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ACTIVIDAD BIOESTIMULANTE DE EXTRACTOS DE MACROALGAS Y SU

EVALUACIÓN SOBRE EL CRECIMIENTO DE FRIJOL MUNGO (Vigna radiata)

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORA EN CIENCIAS MARINAS

PRESENTA

DANIA ANDREA DI FILIPPO HERRERA

LA PAZ, B.C.S., MÉXICO. DICIEMBRE DE 2018

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS

DEDICATORIA

A mi padre por siempre inculcarme el hábito de cuestionar todo lo que me rodea.

Tú has sido mi ejemplo a seguir.

AGRADECIMIENTOS

A mi familia por apoyarme incondicionalmente en todo lo que me he propuesto en la

vida.

A mis directores por ser el pilar y motor en mi formación personal y profesional.

Al comité tutorial por el tiempo y su aporte en mi formación profesional,

especialmente a la doctora Rosalba Mireya Hernández Herrera, la cual ha sido una

directora más en este trabajo de investigación.

A mis compañeros del laboratorio de Química de Algas Marinas en CICIMAR por

estar siempre presente y apoyarme personal y académicamente.

Al Instituto Politécnico Nacional por la oportunidad de formarme como mejor

profesional.

A CONACyT y BEIFI por el apoyo económico en mis años de doctorado.

i

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

Índice de figuras ii

Índice de tablas v

Resumen vi

Abstract vii

1. Introducción 1

2. Antecedentes 6

3. Planteamiento del problema 31

4. Hipótesis 32

5. Objetivos 33

6. Metodología 34

8. Resultados 42

9. Discusión 75

10. Conclusión 90

11. Recomendaciones 92

12. Literatura citada 93

ii

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig. Pág.

1 Espectro de infrarrojo de los fucoidanos de Ecklonia arborea (EA-FC) y Sargassum

horridum (SH-FC)

49

2 Espectro de infrarrojo de los alginatos de Ecklonia arborea (EA-FC) y Sargassum horridum

(SH-FC)

50

3 Espectro de infrarrojo del agar obtenido de Gracilaria parvispora (GP-AG) 50

4 Curva dosis-respuesta del porcentaje de germinación (GP) a los extractos alcalinos de

Macrocystis pyrifera (MP), Sargassum horridum (SH), Ecklonia arborea (EA), Acanthophora

spicifera (AS), Gelidium robustum (GR) y Gracilaria parvispora (GP) a diferentes

concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 y 2.0%). Los valores representan la media de n

= 30 plántulas; las barras representan errores estándar. La marca (──) indica la línea de

base de la figura que corresponde al control.

52

5 Efecto de los extractos líquidos alcalinos de Macrocystis pyrifera (MP), Sargassum

horridum (SH), Ecklonia arborea (EA), Acanthophora spicifera (AS), Gelidium robustum

(GR) y Gracilaria parvispora (GP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 y

2.0 %) en a) longitud del tallo, b) longitud de la raíz, y c) longitud total de la planta del frijol

mungo. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

54

6 Efecto de los extractos líquidos alcalinos de Macrocystis pyrifera (MP), Sargassum

horridum (SH), Ecklonia arborea (EA), Acanthophora spicifera (AS), Gelidium robustum

(GR) y Gracilaria parvispora (GP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 y

2.0 %) en a) peso fresco y b) peso seco de la planta de frijol mungo. Las barras

representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

55

7 Curva dosis-respuesta del porcentaje de germinación (PG) de las mezclas de los extractos

líquidos GRGP (G. robustum y G. parvispora), EAGP (E. arborea y G. parvispora), MPGP

(M. pyrifera y G. parvispora), MPGR (M. pyrifera y Gelidium robustum), EAGR (E. arborea y

G. robustum), MPEA (M. pyrifera y E. arborea), y NPKelp = Producto comercial, a

diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 and 2.0 %). Los valores representan

la media de n = 30 plántulas; las barras representan errores estándar. La marca (──)

indica la línea de base de la figura que corresponde al control.

56

8 Efectos de las diferentes mezclas a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 y

2.0 %) en: a) longitud del tallo, b) longitud de la raíz, y c) longitud total de plantas de frijol

mungo. GRGP = (Gelidium robustum + Gracilaria parvispora, EAGP = (Ecklonia arborea +

Gracilaria parvispora), MPGP = (Macrocystis pyrifera + Gracilaria parvispora), MPGR =

(Macrocystis pyrifera + Gelidium robustum), EAGR = (Ecklonia arborea + Gelidium

robustum), MPEA = (Macrocystis pyrifera + Ecklonia arborea), y NPKelp = Producto

comercial. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias

significativas

57

9 Efecto de las diferentes mezclas a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1 y 2 59

iii

%) en: a) peso fresco y b) peso seco de la planta de frijol mungo. GRGP = (Gelidium

robustum + Gracilaria parvispora, EAGP = (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora),

MPGP = (Macrocystis pyrifera + Gracilaria parvispora), MPGR = (Macrocystis pyrifera +

Gelidium robustum), EAGR = (Ecklonia arborea + Gelidium robustum), MPEA =

(Macrocystis pyrifera + Ecklonia arborea), y NPKelp = Producto comercial. Las barras

representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

10 Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre la longitud del tallo de plantas de

frijol mungo a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25 %) en tres proporciones

diferentes de mezclas de algas en: a) 30:70 p/p, b) 50:50 p/p y c) 70:30 p/p. EAGPBM=

(Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPBM= (Sargassum horridum + Gracilaria

parvispora) por el método de extracción en baño María y EAGPAC = Ecklonia arborea +

Gracilaria parvispora) y SHGPAC= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el

método de autoclavado y NPKelp = Producto comercial. Las barras representan el error

estándar y los asteriscos diferencias significativas.

61

11 Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre la longitud de la raíz de plantas de

frijol mungo a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25 %) en tres proporciones

diferentes de mezclas de algas en: a) 30:70 p/p, b) 50:50 p/p y c) 70:30 p/p. EAGPBM=

(Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPBM= (Sargassum horridum + Gracilaria

parvispora) por el método de extración en baño María y EAGPAC = Ecklonia arborea +




63

12 Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre la longitud total de plantas de frijol

mungo a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25 %) en tres proporciones diferentes de

mezclas de algas en: a) 30:70 p/p, b) 50:50 p/p y c) 70:30 p/p. EAGPBM= (Ecklonia

arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPBM= (Sargassum horridum + Gracilaria





64

13 Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre el peso fresco de plantas de frijol








65

14 Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre el peso seco de plantas de frijol 67

iv








15 Incremento del porcentaje de germinación (GP) de semillas de frijol mungo tratadas con los

polisacáridos (fucoidano (FC), alginato (ALG) obtenidos de las algas Ecklonia arborea (EA),

Sargassum horridum (SH) y el agar (AG) de Gracilaria parvispora (GP).

68

16 Efecto de los polisacáridos fucoidano (FC) y alginato (ALG) obtenidos de Ecklonia arborea

(EA) y Sargassum horridum (SH) y el agar (AG) obtenido de Gracilaria parvispora (GP) a

diferentes concentraciones (0.06, 0.12 y 0.25 %) en a) longitud del tallo, b) longitud de la

raíz, y c) longitud total de la planta del frijol mungo. Las barras representan el error

estándar y el asterisco sobre las barras diferencias significativas con respecto al control

(línea base de las gráficas).

69

17 Efecto de los polisacáridos fucoidano (FC) y alginato (ALG) obtenidos de Ecklonia arborea

(EA) y Sargassum horridum (SH) y el agar (AG) obtenido de Gracilaria parvispora (GP) a

diferentes concentraciones (0.06, 0.12 y 0.25 %) en a) peso fresco, b) peso seco de la

planta del frijol mungo. Las barras representan el error estándar y el asterisco sobre las

barras diferencias significativas con respecto al control (línea base de las gráficas).

71

18 Incremento del porcentaje de germinación (PG) de semillas de frijol mungo tratadas con

extractos etanólicos (OH) de Ecklonia arborea y Gracilaria parvispora (EAGP) y Sargassum

horridum y Gracilaria parvispora (SHGP).

72

19 Efecto de los extractos etanólicos (OH) de Ecklonia arborea y Gracilaria parvispora (EAGP)

y Sargassum horridum y Gracilaria parvispora (SHGP) a diferentes concentraciones (0.06,

0.12 y 0.25 %) en la a) longitud del tallo, b) longitud de la raíz, y c) longitud total de la

planta del frijol mungo. Las barras representan el error estándar y el asterisco sobre las

barras diferencias significativas con respecto al control (línea base de las gráficas).

73

20 Efecto de los extractos etanólicos (OH) de Ecklonia arborea y Gracilaria parvispora (EAGP)

y Sargassum horridum y Gracilaria parvispora (SHGP) a diferentes concentraciones (0.06,

0.12 y 0.25 %) en el a) peso fresco, b) peso seco de la planta del frijol mungo. Las barras

representan el error estándar y el asterisco sobre las barras diferencias significativas con

respecto al control (línea base de las gráficas).

74

v

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla Pág.

1 Minerales reportados en algas y extractos de algas marinas usados como BCV 12

2 Fitohormonas en extractos algales con actividad como BCV 17

3 Carbohidratos y ficocoloides algales con actividad como BCV 19

4 Carbohidratos y ficocoloides en extractos algales BCV 21

5 Proteínas y aminoácidos en extractos algales BCV 23

6 Lípidos, cenizas, vitaminas y pigmentos en extractos algales BCV 28

7 Compuestos de bajo peso molecular extraídos con solventes orgánicos con

actividad BCV

30

8 Composición química proximal de las algas marinas en % de polvo seco del

peso del alga molida

42

9 Composición química de los extractos algales ELAs 43

10 Composición química de las mezclas de extractos algales MELAs 45

11 Composición química de los EMAs preparados en baño María. Proporciones

de tejido algal mezclado (p/p) de E. arborea y G. parvispora (EAGP), S.

horridum y G. parvispora (SHGP)

46

12 Composición química de los EMAs preparados en autoclave. Proporciones de

tejido algal mezclado (p/p) de E. arborea y G. parvispora (EAGP), S. horridum

y G. parvispora (SHGP)

48

13 Perfil fitoquímico de extractos etanólicos EAGP-OH (Ecklonia arborea +

Gracilaria parvispora) y SHGP-OH (Sargassum horridum + Gracilaria

parvispora). X=presencia de los compuestos.

51

14 Efecto de los extractos líquidos alcalinos de mezclas de algas (EMAs) en el

porcentaje de germinación (PG).

60

vi

RESUMEN

Extractos líquidos alcalinos individuales y mezclados a partir de algas rojas

(Acanthophora spicifera, Gelidium robustum y Gracilaria parvispora) y pardas

(Macrocystis pyrifera, Sargassum horridum y Ecklonia arborea) fueron evaluados

como bioestimulantes de crecimiento vegetal, así como fucoidanos, alginatos, agar y

extractos etanólicos. Los extractos fueron aplicados a varias concentraciones (0.06,

0.12, 0.25, 0.5, 1 y 2 %) y mostraron diferencias significativas (p ≤ 0.05) en la

longitud y peso de frijol mungo. El mayor incremento en el porcentaje de germinación

fue del 9 % sobre el control y se obtuvo usando la mezcla de los extractos de M.

pyrifera y G. robustum (MPGR), a una concentración del 0.5 %. El mejor efecto

bioestimulante se obtuvo en la longitud del tallo (39 %) usando el extracto líquido de

E. arborea al 0.25 %, así como el mayor incremento en longitud total (27 %) a una

concentración del 2 %. Adicionalmente, el mayor incremento en la longitud de la raíz

de frijol mungo fue del 35.6 % y se obtuvo con la mezcla de los extractos de E.

arborea y G. parvispora, a una concentración del 1 %. Comparado con el control, el

mayor incremento en el peso fresco fue del 43.2 % y se observó en las plantas

tratadas con el extracto de G. robustum a una concentración del 2 %. En contraste, el

mejor efecto bioestimulante de aumento del peso seco se obtuvo con la mezcla de

los extractos de E. arborea y G. parvispora al 25 % con un incremento del 45 %.

Aunque no todas las mezclas de algas y extractos mostraron un incremento

significativo sobre el control, se pudo observar un efecto sinérgico al combinar los

extractos individuales. De la misma forma los polisacáridos fucoidano y agar

presentaron una actividad bioestimulante superior a la de los extractos líquidos

estudiados. Este resultado sugiere que estos polisacáridos tienen actividad tipo

hormona. Se concluye que el uso de E. arborea, G. parvispora y la mezcla de sus

extractos líquidos alcalinos y los polisacáridos fucoidano y agar como

bioestimulantes de crecimiento vegetal para el recubrimiento / remojo de semillas es

una opción prometedora para una agricultura sostenible que apunta a reducir el uso

de fertilizantes minerales.

vii

ABSTRACT

Experimental alkaline and blended seaweed liquid extracts were produced from red

seaweed (Acanthophora spicifera, Gelidium robustum and Gracilaria parvispora) and

brown seaweed (Macrocystis pyrifera, Sargassum horridum and Ecklonia arborea)

and were evaluated on the germination and growth of the mung bean (Vigna radiata),

as well as fucoidans, alginates, agar and ethanolic extracts. The extracts were

applied at variable concentrations (0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 1 and 2 %) and showed

significant differences (p ≤ 0.05) between the effects of the varying seaweed liquid

extracts on the mung bean. The maximum increment in the germination percent (9 %)

over the control, was obtained using the 0.5 % that the blended of extracts from M.

pyrifera and G. robustum (MPGR). The best biostimulant effect was observed in the

shoot length, with an increase of 39 %, compared to the control using 0.25 % that que

liquid seaweed extract from E. arborea, as well as, an increase of 27 % was obtained

with a 2 % in the total length. Additionally, the maximum root length of 35.6 % was

obtained using 1 % form the blended of the extracts from E. arborea and G.

parvispora. Compared to the control, the maximum fresh weight average with an

increase of 43.2 % was obtained with a 2 % G. robustum extract. In contrast, the

maximum dray weight average with an increase of 45 % was obtained with 0.25 %

bend composed of E. arborea and G. parvispora. Although not all the experimental

alkaline and blended seaweed liquid extracts showed a significant increase over the

control, but, a synergistic effect can be observed when combining the individual

seaweed extracts. In the same way, fucoidan and agar polysaccharides showed a

biostimulant activity superior to that some liquid extracts studied. This result suggests

that these polysaccharides have hormone-like activity. Finally, we can conclude that

the use of E. arborea, G. parvispora and the mixture of its alkaline liquid extracts,

fucoidan and agar as plant growth biostimulants for the coating / soaking of seeds is a

promising option for a sustainable agriculture that aims to reduce the use of mineral

fertilizers.

1

1. INTRODUCCIÓN

Los extractos de algas marinas son ampliamente utilizados en la agricultura como

bioestimulantes de cultivos vegetales. Según la definición de du Jardin (2015), un

bioestimulante es una sustancia que mejora la eficiencia de la nutrición, la tolerancia

al estrés abiótico y las características de calidad de los cultivos, independientemente

de su contenido de nutrientes. Las ventajas de usar extractos de algas marinas como

estimulantes para el crecimiento de las plantas incluyen, mayor tasa de germinación,

desarrollo del sistema radicular, así como mayor área foliar, número de hojas, brotes,

peso de la planta, calidad de la fruta y vigor de la planta (Hong et al., 2007; Rayorath

et al., 2008; Khan et al., 2009; Sunarpi et al., 2010; Craigie, 2011; Vinoth et al.,

2012a, b; Babu y Rengasami, 2012; Mattner et al., 2013; Chbani et al., 2013; Vinoth

et al., 2014; Arioli et al., 2015; Bharath et al., 2018; Layek et al., 2018; Prakash et al.,

2018).

El uso de extractos de macroalgas es una tecnología alternativa para remplazar los

bioestimulantes químicos convencionales en el cultivo de vegetales. En la actualidad,

los productos comerciales y experimentales derivados de especies de macroalgas se

basan en la extracción convencional con disolventes o en una hidrólisis a diferentes

pH: neutro (Hernández-Herrera et al., 2014a y b), alcalino (Briceño-Domínguez et al.,

2014; Hernández-Herrera et al., 2016) o en condiciones ácidas (Castellanos-Barriga

et al., 2017). Estos extractos muestran actividad bioestimulante en el crecimiento y

aumento de los parámetros bioquímicos de las plantas.

En México, el único bioestimulante líquido de origen algal orgánico es producido a

partir de las macroalgas de la Península de Baja California, Macrocystis pyrifera y

Gelidium robustum. El extracto NPKelp es producido por la compañía Algaspacific

mediante una mezcla de 59 % de algas frescas y un 41 % de agua y otros

ingredientes de extracción y estabilizadores ácidos, para su uso en la industria

agrícola (Hernández-Herrera et al., 2018; http://algaspacific.com/npkelp/).

http://algaspacific.com/npkelp/

2

Las algas son una fuente natural de compuestos bioestimulantes, ya que su

composición química incluye carbohidratos, proteínas, fitohormonas y metabolitos

secundarios como polifenoles y terpenos, los cuales mejoran el crecimiento vegetal

(du Jardin, 2015; Arioli et al., 2015). Además, hay casos en los que el uso de

extractos líquidos algales (ELAs) muestra la capacidad de formar complejos con

iones de Zn (II) (Michalak et al., 2017), indispensables para la formación de quelatos.

Por otro lado, se han descrito oligosacáridos (ulvanos) a partir de algas verdes

marinas y manitol de algas pardas, que son capaces de formar de manera efectiva

un complejo (quelatos) con átomos de boro, considerado un importante nutriente

vegetal (Dembitsky et al., 2002).

Los mecanismos de acción de los bioestimulantes en las plantas no son claros,

debido al complejo conjunto de moléculas bioactivas y sus proporciones presentes

en las algas. Por esta razón, los extractos algales pueden tener efectos tanto

negativos como positivos, debido a los componentes y dependiendo de la

concentración cuando se aplican directamente a las semillas y plantas. El estudio de

los componentes algales de forma individual como bioestimulantes puede ayudar a

elucidar la actividad de estos, sin embargo, la actividad bioestimulante puede ser el

resultado una acción sinérgica de todos los constituyentes en la mezcla (Ertani et al.,

2018). Los efectos de los bioestimulantes no siempre son consistentes entre las

especies de plantas. Esto es porque las plantas pueden exhibir umbrales de

sensibilidad diferentes para una o más moléculas bioactivas (Colla et al., 2015).

En la península de Baja California existen macroalgas pardas con una gran biomasa

como Macrocystis pyrifera (35,813 - 97,804 toneladas húmedas; Hernández-

Carmona et al., 1991), Sargassum horridum (18,900 toneladas húmedas; Hernández-

Carmona et al., 1990) y Ecklonia arborea (antes Eisenia, Rothman et al., 2015). E.

arborea es considerada la tercera alga parda más importante con una alta biomasa;

sin embargo, no se ha llevado a cabo ninguna evaluación científica que evalúe su

biomasa. Las tres algas rojas más abundantes en la península de Baja California son

Gelidium robustum (507 - 796 toneladas húmedas; Casas-Valdez et al., 2005), que

3

se cosecha comercialmente para la producción de agar (Casas-Valdez et al., 2005);

Gracilariopsis sp. (1,300 toneladas húmedas; Vergara-Rodarte et al., 2016), cuya

identificación se cambió a Gracilaria parvispora (Krueger-Hadfield et al., 2016) y

Acanthophora spicifera, que es un alga invasiva abundante, pero aún no se ha

evaluado su biomasa (Ávila et al., 2012; Méndez-Trejo et al., 2014).

El grupo de algas marinas más utilizado en la producción de bioestimulantes algales

son las algas pardas (Khan et al., 2009). Esto puede ser debido a que son las algas

de mayor tamaño y abundantes y a su composición química. La primera patente de

producción de bioestimulantes algales fue del extracto algal alcalino de Macrocystis

pyrifera (London y Milton, 1952). Sin embargo, con el paso del tiempo se han

utilizado como materia prima otras especies de algas marinas que están disponibles

en los diferentes países productores.

El alga más usada como materia prima en la producción de bioestimulantes de

crecimiento vegetal es el alga parda Ascophyllum nodosum. Ésta, junto con otras

algas pardas de los géneros Fucus, Laminaria, Sargassum, Turbinaria y Ecklonia,

conforman la mayor fuente de materia prima algal usada en la formulación de

bioestimulantes algales (Hong et al., 2007; Sharma et al., 2014).

Se ha reportado actividad bioestimulante de crecimiento vegetal con el uso de

extractos obtenidos de algas rojas y verdes. Entre las algas rojas más estudiadas

está Kappaphycus alvarezii (Hong et al., 2007; Zoodape et al., 2010; Zoodape et al.,

2011; Badu y Rengasamy, 2012; Pramanick et al., 2013) y especies del género

Gracilaria (Demir et al., 2006; Kamaladhasan y Subramanian, 2007; Pise y Sabole,

2010; Vinoth et al., 2012; Pramanick et al., 2013; Satish et al., 2014; Vinoth et al.,

2014). El alga verde más estudiada como fuente de extractos bioestimulantes de

crecimiento vegetal es Ulva lactuca (Montero et al., 1999; Sridhar y Ramasamy,

2010; Sivasangari et al., 2010; Houssien et al., 2011; Sridhar y Rengasamy, 2011;

Kavipriya y Nallamuthu, 2011; Ramarajan et al., 2012; Hernández-Herrera et al.,

2014; Castellanos-Barriga et al., 2017) y Caulerpa scalpelliformis (Kamaladhasan y

4

Subramanian, 2007; Kavipriya y Nallamuthu, 2012; Jebasingh et al., 2015; Vinoth et

al., 2014). Sin embargo, solo se ha reportado el uso del alga roja Gelidium robustum

en combinación con M. pyrifera para la producción del producto comercial NPKelp.

Entre otras empresas que reportan el uso de otra clase de algas marinas diferentes a

las pardas se encuentra la empresa Qingdao Seawin Biotech Group Co., Ltd. Ésta,

es una de las pocas empresas que no solo utiliza algas pardas para la producción de

bioestimulantes, también ha reportado el uso de algas verdes como materia prima

para la producción del bioestimulante Seawinner Extra-45.

Existen diversos métodos de extracción para la formulación de bioestimulantes de

origen algal. Actualmente, el estudio de bioestimulantes algales no solo se ha

enfocado en los extractos líquidos. También los polisacáridos y sus hidrolizados

como alginatos (Laporte et al., 2007), fucoidanos (Klarzynki et al., 2003), laminarán

(Trouvelot et al., 2008) y carragenina (Mercier et al., 2001), así como de extractos

etanólicos (Chaikina et al., 2009) y acetónicos (Houssien et al., 2011; Rengasamy et

al., 2014) obtenidos de algas pardas, rojas y verdes han demostrado actividad

bioestimulante de crecimiento vegetal.

Sin embargo, aunque se ha demostrado el efecto bioestimulante de extractos

líquidos, polisacáridos y compuestos extraídos con otro tipo de solventes, hasta el

momento no existe ningún estudio que reporte una comparación de cada uno de los

diferentes compuestos que se extraen de una misma especie. Entre estos, se

encuentran diferentes polisacáridos, extractos con solventes orgánicos y extractos

acuosos que extraen mezcla de componentes o una combinación de varias de estas.

El uso de la extracción acuosa para la obtención de polisacáridos y solventes

orgánicos como etanol, metanol, acetato de etilo y acetona para la obtención de

compuestos de bajo peso molecular son esenciales para la formulación de mezclas

para obtener extractos con actividad bioestimulantes de crecimiento vegetal (BCV).

Los polisacáridos tienen importantes funciones primarias en las plantas ya que

además de ser el componente principal de las paredes celulares (ej. celulosa) actúan

5

como compuestos con actividad tipo hormona cuando se hidrolizan a oligosacáridos

(Rolland, 2002; Falcón y Cabrera, 2007; Trouvelot et al., 2014) controlando el

metabolismo, crecimiento y desarrollo de las plantas, la expresión génica y múltiples

rutas de señalización hormonal. Así como respuestas a la luz y el estrés (Sheen et

al., 1999; Smeekens, 2000; Finkelstein y Gibson, 2001).

En las últimas décadas los estudios enfocados a la actividad bioestimulante de

polisacáridos algales ha sido evidenciada en diversos cultivos como por ejemplo uva

(Aziz et al., 2003), frijol (Paulert et al., 2009), cebada (Natzume et al., 1994) y maíz

(Kannan et al., 2014). Recientemente se ha evaluado la actividad bioestimulante de

crecimiento vegetal de extractos etanólicos, metanólicos y acetónicos. Estos estudios

han evidenciado el aumento del peso seco de las plantas (Paulert et al., 2009) y un

aumento en las defensas tanto biológicas como ambientales (Houssien et al., 2011),

así como un aumento en el porcentaje de germinación de las semillas (Chaikina et

al., 2009) y crecimiento en plantas de cultivo (Michalak et al., 2015).

Además, es importante desarrollar métodos in vitro simples para la selección

preliminar de extractos y evaluar las aplicaciones potenciales como bioestimulantes,

incluida la validación, utilizando una planta modelo. El frijol mungo se ha identificado

como un sistema de modelo experimental adecuado para los experimentos (Stirk y

van Staden, 1997; Castellanos-Barriga et al., 2017), por este motivo en el presente

estudio se utilizó como planta modelo.

Se ha reportado actividad bioestimulante de crecimiento vegetal (BCV) para

extractos líquidos, polisacáridos y compuestos de bajo peso molecular de origen

algal. Sin embargo, actualmente se desconoce la formulación de los bioestimulantes

de origen algal.

6

2. ANTECEDENTES

Las algas marinas son una fuente ideal como materia prima en la elaboración de

bioestimulantes de crecimiento vegetal (BCV), ya que estas aportan nutrientes. Los

bioestimulantes de crecimiento vegetal se clasifican en ocho categorías: 1)

Sustancias húmicas, 2) Sales inorgánicas, 3) Extractos de algas marinas y botánicos,

4) quitosanos y otros biopolímeros, 5) compuestos inorgánicos y 6) Proteínas

hidrolizadas y otros compuestos nitrogenados, 7) hongos benéficos, 8) bacterias

benéficas (du Jardin, 2015). Estas categorías no se excluyen mutuamente, de esta

forma la clasificación de los extractos de algas marinas que son objeto de este

estudio se incluye en varias de las categorías antes mencionadas.

Las algas marinas pueden ser usadas como sustancias húmicas cuando se agregan

a la tierra durante el proceso de descomposición. Son materia orgánica, fuente de

elementos químicos y acumulan sales inorgánicas. Están compuestas de proteínas y

aminoácidos esenciales y producen otros metabolitos secundarios como los

florotaninos y polifenoles, que actualmente han sido probados como bioestimulantes

de crecimiento vegetal (Michalak y Chojnacka et al., 2014; Rengasamy et al., 2016b).

Se analizaron 250 artículos y capítulos de libros, encontrando que se han descrito

134 extractos de algas marinas con actividad bioestimulante de crecimiento vegetal,

incluyendo feofitas (67), rodofitas (41) y clorofitas (26). En 69 extractos no se reportó

ninguna caracterización química y en los 65 extractos algales restantes, se reportó el

contenido de minerales (45), fitohormonas (32), carbohidratos (19), aminoácidos y/o

proteínas (16), lípidos (18), cenizas (14), vitaminas y pigmentos (9), solo algunos

estudios reportan análisis químico proximal del alga o del extracto estudiado

(Siddhanta et al., 2001; Hong et al., 2007; Elumalai y Rengasamy, 2012; Kalaivanan

y Venkatesalu, 2012; Sharma et al., 2012a; Pramanick et al., 2013). Asimismo, se

reportan un total de 22 estudios de carbohidratos (como alginatos, fucoidano,

laminarán, carragenina y agar) con actividad BCV y el efecto bioestimulante de

extractos obtenidos a partir de 16 algas marinas con solventes orgánicos.

7

Desde la publicación de la primera patente sobre la obtención y el uso de un extracto

algal como “fertilizante líquido” (London y Milton, 1952), se comenzó la

industrialización y el estudio sobre la obtención y propiedades de los extractos con

efecto BCV obtenidos a partir de macroalgas, siendo las algas pardas las más

utilizadas y estudiadas. Los estudios han ido en aumento y se ha evaluado su efecto

sobre una gran variedad de cultivos, generando la creación de diversas industrias

dedicadas a la obtención y comercialización de bioestimulantes algales (Algaspacific,

Acadian, Kelpak, Seasol, Algaemzin, AgroKelp, entre otras) (Sharma et al., 2014).

Todas las industrias sin excepción buscan incrementar su producción agrícola. Lo

cual ha generado la búsqueda y comercialización de fertilizantes y bioestimulantes

orgánicos. En el mercado se encuentran diversos tipos de fertilizantes y

bioestimulantes, muchos de ellos especializados en el aumento del porcentaje de

germinación o un mayor crecimiento de los vegetales y frutas. También están los que

ayudan a aumentar las defensas contra los cambios extremos en el ambiente como

las heladas o las plagas en los cultivos.

Se ha descrito que el uso de bioestimulantes de origen algal aumenta la

concentración de los nutrientes en vegetales y en frutas, así como una mayor

producción de pigmentos como la clorofila y por ende un mejor color (Jebasingh et

al., 2014). Para las industrias es cada vez más urgente la búsqueda y formulación de

nuevos y mejores productos, por este motivo las algas marinas son esenciales como

materia prima para la formulación de bioestimulantes orgánicos.

Para mejorar la actividad de los extractos algales como BVC en los cultivos, es

necesario investigar cuáles son los componentes activos y elaborar mezclas de

extractos, que sumen o mejoren sus efectos. También se pueden mejorar los

diferentes procesos de extracción para aumentar el rendimiento y concentración de

los principios activos. Así como, evaluar especies algales aun inexploradas en busca

de los componentes activos.

8

Se debe tomar en consideración que la producción de componentes en las algas

está sujeta a diversos factores ambientales y cambios fisicoquímicos del lugar en

donde se desarrolla la especie.

En los extractos algales con actividad bioestimulante de crecimiento vegetal se ha

reportado la presencia de fitohormonas, proteínas, carbohidratos, grasas, pigmentos,

minerales y otros metabolitos secundarios como fenoles y terpenos extraídos con

disolventes orgánicos. Los carbohidratos y los compuestos de bajo peso molecular

extraídos con disolventes orgánicos son los únicos componentes de las macroalgas

que han sido probados independientemente como bioestimulantes de crecimiento

vegetal (BCV). Sin embargo, aunque estos han mostrado un efecto bioestimulante,

no se ha realizado una comparación con los extractos líquidos algales. También se

desconoce que componente o mezcla de ellos son los responsables del mayor efecto

bioestimulante.

2.1. Bioestimulantes de crecimiento vegetal

Las fitohormonas son indispensables para regular el ciclo de vida vegetal y tolerar los

factores bióticos y abióticos del ambiente que afectan a las plantas y a las

macroalgas. Sin embargo, aunque algunos autores sugieren que el efecto

bioestimulantes de los extractos algales es producido exclusivamente por las

fitohormonas presentes en el extracto (Temple et al., 1989; Yokoya, 2010), otras

investigaciones concluyen que tal efecto es causado por la acción conjunta de la

mezcla de componentes presentes en el extracto (Zodape, 2001; Chojnacka et al.,

2012). Teniendo en cuenta que las fitohormonas regulan los procesos fisiológicos y

químicos en los vegetales es pertinente el planteamiento de las siguientes preguntas:

¿Qué es un bioestimulante de crecimiento vegetal? ¿Cuál es la diferencia entre un

fertilizante y un bioestimulante?

Según el diccionario de la real academia, fertilizar es hacer que la tierra sea fértil. La

FAO en 2004 define a los fertilizantes como sustancias que proveen nutrientes que

9

los cultivos necesitan, mejorando la baja fertilidad de los suelos que han sido

sobreexplotados. En http://www.fertilizer.org/AboutFertilizers los definen como

sustancias sólidas, líquidas o gaseosas que contienen uno o más nutrientes para las

plantas. Estos se aplican ya sea al suelo, directamente en la planta (follaje) o se

añaden a las soluciones acuosas, con el fin de mantener la fertilidad del suelo,

mejorar el desarrollo, el rendimiento y/o calidad de los cultivos.

Los bioestimulantes vegetales son acondicionadores de plantas, que mejoran su

respuesta a ambientes adversos y reducen las limitaciones de crecimiento por

efectos del medio ambiente. Las algas marinas y sus extractos han sido utilizadas

como biofertilizantes y acondicionadores vegetales en la agricultura por siglos,

aplicadas frescas o secas como fuente de materia orgánica fertilizante (du Jardin,

2012).

La definición del término bioestimulante no está dada por su composición química, ya

que ésta puede ser muy diversa. Los bioestimulantes de crecimiento vegetal son

sustancia o microorganismo que mejoran la eficiencia nutricional, la tolerancia al

estrés abiótico y/o los rasgos de calidad de los cultivos, independientemente de su

contenido de nutrientes; así como todos los productos comerciales que contienen

mezclas de sustancias y/o microorganismos que ayuden al desarrollo de los cultivos

(du Jardin, 2015).

Uno de los primeros investigadores que indagó que hacía que las plantas crecieran

fue Darwin (The Power of Movements in Plants) en 1880. En este trabajo llamó a las

fitohormonas como “algo”, alguna sustancia o estímulo que podía moverse de un

lugar a otro de la planta. Pasaron treinta años hasta que se demostró que ese “algo”

era una sustancia química y hasta 1940 cuando Van Overbeek identificó las auxinas

en algas marinas. Con el paso del tiempo y el resultado de las investigaciones, se

han identificado más sustancias químicas como fitohormonas y se han clasificado en

cinco grupos: auxinas, giberelinas, citocininas, etileno y ácido abscísico.

http://www.fertilizer.org/AboutFertilizers

10

También se ha demostrado la acción de sustancias activas diferentes a las

hormonas, a las cuales se les ha llamado sustancias con actividad “tipo hormona” o

reguladores de crecimiento. Jordán y Casaretto (2006) reportan como otros

reguladores de crecimiento a brasinoesteroides, poliaminas, ácido salicílico y ácido

jasmónico.

Las auxinas son el grupo de fitohormonas más abundantes y estudiadas hasta el

momento. La más estudiada es el ácido indolacético (IAA) y se ha comprobado su

acción estimulante en más de 50 estudios (www.scopus.com, Olivella et al., 2001;

Castillo et al., 2005; Hernández-Mendoza et al., 2008; Laskowski et al., 2008; Rojas

et al., 2012, entre otros). Por este motivo inicialmente los trabajos de caracterización

de extractos algales BCV fueron enfocados hacia la detección y caracterización de

auxinas (van Overbeek, 1940).

2.2 Efecto de extractos algales como bioestimulantes de crecimiento vegetal (BCV)

En esta sección se discutirá sobre la actividad bioestimulante de crecimiento vegetal

de extractos de algas marinas, a partir de la información publicada de 1993 a la

fecha. La mayoría de los autores concuerdan en que el efecto BCV se presenta por

la acción de la combinación de todos los componentes de los extractos.

Las industrias productoras de BCV y los agricultores buscan en los bioestimulantes

mejoras en el rendimiento de los cultivos y no la composición química de estos.

Aunque se cuenta con reportes de la composición química general de las algas

utilizadas para formular los bioestimulantes, los estudios de la actividad

bioestimulante de extractos algales se centra en el reporte del efecto en diversas

hortalizas (maíz, tomate, frijol, tabaco, entre los más estudiados).

El extracto del alga parda Ascophyllum nodosum, es el mejor caracterizado a la

fecha, obtenido por extracción acuosa en condiciones alcalinas (Hurtado et al., 2009;

http://www.scopus.com/

11

MacKinnon et al., 2010; Kok et al., 2010; Shehata et al., 2011; Sharma et al., 2012a;

Sharma et al., 2012b) y A. nodosum es el alga más usada por las industrias en la

producción de BCV. Khan et al. (2009) realizaron un reporte de 16 extractos

comerciales a partir de esta alga parda. Por otra parte, se han estudiado los

extractos de las algas rojas Kappaphycus alvarezii y Gracilaria spp. (Hong et al.,

2007; Rathore et al., 2009; Zoodape et al., 2010; Zodape et al., 2011; Pramanick et

al., 2013). Sin embargo, la mayoría de estos estudios se han enfocado en los

extractos de K. alvarezii. En lo referente a algas verdes, los extractos mejor

caracterizados son los de Caulerpa racemosa y Ulva reticulata (Hong et al., 2007).

2.2.1 Minerales presentes en extractos algales y su importancia como BCV

En la tabla 1 se muestra el contenido mineral de 45 extractos algales usados como

BCV. Las algas pardas son las más usadas para la elaboración de BCV

industrialmente, por lo que tienen la mayor cantidad de reportes (23 extractos). Los

extractos con mayor número de reportes de contenido mineral son los obtenidos a

partir del alga A. nodosum (Hurtado et al., 2009; Shehata et al., 2011; Sharma et al.,

2012a; Sharma et al., 2012b, entre otros).

El contenido de minerales es indispensable para el desarrollo de las plantas y se

debe cuidar su concentración en los suelos. Cuando estos faltan, interfiere en el

desarrollo normal de los cultivos por lo que deben ser adicionados a través de

fertilizantes y bioestimulantes.

Los macro y microelementos que han sido mayormente reportados como parte de la

composición química de las algas y los extractos algales BCV son: macroelementos:

nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K), magnesio (Mg), azufre (S) y calcio (Ca) y

microelementos: hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), cobre (Cu), molibdeno (Mo),

cloro (Cl) y boro (B) (Tabla 1). Los macroelementos son indispensables en la

conformación de los compuestos orgánicos como carbohidratos, proteínas, ácidos

nucleicos, así como en la regulación de los procesos fisicoquímicos como la ósmosis,

12

difusión, permeabilidad, viscosidad y tienen relación con la economía del agua, y los

procesos afines, como la absorción y la transpiración. Los microelementos son

importantes ya que actúan como quelatos (unión de un metal a una molécula

orgánica (ligando) y ayudan en la absorción de otros nutrientes (FAO, 2002; Pilon-

Smits et al., 2009).

Tabla 1. Minerales reportados en algas y extractos de algas marinas usados como Bioestimulantes del Crecimiento Vegetal (BCV)

Minerales Función Referencia

en algas Referencias en extractos

Macronutrientes

Nitrógeno

(N)

Forma aminoácidos y

proteínas, ayuda a

absorber otros

nutrientes

Montero et

al., 1999

Temple y Bomke, 1989; Hong et al., 2007; Rathore et al.,

2009; Sasikumar et al., 2011; Zodape et al., 2010, 2011;

Shehata et al., 2011; Sridhar y Rengasamy, 2011;

Ahmed y Shalaby, 2012; Sharma et al., 2012a y b;

Chbani et al., 2013

Fósforo (P)

Transferencia de

energía, fotosíntesis,

diferenciación celular y

desarrollo de tejidos.

Procesos genéticos.

Montero et

al., 1999

Temple y Bomke, 1989; Sivasankari et al., 2006; Hong et

al., 2007; Caparkaya et al., 2009; Rathore et al., 2009;

Sasikumar et al., 2011; Thorsen et al., 2010; Zodape et

al., 2010, 2011; Sridhar y Rengasamy, 2011; Ahmed y

Shalaby, 2012; Sharma et al., 2012a y b; Pramanick et

al., 2013; Chbani et al., 2013; Hernández-Herrera et al.,

2014a.

Potasio (K)

Activador de más de

60 enzimas, síntesis

de carbono y

proteínas. Mejora

régimen hídrico y

aumenta tolerancia a

sequías, heladas y

salinidad. Mejora

resistencia a

enfermedades.

Montero et

al., 1999


al., 2007; Caparkaya et al., 2009; Hurtado et al., 2009;

Rathore et al., 2009; Sasikumar et al., 2011; Sivasangari

et al., 2010, 2011, 2012; Thorsen et al., 2010; Zodape et

al., 2010, 2011; Kumari et al., 2011, 2013; Shehata et al.,

2011; Sridhar y Rengasamy, 2011; Ahmed y Shalaby,

2012; Elumalai y Rengasamy, 2012; Kalaivanan y

Venkatesalu, 2012; Sharma et al., 2012a y b; Chbani et

al., 2013; Pramanick et al., 2013; Hernández-Herrera et

al., 2014a; Jebasingh et al., 2014.

Magnesio

(Mg)

Regulador de

procesos

fisicoquímicos.

Constituyente central

de la clorofila.

Reacciones

Montero et

al., 1999

Temple y Bomke, 1989; Hong et al., 2007; Caparkaya et

al., 2009; Hurtado et al., 2009; Omezzine et al., 2009;

Rathore et al., 2009; Sivasankari et al., 2006; Sasikumar

et al., 2011; Srijaya et al., 2010; Sivasangari et al., 2010,

2011, 2012; Zodape et al., 2010; Kumari et al., 2011,

2013; Shehata et al., 2011; Sridhar y Rengasamy, 2011;

13

enzimáticas de

transferencia de

energía.

Elumalai y Rengasamy, 2012; Kalaivanan y Venkatesalu,

2012; Sharma et al., 2012a y b; Chbani et al., 2013.

Azufre (S)

Constituyente de dos

aminoácidos la

cisteína y la cistina,

formadores de

proteínas.

Constituyente de

grupos sulfatos

Hurtado et al., 2009; Rathore et al., 2009; Srijaya et al.,

2010; Thorsen et al., 2010; Shehata et al., 2011; Sharma

et al., 2012a y b; Chbani et al., 2013; Kumari et al., 2013;

Jebasingh et al., 2014

Calcio (Ca)

Regulador de

procesos

fisicoquímicos como la

ósmosis.

Constituyente de

raíces y tejido celular

de membranas

Montero et

al., 1999

Temple y Bomke, 1989; Hong et al., 2007; Omezzine et

al., 2009; Hurtado et al., 2009; Rathore et al., 2009;

Sasikumar et al., 2011; Zodape et al., 2010; Kumari et al.,

2011, 2013; Shehata et al., 2011; Sridhar y Rengasamy,

2011; Elumalai y Rengasamy, 2012; Kalaivanan y


al., 2013; Hernández-Herrera et al., 2014a

Micronutrientes

Hierro (Fe)

Formación de la

clorofila. Formador de

quelatos, se asemejan

a la función de las

vitaminas en los

humanos

Montero et

al., 1999



Rathore et al., 2009;Sasikumar et al., 2011; Srijaya et al.,

2010; Sivasangari et al., 2010, 2011, 2012; Zodape et al.,

2010; Kumari et al., 2011, 2013; Shehata et al., 2011;

Sridhar y Rengasamy, 2011; Sridhar y Rengasamy,

2011; Zodape et al., 2011; Elumalai y Rengasamy, 2012;

Kalaivanan y Venkatesalu, 2012; Sharma et al., 2012a y

b.

Manganeso

(Mn)

Formación de clorofila.

Procesos enzimáticos

metabolismo del

nitrógeno y

descomposición de

carbohidratos.

Formador de quelatos

Montero et

al., 1999

Temple y Bomke, 1989; Hong et al., 2007; Hurtado et al.,

2009; Rathore et al., 2009; Sasikumar et al., 2011;

Srijaya et al., 2010; Sivasangari et al., 2010, 2011, 2012;

Zodape et al., 2010; Kumari et al., 2011, 2013; Sridhar y

Rengasamy, 2011; Zodape et al., 2011; Elumalai y

Rengasamy, 2012; Chbani et al., 2013; Pramanick et al.,

2013

14

Zinc (Zn)

Producción de

auxinas.

Transformación de

carbohidratos.

Formador de quelatos

Montero et

al., 1999

Srijaya et al., 2010; Temple y Bomke, 1989; Sivasankari

et al., 2006; Hong et al., 2007; Caparkaya et al., 2009;

Hurtado et al., 2009; Rathore et al., 2009; Sasikumar et

al., 2011; Sivasangari et al., 2010, 2012; Zodape et al.,

2010; Kumari et al., 2011, 2013; Zodape et al., 2011;

Kalaivanan y Venkatesalu, 2012

Cobre (Cu)

Activador enzimático.

Formación de clorofila.

Formador de quelatos.

Montero et

al., 1999



Rathore et al., 2009; Sasikumar et al., 2011; Srijaya et

al., 2010; Sivasangari et al., 2010, 2011, 2012; Zodape et

al., 2010, 2011; Kumari et al., 2011, 2013; Sridhar y

Rengasamy, 2011; Kalaivanan y Venkatesalu, 2012;

Sharma et al., 2012a y b

Molibdeno

(Mo)


En leguminosas puede

fijar N atmosférico.

Hong et al., 2007; Zodape et al., 2010

Cloro (Cl) Metabolismo vegetal.


Sivasankari et al., 2006; Caparkaya et al., 2009; Sridhar y

Rengasamy, 2011; Elumalai y Rengasamy, 2012;

Sharma et al., 2012a; Pramanick et al., 2013; Chbani et

al., 2013

Boro (B)

Formación de

carbohidratos.

Formación de semillas

y frutos. Formador

de quelatos

Hong et al., 2007; Hurtado et al., 2009; Srijaya et al.,

2010

Otros minerales presentes

Sodio (Na)

Metabolismo, apertura

y cierre de estomas y

síntesis de clorofila

Montero et

al., 1999

Sivasankari et al., 2006; Hong et al., 2007; Caparkaya et

al., 2009; Hurtado et al., 2009; Rathore et al., 2009;

Sivasangari et al., 2010, 2011, 2012; Srijaya et al., 2010;

Thorsen et al., 2010; Zodape et al., 2010; Kumari et al.,

2011, 2013; Elumalai y Rengasamy, 2012; Kalaivanan y


al., 2013; Pramanick et al., 2013; Hernández-Herrera et

al., 2014a; Jebasingh et al., 2014.

Silicio (Si)

Conformación de

pared celular. Síntesis

de ligninas

Sivasankari et al., 2006; Caparkaya et al., 2009; Elumalai

y Rengasamy, 2012; Kalaivanan y Venkatesalu, 2012.

Cobalto

(Co)

Regulación hormonal

(ABA, Etileno).

Metabolismo de

carbohidratos y

Montero et

al., 1999

Hong et al., 2007; Srijaya et al., 2010; Sivasangari et al.,

2010, 2011, 2012.

15

proteínas.

Síntesis de clorofila

Aluminio

(Al)

Metabolismo, toma y

transporte de

nutrientes y

crecimiento de la raíz

Montero et

al., 1999

Srijaya et al., 2010; Sharma et al., 2012a; Kalaivanan y

Venkatesalu, 2012.

Yodo (I) Fotosíntesis y

regulación hormonal Hong et al., 2007; Sharma et al., 2012a y b.

Plomo (Pb) Metabolismo.

Crecimiento Hong et al., 2007; Srijaya et al., 2010.

Bario (Ba) Absorción y transporte

de otros elementos Srijaya et al., 2010.

Cromo (Cr) Metabolismo, síntesis

de ácidos grasos Hong et al., 2007; Srijaya et al., 2010.

Cadmio

(Cd)

Metabolismo.

Fotosíntesis Hong et al., 2007; Srijaya et al., 2010.

Estroncio

(Sr)

Metabolismo.

Permeabilidad de la

pared celular

Hong et al., 2007.

Los agricultores de zonas cercanas a la costa han utilizado las algas marinas por

décadas para fertilizar sus tierras o directamente en los cultivos, y en las últimas seis

décadas han sido fuente natural de nutrientes en la elaboración de fertilizantes y

bioestimulantes de crecimiento vegetal. El contenido mineral en algas marinas

(Montero et al., 1999; Carrillo-Domínguez et al., 2002), en un inicio atrajo el interés

de agricultores e investigadores por el uso de estas en la agricultura. Aunque los

minerales no son bioestimulantes de crecimiento vegetal ya que se consideran como

nutrientes, algunas industrias los incluyen en la formulación de sus bioestimulantes,

por ejemplo, macroelementos como N, P y K.

2.2.2 Fitohormonas reportadas en extractos algales con actividad BCV

Hasta el momento se ha reportado el contenido de fitohormonas para 30 algas y

extractos algales. Estos estudios se han enfocado hacia extractos obtenidos de algas

pardas (14), seguidos de extractos de algas rojas (11) y unos pocos de algas verdes

16

(5). Es escasa la información que actualmente existen sobre estos compuestos, ya

que de 134 extractos algales bioactivos solo el 20% reporta la presencia de

fitohormonas y el estudio de Han (2006) reporta más de la mitad (16) de los extractos

con presencia de la auxina IAA.

El IAA actúa como BCV en el desarrollo vegetal. Por ejemplo, el contenido de

citocininas y giberelinas no se ha estudiado mucho (Tabla 2). Aunque Temple et al.

(1989) reportaron la presencia de citocininas en Macrocystis integrifolia y Ecklonia

máxima; a la fecha (27 años después) no se han realizado más reportes de este

grupo de fitohormonas (Sasikumar et al., 2011). Por otra parte, algunos trabajos se

han centrado en el efecto conjunto de las fitohormonas (Beaudoin et al., 2000;

Moubayidin et al., 2009; Wilmowicz et al., 2016).

Investigaciones recientes, han reportado un análisis más complejo del contenido de

fitohormonas (auxinas, giberelinas y citocininas) en extractos bioactivos (Hong et al.,

2007; Sivasangari et al., 2010; Sivasangari et al., 2011; Ahmend y Shalaby, 2012;

Sivasangari et al., 2012). Estos análisis dan una mejor perspectiva sobre la actividad

bioestimulante, como es el crecimiento de raíces, o el crecimiento y diferenciación

celular.

Del análisis de la tabla 2, se concluye que, aunque la función de las auxinas y

giberelinas en las plantas terrestres es diversa, en las algas su función puede ser

más básica, ya que estructuralmente las necesitan en el proceso de elongación y es

posible que también sean importantes en la formación de estructuras reproductivas,

aunque no tan especializadas como en las plantas terrestres (formación de flores).

En el caso de las citocininas, además de las funciones ya mencionadas, también son

necesaria en los procesos de división celular y fotosíntesis, muy importante para

todos los organismos autótrofos y pueden tener un papel muy importante en el

proceso de senescencia de las algas (Azcón-Bieto y Talón, 2013).

17

Otros compuestos con efecto bioestimulante de crecimiento vegetal son el etileno

(única fitohormona gaseosa), ácido abscísico, ácido jasmónico, ácido salicílico,

brasinoesteroides, poliaminas y betaínas (Jordan y Casaretto, 2006). Sin embargo,

en las algas marinas ningún estudio hasta el momento se ha enfocado en detectar la

presencia de etileno, poliaminas, ácido salicílico y ácido jasmónico, los cuales al igual

que en las plantas terrestres pueden estar presentes en las algas cumpliendo

funciones básicas para el desarrollo de estas en el ambiente.

Tabla 2. Fitohormonas en extractos algales con actividad como BCV

Tipo Extracto algal Fitohormona Referencia

Parda Sargassum thunbergii Auxina: AIA Han, 2006

Parda S. kjellmaniamum Auxina: AIA Han, 2006

Parda S. wightiiAuxinas (AIA), citocininas,

giberelinas

Sridhar y Rengasamy, 2011; Sivasangari et

al ., 2012

Parda Sargassum sp. Fitohormonas en general Sheata et al ., 2011

Parda Undaria pinnatifida Auxina: AIA Han, 2006

Parda Laminaria japonica Auxina: AIA Han, 2006

Parda Laminaria spp. Fitohormonas en general Sheata et al ., 2011

Parda Chorda filum Auxina: AIA Han, 2006

Parda Ascophyllum nodosum Betaínas, hormonas en general Mackinnon et al ., 2010; Shehata et al ., 2011

Parda Dyctiota dichotoma Citocininas y auxinas Sasikumar et al ., 2011

Parda Ecklonia maximaGiberelinas, citocininas y auxinas,

ácido abcísico, brasinoesteroides

Temple et al ., 1989; Temple y Bunke, 1989;

Stirk et al ., 2004

Parda Macrocystis integrifolia Citocininas Temple et al ., 1989

Parda M. pyrifera Auxinas y citocininas Stirk et al ., 2004

Parda Stoechospermum marginatum Auxinas, citocininas y giberelinas Sivasangari et al ., 2011

Roja Porphyra yezoensis Auxina: AIA Han, 2006

Roja Symphyocladia latiuscula Auxina: AIA Han, 2006

Roja Polysiphonia urceolata Auxina: AIA Han, 2006

Roja Grateloupia filicina Auxina: AIA Han, 2006

Roja Hyalosiphonia caespitosa Auxina: AIA Han, 2006

Roja Corallina pilulifera Auxina: AIA Han, 2016

Roja Plocamium telfairiae Auxina: AIA Han, 2006

Roja Chondrus senensis Auxina: AIA Han, 2006

Roja Asparagopsis spp. Auxinas, ABA y giberelinas Ahmend y Shalaby, 2012

Roja Gelidium pectinutum Auxinas, ABA y giberelinas Ahmend y Shalaby, 2012

Roja Kappaphycus sp. AIA y giberelinas Pramanick et al ., 2013

Verde Entermorpha linza Auxina: AIA Han, 2006

Verde E. compressa Auxina: AIA Han, 2006

Verde E. intestinelis Auxinas, ABA y giberelinas Ahmend y Shalaby, 2012

Verde Ulva pertusa Auxina: AIA Han, 2006

Verde U. lactuca Auxinas, citocininas y giberelinasSivasangari et al ., 2010; Sridhar y

Rengasamy, 2011

18

2.2.3. Carbohidratos, proteínas y otros componentes presentes en extractos

algales con actividad BCV

Se sabe que los carbohidratos median la expresión de genes que expresan la

producción de fitohormonas en las plantas (Rolland et al., 2002), por este motivo en

los últimos 20 años, algunas investigaciones se han enfocado hacia el uso de

carbohidratos y sus oligosacáridos como BCV (Tabla 3) y otros trabajos han

reportado la presencia de estos en los extractos algales estudiados (Tabla 4).

La presencia y cantidad de carbohidratos en las algas depende de varios factores:

tipo de alga (roja, verde o parda), factores fisicoquímicos del hábitat y cambios medio

ambientales. Los carbohidratos son importantes para las algas ya que son

constituyentes fundamentales de la pared celular y cumplen funciones específicas en

el mantenimiento de la integridad del alga, ya que les confieren flexibilidad a las

láminas en las algas pardas y de esta forma evitan que el alga se rompa con el

oleaje y las marejadas intensas y evitan la desecación de estas en marea baja.

Las algas rojas también cuentan con polisacáridos estructurales: los carragenanos y

el agar. Actualmente estos son usados por diversas industrias como la farmacéutica

(encapsulamiento de medicamentos, nutraceúticos), alimenticia (conservación de

alimentos), textil (espesantes y conservantes de pinturas), cervecera (conservante y

textura) y cosmética (por propiedades hidratantes) (Kraan, 2012; Rupérez et al.,

2014).

Se ha realizado un mayor reporte del contenido de carbohidratos en extractos de

algas pardas, seguido de los obtenidos de algas rojas y finalmente de algas verdes.

Ya que estas últimas son las menos estudiadas en este campo.

19

Tabla 3. Carbohidratos y ficocoloides algales con actividad como BCV

Tipo Extracto algal Carbohidrato o ficocoloide Vegetal Referencia

Parda No hay información Oligosacáridos de alginato de Na Lechuga Iwasaki y Matsubara, 2000

Parda Laminaria digitata Laminarán, alginato de sodio Tabaco, uva

Klarzynski et al ., 2000; Mercier et al .,

2001; Aziz et al ., 2003; Menard et al .,

2004; Fu et al ., 2011

Parda L. japonica Banana Cao et al ., 2007

Parda Lessonia vadosaÁcido algínico, oligosacáridos de

alginatoTrigo, tabaco Chandía et al ., 2004, Laporte et al ., 2007

Parda L. trabeculata Alginato de sodio Tabaco Laporte et al ., 2007

Parda Schizymenia binderi Oligosacáridos de alginato Tabaco Laporte et al ., 2007

Parda Padina gymnospora Polisacáridos Tomate y frijol Hernández-Herrera et al ., 2016

Parda Pelvetia canaliculata Fucoidan Tabaco Klarzynski et al ., 2003

Parda No hay información Laminarán Uva Trouvelot et al ., 2008

Parda No hay información Oligomeros uronatos de alginato Zanahoria y arroz Xu et al ., 2003

Parda No hay información Oligosacáridos de alginato Maíz Hu et al ., 2004

Roja Eucheuma cottonii k-Carragenano Tabaco Mercier et al ., 2001

Roja E. spinosa i-carragenano Tabaco Mercier et al ., 2001

Roja Gigartina acicularis l-carragenano Tabaco Mercier et al ., 2001

Verde Ulva fasciata Polisacáridos sulfatados Frijol Paulert et al ., 2009

Verde U. lactuca Polisacáridos Tomate y frijol Hernández-Herrera et al ., 2016

Verde Ulva spp. Ulvano Frijol Borsato et al ., 2010

20

El contenido de proteínas en las algas marinas es variable. En algas pardas es

más bajo (inferior al 15%) al reportado en algas rojas, sin embargo, hay

excepciones como en el alga Undaria pinnatifida (wakame), la cual es usada como

alimento. En esta, el contenido de proteína es del 11-24 % de su peso seco. Las

algas verdes y rojas presentan un contenido de proteína entre el 10-47 % de peso

seco. Al igual que los carbohidratos, las proteínas y demás componentes algales

pueden presentar variación en su composición química y concentración, ya que su

producción está influenciada por el estado de desarrollo del alga, la variación

fisicoquímica del hábitat (temperatura, salinidad, contenido de nutrientes

disponibles) y condiciones medioambientales como huracanes, tormentas y época

del año (verano, invierno, primavera y otoño; Fleurence, 1999; Harnedy y

FitzGeald, 2011).

Así como son escasos los estudios que reportan contenido de carbohidratos en los

extractos BCV, también son pocos los reportes del contenido de proteínas y

aminoácidos de estos. Solo el 10 % de la bibliografía consultada reporta

caracterización química o carbohidratos y/o proteínas. La mayoría de los reportes

de proteínas y/o aminoácidos en extractos algales BCV son para algas rojas (7),

seguido de las pardas (6) y en mejor cantidad las verdes (3; Tabla 5). Esto

evidencia la escasa información que hay de la presencia de estos componentes en

los extractos.

Hong et al. (2007), realizaron una de las caracterizaciones químicas más

completas. En su estudio reportan el uso de 9 algas como materia prima de

biofertilizantes: dos verdes (Caulerpa racemosa y Ulva reticulata), seis rojas

(Gelidiella acerosa, Laurencia obtusa, Gracilaria tenuistipitata, Hypnea valentiae,

Porphyra crispata y Kappaphycus alvarezii) y una parda (Sargassum mcclurei).

También reportan la composición de macro y microelementos (Tabla 1),

carbohidratos (Tabla 3 y 4), proteínas, incluyendo el perfil de aminoácidos que las

componen (Tabla 5) y contenido de lípidos, vitaminas y pigmentos (Tabla 6), estos

últimos en análisis de composición química proximal.

21

Tabla 4. Carbohidratos y ficocoloides en extractos algales BCV

Tipo Extracto algal Carbohidratos y/o ficocoloides Referencia

PardaAscophyllum nodosum

Ácido algínico, manitol, laminarano. laminarina,

fucoidano

Hurtado et al ., 2009; Shehata et al ., 2011;

Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda Fucus serratus Ácidos algínico, manitol, laminarina y fucoidano Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda F. vesiculosus Ácidos algínico, manitol, laminarina y fucoidano Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda Sargassum muticum Ácidos algínico, manitol, laminarina y fucoidano Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda S. polycystum Carbohidratos Elumalai y Rengasamy, 2012

Parda S. mcclurei Carbohidratos Hong et al ., 2007

Parda Sargassum sp. Ácido algínico Sheata et al ., 2011

Parda Laminaria hyperborea Ácidos algínico, manitol, laminarina y fucoidano Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda Eclonia maxima Carbohidratos y alginato Lotze y Hoffman, 2015

Parda Laminaria spp Ácido algínico Sheata et al ., 2011

Roja Kappaphycus alvarezii Carbohidratos Hong et al ., 2007; Pramanick et al ., 2013

Roja Gracilaria spp. Carbohidratos Pramanick et al ., 2013

Roja Gelidiella acerosa Carbohidratos Hong et al ., 2007

Roja Laurencia obtusa Carbohidratos Hong et al ., 2007

Roja Gracilaria tenuistipitata Carbohidratos Hong et al ., 2007

Roja Hypnea valentiae Carbohidratos Hong et al ., 2007

Roja Porphyra crispata Carbohidratos Hong et al ., 2007

Verde Ulva reticulata Carbohidratos Hong et al ., 2007

Verde Caulerpa racemosa Carbohidratos Hong et al ., 2007

22

Sin embargo, en el estudio no se reporta el contenido de fitohormonas. Algunos

estudios a posteriori reportan la composición de fitohormonas en extractos BCV

obtenidos a partir de K. alvarezii (Pramanick et al., 2013).

La mayoría de los trabajos que realizan análisis del contenido proteico lo hacen de

forma general a través del análisis químico proximal. Solo tres estudios reportan

aminoácidos presentes en los extractos. Los trabajos de Hurtado et al. (2009), Kok

et al. (2010) y el de Lötze y Hoffman (2015). Los dos primeros reportan

aminoácidos, uno a través de un perfil de aminoácidos y otro a través de presencia

de aminoácidos libres para el alga Ascophyllum nodosum y el último reporta perfil

de aminoácidos en tres extractos comerciales de Ecklonia maxima (Tabla 5).

La importancia de reportar el contenido de proteínas y los aminoácidos que

componen las proteínas es debido a que la producción de algunos componentes

de BCV depende de la presencia y disposición de estos. Es el caso de las

poliaminas, las cuales se sintetiza a partir de tres aminoácidos básicos: arginina,

lisina, ornitina y la metionina, y para la producción de ácido salicílico se necesita

fenilalanina. Así como la producción de betaínas, la cual también es dependiente

de aminoácidos (Azcón-Bieto y Talón, 2013).

Por otro lado, las fitohormonas (auxinas, giberelinas, citocininas) estimulan

procesos como la elongación, donde además requieren componentes como los

carbohidratos, proteínas, ácidos grasos, entre otros, para el proceso de división

celular y por ende para su crecimiento (Azcón-Bieto y Talón, 2013). Esto lleva a

concluir que indirectamente las fitohormonas son estimulantes de la producción de

estos compuestos tanto en las algas como en las plantas terrestres.

23

Tabla 5. Proteínas y aminoácidos en extractos algales BCV

Tipo Extracto algal Proteínas y/o aminoácidos Referencia

Parda Ascophyllum nodosumPerfil de aminoácidos y

aminoácidos libresHurtado et al ., 2009; Kok et al ., 2010

Parda Sargassum polycystum Proteínas Elumalai y Rengasamy, 2012

Parda S. duplicatum Proteínas Jebasingh et al ., 2014

Parda S. mcclurei Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

Parda Ecklonia maxima Perfil de aminoácidos Lotze y Hoffman, 2015

Roja Laurencia pinnatifida Proteínas Jebasingh et al ., 2014

Roja L. obtusa Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

Roja Gelidiella acerosa Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

Roja Gracilaria tenuistipitata Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

Roja Hypnea valentiae Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

Roja Porphyra crispata Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

Roja Kappaphycus alvarezii Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

Verde Caulerpa racemosa Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

Verde C. scalpelliformis Proteínas Jebasingh et al ., 2014

Verde Ulva reticulata Proteínas y aminoácidos Hong et al ., 2007

De la misma forma la síntesis de fitohormonas depende de la disponibilidad de

metabolitos primarios. Por ejemplo, la producción de auxinas sigue una ruta

dependiente de triptófano el cual es un aminoácido esencial y su producción no

solo depende de la presencia de este aminoácido, el proceso esta mediado por

enzimas como las descarboxilasas (proteínas) y estas enzimas necesitan

cofactores (minerales) para llevar a cabo el proceso (Azcón-Bieto y Talón, 2013).

Otros componentes necesarios para el desarrollo vegetal son los lípidos, ácidos

grasos y esteroles. Estos son componentes estructurales esenciales de la

membrana celular. Aunque son un grupo minoritario en la composición química

vegetal, estos son indispensables para el funcionamiento básico de las algas

(Kumari et al., 2013).

Estos componentes son reportados solo como parte del análisis químico proximal

del alga o del extracto algal (Tabla 6) por este motivo, se necesita realizar una

caracterización más específica de estos. Por ejemplo, el contenido lipídico, para

conocer los lípidos que están presentes en el extracto, ya que los

brasinoesteroides y el ácido jasmónico son de origen lipídico (Jordan y Casaretto,

2006).

24

Aunque no ha sido estudiada la presencia y caracterización de los ácidos grasos

en los extractos algales BCV, se considera importante investigarlos, ya que,

algunos ácidos grasos como el linoleico y linolénico son precursores de la

producción del ácido jasmónico el cual cumple funciones importantes para el

desarrollo de las plantas, estimulando el crecimiento del tallo y raíces, la síntesis

de etileno, maduración y coloración de frutos y senescencia vegetal (Azcón-Bieto y

Talón, 2013).

Menos del 5% de los trabajos analizados reportan contenido de cenizas y fibra

(Tabla 6). La ceniza es la materia inorgánica en las algas marinas, y está

compuesta principalmente por minerales y son esenciales para el desarrollo

vegetal (Tabla 2; Montero et al., 1999). La fibra tiene efecto aireador en el suelo y

esta aireación es importante para abastecerse de oxígeno a los animales y

garantizar el buen desarrollo de los microorganismos descomponedores y de las

raíces de las plantas (Craigie, 2011; Azcón-Bieto y Talón, 2013).

Otro tipo de componentes esenciales para las plantas y las algas son los

pigmentos. Existen tres grandes grupos, clorofila, carotenoides y ficobilinas. Las

clorofilas son un grupo de pigmentos verdes solubles en lípidos indispensable para

el desarrollo vegetal. Las algas producen vitaminas solubles en agua y solubles en

grasas (Nishizawa, 2002). Entre las primeras se han identificado B1, B2, B12 y C.

En el segundo grupo se han reportado la vitamina A, E, D y K (Nishizawa, 2002).

Aunque se desconoce la acción de las vitaminas y pigmentos presentes en los

extractos BCV en el desarrollo vegetal, se sabe que los pigmentos son

importantes para las plantas, ya que estos son la base del funcionamiento vegetal.

2.2.4 Polisacáridos y oligosacáridos como BCV y activadores de defensa en plantas

Los polisacáridos y oligosacáridos algales estimulan el crecimiento y aumentan las

defensas de las plantas. Se sabe que la respuesta en el aumento de defensas en

las plantas a daños fisiológicos se da cuando los carbohidratos que componen la

25

pared celular de las células vegetales se empiezan a degradar hasta

oligosacáridos (González et al., 2013).

Los oligosacáridos actúan como señal química para estimular la síntesis hormonal

como etileno y ácido abscísico. Además, de estos se sabe que de la misma forma

modula el desarrollo de las plantas. Las oligosacarinas pueden promover la

proliferación y/o diferenciación celular y actúan antagónicamente con las auxinas

en el crecimiento del tallo y el enraizamiento, ya que alteran el metabolismo

normal de estas. No solo las oligosacarinas pueden estimular el desarrollo de las

plantas, otro tipo de oligosacáridos también han mostrado actividad BCV

(Albersheim et al., 1993; Yonemoto et al., 1993). En base a estos y otros estudios

similares, la comunidad científica que investiga el efecto BCV de extractos algales

empezó a interesarse por investigar la actividad BCV de los polisacáridos y

oligosacáridos algales (Tabla 3).

Inicialmente se empezó a estudiar el efecto de algunos carbohidratos y

oligosacáridos como inductores del aumento de las defensas en plantas. Esta

hipótesis fue comprobada en plantas de tabaco, en las cuales se concluyó que las

plantas presentaban un aumento en sus defensas con el uso de oligosacáridos

obtenidos de Laminaria digitata (Klarzynski et al., 2000; Klarzynski et al., 2003).

Iwasaki y Matsubara (2000) realizaron una investigación del efecto BCV de

oligosacáridos en plantas de lechuga, comprobando que el uso de oligosacáridos

obtenidos de alginato produce un aumento en el crecimiento vegetal, mayor que el

uso del polisacárido intacto (ficocoloide). Otros estudios han demostrado el efecto

BCV, así como el aumento de la defensa en las plantas tratadas con los

polisacáridos y sus oligosacáridos (Tabla 3).

Más de la mitad de los estudios reportados se centran en el reporte de minerales y

fitohormonas (auxinas, giberelinas, citocininas, entre las más estudiadas) en los

extractos algales BCV, sin embargo, los estudios sobre el efecto de los

carbohidratos y ficocoloides extraídos de algas marinas y sus oligosacáridos es

26

escaso (<10% del total de reportes de extractos caracterizados). Por esta razón es

necesario seguir enfocando las investigaciones hacia la actividad BCV que puedan

presentar los polisacáridos algales.

En México se ha observado un aumento en el crecimiento de tomate al agregarle

perlas de alginato de sodio al cultivo (Yabur et al., 2007). Esto generó otras

investigaciones más específicas hacía el aumento de defensas en plantas con

ayuda de bioestimulantes de origen algal (Hernández-Herrera et al., 2014b;

Hernández-Herrera et al., 2016).

Considerando que los extractos algales aumentan la tasa de crecimiento y

defensa de vegetales, se propone seguir investigando otro tipo de extractos y

otras algas con disponibilidad abundante que puedan ser fuente de BCV. El

aumento de las defensas de las plantas tratadas con polisacáridos algales es

atribuido a la sulfatación de los polisacáridos como fucoidanos, carragenanos y

ulvanos. Esto puede deberse a que estos estimulan la producción de

bioestimulantes de crecimiento vegetal que generan respuestas ante estrés biótico

o abiótico como el ácido abscísico, brasinoesteroides, poliaminas, ácido salicílico,

ácido jasmónico y betaínas (Vera et al., 2011; Stadnik y Freitas, 2014).

2.2.5. Metabolitos secundarios extraídos con solventes orgánicos como BCV

Los metabolitos secundarios extraídos con etanol, metanol y acetato de etilo son

bioestimulantes de crecimiento vegetal. Al utilizar solventes orgánicos se extraen

compuestos de bajo peso molecular como florotaninos y terpenos. Varios estudios

han evidenciado la bioactividad de estos componentes algales como

antioxidantes, antibacterianos, anticoagulantes (Muñoz-Ochoa et al., 2010; Di-

Filippo-Herrera et al., 2018), sin embargo, los estudios enfocados a estos como

bioestimulantes de crecimiento vegetal son escasos (Tabla 7).

27

La importancia de conocer y caracterizar los metabolitos secundarios como los

terpenos, se debe a que la síntesis de fitohormonas y reguladores de crecimiento

como las giberelinas, citocininas, brasinoesteroides y el ácido abscísico se

producen a través de la vía de biosíntesis de estos (Jordán y Casaretto, 2006), por

este motivo son esenciales para el desarrollo vegetal.

A partir de distintos precursores terpenoides como el gliceraldehído-3-fosfato y

piruvato (en cloroplasto) y la ruta del ácido mevalónico (citosólica) estos son

producidos. La formación de isopentil pirofosfato (IPP) desencadena la producción

de citoninas ya que este entra en la ruta de los mevalonatos en el citosol para

producir dimetilalil pirofosfato (DMAPP). De la misma forma siguiendo la ruta de

melavolatos, las giberelinas se producen a partir de diterpenos (Geranilgeranil

pirofosfato (GGPP), los brasinoesteroides a partir del triterpeno (Escualeno) y el

ácido abscísico a partir de tetraterpenos (Fitoeno) (Azcón-Bieto y Talón, 2013).

28

Tabla 6. Lípidos, cenizas, vitaminas y pigmentos en extractos algales BCV

Tipo Extracto algal Lípidos Cenizas Vitaminas y pigmentos Referencia

Parda Ascophyllum nodosum X X Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda Fucus serratus X X Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda F. vesiculosus X X Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda Sargassum muticum X X Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda Sargassum polycystum X Elumalai y Rengasamy, 2012

Parda Laminaria hyperborea X X Sharma et al ., 2012a; Sharma et al ., 2012b

Parda Sargassum mcclurei X X X Hong et al ., 2007

Roja Polysiphonia spp. X Michalak et al ., 2015; Godlewska et al ., 2016

Roja Kappahpycus alvarezii X X X Hong et al ., 2007

Roja Gelidiella acerosa X X X Hong et al ., 2007

Roja Laurencia obtusa X X X Hong et al ., 2007

Roja Gracilaria tenuistipitata X X X Hong et al ., 2007

Roja Hypnea valentiae X X X Hong et al ., 2007

Roja Porphyra crispata X X X Hong et al ., 2007

Verde Ulva spp. X Michalak et al ., 2015; Godlewska et al ., 2016

Verde Ulva reticulata X X X Hong et al ., 2007

Verde Caulerpa racemosa X X X Hong et al ., 2007

Verde Cladophora spp. X Michalak et al ., 2015; Godlewska et al ., 2016

29

Entre los pocos estudios referentes a la actividad BCV de metabolitos secundarios

que se han realizado se ha comprobado su efecto BCV. Se ha demostrado que la

aplicación de metabolitos secundarios en altas concentraciones inhibe la

germinación en lechuga y tomate (Hassan y Ghareib, 2009; Houssien et al., 2011).

Otros trabajos han evidenciado que el uso de metabolitos secundarios aumenta el

peso seco de las plantas (Paulert et al., 2009) y las defensas tanto biológicas

como ambientales de las plantas (Houssien et al., 2011).

También se ha reportado un aumento en el porcentaje de germinación de semillas

(Chaikina et al., 2009) y crecimiento en plantas de cultivo (Michalak et al., 2015).

Recientemente algunos investigadores han evaluado el efecto del Eckol como

BCV, este compuesto fue aislado como metabolito secundario del alga parda

Ecklonia maxima (Rengasamy et al., 2016a; Rengasamy et al., 2016b),

determinando el efecto bioestimulante de este.

30

Tabla 7. Compuestos de bajo peso molecular extraídos con solventes orgánicos con actividad BCV

Tipo Extracto algal Extractos Vegetal Referencia

Parda Ecklonia maximaExtracto de acetato de etilo,

florotaninos

Zea mays (Maíz), Brassica

oleracea (Repollo)

Rengasamy et al ., 2016a;

Rengasamy et al ., 2016b

Parda Costaria costata Extracto etanólico Glycine max (Soja) Chaikina et al ., 2009

Parda Leathesia difformis Extractos acetónicos

Varios cultivos: B. oleracea ,

Solanum lycopersicum

(Tomate)

Houssien et al ., 2011

Roja Pterocladia pinnate Extractos acetónicos



(Tomate)


Roja Cladophora sp Polifenoles Lepidium sativum (Berro) Michalak et al ., 2015

Verde Ulva lactucaExtractos acetónicos,

metanólicos y etanólicos



(Tomate)

Hassan y Ghareib, 2009;


Verde Ulva fasciata Phaseolus vulgaris (Frijol) Paulert et al ., 2009

Verde Ulva sp. Polifenoles Lepidium sativum (Berro) Michalak et al ., 2015

Verde Polysiphonia sp. Polifenoles Lepidium sativum (Berro) Michalak et al ., 2015

31

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los fertilizantes y bioestimulantes químicos convencionales se han convertido en

un problema para el sector agrícola, ya que, el uso de estos deteriora la calidad de

los suelos. Además, actualmente la industria alimentaria busca productos

orgánicos, que ayuden a mejorar la composición química de los alimentos.

El uso de macroalgas como materia prima para la producción de bioestimulantes

de crecimiento vegetal es una alternativa para reducir el uso de bioestimulantes y

fertilizantes químicos convencionales en los cultivos. En México hay pocas

industrias dedicadas a la producción de bioestimulantes y las únicas especies de

macroalgas mexicanas utilizadas como materia prima para la formulación de estos

son M. pyrifera y G. robustum. Por este motivo, es necesario investigar

alternativas de macroalgas mexicanas como biomasa potencial para la producción

de bioestimulantes, así como, diversos métodos de extracción y la composición

química de los extractos con la finalidad de dilucidar el mejor método de obtención

y formulación de extractos bioactivos.

Considerando el planteamiento del problema anteriormente descrito, esta

investigación evaluó el efecto bioestimulante de germinación y crecimiento vegetal

de macroalgas mexicanas abundantes en la Península de Baja California y la

diferencia en la actividad de los extractos usando dos métodos de extracción,

baño María y autoclave, así como la bioactividad de polisacáridos y extractos

etanólicos. Teniendo en cuenta la composición química de los extractos algales,

ya que, conociendo la composición química de los extractos más activos se puede

mejorar su formulación.

32

4. HIPÓTESIS

Premisa: Se ha demostrado que el efecto bioestimulante de crecimiento vegetal no

solo es causado por las fitohormonas. Existen otros componentes con “actividad

tipo hormona” como polisacáridos, oligosacáridos y compuestos de bajo peso

molecular, que han demostrado tener un efecto benéfico sobre el crecimiento de

las plantas, por lo que se plantean las siguientes hipótesis de trabajo:

H1: Los carbohidratos, los oligosacáridos y los extractos etanólicos obtenidos de

macroalgas, presentarán una mayor actividad bioestimulante sobre la germinación

y crecimiento vegetal que los extractos algales líquidos alcalinos.

H2: La combinación de extractos algales individuales aumentará la diversidad y

concentración de componentes químicos que potencializará la actividad

bioestimulante en la germinación y crecimiento vegetal.

33

5. OBJETIVOS

General:

Evaluar la actividad bioestimulante de crecimiento vegetal de extractos líquidos

alcalinos, polisacáridos y extractos etanólicos sobre el crecimiento de frijol mungo

(Vigna radiata).

Específicos:

1. Determinar el efecto bioestimulante de los extractos líquidos alcalinos y

establecer los extractos más activos en bioensayos de germinación y crecimiento

del frijol mungo.

2. Determinar el efecto de las mezclas de algas (dos especies) y mezcla de

extractos individuales (dos extractos) con mayor actividad sobre frijol mungo.

3. Determinar el contenido de macro, micronutrientes en los extractos líquidos

alcalinos y algunos parámetros generales como materia orgánica, pH, electro

conductividad, sólidos y sales totales suspendidas.

4. Evaluar el efecto de dos técnicas de producción de extracción líquidos de algas:

baño María y autoclave, sobre el efecto bioestimulante de los extractos sobre la

germinación y crecimiento de frijol mungo.

5. Evaluar la actividad bioestimulante de polisacáridos y extractos etanólicos de

las especies con mayor actividad BCV sobre la germinación y crecimiento de frijol

mungo.

6. Analizar el perfil fitoquímico de cada uno de los extractos obtenidos.

7. Caracterizar los polisacáridos algales por medio de espectroscopía de infrarrojo.

34

6. METODOLOGÍA

6.1 Recolección de algas marinas y preparación de extractos algales Las algas marinas seleccionadas se cosecharon de poblaciones silvestres desde

una panga. Dos pescadores recolectaron por buceo o manualmente en marea

baja a lo largo de la costa de la Península de Baja California, de marzo a octubre

de 2015. Las frondas superficiales de Macrocystis pyrifera se cosecharon en

Santo Tomás (31º 49' 98.56" N - 116º 62' 65.03" O), plantas completas de

Gelidium robustum fueron recolectada en Isla San Martín (30° 29' 20.07" N - 116°

06' 50.61" O), Ecklonia arborea (fronda y estipe) fue recolectada en Bahía

Magdalena (24° 35' 0" N - 112° 0' 0" O), Gracilaria parvispora fue cosechada en

Laguna San Ignacio (26° 54' 00" N - 113° 13' 00" O), especímenes completos de

Sargassum horridum y Acanthophora spicifera fueron recogidas en las playas de

Bahía de La Paz (24° 08' 32" N - 110° 18' 39" O). Las algas frescas se lavaron

inmediatamente después de la cosecha con agua de mar para limpiar cualquier

organismo epifito y arena. Luego se secaron al sol hasta obtener un porcentaje de

humedad inferior al 10 % y se molieron con un molino manual hasta un tamaño de

malla 40 (0.38 mm2).

6.2 Producción de extractos individuales (ELAs) Los ELAs se prepararon en condiciones alcalinas siguiendo los procedimientos

descritos por Briceño-Domínguez et al. (2014). Las algas secas (20 g) se

rehidrataron durante la noche en agua destilada (180 mL), luego se trataron con

solución de Na2CO3 al 10 % (120 mL) para lograr un pH de 10 y se mantuvieron a

80 °C en un baño María con agitación constante durante 2 h. El extracto líquido

obtenido se diluyó para obtener un total de 250 mL. El extracto se filtró

posteriormente al vacío para eliminar el alga residual.

Se elaboraron 6 extractos líquidos (ELAs) y se rotularon con la primera letra del

nombre del género y de la especie: M. pyrifera (MP), G. robustum (GR), E. arborea

35

(EA), G. parvispora (GP), S. horridum (SH), y A. spicifera (AS). Los ELAs que

mostraron un aumento significativo en el porcentaje de germinación y crecimiento

de frijol mungo fueron seleccionados para producir Mezclas de Extractos Líquidos

Algales (MELAs).

6.3 Producción de extractos combinados 6.3.1 Formulación de los MELAs Para la producción de los MELAs se seleccionaron los ELAs que mostraron una

mayor actividad BCV (EA, MP, GP, GR). La mezcla de extractos se realizó

combinando dos extractos líquidos (ELAs) en una proporción 50:50 v/v.

6.3.2 Formulación de EMAs

Para la producción de los EMAs se seleccionaron tres especies algales, dos algas

cafés: S. horridum y E. arborea y una roja Gracilaria parvispora. Previo al proceso

de extracción se realizó la mezcla del tejido algal seco y molido de dos especies

de algas, una roja y una parda en tres proporciones diferentes 30:70 p/p, 50:50 p/p

y 70:30 p/p. La preparación de los extractos se realizó mediante dos técnicas

(baño María y autoclave), con la finalidad de comparar la bioactividad de los

extractos preparados de diferentes formas. Una vez mezcladas las dos especies,

se realizó el primer tipo de extracción, empleando un baño María, siguiendo la

metodología de Briceño-Domínguez et al. (2014). Solo se varió el tiempo de

rehidratación a 12 h.

El segundo tipo de extracción empleado fue en autoclave a 121 ºC y 15 psi por 2

h, modificando la metodología empleada por Castellanos-Barriga et al. (2017). La

extracción se realizó en condiciones alcalinas, para lo cual 20 g de algas

mezcladas en las proporciones antes mencionadas fueron hidratados con 300 mL

de agua destilada, aumentando su pH a 11 con Na2CO3 al 10 % (120 mL).

36

Finalmente, estos extractos se etiquetaron como Extractos de Mezclas de Algas

(EMAs).

Todos los ELAs, MELAs y EMAs se conservaron reduciendo el pH de 10 a un

rango de 4-5 con ácido cítrico en polvo (10 g) para estabilizarlos y promover la

formación de quelatos (la formación de los grupos quelatos ayuda a las plantas a

asimilar los macro y micronutrientes por las plantas). Finalmente, los extractos

acidificados se diluyeron a la concentración experimental y se aplicaron

directamente a las semillas de frijol mungo.

6.4 Extracción de polisacáridos

La extracción de los polisacáridos fucoidan y alginato de Ecklonia arborea y

Sargassum horridum y el extracto etanólico de la mezcla 50:50 p/p se realizó

siguiendo la metodología de Muñoz-Ochoa et al. (2009), Rodríguez-Montesinos et

al. (2008) y (Di Filippo-Herrera et al., 2018), respectivamente. Para la extracción

de agar de Gracilaria parvispora se siguió la metodología de Arvizu-Higuera et al.

(2008).

6.4.1 Obtención de fucoidano

Los fucoidanos (FC) fueron extraídos a partir de 25 g de polvo de alga (E. arborea

y S. horridum) seca y molida, la cual fue hidratada con 350 mL de agua destilada

durante 2 h a 55 ºC en baño María con agitación contante con una propela, a una

velocidad de agitación de 2000 rpm. Al extracto obtenido (350 mL) se le adicionó

CaCl2 para eliminar alginato residual, se centrifugó a 3000 rpm por 20 min y se

precipitó con 3 volúmenes de etanol. El precipitado obtenido se secó a 50 ºC por

20 horas en estufa de secado. Finalmente se obtuvo el fucoidano seco, el cual se

almacenó y refrigeró en viales de vidrio (Muñoz-Ochoa et al., 2009). El fucoidano

obtenido de cada alga fue nombrado: fucoidano de E. arborea (EA-FC), fucoidano

de S. horridum (SH-FC).

37

6.4.2 Obtención de alginato

La extracción de alginato (ALG) de las algas pardas E. arborea y S. horridum se

realizó mediante una extracción alcalina, siguiendo la metodología de Rodríguez-

Montesinos et al. (2008), donde 20 g de cada alga parda seca y molida se hidrató

con una solución de formaldehido al 0.1 % por 12 h para ablandar el tejido algal y

evitar la pigmentación del alginato. A la mañana siguiente al alga hidratada se le

realizó un lavado con HCl a pH 4 con un agitador magnético y movimiento

constante durante 15 min para eliminar sales externas. Posteriormente el alga fue

filtrada con una malla, y se procedió a la extracción alcalina con 300 mL de una

solución de Na2CO3 a pH 10, a 80 ºC agitando con una propela acoplada a un

motor externo (Caframo) por 2 h. La solución de alginato obtenida fue filtrada al

vacío con papel Whatman Nº40 y tierra de diatomeas Celite 545. El alginato fue

obtenido por precipitación añadiendo dos volúmenes de etanol y fueron secadas a

50 ºC por 12 h (Rodríguez-Montesinos et al., 2008). Los alginatos obtenidos de

cada alga fueron nombrados alginato de E. arborea (EA-ALG) y alginato de S.

horridum (SH-ALG).

6.4.3 Obtención de agar

Para la extracción de agar (AG) de G. parvispora se realizó un tratamiento alcalino

previo: veinticinco gramos de G. parvispora seca y molida fueron tratadas en 500

mL de una solución de NaOH al 7 % a 85 ºC en baño María, con movimiento

constante por 12 h. Posteriormente, el tejido algal fue lavado 3 veces con 500 mL

de agua destilada por 5 min. El alga húmeda fue tratada con 500 mL de una

solución de H2SO4 al 0.025 % con agitación constante con propela por 2 h.

Finalmente se removió el exceso de ácido del tejido algal lavándola con 500 mL de

agua destilada por 10 min. Luego, el alga fue colocada en 900 mL de agua

destilada a un pH de 6.5 (la cual fue ajustada con ácido fosfórico al 10 %) con

agitación constante a 80 ºC por 2 h. El extracto fue filtrado al vacío con tierra de

diatomeas Celite 545. Se dejó gelificar a temperatura ambiente en bandeja de

plástico y se congeló durante 16 h. Al día siguiente se descongeló a temperatura

38

ambiente y finalmente se lavó con etanol al 97 %. Las fibras de agar fueron

secadas en un horno a 55 °C durante 24 h (Arvizu-Higuera et al., 2008). El agar

resultante fue nombrado GP-AG.

6.5 Obtención de extracto etanólico

Los extractos etanólicos se obtuvieron a partir de las mezclas de cada alga parda

con la roja en una proporción 50:50 p/p, donde 50 g de tejido algal total fue

embebido en 150 mL de etanol por 72 h, con 3 recambios de etanol cada tercer

día (9 días). El extracto se filtró con papel filtro y se roto evaporó a una

temperatura de 40ºC hasta sequedad (Di Filippo-Herrera et al., 2018). Los

extractos etanólicos se nombraron de acuerdo con las mezclas E. arborea + G.

parvispora (EAGP-OH) y S. horridum + G. parvispora (SHGP-OH).

6.6 Análisis químico proximal de algas marinas

El análisis químico de las algas marinas secas se llevó a cabo siguiendo los

métodos de la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC, 2000). La

humedad se determinó por la diferencia de peso después del secado a 60 °C

hasta alcanzar un peso constante (método 930.36), las proteínas se cuantificaron

usando el factor 5.38 para algas pardas y 4.92 para algas rojas (método 954.04;

Lourenco et al., 2002), el extracto etéreo y la fibra cruda se cuantificaron por

Soxhlet (método 954.02), el contenido de cenizas por calcinación a 550 °C

(método 942.05). Los carbohidratos se calcularon como: % de carbohidratos = 100

- (% de ceniza + % de proteínas + % de extracto de éter + % de fibra cruda).

6.7 Análisis químico de los extractos líquidos alcalinos ELAs, MELAs y EMAs

La composición fisicoquímica de los ELAs, MELAs y EMAs fue determinada por

servicio externo en la empresa Algaspacific (algaspacific.com), siguiendo la

39

metodología utilizada para realizar el control de calidad de su extracto NPKelp

(Laboratorio Agrícola Agroambiental) e incluye, medición del pH y electro-

conductividad (EC), expresada como dS−1. Los sólidos totales (ST) corresponden

al residuo que queda después de evaporar y secar los extractos a una

temperatura de 105 ºC ± 2 ºC. Las sales solubles totales (con salinómetro),

densidad (densímetro), la materia orgánica (se calculó por diferencia de porcentaje

de cenizas del 100 %), el contenido de ceniza (por calcinación a 550 ºC en una

mufla, método 942.05) y contenido de nitrógeno por el método micro-Kjeldahl

(método 976.05). Los minerales fueron analizados por espectrofotometría de

absorción atómica para carbono orgánico, sodio total, potasio total, óxido de

potasio, calcio total, cloruros, sulfatos, bicarbonatos, hierro, zinc, cobre, boro y

fósforo (por colorimetría) siguiendo los procedimientos de la Asociación de

Químicos Analíticos Oficiales (AOAC, 1990).

6.8 Caracterización por espectroscopía de infrarrojo (FTIR-ATR) de polisacáridos

La caracterización de los polisacáridos se realizó mediante espectrometría de

infrarrojo. Los espectros de fucoidanos, alginatos y agar se registraron con un

espectrofotómetro (Perkin Elmer, TWO, Waltham, MA, EE. UU.), equipado con un

atenuador de reflectancia total (ATR). Cada espectro se obtuvo de la suma de 14

exploraciones en el rango espectral 4000–500 cm−1(Lijour et al., 1994).

6.9 Caracterización química de componentes de bajo peso molecular en extractos etanólicos y extractos acuosos Los extractos etanólicos y acuosos fueron caracterizados por medio de la técnica

colorimétrica de presencia o ausencia de alcaloides, triterpenos y esteroles,

fenoles y taninos, flavonoides, cumarinas y saponinas (Harborne,1973).

40

6.10 Bioensayos de germinación y crecimiento en condiciones in vitro Semillas certificadas de frijol mungo (Vigna radiata), Siega Alta, semillas

orgánicas, EE. UU con tamaño, color y peso uniforme se desinfectaron

superficialmente usando una solución jabonosa durante 5 min, seguido de

inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 4 % durante 10 minutos y

posteriormente se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril durante 1 min.

La germinación del frijol mungo se llevó a cabo como lo describe Castellanos-

Barriga et al. (2017). Las semillas fueron embebidas durante 15 min en 20 mL de

ELAs, MELAs y el bioestimulante comercial NPKelp a seis concentraciones

diferentes (0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 1 y 2 %) y en los EMAs, fucoidanos, alginatos,

agar y extractos etanólicos a tres concentraciones diferentes (0.06, 0.12, 0.25) y

un control (agua destilada). A continuación, las semillas fueron retiradas de los

extractos, se envolvieron en papel filtro húmedo y se incubaron a 25 °C en un

régimen de 16 h de luz / 8 h de oscuridad. Las unidades experimentales se

organizaron en un diseño de bloques al azar completo. Los experimentos se

llevaron a cabo por triplicado (n = 30 semillas por bloque y tratamiento).

La germinación se observó diariamente durante 8 días, de acuerdo con los

métodos detallados por la Asociación de Analistas de Semillas Oficiales (AOSA,

2005). Las semillas se consideraron germinadas cuando la radícula sobresalía

más de 2 mm. El porcentaje de germinación fue obtenido aplicando la fórmula, GP

= número de semillas germinadas / número total de semillas x 100.

Después de 8 días, se observaron los efectos de los extractos y polisacáridos en

la longitud del tallo (desde el nodo basal hasta el vértice del brote), la longitud de

la raíz (desde el nodo basal hasta la punta de la raíz principal) y la altura total

(desde la punta de la raíz principal hasta el ápice del brote) de las plántulas,

usando una regla y un vernier. Además, se obtuvo el peso en fresco

(inmediatamente después de la medición) y seco (después del secado al horno a

50 ºC por 48 h) con una balanza analítica. Todos los resultados se presentan en

41

gráficos que muestran el porcentaje de crecimiento promedio adicional al valor del

control (agua destilada) de las plantas que recibieron tratamientos ELAs, MELAs,

EMAs, fucoidanos, alginatos, agar, extractos etanólicos y el extracto comercial

(NPKelp).

6.11 Análisis estadístico

El efecto de los ELAs, MELAs, EMAs, polisacáridos y extractos etanólicos sobre el

crecimiento del frijol mungo fue analizado por medio de un análisis de

comparaciones de medias para múltiples rangos o tratamientos mediante análisis

de varianza MANOVA y las comparaciones múltiples se realizaron mediante la

prueba de rango de mínimas diferencia significativa (LSD) (α = 0,05). Se utilizó

Statgraphics Centurion XV para Windows para todos los análisis.

42

7. RESULTADOS 7.1 Análisis químico proximal de las algas marinas Los carbohidratos fueron el componente mayoritario (> 33 %) en las algas,

seguidos de los minerales, las proteínas, las fibras y el contenido de lípidos. El

mayor contenido de carbohidratos se obtuvo en G. robustum y E. arborea (59 y 50

%, respectivamente) y proteína (13 y 8 %, respectivamente). Las algas marinas M.

pyrifera y G. parvispora presentaron el mayor contenido de minerales (36 y 34 %,

respectivamente) y lípidos (0.92 y 2.1 %, respectivamente). Por el contrario, se

encontró que A. spicifera y S. horridum tenían el menor contenido de lípidos (0.3

%) y de contenido de proteína (8.2 y 7.5 %, respectivamente; Tabla 8).

Tabla 8. Composición química proximal de las algas marinas en % de polvo seco del peso del alga molida

Algas Humedad Proteína Lípidos Cenizas Fibra Carbohidratos

Macrocystis pyrifera 6.85 ± 0.31 7.53 ± 0.62 0.92 ± 0.02 36.67 ± 1.66 7.69 ± 0.40 43.70 ± 1.02

Sargassum horridum 8.70 ± 0.17 7.53 ± 0.36 0.28 ± 0.04 34.75 ± 1.34 7.67 ± 0.17 42.25 ± 1.59

Ecklonia arborea 9.03 ± 0.03 8.12 ± 0.35 0.43 ± 0.03 17.21 ± 1.32 4.10 ± 0.10 50.52 ± 1.56

Acanthophora spicifera 10.09 ± 0.09 8.12 ± 0.07 0.30 ± 0.06 31.09 ± 1.12 5.02 ± 0.38 33.50 ± 1.53

Gelidium robustum 8.05 ± 0.00 13.78 ± 0.42 0.51 ± 0.02 10.69 ± 0.96 7.05 ± 0.36 59.92 ± 1.73

Gracilaria parvispora 8.70 ± 0.25 8.46 ± 0.04 2.17 ± 0.02 34.86 ± 0.36 2.06 ± 0.69 43.75 ± 1.27

7.2 Análisis químico de los extractos líquidos alcalinos (ELAs), las mezclas de extractos (MELAs) y mezcla de algas previa al proceso de extracción EMAs Todos los parámetros químicos evaluados para ELAs mostraron valores similares,

excepto para G. parvispora. El pH en todos los ELAs fue ácido y no fueron

superior a 5.6 para su estabilización y aplicación. La densidad estuvo entre 1.03 y

1.08 g mL-1 y la conductividad eléctrica (CE) entre 26.6 y 28.1 dS m-1. De manera

similar, el contenido de sales solubles osciló entre 17,010 y 17,909 ppm.

43

Finalmente, se encontró que el contenido mineral en los ELAs varió de 2.5 a 8.6

%. Se presentaron amplios intervalos en el contenido de macro y micronutrientes,

especialmente para zinc (0.15 a 2.19 %), boro (2.6 a 9.2 %) y hierro (2.3 a 3.5 %),

ppm; Tabla 9).

Específicamente, los ELAs de A. spicifera y E. arborea mostraron un mayor

contenido de sólidos totales, materia orgánica, carbono orgánico, nitrógeno total,

fósforo total, potasio total y zinc, comparando estos con los otros ELAs analizados.

Además, los ELAs de G. robustum y S. horridum tuvieron los más altos niveles de

calcio y cloruros totales. El ELA de M. pyrifera mostró altas concentraciones de

nitrógeno total, fósforo total y hierro. La composición química del ELA de G.

parvispora fue comparable a la del extracto comercial NPKelp (Tabla 9).

Tabla 9. Composición química de los extractos algales ELAs

MP SH EA AS GR GP

pH 1:10 5.15 5.62 5.50 5.10 5.32 4.40

Electro conductividad (1:10) (dS m-1) 28.10 26.60 27.10 27.30 27.60 43.00

Sales solubles totales (ppm) 17,990 17,010 17,340 17,460 17,660 27,520

Sólidos totales (%) 7.2 6.8 20.17 20.2 7.2 34.7

Materia orgánica (%) 2.05 2.05 2.11 2.12 2.05 1.96

Densidad (g mL-1) 1.03 1.04 1.07 1.07 1.03 1.08

Cenizas (%) 6.72 4.94 8.65 8.65 6.72 2.50

Macronutrientes y otros componentes (%)

Carbón orgánico 1.19 1.19 1.22 1.23 1.19 1.14

Nitrógeno total 1.05 0.84 0.95 1.01 0.98 0.77

Relación C/N 0.88 0.71 1.30 1.22 0.82 1.48

Nitratos (NO3) nd nd nd nd nd 17.5

Amonio (NH4) nd nd nd nd nd 0.75

Fósforo total 0.12 0.12 0.12 0.13 0.15 0.07

Fósforo (P2O5) 2.75 2.79 2.75 2.87 3.36 1.64

Potasio total 1.60 1.55 2.20 2.40 1.80 2.10

Potasio (K2O) 1.92 1.86 2.64 2.88 2.16 2.52

Calcio total 0.04 0.05 0.04 0.07 0.05 0.06

Sodio total 0.08 0.08 0.08 0.06 0.08 0.08

44

Cloruros 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.01

Sulfatos (S-SO4) 0.0001 0.0001 0.0000 0.0003 0.0001 0.0003

Bicarbonatos (HCO3) 0.06 0.06 0.05 0.05 0.06 0.06

Micronutrientes (%)

Hierro (Fe) 3.22 2.33 2.78 2.78 3.00 3.54

Zinc (Zn) 0.38 0.24 2.00 2.19 0.15 0.24

Boro (B) 7.34 8.6 9.20 4.90 6.12 2.57

nd= no determinado

Los parámetros químicos evaluados para MELAs mostraron valores similares. La

densidad varió de 1.03 a 1.07 g mL-1, y la CE entre 26 y 28 dS m-1. El contenido de

sales solubles tuvo un intervalo de 17,000 a 17,820 ppm, el contenido de sólidos

totales en un intervalo de 2 a 21.5 % y los minerales variaron de 5 al 8.6 %,

específicamente zinc (0.2 a 2 %) y boro (3.1 a 9.2 %), como se muestra en la

Tabla 10.

La mezcla de extractos compuesta por M. pyrifera y G. parvispora (MPGP) y M.

pyrifera y G. robustum (MPGR) mostraron un intervalo similar para potasio (2.17 -

2.50 %), óxido de potasio (2.64 - 2.68 %), zinc (1.02 - 2.0 %) y boro (7.03 - 8.41

%). Igualmente, la combinación de G. robustum y G. parvispora (GRGP) mostró un

alto contenido de nitrógeno total, fósforo total, pentóxido de fósforo y cobre, en

comparación con los otros MELAs.

Además, la composición química del MELAs a partir de dos algas pardas, M.

pyrifera y E. arborea (MPEA) mostró un mayor contenido de hierro (3.30 ppm). El

extracto comercial NPKelp presentó niveles más altos de cloruros (0.62 %) y sales

solubles (30,080; Tabla 10).

45

Table 10. Composición química de las mezclas de extractos algales MELAs

nd=no determinado

El análisis químico de los EMAs producidos en baño María mostró que el proceso

de hidrólisis de SHGP deja disponibles una mayor cantidad de sales totales

(16,768 a 21,120 ppm) y por ende un menor contenido de materia orgánica (1.97 a

2.37 %), en los extractos producidos a partir de la mezcla algal de S. horridum

GRGP EAGP MPGP MPGR EAGR MPEA NPKelp

pH 1:10 5.31 5.60 5.00 5.10 5.61 5.20 4.85

Electro conductividad (1:10) (dS m-1) 27.1 26.0 27.3 27.3 26.7 28.0 47.00

Sales solubles totales (ppm) 17,790 16,640 17,498 17,459 17,000 17,821 30,080

Sólidos totales (%) 2.3 21.56 7 18 8.9 7 18.1

Materia orgánica (%) 2.05 2.00 2.05 2.10 2.06 2.05 1.91

Densidad (g mL-1) 1.03 1.06 1.03 1.07 1.05 1.03 1.08

Cenizas (%) 6.75 8.70 6.82 8.60 5.00 6.80 2.04


Carbón orgánico 1.22 1.31 1.21 1.22 1.22 1.20 1.11

Nitrógeno total 1.02 1.00 0.95 1.00 0.90 1.00 0.77

Relación C/N 0.86 1.39 0.79 1.22 0.76 0.84 1.44

Nitratos (NO3) nd nd nd nd nd nd 18.00

Amonio (NH4) nd nd nd nd nd nd 0.85

Fósforo total 0.15 0.14 0.10 0.12 0.13 0.13 0.05

Fósforo (P2O5) 3.52 2.75 2.33 2.67 3.00 2.98 1.13

Potasio total 1.80 2.22 2.17 2.50 1.76 1.60 1.95

Potasio (K2O) 2.16 2.60 2.64 2.68 1.70 1.92 2.34

Calcio total 0.05 0.06 0.07 0.07 0.05 0.04 0.07

Sodio total 0.08 0.10 0.08 0.06 0.08 0.07 0.08

Cloruros 0.06 0.07 0.04 0.07 0.07 0.06 0.62

Sulfatos (S-SO4) 0.0001 0.0002 0.0001 0.0003 0.0001 0.0001 0.0003

Bicarbonatos (HCO3) 0.06 0.05 0.06 0.05 0.06 0.06 0.06

Micronutrientes (%)

Hierro (Fe) 3.00 2.83 2.93 2.77 2.33 3.30 3.18

Zinc (Zn) 0.22 2.00 1.02 2.00 0.27 0.40 1.94

Cobre (Cu) 0.55 0.33 0.39 0.50 0.41 0.38 nd

Boro (B) 6.54 9.02 7.03 8.41 8.66 7.00 3.06

46

(SH) y G. parvispora (GP), especialmente los obtenido con la proporción 30:70 p/p

y 70:30 p/p de algas parda y roja, respectivamente.

La densidad de los extractos varió de 1.04 a 1.11 g mL-1: la EC entre 25 y 33 dS

m-1 y el contenido de fósforo (P2O5) y potasio (K2O) de 2.00 a 2.90 y 2.00 a 2.80,

respectivamente y fue superior al contenido de fósforo y potasio total en

comparación a los otros EMAs evaluados. El contenido de micronutrientes fue

diferente entre los extractos, y varió de 0.07 al 8.2 %, específicamente boro (1.5 a

8.7 %), hierro (1.1 a 2.2 %), cobre (0.07 a 0.66 %) y zinc (0.6 a 1.8 %), como se

muestra en la Tabla 11.

El EMA compuestos por S. horridum y G. parvispora (SHGP) mostró un mayor

contenido de óxido de potasio y el óxido de fósforo en las mezclas en proporción

algal de 30:70 p/p (SHGP) y 50:50 p/p (SHGP). Así como, un mayor contenido de

hierro, especialmente a las proporciones 30:70 p/p (SHGP) y 70:30 p/p (SHGP). El

EMA compuesto por E. arborea y G. parvispora exhibió altas concentraciones de

sólidos totales y boro (Tabla 11).

Tabla 11. Composición química de los EMAs preparados en baño María. Proporciones de tejido algal mezclado (p/p) de E. arborea y G. parvispora (EAGP), S. horridum y G. parvispora (SHGP)

EAGP

30:70

EAGP

50:50

EAGP

70:30

SHGP

30:70

SHGP

50:50

SHGP

70:30

pH 1:10 4.7 5.64 5.00 5.00 5.10 4.70


Sales solubles totales (ppm) 17280 17088 16256 21120 16768 19200

Sólidos totales (%) 13 18.8 16.9 9.4 10.4 11.9


Densidad (g mL-1) 1.11 1.08 1.09 1.05 1.05 1.04

Cenizas (%) 6.09 7.07 6.02 6.30 6.49 6.42


Carbón orgánico 1.19 1.34 1.31 1.14 1.38 1.15

Nitrógeno total 1.22 1.08 1.11 0.88 1.52 0.91

Relación C/N 0.97 1.25 1.18 1.31 0.91 1.27

Fósforo total 0.31 0.16 0.18 0.47 0.17 0.49

47

Fósforo (P2O5) 2.00 2.70 2.33 2.50 2.90 2.16

Potasio total 1.84 2.19 2.22 1.90 2.13 1.70

Potasio (K2O) 2.00 2.72 2.80 2.10 2.51 2.00

Calcio total 0.22 0.08 0.10 0.49 0.09 0.63

Sodio total 0.07 0.09 0.08 0.18 0.05 0.21

Cloruros 0.05 0.08 0.07 0.03 0.06 0.03

Sulfatos (S-SO4) 0.0001 0.0002 0.0005 0.0002 0.0001 0.0001


Micronutrientes (%)

Hierro (Fe) 1.65 2.00 1.81 2.20 1.10 2.7

Zinc (Zn) 0.75 1.77 1.83 0.75 1.22 0.79

Cobre (Cu) 0.66 0.21 0.25 0.47 0.07 0.58

Boro (B) 6.2 8.2 8.1 1.5 5.3 1.9

nd=no determinado

Mientras que los EMAs producidos en autoclave mostraron valores similares para

densidad, variando esta de 1.03 a 1.33 g mL-1 y la EC varió entre 26.1 a 34 dS m-1.

El contenido de sales solubles estuvo en el rango de 16,640 a 21,760 ppm y el

contenido de micronutrientes fue diferente, y varió de 0.45 a 8.8 %, especialmente

el hierro (1.2 a 3.3 %), zinc (0.6 a 1 %), cobre (0.4 a 0.7 %) y boro (1.2 a 8.8 %),

como se muestra en la Tabla 12.

El EMA compuesto por S. horridum y G. parvispora (SHGP) mostró un mayor

contenido de sales solubles, electro conductividad, fósforo, calcio y sodio total,

especialmente a la proporción 30:70 p/p (SHGP).

Así mismo, la mezcla de las algas E. arborea y G. parvispora (EAGP) mostró un

mayor contenido de óxido de fósforo, óxido de potasio y potasio total.

Especialmente a la proporción de mezcla algal de 70:30 p/p (EAGP; Tabla 12).

48

Tabla 12. Composición química de los EMAs preparados en autoclave. Proporciones de tejido algal mezclado (p/p) de E. arborea y G. parvispora (EAGP), S. horridum y G. parvispora (SHGP)

EAGP

30:70

EAGP

50:50

EAGP

70:30

SHGP

30:70

SHGP

50:50

SHGP

70:30

pH 1:10 5.00 4.7 4.9 4.70 4.80 4.65


Sales solubles totales (ppm) 17,600 16,640 16,704 21,760 19,200 18,560

Sólidos totales (%) 10 16 16.4 15.1 8 12.3


Densidad (g mL-1) 1.33 1.09 1.10 1.04 1.03 1.03

Cenizas (%) 6.22 6.04 6.10 6.08 6.20 6.17


Carbón orgánico 1.23 1.14 1.38 1.16 1.16 1.15

Nitrógeno total 1.46 1.04 1.17 1.09 0.86 1.07

Relación C/N 0.84 1.10 1.17 1.07 1.34 1.09

Fósforo total 0.45 0.28 0.20 0.67 0.45 0.55

Fósforo (P2O5) 2.31 2.06 2.33 1.98 2.38 2.00

Potasio total 1.94 2.01 2.13 1.04 1.77 1.80

Potasio (K2O) 2.07 2.40 2.77 2.00 2.00 2.07

Calcio total 0.27 0.17 0.12 0.92 0.44 0.84

Sodio total 0.13 0.04 0.06 0.26 0.20 0.23

Cloruros 0.07 0.06 0.08 0.05 0.06 0.05

Sulfatos (S-SO4) 0.0003 0.0003 0.0002 0.0001 0.0003 0.0001


Micronutrientes (%)

Hiero (Fe) 2.20 1.23 1.90 3.10 1.70 3.30

Zinc (Zn) 0.92 0.61 0.97 0.88 0.70 0.92

Cobre (Cu) 0.72 0.41 0.45 0.65 0.45 0.63

Boro (B) 8.8 5.5 7.2 1.8 3.6 1.2

nd=no determinado

7.3 Caracterización por espectroscopía de infrarrojo (FTIR-ATR) de polisacáridos 7.3.1 Fucoidano

El espectro de infrarrojo (IR) muestra bandas de absorción propias de fucoidanos.

Las bandas de absorción en el rango 1680–1600 cm-1 muestran la presencia de

49

ácidos urónicos. Las bandas en 1260–1200 cm−1 son atribuido a las vibraciones

del enlace S=O del grupo sulfato. Se corrobora la presencia de los grupos sulfato

con la banda alrededor de 580 cm−1. Las bandas entre los 1100–1000 cm−1

corresponden a anillos hemiacetal, y las bandas en 850–820 cm−1 se atribuyen a

las sustituciones de grupos sulfato en las posiciones C2 o C3 y C4 de residuos de

fucosa (Fig. 1).

Figura 1. Espectro de infrarrojo de los fucoidanos de Ecklonia arborea (EA-FC) y Sargassum

horridum (SH-FC)

7.3.2 Alginato El espectro de IR mostró bandas de absorción típicas de alginatos a los 872 y 811

cm-1. Las bandas de absorción a los 1605 y 1410 cm-1 son causadas por las

vibraciones asimétricas y simétricas del estiramiento de los grupos C=O-O,

respectivamente. Las bandas de absorción correspondientes a la vibración de los

enlaces hemiacetal de los residuos de ácido manurónico y gulurónico se

observaron a los 1120 y 1082 cm-1, respectivamente. Así como la banda a los

1026 cm-1, que corresponde a los grupos COC (Fig. 2).

50

Figura 2. Espectro de infrarrojo de los alginatos de Ecklonia arborea (EA-FC) y Sargassum horridum (SH-FC)

7.3.3 Agar

El espectro de IR mostró bandas de absorción típicas de agar a los 930 cm-1. Esta

señal es típica de la unión C=O en la 3,6 anhidrogalactosa y el pico alrededor de

los 900 cm-1 corresponden a los grupos =SO3H. Las bandas de absorción

alrededor de los 1240-1250 cm-1 son típicas de los polisacáridos sulfatados. La

ausencia de los enlaces a los 845-850 cm-1 del sulfato axial secundario en

galactosa 4 sulfato con enlace polimérico 1,3 y a los 805-810 cm-1, permite

constatar que el polisacárido algal estudiado es agar y no es un carragenano y el

proceso de extracción se realizó adecuadamente (Fig. 3).

Figura 3. Espectro de infrarrojo del agar obtenido de Gracilaria parvispora (GP-AG)

51

7.4 Perfil fitoquímico de extractos etanólicos y acuosos

El perfil fitoquímico muestra la presencia de alcaloides, triterpenos y esteroles,

fenoles, taninos, flavonoides, cumarinas y saponinas en los extractos etanólicos.

Los extractos acuosos no contienen alcaloides, triterpenos y esteroles (Tabla 13).

Tabla 13. Perfil fitoquímico de extractos etanólicos EAGP-OH (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGP-OH (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora). X=presencia de los compuestos

EAGP-OH SHGP-OH Ext. Acuosos

Alcaloides X X

Triterpenos y esteroles X X

Fenoles y taninos X X X

Flavonoides X X X

Cumarinas X X X

Saponinas X X X

ExtractosMetabolitos

7.5 Bioensayos de germinación y crecimiento en condiciones in vitro 7.5.1 Efecto de ELAs sobre la germinación y el crecimiento de las plántulas de frijol mungo

La germinación de las semillas del frijol mungo se produjo en la mayoría de los

tratamientos después del día 4. El mayor efecto sobre el porcentaje de

germinación se observó en las semillas tratadas con los ELAs producidos a partir

del grupo de algas pardas, en comparación con los ELAs producido a partir de

algas rojas. En particular, el ELA de E. arborea aumentó la germinación en un 6 %

sobre el control a todas las concentraciones probadas. Del mismo modo, los ELAs

de M. pyrifera y S. horridum a una concentración de 0.5 y 2 % mostraron efectos

positivos significativos sobre el porcentaje de germinación (6 %). En contraste con

los ELAs de A. spicifera y G. robustum aplicados al 0.5 % y el ELAs de G.

parvispora al 2 % redujeron la germinación (Fig. 4).

52

Figura 4. Curva dosis-respuesta del porcentaje de germinación (GP) a los extractos alcalinos de Macrocystis pyrifera (MP), Sargassum horridum (SH), Ecklonia arborea (EA), Acanthophora spicifera (AS), Gelidium robustum (GR) y Gracilaria parvispora (GP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 y 2.0%). Los valores representan la media de n = 30 plántulas; las barras representan errores estándar. La marca (──) indica la línea de base de la figura que corresponde al control.

Los resultados muestran que varios ELAs produjeron un efecto estimulante

significativo (p ≤ 0.05) en la longitud del tallo de frijol mungo. El mayor promedio

de longitud del tallo se presentó en las plantas de frijol mungo que recibieron

tratamiento con el ELAs de E. arborea al 0.25 % y M. pyrifera al 0.12 %, con un

aumento de 39 y 30 %, respectivamente, en comparación con el control (Fig. 5a).

Además, los ELAs de M. pyrifera, E. arborea, G. robustum y G. parvispora

promovieron el crecimiento de la raíz. La mayor longitud de la raíz se observó en

plantas que recibieron tratamiento con los ELAs de M. pyrifera y E. arborea al 2 %,

con un aumento del 28 y 21 %, respectivamente, en comparación con el control

(Fig. 5b). Por el contrario, los ELAs de G. robustum y G. parvispora a la más baja

concentración (0.06 %) promovieron el crecimiento de la raíz, en un periodo de

tiempo mayor que los ELAs de las algas pardas (Fig. 5b).

La longitud total de las plantas se incrementó con el tratamiento de casi todos los

ELAs. Las plántulas que fueron tratadas con los ELAs de E. arborea y M. pyrifera

53

mostraron el mayor aumento en su longitud, con 27 y 21 %, respectivamente,

sobre el control. De forma similar, los ELAs de G. robustum al 2 % y G. parvispora

al 0.06 % mostraron un aumento significativo del 18 y 12 %, respectivamente. En

contraste, los ELAs de S. horridum y A. spicifera mostraron un efecto inhibitorio

sobre la longitud de las plantas de frijol mungo (Fig. 5c).

El extracto de G. robustum al 2 %, mostró un aumento significativo del 43 % en

comparación con el control en el peso fresco de frijol mungo. Además, los ELAs de

M. pyrifera al 0.06 %, E. arborea al 0.25 % y G. parvispora al 0.06 % mostraron un

efecto significativo sobre el peso fresco de la planta (35, 34 y 31 %,

respectivamente; Fig. 6a).

54

Figura 5. Efecto de los extractos líquidos alcalinos de Macrocystis pyrifera (MP), Sargassum horridum (SH), Ecklonia arborea (EA), Acanthophora spicifera (AS), Gelidium robustum (GR) y Gracilaria parvispora (GP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 y 2.0 %) en: a) longitud del tallo, b) longitud de la raíz, y c) longitud total de la planta del frijol mungo. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

55

El ELA de G. parvispora al 0.06 % mostró el mayor incremento en el peso seco de

las plantas de frijol mungo con un aumento del 26 % en comparación con el

control para los ELAs de las algas rojas. Los ELAs de M. pyrifera y S. horridum a

0.5 % tuvieron un efecto bioestimulante en el crecimiento de frijol mungo de 18 y

13 %, respectivamente, en comparación con el control (Fig. 6a-b). En contraste,

los ELAs de S. horridum y A. spicifera aplicados en la mayoría de las

concentraciones no mostraron un aumento significativo del peso fresco y seco de

las plantas de frijol mungo (Fig. 6a-b).

Figura 6. Efecto de los extractos líquidos alcalinos de Macrocystis pyrifera (MP), Sargassum horridum (SH), Ecklonia arborea (EA), Acanthophora spicifera (AS), Gelidium robustum (GR) y Gracilaria parvispora (GP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 y 2.0 %) en: a) peso fresco y b) peso seco de la planta de frijol mungo. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

56

7.5.2 Efecto de los MELAs en la germinación y el crecimiento de las plántulas de frijol mungo

El MELA de E. arborea y G. parvispora (EAGP) administrada al 0.5 % mostró un

mayor aumento en el porcentaje de germinación (9 %) sobre el control en

comparación con los otros extractos analizados. De manera similar, las plantas de

frijol mungo tratadas con el MELA de E. arborea y G. robustum (EAGR)

administrado al 0.25 y 1 % tuvieron un aumento del 6 y 7 % respecto al control

(agua destilada), respectivamente. Finalmente, el extracto comercial NPKelp

mostró un efecto inhibitorio de la germinación de frijol mungo en comparación con

los extractos experimentales y el control (Fig. 7).

Se observó una respuesta diferencial en el crecimiento de las plantas de frijol

mungo con el uso de las mezclas de extractos (MELAs).

Figura 7. Curva dosis-respuesta del porcentaje de germinación (PG) de las mezclas de los extractos líquidos GRGP (G. robustum y G. parvispora), EAGP (E. arborea y G. parvispora), MPGP (M. pyrifera y G. parvispora), MPGR (M. pyrifera y G. robustum), EAGR (E. arborea y G. robustum), MPEA (M. pyrifera y E. arborea), y NPKelp = Producto comercial, a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 and 2.0 %). Los valores representan la media de n = 30 plántulas; las barras representan errores estándar. La marca (──) indica la línea de base de la figura que corresponde al control.

57

Figura 8. Efectos de las diferentes mezclas a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1.0 y 2.0 %) en: a) longitud del tallo, b) longitud de la raíz, y c) longitud total de plantas de frijol mungo. GRGP = (Gelidium robustum + Gracilaria parvispora, EAGP = (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora), MPGP = (Macrocystis pyrifera + Gracilaria parvispora), MPGR = (Macrocystis pyrifera + Gelidium robustum), EAGR = (Ecklonia arborea + Gelidium robustum), MPEA = (Macrocystis pyrifera + Ecklonia arborea), y NPKelp = Producto comercial. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

58

El mayor promedio de longitud del tallo se encontró en las plantas que recibieron

el tratamiento del MELA EAGP con un aumento de hasta el 21 % en comparación

con el control, y del doble de aumento en comparación con el NPKelp aplicado al

0.25 % (Fig. 8a).

Además, el MELA de EAGP tuvo un efecto significativamente mayor (p ≤ 0.05) en

la longitud de la raíz de las plántulas de frijol mungo a una concentración del 1 %,

mostrando un aumento del 36 % en comparación con el control.

La mezcla de los extractos MPEA aplicado al 1 % aumentó la longitud de la raíz

hasta un 20 % (Fig. 8b). Se observó un aumento de la longitud total del 25 y 13 %

en las plantas tratadas con el MELA de EAGP al 0.25% y con el MELA de MPEA

al 0.12 %, en comparación con el control, respectivamente (Fig. 8c).

El peso fresco de frijol mungo aumentó con tres de las seis mezclas, GRGP,

EAGP y MPEA. El peso fresco se incrementó principalmente en aquellas plantas

tratadas con la mezcla EAGP, particularmente a una concentración de 0.25 %,

donde el aumento fue del 32 % comparado con el control (agua destilada), y

también un 30.6 % mayor al efecto del NPKelp.

El MELA GRGP al 0.5 % mostró un aumento del 29 % sobre el control y una

diferencia de 5 veces entre las concentraciones más altas de GRGP. Además, la

aplicación del MELA de MPEA al 0.12 % mejoró el peso fresco en un 31 %

comparado con el control, y dos veces mayor en comparación con el NPKelp (Fig.

9a).

El aumento máximo del peso seco se obtuvo con el MELA obtenido con la mezcla

de los extractos de E. arborea y G. parvispora (EAGP), a la concentración de 0.5

% con un aumento del peso seco de frijol mungo de 45 % sobre el control y el

NPKelp (Fig. 9b). Finalmente, las mezcla de MPGP, MPGR y EAGR mostraron un

efecto negativo en todos los parámetros de crecimiento evaluados (Fig. 8 y 9).

59

Figura 9. Efecto de las diferentes mezclas a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25, 0.5. 1 y 2 %) en: a) peso fresco y b) peso seco de la planta de frijol mungo. GRGP = (Gelidium robustum + Gracilaria parvispora, EAGP = (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora), MPGP = (Macrocystis pyrifera + Gracilaria parvispora), MPGR = (Macrocystis pyrifera + Gelidium robustum), EAGR = (Ecklonia arborea + Gelidium robustum), MPEA = (Macrocystis pyrifera + Ecklonia arborea), y NPKelp = Producto comercial. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

7.5.3 Efecto de los extractos producidos con la combinación de tejido algal previa al proceso de extracción (EMAs) sobre la germinación y el crecimiento de las plántulas de frijol mungo

La germinación del frijol mungo se produjo en la mayoría de los tratamientos

después del día 1. Todos los extractos analizados: EAGPBM, EAGPAC, SHGPBM

y SHGPAC aumentaron la germinación en un 3.4 % sobre el control a todas las

concentraciones probadas (0.12, 0.25 y 0.5 %), con un porcentaje de germinación

del 100 % (Tabla 14).

60

Tabla 14. Efecto de los extractos líquidos alcalinos de mezclas de algas (EMAs) en el porcentaje de germinación (PG)

GP

EAGPBM EAGPAC SHGPBM SHGPAC

30:70 50:50 70:30 30:70 50:50 70:30 30:70 50:50 70:30 30:70 50:50 70:30

Control 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 93.3 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6

0.06 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

0.12 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

0.25 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Como respuesta varios EMAs produjeron un efecto bioestimulante significativo (p

≤ 0.05) en la longitud del tallo de frijol mungo en comparación al control (agua

destilada). Además, los dos métodos de extracción empleado (baño María y

autoclave) en la producción de los bioestimulantes de crecimiento vegetal (BCV)

tuvieron diferencias significativas (p ≤ 0.05) en el crecimiento de las plantas.

El mayor promedio del aumento de la longitud del tallo se presentó en las plantas

de frijol que recibieron tratamiento con los EMAs producidos en autoclave (AC), en

una proporción de mezcla algal 30:70 p/p de E. arborea + G. parvispora

(EAGPAC) con un aumento del 15.5 % en comparación con el control (agua

destilada) y mayor al efecto del NPKelp.

El EMA de S. horridum y G. parvispora (SHGPAC) al 0.12 %, tuvo un efecto

significativamente mayor (p ≤ 0.05) al control, mostrando un aumento en la

longitud del tallo del 12.4 % y le duplico la actividad si se compara con el NPKelp a

la misma concentración (Fig. 10).

61

Figura 10. Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre la longitud del tallo de plantas de frijol mungo a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25 %) en tres proporciones diferentes de mezclas de algas en: a) 30:70 p/p, b) 50:50 p/p y c) 70:30 p/p. EAGPBM= (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPBM= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de extracción en baño María y EAGPAC = Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPAC= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de autoclavado y NPKelp = Producto comercial. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

Además, el EMA de SHGPAC al 0.12 %, tuvo un efecto estadísticamente

significativo (p ≤ 0.05) en la longitud de la raíz en frijol mungo a una concentración

62

de 26.8 y 21.7 % en una proporción de mezcla algal de 50:50 p/p y 70:30 p/p, en

comparación con el control y un 26 % de aumento en comparación con el NPKelp

aplicado al 0.12 % (Fig. 11).

Se observó un aumento en la longitud total del 19.7 y 16.8 % en las plantas

tratadas con el EMA de SHGPAC al 0.12 y 0.25 % y con el EMA de EAGPAC al

0.06 % con una proporción de mezcla algal de 50:50 p/p, comparado con el control

(Fig. 12).

63

Figura 11. Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre la longitud de la raíz de plantas de frijol mungo a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25 %) en tres proporciones diferentes de mezclas de algas en: a) 30:70 p/p, b) 50:50 p/p y c) 70:30 p/p. EAGPBM= (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPBM= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de extración en baño María y EAGPAC = Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPAC= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de autoclavado y NPKelp = Producto comercial. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

64

Figura 12. Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre la longitud total de plantas de frijol mungo a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25 %) en tres proporciones diferentes de mezclas de algas en: a) 30:70 p/p, b) 50:50 p/p y c) 70:30 p/p. EAGPBM= (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPBM= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de extración en baño María y EAGPAC = Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPAC= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de autoclavado y NPKelp = Producto comercial. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

65

Figura 13. Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre el peso fresco de plantas de frijol mungo a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25 %) en tres proporciones diferentes de mezclas de algas en: a) 30:70 p/p, b) 50:50 p/p y c) 70:30 p/p. EAGPBM= (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPBM= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de extración en baño María y EAGPAC = Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPAC= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de autoclavado y NPKelp = Producto comercial. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

66

El peso fresco de frijol mungo aumentó significativamente (p ≤ 0.05) con los EMAs

producidos en baño María, SHGP30:70 y EAGP50:50 al 0.25 y 0.06 %, donde el

aumento fue del 25.2 y 17.5 %, respectivamente, comparado con el control y con

un efecto 7 % mayor al producido por el NPKelp (Fig. 13a-c).

El aumento máximo del peso seco se obtuvo con el EMA obtenido en autoclave de

la mezcla de algas E. arborea y G. parvispora en proporción 30:70 p/p al 0.12 %

con un aumento del 37.2 % sobre el control y una diferencia de 3 veces entre la

mayor actividad del NPKelp (Fig. 14).

Finalmente, los extractos producidos con la mezcla de las algas S. horridum y G.

parvispora en autoclave mostraron un efecto negativo en todos los parámetros de

crecimiento evaluados.

67

Figura 14. Efectos bioestimulante de crecimiento de EMAs sobre el peso seco de plantas de frijol mungo a diferentes concentraciones (0.06, 0.12, 0.25 %) en tres proporciones diferentes de mezclas de algas en: a) 30:70 p/p, b) 50:50 p/p y c) 70:30 p/p. EAGPBM= (Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPBM= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de extración en baño María y EAGPAC = Ecklonia arborea + Gracilaria parvispora) y SHGPAC= (Sargassum horridum + Gracilaria parvispora) por el método de autoclavado y NPKelp = Producto comercial. Las barras representan el error estándar y los asteriscos diferencias significativas.

68

7.5.4 Efecto de los polisacáridos sobre la germinación y el crecimiento de las plántulas de frijol mungo La germinación de las semillas de frijol mungo se produjo en la mayoría de los

tratamientos al día 1. El mejor efecto sobre el porcentaje de germinación (3.5 %)

se observó en las semillas tratadas con todas las concentraciones de fucoidano y

alginato de E. arborea (EA-FUC y EA-ALG) y el agar obtenido de G. parvispora

(GP-AG), los cuales indujeron al 100 % el porcentaje de germinación. Aunque el

alginato y el fucoidano obtenido de S. horridum no mostraron un 100 % de

germinación a todas las concentraciones, mostro su mayor actividad (100 %) al

0.25 y 0.12 % (Fig. 15).

Figura 15. Incremento del porcentaje de germinación (GP) de semillas de frijol mungo tratadas con los polisacáridos (fucoidano (FC), alginato (ALG) obtenidos de las algas Ecklonia arborea (EA), Sargassum horridum (SH) y el agar (AG) de Gracilaria parvispora (GP).

Además, el fucoidano obtenido de E. arborea y S. horridum y el agar de G.

parvispora mostraron un efecto positivo significativamente mayor (p ≤ 0.05) en la

longitud de frijol mungo, comparado con el control agua destilada.

69

Figura 16. Efecto de los polisacáridos fucoidano (FC) y alginato (ALG) obtenidos de Ecklonia arborea (EA) y Sargassum horridum (SH) y el agar (AG) obtenido de Gracilaria parvispora (GP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12 y 0.25 %) en a) longitud del tallo, b) longitud de la raíz, y c) longitud total de la planta del frijol mungo. Las barras representan el error estándar y el asterisco sobre las barras diferencias significativas con respecto al control (línea base de las gráficas).

70

El mayor incremento en la longitud del tallo se obtuvo con el uso del fucoidano

obtenido de S. horridum al 0.25 %, mostró un aumento en la longitud de 12.1 %;

valores similares se obtuvieron con el fucoidano de E. arborea al 0.12 y 0.25 %, el

cual mostró un incremento del 10.5 y 7.4 %, respectivamente (Fig. 16a).

Las plantas de frijol mungo tuvieron su mayor incremento en la longitud de la raíz

con el uso del agar de G. parvispora al 0.25 %, con un incremento del 17.7 %,

respecto al control. Así como con el tratamiento con fucoidano de E. arborea que

tuvo un aumento en del 12.2 % a la misma concentración (Fig. 16b).

El mayor incremento en la longitud total de frijol mungo se presentó con el

fucoidano de E. arborea al 0.25 y 0.12 %, con un incremento del 10.7 y 9.8 %,

respectivamente (Fig. 16c).

El peso fresco de frijol mungo mostró diferencias estadísticamente significativas (p

≤ 0.05) con el control agua destilada. A diferencia del aumento en la longitud de

frijol mungo, los mayores incrementos en el peso fresco fueron obtenidos con el

uso de los alginatos como bioestimulantes.

El alginato de E. arborea al 0.25 y 0.12 % tuvo el mayor incremento sobre el

control, con un aumento del 11.2 y 9.7 %, respectivamente y no mostró diferencias

significativas (p ≤ 0.05) con el peso fresco de frijol mungo tratado con alginato al

0.12 % de S. horridum (Fig. 17a).

Al igual que el aumento de la longitud de frijol mungo, los mayores aumentos del

peso seco se obtuvieron con los fucoidanos y el agar. El mayor incremento se

obtuvo con el uso de los fucoidanos de S. horridum y E. arborea, y el agar de G.

parvispora, a una concentración del 0.25 % con un aumento sobre el control del

23.3, 17.7 y 16.5 %, respectivamente (Fig. 17b).

71

Figura 17. Efecto de los polisacáridos fucoidano (FC) y alginato (ALG) obtenidos de Ecklonia arborea (EA) y Sargassum horridum (SH) y el agar (AG) obtenido de Gracilaria parvispora (GP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12 y 0.25 %) en a) peso fresco, b) peso seco de la planta del frijol mungo. Las barras representan el error estándar y el asterisco sobre las barras diferencias significativas con respecto al control (línea base de las gráficas).

7.5.5 Efecto de los extractos etanólicos sobre la germinación y crecimiento de las plántulas de frijol mungo

Las semillas de frijol mungo tratadas con los extractos etanólicos germinaron al

primer día. El mejor efecto sobre el porcentaje de germinación al día 8 se observó

en las semillas tratadas con todas las concentraciones de EAGP-OH con un

aumento del 3.4 % sobre el control, así como las semillas tratadas con SHGP-OH

al 0.12 y 0.25 % (Fig. 18).

72

Figura 18. Incremento del porcentaje de germinación (PG) de semillas de frijol mungo tratadas con extractos etanólicos (OH) de Ecklonia arborea y Gracilaria parvispora (EAGP) y Sargassum horridum y Gracilaria parvispora (SHGP).

El uso de los extractos etanólicos EAGP-OH y SHGP-OH como bioestimulantes

del crecimiento de frijol mungo no fue positiva, ya que en la longitud de tallo, raíz y

longitud total no mostró diferencias significativas (p ≤ 0.05) superiores al control de

agua destilada a ninguna de las concentraciones probadas (Fig. 19).

73

Figura 19. Efecto de los extractos etanólicos (OH) de Ecklonia arborea y Gracilaria parvispora (EAGP) y Sargassum horridum y Gracilaria parvispora (SHGP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12 y 0.25 %) en la a) longitud del tallo, b) longitud de la raíz, y c) longitud total de la planta del frijol mungo. Las barras representan el error estándar y el asterisco sobre las barras diferencias significativas con respecto al control (línea base de las gráficas).

74

Los extractos etanólicos mostraron actividad bioestimulante en el peso fresco de

frijol mungo, con diferencias estadísticamente significativas (p ≤ 0.05) con el

control agua destilada. El mayor incremento en el peso fresco se obtuvo el

extracto de E. arborea y G. parvispora (EAGP-OH) al 0.06 y 0.12 %, con un

incremento del 11.4 y 11.8 %, respectivamente, esta actividad fue similar a la

obtenida de S. horridum y G. parvispora (SHGP-OH) al 0.25 %, con un incremento

de 11.2 % sobre el control (Fig. 20).

Figura 20. Efecto de los extractos etanólicos (OH) de Ecklonia arborea y Gracilaria parvispora (EAGP) y Sargassum horridum y Gracilaria parvispora (SHGP) a diferentes concentraciones (0.06, 0.12 y 0.25 %) en el a) peso fresco, b) peso seco de la planta del frijol mungo. Las barras representan el error estándar y el asterisco sobre las barras diferencias significativas con respecto al control (línea base de las gráficas).

75

8. DISCUSIÓN

En el presente estudio se evaluó la actividad bioestimulante de crecimiento vegetal

de varias algas con potencial de explotación del Golfo de California y costa

occidental de la Península de Baja California, así como diferentes combinaciones

algales y sus extractos acuoso, extractos etanólicos que contienen compuestos de

bajo peso molecular como fenoles (Kannan et al., 2015; Rengasamy et al., 2015).

Así como, polisacáridos algales de interés comercial (alginatos, fucoidanos y

agar), con diferentes métodos de extracción, con la finalidad de dilucidar el mejor

método de extracción y formulación de bioestimulantes algales.

8.1 Efecto de los ELAS y MELAs en la germinación y el crecimiento de las plántulas de frijol mungo

Casi todos los ELAs aumentaron la germinación y el crecimiento de frijol mungo.

Los mejores efectos bioestimulantes se obtuvieron con los ELAs de E. arborea

(EA), M. pyrifera (MP) y G. parvispora (GP) y el MELAs EAGP. Sin embargo, no

todas las mezclas de extractos (MELAs) probadas, tuvieron un efecto sinérgico en

la actividad de los bioestimulantes. Las mezclas de M. pyrifera y G. robustum

(MPGR), M. pyrifera y G. parvispora (MPGP) y E. arborea y G. robustum (EAGR)

mostraron una menor bioactividad que el control (agua destilada).

Los extractos líquidos de algas marinas se han utilizado desde 1950 como

promotores del crecimiento de las plantas (London y Milton, 1952; Craigie, 2011;

Arthur et al., 2013), ya que contribuyen con nutrientes esenciales como minerales,

aminoácidos, oligosacáridos y fitohormonas a los cultivos (Nabti et al., 2017).

Los fertilizantes se definen como “cualquier materia natural o mineral con al menos

un 5 % de uno o más de los tres nutrientes primarios: N, P, K” (McHugh, 2002).

Los extractos líquidos de algas reportados en este estudio tienen un contenido

inferior al 5 % de estos tres nutrientes primarios y la actividad sobre el crecimiento

de frijol mungo es causada por los extractos diluidos a bajas concentraciones (<2

76

%). Por lo tanto, esta información sugiere que los extractos líquidos algales

analizados en esta investigación actúan como bioestimulantes de crecimiento

vegetal no como fertilizantes.

Si bien, se ha informado de la actividad bioestimulante con el uso de extractos

líquidos algales neutros, ácidos y alcalinos, la extracción alcalina es el método

más utilizado para la producción de extractos bioestimulantes líquidos comerciales

(Briceño-Domínguez et al., 2014). Esto puede deberse a que la extracción líquida

a una temperatura igual o superior a 80 ºC a pH alto, propicia la liberación de los

componentes disponibles en las algas y mejoran la eficiencia de la extracción

(Godlewska et al., 2016). Por este motivo en este trabajo fue utilizada la extracción

alcalina a 80 ºC para la obtención de los extractos analizados en esta

investigación. El propósito del proceso de hidrólisis por medio de la extracción

líquida alcalina es romper las paredes celulares de las algas y de esta forma dejar

disponibles los componentes del tejido algal. Sin embargo, el proceso de

extracción que utilizamos no hidrolizó completamente el alga, ya que, al finalizar la

extracción aún se obtuvo tejido algal residual en el proceso de filtración de los

extractos algales.

Si se compara el porcentaje de ceniza (que es la representación del contenido de

macro y micronutrientes presentes en las algas), con el contenido de macro y

micronutrientes de los extractos obtenidos, podemos observar que el porcentaje

de minerales en los extractos es más bajo que el presente en el tejido algal, esto

indica que el proceso de extracción empleado no extrae todos los componentes

presentes en el tejido algal.

Los productos obtenidos a partir de macroalgas rara vez se estudian en términos

de sus componentes químicos. Los resultados de esta investigación mostraron

que los extractos líquidos individuales y las mezclas de éstos, pueden ser una

fuente de micro y macroelementos benéficos para el cultivo de plantas,

especialmente los extractos de las algas cafés M. pyrifera y E. arborea, así como

77

la mezcla de estos MPEA, siendo uno de los tratamientos más efectivos. Sin

embargo, no todos los extractos mostraron el mismo tipo de efecto, en algunos

casos, como los extractos individuales de S. horridum y A. spicifera, el efecto

retrasó o inhibió la germinación de frijol mungo. La presencia de varios

compuestos bioactivos, como macro y microelementos y carbohidratos en los

extractos y las mezclas, pueden estimular y/o inhibir la germinación de las semillas

de frijol mungo y puede ayudar a explicar estas diferencias.

Por ejemplo, el aumento del porcentaje de germinación en semillas de frijol mungo

tratadas con los extractos a bajas concentraciones puede deberse a la presencia

de sustancias que estimulan el crecimiento, como las fitohormonas, oligosacáridos

y los micronutrientes. Además, se sabe que las concentraciones más altas de los

extractos líquidos de Ulva lactuca pueden inhibir la germinación de frijol mungo

(Castellanos-Barriga et al., 2017) y los extractos líquidos de Sargassum liebmannii

en semillas de tomate (Hernández-Herrera et al., 2014). Algunos extractos líquidos

algales como los obtenidos a partir de Sargassum wightii, Caulerpa scalpelliformis,

Gracilaria corticata, Ulva lactuca y Padina gymnospora puede estimular la

germinación de las semillas (Vinoth et al., 2012a, 2014; Hernández-Herrera et al.,

2014a). Estudios previos de la actividad bioestimulante de otros extractos de algas

mexicanas sobre el porcentaje de germinación de frijol mungo (Vigna radiata) no

han obtenido un aumento mayor al 9 % en la germinación, incluso a bajas

concentraciones (0.5 %; Hernández-Herrera et al., 2014a; Castellanos-Barriga et

al., 2017), esto nos indica que los extractos alcalinos de las algas E. arborea y G.

parvispora estudiados tienen potencial como bioestimulantes de germinación.

En esta investigación se encontró que cuando las mezclas estaban elaboradas

con extractos de dos algas rojas, como, G. robustum y G. parvispora (GRGP) o

con dos SLE de algas pardas, como, M. pyrifera y E. arborea (MPEA), la actividad

de crecimiento de la planta aumenta, en comparación con el efecto de los

extractos individuales.

78

También se encontró que la mezcla producida con el ELA del alga parda E.

arborea y el ELA del alga roja G. parvispora, produjo una actividad bioestimulante

sinérgica del crecimiento en frijol mungo. El tratamiento de la mezcla de estos dos

extractos (EAGP) mostró el efecto más efectivo como bioestimulante a partir de

los parámetros de crecimiento de frijol mungo en comparación con el producto

comercial NPKelp (producido con M. pyrifera y G. robustum). Un resultado similar

fue observado por Mattner et al. (2018) utilizando un extracto alcalino de algas

marinas, producido a partir de dos algas pardas, Durvillaea pottum y Ascophyllum

nodosum. Este extracto se evaluó en el cultivo de fresa, obteniendo un aumento

en la longitud de crecimiento de la raíz del 38 % y los rendimientos de frutos

comercializables en un 8 %.

En contraste, la mayoría de los tratamientos de mezcla de algas (MELAs) que

incluyen un ELA obtenido de algas rojas mezclado con un ELA obtenido de algas

pardas como MPGP, MPGR y EAGR, muestra una disminución de la actividad de

crecimiento vegetal.

Sin embargo, se conoce que el producto comercial NPKelp producido con una

mezcla del alga parda M. pyrifera y el alga roja G. robustum tiene un efecto

bioestimulante en el crecimiento vegetal (Hernández-Herrera et al., 2018). En el

presente estudio, la mezcla experimental de MPGR producida con las mismas

algas (M. pyrifera y G. robustum) tuvo una actividad bioestimulante más baja que

la mostrada con el uso de NPKelp y el control de agua destilada. Probablemente

porque el método de extracción del material de origen es crítico para mantener la

actividad de los componentes mezclados. Diferentes procedimientos de extracción

de la misma matriz algal pueden producir más bioestimulantes con propiedades y

efectividad diferente (Godlewska et al., 2016; Michalak et al., 2015), porque la

composición química de los extractos obtenidos también es diferente. Por ejemplo,

una extracción líquida a temperatura inferior a los 50 ºC no alcanza a extraer

polisacáridos como alginatos en las algas pardas y agar en las rojas, ya que su

79

proceso de extracción es a temperaturas iguales o superiores a 80 ºC,

respectivamente.

Además, la proporción de biomasa de algas rojas y pardas utilizada para la

producción de los productos comerciales y el producto experimental fue diferente.

También hay que tener en cuenta que las plantas pueden exhibir diferentes

umbrales de sensibilidad a una o más moléculas bioactivas (Colla et al., 2015).

La combinación de algas en el proceso de producción de bioestimulantes no es

nueva. Sin embargo, hay pocos informes que muestren el uso de estos en la

producción de bioestimulantes. Los productos bioestimulantes, Liquid Kelp,

producido por Sea Gold, Gofar (Gofar Agro Specialties Co Ltd), Algovert (Setalg),

Ocean (VNET), Rygex (Agripes srl) utilizan el alga parda Ascophyllum nodosum

combinada con otras algas marinas como Possidonius australus, Laminaria sp.,

Sargassum sp., L. digitata, Fucus spp. y Laminaria sp., entre otras, para la

producción de bioestimulantes de algas mezcladas. Otros productos

bioestimulantes obtenido a partir de algas marinas, Fartum, Algreen, Seaweed,

Crop-plus y Sea Magic, solo reportan que los bioestimulantes se producen

utilizando varias especies de algas como biomasa (Sharma et al., 2014), sin

ninguna especificación sobre el proceso de extracción.

Ninguna de las industrias productoras de bioestimulantes muestran el proceso de

obtención de sus extractos, aunque estos sean obtenidos de una sola especie

algal, como es el caso del alga parda A. nodosum la cual es utilizada por muchas

industrias bioestimulantes o a partir de una mezcla de algas (Khan et al., 2009;

Sharma et al., 2014).

Recientemente se estudió el efecto bioestimulante de la combinación de extractos

obtenidos a partir de Sargassum wittii, Caulerpa racemosa y Turbinaria ornata

señalando que la mezcla se realizó obteniendo individualmente cada extracto y

realizando la mezcla en proporción 3:3:4 respectivamente, para obtener una

80

concentración al 10 % y al comparar la actividad de los extractos individuales con

la del extracto combinado se evidenció un mayor efecto bioestimulantes en el

extracto algal combinado en plantas de albahaca morada (Ocimum sanctum;

Uthirapandi et al., 2018), siendo este el único estudio que a la fecha evidencia la

concentración y proceso de obtención de los extractos.

Hay pocos informes que reporten los métodos de extracción empleados para la

producción de bioestimulantes algales y aún un menor número de estudios que

reporten la producción y actividad de bioestimulantes líquidos obtenidos con la

mezcla de algas. Por lo que este estudio contribuye a dilucidar el proceso de

producción y la sinergia de los extractos estudiados como bioestimulantes de

crecimiento vegetal. Por este motivo es importante estudios como este, que

busquen la mejor forma de producción y formulación de extractos bioestimulantes

de crecimiento vegetal.

8.2 Efecto de los EMAs en la germinación y el crecimiento de las plántulas de frijol mungo

La mezcla de algas en la formulación de bioestimulantes de origen algal se puede

realizar de dos formas. La primera es produciendo los extractos líquidos de cada

alga y mezclando los extractos. El segundo método es realizando la extracción de

las algas mezcladas antes del proceso de extracción. Aunque, son pocos los

estudios que describen la forma en la que se realiza el proceso de mezcla al

formular los bioestimulantes, en el presente estudio se evidencia con la finalidad

de conocer las ventajas o desventajas de la extracción simultánea de las algas

empleadas como materia prima para la producción de BCV.

La mezcla de algas en la formulación de bioestimulantes líquidos algales es

empleada actualmente por diversas industrias (Khan et al., 2009; Sharma et al.,

2014; Hernández-Herrera et al., 2018). Sin embargo, las condiciones a las cuales

se realizan las mezclas son desconocidas. Por este motivo en esta sección se

81

evaluaron tres proporciones (30:70, 50:50 y 70:30) de mezcla de alga parda y roja

para tres especies, dos pardas: E. arborea y S. horridum y sus mezclas con la roja

G. parvispora.

El estudio de la mezcla de algas o extractos algales en la formulación de

bioestimulantes líquidos algales, ayuda a conocer el efecto sinérgico que se puede

presentar en los extractos. Otra ventaja es que se incorporarían a la producción de

bioestimulantes otras especies abundantes que produzcan extractos con actividad

similar a los usados actualmente o que al ser combinados con otros extractos

aumenten la bioactividad de este. Además, el uso de la mezcla de extractos

reduce la cantidad de materia prima del alga más explotada para la producción de

bioestimulantes.

La mayor actividad bioestimulante de crecimiento vegetal mostrada por los

extractos líquidos algales producidos en autoclave puede deberse a un mayor

proceso de hidrólisis de los componentes químicos presentes en las algas. Las

características físicas de los extractos como un mejor color, textura del extracto,

uniformidad de este y una menor cantidad de residuo algal en el proceso de

filtración y el mejor efecto bioestimulante sobre el crecimiento de frijol mungo,

confirma que la extracción en autoclave es el mejor método de obtención de

bioestimulantes líquidos algales. Aunque la composición química de macro y

micronutrientes en los extractos obtenidos en baño maría y en autoclave fue muy

similar, el uso de autoclave como proceso de hidrólisis puede dejar disponible

otros compuestos químicos con actividad tipo hormona como oligosacáridos

(Falcón y Cabrera, 2007).

Los resultados obtenidos hasta el momento muestras que la mejor forma de

obtención de extractos algales combinados es la mezcla de estos (MELAs),

siempre y cuando sean obtenidos individualmente (ELAs). Los estudios enfocados

hacia la producción de bioestimulantes de crecimiento vegetal líquidos algales que

se han reportado hasta la fecha, generalmente son producidos mediante la

82

extracción líquida a temperaturas mayores de 80 ºC o usando extracción en baño

María (Vinoth et al., 2012; Briseño-Domínguez et al., 2014).

Otros estudios han reportado actividad bioestimulantes de crecimiento vegetal

para extractos líquidos algales producidos mediante el uso de autoclave. Las

investigaciones realizadas muestran un aumento del crecimiento y desarrollo de

las plantas de tagete, conocida como flor de muertos, tomate y frijol mungo

(Sridhar y Rengasamy, 2010; Hernández-Herrera et al., 2014a, Hernández-

Herrera et al., 2014b; Castellanos-Barriga et al., 2017; Mohanty y Adhikary, 2018)

entre otros.

El género Sargassum es considerado el género con mayor biomasa en el Golfo de

California (Casas et al., 2009; Casas et al., 2016), especialmente el alga

Sargassum horridum (Di Filippo-Herrera et al., 2018), la cual es considerada la

segunda alga con mayor biomasa en la Península de Baja California. Sin

embargo, estas no son explotada actualmente. En el caso de S. horridum, su ciclo

de vida puede facilitar su explotación sostenible, ya que, en su etapa de

senescencia la fronda se desprende de su pie basal.

En la presente investigación se observó que el extracto líquido de S. horridum

inhibió el crecimiento de frijol mungo. Con la finalidad de mejorar el efecto

bioestimulante de este extracto, se obtuvieron extractos mezclando Sargassum

horridum (SH) con el alga roja G. parvispora (GP) obteniendo el EMA de SHGP.

Considerando la composición química mostrada por el extracto de G. parvispora

(GP), el cual tiene un mayor contenido de sales solubles y el menor porcentaje de

materia orgánica. Como resultado se obtuvo que se promovió el efecto sinérgico

de la actividad BCV con la mezcla de estas dos algas (EA y SH) con el alga roja

G. parvispora. La composición química de los extractos de G. parvispora indica

que el uso de autoclave deja a disposición una mayor cantidad de materia

inorgánica, la cual es asimilada más rápidamente por las plantas que en forma

orgánica.

83

Aunque, es conocido el efecto bioestimulante de extractos de otras especies del

género Sargassum obtenidos en autoclave, como el extracto neutro de Sargassum

wightii, que mostró un efecto bioestimulante en la longitud del tallo y la raíz de

Vigna radiata de 9 cm a las concentraciones analizadas (0.5, 1 y 2 %) y tuvo un

aumento sobre el control inferior al 5 % (Kumar et al., 2012). El extracto líquido

obtenido de S. plagiophyllum probado como bioestimulante en cultivos de arroz,

mostró un efecto bioestimulante, evidenciado en el aumento de la longitud de tallo,

raíz y longitud total, que no fue superior al 3, 2 y 4.5 %, respectivamente, sobre el

control (Kavipriya y Thangaraju, 2012).

Algunos extractos líquidos obtenidos en autoclave de especies de algas pardas de

otros géneros como Turbinaria conoides y Padina tetrastromatica también han

sido estudiados en plantas de arroz (Kavipriya y Thangaraju, 2012), sin embargo,

el efecto bioestimulante no supera el efecto bioestimulante de los extractos

obtenidos en el presente estudio con el uso de autoclave, con los EMAs, EAGP y

SHGP, ni el obtenido en baño maría con la mezcla de S. horridum y G. parvispora

al 0.25 %.

Además, solo se tiene el conocimiento de un estudio en él que se reporta la

mezcla de algas previo al proceso de extracción, en ese estudio se usaron las

algas pardas Sargassum pollyphyllum, Turbinaria ornata, Padina tetrastomatica y

las rojas Gelidiopsis sp. y Gracilaria corticata como materia prima, en proporciones

iguales para la producción de un extracto líquido usando autoclave por 1 h (Sarkar

et al., 2018). Por este motivo se consideró de suma importancia incluir en esta

investigación el estudio de la actividad bioestimulante de la mezcla de las algas

pardas E. arborea y S. horridum con la roja G. parvispora, previa al proceso de

extracción y de esta forma poder determinar la diferencia en la actividad

bioestimulante de los extractos preparados con la mezcla de algas. Especialmente

la actividad BCV del extracto preparado con la combinación de S. horridum y G.

parvispora, ya que el primero, preparado individualmente mostró una actividad

84

menor que el control (sin tratamiento, solo agua destilada) sobre las plantas de

frijol mungo.

En esta investigación encontramos que la mezcla del alga parda S. horridum con

la roja G. parvispora incrementa la actividad de crecimiento vegetal comparado

con el efecto del extracto individual de S. horridum. Adicionalmente pudimos

confirmar que la mejor forma de obtener el extracto con mayor efecto

bioestimulante de la mezcla de E. arborea y G. parvispora es realizando

extracciones individuales de estas y realizando la mezcla de estos extractos

(EAGP) después de su extracción, ya que la actividad de los EMAs EAGP en baño

María y EAGP en autoclave, con la extracción simultánea de las algas tuvo una

actividad menor sobre el crecimiento de frijol mungo.

Si bien, no se encuentran evidencias claras del uso de algas del género Gracilaria

como biomasa en la producción de bioestimulantes de crecimiento vegetal

comerciales, el género Gracilaria es el género de algas rojas más estudiado por la

comunidad científica. Se ha reportado actividad bioestimulante de crecimiento

vegetal para extractos de G. corticata (Kamaladhasan y Subramanian, 2007; Pise

y Sabole, 2010; Vinoth et al., 2014), G. edulis (Vinoth et al., 2012), G. gracilis

(Demir et al., 2006), G. salicornia (Lakkakula et al., 2014), Gracilaria sp.

(Pramanick et al., 2013), G. tepocensis (de Abreu et al., 2008) y G. tenuistipiatata

(Hong et al., 2007), lo cual posiciona a este género como una fuente viable de

explotación para las industrias productoras de bioestimulantes.

En general todas las algas analizadas tuvieron efecto bioestimulante de

crecimiento vegetal, ya sea de forma individual o combinada. Esto comprueba el

gran potencial que tiene las macroalgas mexicanas de la Península de Baja

California, ya que estas especies son una fuente natural de compuestos con

efecto bioestimulante. Aunque no todos los extractos individuales analizados

mostraron un efecto bioestimulante positivo sobre el crecimiento vegetal, la

combinación de extractos muestra la actividad sinérgica que estos tienen y lo

85

esencial que es plantear la explotación sostenible del recurso; ya que actualmente

solo hay plan de manejo y se explotan comercialmente el alga parda Macrocystis

pyrifera y el alga roja Gelidium robustum (DOF, 2012)

8.3 Efecto bioestimulante de polisacáridos algales en la germinación y el crecimiento de las plántulas de frijol mungo

Los polisacáridos y sus oligosacáridos son los componentes de las macroalgas

evaluados por primera vez de forma individual como bioestimulantes de

crecimiento vegetal, aunque, algunos trabajos han reportado contenido de

carbohidratos en los extractos acuosos (Abd El-Motty et al., 2010; N. Loyola y

Muñoz, 2011; Abou El-Yazied et al., 2012), en ninguno de estos estudios se

consideró que estos podían promover efecto bioestimulante sobre el crecimiento

de las plantas. Sin embargo, el interés por el estudio del efecto bioestimulante

sobre el crecimiento vegetal de polisacáridos y oligosacáridos de macroalgas ha

ido en aumento, desarrollándose desde hace aproximante 20 años; evidenciando

un aumento en el porcentaje de germinación, longitud y peso de las plantas

(Mzibra et al., 2018).

En este estudio se describe por vez primera la actividad bioestimulante de

crecimiento vegetal de fucoidanos, alginatos y agar, mostrando una mayor

actividad el fucoidano de E. arborea y S. horridum y el agar de G. parvispora sobre

la longitud del brote, raíz y longitud total y peso seco de frijol mungo (Vigna

radiata) que los alginatos de E. arborea y S. horridum. Aunque se ha demostrado

que los oligosacáridos de alginato de sodio (Idrees et al., 2012; Gonzales et al.,

2013) tienen efectos positivos en el crecimiento vegetal. En el presente estudio no

presentaron una actividad significativa sobre el crecimiento de frijol mungo.

Las algas marinas estudiadas mostraron un alto contenido de polisacáridos,

especialmente E. arborea y G. parvispora. Los resultados obtenidos evidencian la

actividad bioestimulante de crecimiento vegetal de los polisacáridos más

86

abundantes de las especies, alginato y fucoidano para las algas pardas y agar

para la roja G. parvispora. Tomando en cuenta estos resultados podemos concluir

que los polisacáridos presentes en los extractos acuosos actúan como

bioestimulantes de germinación y crecimiento de vegetales terrestres como el frijol

mungo.

El efecto bioestimulante en el crecimiento y peso de los vegetales y la mejora de

respuesta al estrés biótico y abiótico ha sido estudiado con polisacáridos algales

específicos como alginatos (Laporte, 2007), fucoidanos (Klarzynski et al., 2003),

laminarán (Fu et al., 2011), carragenanos (Trouvelot et al., 2014) y ulvanos

(Borsato et al., 2010), entre otros. La mayoría de estos estudios se centra en

polisacáridos de algas pardas. El más estudiado es el alginato (Iwasaki y

Matsubara, 2000; Hu et al., 2004; Laporte et al., 2007), seguido del fucoidano

(Klarzynski et al., 2003) y el laminarán (Trouvelot et al., 2008), siendo estos dos

últimos poco estudiados. El polisacárido obtenido a partir de algas rojas más

estudiado son los carragenanos, aunque aún con pocos reportes (Mercier et al.,

2001) y finalmente el ulvano (Borsato et al., 2010), obtenido de algas verdes.

En el presente estudio se reporta y compara el efecto bioestimulantes de cinco

polisacáridos obtenidos a partir de E. arborea (fucoidano y alginato), S. horridum

(fucoidano y alginato) y G. parvispora (agar). Los resultados muestran que todos

los polisacáridos analizados tienen efecto bioestimulante sobre la germinación y

crecimiento de frijol mungo. Sin embargo, los fucoidanos de E. arborea y S.

horridum y el agar de G. parvispora mostraron una mayor actividad sobre la

longitud del tallo, raíz y longitud total y peso seco de frijol mungo (Vigna radiata)

que los alginatos de E. arborea y S. horridum.

Aunque se ha evidenciado la actividad bioestimulante del alginato de sodio

(Iwasaki y Matsubara et al., 2000; Laporte et al., 2007), esta nunca había sido

comparada con el efecto bioestimulante de otros polisacáridos obtenido de la

misma especie algal, como es el caso de los dos fucoidanos evaluados, ni con la

87

bioactividad del agar. Por este motivo es importante conocer qué tipo de

polisacáridos algales tienen mayor actividad bioestimulante, ya que el proceso de

extracción del fucoidano tiene un menor costo que el proceso de producción de los

alginatos. Además, hay estudios previos que reportan la variación estacional tanto

de fucoidan como de alginato de las dos especies estudiadas en el Golfo de

California. S. horridum (Di Filippo-Herrera et al., 2018) y E. arborea (Landa-

Cansigno et al., 2017), siendo esta información indispensable para plantear la

explotación sostenible del recurso, si se deseara utilizar para la extracción de

estos compuestos.

Las investigaciones enfocadas hacia el efecto bioestimulante de crecimiento

vegetal de polisacáridos y oligosacáridos de origen algal pocas veces se han

enfocado hacia su bioactividad como inductor de germinación o crecimiento

vegetal (Xu et al., 2003; Bi et al., 2011). La mayoría de las investigaciones se

centran en la actividad inductora de defensas y resistencia sistémica que estos y

sus oligosacáridos puedan tener (Klarzynski et al., 2000; Laporte et al., 2007;

Paulert et al., 2009). Ejemplo de esto es que hasta el momento la única

información encontrada del efecto bioestimulante del fucoidano se centra en la

inducción de defensas en las plantas, evaluando el efecto del fucoidano obtenido

del alga parda Lessonia vadosa en plantas de tabaco (Chandía y Matsuhiro,

2008).

Los oligosacáridos del alginato de sodio de Lessonia trabeculata y L. vadosa,

mostraron un aumento en longitud y peso de plantas de tabaco (Laporte et al.,

2007) y el alginato obtenido de Lessonia vadosa en plantas de trigo (Chandía et

al., 2004). Aunque hasta el momento ningún estudio conocido ha evaluado el

efecto bioestimulante del agar sobre el crecimiento vegetal, se ha evaluado el

efecto bioestimulante de crecimiento vegetal del k-carragenano obtenido de

Hypnea musciformis en plantas de garbanzo y maíz (Bi et al., 2011). Así como el

k-carragenano de Eucheuma cottonii, i-carragenano de Eucheuma spinosa, l-

88

carragenano de Gigartina acicularis y G. pistillata en plantas de tabaco (Mercier et

al., 2001).

8.4 Efecto bioestimulante de extractos etanólicos en la germinación y el crecimiento de las plántulas de frijol mungo

En la presente investigación, al comparar el efecto bioestimulante de los extractos

acuosos con el de los extractos etanólicos se observó que los primeros son más

bioactivos. Efectos similares han sido reportados sobre plantas de lechuga con el

uso de extractos de Gracilaria caudata y G. domingensis, en este reporte se

comparó la actividad bioestimulante de extractos de hexano, diclorometano,

metanol y agua ultra pura; siendo los extractos acuosos los que mostraron un

mayor efecto bioestimulante sobre la longitud de la raíz e hipocótilo de las

plántulas de lechuga, atribuyendo la mayor actividad de los extractos acuosos al

contenido del polisacárido agarosa (Torres et al., 2018). Se han reportado

resultados similares a los obtenidos en este estudio para extractos metanólicos y

etanólicos de C. costata (Chaikina et al., 2009).

Contradictoriamente, el extracto etanólico del alga verde Ulva fasciata si mostró

actividad bioestimulante sobre la germinación y el crecimiento del frijol común

(Phaseolus vulgaris), sin embargo, el polisacárido ulvano tuvo una mayor actividad

(Paulert et al., 2009). Concordando con la actividad mostrada por los polisacáridos

fucoidano y agar en comparación a la de los extractos etanólicos en el presente

estudio.

El uso de solventes orgánicos como el etanol, metanol, acetona y acetato de etilo

para la obtención de extracto bioestimulantes de crecimiento vegetal ha sido poco

estudiado. Sin embargo, se ha reportado el efecto BCV del extracto etanólico del

alga parda Costaria costata en plantas de Soja (Chaikina et al., 2009).

89

Los extractos etanólicos evaluados en el presente estudio tuvieron un aumento en

la longitud de la raíz y el peso fresco de frijol mungo, especialmente la mezcla de

E. arborea y G. parvispora similar al efecto reportado para florotaninos,

floroglucinol y ecklol del alga Ecklonia máxima en plantas de frijol mungo (Kannan

et al., 2014) y maíz (Kannan et al., 2015).

Todos los extractos líquidos, individuales, combinados y polisacáridos, obtenidos

con diferentes tipos de extracción (baño María y autoclave) y formas de mezcla

(mezcla de extractos y mezclas de algas previa al proceso de extracción), tuvieron

actividad bioestimulante de crecimiento vegetal. Este es un resultado esperado ya

que la extracción acuosa implica un proceso de hidrólisis, en menor o mayor

medida y es este proceso el que convierte la materia orgánica (biomasa algal) en

materia inorgánica (minerales) disponible para la absorción por los vegetales,

facilita la extracción de compuestos con actividad tipo hormona como

polisacáridos-oligosacáridos, aminoácidos y deja disponibles las fitohormonas.

90

9. CONCLUSIONES

Las algas marinas de la Península de Baja California son una fuente natural de

bioestimulantes de crecimiento vegetal, especialmente el alga parda E. arborea y

la roja G. parvispora. Sin embargo, aunque los extractos líquidos de estas

especies tuvieron actividad bioestimulante, los polisacáridos fucoidano y agar,

promovieron de mejor forma la germinación de frijol mungo y produjeron una

reducción del tiempo de germinación al día primero.

Además de las especies actualmente explotadas en México: M. pyrifera y G.

robustum, como materia prima en la producción de bioestimulantes, este trabajo

reporta actividad bioestimulante de tres especies más: Sargassum horridum,

Ecklonia arborea y Gracilaria parvispora que pueden ser consideradas como

materia prima para las industrias, con miras a generar bioestimulantes con una

actividad mayor como la que reporta este estudio.

La mezcla de extractos produjo un efecto sinérgico que aumenta la actividad

bioestimulante a niveles mayores que cuando se analizaron individualmente. El

extracto con el mayor efecto bioestimulante fue la mezcla de E. arborea y G.

parvispora (EAGP) en una proporción 50:50 v/v de mezcla de los extractos,

aplicada a una concentración de 0.25 y 0.5 %.

La combinación producida con el tejido algal previa al proceso de extracción del

alga parda S. horridum con el alga roja G. parvispora SHGP, tuvo un mayor efecto

bioestimulante que el mostrado por el extracto individual del ELA de S. horridum.

La aplicación de mezclas líquidas de algas marinas como bioestimulantes de

crecimiento y germinación de semillas usando el método de imbibición es una

opción prometedora para la agricultura sostenible, con el objetivo de reducir el uso

de fertilizantes minerales y pesticidas.

91

La composición química de los extractos sugiere una nueva formulación de

bioestimulantes orgánicos algales, teniendo en cuenta un alto contenido de sólidos

totales, carbohidratos y boro. Esta formulación debe estar basada en las

propiedades multifuncionales de los extractos obtenidos individualmente.

El uso de autoclave como método de extracción produce los extractos con mayor

bioactividad, siendo el EMA de SHGP el que produce el mayor aumento el

crecimiento de frijol mungo a una concentración de 0.12 %. Estos resultados

muestran que el uso de la extracción alcalina a pH de 10 con autoclave como

método de producción de bioestimulantes líquidos algales es la mejor opción para

obtener extractos que promuevan el crecimiento vegetal.

En conclusión, esta investigación muestra que los polisacáridos algales,

especialmente los fucoidanos extraídos de E. arborea y S. horridum y el agar de

G. parvispora pueden ser utilizados como bioestimulantes de crecimiento vegetal,

en contraste con la baja actividad de los alginatos.

92

10. RECOMENDACIONES

Se recomienda realizar una comparación entre los métodos de extracción líquidos

a diferentes pH. Así como, evaluar la actividad bioestimulante de otros

polisacáridos algales como ulvanos de especies locales como Ulva lactuca.

Además, es importante evaluar la actividad de los extractos en cultivos locales, en

miras de realizar la formulación de un bioestimulante comercial.

93

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