1

Innhold

Program ................................................................................................................................................... 2

Digital patologi – fra teori til praksis ....................................................................................................... 3

Anna Bodén ......................................................................................................................................... 3

Digital patologi – i praksis innen et fagfelt i Norge ................................................................................. 5

Sabine Leh, overlege, avdeling for patologi, Haukeland Universitetssykehus .................................... 5

Histologiske farginger – oversikt og prinsipper ....................................................................................... 8

Vidar Isaksen, overlege, Klinisk patologi, UNN, Tromsø ..................................................................... 8

Histologiske markører – er de enda brukbare? ..................................................................................... 11

Andrej Valkov, overlege, Klinisk patologi, UNN, Tromsø .................................................................. 11

Molekylærgenetiske metoder, oversikt ................................................................................................ 14

Hege Russnes, overlege, Avdeling for patologi, Oslo Universtitessykehus ....................................... 14

NGS i diagnostisk praksis ....................................................................................................................... 15

Sonja E. Steigen, overlege og Thomas Berg, forsker, Klinisk patologi, UNN, Tromsø ....................... 15

Kvalitetssikring i diagnostikken – hvilke metoder? ............................................................................... 19

Sveinung Sørbye, overlege, Klinisk patologi, UNN, Tromsø .............................................................. 19

Akkreditering - en metode for å sikre bedre diagnostisk kvalitet? ....................................................... 22

Ingrid Lott og Ragnhild Margrete Wold, LIS, Klinisk patologi, UNN, Tromsø .................................... 22

Deltagerliste .......................................................................................................................................... 24

2

Program

Kurs i Diagnostiske metoder 1030-1100 Registrering

1100-1105 Åpning

Tema I - Digital patologi

1105-1200 Digital patologi - fra teori til praksis

Anna Bodén, Linkoping

1200-1230 Digital patologi - i praksis innen ett fagfelt i Norge

Sabine Leh, UiB

1230-1330 Lunsj

Tema II - Histologiske markører

1330-1415 Histologiske farginger - oversikt og prinsipper

Vidar Isaksen, UNN

1415-1500 Histologiske markører – er de enda brukbare?

Andrej Valkov, UNN

1500-1515 Pause

Tema III - Molekylærdagnostikk

1515-1600 Molekylærgenetiske metoder, oversikt.

Hege Russnes, Ous/Sonja E. Steigen, UNN

1600-1645 NGS i diagnostisk praksis

Sonja E. Steigen, UNN

1645-1700 Pause

Tema IV - Kvalitetssikring

1700-1745 Kvalitetssikring i diagnostikken - hvilke metoder?

Sveinung W. Sørbye, UNN

1745-1815 Akkreditering - en metode for å sikre bedre diagnostisk kvalitet?

Ingrid Lott/Ragnhild Wold, UNN

1815-1830 Diskusjon/oppsummering

3

Digital patologi – fra teori til praksis

Anna Bodén

Digital pathology - 5 years’ experience from implementation of large-scale routine diagnostics

using whole slide imaging in Linköping, Sweden

Anna Bodén, MD, Department of Clinical Pathology and Department of Clinical and Experimental

Medicine, Linköping University, Linköping, Sweden.

Traditionally, light microscopy (LM) has been the reference method enabling the visual interpretation

of the cellular components in tissue, used by pathologists in the field of histopathology to render

diagnosis of many diseases. During the late 1990’s and further on, the technology of automated,

high-resolution whole-slide imaging (WSI) systems has expanded.1 Whole slide imaging (WSI) systems

can render a virtual slide image, visible at resolutions of less than 0,5 µm/pixel 2, producing images

that can be viewed and examined with interactive software on a computer screen enabling

diagnostic work using the same criteria as in LM. In comparison to LM, WSI offers numerous

advantages such as change of ergonomics workplace 3, effective access to a virtual slide independent

of location and enabling multiple viewing. The virtual slides open up possibility of examining multiple

slides allowing side-by-side comparisons, automatically calibrated measurements of scales and areas

and detailed annotations et cetera. A not so often spoken benefit is the intgegration of WSI in the

laboratory environment, with macro cameras supporting documentation during grossing and

possibility to see WSI when sectioning as effective, precise, ancillary tests can be performed on tissue

blocks from the information of an annotation on the WSI instead of on a physical glass slide as

needed when need of immunohistochemistry stains on large sections or in the field of molecular

pathology. The whole slide images generated are stored and shared virtually, decreasing time taken

to render second opinions, retrospective comparison with newer material, multidisciplinary

conferences, and preventing slidecolor degeneration and physical damage 4. At present in a globally

perspective WSI is more commonly used in education and research and preliminary diagnostics such

as in intraoperatively frozen sections or secondary diagnostics. Its use in routine involving primary

clinical diagnosis remains limited (Sweden, Toronto, Ontario, Canada) 5

At the department in Linköping we have over 5 years of experience of whole slide scanning in routine

and diagnostic implementation, starting in 2010-2011. Until today we appreciate that about 30% of

our production is produced based on primary WSI diagnostic. Today in 2017 we will soon finish the

third nationally digitally project, Digipat 3, with experiences of implementing, introducing and using a

new generation of WSI system enabling every pathologist and laboratory staff at the department to

use WSI. During this project phase, we have been involved in further design of software, redefining a

workstation and validated screens and software, educating and introducing secondary diagnostic

options, multidisciplinary WSI settings etc. to every employed pathologist at the department. Also,

we are presently revalidating each pathologist individually in separately diagnostic fields introducing

primary diagnostic to a broader user group as we are moving further from project phase to an

established management.

4

Apart from background and experiences of WSI and the diagnostic process using digital pathology I

will explain the components of a whole slide imaging (WSI) system and relate them to different

scenarios of impact in the diagnostic work with image examples and explaining notes from learned

lessons.

1. Ghaznavi F, Evans A, Madabhushi A, Feldman M. Digital Imaging in Pathology: Whole-Slide Imaging and Beyond. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2013;8:331-359. doi:10.1146/annurev-pathol-011811-120902.

2. Ho J, Parwani A V, Jukic DM, et al. Use of whole slide imaging in surgical pathology quality assurance: design and pilot validation studies. doi:10.1016/j.humpath.2005.11.005.

3. Thorstenson S, Molin J. Implementation of large‑scale routine diagnostics using whole slide

imaging in Sweden: Digital pathology experiences 2006‑2013. doi:10.4103/2153-3539.129452.

4. André, Phd H, Looijen Msc A, Van Den Brink SM, Van Diest PJ. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Hum Pathol. 41:751-757. doi:10.1016/j.humpath.2009.08.026.

5. Goacher E, Randell R, Williams B, Treanor D. The Diagnostic Concordance of Whole Slide Imaging and Light Microscopy A Systematic Review. Arch Pathol Lab Med. 2017;1415858. http://www.archivesofpathology.org/doi/pdf/10.5858/arpa.2016-0025-RA. Accessed March 11, 2017.

5

Digital patologi – i praksis innen et fagfelt i Norge

Sabine Leh, overlege, avdeling for patologi, Haukeland Universitetssykehus

Avdeling for patologi ved Haukeland universitetssykehus begynte å digitalisere alle ikke-neoplastiske

nyrebiopsier i 2012. Samtidig ble det påbegynt et digitalt arkiv av alle nyrebiopsier i Norge. Dette

arkivet er knyttet opp mot seksjon for nyrebiopsi i Norsk Nyreregister. Digital diagnostikk av

nyrebiopsier startet rett etter implementeringsfasen.

Hvorfor ikke-neoplastiske nyrebiopsier? De avgjørende momentene var:

Nyrelegene ville gjerne ha mulighet å se på biopsiene sine selv. En nyrelege skaffet penger for å kjøpe den første skanneren (Trond Mohn midler)

Nyrebiopsiene utgjør ikke mange biopsier (ca. 600 per år i Norge) og de viser lite vev. Dette betydde håndterlige lagringskostnader. Denne type biopsi var således velegnet for et pilotprosjekt innenfor digitalisering

Noen harde fakta:

Avdelingen har 2 digitale snittskanner, en Scanscope XT fra Aperio/Leica, kjøpt 2011, og en

Hamamatsu Nanozoomer XR, kjøpt 2015.

Alle snitt skannes med 40x.

Som bildedatabase brukes e-Slide Manager fra Aperio/Leica. Bildevisningsprogram er imagescope.

Bildedatabasen inneholder 5533 nyrebiopsier med 42600 digitale snitt. I tillegg til nyrebiopsier

skannes snitt til møter, mindre piloter innenfor digital diagnostikk og forskningsprosjekter. Det

brukes per i dag 17 Tb lagringsplass.

671 nyrebiopsier har blitt diagnostisert basert på digitale snitt inntil nå. Til diagnostikk brukes en Fuji

P27T-6 skjerm, 2560x1440, 3.7 Mill Pixel med en dot pitch av 0.23 mm.

De digitale snitt er tilgjengelig fra enhver arbeidsplass i Helse Vest.

6

Figur 1: Oversiktskart skanner, bildedatabase og klienter.

Positive erfaringer med digital diagnostikk av ikke-neoplastiske nyresykdommer:

Det var i alle tilfeller mulig å lage en diagnose basert på digitale snitt. Digital diagnostikk var i mange

områder overlegen sammenlignet med konvensjonell diagnostikk ved mikroskopet. Her kommer en

liste med de 10 viktigste fordeler ved digital diagnostikk:

1. Alle biopsier, også historiske, er kun et museklikk unna 2. Det er lett å følge små forandringer gjennom snittserier 3. Immunhistokjemiske farginger kan sammenlignes side ved side; dette letter tolkningen

betydelig. 4. Det er enkelt å utføre målinger, for eksempel glomerulusstørrelse 5. Annoteringer brukes i stor grad for å dokumentere viktige forandringer 6. Det er lett å demonstrere funn i klinisk-patologiske møter basert på annoteringer. Møter

krever mye mindre forberedelsestid. 7. Det trengs ikke lenger mikroskop på møterommene. Det er således lett å gjennomføre

videokonferanser med deltakere utenfor sykehus ved bruk av eksisterende videokonferanserom.

8. Med hjelp av VPN tilgang er biopsiene tilgjengelig ved opphold utenfor Helse Vest. Dette gir mye større fleksibilitet og frihet til å reise.

9. Digitale snitt legger til rette for eksellent samarbeid i forskningsprosjekter 10. Arbeidsplassen er alltid ryddig – biopsibunkene er forsvunnet. Snitt trengs ikke lenger å

sortere på brettene.

7

Figur 2: Dokumentasjon av forandringer med hjelp av annoteringer

Blandete erfaringer og begrensninger

Polarisering er ikke mulig. Om en ønsker å polarisere, så må en bruke mikroskopet.

Våre 2 skannere har forskjellig fargetone. Dette blir særlig tydelig ved PAS fargete snitt.

Oppgraderinger av systemene har ofte vært krevende. Det er viktig med gode testsystemer, IKT

fagkunnskap og god støtte fra leverandør.

Systemet vårt er proprietært; migrering av digitale snitt er utfordrende.

Oppsummering

Diagnostisering av ikke-neoplastiske nyresykdommer basert på digitale snitt er gjennomførbar.

Digitale system viser i mange aspekter økt funksjonalitet sammenlignet med konvensjonell

mikroskopi.

8

Histologiske farginger – oversikt og prinsipper

Vidar Isaksen, overlege, Klinisk patologi, UNN, Tromsø

Histologiske farginger har vært brukt i hvert fall siden 1682 da N. Grew farget plantevev med

carminsyre fra Dactylopius coccus cacti og 1712 da A. P. van Leeuwenhoek farget muskelfibre med

safran utvunnet fra crocusplanten. I 1856 syntetiserte W. H. Perkin den første syntetiske fargen –

anilin fiolett.

De fleste fargene som brukes på histologiske snitt, ble opprinnelig produsert for farging av tøy.

Eksempel på det er hematoxylin som har vært kjent siden 1502 og ble tatt i bruk på histologiske snitt

og cytologiske utstryk i 1863 av H. W. G. Waldeyer og eosin som ble syntetisert av H. Caro i 1871. Det

var A. Wissowzky som i 1876 kombinerte hematoxylin og eosin som vevs- og cellefarge og har siden

vært brukt. Hematoxylin er komponent i mange spesialfarger. Mange av de andre fargene som

brukes i dag, har også sin opprinnelse fra 1800-tallet og først på 1900-tallet.

De fleste fargestoffene er organiske molekyler som inneholder derivater av benzen med ulik

kompleksitet. Molekylene må ha en kromofor som gir en spesiell farge når hvitt lys passerer gjennom

og med få unntak et auxokrom som gjør at fargestoffet kan binde seg til vevet. Auxokromet kan være

kationisk, anionisk eller nøytralt og vil da kunne binde seg til ulike vevsstrukturer.

Fargestoffene kan modifiseres med metylering og etylering og ved å øke vannløselighet med blant

annet svovelsyreradikaler samt ved oksydasjons- og reduksjonsreaksjoner. Affinitet for fargestoff i

vev kan også endres ved å forandre pH.

Impregnering med metallsalter for å få fram vevsmorfologi brukes også. Stort sett er det sølvnitrat og

i mindre grad gullklorid som brukes.

De fleste fargestoffene binder seg til vevstrukturer med elektrostatiske bindinger, men

hydrogenbindinger, van der Waalske krefter og kovalente bindinger forekommer også. For noen

farger er bindingsmekanismene fortsatt uklare.

Det finnes i dag histologiske farger for bindevev, muskel, intranucleære granula, proteiner,

nucleinsyrer, proteinavleiringer, karbohydrater, lipider, pigmenter, endokrine celler og infektiøse

agens.

Historikk, oppbygning av fargestoffer og eksempler på noen vanlig brukte fargestoffer vil bli

gjennomgått.

Tabellen viser utvalget av spesialfarger ved 5 laboratorier i Norge i dag.

Referansene nedenfor er til histologifargelærebøker og til artikler hvor spesialfarger er brukt.

Spesialfarger som brukes ved Universitetssykehuset Nord-Norge, Akershus Universitetssykehus,

Stavanger Universitetssykehus, Haukeland Universitetssykehus, St. Olavs Hospital og ved Oslo

Universitetssykehus:

9

UNN Ahus SUS Haukeland St. Olav OUS Alcian Blue Alcian Blue AFB ABP Alcian Blue Alcian Blue

AB-PAS AB-PAS Alcian Blue ABP hyaluronidase

Bodian Auramin Rhodamin

Attwood Bodian AB-PAS AFB Elastin Churukian Shenk

Congo Rød Congo rød Congo Rød Congo Rød EVG Congo

Elastin Gallays Elastin Elastin Gallays Giemsa

Giemsa Giemsa Giemsa Giemsa Giemsa Gomori

Gram Gram Gram GMS Grimelius Gram

Jones Grimelius Grocott Gram Gordon & Sweet

Grocott

Luxol fast blue Grocott Iron Iron Gram Kopper

Masson Trichrome

Gordon & Sweet

Jones Jones Grocott Masson Fontana

Melanin Hales colloidal jern

MSB Lendrum Hagas sølv-metenamin

Masson trichrome

MSB Luxol fast blue

Oil Red Masson Trichrome

Hales colloidal jern

Melanin

Mucicarmin Mallory trichrome

PAS PAS Luxol fast blue

Oil Red

Oil Red Oil Red PASD PASD Masson Trichrome

PAS

Orcein PASD Reticulin Reticulin Masson Fontana

PASD

PAS PASM Steiner Schmorle Melanin Perls

PASD Perls Trichrome Masson

Sopp MSB Pinocyanol erthrocyanat

Perls Melanin Masson Fontana

Von Kossa Oil Red Sølv-methenamin

Reticulin Van Gieson PAS Van Gieson

Toluidin blå Verhoeff elastin

PASD Verhoeff

Von Kossa Von Kossa Perls Von Kossa

Ziehl Neelsen Warthin Starry

Sirius (congo) Wright

Wright Giemsa

Sudan Ziehl Neelsen

Ziehl Neelsen Sudan Black

Sølv-methenamin

Toluidin blå

Von Kossa

Warthin Starry

Ziehl Neelsen

10

Bancroft JD et al: Manual of Histological Techniques and their Diagnostic Application.

Churchill Livingstone 1994. ISBN 0 443 04534 8

Bancroft JD et al: Theory and Practice of Histological Techniques. 4th ed.

Churchill Livingstone 1996. ISBN 0 443 04760 X

Fossum B et al: Kompendium i histopatologiske teknikker. HiO-notat 2001 nr 4.

Wulff S (ed): Guide to Special Stains.

DakoCytomation 2004

Barcia JJ et al: The Giemsa Stain: Its History and Applications International Journal of Surgical

Pathology, Vol 15, Issue 3, 2007.

Fischer AH et al: Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008

May 1;2008:pdb.prot4986. doi: 10.1101/pdb.prot4986.

Gupta K et al: A histochemical comparison of methylene-blue/acid fuchsin with hematoxylin

and eosin for differentiating calcification of stromal tissue. Journal Biotechnic &

Histochemistry Volume 87, 2012; 249-256.

Bowen K et al: AL-Amyloidosis Presenting with Negative Congo Red Staining in the Setting of

High Clinical Suspicion: A Case Report. Case Reports in Nephrology Volume 2012.

Gupta B et al: Identification of High-Risk Aberrant Crypt Foci and Mucin-Depleted Foci in the

Human Colon With Study of Colon Cancer Stem Cell Markers. Clinical Colorectal Cancer.

Available online 20 September 2016

Laguna-Fernandez A et al: Iron alters valvular interstitial cell function and is associated with

calcification in aortic stenosis. Eur Heart J 2016 Dec 14;37(47):3532-3535

Tezcan O et al: Effects of Hyperbaric Oxygen Treatment on Renal System. Iran J Kidney Dis.

2017 Jan;11(1):18-22.

11

Histologiske markører – er de enda brukbare?

Andrej Valkov, overlege, Klinisk patologi, UNN, Tromsø

Utviklingen av histopatologi startet med innføring av mikroskopet, og senere av mikrotom i midten

av 1800-tallet. Da ble det mulig å skjære vevssnitt til å se forandringene. For å tolke forandringene

måtte man i tillegg innføre vevsfarginger, og fra 1876 ble hematoksyllin og eosin en rutinefarging,

som tillot å visualisere både celler, med kjerne- og cytoplasmadetaljer, og intercellulær stoff. I seg

selv er H&E en veldig informativ farging som gir mulighet til å vurdere forskjellige patologiske

prosesser.

Likevel ville man få mest mulig informasjon om ulike sykdommer, med utgangspunkt i histopatologi,

da ble det i løpet av 1900 århundre innført tallrike spesielle farginger som var utformet til å

identifisere bestemte substanser i vev. Eksemplene er Feulgen farging for kromatin, Oil Rødt farging

for fett, PAS farging for slim og glykogen mm.

I løpet av de siste 50 år har man utviklet flere nyere metoder, inkludert enzymohistiokjemi,

elektronmikroskopi, polarisert mikroskopi, immunhistokjemi, flowcytometri, FISH og

molekylærpatologi. Med tanke på pasientens behandlingsbehov, tillater disse metodene å finne ut

spesielle molekylære mål for en spesialisert og målrettet behandling. Kan dette bety at vi ikke

trenger de gode gamle spesielle farginger lengere?

Svaret er både ja og nei. Ja, da mesteparten av spesielle fargingene er erstattet av de nyere metoder.

Samtidig så trenger vi fortsatt noen av dem i noen spesielle settinger i morfologisk diagnostikk.

Her skal vi drøfte de ulike fargingene som fortsatt er i drift og betyr mye for diagnostikken.

Listen er følgende:

• H&E

• Congo

• Perls

• Fettfarginger

• Gomory trikrom

• Melanin (Fontana-Masson)

• Myelin (LFB-PAS)

• Giemsa

• Alcian Blue

• PAS

• VG/Masson

• Elastin

• Reticulin

12

Hematoksyllin og eosin.

Kjerner er blåe, cytoplasmiske strukturer er rosa. Man kan se intranukleære pseudo- og reelle

inklusjoner og vakuoler, samt forskjellige cytoplasmiske forandringer, inkludert inklusjoner og

granuler. Ekstracellulært kan man se globuler, både eosinofile og basofile, samt ikke-globulære

stoffavleiringer.

Congo.

Viser amyloidavleiringer. Gir grønn lysbryting i polarisert lys. Biopseres for fettvev eller slimhinner.

Brukes som rutinefarging ved nyrebiopsi.

Perls.

Historisk første vevsfarging, innført 2 år før H&E. Brukes mtp hemosiderin i hud (stasedermatitt, Mb

Schamberg etc), lever (hemokromatose), benmarg (serøs atrofi) og ved diagnostikk av endometriose.

Fettfarginger.

Mindre og mindre brukt. I vår avdeling begrenset muskelbiopsi mtp «lipid storage disease».

Gomory trikrom.

Begrenset nå av muskelbiopsi, mtp «red rugget fibers», nemalin legemer og rimmed vakuoler.

Lendrum fast blue, med PAS motfarging.

Brukes ved demyeliniserende sykdommer av CNS.

Giemsa.

Standart HP farging (men kan erstattes av flere andre og IHC). Brukes for å visualisere mast celler,

spesielt i hud og benmarg mtp flere sykdommer bl.a mastocytoser og lymfoplasmacyttisk lymfom.

Alcian blue.

I noen avdelinger brukes (sammen med PAS) som standart GIT farging, men brukes mye mindre nå.

Viser slimvakuoler i slimproduserende adenokarsinom og i mucoepidermoid karsinom. Positiv i

myksoide svulster.

PAS.

Lik effektiv som, men billigere enn, Grocott som soppfarging. Noen fortsatt bruker som Ewings

sarkomfarging og farging for alveolær bløtvevssarkom.

Farginger mot kollagenfibre.

VG og Masson trikrom er like gode. I lever brukes de for å definere grad av cirrhose. I benmarg mtp

grad av myelofibrose (Kvasnicka grad).

13

Elastin farging.

Brukes mest for å fremvise tap av elastinlameller ved cystisk medianekrose i aorta. Tas sammen med

Alcian Blue farging som viser akkumulering av syre glykosaminoglykaner.

Retikulinfarging.

Brukes omfattende. I lever mtp diagnostikk av lavgradige hepatocellulære karsinomer. I

paragangliomer/pheochromocytomer mtp «cellballen» mønster. I benmarg mtp grad av

myelofibrose (Kvasnicka grad).

14

Molekylærgenetiske metoder, oversikt

Hege Russnes, overlege, Avdeling for patologi, Oslo Universtitessykehus

De fleste fagområdene innen patologi bruker nå ulike typer analyser i tillegg til histo-morfologisk

vurdering i diagnostikk. Både genforandringer (ulike typer mutasjoner og modifikasjoner), endring av

genuttrykk (genekspresjon) og proteinvurdering (immunhistokjemi, flowcytometri) kan regnes som

molekylærgenetiske markører. Til nå har man ofte undersøkte få, utvalgte markører, men det er en

endring av teknologi som gjør at slik man nå har mulighet til å undersøke mange gener eller proteiner

samtidig og informasjonsmengden øker betraktelig.

Uansett om man trenger å innføre enkeltmarkører eller paneler av markører er det mange valg som

må taes når man implementerer slike tester i laboratoriene.

Det er viktig å ta hensyn til:

- faggrunnlag - pasient/diagnose gruppe - valg av molekylær markør (forandringen man vil påvise) - valg av metode og teknologi - analysering og tolkning av data - formulering i besvarelsen av funn - integrering av ulike tilleggsanalyser med histo-morfologiske funn - kostnader

Slike tilleggsundersøkelser blir innført av ulike grunner. Noen tester gir betydelig informasjon for

diagnose, andre er informative for (sub-) klassifisering og noen innføres pga klinisk behov slik som

prediksjon av terapi respons eller monitorering av sykdomsforløp. Patologer må kunne vurdere

behov og nytteverdi av slike analyser samt ta stilling til metoders robusthet, sensitivitet, spesifisitet

og mulige feilkilder for å kunne ha en vellykket innføring av nye markører.

15

NGS i diagnostisk praksis

Sonja E. Steigen, overlege og Thomas Berg, forsker, Klinisk patologi, UNN, Tromsø

Sekvensering, det vil si teknologien som benyttes for å bestemme baserekkefølgen i arvematerialet,

har gjennomgått en rivende utvikling det siste tiåret. De nye sekvenseringsmetodene omtales med

flere navn. Mest vanlig er nestegenerasjonsekvensering (Next Generation Sequencing =NGS), men

andre begreper som benyttes er massiv parallell sekvensering (MPS) og dypsekvensering. Metodene

er blitt del av det som kalles presisjonsdiagnostikk hvor målet er å tilpasse behandling den enkelte

pasient på best mulig måte, såkalt eller persontilpasset medisin. NGS er nå på full fart inn i den

patologiske rutinediagnostikken.

Målrettet sekvensering av tumor DNA

Den mest aktuelle sekvenseringsstrategien for patologifaget er målrettet sekvensering («targeted

resequencing»). Dette innebærer sekvensering av et begrenset utvalg (bibliotek) av klinisk relevante

gener. Fordelen med målrettet sekvensering er at man trenger lite materiale, samtidig som man

oppnår en stor lesedybde for de gener som undersøkes. Dette er viktig i patologidiagnostikken hvor

man ofte har begrenset materiale, og materialet som undersøkes ofte har betydelig cellulær

heterogenitet.

Sekvenseringsbibliotek

Et sentralt begrep innen NGS er sekvenseringsbibliotek. Biblioteket representerer utvalget av gener

som skal sekvenseres. For patologidiagnostikken hvor hoveddelen av prøvematerialet består av

formalinfikserte vevsprøver har det vist seg at PCR kanskje er den mest effektiv måten å lage

bibliotek for sekvensering. Det finnes mange leverandører av bibliotek til bruk i kreftdiagnostikken,

de fleste diagnostiske bibliotek består av et titalls- til hundretalls gener som kan være klinisk

relevante.

Sekvenseringsteknologi

For diagnostisk sekvensering finnes det to dominerende leverandører, hhv Illumina og Ion Torrent

(ThermoFisher). Begge metodene baserer seg på at det først lages et bibliotek med utvalgte gener,

som så sekvenseres (avleses) på et sekvenseringsinstrument. Sekvenseringsinstrumentene som

leveres av Illumina baserer seg på deteksjon av fluoroscens-signaler som sendes ut når DNA trådene i

biblioteket leses av. Den andre plattformen som leveres av Ion Torrent (ThermoFisher), og baserer

seg på at H+ ioner frigjøres når DNA-trådene i biblioteket leses av.

Begge metodene innebærer nokså omfattende prosesser på lab med mange analytiske steg. Som

følge av de store mengde komplekse data som genereres ved sekvensering, innebærer analysene

også betydelig arbeid med bioinformatikk, dvs at man bearbeider og tolker dataene fra

sekvenseringsanalysene.

16

Eksempel på sekvenseringsbibliotek: Illumina TruSight Tumor 15

Ved klinisk patologi UNN, har vi etablert et bibliotek som kalles Illumina Trusight Tumor 15. Dette er

et bibliotek hvor man kan undersøke 15 gener som kan være av klinisk relevanse for solide svulster,

typisk lungekreft, tykk/endetarmskreft, melanom og GIST. Bioblioteket dekker gener som EGFR,

KRAS, NRAS, BRAF, KIT og PDGFRA, Biblioteket lages ved hjelp av PCR, ved at det lages 250

amplikoner hver på ca 150-175 basepar. Totalt avleses ca 44 000 basepar. Dette biblioteket gir meget

stor lesedybde (minimum 500x), og dermed høy analytisk sensitivitet.

Tabell 1. Genpanel TruSight tumor 15

Gene Target or Region Clinical relevance

AKT1 E17K AKT1(E17K) mutations occur at low frequency in a variety of solid tumors,

including those of the breast and urinary bladder (3-5%)

BRAF Exon 15 (partial) Melanoma, CRC (lung, Colorectal, Hairy cell leukemia)

EGFR Exon 18-21 (++) Lung

ERBB2

p.E770_A771insAYVM

(equivalent to

p.A775_G776insYVMA)

FOXL2 C134W Adult-Type Granulosa Cell Tumor

GNA11 Q209L Uveal melanoma is characterised by mutations in GNAQ and GNA11,

resulting in Ras/Raf/MEK/ERK pathway activation.

GNAQ Q209L

KIT Exons 8, 9, 10, 11, 13, 14, 17, 18 GIST (melanoma)

KRAS Exon 2,3,4 CRC

MET Focal Amplification

NRAS Exon 2,3,4 CRC

PDGFRA Exons 12, 14, 18 GIST

PIK3CA Exons 9, 20

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit alpha,

PIK3CA, is one of the most frequently mutated genes in breast cancer,

and the mutation status of PIK3CA has clinical relevance related to

response to therapy. + diverse andre

RET M918T Oncogenic mutation of the RET receptor tyrosine kinase is observed in

several human malignancies.

TP53 Full CDS Mutated in many cancers

17

Validering og innføring av Illumina TruSight Tumor 15

NGS med TruISight tumor 15 erstatter en rekke PCR-baserte metoder hvor et utvalg av mutasjoner i disse genene ble påvist gjennom spesifikke analyser. Det overordnete kravet ved innføring av nye metoder er som regel at den nye metoden skal være like bra eller bedre enn eksiterende metode. For innføring av NGS-analyses ved avdelingen ble det dessuten satt en rekke krav som skulle evalueres og dokumenteres gjennom valideringsprosessen. Utforming av krav var i stor grad basert på anbefalinger i referanse (1), eksempelvis:

Mutasjoner som påvises ved NGS skal samsvare med tidligere påviste mutasjoner i prøvene Lesedybde på min 500x for alle målgener som rapporteres. I første omgang vil derfor kravet

gjelde relevante eksoner i KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, KIT og PDGFRA. Skal påvise mutasjoner (Limit Of Detection=LOD) ned til 5% VAF. Det vil si at vi skal kunne

påvise mutasjoner prøver med minst 10% neoplastiske celler. Metoden skal vise god repeterbarhet og reproduserbarhet Kvalitetsparameter sekvensering (run metrics) skal være innenfor spesifikasjoner

/anbefalinger fra leverandør.

Prøver for validering besto av et panel av formalinfiksert pasientprøver hvor mutasjonsstatus i aktuelle gener er bestemt ved standard metoder. Dette var prøver med lungekreft, melanom, tykk-og endetarmskreft og GIST. DNA var renset med laboratoriets akkrediterte metoder. Det ble også benyttet prøver med referansematerialet fra UKNEQAS, samt kommersielt tilgjengelige referanseprøver.

Rapportering av NGS-resultater Ved NGS vil man som regel påvise et stort antall varianter i prøven som undersøkes. Imidlertid vil det være et fåtall som vil være av klinisk relevans. Ved rapportering av resultat er det derfor viktig at det kommer klart frem hvilke variantfunn som vurderes å være klinisk relevante. Nylig ble det publisert en artikkel hvor det anbefales å klassifisere varianter etter et firedelt system, se ref (2). Ved avdelingen har vi også laget et tabell som mal for rapportering av funn ved NGS analyse, hvor vi opplyser om funn og hvilke gener som er sekvensert, men hvor funn per i dag ikke rapporteres (tabell 2).

18

Figur 1. Inndeling av varianter etter klinisk signifikans, slik det er anbefalt i ref (2). Oversatt til norsk blir klassene: Klasse I: Variant med høy klinisk signifikans Klasse II: Variant med potensiell klinisk signifikans, Klasse III: variant med ukjent signifikans og Klasse IV: Benign, eller sannsynlig benign variant.

Tabell 2. Rapportering av funn

Gen Funn Koordinater cDNA

Koordinater protein

Allelfrekvens variant (%)

Cosmic ID

Klassifisering

BRAF Ingen

EGFR Påvist mutasjon

c.2573T>G p.Leu858Arg 20 COSM29575 I: Variant med høy klinisk signifikans

KRAS Ingen

NRAS Ingen

KIT Ingen

PDGFRA Ingen

I tillegg undersøkes hele eller deler av følgende gener: AKT1, ERBB2, FOXL2, GNA11, GNAQ, MET, PIK3CA, RET og TP53. Resultat fra disse undersøkelsene kan fås ved henvendelse til lab.

Fordeler og ulemper ved innføring av NGS ved klinisk patologi, UNN.

Fordeler Ulemper

Betydelig utvidelse av mutasjonsundersøkelsene

Kompleks tolkning. Stiller store krav til kompetanse i molekylær genetikk og bioinformatikk-

Kvantitativ undersøkelse Gir en del resultater med usikker klinisk betydning

Felles arbeidsrutine for mange analyser Tar lengre tid

Krever lite materiale Sårbart for feil, ved feil må prøve vente til neste uke

Fremtidsrettet Kostbart

Referanser:

1. Deans ZC, Costa JL, Cree I, Dequeker E, Edsjo A, Henderson S, et al. Integration of next-generation sequencing in clinical diagnostic molecular pathology laboratories for analysis of solid tumours; an expert opinion on behalf of IQN Path ASBL. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 2017;470(1):5-20. 2. Li MM, Datto M, Duncavage EJ, Kulkarni S, Lindeman NI, Roy S, et al. Standards and Guidelines for the Interpretation and Reporting of Sequence Variants in Cancer: A Joint Consensus Recommendation of the Association for Molecular Pathology, American Society of Clinical Oncology, and College of American Pathologists. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2017;19(1):4-23.

19

Kvalitetssikring i diagnostikken – hvilke metoder?

Sveinung Sørbye, overlege, Klinisk patologi, UNN, Tromsø

Feilkilder i patologifaget

• Alt som kan gå galt vil før eller senere gå galt

• I mange industriprosesser er risiko for feil mye mindre enn en prosent (typisk 0,01 %)

• I patologifaget snakker vi om hele prosenter

• Tekniske feil eller logistiske feil i 2-3 % av tilfellene

• Feildiagnostikk i 5-10 % av tilfellene

Akkreditering

• Valideringssystem

• Kontrollsystem (interne og eksterne)

• Opplæring, avvikssystem

• Interne revisjoner

• Ledelsens gjennomgang

• Sporbarhet, Dokumentstyring

• Malboken

Tiltak mot preanalytiske feil

• Prosedyrer for prøvetakning

• Elektronisk rekvisisjon

• Muligheter for ”sporing” av prøven

• Rekvirent må ha oversikt om innsendte prøver er blitt mottatt og besvart

• Bruk av strekkoder / barkoder

• Unngå manuell punching av prøvenummer

• Sporbarhet i alle ledd

20

Tiltak mot feil ved makro

• Strukturert opplæring

• Gode rutiner på beskjæringsrommet

• Riktig utstyr, skarpe kniver

• Ergonomi, plass, hygiene, orden

• Makromaler

• Mikroskopi av preparater som er beskåret selv

Eksempler på diagnostiske feil

• Benign diagnose ved kreft

– Forsinket behandling

• Malign diagnose ved benign tilstand

– Unødvendig behandling / fjerning av friskt organ

• Feil malign diagnose

– Feil behandling / suboptimal behandling

Tiltak mot feildiagnoser

• Dobbeltsignering ved nye tilfeller av høygradig dysplasi og kreft

• Strukturerte diagnosemaler / malbok

• Diagnoseprofiler

• Intern og ekstern ringtesting

• Revurdering / rescreening av et tilfeldig utvalg prøver

• Immunfarging

• Diagnoseprofiler

• Samsvar mellom Gleason i nålebiopsi og prostataresektat

• Andel HPV positive ASC-US og LSIL

• Samsvar lavgradig cytologi og lavgradig histologi

21

• Samsvar høygradig cytologi og høygradig histologi

• Laboratoriesammenlignende prøver

Oppsummering

• Det gjøres mange feil i patologifaget

• Elektronisk rekvirering og elektroniske svar reduserer risiko for at ting forsvinner i posten

• Scanning av strekkoder reduserer risiko for feilpunching

• Dobbeltsignering av nye tilfeller av høygradig dysplasi og kreft reduserer risiko for falske

positive svar

• Diagnosemaler og strukturerte besvarelser øker sikkerheten for at alle nødvendige punkter

blir besvart

• Diagnoseprofiler og ringtesting kan avdekke systematiske feil

• Immunfarging gjør tolkning mindre subjektivt

• Det er umulig å eliminere alle feil

22

Akkreditering - en metode for å sikre bedre diagnostisk kvalitet?

Ingrid Lott og Ragnhild Margrete Wold, LIS, Klinisk patologi, UNN, Tromsø

Akkreditering er en offisiell anerkjennelse av at en organisasjon arbeider i henhold til et dokumentert

kvalitetssystem og har demonstrert kompetanse til å utføre nærmere beskrevne oppgaver. Dette

gjøres på laboratorier og hos sertifiserings-, verifiserings- og inspeksjonsorganer. Norsk akkreditering

(NA) er et forvaltningsorgan under Nærings- og fiskeridepartementet med nasjonalt ansvar for

teknisk akkreditering.

International Organisation for Standardisation (ISO) er et uavhengig globalt organ bestående av 164

medlemsland. ISO er verdens største utvikler av konsensusbaserte internasjonale standarder, som

tilrettelegger for utvikling av pålitelige produkter og tjenester, og ivaretar forbrukerne ved å sikre at

produktene og tjenestene holder og følger en minimumsstandard. ISO 15189 er standarden utviklet

for medisinske laboratorier, som spesifiserer kravene for kvalitet og kompetanse. For akkreditering

gjennom NA kreves det at kravene i ISO 15189 ivaretas.

I et laboratorium kan man akkreditere utstyr som pipetter, vekter og kjølerom. Man kan også

akkreditere bruken av reagenser, noe som sikrer økt sporbaret. I tillegg har ulike laboratoriemetoder

og prosedyter godkjente og lett tilgjengelige beskrivelser. Når en ny metode tas i bruk, er det krav til

en dokumentert plan, registering og evaluering av metoden. Det er også krav til dokumentasjon ved

opplæring av personell. Fleksibel akkreditering vil si at en kan bytte ut f.eks. utstyr eller reagenser i

en analyse uten at akkrediteringen faller bort.

Akkreditering kan også gjøres i selve diagnostikken. Eksempler er dobbelvurdering/-signering,

diagnoseprofiler, sammenlikning av cytologi- og histologifunn samt sammenlikning av prøver på tvers

av laboratorier. I tillegg kan det gjøres nærmere gransking av noen utvalgte diagnoser.

Eksempler på akkrediterte diagnoser ved Klinisk patologi UNN:

Intern kontroll: Alle første gangs kreftdiagnoser vurderes og signeres av 2 overleger. To uavhengige

leger vurderer og sammenlikner HER2 immunhistokjemi og diagrammer for DNA-ploiditet i et tilfeldig

utvalg prøver. Prøver med manglende samsvar mellom cytologi og histologi diskuteres. 10

nålebiopsier fra prostata sirkuleres internt blant ulike overleger ved avdelingen. 10 cervixcyt

sirkuleres internt blant ulike screenere ved avdelingen. Diagnoseprofiler (for prostata og cervix) gir

fortløpende statistikk over fordeling av diagnoser, antall diagnoser pr år og antall diagnoser pr

overlege eller screener.

Ekstern kontroll: 10 nålebiopsier fra prostata og 10 celleprøver fra cervix sendes til Kristiansand og

Tønsberg for sammenligning en gang pr år.

Aktuelle tiltak ved avvikende resultater: internt vurdering, ekstern vurdering, kriterier oppfriskes,

kvalitet gjennomgås. Avvikende resultater der det er behov for korrigerende/forbedrende tiltak skal

meldes som avvik.

23

Fordeler: Sannsynligvis færre feil og bedre kvalitet. Fordel ved søknad om kompetansesenter.

Sammenliknbare laboratorier. Det kan øke vår egen trygghet på at jobben vi gjør er god.

Ulemper: Få er interesserte i akkreditering. Innføring av nye rutiner er tidkrevende og

arbeidskrevende. Akkreditering koster penger. Det er økte krav til journalføring og mange skjemaer.

Referanser:

https://www.iso.org/home.html

http://www.akkreditert.no/

Kvalitetshåndbok for Klinisk Patologi Universitetssykehuset Nord-Norge

Takk til Lena Oprand Heggelund, Kvalitetsleder Klinisk Patologi Universitetssykehuset Nord-Norge

24

Deltagerliste

Adams, Benedicte Elisabeth

Avd for patologi - UUS Klinikk for radiologi og nukleærmedisin - OUS

Alfsen, Glenny Cecilie Avdeling for patologi - Ahus Akershus universitetssykehus

Baysa, Anton Avdeling for patologi Klinikk medisinsk diagnostikk

Berget, Elin Skafle Seksjon for patologi Sykehuset Telemark

Bie, Rolf Bruun Patologisk avdeling - Kristiansand

Sørlandet sykehus Medisinsk serviceklinikk

Bjerkestrand, Ane Bergsli

Avdeling for patologi Klinikk medisinsk diagnostikk

Bondø, Marthe Olufsen

Brekke, Marianne Birgitte Avd. for patologi og medisinsk genetikk

St. Olavs Hospital

Carlsen, Birgitte Avdeling for patologi Sykehuset i Vestfold HF

Daetz, Wiebke Avdeling for patologi Klinikk medisinsk diagnostikk

Dalen, Stig Manfred Klinisk patologi - Tromsø Universitetssykehuset Nord-Norge - Tromsø

Dirdal, Hege Ulland Avd. for patologi Stavanger Universitetssjukehus

Doughty, Richard William

Avd for patologi - RH Klinikk for radiologi og nukleærmedisin - OUS

Dyrli, Rebekka Sykehuset Innlandet Divisjon Lillehammer

Sykehuset Innlandet Divisjon Lillehammer

Eidsnes, Tonje Jeanette Hitland

Avd. for patologi Stavanger Universitetssjukehus

Isaksdottir, Helga Valgerdur

Avd for patologi - OUS (Enhet) Klinikk for radiologi og nukleærmedisin - OUS

Jamtøy, Ann-Helen Avd. for patologi og medisinsk genetikk

St. Olavs Hospital

Kvelstad, Ingjerd Lien Avd. for patologi Sykehuset Innlandet Divisjon medisinsk service

Liland, Katrine Høeg Avdeling for patologi - Ahus Akershus universitetssykehus

Lott, Ingrid Klinisk patologi - Tromsø Universitetssykehuset Nord-Norge - Tromsø

Lyckander, Lars Gustav Avdeling for patologi - Ahus Akershus universitetssykehus

Lyngra, Marianne Avdeling for patologi - Ahus Akershus universitetssykehus

Mangrud, Ok Målfrid Avd. for patologi Sykehuset Innlandet Divisjon medisinsk service

Mattsson, Min

Momcilovic, Dejan Avd. for patologi Sykehuset Innlandet Divisjon medisinsk service

Myhre, Maria Avd. for patologi og medisinsk genetikk

St. Olavs Hospital

25

Myrmel, Kristin Smistad Klinisk patologi - Tromsø Universitetssykehuset Nord-Norge - Tromsø

Myrvold, Anne Kristina Avd for patologi - UUS Klinikk for radiologi og nukleærmedisin - OUS

Nilsen, Eirin Klinisk patologi - Tromsø Universitetssykehuset Nord-Norge - Tromsø

Nybø, Camilla Jøsok Klinikk for diagnostikk - Møre og romsdal

Klinikk for diagnostikk - Møre og romsdal

Overrein, Tina Syvertsen Avd. for patologi og medisinsk genetikk

St. Olavs Hospital

Plotnikov, Igor Lab. for patologi Helse Fonna Medisinsk service

Randen, Ulla Akershus universitetssykehus HF

Akershus universitetssykehus HF

Reber, Anna Veronica Medisinsk avdeling - Kristiansand

Klinikk for somatikk Kristiansand

Rise, Tor Vikan Avd. for patologi og medisinsk genetikk

St. Olavs Hospital

Røyset, Elin Synnøve Avd. for patologi og medisinsk genetikk

St. Olavs Hospital

Sandnes, Line Aas Sykehuset Innlandet Divisjon Lillehammer

Sykehuset Innlandet Divisjon Lillehammer

Sauer, Torill Avd for patologi - UUS Klinikk for radiologi og nukleærmedisin - OUS

Savulis, Aurimas Lab. for patologi Helse Fonna HF

Skovholt, Else Kathrine Avd for patologi - RH Klinikk for radiologi og nukleærmedisin - OUS

Solstad, Ørjan Brendeford

Klinisk patologi - Tromsø Universitetssykehuset Nord-Norge - Tromsø

Stalund, Ida Viken Avdeling for patologi - Haukeland

Haukeland universitetssykehus

Strøm, Erik Heyerdahl Avd for patologi - RH Klinikk for radiologi og nukleærmedisin - OUS

Suhrke, Pål Sykehuset i Vestfold HF

Sundrehagen, Bendik Holmsen

Klinikk for medisinsk service Sykehuset Østfold

Sæle, Anna Kristine Myrmel

Avdeling for patologi - Haukeland

Haukeland universitetssykehus

Søland, Torunn Seksjon for patologi - Fredrikstad

Sykehuset Østfold

Thesen, Katrine Patologisk avdeling - Kristiansand

Sørlandet sykehus Medisinsk serviceklinikk

Thorsteinsdottir, Maria Avdeling for patologi - Haukeland

Haukeland universitetssykehus

Thune, Ada

Tjørstad, Siri Nes Klinikk for diagnostikk - Møre og romsdal

Klinikk for diagnostikk - Møre og romsdal

Tærud, Hans-Erik Avdeling for patologi - Haukeland

Haukeland universitetssykehus

Vallevik, Ingrid Ørbeck Senter for medisinsk genetikk og molekylærmedisin

Medisinsk servicedivisjon - Haukeland

26

Valset, Hans Kristian Lindsøe

Avd. for patologi Sykehuset Innlandet Divisjon medisinsk service

Villumsen, Anne Lise Patologisk avdeling - Bodø Diagnostisk klinikk - Bodø

Wik, Elisabeth Avdeling for patologi - Haukeland

Haukeland universitetssykehus

Wold, Ragnhild Margrete Klinisk patologi - Tromsø Universitetssykehuset Nord-Norge - Tromsø

Zaharia, Claudia Avd. for patologi Stavanger Universitetssjukehus

Ågren, Sara Joanna Maria

Avd for patologi - OUS (Enhet) Klinikk for radiologi og nukleærmedisin - OUS