkissian (1990), para lo cual se registró el peso fresco (PF) y el peso seco (PS) de
los cultivos celulares cada 5 días con tres repeticiones. Para la determinación del PF,
se colocaron los callos en papel aluminio llevado previamente a peso constante e
inmediatamente se pesaron en una balanza analítica (OHAUS GA200D).
Posteriormente esos mismos callos se introdujeron en una estufa a 50 ºC durante 48
h hasta llegar a peso constante, obteniéndose así los valores de PS por unidad de
volumen mediante la diferencia de pesos con respecto al papel aluminio. Con los
datos obtenidos se trazaron las gráficas correspondientes a las cinéticas de
crecimiento (PF y PS en función del tiempo) y a partir de éstas se calculó la
velocidad específica de crecimiento y el tiempo de duplicación de las células
mediante las siguientes ecuaciones (Rodríguez, 2007).
Tiempo de duplicación celular (tdc)
tdc= ln2 = 0.693 [días] m m
Velocidad específica de crecimiento (µ) a partir de tdc
µ= 1 [d-1] tdc
Donde: m: pendiente de la recta en la fase exponencial
ln2: logaritmo natural de 2
µ: velocidad específica de crecimiento
En cuanto al tamaño de los callos se midió el crecimiento radial (expansión) cada 5
días por triplicado, tomando en consideración la longitud máxima (tamaño
comprendido entre los extremos laterales del callo) de la masa celular, para lo cual
se colocó el callo en papel milimétrico y se registró el tamaño, reportándolo en cm
correspondientes. Con los datos obtenidos se calculó la velocidad de crecimiento
radial cada 5 días (cm·5 días-1) (Cosgrove, 2000).
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5.6. Obtención de extractos y de las fracciones proteicas
De los subcultivos de brote y callo realizados con el tratamiento seleccionado (Figura
5) se prepararon los extractos para el fraccionamiento y cuantificación de proteínas.
Figura 5. Diagrama experimental para la obtención de extractos, fraccionamiento y
cuantificación de proteínas de extractos de J. curcas.
-
27
60%Se pesó 1 g del material vegetativo in vitro subcultivado (plántula y callo), las
muestras fueron congeladas a -15±2°C por 2 h; posteriormente se trituraron con
mortero y se pusieron en agitación en frío a 4 °C con 4 ml de solución PBS a pH 7.2
(NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM y KH2PO 2 mM) por 3 h. La mezcla
muestra-PBS, se centrifugó (Centrífuga HERMLE Z383K) a 10,000 rpm por 25 min a
4°C, separando el sobrenadante el cual se saturó al 60% con sulfato de amonio
sólido (NH4)2SO4, después de 6 h, las proteínas precipitadas fueron separadas por
centrifugado a 10,000 rpm por 20 min y se disolvieron en la menor cantidad de PBS
(0.5 ml). La solución fue dializada en membranas (Dialysis tubing cellulose,
membrana 33 mm x 21 mm) por 24 h a 4 ºC con agua destilada, y posteriormente
con PBS pH 7.2 por 24 h. El precipitado se separó por centrifugación a 12000 rpm
durante 20 min, obteniendo el sobrenadante, considerándose como el extracto de
proteína cruda (Lin y col., 2010).
De los extractos obtenidos se inyectó 1.5 ml en columnas BIO-RAD™ de diferentes
dimensiones (3.0 x 100 cm, 1.0 x 50 cm y 3.0 x 30 cm), para probar en cual se
obtenía una mejor resolución de los picos máximos, éstas fueron empacadas a 55 ºC
con Sephadex G-100 previamente lavada e hidratada durante 24 h con PBS a pH
7.2, misma solución que fue utilizada como fase móvil. Las fracciones proteicas se
obtuvieron por cromatografía de exclusión por tamaño. De las fracciones obtenidas
se realizó un barrido espectrofotométrico a 280 nm en un espectrofotómetro (UV-
160A SHIMADZU, Japón) para trazar la gráfica correspondiente a los picos
cromatográficos de las fracciones proteicas resultantes (Stirpe y col., 1976; Lin y col.,
2010).
5.7. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico
De las fracciones proteicas obtenidas, así como de los extractos de proteína cruda
(sin fraccionar) se cuantificó la concentración de proteínas totales mediante el
método colorimétrico del BCA (Bollag y Edelstein, 1991). Para tal efecto se preparó
una recta de calibración de estándares (Cuadro 4), con suero de albúmina de bovino
-
28
(BSA) disuelta en PBS (pH 7.2), a cada concentración de la recta se agregó 2 ml de
BCA (sulfato cúprico al 4% p/v + ácido bicinconìnico, Kit SIGMA).
Cuadro 4. Recta de estándares de BSA
µg·ml-1 BSA
BSA µg·ml-1
BCA ml
Volumen total, ml A
0 0 2 2.1 0 200 20 2 2.1 0.252 400 40 2 2.1 0.393 600 60 2 2.1 0.630 800 80 2 2.1 0.801 1000 100 2 2.1 0.933
Se agitó ligeramente y dejó en reposo por 2 h a 25 ºC. Finalmente se leyeron las
absorbancias a 562 nm en un espectrofotómetro (Figuras 6 y 7). Se realizó la misma
operación con las muestras, tomando 100 µl de cada extracto (Vepachedu y col.,
2003; Sharma y col., 2004).
Figura 6. Soluciones estándar de BSA para la cuantificación de proteínas
-
29
Figura 7. Recta de estándares de BSA.
5.8. Identificación de pesos moleculares de las proteínas por SDS-PAGE
Las fracciones obtenidas, así como los extractos referidos como proteína cruda
fueron analizados por electroforesis desnaturalizante. Se probaron dos métodos para
la concentración de proteínas:
a) Tomando alícuotas de 0.5 ml de las fracciones proteicas y los extractos crudos
sin fraccionar, se concentraron en una solución metanol-cloroformo-agua 2:1:1
por 24 h, posteriormente se separaron las fases de la solución por
centrifugación a 10,000 rpm por 10 min y el pelet obtenido fue analizado
mediante electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE).
b) Otro método fue tomando alícuotas con concentraciones de 1mg·ml-1 de
proteína, y fueron concentradas con bomba de vacío por 1h.
Las muestras obtenidas (alícuotas que contenían 100 µg·ml-1 proteína) en ambos
métodos, fueron homogenizadas con regulador de carga (trizma base pH 6.8, SDS al
10%, glicerol al 50%, β-mercaptoetanol G.R., azul de bromofenol al 0.1%) en una
relación 1:1. Las muestras fueron desnaturalizadas a 95 °C por 5 min, y
centrifugadas a 5000 rpm durante 5 min. Se tomaron alícuotas de 25 μl del
-
30
sobrenadante obtenido anteriormente y se cargaron en geles de poliacrilamida a
concentraciones del 12%, los cuales fueron puestos en una cámara de electroforesis
con soluciones de tris-glicina (tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0.1%) a 40 mA, 100
V por 2 h (BIO-RAD Power Pac basic™). Los geles fueron revelados con solución de
azul de Coomassie coloidal (Biorad safe – Coomassie stain 161-0787) (Bollag y
Edelstein, 1991).
-
31
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Establecimiento del cultivo in vitro de J. curcas
La formación de callo, se indujo a partir de explantes de tallo con un solo nudo
(Figura 8a), el análisis de cada tratamiento se llevó a cabo por triplicado. En las
observaciones realizadas en las primeras tres semanas (21 días) de incubación, los
explantes presentaron formación de células desdiferenciadas (callo), (Figura 8b) así
como brotes múltiples (Figura 8c), la en la mayoría de los tratamientos utilizados.
Figura 8. a) explante de segmento nodal, b) Inducción de callo, c) multibrotación.
6.1.1. Inducción de brotes
En el caso de la multibrotación los tratamientos con AIB (0.1 mg·L-1) indujeron brotes
múltiples (1-4 brotes por explante) sin presencia de callo, mientras que con los
tratamientos AIB 0.5 mg·L-1 + BAP 0.25 mg·L-1 y AIB 0.1 mg·L-1 + BAP 0.25 mg·L-1 se
indujeron mayor número de brotes. Los explantes de tallo con un solo nudo
presentaron sus primeros brotes a los cinco días de cultivo. Entre los días 14-16 se
obtuvieron entre 2-3 brotes por explante, observándose a los 21-25 días de cultivo
plántulas de J. curcas con 7 a 9 brotes por explante (Figura 9). Publicaciones como
las de Datta y col. (2007) reportaron la inducción de brotes a partir de nodales de J.
-
32
curcas a los 28-42 días de incubación, de igual forma que Banerjee y Shrivastava
(2008) obtuvieron brotes con los mismos explantes a los 21-28 días de cultivo,
utilizando AIB y BAP a concentraciones más altas que las utilizadas en esta
investigación, además de otros aditivos como sulfato adenina, glutamina, L-arginina y
ácido cítrico.
Figura
9. Brotación de los explantes de J. curcas a partir de tallos con un solo nudo.
En este trabajo, no sólo se obtuvieron brotes múltiples en menor tiempo (21 días)
que es los citados anteriormente, sino que presenta la ventaja de obtener mayor
número de brotes (7-9 brotes) e inducción del 100% de brotes (Cuadro 5) a menor
concentración de AIB, ya que en el caso de Banerjee y Shrivastava (2008) utilizan 2-
3 mg·L-1 para obtener el 100% de inducción, mientras que Datta y col. (2007)
obtuvieron 52% de inducción con MS y AIB 0.2 mg·L-1.
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33
El número de brotes por explante fue evaluado mediante un análisis de varianza
simple y por comparación de medias de Tuckey, utilizando un nivel de confianza del
95% (Montgomery, 2004).
Cuadro 5. Número de brotes inducidos por explante en cada tratamiento
No.
Tratamiento
RCV
mg·L-1
No.de
brotes
AIB BAP
1 0 0 1ª
2 0 0.1 2b
3 0 0.25 2b
4 0 0.5 1ª
5 0.1 0 1ª
6 0.1 0.1 2b
7 0.1 0.25 7c
8 0.1 0.5 4d
9 0.25 0 NI
10 0.25 0.1 2b
11 0.25 0.25 NI
12 0.25 0.5 1ª
13 0.5 0 1ª
14 0.5 0.1 2b
15 0.5 0.25 9e
16 0.5 0.5 2b
NI: no inducido; fueron tres repeticiones de cada tratamiento; diferentes letras en los valores del No de brotes indican diferencia significativa P
-
34
Es importante recalcar que en el caso de los tratamientos AIB (0.5 mg·L-1) combinado
con BAP (0.25 y 0.5 mg·L-1) también se observó la inducción simultánea de brotes y
callo en el mismo explante (Figura 10).
Figura 10. Brotación múltiple y callo de J. curcas a partir del mismo explante.
Uno de los inconvenientes en el cultivo de los brotes fue que después del tercer o
cuarto subcultivo se presentó la contaminación por bacteria en el 25% de los
explantes, la cual se observaba por la formación de un halo de apariencia lechoso y
blanquecino alrededor del explante. En un principio se utilizó como antibiótico
Cefotaxima® 500 mg aplicando sobre el medio (100 mg·L-1) en los subcultivos, el
cual disminuyó la contaminación a un 10 % de las plantas subcultivadas.
Según las características observadas, este problema podría tratarse de una bacteria
endófita de J. curcas identificada por Misra y col. (2010), como Enterobacter ludwigii;
basándose en este reporte, cuando se volvió a presentar contaminación bacterial se
utilizó el Augmentin® (Amoxicilina 250 mg·5ml-1 + clavulanato de potasio 62.5
mg·5ml-1) adicionando al medio concentraciones de 100 mg·L-1 como antibiótico, con
lo cual se eliminó por completo la contaminación.
-
35
También se presentó contaminación por hongo en uno de los cultivos iniciales la cual
pudo deberse a un mal manejo del material en el proceso de desinfestación, ya que
en la resiembra de subcultivos no se presentó este problema, por lo que como
medida preventiva en los siguientes cultivos, los explantes además de ser tratados
por la desinfestaciòn adecuada, fueron tratados con una solución de Benomyl® del
1% antes de ser sembradas en el medio MS.
6.1.2. Inducción de callo
Los callos formados fueron diferentes en cuanto a tamaño, color y consistencia
(friable y no friable), mostrándose también diferencias significativas con una P
-
36
Cuadro 6. Características de los callos obtenidos en los diferentes tratamientos
No.
Tratamiento
RCV
mg·L-1
Tamaño del callo Inducción de callo
%
Consistencia
AIB BAP
1 0 0 + 22.2a NF
2 0 0.1 ++ 55.5b F
3 0 0.25 + 44.4c NF
4 0 0.5 + 88.8d NF
5 0.1 0 + 22.2a NF
6 0.1 0.1 + 66.6e NF
7 0.1 0.25 + 66.6e NF
8 0.1 0.5 + 55.5b F
9 0.25 0 NI 0 ---
10 0.25 0.1 + 88.8d F
11 0.25 0.25 NI 0 ---
12 0.25 0.5 + 66.6e NF
13 0.5 0 + 44.4c F
14 0.5 0.1 ++ 66.6e F
15 0.5 0.25 +++ 100f F
16 0.5 0.5 +++ 100f F
NI: no inducido; tamaño de callo: (+) pequeño, (++) mediano, (+++) grande; %, Porcentaje de explantes que formaron callo de las tres repeticiones de cada tratamiento; F: friable, NF: no friable; diferente letra en los % de callo indican diferencia significativa P
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37
Con esta prueba se observa que las condiciones de diferenciación celular y su
respuesta a los factores físicos controlados (fotoperíodo, humedad, temperatura,
nutrientes, RCV pueden variar entre plantas de la misma especie, como en el trabajo
de López-Hernández y col. (2008) quienes trabajaron con plantas de J. curcas de
diferente procedencia (africana y cubana) utilizando en ambos casos los mismos
explantes (hoja, hipocotilo e inflorescencias) y RCV (BAP y 2,4-D), obteniendo en la
de procedencia cubana 100% de callos a partir de pecíolo con BAP 0.5 y 1.5 mg·L-1 y
50% de callos a partir de hoja a los 30 días de cultivo. Mientras que el genotipo
africano presentó el mayor rendimiento de callos a partir de explanes de hoja a
concentraciones de 2,4-D 0.5, 1 y 2 mg·L-1, igualmente a los 30 días de cultivo.
Una vez inducidos los callos, el 50% de éstos fue subcultivado en medio MS con los
tratamientos AIB 0.5 mg·L-1 + BAP 0.25 mg·L-1, mientras que el 50% de los callos
restantes fueron resembrados en la combinación AIB 0.5 + BAP 0.5 mg·L-1, puesto
que fueron los tratamientos que mostraron mejor inducción de callo.
Al tercer subcultivo se observó que los callos resembrados en el tratamiento AIB 0.5
mg·L-1 + BAP 0.25 mg·L-1 seguían presentado coloración verde y consistencia friable
(disgregación de la masa celular), además de que hubo aumento de tamaño del callo
(Figura 11a). Mientras que en callos subcultivados en MS con AIB 0.5 + BAP 0.5
mg·L-1 se inició el proceso de necrosis desde el segundo subcultivo (Figura 11b),
presentándose necrosis de toda la masa celular en material subcultivado en el
tratamiento AIB 0.5 mg·L-1 + BAP 0.5 mg·L-1 (Figura 11c).
-
38
Figura 11. Subcultivo de callos: a) callo verde y friable, b) inicio de necrosis, c)
necrosis completa del callo.
Puesto que los callos del tratamiento AIB 0.5 mg·L-1 + BAP 0.5 mg·L-1presentaron
necrosis los siguientes subcultivos en este medio fueron tratados con carbón
activado (1 mg·L-1) y L-cisteína (0.4 mg·L-1) (Azofeifa, 2009), sin embargo, estos
antioxidantes no mostraron respuesta positiva, ya que los callos continuaron
necrosándose (Figura 12).
Figura 12. Tratamiento de callos con antioxidantes a) L-cisteína y b) carbón activado.
-
39
Por otra parte, en los cultivos a partir de hoja y pecíolo de J. curcas tratados con AIB
Y BAP combinados con 2,4-D (0.5 y 1 mg·L-1), ANA (0.5 y 1 mg·L-1) y TDZ (0.5 y 1
mg·L-1), no hubo respuesta a brotación, y en cuanto a la inducción de callo sólo se
presentó callo compacto y no friable en la combinación de (AIB 1 mg·L-1) + (BAP 0.5
mg·L-1) y TDZ (1 mg·L-1) en un 25% de los explantes de hoja hasta los 30 días de
incubación, a diferencia de Misra y col. (2010) y Soomro y Memon (2007), que
reportan obtención de brotes y callo con dichos reguladores.
Con base a condiciones como son los RCV en el medio, consistencia y tamaño del
callo, los subcultivos se continuaron cada 20 días en el tratamiento AIB 0.5 mg·L-1 +
BAP 0.25 mg·L-1 que presentaron mejores resultados también para la obtención de
brotes
6.1.3. Cinética de crecimiento y aumento de tamaño de las células
desdiferenciadas
Respecto al crecimiento de los callos, se observó que entre los días 20-45 fue
constante, obteniendo el mayor tamaño entre los días 35-45, hasta el día 50 que
comenzó a observarse la muerte de la masa celular (Figura 13). En cuanto al tiempo
de vida del callo de J. curcas fue mayor en este caso, en comparación con el trabajo
de Misra y col. (2010) que mantuvieron callos hasta el segundo y tercer subcultivo
(25 días de incubación), pues posteriormente comienzan a presentar problemas de
infección por bacteria (Enterobacter ludwigii).
-
40
Figura 13. Crecimiento radial de los callos de J. curcas medidos cada 5 días: a) día
20 b) día 25, c) día 30, d) día 35, e) día 40, f) día 45.
Se midió la longitud máxima de los callos ya que el crecimiento de éstos fue más
notorio en cuanto a su expansión. Los resultados de la longitud máxima de los callos
dieron una pendiente (m) de 0.1128, obteniéndose una velocidad de crecimiento
radial de 0.563 cm·5días-1. En la gráfica correspondiente a la velocidad de
crecimiento radial (Figura 14) se muestran tres etapas de expansión del callo, las
cuales podría estar relacionadas con la estructura y composición de la pared celular
de las células, la cual puede modificarse por A) crecimiento de las células
meristemáticas, B) cambios en los componentes de pared celular o C) por acción de
las enzimas (Cosgrove, 2000).
Comúnmente el crecimiento de los callos es asincrónico, sin embargo, en ocasiones
se presenta un crecimiento sincrónico que podría deberse a que durante las
diferentes fases de crecimiento pueden presentarse procesos de síntesis de
proteínas y otros metabolitos que las células necesiten (Cosgrove, 2000).
-
41
Figura 14. Velocidad de crecimiento radial de callos de J. curcas.
Respecto al crecimiento celular, las gráficas de la cinética del callo de J. curcas,
tanto de PF como de PS coincidieron presentando un perfil típico sigmoide en el que
se observaron las fases de crecimiento celular.
En el caso del PF (Figura 15), la fase de reposo (lag) en la que el cultivo no presentó
crecimiento y comenzó a adaptarse a las condiciones del medio fue del día 0 al 10,
iniciando su crecimiento del día 12 al 20 e incrementó la velocidad de crecimiento del
día 21 al 40 durante las fases exponencial y lineal.
De los días 41 al 50 de presenta la fase de disminución progresiva para
posteriormente entrar a la fase estacionaria, momento en que se van agotando los
nutrientes para finalmente entrar a la etapa de muerte celular. Visualmente a partir
del día 45 los callos comenzaron a presentar necrosis (Hurtado y Merino, 1988).
-
42
Figura 15. Cinética de crecimiento en base a PF de callos de J. curcas.
Por otra parte a cinética del PS (Figura 16) también tuvo una etapa de adaptación
durante los primeros 10 días del cultivo. Las etapas exponencial y lineal del PS, al
igual que las de PF se observaron de los días 15 al 40. En el día 41 la velocidad de
división comenzó a disminuir gradualmente. Está disminución en base a PS podría
deberse a que por la disminución de nutrientes, los compuestos presentes en las
células pueden comenzar a hidrolizarse o incluso iniciar un proceso de autofagia
celular. (Cosgrove, 2000).
El cultivo de callo de J. curcas presentó en base al PF un tiempo de tdc de 6.64 días
y una µ de 0.151 d-1.
-
43
Figura 16. Cinética de crecimiento en base a PS de callos de J. curcas.
La cinética de crecimiento celular de callos de J. curcas resultante mostró un
comportamiento similar (gráfica sigmoide) a la reportada por Memon y Soomro,
(2007) la cual pertenece a una cinética de crecimiento de callos obtenidos a partir de
explantes de hipocotilo en medio MS adicionado con 2,4-D, en la que se observó un
un crecimiento celular acelerado de los días 7 al 30.
-
44
6.2. Obtención de extractos y fracciones proteicas Para el fraccionamiento de los extractos proteicos se siguió la metodología reportada
por Stirpe y col. (1976) y Lin y col. (2010); sin embargo cuando se uso la columna de
3.0x100 cm no se obtuvieron picos de elución correspondientes a las fracciones que
ellos reportan. Aún cuando se utilizó la misma metodología, una razón por la que no
se mostraron picos máximos en este fraccionamiento pudo deberse a la baja
concentración de proteína en la muestra de plántula in vitro, pues dichos autores
trabajaron con extractos de semilla de J. curcas, parte de la planta en la que se ha
reportado la mayor concentración de proteína.
Debido a los inconvenientes se trabajó con columnas de menor tamaño. Se inyectó
el extracto de hoja in vitro en una columna 3.0x30 cm, recuperando 55 fracciones (2
ml·12 min-1), en las que se presentaron cuatro picos máximos en las fracciones 23 a
la 42 con absorbancias entre 0.100-0.379 nm a un λde 280 nm (Figura 17).
Figura 17. Perfil de elución de cromatografía de exclusión molecular de extracto
proteico de plantas in vitro de J. curcas (3.0x30 cm).
El perfil de elución con la columna anterior no tuvo buena resolución de los picos
máximos por lo que se utilizó una columna de 1.0x50 lo cual sería más eficiente para
el fraccionamiento del extracto.
-
45
De las fracciones proteicas obtenidas de esta columna también se llevó a cabo un
barrido espectrofotométrico a una λ de 280 nm, obteniendo cuatro picos máximos. El
pico I se obtuvo en las fracciónes 5-6, y los picos II, III, IV estuvieron formados por
las fracciones 26-45 (Figura 18).
La mejor resolución de picos fue la de 1.0x50 cm, por los que los fraccionamientos se
continuaron con dicha columna.
Figura 18. Perfil de elución de cromatografía de exclusión molecular de extracto
proteico de plantas in vitro de J. curcas.
Al igual que para la plántula in vitro, se fraccionó el extracto de proteína cruda del
callo y las fracciones obtenidas fueron leídas a una λ de 280 nm, obteniendo de este
barrido espectrofotométrico tres picos máximos, referidos como pico I el cual está
formado por las fracciones 13 y 14, el pico II de las fracciones 32-43 y el pico III
correspondiente a la fracción 48 (Figura 19).
-
46
Figura 19. Perfil de elución de cromatografía de exclusión molecular de extracto
proteico de callo de J. curcas.
Puesto que no hay un estándar de curcina, como control positivo se preparó y
fraccionó un extracto de hoja de crotón (Croton tiglium) basándose en Stirpe y col.
(1976), trabajo en el que comparan la curcina con la crotina y reportan la purificación
de la curcina en semillas de J. curcas en la que obtiene tres picos I, II y III en el orden
de elución, los cuales corresponden a las fracciones 45, 100 y 135-60. Así mismo
este autor, demostró que la curcina en J. curcas es similar a la crotina extraída del
crotón, también perteneciente a la familia de las Euphorbiaceaes, ya que al
fraccionar los extractos se obtienen los mismos picos cromatográficos, por lo que
estas proteínas tienen pesos moleculares similares y demostraron ser tóxicas ante
una DL50 (probada en ratones).
El perfil de elución del control positivo (croton) presentó tres picos I II y III, en las
fracciones 8-11, 21-36 y 39 respectivamente (Figura 20). Los picos graficados del
extracto de plántula in vitro, así como de callo de J. curcas coincidieron con los picos
obtenidos del control positivo.
-
47
Figura 20. Perfil de elución de cromatografía de exclusión molecular de extracto
proteico croton.
Como segundo control positivo, se fraccionó un extracto de semilla de J.curcas de
acuerdo a Lin y col. (2010), quienes purificaron curcina a partir de extractos de
semillas maduras de J. curcas. Como resultado se obtuvieron dos picos en las
fracciones 11-13 y 31-40 (Figura 21).
Figura 21. Perfil de elución de cromatografía de exclusión molecular de extracto
proteico de semilla J. curcas.
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48
Otra de las razones por las que se utilizó como control positivo e