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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E
BIOLOGIA EVOLUTIVA – GCBEv
AVALIAÇÃO DO SEMISSINTÉTICO ISODILAPIOL NA EXPRESSÃO DE GENES
DE RESISTÊNCIA A INSETICIDAS EM MOSQUITOS AEDES (STEGOMYIA)
AEGYPTI
VALDIRLEY DE SOUZA LIMA
Manaus, Amazonas
março, 2015
i
VALDIRLEY DE SOUZA LIMA
AVALIAÇÃO DO SEMISSINTÉTICO ISODILAPIOL NA EXPRESSÃO DE GENES
DE RESISTÊNCIA A INSETICIDAS EM MOSQUITOS AEDES (STEGOMYIA)
AEGYPTI
ORIENTADORA: Dra. Míriam Silva Rafael
Co-Orientador: Dr. Cleverson Carlos Matiolli
Manaus, Amazonas
março, 2015
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva (PPG-GCBEv) do INPA, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre em
Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
ii
Ficha catalográfica
L732 Lima, Valdirley de Souza
Avaliação do semissintético isodilapiol na expressão de genes de resistência a
inseticidas em mosquitos Aedes (Stegomyia) aegypti / Valdirley de Souza Lima. ---
Manaus: [s.n.], 2015. viii, 40 f.: il. color.
Dissertação (mestrado) --- INPA, Manaus, 2015.
Orientadora: Míriam Silva Rafael
Co-orientador: Cleverson Carlos Matiolli
Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
1. Expressão Gênica. 2. Isodilapiol. 3. Aedes aegypti.
CDD 595.77
Sinopse:
Aedes aegypti é o principal vetor da dengue, e apresenta resistência a inseticidas
químicos. Os genes GSTE7 e P450-12 estão relacionados com resistência a compostos
xenobióticos, como os inseticidas sintéticos. Larvas de 3° estádios de Aedes aegypti
foram expostas a quatro concentrações (20, 40, 60 e 80µg/mL) do composto Isodilapiol,
por quatro horas. Observaram-se mortalidade de larvas com os tratamentos a 60 e 80
µg/mL. O nível de expressão elevados dos genes GSTE7 e P450-12 ocorreram nas
gerações (G4, G5, G6 e G7). O gene P450-12 expressou-se diferencialmente nas duas
concentrações quando comparado ao GSTE7, o que indica que o composto Isodilapiol
pode ter desencadeado estresse oxidativo e mortalidade de larvas de estádio L3 de Aedes
aegypti, revelando-se um composto de potencial efeito no controle de A. aegypti, vetor
da dengue.
Palavras-Chave: Expressão Gênica, Isodilapiol, Aedes aegypti.
iii
Dedico
A toda minha família, em especial
minha mãe Eunice de Souza Lima.
Por me acompanhar em todo meu
ciclo educacional.
iv
AGRADECIMENTO
A Deus por ter proporcionado saúde, sabedoria e conforto nos momentos mais difíceis
do mestrado.
A meus pais por acompanhar-me na minha trajetória educacional no decorre da minha
vida, meus irmãos, em especial Valdenize de Souza Lima que lutou incansavelmente para
conseguir meu decreto de liberação para cursar o mestrado.
Ao Governo do Estado do Amapá (GEA), Decreto N°7613 e à Universidade Federal
do Amapá (UNIFAP), pela Portaria N°1890/2013, que oficializou o meu deslocamento até a
cidade de Manaus para cursar o mestrado.
Ao Ministério de Ciências e Tecnologia e Inovação, por meio do Instituto Nacional de
Pesquisa da Amazônia (INPA), pelo suporte estrutural para o desenvolvimento desse trabalho.
À CAPES, CNPq e FAPEAM, pela concessão da bolsa e apoio financeiro, o qual não
essa pesquisa não poderia ser desenvolvida.
Ao Curso de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
(GCBEV/INPA), pela oportunidade de crescimento intelectual e profissional.
À Dra. Míriam Silva Rafael pela orientação recebida, aprendizado técnico adquirido e
momentos de amizades vivenciados.
À Dra. Gislene Almeida Carvalho-Zilse, por disponibilizar seu laboratório (GPA) para
quantificar o RNA total.
À Dra. Vera Val, por ter concedido gentilmente seu laboratório para as corridas das
placas de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). E à Nayara Castro, por me ajudar na
manipulação do equipamento de PCR em tempo real e na montagem das placas.
v
RESUMO
O A. aegypti é o principal vetor da dengue e outras arboviroses no mundo. As medidas de
controle vetorial são por meio de inseticidas sintéticos, que causam resistência a esse
mosquito. O composto Dilapiol, encontrado em óleos essenciais da planta Piper aduncum da
família Piperaceae, tem sido eficaz como bioinseticida contra A. aegypti. Neste estudo, o
semissintético Isodilapiol, derivado do Dilapiol, foi avaliado quanto ao seu potencial de
indução de expressão diferencial de genes de resistência a inseticida (GSTE7 e P450-12) em
larvas de 3º estádio de A. aegypti. As formas imaturas foram coletadas no bairro Cidade Nova
(3° 1’ 21,36’’S e 59º 58’ 5,32’’O), Manaus, AM, e encaminhadas ao Laboratório de Malária e
dengue/INPA. Os imaturos completaram o seu desenvolvimento, e os adultos após
cruzamento deram origem a três gerações consecutivas (G1, G2 e G3), a fim de minimizar as
variantes ambientais. Os ensaios toxicológicos com o Isodilapiol tiveram início a partir de G4
(4ª geração). As larvas de 3º estádios de A. aegypti foram expostas a quatro concentrações
(20, 40, 60 e 80 µg/mL) de Isodilapiol, durante 4 horas. As larvas foram congeladas em N2
líquido e armazenadas em freezer 80°C negativos. Esses tratamentos foram repetidos para
formar as gerações seguintes: G5, G6 e G7. A extração e purificação do RNA total foram
realizadas com o Kit de extração da Quiagen®, e a fita complementar de RNAm (cDNA),
com o kit da Promega®. Os primers dos genes GSTE7 e P450-12 foram desenhados com
software “Gene Runer” e Primer3. O método de qRT-PCR foi utilizado segundo o protocolo
SYBR Green® Master Mix (Applied Biosystems®), adaptado para A. aegypti, e as
amplificações ocorreram no termociclador ABI-7500™ Real-Time PCR System, Applied
Biosystems®. Observaram-se a expressão diferencial dos genes GSTE7 e P450-12 em quatro
concentrações (20, 40, 60 e 80 µg/mL) nas gerações G4, G5, G6 e G7. Porém, os picos de
expressão foram maiores na concentração 20 µg/mL, e houve picos de expressão gênica em
G4, G5, G6 e G7. O gene P450-12 expressou-se diferencialmente quando comparado ao
GSTE-7. Logo, o gene P450-12 pode ter causado estresse oxidativo em larvas de 3º estádio de
A. aegypti revelando-se um composto de potencial efeito no controle de A. aegypti, vetor da
dengue.
Palavras-chave: Expressão Gênica, Isodilapiol, Aedes aegypti
vi
ABSTRACT
A. aegypti is the main vector of dengue and other arboviruses in the world. The vector control
measures use synthetic insecticides, which cause resistance in this mosquito. The compound
Dilapiolle, found in essential oils of the plant Piper aduncum of the Piperaceae family, has
been effective as a biopesticide against A. aegypti. In this study, Isodilapiol, derived from the
semisynthetic Dilapiolle was evaluated for its potential to induce differential expression of
pesticide resistance genes (GSTE7 and P450-12) in the 3rd stage larvae of A. aegypti. The
immature forms were collected in the Cidade Nova neighborhood (3 ° 1 '21.36 "S and 59 58'
5,32''O), Manaus, AM, and sent to the Laboratory of Malaria and Dengue / INPA. The
immature ones completed their development and the adults, after the cross, gave rise to three
successive generations (G1, G2, G3) in order to minimize the environmental variations. The
toxicological tests with 2KL-15 started from G4 (4th generation). 3rd stage larvae of A.
aegypti were exposed to four concentrations (20, 40, 60 and 80 µg / ml) of 2KL-15 for 4
hours. The larvae were frozen in liquid N2 and stored in a freezer at -80°C. These treatments
were repeated to form the next generations: G5, G6 and G7. The extraction and purification of
total RNA was performed with the Quiagen® extraction kit, and the complementary strand of
mRNA (cDNA) with the kit Promega®. The primers of GSTE7 and P450-12 genes were
designed with software "Gene Runner" and Primer3. The qRT-PCR method was performed
according to the protocol SYBR Green® Master Mix (Applied Biosystems®) adapted for A.
aegypti, and amplifications occurred in the thermal cycler ABI-7500™ Real-Time PCR
System, Applied Biosystems®. We observed a differential expression of GSTE7 and P450-12
genes in four concentrations (20, 40, 60 and 80 µg / mL) in generation G4, G5, G6 and G7.
However, the major peaks was observed at a concentration of 20 µg / ml, and the gene
expression peaks were seen in G4, G5, G6 and G7. The P450-12 gene was differentially
expressed when compared to GSTE7. The P450-12 gene might cause oxidative stress in the
3rd
larval stage of Ae. aegypti revealing a compound potential effect on the control of A.
aegypti, the dengue vector.
vii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1
1.1 Aspectos gerais do Aedes aegypti ............................................................................. 1
1.2 Aedes aegypti e sua importância epidemiológica ........................................................ 2
1.3 Inseticidas químicos ..................................................................................................... 3
1.4 Bioinseticidas ............................................................................................................... 5
1.5 Expressão de genes de resistência a inseticidas ........................................................... 6
1.6 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) ...................................... 7
2 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 9
2.1 Objetivo geral .............................................................................................................. 9
2.2 Objetivos específicos ................................................................................................... 9
3. MATERIAL E MÉTODO .............................................................................................. 10
3.1 Local de coleta e desenvolvimento do A. aegypti ...................................................... 10
3.2 Ensaio toxicológico com larvas de A. aegypti ........................................................... 11
3.3 Extração de RNA total ............................................................................................... 12
3.4 Síntese da fita de cDNA ............................................................................................. 13
3.5 Desenho e síntese dos primers. .................................................................................. 13
3.6 Reação em cadeia da polimerase clássico .................................................................. 14
3.7 Reação em cadeia da polimerase quantitativo qPCR ................................................. 15
3.8 Quantificação relativa dos genes ............................................................................... 15
3.9 Análise estatística ...................................................................................................... 15
4. RESULTADOS ................................................................................................................ 16
4.1 Ensaio toxicológico com 2KL-15 .............................................................................. 16
4.2 Extração e tratamento com DNAse do RNAt ............................................................ 16
4.3 Síntese de cDNA de Ae. aegypti ................................................................................ 18
4.4 Teste de eficiência dos primers para o qRT-PCR ...................................................... 19
4.5 qRT-PCR em tempo real e quantificação relativa ..................................................... 21
4.6 Análise estatística ...................................................................................................... 24
5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 26
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 30
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 31
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados para qRT-PCR com seus respectivos tamanhos de
amplicons e identificação de acesso dos gene aos bancos de dados Vector Base. ................... 14
Tabela 2. Reagentes da PCR clássica para o gradiente de temperatura dos primers citocromo
P450-12, Glutationa-S-transferase (GSTE7) e Ribossomal S7. ............................................... 14
Tabela 3. A viabilidade (sobrevivência) com 20 e 40 µg/mL foi considerada para as larvas de
3º estádio que atingiram a fase adulta. Da fase adulta prosseguiram-se os bioensaios nas
gerações seguintes (G5, G6 e G7). Na inviabilidade (mortalidade) com 60µg/mL e 80 µg/mL
consideram-se as larvas submetidas a esses tratamentos por 4 horas ou após o tempo de 24
horas. ........................................................................................................................................ 16
Tabela 4. Perfil das amostras quantificadas em NanoDrop após a extração de RNAt,
utilizando método de coluna. Observam-se RNA com boa qualidade para prosseguir com os
experimentos. ............................................................................................................................ 17
Tabela 5. Valores de Cts dos genes P450-12 e RS-7, ∆Ct das amostras de A. aegypti tratadas
e controle. Na última coluna à esquerda os valores de RQ calculados a partir de 2-∆∆Ct. ..... 21
Tabela 6. Valores da média (M), desvio padrão (D.P) e erro padrão (E.P) dos RQs para
concentações, gerações e genes (GSTE7 e P450-12). Analisados pelo programa Statistic 12.24
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição global de A. aegypti (Khormi e Kumar, 2014). ..................................... 1
Figura 2. Fases do desenvolvimento de A. aegypti: a) ovos; b) larva; c) pupa; d) adultos
(Munstermann, 1995; Melo-Santos, 2000; Russell, 2000;Vieira, 2008). ................................... 2
Figura 3. Isodilapiol (2KL-15). ................................................................................................. 6
Figura 4. Área de coletas de A. Aegypti, Manaus-AM (Fonte: Google imagem). .................. 10
Figura 5. Bioensaio com Isodilapiol (2kL-15) e seus respectivos tratamentos: 20,40,60 e
80µg/mL, os copos contendo 200 larvas, onde 20 larvas de cada copo foram congeladas em
N2 líquido e armazenadas em 80°C negativo, o restante seguiu para as gerações seguintes. .. 12
Figura 6. RNAt em gel desnaturante com agarose a 1% corados com gel Red identificando as
amostra de N°50 a N°64. O RNAt com suas subunidades 28S e 18S próximas, de coloração
fraca (28S) e coloração forte (18S) em repetidas corridas desse sistema eletroforético. ......... 17
Figura 7. a) RNAt não tratado com DNAse em gel de agarose a 1%; a seta superior indica
possível contaminação com DNA genômico e a inferior indica o RNAt (nos 1 e 2). b) PCR do
RNAt tratado com DNAse (ao centro) e não tratado com DNAse (à esquerda), mostrando que
houve amplificação das amostras não tratadas com DNAse (no 1 e 2). ................................... 18
Figura 8. Eletroforese em gel de agarose a 1% mostrando a síntese do cDNA de A. aegypti
sem contaminações (amostras 34 a 44). ................................................................................... 18
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose a 1% do produto da PCR de cDNA dos genes
GSTE7, P450-12e RS7. O gradiente de temperatura, validou os primers para amplificar o
cDNA entre 59° a 60°C em PCR em tempo real, um pré-requisito do termociclador Life
Technologie Applied Biosystems. O tamanho do amplicon ficou entre os valores esperados,
mostrado pelas setas vermelha superior (200pb) e inferior (75pb).Erro! Indicador não
definido.
Figura 10. a) curva de Melting, com apenas um pico, mostrando que o primer do gene RS-7
foi validado, apesar de apresentar alguns ruídos. b) curva padrão do gene RS-7, com 8 pontos
de diluição (1:2), valores de Slope: 3,20, R2=0,988 e eficiência estimada em 106,5%. ......... 19
Figura 11. a) curva de Melting com apenas um pico, mostrando que o primer do gene P450-
12 foi validado. b) curva padrão do gene P450-12, com 5 pontos de diluição (1:2), valores de
Slope: -3,37, R2= 0,998 e eficiência estimada em 97,78%. ..................................................... 20
Figura 12. A: curva de Melting com apenas um pico, mostrando que o primer do gene GSTE-
7 foi validado. B: curva padrão do gene GSTE-7, com 5 pontos de diluição (1:2), valores de
Slope: -3,32, R2= 0,970 e eficiência 100,05%. ........................................................................ 20
x
Figura 13. Quantificação relativa do gene GSTE7, de larvas de 3° estádio de A. aegypti
tratadas com 20 µg/mL de 2 KL-15 (Isodilapiol). O grafico representa os níveis de RQ das 4
gerações. ................................................................................................................................... 22
Figura 14. Quantificação relativa do gene GSTE7, de larvas de 3°estádio de A. aegypti
tratadas com 40 µg/mL de 2 KL-15 (Isodilapiol), O gráfico representa os níveis de RQ nas 4
gerações. ................................................................................................................................... 22
Figura 15. Gráfico comparativo dos níveis de expressão do gene GSTE7 em larvas de A.
aegypti com dois tratamentos: 20 e 40 µg/mL 2KL-15 (Isodilapiol). RQ das quatro gerações.
.................................................................................................................................................. 23
Figura 16. Quantificação relativa do gene P450-12 de larvas de 3° estádio de A. aegypti
tratadas com 20 µg/mL 2KL-15 (Isodilapiol) em quatro gerações. ......................................... 24
Figura 17. Quantificação relativa do gene P450-12 de larvas de 3°estádio de A. aegypti,
tratadas com 40 µg/mL 2KL-15 (Isodilapiol) em 4 gerações. .................................................. 24
Figura 18. ANOVA fatorial relacionando os níveis de expressão (RQ) dos genes GSTE7 e
P450 das gerações (G4, G5, G6 e G7), p= 0,02039. Amostras tratadas com 20 µg/mL 2KL-15.
.................................................................................................................................................. 25
Figura 19. ANOVA fatorial relacionando os tratamentos 20 (a) e 40 µg/mL (b) com o
Isodilapiol, nas gerações (G4, G5, G6 e G7) e os genes GSTE7 e P450-12, p=0,0192.
.................................................................................................................................................. 26
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos gerais do Aedes aegypti
O Aedes aegypti (aedes, do grego, odioso e aegypti, do latim, do Egito) é oriundo do
Velho Mundo, provavelmente da Etiópia. Foi introduzido ao Novo Mundo durante o século
XV ao XIX, por meio de intenso tráfego marítimo. Na Ásia, a introdução deste vetor ocorreu
devido ao desenvolvimento da indústria e da navegação (MacDonald, 1956; Smith, 1956;
Forattini, 2002). Está distribuído nas regiões Tropicais e Subtropicais entre os paralelos de 45º
de latitude Norte e 40º de latitude Sul, sendo raramente encontrada além destes limites
(Forattini, 2002) (Figura 1).
Figura 1. Distribuição global do mosquito Aedes aegypti (Khormi e Kumar, 2014).
Aedes aegypti pertence à família Culicidae, subfamília Culicinae, gênero Aedes e
subgênero Stegomyia. Morfologicamente, a forma adulta apresenta escamas de cor escura,
com faixas brancas nas bases dos segmentos tarsais e um desenho em forma de lira no
mesonoto (Figura 1). O macho se distingue da fêmea por possuir antenas plumosas e palpos
mais longos (Forattini, 2002).
O ciclo de vida de A. aegypti apresenta duas fases distintas, uma aquática (ovo, larva e
pupa) e a outra terrestre (adulto). Após o acasalamento, as fêmeas alimentam-se de sangue
mais de uma vez entre duas oviposições sucessivas, aumentando a probabilidade deste vetor
transmitir o vírus dengue (Barata et al., 2001; Forattini, 2002), sendo o sangue indispensável à
maturação dos ovos (Figura 2a). O intervalo entre a alimentação sanguínea e a oviposição
varia de dois a três dias. Os ovos são depositados pela fêmea, individualmente, nas paredes
2
internas de coleções de água. Medem, aproximadamente, 1mm de comprimento, de contorno
alongado e fusiforme. As larvas são compostas de cabeça, tórax e abdômen. O abdômen é
dividido em oito segmentos (Figura 2b). Estas passam por quatro fases, podendo durar de
quatro a oito dias até alcançar o estágio de pupas (Figura 2c), cujo corpo é dividido em
cefalotórax e abdômen, também bastante móveis, com atividade respiratória e tempo de
desenvolvimento de aproximadamente dois dias. Da pupa, emerge a forma adulta (Figura 2d),
e o macho se alimenta de carboidratos presente em néctar de flores (Consoli e Oliveira, 1994;
Forattini, 2002; Service, 2004).
Figura 2. Fases do desenvolvimento de Aedes aegypti: a) ovos; b) larva; c) pupa; d) adultos (Munstermann,
1995; Melo-Santos, 2000; Russell, 2000;Vieira, 2008).
1.2 Aedes aegypti e sua importância epidemiológica
Segundo a Organização Mundial da Saúde, arbovírus são vírus mantidos na natureza por
meio da transmissão biológica por artrópodes hematófagos entre hospedeiros vertebrados
suscetíveis. As espécies do gênero Aedes podem transmitir mais de 20 tipos de arboviroses
humanas, dentre elas a dengue, a febre amarela, e as encefalites: Rocio, Japonesa e Saint
Louis (Eldridge e Edman, 2000; Monath, 1988). Pelo menos cinco espécies de Aedes podem
estar relacionadas com a transmissão do vírus da dengue: Aedes aegypti, Aedes albopictus
Skuse 1894, Aedes polynesiensis Marks 1954, Aedes pseudoscutellaris Theobald (1910) e
Aedes horrescens Edwards 1935 (Raju, 2003). O A. aegypti é o principal vetor da dengue e da
febre amarela em áreas urbanizadas, sendo o. A. albopictus considerado um vetor secundário
(Tauil, 2001; Huber et al., 2002).
A dengue é a mais importante doença causada por arbovírus que infectam os seres
humanos, causando alta taxa de mortalidade em diferentes regiões no mundo (Figueiredo et
al., 2004). É uma doença febril aguda, causada por um vírus do gênero Flavivirus, com
antigenicidade para quatro sorotipos virais: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. O ciclo
3
de transmissão da dengue inicia-se, quando o mosquito pica um ser humano infectado com o
vírus, no período chamado de viremia. A incubação do vírus no mosquito dura de oito a 11
dias (Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1994; Service, 2004; FIOCRUZ, 2005).
A dengue pode apresentar duas formas clínicas: a febre clássica do dengue (FD ou
DC) e a febre hemorrágica do dengue (FHD), o que representa um problema de alta
relevância para a saúde pública em áreas tropicais e subtropicais do mundo. A FHD apresenta
características complexas e não muito claras, sendo provavelmente relacionadas à cepa do
vírus, à densidade, ao comportamento e à competência do mosquito vetor, ao estado
imunitário e genético do paciente, à concomitância com outras doenças e à infecção prévia
por outro sorotipo viral da doença. A FD não possui imunidade cruzada, embora possa haver
uma imunidade cruzada transitória, de curta duração (Tauil, 2001; Huber et al., 2002).
Estima-se que entre 2,5 a 3,6 bilhões de pessoas, mais de 50% da população mundial,
estão sob ameaça de infecções pelo vírus da dengue. Mais de 50 milhões de pessoas são
infectadas no mundo, e dois milhões podem evoluir para os estágios mais graves como a FHD
e 21 mil resultam em mortes, anualmente (Ferreira, 2012).
No Brasil, segundo o SINAN (Sistema de Informação de Agravos de Notificação,
2014) foram notificados 587.815 casos de dengue, e destes 405 foram a óbitos. Na região
Norte foram notificados 48.632 casos de dengue, sendo que o Estado do Acre obteve maior
números de casos com 28.873, e o Estado do Amazonas registrou 6.418 casos. O número de
óbitos em 2014 foi de 405 casos o que representou uma redução no país de 39,6% em
comparação com o mesmo período de 2013, quando foram confirmados 674 óbitos.
A utilização de inseticidas químicos, para o controle de espécies do gênero Aedes e de
outros mosquitos, tem sido auxiliado na prevenção da dengue e outras arboviroses (Tauil,
2001; Donalísio e Glasser, 2002). Apesar da aplicação de inseticidas sintéticos diminuírem a
incidência dos casos de dengue, tal iniciativa não é eficiente para o controle de Ae. aegypti,
além de desencadear resistência de alguns vetores a vários compostos químicos. .
1.3 Inseticidas químicos
Os inseticidas são substâncias de origem sintética ou natural utilizadas para eliminar
insetos em diferentes fases do seu ciclo de vida, ou seja, quaisquer agentes químicos ou
biológicos utilizados para impedir, destruir, repelir ou mitigar qualquer praga (Ritter, 1997).
Os inseticidas químicos foram aperfeiçoados durante a Segunda Guerra Mundial, para
controlar insetos transmissores de doenças como malária, piolhos, dentre outras enfermidades.
4
Foram desenvolvidos entre eles o DDT (dicloro fenil tricloroetano), os carbamatos e os
piretróides. O uso indiscriminado desses inseticidas químicos nas ações de controle de
mosquitos e outros insetos tem causado tolerância nesses artrópodes Luna et al., 2004; Braga
et al., 2007).
O DDT, no ano de 1946, foi um inseticida de excelência em substituição a outros
compostos utilizados na época (Beaty e Marquardt, 1996), para o controle de mosqutios. No
ano seguinte foi identificada resistência de Aedes tritaeniorhynchus e Aedes solicitans a este
composto (Brown, 1986).
Os organoclorados foram os primeiros praguicidas sintéticos e dominaram o mercado
durante de 1940 até 1960, com amplo uso agrícola e domiciliar. São moléculas de
hidrocarbonetos (aldrin, endrin, hexacloro benzeno (BHC), DDT, ensossulfan, heptacloro,
lindane, toxafeno), que além de cloro algumas delas possuem oxigênio em sua estrutura. São
derivados do clorobenzeno, ciclohexano ou do ciclodieno. O mecanismo de ação inseticida
dos grupos do clorobenzeno, que inclui o DDT, e do hexaclorociclohexano não foi totalmente
elucidado. Sabe-se que esses compostos atuam por ingestão e/ou contato, interferindo nos
canais de sódio regulado por voltagem, alterando o equilíbrio sódio e potássio, impedindo a
transmissão nervosa normal, provocando paralisia no inseto seguida de morte, fenômeno
conhecido por “knockdown” (Holan, 1969; Coats, 1990).
Os carbamatos disponíveis no mercado desde 1950 (Casida e Quistad,1998) são
praguicidas orgânicos derivados do ácido carbâmico, que possuem pequeno espectro de
atividade inseticida. Apresentam três classes: carbamatos inseticidas (e nematicidas),
carbamatos herbicidas e carbamatos fungicidas. Os mais conhecidos são carbaril-metomil,
carbofuran, metiocarb, primicarb, indoxacarb, alanicarb e furatiocarb (Sucen, 2001). Os
carbamatos, assim também os organofosforados são inibidores de enzimas como as
acetilcolinesterases (Beaty e Marquardt, 1996; Sucen, 2001). Estas atuam sobre os
neurotransmissores via acetilcolinas, que se não forem degradados por essas enzimas acabam
acumulando-se nas fendas sinápticas, provocando a não interrupção dos impulsos nervosos,
que se manterão constantes causando a morte do inseto, também, por paralisia.
Os organofosforados foram desenvolvidos em 1940, e apresentam grandes variáveis
desde os mais tóxicos até os menos tóxicos (Chavasse e Yap, 1997). Estes são compostos que
apresentam várias combinações de carbono, hidrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre e
nitrogênio, que formam grupos como amida, ésteres derivados do tiol de ácido fosfórico.
Atuam no sistema nervoso do inseto, provocando hiperatividade nervosa e dessensibilização
5
do receptor de acetilcolina, que cessa o impulso nervoso levando o inseto a morte (Eldefrawi,
1976; Eldefrawi et al., 1982; SUCEN, 2001).
1.4 Bioinseticidas
Extratos de plantas têm sido bastante estudados no controle de vetores na última
década devido, principalmente, ao seu menor impacto à saúde humana e ao meio ambiente
(Roel, 2001). Exemplificam-se o extrato saponinas, da planta Balanites aegyptiaca, como
larvicida e óleos essenciais de Dilapiol e seus derivados, de Piper aduncum com ação
adultocida em A. aegypti, respectivamente, ambos de grande eficácia no controle desse vetor
(Chapagain et al.,2008; Pinto et al., 2012).
Piper aduncum é uma planta aromática pertencente à família Piperaceae encontrada na
região amazônica, com alto teor de óleo essencial (2,5 a 4%), rico em dilapiol. O dilapiol é
um éter fenílico que vem sendo testado com êxito como fungicida, moluscicida, acaricida,
bactericida e larvicida com a vantagem de ser um produto biodegradável (Silva, 2004).
Estudos realizados por Aciole et al. (2013), utilizando óleo essencial de dilapiol,
demonstraram que esse composto tem ação de toxicidade em células somáticas de Drosophila
melanogaster.
O dilapiol tem sido eficaz no controle de mosquitos, como em Aedes atropalpus
(Belzile et al., 2000). A utilização de derivados semi-sintéticos do dilapiol, com atividade
adultocida em A. aegypti mostraram excelentes resultados (Pinto, 2008). Santos et al. (2011)
testaram semi-sintéticos de outros derivados de óleos essenciais, os monoterpenos, e
observaram melhoria na ação de alguns compostos quanto a sua atividade larvicida contra A.
aegypti. Rafael et al. (2008) estudou o dilapiol, em A. aegypti, e mostrou que esse composto
tem ação citotóxica, causando danos cromossômicos e formação de micronúcleo, além de ser
tóxico para larvas e pupas desse mosquito. Domingos (2012) estudou o efeito dos
semissintéticos derivados do dilapiol, o éter etil dilapiol (1KL39-B) e o éter n-butil dilapiol
(1KL43-C) em A. aegypti. Os resultados mostraram efeitos tóxicos e genotóxicos
acumulativos em quatro gerações consecutivas (G1, G2,G3 e G4) de A. agypti, causando
mortalidade de 100% em altas concentrações destes produtos. Anomalias nucleares como
brotamento e micronúcleo em larvas e fêmeas adultas também foram observadas em
concentrações menores.
Considerando o A. Albopictus, a toxicidade e genotoxicidade dos compostos 1KL-B e
1 KL-C foram observadas em duas gerações (F1 e F2) desse mosquito, de Manaus, AM
6
(Meirelles, 2013). Essa autora mostrou os efeitos tóxicos e genotóxicos dessas substâncias,
que provocaram alto índice de mortalidade e danos a nível cromossômico nas larvas e adultos.
Figura 3. Isodilapiol.
1.5 Expressão de genes de resistência a inseticidas
O termo “resistência” é definido como o desenvolvimento da capacidade de certos
organismos em tolerar diferentes doses de agentes tóxicos, que seriam letais para a maioria da
população da mesma espécie (Organização Mundial de Saúde, 1981). Os insetos produzem
várias enzimas com a função de degradar, solubilizar e metabolizar compostos xenobiótico
(Braga; Valle, 2007a; Hemingway, 2000; Hemingway et al., 2004; Russell et al., 2011). Essas
enzimas podem sofrer modificações estruturais em suas moléculas, aumentando sua
habilidade de detoxificar diversos inseticidas.
Inúmeros genes de detoxificação, obtidos a partir de diversos sequenciamentos e
anotação de genomas completos de mosquitos, evidenciaram genes envolvidos em processos
metabólicos, por exemplo, em constante evolução, com apenas poucos genes ortólogos entre
espécies de mosquitos (Ranson et al, 2002; Strode et al., 2008). A rápida expansão e
diversificação de genes de detoxificação provavelmente facilitaram a adaptação de diversas
espécies de mosquitos a seus respectivos nichos, e dentro de uma escala de tempo mais
recente, possibilitaram sua sobrevivência a vários agentes xenobióticos, incluindo os
inseticidas (Strode et al., 2008).
A enzima glutationa-s-transferase (GST) está associada à detoxificação, participando
no metabolismo de DDTs, organofosforados e piretróides. Em mosquitos, ela atua catalisando
a conjugação da glutationa ao centro hidrofílico de compostos tóxicos, aumentando a
solubilidade e auxiliando a excreção de tais xenobióticos (Lumjuan et al., 2007).
As GSTs apresentam superfamílias de genes que podem ser divididas em três grupos:
GSTs citosólicas, microssomais e mitocondriais (Robinson et al. 2004; Sheehan et al., 2001).
7
Em mosquitos são encontradas apenas as GSTs citosólicas e microssomais. Seis classes de
GSTs citosólicas foram identificadas em insetos: Delta, Epsilon, Omega, Sigma, Teta e Zeta
(Ranson et al., 2001). As classes Delta e Epsilon, encontradas apenas em artrópodes, são as
mais abundantes dentre as GSTs citosólicas em An. gambiae, D. melanogaster e Ae. aegypti e
estão implicadas na detoxificação de compostos inseticidas (Ranson et al., 2002a; Strode et
al., 2008). Naice (2010) submeteu o Anopheles darlingi adulto, vetor da malária, a diferentes
concentrações do inseticida sintético Deltametrina. Os resultados mostraram a expressão
diferencial do gene GST em relação ao gene constitutivo GAPDH, cujo nível de expressão
gênica diferencial pode estar associado à resistência desse mosquito à Deltametrina.
Outra enzima que participa do processo de resistência a inseticidas em insetos é o
Citocromo P450, também conhecida como monooxigenase, que faz parte de uma família
complexa de enzimas encontradas desde bactérias até mamíferos. São responsáveis pelo
metabolismo oxidativo de vários compostos endógenos e exógenos (Scott e Wen, 2001).
Estudos relatam, que o citocromo P450 é fortemente associada com a resistência aos
piretróides em populações de A. aegypti (Bariami et al., 2012). Os diferentes padrões de
expressão das monooxigenases, explica as diversas formas de substratos dessa enzima, o que
mostra um aumento da atividade enzimática do citocromo P450, quando submetido a
compostos como: organoclorados, organofosforados e piretróides (Hemingway et al., 2004).
Um gene conservado conhecido como RS-7 (gene Ribossomal S7) 40S tem sido
bastante utilizado como gene de controle interno para normalizar a Reações em Cadeia da
Polimerase quantitativo com transcriptase reversa (qRT-PCR). O gene RS-7 codifica uma
proteína ribossomal encontrada na subunidade 40S dos ribossomos dos eucariotos (Nene et
al., 2007). Estudos realizados por González et al., 2010, com A. aegypti, investigaram genes
de resistência a organoclorados, demonstraram que o gene GST apresentou altos padrões de
expressão gênica, utilizado o gene RS-7 como controle interno, validado pelo método da qRT-
PCR.
Várias pesquisas com genes de resistência a inseticidas, para detectar seus mecanismos
de expressão, por meio dos métodos de microarranjos e qRT-PCR, tal como o trabalho
Bariami et al. (2012), demonstraram os padrões de expressão e suas formas alternativas dos
genes citocromo P450-12 e GSTs.
1.6 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR)
8
O desenvolvimento da biologia molecular, no século XX, possibilitou avanços em
inúmeras pesquisas, como a descoberta do método de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR), por Kary Banks Mullis em 1983. É uma ferramenta útil para a realização de
sequenciamentos de genomas, expressão de genes em sistemas recombinantes, diagnóstico de
doenças infecciosas, dentre outros. Avanços no método da PCR resultaram no método da
PCR em Tempo Real. Diferencia-se do método da PCR convencional por gerar resultados
quantitativos, permitindo o acompanhamento da reação e a apresentação dos dados de forma
mais precisa e rápida, fato esse não evidenciado na PCR clássica, que apresenta resultados
apenas qualitativos (Novais e Alves, 2004).
O método da PCR em Tempo Real permite que seja adicionado ao mix da reação um
composto fluorescente (Sybr Green) que, durante o procedimento de ciclagem, se intercala na
fita dupla do DNA, e o mesmo é detectado pelo equipamento, permitindo o acompanhamento
da cinética de amplificação de um determinado produto de PCR. Ao ser adicionado na reação,
o Sybr Green se liga, imediatamente, a todos os DNAs fita-dupla presentes na amostra.
Assim, à proporção que a Taq polimerase amplifica a sequência-alvo, criando os produtos de
PCR, o Sybr Green se liga a cada nova cópia amplificada. Ao final da reação, a intensidade da
fluorescência será proporcional à quantidade de produto de PCR produzida. O nível de
fluorescência computado para cada amostra é aquele suficiente para atingir um ciclo limiar,
por convenção esse limiar é denominado de Ct (Cycle Treshold).
A importância da utilização da qRT-PCR em estudos da expressão de genes resistentes
a inseticida, deve-se ao fato do método validar a atividade desses genes quando submetidos a
estresse químicos. Rodriguez et al. (2012), utilizando os métodos de microarray e qRT-PCR,
demonstraram que cinco genes (GSTs) de resistência a permetrina foram expressos em
populações de Ae. aegypti. Em An. gambiae e Anopheles funestus . Wondjia et al. (2012),
utilizando análise quantitativa de qRT-PCR identificaram variantes do gene P450
relacionados com resistência a piretróides.
No presente estudo, o método da qRT-PCR foi utilizado, para avaliar a expressão dos
genes de resistência a inseticidas: GSTE7, Citocromo P450-12 e RS-7 em Ae. aegypti
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) frente ao semissintético isodilapiol (Figura 3).
9
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Estudar o nível de expressão diferencial dos genes de resistência a inseticidas GSTE7,
Citocromo P450-12 em larvas de 3° estádio de A. aegypti.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar o nível de expressão dos genes de resistência a inseticidas GSTE7 e Citocromo
P450-12 em A. aegypti, a partir de diferentes concentrações do semissintético do
isodilapiol , tendo o RS-7 como gene de controle interno.
Comparar os níveis de expressão dos genes GSTE7 e P450-12 em quatro gerações de
A. aegypti submetidas a bioensaios com o Isodilapiol.
10
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1 Local de coleta e desenvolvimento do Ae. aegypti
As amostras de A. aegypti foram coletadas em estágios imaturos (larvas e pupas) no
bairro Cidade Nova 3º1’21,36” S e 59º58’5,32” O, Manaus, AM.
Figura 4. Área de coletas de Ae. Aegypti, Manaus-AM (Fonte: Google imagem).
Após a coleta das formas imaturas de Ae aegypti, estas foram transportadas ao
Laboratório de Malária de Dengue/INPA, onde foram identificadas conforme a chave
dicotômica de Consoli & Lourenço-de-Oliveira. No insetário, após serem colocadas em
bandejas plásticas contendo 400 mL de água potável, as larvas foram alimentadas com ração
granulada (Tetra Cichlid) comercial para peixe, onde atingiram o estágio pupal. As pupas
foram transferidas para copos plásticos contendo água potável e cobertas com tela de nylon
(filó). Os mosquitos adultos que emergiram foram transferidos para gaiolas contendo copos
plásticos preenchidos com água em 1/3 de seu volume e revestidos internamente com papel
filtro, para deposição dos ovos pelas fêmeas.
Quando as larvas atingiram o estágio de pupas, estas foram separadas em recipientes
apenas com água e cobertos com tela. Os mosquitos adultos que emergiram foram
transferidos para copos plásticos preenchidos com água em 1/3 de seu volume com telas
revestidas internamente com papel filtro, para deposição dos ovos pelas fêmeas. A
alimentação dos mosquitos (adultos) machos foi realizada com solução açucarada e as fêmeas,
com sangue de hamster (Mesocricetus aureatus),
11
Os mosquitos foram mantidos em gaiolas no insetário à temperatura de 26-27º C. Os
resultados dos cruzamentos geraram ovos férteis depositados no papel filtro, que foram
armazenados em caixa de isopor. Posteriormente foram utilizados no ensaio toxicológico com
Isodilapiol.
3.2 Ensaio toxicológico com larvas de A. aegypti
Anteriormente ao ensaio toxicológico as formas imaturas coletadas foram criadas por
três gerações (G1, G2 e G3), com objetivo de se obter linhagens livres de interferências
ambientais. O bioensaio com Isodilapiol foi padronizado por Domingos (2012) com larvas de
A. aegypti de 3° estádio. No presente estudo, foram colocados para eclosão 3600 ovos de A.
aegypti em bandejas plásticas, contendo 600 mL de água potável. Após a eclosão dos ovos,
800 larvas de 3° estádio foram divididas em copos descartáveis com água nas seguintes
concentrações: 20 μg/mL, 40 μg/mL, 60 μg/mL e 80 μg/mL de Isodilapiol diluídos em DMSO
0,05%. As larvas controle (n=200) foram adicionadas em copos contendo água potável e
DMSO. O tempo de exposição das larvas para cada concentração, foi de 4 horas. Após a
exposição, foram selecionadas 80 larvas de cada copo (n=20 amostras biológicas e n=20 três
réplicas, respectivamente). Posteriormente, as larvas foram congeladas em nitrogênio líquido
e armazenadas a 80°C negativos, para extração de RNA total. Esse procedimento foi repetido
por quatro gerações (G4, G5, G6 e G7). As larvas remanescentes da geração G4 foram
mantidas em bandejas, contendo água potável e alimento (Tetra Cichlid), até a fase de pupa e
emersão do adulto, quando foram observadas as proporções de sobrevivência. Esses adultos
foram utilizados para as gerações G5, G6 e G7. Na geração G5, os mosquitos adultos (fêmeas
e machos) foram distribuídos em gaiolas, para cruzamentos, afim de prosseguir com o
bioensaio de G5, em seguida as gerações G6 e G7 (Figura 5).
12
3600 ovos A. aegypti 3 geração
Concentração 20µg/mLConcentração 40µg/mL Concentração 60µg/mL Concentração 80µg/mL
Controle20 Controle40 Controle60Controle80
200larvas L3 p/copo200larvas L3 p/copo 200larvas L3 p/copo
200larvas L3 p/copo
Congelamento em N2
20 larvas p/microtubo
Ensaio com Isodilapiol
Congelamento em N2
20 larvas p/microtuboCongelamento em N2
20 larvas p/microtubo
Congelamento em N2
20 larvas p/microtubo
Pupa
Adulto
Figura 5. Bioensaio com Isodilapiol e seus respectivos tratamentos: 20,40,60 e 80µg/mL, os copos contendo 200
larvas, onde 20 larvas de cada copo foram congeladas em N2 líquido e armazenadas em 80°C negativo, o restante
seguiu para as gerações seguintes.
3.3 Extração de RNA total
Larvas de 3º estádios de A. aegypti em triplicata, uma biológica (n=20) e duas réplicas
técnicas (n=20, cada) foram congeladas em nitrogênio líquido e utilizadas para extração do
RNA total – RNAt (método da Quiagen® adaptado para A. Aegypti). As larvas foram
maceradas em 450 μl de tampão RLT dentro de tubos de 2 mL em um isopor com nitrogênio
líquido. As amostras foram submetidas ao agitador magnético.
O lisado foi transferido a uma coluna spin QIAshredder em um microtubo de 2 mL e
centrifugado por 2 minutos na velocidade máxima. O sobrenadante foi transferido
cuidadosamente para novo microtubo. Foram adicionados 0,5 volume de etanol (96-100%)
para o lisado, e misturando imediatamente por pipetagem. A amostra foi transferida para uma
coluna de spin RNeasy, colocado em um tubo de coleta de 2 ml. O material foi centrifugado
por 15s a (≥10.000 rpm).
Foram adicionados 700 μl de tampão RW1 à coluna spin RNeasy, que foram
centrifugados por 15s a (≥10.000 rpm) e descartado o material escoado. Essa lavagem foi
repetida na mesma coluna, colocando-se 500 μL tampão RPE, que foi colocada em um novo
tubo de coleta de 1,5 mL. Foram acrescentados a ela 40 μL de água livre de DNA diretamente
à membrana dessa coluna, que foi centrifugada por 1 minuto (≥10.000 rpm). O microtubo
13
contendo o RNA total foi estocado em menos 80°C. O RNA total foi quantificado em
aparelho NanoDrop, que rendeu 30 μg de RNAt de cada extração, aproximadamente.
Em seguida, foi feito um gel desnaturante com agarose a 1% , em tampão MOPS 1X,
por eletroforese horizontal a 100V, por 40 minutos. Os acessórios da cuba em contato com gel
e tampão foram previamente tratados com peróxido de Hidrogênio (10%), por 20 minutos, e
lavados com água Mili-Q DEPC (Dietilpirocarbonato), por 3 vezes. Em seguida, após o
tratamento do RNAt com DNAse foi realizada a PCR convencional do RNA total tratado com
DNAse e do RNA total não tratado, para confirmar a ausência de contaminação (DNA) na
amostra do RNAt tratado, para prosseguir com a síntese do cDNA.
3.4 Síntese da fita de cDNA
No procedimento para a síntese da fita complementar de RNAm (cDNA) foi utilizado
o kit Promega, segundo as instruções do fabricante. Em um microtubo de 0,5mL foram
adicionados 12µLe RNA total (5µg) e 1,5µL de oligo dT, posteriormente foi submetido ao
vórtex e spin a 10.000 rpm a 4°C. Em seguida as amostras foram incubadas em banho Maria a
70°C durante 10 minutos. Mix: em um outro microtubo de 1,5mL foram adicionados 3µL de
tampão 5x, 3 µL de MgCl2, 1,25 de dNTP, 1,25 de RNAse OUT, 1uL de Transcriptase reversa
e 2uL de água DEPC, totalizando um volume de 11,5uL por amostra. Foi adicionado 11,5 do
mix em cada microtubo contendo RNA somando um volume final de 25µL, em seguida as
amostras foram incubadas a 42 °C durante 40 minutos e a 65 °C por 15 minutos. Após o
período de incubação as amostras foram estocadas em 20°C negativo.
3.5 Desenho e síntese dos primers.
As sequências dos genes de interesse (citocromo P450, Glutationa-S-transferase e
Ribossomal S7) foram obtidas em bancos de dados (http://www.ncbi.nlm.nih.gov e
https://www.vectorbase.org). Os primers foram desenhados utilizando software Gene Runner
e Primer3. Os parâmetros utilizados foram Tm de 58-60°C; GC% de 60, com ausência de
hairpin e dímeros. A Tm foi calculada segundo a fórmula: Tm=4x(G+C)+2x(A+T). Em
seguida procurou-se regiões que apresentavam conteúdo de GC e AT (1:1). A síntese dos
primers foi realizada pela Integrated DNA Technologies com sequências, conforme a Tabela
1.
14
Tabela 1. Sequências dos oligos utilizados para qRT-PCR com seus respectivos tamanhos de amplicons e
identificação de acesso dos gene aos bancos de dados Vector Base.
Primers Nome do
Gene ID Vector Base Amplicon Referência
Fw 5'-CGACAGCCATGCCATTCTCGTC-3' GSTE7 AAEL007948 92pb Lima (2014)
Rv 5'-TGATGCGAGCTTGGATGACGG-3'
Fw 5'-ACCGACGTGATTGGCACCTGTG-3' P450-12
(CYP6N12) AAEL009124 123pb Lima (2014)
Rv 5'-TGCCTTCAGGAACCGCCCATTG-3'
Fw 5'-TCAGTGTACAAGAAGCTGACCGGA-3' RS-7 AAEL009496 118pb Telang et al
2010
Rv 5'-TTCCGCGCGCGCTCACTTATTAGATT-3'
3.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Os primers sintetizados foram amplificados, primeiramente, pelo método da PCR
convencional, para validação. Cada reação foi composta pelos reagentes: Tampão 10x,
MgSO4, dNTP 10mM, cDNA, água Mili-Q e Platinum Taq. Cada par de primer foi diluído a
10μM e otimizado para um gradiente de concentração específico, visando ter melhores
eficiências nas reações. Os primers dos genes GSTE7 e RS-7 ficaram numa concentração de
2,5μM, em contrapartida, o gene P450-12 teve sua concentração otimizada em 1μM.
Posteriormente adicionou-se ao microtubo, cujo valor total da reação para cada amostra foi de
20μL (Tabela 2).
Tabela 2. Reagentes da PCR clássica para o gradiente de temperatura dos primers citocromo P450-12,
Glutationa-S-transferase (GSTE7) e Ribossomal S7.
Reagentes Quantidade
Buffer 10x 2µL
MgSO4 1µL
dNTP 10mM 1µL
Primer Fw 2,5uM 1µL
Primer Rv 2,5uM 1µL
cDNA 0,5µL
H2O Mili-Q 13,35µL
Platinum Taq 0,15µL
V. total 20µL
15
3.7 Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qRT-
PCR)
A qRT-PCR foi realizada, de acordo com protocolo Fast SYBR Green® Master Mix
(Applied Biosystems®), adaptado para A. aegypti. Foram utilizados três mixs, sendo um mix
para cada primer: Em um microtubo de 1,5mL foi adicionado 5µL de Master Mix SYBR
Green, 2µL água Milli-Q e 1 µL de primer Forward, 1µL de primer Reverse e 1µL de
amostra de cDNA, totalizado um volume final 10 µL para cada amostra. Em seguida foram
utilizados 10 μL da amostra em cada well da placa de PCR. Posteriormente, essa placa foi
submetida ao equipamento Real-Time PCR System™ 7.500 da Applied Biosystems®. Sendo 4
replicas biológicas e 3 replicas técnicas (n=12).
A amplificação gênica ocorreu mediante os seguintes parâmetros: um ciclo inicial de
95 °C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos e 60 ºC por 60
segundos.
Antes das corridas do cDNA por qRT-PCR foi realizado o teste de eficiência dos
primers. Utilizaram-se curva padrão de diluição seriada (1:2) do cDNA, com oito fatores de
diluição, onde foi estabelecida uma eficiência de 100% das reações, com valores aceitáveis
de 90% a 110%.
3.8 Quantificação relativa dos genes
Após o PCR em tempo real, foram obtidos os Cts (Threshold cycle), dos genes
GSTE7, P450-21 e RS-7, a partir dos quais foram realizados os cálculos do ∆∆Ct de cada
amostra: ∆Ct = Ct (gene alvo) – Ct (gene controle interno). Após estabelecer o ∆Ct da
amostra (tratada e calibradora), utilizaram-se esse valor para calcular o ∆∆Ct: ∆∆Ct = ∆Ct
(amostra tratada) - ∆Ct (amostra calibradora) e, posteriormente, utilizaram-se a fórmula: 2-∆∆Ct
para calcular o RQ (Quantificação Relativa). Assim, obtiveram-se os valores dos níveis de
expressão relativa de cada gene alvo GSTE7 e P450-12 (Pfaffl, 2001).
3.9 Análise estatística
Os Resultados foram analisados sob a forma de média, desvio padrão e erro padrão. A
significância de diferenças nos níveis de expressão gênica foi analisada estatisticamente por
16
meio da ANOVA Fatorial a x b x c, utilizando-se o sistema Statistica 12 versão 12.0. O nível
de significância assumido foi p<0,05 em todos os testes (Zar, 1984).
4. RESULTADOS
4.1 Ensaio toxicológico com Isodilapiol
O composto Isodilapiol foi utilizado o nas concentrações (20, 40, 60 e 80µg/mL) na
geração 1 e de 20 e 40µg/mL nas gerações seguintes (G2, G3 e G4) de Ae. aegypti, durante 4
horas. Em G1, os tratamentos (60µg/mL e 80µg/mL) causaram a mortalidade de todos os
indivíduos e, por isso, foram descartados. Nos bioensaios seguintes (G2,G3 e G4) foram
utilizados apenas os tratamentos de 20 e 40µg/mL (Tabela 3), para o estudo do nível de
expressão dos genes GSTE7 e P450-12 e de seu controle interno (RS-7).
Tabela 3. A viabilidade (sobrevivência) de larvas de 3º estádio que atingiram a fase adulta foi considerada com
o isodilapiol a 20 e 40 µg/mL. Da fase adulta prosseguiram-se os bioensaios nas gerações seguintes (G5, G6 e
G7). Na inviabilidade (mortalidade) com 60µg/mL e 80 µg/mL foram consideradas as larvas submetidas a esses
tratamentos por 4 horas ou após o tempo de 24 horas.
Gerações Concentrações
20µg/mL 40µg/mL 60µg/mL 80µg/mL
G4 Viável Viável Inviável Inviável
G5 Viável Viável Inviável Inviável
G6 Viável Viável Inviável Inviável
G7 Viável Viável Inviável Inviável
4.2 Extração e tratamento do RNA total com DNAse
O RNA total de A. aegypti (n=64 amostras) foi extraído, a partir de 16 exemplares de
cada geração G4, G5, G6 e G7 (4 x tratamento 20 µg/mL, 4 x controle 20 µg/mL, 4 x
tratamento 40 µg/mL e 4 x controle 40 µg/mL, respectivamente), pelo método de coluna
(Mini kit RNeasy® Plant). O RNAt, foi quantificado em NanoDrop, onde foram considerados
os valores aceitáveis de absorbância (260/280, 1,9 a 2,1). A tabela 4 exemplifica o perfil das
amostras.
17
Tabela 4. Perfil das amostras quantificadas em NanoDrop após a extração de RNAt, utilizando método de
coluna. Observam-se RNA com boa qualidade para prosseguir com os experimentos.
Amostras
(Ae.aegypti)
Concentração
(ng/µL) Volume (µL)
Absorbância
260/280
Absorbâcia
260/230
51 435,4 40 2,05 1,79
52 375,2 40 2,10 2,04
53 309,4 40 2,06 1,64
54 393,3 40 2,08 0,39
55 576,7 40 2,11 1,34
56 576,0 40 2,06 1,84
A eletroforese de A. aegypti em gel desnaturante mostrou um RNAt íntegro ( bandas
28S e 18S), conforme a Figura 6.
Figura 6. RNAt em gel desnaturante com agarose a 1% corados com gel Red identificando as amostra de N°50 a
N°62. O RNAt com suas subunidades 28S e 18S próximas, de coloração fraca (28S) e coloração forte (18S) em
repetidas corridas desse sistema eletroforético.
No tratamento do RNAt com DNAse as amostras de RNAt íntegro (Tabela 4 e Figura
6) foram submetidas ao tratamento com DNAse, para eliminar possíveis contaminações de
DNA genômico. Posteriormente, utilizaram-se o RNAt tratado com DNAse a fim de fazer a
PCR clássica, para verificar possíveis amplificações entre RNA tratado e não tratado com
DNAse (Figura 7).
18
Figura 7. a) RNAt sem tratamento com DNAse em gel de agarose a 1%; a seta superior indica possível
contaminação com DNA genômico e a inferior indica o RNAt (nº 1 e 2). b) PCR do RNAt tratado com DNAse
(ao centro), c) e não tratado com DNAse, mostrando que houve amplificação das amostras não tratadas com
DNAse (nº 1 e 2).
4.3 Síntese de cDNA de A. aegypti
O RNAt após tratamento com DNAse foi utilizado para a obtenção da síntese de
cDNA com a enzima transcriptase reversa, mostrando rastro característico de cDNA sem
contaminantes (Figura 8).
Figura 8. Eletroforese em gel de agarose a 1% mostrando a síntese do cDNA de A. aegypti sem contaminações
(indivíduos 34 a 44).
19
4.4 Teste de eficiência dos primers para o qRT-PCR
A especificidade dos primers obtidos (200 a 75pb) dos genes alvo GSTE7
(AAEL007948) P450-12 (AAEL009124) e interno RS-7 (AAEL009496) foram testadas
inicialmente, por PCR clássico, e verificada a especificidade de amplificação na temperatura
de Tm: 60°C (Figura 9).
Após os testes de amplificação pela PCR clássica, os primers foram avaliados com
relação a sua eficiência, por meio de uma curva-padrão. Os pontos de diluição do cDNA (1:2)
variaram de 5 a 8, resultando em um gráfico de regressão linear. Obtiveram-se eficiências
significativas para os três pares de primers. Os valores de R2, o aparelho de PCR em tempo
real modelo ViiA 7 Dx by Life Technologies Applied Biosystems.
Figura 9. a) curva de Melting, com um pico, mostrando que o primer do gene RS-7 foi validado, apesar de
apresentar alguns ruídos. b) curva padrão do gene RS-7, com 8 pontos de diluição (1:2), valores de Slope: 3,20,
R2=0,988 e eficiência estimada em 106,5%.
20
Figura 10. a) curva de Melting com um pico, mostrando que o primer do gene P450-12 foi validado. b) curva
padrão do gene P450-12, com 5 pontos de diluição (1:2), valores de Slope: -3,37, R2= 0,998 e eficiência
estimada em 97,78%.
Figura 11. a: curva de Melting com um pico, mostrando que o primer do gene GSTE7 foi validado. b: curva
padrão do gene GSTE7, com 5 pontos de diluição (1:2), valores de Slope: -3,32, R2= 0,970 e eficiência
100,05%.
Os cálculos dos valores da eficiência dos primers foram realizados com a fórmula:
E=10 (-1/slope) – R2, onde R2 indica a proximidades entre os pontos de diluição que
equivalem ao Ct (Threshold cycle). O valor R2 varia entre 0 e 1, e quanto mais próximo de 1,
maior é o ajuste do modelo. Os valores de slope correspondem à inclinação da reta que é
representado pela incógnita “a” na equação da reta y = ax + b. Dessa forma, todos os valores
da eficiência dos primers foram considerados aceitáveis, pois estão dentro da margem de erro
21
10% com variação (90% a 110%), considerada ótima para as reações em PCR em tempo real
e testes de quantificação relativa.
4.5 qRT-PCR em tempo real e quantificação relativa
A Tabela 5, mostra indivíduos de A. aegypti tratados com Isodilapiol (20 µg/mL e 40
µg/mL), e o controle submetidas à reação de qPCR no termociclador Real time modelo 7500
System SDS Software – Applied Biosystms®. Valores correspondentes aos Cts dos genes alvo
(GSTE-7 e P450-12) e do controle interno (RS-7). A quantificação relativa foi realizada pelo
método ∆∆Ct. Os valores dos Cts dos genes GSTE7 e P450-12 correspondentes a dois
tratamentos com Isodilapiol (20 µg/mL e 40 µg/mL) com quatro gerações de A. aegypti,
foram agrupados de acordo com cada geração e seu respectivo tratamento (n=12 indivíduos)
para cada tratamento/geração. Calculou-se a média aritmética de cada geração correspondente
a cada tratamento. Sendo assim, estimaram-se os níveis de expressão gênica (RQ) dos genes
(GSTE7 e P450-12) em larvas de 3° estádio de A. aegypti.
Tabela 5. Valores de Cts dos genes P450-12 e RS-7, ∆Ct das amostras de A. aegypti tratadas e controle. Na
ultima coluna à esquerda os valores de RQ calculados, a partir de 2-∆∆Ct
Gerações
Tratamento
ug/mL
Gene Ct-P450e
GSTE-7 Ct RS7
∆Ct- P450-12 e
GSTE-7
∆Ct-
∆∆Ct
RQ-
P450-12 alvo Controle
4 20 P450-12 22.4621 15,592 68,701 8,848 19,779 39,392
5 20 P450-12 21.8109 15,554 62,569 8,107 18,501 36,053
4 40 P450-12 20.2009 12,486 77,149 7,296 0,4189 0,7480
5 40 P450-12 19.9954 12,748 72,474 7,926 0,6786 16,006
4 20 GSTE-7 21,730 14594 6,1380 5466 6,7200 0,6276
5 20 GSTE-7 23369 14016 4,5940 7251 -2,6570 6,3070
4 40 GSTE-7 21327 12486 8,8410 6621 2,2200 0,2146
5 40 GSTE-7 21642 13256 8,3860 6571 1,8150 0,2842
As Figuras 13 e 14, demonstram variações nos níveis de expressão do gene GSTE7, no
decorrer dos tratamentos nas gerações. No tratamento do isodilapiol com 20 µg/mL,
observam-se pico elevado de expressão em G2 e uma baixa expressão em G3. No tratamento
com 40 µg/mL de isodilapiol, identificam-se um alto pico de expressão do gene GSTE7 em
G1, e baixo pico em G2, entretanto, ocorreu um aumento gradual dos níveis de expressão, a
partir de G2 até G4. A Figura 15 mostra a comparação entre os tratamentos (20 e 40 µg/mL
Isodilapiol) e, observam-se que na concentracão baixa (20 µg/mL) os índices de expressão da
22
GSTE7 são elevados, com exceção de G3, onde podem-se verificar pico mais elevado no
tratamento 40 µg/mL.
Figura 12. Quantificação relativa do gene GSTE7, de larvas de 3° estádio de A. aegypti tratadas com 20 µg/mL
de (Isodilapiol). O gráfico representa os níveis de RQ das quatro gerações.
Figura 13. Quantificação relativa do gene GSTE7 nas quatro gerações (G4,G5,G6,G7), de larvas de 3°estádio de
A. aegypti tratadas com 40 µg/mL de (Isodilapiol), O gráfico representa os níveis de RQ nas quatro gerações.
23
Figura 14. Gráfico comparativo dos níveis de expressão do gene GSTE7 em larvas de A. aegypti com dois
tratamentos: 20 e 40µg/mL (Isodilapiol). RQ das quatro gerações.
As Figuras 16 e 17 mostram os níveis de expressão do gene P450-12 nos tratamentos,
20 e 40 µg/mL, respectivamente. Na Figura 16 o tratamento com 20 µg/mL Isodilapiol a
expressão da P450 tem crescimento gradual da 4ª a 6ª geração, porém durante a 7ª geração
ocorre queda extrema dos valores de RQ. No tratamento com 40 µg/mL 2KL-15 (Figura 16),
ocorreram variações com altas e baixas nos picos de expressão do gene P450-12. A 7ª geração
do tramento com 40 µg/mL Isodilapiol mostrou elevado pico de expressão, fato esse, não
verificado com o tratamento 20 µg/mL.
24
Figura 15. Quantificação relativa do gene P450-12 de larvas de 3° estádio de A. aegypti tratadas com 20 µg/mL
Isodilapiol em quatro gerações.
Figura 16. Quantificação relativa do gene P450-12 de larvas de 3°estádio de A. aegypti, tratadas com 40 µg/mL
Isodilapiol em quatro gerações.
4.6 Análise estatística
Os níveis de expressão dos genes GSTE7 e P450-12 foram analizados no software
Statistica 12 versão 12.0, com teste de média, desvio padrão e erro padrão. Utilizou-se a
ANOVA fatorial a x b x para verificar a significância na expressão diferencial dos genes.
Tabela 6. Valores da média (M), desvio padrão (D.P) e erro padrão (E.P) dos RQs para concentrações, gerações
e genes (GSTE7 e P450-12), analisados pelo programa Statistic 12.
25
Gene Gerações Tratamento µg/mL n M (RQ) D.P (RQ) E.P (RQ)
GSTE7 4 20 12 1,6982 1,8862 0,5445
GSTE7 4 40 12 0,8203 0,7185 0,2074
GSTE7 5 20 12 9,7780 14,0149 4,0457
GSTE7 5 40 12 0,3618 0,2114 0,0610
GSTE7 6 20 12 0,5476 0,4308 0,1244
GSTE7 6 40 12 0,6132 0,5423 0,1566
GSTE7 7 20 12 1,5621 2,2494 0,6493
GSTE7 7 40 12 0,8186 0,6554 0,1892
P450-12 4 20 12 15,8061 9,5348 2,7525
P450-12 4 40 12 1,6786 1,0645 0,3073
P450-12 5 20 12 93,0064 110,1889 31,8088
P450-12 5 40 12 15,6428 16,9522 4,8937
P450-12 6 20 12 172,4317 231,8956 66,9425
P450-12 6 40 12 7,8857 9,1329 2,6364
P450-12 7 20 12 46,3435 32,1023 9,2671
P450-12 7 40 12 22,8526 13,8641 4,0022
As Figuras 18 e 19 mostram expressão diferencial do gene P450-12 em relação a
GSTE7. A 6ª geração apresentou o maior pico de expressão do gene P450-12 na concentração
20 µg/mL (Figura 17). Os níveis de expressão elevam-se no tratamento com 20 µg/mL de
Isodilapiol, para os dois genes alvo (Figura 18). A expressão diferencial comparando
gerações, concentrações e genes (GSTE7 e P450-12) foram significativos.
Figura 17. ANOVA fatorial relacionando os níveis de expressão (RQ) dos genes GSTE7 e P450-12 das gerações
(G4, G5, G6 e G7), p= 0,02039. Amostras tratadas com 20 µg/mL de Isodilapiol.
(a) (b)
26
Figura 18. ANOVA fatorial relacionando os tratamentos 20 (a) 40 µg/mL (b) com o Isodilapiol, nas gerações
(G4, G5, G6 e G7) e os genes GSTE7 e P450-12, p=0,0192.
5. DISCUSSÃO
A expressão diferencial de diversos genes tem sido uma ferramenta muito útil, na
busca de alternativas para o controle populacional de vetores envolvidos no processo de
resistência a compostos xenobióticos (Hemingway et al., 2004). O estudo com larvas de 3°
estádio de A. aegypti por Lima et al. (2011) demonstrou resistência ao temefós, um inseticida
sintético utilizado no controle desse mosquito. O presente estudo utilizou larvas de 3º estádio
de A. aegypti previamente submetidas a bioensaios com o semissintético isodilapiol, para
verificar a expressão diferencial dos genes de resistência a inseticida (GSTE7 e P450-12),
durante quatro gerações.
Os ensaios toxicológicos em larvas de 3º estádio de A. aegypti revelaram que o
semissintético Isidilapiol em altas concentrações (60 e 80 µg/mL), foi letal a todas as larvas,
em 4 horas, o que inviabilizou o prosseguimento dos bioensaios com essas concentrações nas
gerações seguintes. Considerando o período de exposição e particularidades desse
semissintético, o seu efeito na mortalidade nas concentrações (60 e 80 µg/mL) foi mais eficaz
quando comparado aos compostos 1KL39-B (80 µg/mL) e 1KL39-C (70 µg/mL) utilizados
em larvas de 3º estádio de A. aegypti, cuja mortalidade ocorreu em 24 e 48 horas,
respectivamente (Domingos et al., 2014).
A qRT-PCR com o gene GSTE7 realizada em amostras de A. aegypti previamente
submetidas ao Isodilapiol (20 e 40 µg/mL), apresentou gráficos com picos de expressão
gênica mais altos em indivíduos submetidos a bioensaios na menor concentração (20 µg/mL),
principalmente na 5ª geração. Esse biossintético pode ter causado o aumento da taxa
27
metabólica da larva, evidenciada pelo aumento dos picos de expressão do gene GSTE7. O
aumento da taxa de resistência metabólica, leva à formação de produtos menos tóxicos,
podendo elevar a ação enzimática, ou acionam os mecanismos regulatórios, tornando-os mais
eficazes no aumento da produção de enzimas (Braga e Valle, 2007).
Estudos com semissintéticos avaliando a sua ação na expressão de genes de resistência
a inseticida voltados ao controle de A. aegypti, são escassos.
O trabalho de Riaz et al. (2013) com neonicotinóides em larvas de 4° estádio de A.
aegypti suscetível a inseticida, revelou intensa ação enzimática da monooxigenases (P450) em
relação à glutationa-s-transferase (GST), fato esse justificado, pela GST agir de forma
secundária no metabolismo de compostos xenobióticos (neonicotinóides). Esses autores
também demonstraram que a tolerância larval aumenta, gradualmente, sem que ocorra
estabilização, e pode acontecer de forma relativamente rápida sobre pressão de seleção com
inseticida, aumentando os níveis de expressão dos genes GSTE7 e P450-12 (CYP6N12).
Nesse sentido, os nossos resultados mostraram picos elevados de expressão dos genes GSTE7
e P450-12, Gerações 5 e 6 de A. aegypti, previamente tratadas com 20µg/mL, de Isodilapiol.
O gene P450-12 (CYP6N12) expressou-se diferencialmente de GSTE7,
principalmente no tratamento com 20 µg/mL, de Isodilapiol, o que podemos inferir que esse
composto causou estresse oxidativo nas larvas de A. aegypti, elevando os índices de expressão
do gene P450-12. Lumjuan et al. (2007) estudaram genes pertencentes à classe Epsilon
(GSTe), família das GSTs e, sugeriram, que estes podem atuar de forma coordenada na ação
contra inseticidas, pelo fato de se apresentarem como sequências repetidas uma atrás das
outras nos cromossomos, o que talvez, justificaria a baixa expressão de GSTE7 quando
comparado ao gene P450-12 Estudos com RNA de interferência (RNAi) demonstraram que
os genes GSTE2 e GSTE7, quando silenciados, não minimizaram a resistências de cepas de
A. aegypti ao DDT, reforçando a hipótese de que a família desses genes agem em cascatas,
tendo vias alternativas para sua expressão (Lumjuan, et al., 2011).
Em insetos, as enzimas P450 estão envolvidas no metabolismo de esteróides
endógenos, tais como os hormônios e lipídios. Essas monooxigenases (P450 ou CYPs)
pertencem a uma superfamília de enzimas que participam do metabolismo de compostos
xenobióticos ou endógenos, catalisando reações de desintoxicação (Scott et al., 1998).
Trabalho realizado com larvas e adultos de A. aegypti, por Grizales, et al. (2013), da cidade de
Cucuta, Colômbia demonstraram que o gene CYP6N12 (P450-12), são super expressos em A.
aegypti quando foi submetido a doses elevadas de temefós. Poupardin et al. (2008) utilizando
métodos de microarranjo e qPCR em tempo real observaram que vários genes do grupo das
28
enzimas P450 são expressos em picos diferenciados em presença de compostos xenobióticos,
entre eles, a permetrina. Esses autores sugeriram que, tais mecanismos de regulação gênica
podem ser controlados por Elementos de Resposta a Xenobióticos (XRE), que funcionam
como indutores em regiões promotoras dos genes de resistência a inseticida (P450) e que, no
entanto, outros fatores também podem participar da indução da expressão gênica do grupo
P450.
A expressão do gene P450-12 foi observada com o tratamento 40 µg/mL, apesar dessa
concentração não ter causado a mortalidade das larvas. Observou-se imobilidade larval no
intervalo das 4 horas do ensaio toxicológico. Bioensaio com a serrapilheira tóxica em larvas
de A. aegypti revelou que essa substância em altas concentrações ocasiona baixa atividade
enzimática de P450. Essa alta concentração pode indicar a saturação larval, influenciando na
capacidade enzimática de desintoxicação quando as larvas se deparam com altas doses de
xenobióticos, levando ao estresse metabólico o que pode ocasionar mortalidade larval (David
et al., 2010).
Considerando nossos dados de expressão do gene P450-12, dentre as quatro gerações
(G4,G5,G6 e G7), submetidas a bioensaios com isodilapiol, nos dois tratamentos (20 e 40
µg/mL), verificaram-se picos elevados de expressão gênica durante as gerações G6
(tratamento a 20 µg/mL) e G7 (tratamento a 40 µg/mL). Resultado similar de picos elevados
de expressão gênica ocorreu em amostras de gerações de A. aegypti tratadas com o inseticida
sintético permetrina (Poupardin et al., 2008). Em A. aegypti, com o composto 2KL-15, a
elevada expressão gênica pode ser justificada pela permanência de alelos resistentes nas
gerações G6 e G7, nas quais as larvas podem ter sido sensíveis a esse composto. A possível
permanência de alelos resistentes nas gerações de A. aegypti está de acordo com os resultados
demonstrados por Carvalho et al. (2004), que estudaram gerações de larvas de 3º estádios de
A. aegypti tratadas com inseticida temefós, sugeriram que durante as gerações larvas sensíveis
tendem a ser eliminadas. Hidayati et al. (2011) estudaram gerações de larvas e adultos de A.
aegypti, submetidos a bioensaios com o composto sintético malation, e sugeriram que a
resistência a esse inseticida aumentava 2,55 vezes na 4ª geração.
Considerando o gene P450-12, que confere resistência a inseticidas sintéticos, a
sensibilidade do método qRT-PCR, e os fatores, como temperatura, ciclo circadianos,
umidade e disponibilização de alimentos, Yang et al. (2010) realizaram ensaios toxicológicos
com larvas de 3º estádio de A. aegypti contaminadas com permetrina. Os autores registraram
que os fatores como: umidade, temperatura e disponibilidade de alimentos, interferiram nos
ensaios toxicológicos bem como nos níveis de expressão do gene P450-12. Em nosso estudo,
29
os ensaios toxicológicos com larvas de 3º estádio de A. aegypti foram padronizados em
relação ao foto período, temperatura, umidade e alimentação, evitando possíveis variáveis as
quais poderiam interferir nos ensaios toxicológicos.
No presente estudo, os picos de expressão diferencial gênica foram estatisticamente
significativos entre tratamentos, gerações e, também, entre os genes GSTE7 e P459-12. O
desvio padrão para cada tratamento (n=12) foi baixo para o gene GSTE7 nas gerações G4, G6
e G7, exceto em G5 tratado com 20 µg/mL. O gene P450-12 teve variações no desvio padrão
causadas pelos altos picos de sua expressão gênica. Esse desvio padrão e o nível de expressão
gênica elevado em amostras de G5 e G6 tratadas com 20µg/mL Isodilapiol podem ser
justificados pela ação tóxica do isodilapiol e da presença de alelos resistentes entre as larvas
distribuídas aleatoriamente nos copos durante o ensaio toxicológico. Padrões diferenciais de
expressão do gene P450 com A. aegypti oriundos de mesma linhagem foram observados por
Rodriguez et al. (2012). Esses autores estudaram linhagens de A. aegypti do México e,
observaram diferentes padrões de expressão gênica de amostras tratadas com o inseticida
químico permetrina. Os resultados mostraram que, os indivíduos das primeiras linhagens
carregavam alelos resistentes à pressão de seleção a compostos xenobióticos e que isso,
possivelmente, elevou as taxas de expressão diferencial do gene P450.
Os ensaios realizados em A. aegypti com o composto Isodilapiol revelaram alto nível
de expressão do gene P450-12, corroborando com Hemingway et al. (2004), que sugeriram
que os genes da família das P450 são induzidos em presença de diferentes tipos de compostos
xenobióticos. O composto Isodilapiol pode ter participação em diversas função metabólicas,
ativando a expressão diferencial do gene P450-12.
No processo de desintoxicação, também, são expressas as enzimas GSTs e
monooxigenases (chaperonas, hidrogenases, proteases e colagenases) e, outros grupos de
proteínas, como proteínas da cutícula, que exercem papel fundamental na proteção do inseto a
fatores extrínsecos (Araujo et al., 2008; David et al., 2010; Puinean et al., 2010). Assim, o
composto Isodilapiol pode ter participado em diversas funções metabólicas, ativando a
expressão diferencial de GSTE7 e P450-12 e de outros grupos de genes relacionadas a essas
famílias. No entanto, estudos futuros são necessários para elucidar outros mecanismos
metabólicos ativados pelo composto Isodilapiol e as variações nos níveis de transcrição dos
genes GSTE7 e P450-12, como um potencial controle do vetor da dengue, o A. aegypti.
30
6. CONCLUSÕES
Os picos de expressão diferencial dos genes GSTE7 e P450-12 de resistência a
inseticida em larvas de 3° estádio de Aedes aegypti foram mais elevados na menor
concentração do Isodilapiol (20 µg/mL) comparadas à concentração de 40µg/mL, o que pode
ser provavelmente devido a ação eficiente de alguma proteína de transcrição.
As variações nos níveis de expressão do gene P450-12 podem estar relacionadas com
a ocorrência de alelos de resistência a inseticidas nas larvas de 3° estádios de A. aegypti. E o
gene GSTE7 pode atuar secundariamente no metabolismo do Isodilapiol.
Os genes GSTE7 e P450-12, apresentaram alto nível de expressão diferencial, nestes
nos dois tratamentos e entre as gerações G4, G5, G6 e G7. Inferem-se que as enzimas
monooxigenases podem ter interagido no processo metabólico do Isodilapiol facilitando o
estresse oxidativo desse composto em larvas de 3º estádio de A. aegypti, revelando-se
composto de potencial efeito no controle de A. aegypti, vetor da dengue.
31
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