inmovilización de células dr. j.v. sinisterra grupo de...
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Inmovilización de células
Dr. J.V. Sinisterra
Grupo de BiotransformacionesUniversidad Complutense de Madrid
Facultad de Farmaciawww.biotransformaciones.com
• Optimización de los Biocatalizadores
- Células en fermentación
- Células en reposo
-Células liofilizadas
- Células inmovilizadas
Resultados obtenidos en la oxidación de ciclohexanol utilizando células en fermentación, células en reposo o células liofilizadas
Oxidación del ciclohexanol (% conversión)
W. californica
W.saturnus
P.tannophilus
C.velutina
Condiciones de fermentación (1x) 92 71 91 31
Células en reposo (1x) 74 50 73 20
Células liofilizadas (100 mg) 12 15 13 9
Tabla.- Ventajas e Inconvenientes del uso de Enzimas aisladas frente a Células Enteras.
Biocatalizador Forma Ventajas Inconvenientes
En general
Dispositivo de trabajo simpleMayor productividad debido a
la elevada tolerancia a la concentración de sustrato
Necesario el reciclaje de la coenzima.
Disueltas en agua Elevadas actividades catalíticas
Posibles reacciones colaterales. Los sustratos lipófilos son
insolubles enAgua y se requiere un proceso
de extracciónSuspendi
das en disolvent
es orgánicos
Fácil de realizar, Los sustratos lipófilos son solubles.
Recuperación de la enzimaActividades reducidas
Inmovilizadas Fácil recuperación de la enzima Pérdida de actividad durante la
inmovilización.
Enzimas aisladas
Biocatalizador Forma Ventajas Inconvenientes
En general
No es necesario el reciclaje
de la coenzima
Equipamiento caro. Proceso tedioso debido
a los elevados volúmenes. Baja
productividad debido a la menor tolerancia a la
concentración, baja tolerancia a los
disolventes orgánicos, reacciones colaterales
debidas al metabolismo incontrolado.
Cultivo en
crecimiento
Elevadas actividades
Elevada cantidad de biomasa, mayor
cantidad de subproductos, difícil control del proceso
Células en
Reposo
Trabajo más fácil. Menor cantidad de
subproductos al estar el metabolismo controlado
Menores actividades
Inmovilizadas
Posible reutilización de las células
inmovilizadasMenores actividades
Células enteras
• Inmovilización de células
Células (Enzimas) Soporte
Propiedades Bioquímicas
Tipo de reacción y Cinética
Características químicas
Propiedades mecánicas
Rendimiento del método de inmovilización
Productividad del derivado inmovilizado
Introducción• Técnicas de inmovilización
Hay cuatro tipos fundamentales de inmovilización:
i) Adsorción sobre una superficie porosaii) Atrapamiento en una matriziii) Unión covalente a superficiesiv) Reactores de membrana
Matrices para inmovilización por atrapamiento:
i) hidrogeles: alginatos (Mofidi y cols, 2000; Pátková y cols, 2000), carragenano, quitosano, etc.
ii) termogeles: agar, agarosa, celulosa, gelatina (Armisen, 2001).
iii) polímeros: poliacrilamida, poliuretano, alcohol polivinílico
El atrapamiento en una matriz de origen biológico como agar, geles de alginato o carragenano (Unemura y cols, 1984) se usa frecuentemente para las células enteras. Los principales inconvenientes de las matrices de origen biológico son su inestabilidad frente a los cambios de temperatura, pH, alteraciones del entorno iónico y también su baja estabilidad mecánica.
• Técnicas de inmovilización
Hay cuatro tipos fundamentales de inmovilización:
i) Adsorción sobre una superficie porosaii) Atrapamiento en una matriziii) Unión covalente a superficiesiv) Reactores de membrana
Matrices para inmovilización por atrapamiento:
i) hidrogeles: alginatos (Mofidi y cols, 2000; Pátková y cols, 2000), carragenano, quitosano, etc.
ii) termogeles: agar, agarosa, celulosa, gelatina (Armisen, 2001).
iii) polímeros: poliacrilamida, poliuretano, alcohol polivinílico
El atrapamiento en una matriz de origen biológico como agar, geles de alginato o carragenano (Unemura y cols, 1984) se usa frecuentemente para las células enteras. Los principales inconvenientes de las matrices de origen biológico son su inestabilidad frente a los cambios de temperatura, pH, alteraciones del entorno iónico y también su baja estabilidad mecánica.
• Inmovilización por atrapamiento
Alginato Cálcico
OO O
COOHOH
OH
OO
COOH
OH
OH
8,7 Å Glucurónico-Glucurónico
O
O
OCOOH
HOOCOH
OO
HO
OHHO
10.3 Å
Manurónico-Manurónico
OOO
COH
OH
OO
C
OH
OH
Ca+2
O-O
O O-
O-O
O Cadena A
Cadena B
Cadena C
Carargeenanstructure
AGAR.- Ficocolide descrito en en Japon en 1658.
El agar es un ficocoloide formado por una heterogénea familia de polisacáridos (galactanas lineales), obtenido de las paredes celulares de las algas agarofitas, las cuales pertenecen a la Clase Rodofíceas.
Especie: Gelidium, Gelidiella, Pterocladia, Gracilaria, Ahnfeltia
Tanto en las algas carragenofitas como en las agarofitas se produce el un proceso enzimático de desulfatación, que en el caso de los carragenanostransforma el 6- sulfato de la D-galactosa en 3,6 anhidro-D-galactosa mientras en el agar se produce una transformación del 6- sulfato deL-galactosa en 3,6 anhidro-L-galactosa.
En la Industria, este proceso es reemplazado por una hidrólisis alcalinade sulfatos y que en el caso del agar es imprescindible para obtener agaresde Gracilaria de buena calidad.La presencia de unidades de 3-6 anhidro (D ó L) galactosa, tiene unadecisiva influencia en las características reológicas tanto del agar como de los carragenanos, y por tanto influye en gran medida en estos productos.
O
O
OH
CH2OH
OH
O
CH2OOH O
O
OH
CH2OH
OH
O
CH2OOHOO
O
Estructure of agarose
OCH2OHHO
OOH
OO
O
OH O
OCH2HO
OOH
OO
O
OH O
O
O
OHH3CO
HOH2C OH
OCH2O
OOH
OO
O
OH O
O
CH3
HOH2C
OCH2OCH3
O2SO
OOH
OO
O
OH O
OCH2OH
HO
OOH
OO
OHCH2OH
OH
OCH2OHHO
OOH
OO
OHCH2OS2
OH
O
O
OCH2OMeHO
OOH
OO
O
OH O
OCH2OHHO
OOH
OO
O
OMe O
OO2SO
OOH
OO
O
OMe O
CH2OH
OO2SO
OOH
OO
O
OH O
CH2OH
OO2SO
OOH
OO
O
OH O
CH2OSO3
(1)
(3)
(5)
(8)
(10)
(2)
(4)
(6)
(7)
(9)
(11)
Gelificación de la agarosa
S. marcenses in agar from Pterocladia
In table 2 we compare the catalytic activity of some immobilized bacteria - N-2’-deoxyribisyltransferase producers- in the synthesis of 2’-deoxyadenosine from 2’-deoxyuroidine and adenine (Fernandez-Lucas et al. 2007). The cells - harvested in stationary growing conditions – were entrapped in different matrixes. Calcium pectate and calcium alginate were the most interesting matrixes for immobilization.
The first matrix produced softer microbeads than calcium alginate. This affirmation is explained by the low temperature scanning microscopy microphotographs of B. coagulans immobilized in calcium alginate and in calcium pectate (Figure 4) that show a more rigid structure for the calcium alginate matrix than for calcium pectate matrix.
Table 3.- Internal and external mass transference parameters. Conditions:[Adenine] = [2’-deoxyuridine] =5 mM, T=57 ºC.
v0(mM min-1)
Ωa ηib φc Φd DAc * 107
(cm2 s-1)e
Bacillus coagulansFree cellsImmobilizedCalcium alginate Calcium pectate
0.1820.0820.100
0.05940.041
0.450.54
1.81.5
1.461.21
8.319.1
B. psychrosaccharolyticusFree cellsImmobilized Calcium alginate Calcium pectate
0.2340.0440.099
0.0320.041
0.190.42
6.31.9
7.411.52
0.887.7
Lactobacillus spFree cellsImmobilizedCalcium alginate
0.0770.047
0.034 0.61 1.3 1.03 6.4
Psychrobacter immobilisFree cellsImmobilizedCalcium alginateCalcium pectate
0.1430.0470.140
0.0320.058
0.330.97
2.70.28
2.410.08
2.8420
a Observable Ω module for external mass transferb Internal effectiveness factor ηi = v0, obs /v*0 : v0, obs the reaction rate for the immobilized biocatalysts, v*o the reaction rate for free cells c Thiele module; d Weisz module ; e Effectiveness diffusivity
M. kaoliang libre e Inmovilizada en Agar
0123456789
10
0 20 40 60 80 100 120 140
h
cicl
ohex
anol
[ m
M ]
Libre Agar 2,5 % Agar 3,75 %
Comparación de la actividad de la actividad de M. kaoliang libre e inmovilizada en agar en la reducción de ciclohexanona. Crecimiento del hongo 7 días.[ciclohexanona]=10mM, T=28ºC; 200rpm., V= 100ml tampón fosfato pH 6,5
O OH
G. candidun in agarose
OO O
O2 + NADPH/H+
H2O + NADP+
Tabla IV.9. Velocidades iniciales de reacción de la cepa de G. candidumlibre e inmovilizada en diferentes soportes. Monooxigenación de la ciclopentanona 5.0mM, 36ºC
Catalizador Vo (mmoles/ml.h)a
Células libres 1,27
Células libres 2º Ciclo 0,71
Inmov. Agar A28/03 1,27
Inmov. Agar A28/03 2º Ciclo 1,17
Inmov. Agar A27/03 1,31
Inmov. Agar A27/03 2º Ciclo 1,13
Inmov. Agar A-90 1,10
Inmov. Agar A-90 2º Ciclo 0,83
Inmov. Agarosa D5 0,82
Inmov. Agarosa D5 2º Ciclo 0,35a error de replicación < 10%
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
Tiempo en horas
Con
ersi
ón (%
)
(1R)-furil-etanol/P.tannophilus (1R)-furil-etanol/W. californica
(1S)-furil-etanol/P.tannophilus (1S)-furil-etanol/W. californica
•Oxidación del (1R)-(2-furil)-etanol y el (1S)-(2-furil)-etanol empleando las cepas W. californica y P. tannophilus inmovilizadas en agar 28/03 al 2%. La reacción se llevó a cabo utilizando concentraciones de sustrato de 2.5 mM. Temperatura de reacción 28ºC. Agitación 100 rpm. García Burgos C, Quezada A. & Sinisterra J.V.
OCH3
OH
OCH3
OH
OCH3
O
R S
(1R)-1-(2-furil)-etanol (1S)-1-(2-furil)-etanol2-Acetilfurano
Williopsips californica in agarose from Pterocladia
Not used 1000inc reused 5 times 2000inc
M. kaoliang (libre)
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35 40
h
cicl
ohex
anol
[mM
]
1º ciclo 2º ciclo 3º ciclo 5º ciclo 7º ciclo
Reutilización de las hifas de M. kaoliang
M. kaoliang libre e Inmovilizada en Agar
0123456789
10
0 20 40 60 80 100 120 140
h
cicl
ohex
anol
[ m
M ]
Libre Agar 2,5 % Agar 3,75 %
M. Kaoliang inmovilizado en agar
M. Kaoliang inmovilizado en espumas de poliuretano
Influencia de la Inmovilización de M. kaoliang
0123456789
10
0 20 40 60 80 100 120 140
horas
cicl
ohex
anol
[ m
M ]
Libre agar 2,5% agar 3,75% espuma poliuretano
La inmovilización con Resina Lewatit y Poliacrilamida fue deficiente.
Tind Xmax Tmax W cat Prod. x 102
h % h g mM / (h-1. g cat)
Libre 0 90 22 6,89 5,90
Agar A27/03 2,5 % 2 84 113 64,09 0,12
Agar A27/03 3,75 % 4 79 93 63,24 0,13
Espuma glu (0,5 %) 0 94 21 23,86 1,90
Microfotografías de M. kaoliang inmovilizado en espumas
Influencia del Proceso de Inmovilización de M. kaoliang
Difusión Ciclohexanona en Pterocladia 3,75 %
0123456789
10
0 20 40 60 80 100 120 140
t ( min )C
once
ntra
ción
mM
Difusión Ciclohexanona en Pterocladia 2,5 %
0123456789
10
0 20 40 60 80 100 120 140
t ( min )
Conc
entra
ción
mM
Difusión de Ciclohexanona en Espumas de poliuretano
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0 20 40 60 80 100 120
min
Con
cent
raci
ón m
M
kssustrato Soportecm / min
agar 3,75% 0,01395ciclohexanona agar 2,5% 0,01915
Espuma 0,03444agar 3,75% 0,00998
ciclohexanol agar 2,5% 0,01888Espuma 0,03372
Ensayos de Difusión
Reutilizaciones de D. grovesii en diferentes soportes
0102030405060708090
100
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º
11º
12º
13º
14º
15º
16º
17º
18º
19º
20º
21º
ciclos
conv
ersi
on a
cic
lohe
xano
l (%
)
agar 2,5% agar 3,75% espuma de poliuretano
Reutilizaciones de M. kaoliang inmovilizada en espumas con diferentes cosustratos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º 13º 14º 15º 16º 17º
ciclos
conv
ersi
ón e
n ci
cloh
exan
ol (
% )
Espuma (glu- 0,5%) Espuma (sac- 0,5%) Espuma (isop-0,5%)
Desactivación con isopropanol 1%
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
horas
a / a
o
Desactivación con glucosa 1%
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0 500 1000 1500 2000 2500
horas
a / a
o
Desactivación de Biocatalizadores de células enteras
Desmoronamiento de la red que forma el hongo dentro de la espuma