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INHIBICIÓN IN SITU DE LA ADHESIÓN DE

Pasteurella multocida A RECEPTORES DEL

EPITELIO RESPIRATORIO DE CONEJOS POR

MEDIO DE LECTINAS

Magda Patricia Carrillo Lamus

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Bogotá D.C., Colombia

2011

INHIBICIÓN IN SITU DE LA ADHESIÓN DE

Pasteurella multocida A RECEPTORES DEL

EPITELIO RESPIRATORIO DE CONEJOS POR

MEDIO DE LECTINAS

Magda Patricia Carrillo Lamus

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en Salud Animal

Director:

D.M.V., ESP., D.V.M. Carlos Arturo Iregui Castro

Línea de Investigación:

Fisiopatología Veterinaria

Grupo de Investigación:

Patobiología Veterinaria

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Bogotá D.C., Colombia

2011

IV Inhibición in situ de la adhesión de Pasteurella multocida a receptores del epitelio

respiratorio de conejos por medio de lectinas

A quienes quisieron hacerme desistir

porque me enseñaron mucho sobre mí,

principalmente lo ecuánime y perseverante que

puedo ser. A quienes estuvieron junto a mí en el

momento preciso y a mis padres.

Resumen y Abstract VII

Resumen

Pasteurella multocida utiliza como paso previo a la infección adhesinas con propiedad de

lectinas y carbohidratos sobre su superficie que reconocer carbohidratos y lectinas

respectivamente sobre el epitelio respiratorio de sus hospederos. En este trabajo se

evaluó la capacidad de 18 lectinas de evitar la unión de la bacteria al epitelio y

presentación de lesiones como consecuencia de la acción de la bacteria sobre el tejido,

esto se hizo en dos experimentos diferentes, bloqueo e inhibición de la adhesión de P.

multocida a septos nasales de fetos de conejo previa incubación con cada lectina de

forma independiente sobre el epitelio (EL) y sobre la bacteria (PmL). Los resultados

demostraron que el epitelio posee cantidades representativas de D-manosa, D-glucosa,

N-acetil-D-galactosamina que son reconocidos por la bacteria y así mismo sobre la

superficie bacteria existen residuos de D- manosa, D-glucosa, N-acetil-D-glucosamina,

N-acetil-D-galactosamina probablemente ubicados en la capsula o en la cadena O del

LPS.

PALABRAS CLAVE: Pasteurella multocida, lectinas, inhibición, adhesión,

epitelio respiratorio

VIII Inhibición in situ de la adhesión de Pasteurella multocida a receptores del epitelio


Abstract

Pasteurella multocida uses adhesins on it’s surface, with lectin and carbohydrates

characteristics, as a step forward to infection. These adhesins recognize lectins

and carbohydrates respectively on the host respiratory epithelium. This study

evaluated the capacity of 18 lectins to avoid, the adhesion of bacteria to the

epithelium and the later appearance of lesions, these results show that the

epithelium has representative amounts of D-mannose, D-glucose and N-acetyl- D-

galactosamine that are recognized by the bacteria, and at the same time this

determines that on the bacterial surface D-mannose, D-glucose and N-acetyl- D-

galactosamine can be found and are probably located on the capsule or on the O-

chain of the LPS.

Keywords: Pasteurella multocida, lectinas, inhibición, adhesión, epitelio

respiratorio

Contenido IX

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ VII

Lista de figuras ............................................................................................................... XI

Lista de tablas .............................................................................................................. XIII

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Utilización de lectinas en la inhibición de la adhesión de bacterias patógenas .. 3 1.1 Pasteurella multocida....................................................................................... 3 1.2 Lectinas ........................................................................................................... 4 1.3 Terapia anti-adhesiva ...................................................................................... 8

2. Inhibición in situ de la adhesión de Pasteurella multocida a receptores del epitelio respiratorio de conejos por medio de lectinas .............................................. 11

2.1 Materiales y Métodos ..................................................................................... 11 2.1.1 Cepas de Pasteurella multocida y condiciones de crecimiento ............ 11 2.1.2 Lectinas............................................................................................... 11 2.1.3 Cultivo in vitro (explantes) de septo nasal de fetos conejo .................. 12 2.1.4 Evaluación del efecto inhibitorio de lectinas sobre la adherencia de P. multocida a explantes de septos nasales de fetos de conejo ............................ 13 2.1.5 Procesamiento de los tejidos ............................................................... 15 2.1.6 Evaluación de los tejidos ..................................................................... 16 2.1.7 Metodología Estadística ...................................................................... 17

2.2 Resultados ..................................................................................................... 18 2.2.1 Inmunoperoxidasa Indirecta (IPI) ........................................................ 18 2.2.2 Técnica de cortes semidelgados ......................................................... 20

2.3 Discusión ....................................................................................................... 27

3. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 31

A. ANEXO: Resultados estadísticos IPI – EL ............................................................ 33

B. ANEXO: Resultados estadísticos IPI – PmL ......................................................... 34

C. ANEXO: Resultados Estadísticos - Muerte Celular – EL ..................................... 35

D. ANEXO: Resultados Estadísticos - Muerte Celular – PmL .................................. 36

E. ANEXO: Resultados Estadísticos - Vacuolización Intracitoplasmática – EL ..... 37

X Inhibición in situ de la adhesión de Pasteurella multocida a receptores del

epitelio respiratorio de conejos por medio de lectinas

F. ANEXO: Resultados Estadísticos – Vacuolización Intracitoplasmática .............38

G. ANEXO: Resultados Estadísticos- Aumento de Espacios Intercelulares – EL ...39

H. ANEXO: Resultados Estadísticos - Aumento de Espacios Intercelulares – PmL40

I. ANEXO: Resultados Estadísticos - Aumento en la Actividad de CC – EL ..........41

J. ANEXO: Resultados Estadísticos - Aumento en la Actividad de CC – PmL .......42

Bibliografía .....................................................................................................................43

Contenido XI

Lista de figuras

Pág. Figura 1-1: Evasión de los mecanismos de defensa utilizados por el organismo

hospedero (efecto mucociliar o movimiento gastrointestinal), por parte de las bacterias

patógenas. 7

Figura 1-2: Receptores glicosídicos y lectinas en la bacteria y en el tejido que hacen

parte de la adhesión bacteriana. ...................................................................................... 7

Figura 2-1: Experimento EL. Inhibición de la adhesión de la P. multocida por bloqueo

de receptores CHOs sobre el epitelio respiratorio con lectinas. ..................................... 13

Figura 2-2: Experimento PmL. Inhibición de la adhesión de la P. multocida por

bloqueo de CHOs con propiedades ligando con lectinas incubadas con la bacteria previa

adición al cultivo tisular. .................................................................................................. 14

Figura 2-3: Experimento EL. Epitelio respiratorio de septos nasales de fetos de

conejos expuestos a las diferentes lectinas y a P. multocida. A. Control negativo. B.

Tejido preincubado con PNA, inmunomarcación focalizada. C. Tejido preincubado con

VVA, inmunomarcación multifocal. D. C +, inmunomarcación severa generalizada. Tejido

incubado con P. multocida sin lectinas. Inmunomarcación generalizada. IPI. 400X aprox.

18

Figura 2-4: Comparación de los porcentajes de adhesión de la bacteria al borde

ciliado en el experimento EL vs. el tejido expuesto solo a P. multocida - C+. IPI ............ 19

Figura 2-5: Comparación de los porcentajes de la adhesión de bacteria al borde

ciliado para el experimento PmL vs. el tejido expuesto solo a P. multocida C +. IPI.. ..... 20

Figura 2-6: Epitelio de septo nasal de fetos de conejos expuesto a diferentes lectinas

y a P. multocida. A. Epitelio normal, C (-) 400X aprox. B. Epitelio incubado con P.

multocida sin lectina, célula muerta (cabeza de flecha); aumento de los espacios

interepiteliales (flecha). C. Tejido preincubado con PSA antes de la inoculación con P.

multocida, célula muerta (cabeza de flecha). D. tejidos incubados solo con bacteria sin

lectinas C (+), bacterias adheridas a las cilias del epitelio (flecha). Azul de Toluidina.

1000X aprox. Experimento EL ........................................................................................ 21

Figura 2-7: Comparación de los porcentajes de células muertas para cada uno de los

tratamientos EL. Prueba de Dunett. ............................................................................... 21

Figura 2-8: Comparación de porcentajes de células con vacuolas intracitoplasmáticas

para cada uno de los tratamientos vs. el C+. EL. Azul de Toluidina. Prueba de Dunett. . 22

Figura 2-9: Comparación porcentajes de células con aumento de espacios

interepiteliales para cada una de las lectinas - EL. Azul de Toluidina. Prueba de Dunett.

22

XII Inhibición in situ de la adhesión de Pasteurella multocida a receptores del


Figura 2-10: Comparación porcentajes de células con aumento de espacios

interepiteliales para cada una de las lectinas - PmL. Azul de Toluidina. ......................... 23

Figura 2-11: Epitelio respiratorio de septo nasal de fetos de conejos expuesto a

diferentes lectinas y a P. multocida. A. Tejido preincubado con LEL, más del 90% del

área del epitelio en la figura son CC pletóricas con su contenido, aun permanecen

algunas células ciliadas (cabeza de flecha) 400X aprox. B. C (+), severo acumulo de

contenido dentro de las CC con incipiente liberación del mismo. También se aprecian

algunas células ciliadas. EL. .Azul de Toluidina. 1000X aprox. ....................................... 24

Figura 2-12: Comparación de los porcentajes de aumentó de la actividad de las CC en

cada uno de los tejidos expuestos a las diferentes lectinas – EL. Azul de Toluidina.

Prueba de Dunett. ........................................................................................................... 24

Figura 2-13: Efecto de los tratamientos con las distintas lectinas sobre la actividad de

CC – PmL. Azul de Toluidina. Kruskas-Wallis................................................................. 25

Figura 2-14: Comparación de la inhibición de la adhesión de P. multocida y de la

agregación de todas las lesiones en los tejidos tratados con lectinas frente a igual

agregación para C+. IPI y azul de Toluidina, respectivamente. Recuadro blanco -

Tratamientos que mostraron menor inmunomarcación y cantidad de lesiones – EL ....... 26

Figura 2-15: Comparación de la inhibición de la adhesión de P. multocida y de la

agregación de todas las lesiones en los tejidos tratados con lectinas frente a igual

agregación para C+. IPI y azul de Toluidina, respectivamente. Recuadro blanco. -

Tratamientos que mostraron menor inmunomarcación y cantidad de lesiones - PmL .... 27

Contenido XIII

Lista de tablas

Pág. Tabla 2-1: Lectinas, Procedencia y su Especificidad por Carbohidratos (Tomado de

Slifkin and Doyle, 1990 y Sharon and Lis, 2003) ............................................................ 12

Tabla 2-2: Experimento EL. Evaluación de la inhibición de la adhesión de Pasteurella

multocida a explantes de septo nasal de conejo previo tratamiento del epitelio con

lectinas 14

Tabla 2-3: Experimento PmL. Evaluación de la inhibición de la adhesión de Pasteurella

multocida a explantes de septo nasal de conejo previo tratamiento de la bacteria con

lectinas 15

Introducción

La adhesión microbiana previa a la colonización es un paso imprescindible en el proceso de infección en sentido estricto y de invasión de un patógeno a su hospedero; tal adhesión contribuye, además, a la sobrevivencia y evasión frente a los mecanismos de defensa tanto mecánicos como inmunológicos que ofrece el organismo hospedero, para luego, una vez a salvo, desplegar sus estrategias ofensivas (Glorioso et al., 1982; Nakai et al., 1988; Bonilla y García, 1993; Al-Haddawi et al., 2000; Haltfaludi et al., 2010). Dentro del conjunto de estructuras que median la unión hospedero-patógeno se encuentran las lectinas, definidas como proteínas de origen no inmune que reconocen de forma específica receptores glicosídicos y forman con estos una unión selectiva; este grupo de sustancias se ha demostrado para muchos agentes patógenos como virus y bacterias, para algunas de las últimas la adhesión esta mediada por lectinas de superficie, organelos en forma de multisubunidades submicroscópicas llamadas pilis o fimbrias, también se reporta la importancia del lipopolisacárido en la interacción carbohidrato-lectina (Pugin et al., 1993; Pruimboom et al., 1999; Caroff et al., 2002; Ofek et al., 2002; Hatfaludi et al., 2010), mientras que se ha cuestionado el papel de la capsula en la adhesión y más bien tendría un papel en la evasión de la fagocitosis (Chung et al., 2001; Al-haj Ali et al., 2004)

De otra parte, el constante incremento de la resistencia bacteriana a los medicamentos antibacteriales hace imperativa la búsqueda de nuevas alternativas que impidan las infecciones por estos microorganismos, una de tales alternativas se encuentra en el uso de sustancias que, en contraste con los antibacterianos, su fin no sea la destrucción de estos agentes sino que interfieran con su primer paso de patogenicidad, cual es la adhesión a las células del hospedero, esto, tal vez, disminuya la presión evolutiva hacia formas más agresivas de los estos patógenos, un fenómeno afín a esta concepción ha sido ilustrado para Escherichia coli K99 causante de diarrea en lechones (Sharon and Lis 2000); por lo general letal, su adhesión y posterior infección puede prevenirse con la utilización de azúcares, similares resultados se han obtenido para Helicobater pylori y E. coli uropatogénica mediante la utilización de jugo de arándano agrio (Rhodes and Milton, 1998; Ofek et al., 2002; Sharon and Lis, 2003; Sharon, 2007)

En el caso de Pasteurella multocida a pesar de hacer parte de la flora “normal” del tracto respiratorio alto de varias especies animales, son capaces de causar enfermedad en una amplia variedad de ellas entre las que se cuentan los bovinos, porcinos, aves, caninos, animales de laboratorio y conejos, para los que reportan importantes pérdidas económicas (Harper et al., 2006; Hatfalufi, 2010). De otro lado, por mecanismos aún no completamente entendidos pasan estos microorganismos de ser habitantes inocuos en sus hospederos a causar enfermedad y, como en el caso de otros patógenos, a pesar de los esfuerzos por obtener sustancias eficaces de protección, frecuentemente se reportan

2 Introducción

los escasos resultados que tienen las vacunas y los antibióticos contra estos agentes infecciosos (Suckow et al., 2008; Kumarasamy et al., 2010; Önat et al., 2010). Para P. multocida se reportan estructuras con propiedades de lectinas como las fimbrias, las cuales reconocen receptores carbohidratos (CHO) sobre las células del epitelio respiratorio del hospedero, y a su vez éstas poseen ligandos glicosídicos que se asocian a lectinas propias de la mucosa respiratoria del hospedero. Sobre esta base, se dan las condiciones para la adhesión de la bacteria al epitelio del hospedero y con ella se favorece la expresión de una serie de factores de virulencia que finalmente desencadenan la enfermedad (Al-Haddawi et al., 2000, Harper et al., 2007; García, 2010; Hatfaludi et al., 2010). En varios estudios del tracto respiratorio alto de conejos afectados naturalmente por la enfermedad con P. multocida así como en experimentos en cultivos de septo nasal de la misma especie expuestos a esta bacteria, se demostró la inducción de una conjunto de lesiones en la fosa nasal entre las que se sobresalen: muerte celular, vacuolización intracitoplasmática, aumento del tamaño y/o número de los espacios entre las células epiteliales y aumento de la actividad de las células caliciformes (CC) (Botero e Iregui, a y b 1999; Doncel 2004; Esquinas 2006; Guttman et al., 2006; McClenahan et al., 2009).

Con base en los anteriores resultados se propuso esta investigación cuyo objetivo principal fue identificar una o más lectinas capaces de bloquear por competencia la unión de la P. multocida a las células del epitelio respiratorio de septo nasal de conejo, y como consecuencia de este bloqueo impedir la presentación de las lesiones antes descritas.

1. Utilización de lectinas en la inhibición de la adhesión de bacterias patógenas

1.1 Pasteurella multocida

P. multocida hace parte la flora normal de muchas especies animales y ha sido objeto de estudios desde 1880 cuando Louis Pasteur la reconoció como agente causal de enfermedades fatales en aves de corral, hoy en día se le involucra en enfermedades que afectan una amplia cantidad de especies animales, pero también forma parte de la flora orofaríngea normal de dichas especies (Davies et a., 1994; Cohen et al., 2002; Boyce et al., 2004; Dziva et al., 2004; Harper et al., 2006; Hatfaludi et al., 2010).

Este microorganismo es un cocobacilo bipolar, no motil, Gram (-), 0,3 - 1,0 µm de ancho y 1,0 - 2,0 µm de largo, oxidasa y catalasa positivos, no hemolítico. Se han descrito 5 tipos capsulares (A, B, D, E y F) y 16 serotipos somáticos (Frost et al., 2000; Boyce et al., 2000; Boyce et al., 2004). Los distintos tipos de P. multocida se asocian con enfermedades específicas en diferentes especies animales; así la rinitis atrófica de los cerdos se relaciona con los serotipos A y D; la septicemia hemorrágica en bovinos con B:2; B:2,5; E:2 y E:2,5; el cólera aviar con A, F y eventualmente D y el complejo respiratorio de los conejos: con los serotipos A:3 y A:12 (DiGiacomo et al, 1990; Borkowska-Opaka et al., 1995; Mogollón y Valenzuela., 1995; Kawamoto et al., 1997; Boyce et al, 2004).

Se han descrito varios factores de virulencia para las distintas P. multocida, entre los más relevantes se cuentan el lipopolisacárido (LPS) y la capsula que para el caso de las cepas pertenecientes al grupo A está compuesta por ácido hialurónico que es un polímero de ácido D-glucuronico y N-acety-D-glucosamina (Boyce et al., 2000, Townsend et al., 2001; Boyce et al., 2004). Se han descrito también proteínas como la proteína de membrana externa ligadora del hierro, proteasa, neuraminidasa y la porina; además el más recientemente propuesto sistema de metilación de la adenina (Chen et al., 2003; Boyce et al, 2004; Hatfaludi et al., 2010). En algunos serotipos como él A y D se sabe que producen una toxina denominada toxina P. multocida (PMT); esta es una proteína citotóxica de 146 kDa que actúa a través de un complejo de vías de señalización intracelular y estimula la formación de rearreglos del citoesqueleto. En conejos la PMT purificada tiene la capacidad de iniciar neumonía aunque aún no se conoce su papel específico en la enfermedad natural (Boyce et al., 2004; Hatafaludi et al., 2010).

4 Inhibición in situ de la adhesión de Pasteurella multocida a receptores del epitelio


La cápsula le provee a P. multocida, resistencia a la desecación, actividad antifagocítica, protección contra la actividad antibacteriana del complemento y actúa como receptor sobre la bacteria de lectinas ubicadas sobre las células del hospedero mecanismo que contribuye en la adhesión previa a la infección (Boyce et al., 2000). Para la membrana externa se han descrito diferentes proteínas (OMP) que actúan como una barrera selectiva que previene el ingreso de moléculas tóxicas para la bacteria cruciales en la supervivencia de esta en medioambientes adversos y a su vez contribuyen en la captación de nutrientes, transporte de moléculas dentro y fuera, e interacción con los tejidos del hospedero (Confer et al., 2001; Bosch et al., 2002; Balkovetz and Katz, 2003; Hatafaludi et al., 2010)

Los análisis de la secuencia genómica de la cepa PM70 de P. multocida han identificado un grupo de genes que codifican para una serie de proteínas involucradas en la adhesión de las bacterias al hospedero, entre aquellos se encuentran los genes que codifican para la hemaglutinina filamentosa PfbH1 y PfhB2 y las subunidades fimbriales PtfA, FimA, Fip_1 y FIp_2 y los genes que codifican para las proteínas estructurales de las fimbrias de superficie Hsf_1 y Hsf_2, a los que se les reconoce la importancia en la adhesión de este patógeno al hospedero (Boyce et al, 2004; Hatafaludi et al., 2010)

Para el control de las infecciones producidas por P. multocida se han utilizado vacunas (bacterinas), su eficacia es discutible; en algunos casos vacunas vivas se ha comprobado que son capaces de causar enfermedad clínica (Rimler et al, 1979; Verma and Jaiswat, 1998; Chung et al., 2005) y tanto la ineficacia como el desarrollo de resistencia a los antibióticos es ampliamente conocida (Dowling et al., 2004; Kumarasamy et al., 2010).

En otra vía, la patogénesis de la infección por P. multocida en el nivel molecular es poco entendida; sin embargo, es claro que además de los factores arriba comentados, sobre la bacteria existen sustancias proteicas denominadas lectinas que poseen la capacidad de reconocer carbohidratos (CHO) sobre la superficie de las células del hospedero, y a su vez sobre el epitelio existen lectinas que son reconocidas por los residuos CHOs expuestos en la superficie bacteriana, que le permiten adherirse y evadir las líneas de defensa del hospedero (Paustian et al, 2001; Boyce et al 2002)

1.2 Lectinas

Las lectinas se definen como proteínas de origen no inmune que tiene especificidad por residuos carbohidratos, monosacáridos, glicoproteínas o glicolípidos terminales o subterminales, con los que forman uniones no covalentes selectivas y reversibles, característica que le confiere propiedad de reconocer, aglutinar células o precipitar

Capítulo 1 5

glicoconjugados (Perfumo, 1998; Barbeito et al., 1990; Peacock et al., 1990; Sharon et al, 2003). Son ubicuas en la naturaleza y se encuentran en todo tipo de organismos, desde bacterias y virus hasta plantas y vertebrados, son fáciles de detectar y a menudo de aislar y su papel es la base de numerosos procesos biológicos (Sharon et al., 2003).

El término lectina fue inicialmente propuesto por Boyd y Shapleighen en 1954 proveniente del verbo en latín "Legere" el cual significa discernir y se refiere a la marcada selectividad con la que las lectinas se unen a estructuras carbohidrato, también han sido denotadas con los nombres de hemaglutinina o fitohemaglutinina (Sharon and Lis 2003). Hoy en día la denominación más aceptada es la de lectina la cual fue inicialmente propuesta por Goldstein et al (1980) y adoptada por la nomenclatura del Comité de la Unión Internacional de Bioquímica (Rhodes and Milton 1998; Sharon and Lis 2003).

Las lectinas son diversas estructuralmente, difieren marcadamente en tamaño, estructura terciaria y cuaternaria y la estructura de los sitios de combinación llamados DRC (dominio de reconocimiento de carbohidratos), tienen la capacidad de unirse a ciertos azucares mediante interacciones moleculares no covalentes como fuerzas de van der Waals, puentes de hidrogeno, iónicas e interacciones electrostáticas. La unión entre la lectina y el carbohidrato ocurre por lo menos en dos puntos de cada molécula y es fundamental la disposición espacial del CRD, que forma una “bolsa” en la que ingresa el carbohidrato. A pesar de que cada lectina tiene predilección por un CHO específico puede tener un DRC secundario es decir reconocer en menor grado otros azucares; y en algunos casos, en la afinidad pueden contribuir los polisacáridos vecinos a estos últimos. Es común que lectinas con características muy diferentes reconozcan el mismo carbohidrato y que algunas lectinas semejantes tengan afinidad por distintos azucares. Las lectinas siempre tienen afinidad principal por un carbohidrato específico, pero pueden tener afinidad por otros residuos (Barondes, 1989; Barbeito et al., 1990; Rodes and Milton 1998; Sharon et al., 2003).

Las funciones de las lectinas son diversas pero en su mayoría son de reconocimiento, de adhesión de células o sustancias que incluyen síntesis enzimática, degradación de oligo y polisacáridos, transporte de carbohidratos, respuesta inmunológica a antígenos carbohidratos y migración de leucocitos a sitios de inflamación (Spicer et al., 1981; Sharon, 2008). En el caso de las interacciones bacterianas las más importantes son las que son irreversibles y esto le permite ser más resistente a la acción mecánica de defensa del organismo, son interacciones altamente específicas donde la bacteria se une solamente a un sustrato que posee un tipo de receptor CHO específico, un ejemplo clásico es la adhesión entre una lectina bacteriana como la fimbria tipo IV presente en Pasteurella multocida y el carbohidrato específico, manosa, sobre la superficie del hospedero, en este caso solo las bacterias que poseen una lectina que reconozca este carbohidrato en particular podrá adherirse al epitelio del hospedero (Corredor, 1990; Patchett et al., 1991; Rhodes and Milton, 1998; Jack and Turner, 2003; Sharon and Lis, 2003)



Las fimbrias son multisubunidades submicroscópicas también llamadas pilis, que diferencian carbohidratos específicos. Esta característica ha sido repetidamente reportada en E. coli K99 que posee especificidad por el ácido N-glycolylneuraminico, lo cual es fundamental debido a que en la infección por este microorganismo en cerdos este sustancia se encuentra en las células intestinales de los animales recién nacidos y es remplazado por ácido N-acetylneuraminico en el proceso de crecimiento y desarrollo del animal, y es por esto que este patógeno lo reconoce y causa diarrea a menudo fatal en lechones pero no en animales adultos (Ofek and Sharon, 2002, Hatfaludi et al., 2010)

En la práctica clínica y de laboratorio las lectinas son utilizadas de diversas formas como la identificación de tipos celulares particulares como es el caso de células neoplásicas, diferenciación de tipos sanguíneos o en el estudio de la función específica de linfocitos de acuerdo a la expresión de carbohidratos en su superficie; también se las emplea en la identificación de microorganismos y en la terapia antiadhesión contra ellos (Pistole, 1981; Danguy et al., 1988; Sharon and Lis, 2003; Sharon, 2007).

La mayoría de las enfermedades infecciosas inician con la adhesión de un organismo patógeno a las células de la mucosa del hospedero. La adhesión es requerida para evitar el lavado y desalojo de los patógenos por los mecanismos fisiológicos característicos del tejido involucrado como por ejemplo el movimiento permanente del tracto gastrointestinal o la acción mucociliar del tracto respiratorio (Figura 1.1). Este contacto también le permite a los patógenos un mejor acceso a los recursos nutricios, facilita la liberación de toxinas en el hospedero y la eventual penetración del patógeno a los tejidos. En muchos casos, la unión es mediada por lectinas presentes en la superficie de los microorganismos que se unen a glicoproteínas o glicolípidos en la superficie de los tejidos del hospedero como es el caso de los apéndices filamentosos largos y cortos reconocidos como pilis o fimbrias que protruyen desde la superficie de los microorganismos (Figura 1.2) (Ofek and Doyle, 1994; Ruffolo et al., 1997; Chiu et al., 2001; Acord et al., 2005); la especificidad de las lectinas es seguramente uno de los factores determinantes que no solo reconoce qué especie colonizar sino que además determina cuándo debe iniciarse esta colonización y reside en lectinas de ambas superficies, la del hospedero y la de los patógenos, que reconocen glicoproteínas y glicolípidos particulares en la membrana de su contraparte (Sharon and Lis 2003; Acord et al., 2005)

Capítulo 1 7

Figura 1-1: Evasión de los mecanismos de defensa utilizados por el organismo hospedero (efecto mucociliar o movimiento gastrointestinal), por parte de las bacterias patógenas.

Figura 1-2: Receptores glicosídicos y lectinas en la bacteria y en el tejido que hacen parte de la adhesión bacteriana.

El caso de Pasteurella multocida no es diferente. Glorioso et al (1981) estudiaron la adhesión de P. multocida en monocapas de cultivos de células HeLa y células paraqueratóticas faríngeas donde el hallazgo más representativo fue la inhibición de la



adhesión de la bacteria a los dos tipos celulares con N-acetyl-D-glucosamina, lo que sugiere que existen receptores tipo lectinas sobre ambas superficies epiteliales que actúan como mediadores de la unión bacteriana a las células del hospedero, este papel se le atribuye en buena medida a las fimbrias que cuando están presentes en determinadas cepas se observa un elevado patrón de adhesión y la ausencia de las mismas en la misma cepa muestra poca o ninguna adhesividad (Ruffolo et al., 1997); este hallazgo es consecuente con lo descrito por Al-Haddawi et al (2000) donde explican cómo la fimbria reconoce a la N-acetyl-D-glucosamina presente en las cilias del epitelio respiratorio y a su vez reitera que con la utilización de N-acetyl-D-glucosamina es posible bloquear por competencia tal unión (fimbria-CHO). Por otra parte, el ácido hialurónico presente en el serotipo capsular A es posible que contribuya a la unión en este caso actuando como receptor de lectinas ubicadas sobre el epitelio, aunque para la P. multocida contribuiría más a la evasión a los mecanismos del sistema inmune (Pistole, 1981; Jacques et al., 1987; Payne et al., 1992). Jacques et al (1998) y Hatfaludi et al. (2010) sostienen que a pesar de que P. multocida posee diferentes estructuras que contribuyen a la unión a las células del epitelio respiratorio, el LPS y la fimbria tipo IV serian los principales mediadores de dicha adhesión actuando como receptor CHO y lectina respectivamente. Estudios con P. multocida A:3 aislada de conejos enfermos encontraron que la disminución del material capsular y la presencia de la fimbria incrementaron la adhesión de la bacteria a la tráquea (Ruffolo et al. 1997; Al-Haddawi et al 2000).

Las lectinas fimbriales de superficie son estructuras submicroscópicas elongadas relativamente rígidas, filamentos (0,2-20 nm de largo), constituidos por cientos de subunidades proteicas hetero-oligoméricas, estas estructuras multiplican las posibilidades de interacción con los receptores de superficie de los hospederos y permiten una fuerte adhesión; por ejemplo, E. coli con las fimbrias tipo 1 (lectina específica para manosa) o tipo P (lectina específica para galactosa) se adhieren a las células epiteliales en el tracto gastrointestinal y el tracto urinario y eluden la remoción como consecuencia de los fluidos como por ejemplo el flujo de la orina (Ofek and Doyle, 1994; Foo et al., 2000; Ofek et al 2002; Jack and Turner, 2003; Ofek et al 2003; Hatfaludi et al., 2010)

1.3 Terapia anti-adhesiva

Las vacunas contra adhesinas bacterianas tipo lectina han mostrado eficacia en bovinos y cerdos, por ejemplo, al inmunizar vacas con adhesinas fimbriales permite la producción de anticuerpos antifimbriales en la leche que permiten que los terneros adquieran resistencia a los problemas diarreicos. De otra parte, existe un incremento en la resistencia bacteriana a las drogas antimicrobianas y a la vacunación que obliga a la comunidad científica a investigar sobre nuevas alternativas terapéuticas (Ofek et a., 2003; Onat et al., 2010). Una alternativa a las anteriores aproximaciones para la prevención y el control de las infección de origen bacteriano que ha mostrado resultados prometedores es el uso de sustancias que interfieran con la habilidad de las bacterias de adherirse a los tejidos del hospedero que es un prerrequisito para la infección, más

Capítulo 1 9

específicamente, se implementado el uso de azucares con capacidad de interferir en la adhesión de estos microorganismos a través de sus ligandos con propiedades de lectinas a los CHOs de las membranas de las distintas superficies de sus hospederos (Cisar et al., 1997; Foo et al., 2000; Ofek and Sharon, 2002; Ofek et al 2003; Sharon 2007)

El proceso de adhesión no es tan simple como habitualmente se describe puesto que un mismo tipo bacteriano puede co-expresar más de un tipo de estructuras de adhesión y más de una lectina, aun mas, la expresión misma de las lectinas es dependiente de las condiciones de crecimiento en el micro-ambiente en el que se encuentre la bacteria (Foo et al., 2000; Ofek and Sharon 2002; Ofek et al 2003), Con todo, uno de los principales mecanismos de adhesión de que disponen las bacterias son sus constituyentes glicosídicos bien sea en forma de glicoproteínas como las lectinas o como azucares complejos, para P. multocida entre el 20 % y el 30% de todos los sus genes codifican para proteínas de membrana (OMP) y cerca del 50% del total de la masa de la membrana externa está compuesta por proteínas (Hatfaludi et al., 2010); por lo tanto, una inhibición de uno de los constituyentes más abundantes de la superficie adhesiva de este grupo de de patógenos seguramente se reflejara en cantidades menores de los adheridos y en consecuencia menores oportunidades de iniciar infección, colonización y enfermedad. La terapia anti-adhesiva con base en productos inocuos, en buena parte propios de los mismos microorganismos como los CHO, es una alternativa con diferentes ventajas frente a terapias un tanto más agresivas, para ello se utilizan productos naturales y por lo tanto biodegradables; inocuos para el hospedero, para los propios microorganismos y el ambiente; son muy económicos; de fácil consecución y no generan resistencia (Ofek and Doyle, 1994; Sharon and Ofek 2002; Ofek et al. 2003; Aronson et al., 2010)

Un ejemplo de actividad antiadhesiva natural son las secreciones mucosas presentes en todas las superficies epiteliales y en fluidos corporales de las distintas especies animales. El moco está compuesto por una mezcla de agua, iones, lípidos, proteínas y glicoproteínas denominadas mucinas, estas últimas son la mayor macromolécula constitutiva del moco epitelial y están fuertemente implicadas en la salud y enfermedad de estos tejidos, las mucinas en la mayoría de los epitelios animales son un grupo heterogéneo de glicoproteínas de superficie altamente glicosiladas, es decir sustituidas con oligosacáridos, entre el 50 y 90 % de peso molecular de las mucinas está compuesto por carbohidratos como N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glucosa y pequeñas cantidades de manosa, fucosa, arabinosa, glucosa, xilosa y galactosa, y a pesar de que debido a su composición se ha demostrado el papel de la mucina en la adhesión celular en la mayoría de los casos las mucinas tienen una fuerte actividad antiadherente (Shi et al., 2000; Bavington and Page, 2005). Existen excelentes ejemplos evolutivos que ilustran claramente la extensión y los beneficios derivados de esta forma de defensa; así, algunos organismos acuáticos secretan mucinas, carbohidratos antiadhesivos y lectinas que reducen el potencial adhesivo de microorganismos patógenos como la Pseudomona fluorescens (Bavington and Page, 2005), también lo ilustra muy bien el componente sulfatado en el moco de la mucosa gástrica que inhibe la adhesión del Helicobacter pylori, a menos que los componentes del moco se alteren durante la inflamación (Foo et al., 2000; Ofek et al 2002; Ofek et al 2003).



Un ejemplo clásico de eficacia de la terapia antiadherente a través de CHOs (cuyos constituyentes principales son taninos condensados o proantocianidinas) de origen natural lo compone el uso del jugo de arándano (Vaccinium sp.), utilizado en el tratamiento de infecciones urinarias recurrentes por Escherichia coli en el humano, y este CHO al igual que proteínas provenientes de la leche de vaca también disminuyen la adhesión de Streptococcus mutans principal causante de las caries dentales (Kahn et al., 1967; Weiss et al.,1998; Foo et al., 2000; Ofek and Sharon 2002; Ofek et al 2003; Halpìn et al., 2008)

La terapia anti-adhesión también tiene algunas limitaciones, y esto se debe a que existen muchos genes en los microorganismos que codifican para diferentes adhesinas dato que indica que se necesita una mezcla de agentes anti-adhesión para dar unos resultados efectivos, también es importante recordar que la bacteria es un organismo dinámico que expresa diferentes adhesinas en las distintas etapas de su proceso infeccioso, lo anterior puede conducir a que la bacteria se adapte al nuevo medioambiente por mutaciones o transferencia de material genético, por consiguiente, como ocurre con los antibióticos, puede darse un cambio en la bacteria que le permita desarrollar resistencia a los agente antiadhesión, sin embargo, si esto sucede seguramente será un mecanismo que se desarrolle de una manera mucho más lenta que con los antibacterianos debido a que los agentes que son utilizados no son bactericidas, y la propagación y distribución de las cepas resistentes es mucho menor a la que ocurre ante sustancias antibióticas (Foo et al., 2000; Ofek et al 2002; Ofek and Sharon, 2002; Ofek et al 2003)

2. Inhibición in situ de la adhesión de Pasteurella multocida a receptores del epitelio respiratorio de conejos por medio de lectinas

2.1 Materiales y Métodos

2.1.1 Cepas de Pasteurella multocida y condiciones de crecimiento

La cepa de P. multocida utilizada se obtuvo de cornetes, tráquea y pulmón de conejos enfermos naturalmente con signos de rinitis y bronconeumonía. Para su caracterización se hicieron pruebas microbiológicas de rutina, PCR – con primers que amplifican el gen hyaC del locus cap, que codifica para el ácido hialurónico de la cápsula tipo A (GenBank número de acceso AF067175) (Townsend et al., 2001) y secuenciación molecular de su ADN. La bacteria permaneció en crioviales a -70oC hasta el momento de los experimentos.

Para estimular la virulencia de P. multocida, esta fue inoculada vía intraperitoneal en ratones, después de los primeros signos de enfermedad los animales se sometieron a eutanasia y la bacteria se reaisló a partir de corazón, hígado, pulmón y tráquea. Se sembró de forma masiva en cajas de petri con agar BHI y se incubó por 24 horas a 37ºC antes de su utilización en los experimentos.

2.1.2 Lectinas

En los experimentos se utilizaron tres kits comerciales (Vector laboratories®) que en conjunto poseen veintiún lectinas extraídas de diferentes plantas de las cuales se usaron: Con A, DBA, DSL, ECL, GSL I, GSL II, Jacalina, LCA, LEL, PNA, PSA, RCA120, SBA, SJA, STL, UEA I VVA, WGA, éstas se seleccionaron con base en la amplia variedad de especificidades por diferentes azúcares que permite evaluar la



adhesión de P. multocida a diversos receptores (Tabla 2.1.) (Rhodes and Milton, 1998; Sharon and Lis 2003) Tabla 2-1: Lectinas, Procedencia y su Especificidad por Carbohidratos (Tomado de Slifkin and Doyle, 1990 y Sharon and Lis, 2003)

LECTINA CARBOHIDRATO

NOMBRE ORIGEN NOMBRE COMÚN

(ORIGEN) ESPECIFICIDAD

Con A Canavalia ensiformis Frijol Man / Glc

DBA Dolichos biflorus Gal / GalNAc

DSL Datura stramonium Estramonio (GlcNAc)2-4

ECL Erythrina cristagalli Árbol de coral Gal / GalNAc

GSL I Griffonia simplicifolia I Desconocido Gal / GalNAc

GSL II Griffonia simplicifolia II Desconocido GlcNAc

JACALINA Artocarpus integrrifolia Gal / GalNAc

LCA Lens culinaris Lenteja Man / Glc

LEL Lycopersicon esculenum Tomate (GlcNAc)2-4

PNA Arachis hypogaea Maní Gal / GalNAc

PSA Pisum sativa Guisante Man / Glc

RCA 120 Ricinus communis Ricino Gal / GalNAc

SBA Glycine max Soya Gal / GalNAc

SJA Sophora japonica Árbol de pagoda japonés Gal / GalNAc

STL Solanum tuberosum Papa (GlcNAc)2-4

UEA I Ulex europaeus I Aulaga Fuc

VVA Vicia villosa Veza vellosa GalNAc

WGA Triticum vulgaris Germen de trigo GlcNAc & Neu5Ac

2.1.3 Cultivo in vitro (explantes) de septo nasal de fetos conejo

Para la obtención de septos nasales de fetos de conejos se tomaron 16 conejas con 26 días de gestación, fueron anestesiadas con xilazine (5 mg/kg) y ketamina (35 mg/kg), los fetos se extrajeron por cesárea, se procedió a su eutanasia inmediatamente por sección medular, a las madres también se les practicó eutanasia después de la cirugía. Se retiró completamente la piel y la mandíbula de los fetos, se cortó transversalmente la fosa nasal con una cuchilla de afeitar estéril, se obtuvieron tres secciones por animal, cada una con cerca de 0,3 centímetros de grosor, adicionalmente se retiró el músculo y el paladar. En total se obtuvieron y fueron sometidos a experimentación 240 explantes (120 para cada uno de dos experimentos). Estos se lavaron tres veces en medio esencial

Capítulo 2 13

mínimo modificado (MEM) alto en glucosa previo a su utilización. Todos los implementos utilizados fueron previamente esterilizados.

2.1.4 Evaluación del efecto inhibitorio de lectinas sobre la adherencia de P. multocida a explantes de septos nasales de fetos de conejo

Para la evaluación de la acción de las lectinas sobre la adherencia de la P. multocida al epitelio respiratorio del septo nasal de fetos de conejos se utilizaron las dieciocho lectinas arriba mencionadas (Tabla 2.1.); se siguió el procedimiento reportado por Stinson and Wang (1998).

En esta investigación se llevaron a cabo dos experimentos diferentes: 1. Se denominó EL (Explante – Lectina), se buscaba evaluar la acción inhibitoria de las lectinas incubando cada una de ellas con el cultivo tisular previo a la exposición del mismo a P. multocida, se esperaba bloquear receptores CHOs en la membrana apical de las células del epitelio respiratorio como se expone en la Figura 2.1. y Tabla 2.2. Figura 2-1: Experimento EL. Inhibición de la adhesión de la P. multocida por bloqueo de

receptores CHOs sobre el epitelio respiratorio con lectinas.



Tabla 2-2: Experimento EL. Evaluación de la inhibición de la adhesión de Pasteurella

multocida a explantes de septo nasal de conejo previo tratamiento del epitelio con lectinas

El segundo experimento fue denominado PmL (P. multocida – Lectina) y con él se evaluó el efecto de bloquear los potenciales carbohidratos de la superficie de la bacteria con propiedades de ligando (Figura 2-2 y Tabla 2-3)

Figura 2-2: Experimento PmL. Inhibición de la adhesión de la P. multocida por bloqueo de

CHOs con propiedades ligando con lectinas incubadas con la bacteria previa adición al cultivo tisular.

TRATAMIENTO No. Explantes

Incubación inicial

Tiempo de incubación

Incubación final Tiempo de incubación

Control positivo

6 10 ml de MEM 1 hora 107 UFC de P. multocida + 10 ml de MEM

2 horas

Control negativo

6 10 ml de MEM 1 hora MEM 2 horas

Lectina (*) 6 200 µg de lectina +10 ml de MEM

1 hora 107 UFC de P. multocida + 10 ml de MEM

2 horas

Capítulo 2 15

Tabla 2-3: Experimento PmL. Evaluación de la inhibición de la adhesión de Pasteurella

multocida a explantes de septo nasal de conejo previo tratamiento de la bacteria con lectinas

De acuerdo a pruebas preliminares y según lo reportado por Stinson and Wang (1998) se concluyó que la cantidad de lectina a utilizar en esta investigación era de 0,2 µg/ml de lectina diluida en MEM. Para la evaluación de cada lectina se utilizaron seis cortes o explantes de septo nasal; seis cortes adicionales fueron los controles negativos (C-), incubados únicamente en medio MEM y como controles positivos (C+) otros seis explantes incubados únicamente con 107 UFC de P. multocida. Los cortes se incluyeron en cajas de petri de 5 cm de diámetro por 2 cm de alto con un volumen de 10 ml de MEM y el tratamiento correspondiente, se incubó en cámara húmeda en una atmosfera de 5% de CO2 y 95% de O2, luego de cada incubación del tejido se llevaron a cabo lavados para retirar la lectina no adherida.

Finalmente, tres de los explantes de cada uno de los tratamientos con lectina se fijaron en formalina al 3.7% bufferada y tres en fijador de Trump (formalina 40%, glutaraldehido 25%) por 24 horas; igual procedimiento se observó para los cultivos de ambos controles (Esquinas, 2006).

2.1.5 Procesamiento de los tejidos

2.1.5.1 Inmunohistoquímica (IPI)

Con el objeto de valorar la cantidad de bacterias adheridas al borde ciliado de las células del epitelio respiratorio del septo se practicó la técnica de inmunoperoxidasa indirecta (IPI). Los tejidos se incluyeron en parafina y se cortaron a 3 µm de grosor. Como antisuero primario específico contra P. multocida se produjo un antisuero policlonal en ovinos; como antisuero secundario se usó anti IgG de oveja preparado en burro marcado con peroxidasa (Sigma, Aldrich®) (Esquinas, 2006). Para el control de la técnica de IPI se utilizaron como positivos septos nasales de conejos afectados con la enfermedad natural a los cuales se les agregaron ambos antisueros, y como control

TRATAMIENTO No. Explantes

Incubación inicial Tiempo de incubación

Incubación final Tiempo de incubación

Control positivo 6 107 UFC de Pasteurella

multocida + 10 ml de MEM

1 hora 107 UFC de Pasteurella

multocida + 10 ml MEM 2 horas

Control negativo 6 1 hora 10 ml MEM 2 horas

Lectina (*) 6 107 UFC de Pasteurella

multocida + 10 ml de MEM + 200 µg de lectina

1 hora 107 UFC de Pasteurella

multocida + 10 ml MEM 2 horas



negativo septos nasales de animales enfermos a los que no se les adicionó el antisuero primario.

La valoración semicuantitativa de la extensión de la adherencia de P. multocida a la membrana apical de las células del epitelio respiratorio y al borde ciliado se llevo a cabo bajo los siguiente criterios: Ausencia de bacterias adheridas 0 %; bacterias adheridas en un 33 % (localizado) de la extensión de la superficie epitelial, bacterias adheridas en un 66 % (multifocal) y adhesión en 99 % (generalizada).

2.1.5.2 Cortes Semidelgados, coloración de azul de Toluidina

Luego de permanecer 24 horas en fijador con Trump los tejidos fueron decalcificados en EDTA al 10 % durante 7 días, se lavaron en buffer fosfato, se postfijaron en tetróxido de osmio al 1 %, fueron deshidratados en alcoholes con concentraciones ascendentes para posteriormente ser embebidos en Epon 812 - Polysciences®; los bloques se cortaron a un grosor de 0,5 µm con un micrótomo marca Microm®, finalmente se tiñeron con azul de Toluidina durante 30 segundos aproximadamente (Graham et al., 2007).

2.1.6 Evaluación de los tejidos

Los tejidos se evaluaron en un microscopio de luz teniendo en cuenta las siguientes variables: 1) Por la técnica de IPI, valoración semicuantitativa de la cantidad de bacterias adheridas a la membrana apical; y 2) en los cortes semidelgados, se contó el porcentaje de células muertas y cambios indicativos entre los que se encuentran cambios nucleares (cariorexis, cariolisis y picnosis) disminución en la densidad del citoplasma y pérdida o disminución de la barrera celular; también se contó el porcentaje de células con vacuolas intracitoplasmáticas que se observan como espacios menos densos con forma redondeada; porcentaje de espacios interepiteliales dilatados o aumentados que se observan como espacios claros entre las células del epitelio; y porcentaje de células caliciformes (CC) con aumento de actividad (aumento de tamaño y liberación de mucinas). Los criterios empleados para definir los anteriores cambios fueron los mismos descritos por Esquinas (2006).

Para la técnica de corte semidelgado en las tres repeticiones se cuantificó el número de células con cada cambio en ocho campos continuos con objetivo de 100X, se contaron todos los núcleos observados en cada campo y cada uno se considero como representante de una célula epitelial indistinta, finalmente se obtuvo el porcentaje de células afectadas.

Capítulo 2 17

2.1.7 Metodología Estadística

Como se mencionó en la introducción, el objetivo principal de esta investigación era comparar la presencia o ausencia de P. multocida adherida a la membrana apical de las células del epitelio respiratorio de septos nasales de fetos de conejos, junto con la presencia o no de lesiones en dichas células A continuación se describe cada una de las hipótesis que se aplicaron para los dos experimentos (EL y PmL):

Técnica de IPI, para la comparación de la presencia o ausencia de P. multocida adherida se propusieron las siguientes hipótesis:

H0: la acción de ninguna lectina inhibe la adhesión de P. multocida al tejido.

H1: la acción de al menos una de las lectinas inhibe la adhesión de P. multocida al

tejido.

Para la comparación de la presentación de lesiones como consecuencia de la adhesión de P. multocida se propusieron las siguientes hipótesis:

H0: la acción de ninguna lectina evita la presentación de lesiones como consecuencia de

la adhesión de P. multocida al tejido.

H1: la acción de al menos una de las lectinas evita la presentación de lesiones como

consecuencia de la adhesión de P. multocida al tejido.

Para probar las diferentes hipótesis se hizo un análisis de varianza (ANAVA) bajo un

modelo completamente al azar (Kutner et al., 2005), así:

Yij = µ + τi + εjj

Yij= Es la variable respuesta de la i-ésima unidad experimental a la j-ésima lectina

µ= promedio poblacional

τi= Efecto producido por la lectina j (Con A…, WGA)

εij= Error experimental de la unidad experimental i con la lectina.

Para las hipótesis de ausencia-presencia de la bacteria (IPI) que resultaron significativas (p<0.01) se aplico una prueba de comparación múltiple de medias de Duncan. Para el análisis de las lesiones, cuando las hipótesis fueron significativas (p<0.01) se realizó una prueba de Dunett para enfrentar el C+ versus cada una de las lectinas; y para las



variables que no cumplieron el supuesto de homogeneidad de varianzas se realizó el ANAVA mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (Martínez y Martínez, 1997).

2.2 Resultados

2.2.1 Inmunoperoxidasa Indirecta (IPI)

En los tratamientos en ambos experimentos (EL y PmL) con las distintas lectinas se encontró una variación de la inmunomarcación que fue de localizada a generalizada mientras que en los tejidos no expuestos a la bacteria C- no se observó marcación alguna. Los tejidos utilizados como C+ (expuestos únicamente a la P. multocida) mostraron una inmunomarcación similar en todas las repeticiones, con apariencia granular generalizada que ocupó casi en su totalidad el borde ciliado (Figura 2.3).

Figura 2-3: Experimento EL. Epitelio respiratorio de septos nasales de fetos de conejos expuestos a las diferentes lectinas y a P. multocida. A. Control negativo. B. Tejido preincubado con PNA, inmunomarcación focalizada. C. Tejido preincubado con VVA, inmunomarcación multifocal. D. C +, inmunomarcación severa generalizada. Tejido incubado con P. multocida sin lectinas. Inmunomarcación generalizada. IPI. 400X aprox.

Capítulo 2 19

Analíticamente se cumplió con homogeneidad de varianza que fue evaluada a través de la gráfica de residuales Vs. ajustados y aunque no se cumplió con el supuesto de distribución normal del error experimental, la prueba F es robusta a la anormalidad del error experimental (Kutner et al. 2005). Para comparar el efecto de los tratamientos en cuanto al promedio del porcentaje de presencia de la bacteria sobre el borde ciliado, se realizó un ANAVA y los resultados indican que hubo diferencias altamente significativas (p<0,01) para EL y diferencias significativas (p=0,0223) para PmL, para la determinación de cuales son diferentes se realizo una prueba de comparación de medias de Duncan.

De esta forma se concluyó que en el experimento 1 (EL) en los tratamientos en los cuales se utilizaron las lectinas VVA, UEA, GSL I, Con A, LCA, PNA, WGA, RCA120 y DBA hubo inhibición estadísticamente significativa (P<0,01) de la adhesión de la P. multocida al borde ciliado de las células del epitelio respiratorio en comparación con el C+ (Figura 2-4).

Figura 2-4: Comparación de los porcentajes de adhesión de la bacteria al borde ciliado en el experimento EL vs. el tejido expuesto solo a P. multocida - C+. IPI

En el experimento 2 (PmL) los tratamientos con las ECL, SBA, DSL, ConA y GSL II mostraron una disminución estadísticamente significativa en la extensión de la inmunomarcación de las bacterias sobre el borde ciliado en comparación con el C+, como se muestra en la figura 2.5.

* *



Figura 2-5: Comparación de los porcentajes de la adhesión de bacteria al borde ciliado para el experimento PmL vs. el tejido expuesto solo a P. multocida C +. IPI..

2.2.2 Técnica de cortes semidelgados

En los tejidos expuestos únicamente a la P. multocida (C +) las distintas células del epitelio mostraron la mayor variedad y cantidad de alteraciones, mientras que en aquellos no expuestos al microorganismo algunos cambios no estuvieron presentes y en aunque los que si lo estuvieron los cambios siempre fueron en bajos porcentajes (Figura 2.6).

En el experimento EL en el caso de muerte celular se observó una clara disminución del porcentaje de células afectadas en los cultivos sometidos a PNA, GSL I, DBA, WGA, SBA, LEL, LCA, PSA, RCA 120 y SJA (Figura 2.7) con respecto al C+, con la prueba de Dunett se encontró que las diferencias fueron estadísticamente significativas (p<0.01). Mientras que en el experimento con PmL no se encontraron diferencias significativas para muerte celular entre los tratamientos con cualquiera de las lectinas y el C +.

* * * * * *

Capítulo 2 21

Figura 2-6: Epitelio de septo nasal de fetos de conejos expuesto a diferentes lectinas y a P. multocida. A. Epitelio normal, C (-) 400X aprox. B. Epitelio incubado con P. multocida sin lectina, célula muerta (cabeza de flecha); aumento de los espacios interepiteliales (flecha). C. Tejido preincubado con PSA antes de la inoculación con P. multocida, célula muerta (cabeza de flecha). D. tejidos incubados solo con bacteria sin lectinas C (+), bacterias adheridas a las cilias del epitelio (flecha). Azul de Toluidina. 1000X aprox. Experimento EL

Figura 2-7: Comparación de los porcentajes de células muertas para cada uno de los tratamientos EL. Prueba de Dunett.

* * * * * * * * * * *



Figura 2-8: Comparación de porcentajes de células con vacuolas intracitoplasmáticas para cada uno de los tratamientos vs. el C+. EL. Azul de Toluidina. Prueba de Dunett.

Para la presencia de vacuolas citoplasmáticas en EL hubo una reducción significativa (p<0,01) entre los tejidos tratados con LEL, Jacalina, ECL, VVA, LCA, SJA, PSA, WGA, GSL II, Con A, STL, SBA, RCA120, PNA y DBA y el control positivo (Figura 2.8). En PmL no hubo diferencias significativas entre los tratamientos con las distintas lectinas y el C (+)

Figura 2-9: Comparación porcentajes de células con aumento de espacios interepiteliales para cada una de las lectinas - EL. Azul de Toluidina. Prueba de Dunett.

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Capítulo 2 23

En la lesión aumento de los espacios interepiteliales para el experimento EL se estableció que en los tejidos previamente incubados con GSL I, Con A, Jacalina, VVA, DBA, WGA, PSA, PNA, ECL, LEL, GSL II SJA, STL, RCA120, SBA, LCA y DSL disminuyó el tamaño y/o numero significativamente de tales espacios frente al C+ (Figura 2.9).

En el experimento PmL también se encontró disminución significativa (p<0.001) para el aumento de los espacios interepiteliales cuando se comparo el C+ con los tratamientos con LCA, UEA I, RCA120, Jacalina, PNA, PSA, DSL, WGA, GSL II, DBA, SBA, STL, Con A, ECL, GSL I, LEL, SJA y VVA (Figura 2.10).

Figura 2-10: Comparación porcentajes de células con aumento de espacios interepiteliales para cada una de las lectinas - PmL. Azul de Toluidina.

El aumento de la actividad de las células caliciformes (CC) en EL a pesar de que no fue estadísticamente el cambio más significativo o con mayores diferencias fue una lesión visualmente evidente para el control positivo y nunca estuvo presente en los C- (Figura 2.11)

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* * * * * * * * * * * * *



Figura 2-11: Epitelio respiratorio de septo nasal de fetos de conejos expuesto a diferentes lectinas y a P. multocida. A. Tejido preincubado con LEL, más del 90% del área del epitelio en la figura son CC pletóricas con su contenido, aun permanecen algunas células ciliadas (cabeza de flecha) 400X aprox. B. C (+), severo acumulo de contenido dentro de las CC con incipiente liberación del mismo. También se aprecian algunas células ciliadas. EL. .Azul de Toluidina. 1000X aprox.

En EL al comparar los tratamientos con las diferentes lectinas frente al C+ se encontraron diferencias estadísticamente significativas con SBA, ECL y PNA (p<0.01) (Figura 2.12)

Figura 2-12: Comparación de los porcentajes de aumentó de la actividad de las CC en cada uno de los tejidos expuestos a las diferentes lectinas – EL. Azul de Toluidina. Prueba de Dunett.

* * * *

Capítulo 2 25

En el experimento PmL para el análisis del efecto de las distintas lectinas sobre la actividad de las CC frente al control positivo, hubo necesidad de hacer uso de una prueba de estadística no paramétrica debido a la heterogeneidad de varianzas; se encontró una disminución estadísticamente significativa p<0,01 en la actividad de las CC en los tratamientos en los que se incubo la P. multocida con WGA, SJA, VVA, DBA, Con A, Jacalina, UEA I, SBA, LCA, STL, RCA120, DSL, ECL y PNA en comparación con el C+ (Figura 2.13)

Figura 2-13: Efecto de los tratamientos con las distintas lectinas sobre la actividad de CC – PmL. Azul de Toluidina. Kruskas-Wallis .

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Figura 2-14: Comparación de la inhibición de la adhesión de P. multocida y de la agregación de todas las lesiones en los tejidos tratados con lectinas frente a igual agregación para C+. IPI y azul de Toluidina, respectivamente. Recuadro blanco -Tratamientos que mostraron menor inmunomarcación y cantidad de lesiones – EL

La figura 2.14 muestra de manera resumida el efecto de las distintas lectinas sobre las dos variables evaluadas en este estudio: inmunomarcación de la P. multocida y presencia de lesiones en las células del epitelio respiratorio del septo nasal. Si bien, en el experimento EL buena parte de las lectinas tuvieron algún efecto protector sobre el epitelio respiratorio frente a la mayoría de las lesiones inducidas por la P. multocida, fueron la DBA, RCA120 y WGA, las que se comportaron de manera más consistente cuando se agruparon todas las lesiones (figura 2.14).

En el segundo experimento PmL, si bien el efecto inhibidor de la mayoría de las lectinas fue menor respecto a la presencia de lesiones y la inmunomarcación comparado en relación con EL, para los tratamientos con las lectinas Con A, DSL, GSL II y SBA el porcentaje de lesiones y de inmunomarcación se vio disminuido en contraste con el C+ (Figura 2.15).

0,0%10,0%20,0%30,0%40,0%50,0%60,0%70,0%80,0%90,0%

100,0%

C (

-)

C (

+)

Co

n A

DB

A

DSL

ECL

GSL

I

GSL

II

Jaca

lina

LCA

LEL

PN

A

PSA

RC

A 1

20

SBA

SJA

STL

UEA

I

VV

A

WG

A

Figura Comparativa - EL

IPI LESIONES

Capítulo 2 27

Figura 2-15: Comparación de la inhibición de la adhesión de P. multocida y de la agregación de todas las lesiones en los tejidos tratados con lectinas frente a igual agregación para C+. IPI y azul de Toluidina, respectivamente. Recuadro blanco. - Tratamientos que mostraron menor inmunomarcación y cantidad de lesiones - PmL

2.3 Discusión

El primer paso que debe superar un patógeno en su proceso de establecerse en un hospedero y causar infección, colonización e invasión del mismo, es la adhesión a la superficie epitelial de su ruta habitual de ingreso; en el caso específico de las células epiteliales del tracto respiratorio superior de los conejos existen glicoproteínas con propiedades de lectinas y CHOs que son utilizados como receptores específicos por la P. multocida, la cual a su vez posee sus propias lectinas y CHOs específicos utilizados como ligandos (Glorioso et al., 1982; Jacques et al., 1998; Al-Haddawi et al., 2000; García., 2010; Hatfaludi et al., 2010); luego de que se establece la adhesión el patógeno queda protegido de las estrategias defensivas del hospedero, entre las que se encuentra la acción del aparato mucociliar (Pistole, 1981; Firon et al., 1984; Ofek et al., 2002; Sharon and Lis, 2003). Mediante una aproximación por dos vías complementarias diseñadas para demostrar la inhibición de la adhesión de la P. multocida al epitelio respiratorio de septos nasales de fetos de conejos de 26 días de gestación, y con ello a la vez impedir la producción de lesiones sobre el mismo epitelio inducidas por la bacteria, se ensayaron 18 lectinas, de las cuales Con A, DBA, DSL, ECL, GSL I, GSL II, Jacalina, LCA, LEL, PNA, PSA, RCA120, SBA, SJA, STL, UEA I VVA, WGA en ambos experimentos tuvieron un efecto tanto inhibitorio de la adhesión como protector o

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

C (

-)

C (

+)

Co

n A

DB

A

DSL

ECL

GSL

I

GSL

II

Jaca

lina

LCA

LEL

PN

A

PSA

RC

A 1

20

SBA

SJA

STL

UEA

I

VV

A

WG

A

Figura Comparativa - PmL

IPI LESIONES



parcialmente protector frente a las lesiones. En el primer experimento (EL) se pudo demostrar que DBA, RCA120 y WGA además de bloquear tal adhesión en forma significativa, mostraron un efecto protector igualmente significativo frente a las lesiones inducidas por el patógeno. Ahora bien, en el segundo experimento (PmL) la disminución de la inmunomarcación de P. multocida fue significativa al comparar los tejidos tratados con ConA, DSL, GSL II y SBA frente al control positivo; igualmente, cambios en el tamaño de los espacios interepiteliales y menor expresión de la actividad de las CC disminuyeron significativamente en comparación con el C+, Es notorio que las lectinas que tuvieron un efecto inhibidor de la adhesión de la bacteria y protector frente a las lesiones del epitelio en el primer experimento no fueron las mismas, o no tuvieron similar comportamiento en el segundo; en conjunto, estos resultados indicarían la existencia de diferentes estructuras con comportamiento de lectinas en las dos superficies: la del epitelio y la de la P. multocida, con afinidad por sus azúcares respectivos en su contraparte; que en cada caso de inhibirlas con dichos azúcares se bloquea la adhesión de la bacteria y con ello se obtiene un efecto protector frente a los primeros eventos deletéreos inducidos por el microorganismo.

Los anteriores resultados son parcialmente respaldados por Mason y Azizi (1992) y Pruimboom et al., (1996), quienes demostraron que LCA, WGA, PNA y RCA120 reconocen CHOs que se encuentran en las células del epitelio respiratorio de roedores de laboratorio, conejos y humanos; así mismo, Perfumo y col (1998) en estudios de lectinohistoquímica de la fosa nasal de cerdos enfermos con rinitis atrófica, causada por P. multocida y B. bronchiseptica, con la utilización de las lectinas DBA, WGA, LCA, PNA y RCA120 demostraron que el epitelio de animales sanos es rico en acido N-acetilneuraminico (ácido siálico), N-acetil-D-galactosamina, D-galactosa, D-manosa, y que a través de ellos se unen al epitelio respiratorio donde impiden la unión de P. multocida a tales células del hospedero, deducciones concordantes con los resultados en epitelio respiratorio de conejos del experimento EL de este trabajo.

De los resultados en este estudio, se puede apreciar que en el experimento EL, la mayoría de las lesiones mostraron una disminución estadísticamente significativa en los tratamientos con las lectinas LCA, PNA, DBA, WGA y RCA120 vs. el C+ expuesto únicamente a P. multocida, siendo las tres últimas las más relevantes, lo anterior se podría explicar por el hecho de que estas substancias además de reconocer algunos de los receptores en el epitelio para la bacteria reconocerían, adicionalmente, algunos de los receptores de sus subproductos (Pistole, 1981; Rhodes and Milton, 1998; Sharon and Lis, 2003; Hatfaludi et al., 2010). En el experimento PmL si bien la inhibición de la adhesión alcanzó niveles significativos para las ECL, SBA, DSL, ConA y GSL II, no en todas ellas el bloqueo protegió contra todos los efectos deletéreos causados por el patógeno, como se explica a continuación, esto se podría deber a diferencias en los protocolos de los dos experimentos. En consecuencia, si de manera arbitraria se agregan todas las lesiones posibles del epitelio inducidas por P. multocida sola C+ en el primer experimento, estas alcanzarían el 53 % para el C+, un valor cercano al 27 % para UEA I, alrededor del 19 % para GSL I y así sucesivamente hasta alcanzar niveles por debajo del 10% como en el caso de LCA, SBA, DBA, WGA. DSL, PNA, SJA, RCA12 y SBA. Si de igual forma se agregan todas las lesiones en el segundo experimento éstas no

Capítulo 2 29

alcanzaron el 20% aun en el C+. Una explicación para esta diferencia entre los C+ en los dos experimentos se puede encontrar en el hecho de que la P. multocida destinada a los C+ en el PmL, con el fin de observar el mismo rigor, fue sometida a varios lavados con MEM al igual que en todos los tratamientos con las lectinas con el objeto de eliminar el excedente no adherido de éstas, de esta forma seguramente se perdió un porcentaje de biomasa bacteriana. Similar proposición se podría adelantar para explicar la ausencia de significancia para algunas lesiones en los tratamientos con las lectinas vs el C+ en el mismo experimento, esto es, que el tratamiento de las bacterias con las lectinas que demostraron eficacia inhibitoria de la adhesión, antes de ser añadidas al cultivo en mezcla con la P. multocida tendría un efecto protector adicional para el epitelio, quizás como producto de una agregación previa de los microorganismos inducida por las lectinas, lo que dejaría un menor número de ellos libres con posibilidad de acceder al epitelio, criterio compartido por Patchett et al., (1991); Slifkin and Doyle (1990); Payne (1992); Sharon and Lis (2003) y Acord et al., (2005). En favor de esta última hipótesis se podría agregar que mientras en el EL con las lectinas eficaces difícilmente se obtuvieron inhibiciones por debajo del 15 % para ambas variables (IPI y lesiones), la inhibición fue más amplia, por debajo del 10%, para las dos variables en el segundo experimento. Una primera conclusión a dicha diferencia sugeriría que resultaría más efectivo y mucho menos deletéreo inhibir la adhesión de la P. multocida a través de los azúcares correspondientes a esas lectinas: D-manosa, D-glucosa, D-galactosa, N-acetil-D-glucosamina, N-acetil-D-galactosamina que se encuentran en la membrana externa de la bacteria (el LPS y la cápsula principalmente) reconocidos por lectinas propias de la membrana apical de las células del epitelio respiratorio de la fosa nasal, de esta forma se coparían los sitios receptores de las células epiteliales y no dejarían lugar para los azucares del microorganismo (Pistole, 1981; Yeh and Jacobs, 1992; Sharon and Lis, 2003; Sharon 2007) .

3. Conclusiones y recomendaciones

En medicina humana es ya un lugar común señalar los inconvenientes que representa el tratamiento de las distintas infecciones bacterianas con sustancias antimicrobianas (Kumarasamy et al., 2010). También en al ámbito de la Medicina Veterinaria tales inconvenientes adquieren un rol significativo por el menor control en el uso de estas sustancias, particularmente en las especies animales destinadas al consumo humano (Graham et al., 2007); como consecuencia, cantidades residuales de ellas llegan permanentemente a la cadena alimenticia del humano vía la ingestión de carnes o leche de animales que han sido sometidos a permanentes tratamientos con los antibacterianos, la mayoría de las veces de forma inadecuada. Por otro lado, para la prevención de la infección y enfermedad por P. multocida en las especies susceptibles de ser infectadas por este microorganismo, se han ensayado múltiples aproximaciones para la utilización de vacunas, sin resultados satisfactorios (Rimler et al., 1979; Suckow et al., 1995; Ofek and Sharon 2002; Ofek et al., 2003; Boyce et al., 2004; Dowling et al., 2004). Esto ha llevado a la búsqueda de alternativas para la prevención y eventual tratamiento de diferentes agentes bacterianos, y en nuestro caso particular, de la P. multocida por medio de una estrategia no destructiva del patógeno sino impidiéndole su primer paso de patogenicidad como es la adhesión a receptores glicosídicos en la membrana apical de la células del epitelio respiratorio de fosa nasal de conejo, sitio inicial de colonización antes de su diseminación a regiones más profundas del sistema respiratorio, como consecuencia de condiciones ambientales no completamente conocidas, con resultados más catastróficos para el hospedero. Según los hallazgos del presente estudio, sería factible llevar a cabo tal estrategia no destructiva por medio de una terapia preventiva de la infección y colonización antes de que el patógeno ejerza efectos dañinos sobre las células del tracto respiratorio superior y eventualmente impedir que alcance lugares más profundos como el pulmón.

En consonancia con lo anterior, y además de la putativa ventaja de ejercer una menor presión evolutiva a formas más virulentas de algunas bacterias (Ofek and Sharon 2002; Sharon and Ofek 2002), el empleo de CHOs como posibles preventivos de su adhesión, tendrían beneficios adicionales entre los que se encuentran: los azúcares son de fácil obtén|ción y aplicación, son muy solubles en agua y poseen un pH estable (Bavington and Page, 2005). Se cita el ejemplo del jugo de arándano que al ser ingerido inhibe al adhesión de E. coli al epitelio urogenital (Sharon and ofek 2002). Adicionalmente, los CHOs por ser sustancias naturales podrían ser menos nocivos para el organismo hospedero debido al bajo efecto citotóxico de los mismos en comparación con algunas lectinas (Sharon and Lis, 2003).



Con base en los resultados del experimento EL se demuestra que DBA, WGA y RCA120 lectinas reconocen y se unen a CHOs como la acido N-acetilneuraminico (ácido siálico), N-acetil-D-galactosamina, D-galactosa, D-manosa localizados en la membrana apical de las células del epitelio respiratorio de la fosa nasal del conejo, incluidas las cilias; ellos actuarían como receptores para dichas lectinas, propios de la superficie de P. multocida a los cuales se unirían, resultados que son también evidencia indirecta de que P. multocida tiene estructuras con comportamiento similar a estas lectinas como es el caso de la fimbria, la cual además de sus propiedades adhesivas tiene otras protectoras para el patógeno como son la disminución de la acción del moco respiratorio y de la fagocitosis (Sharon 1987; Al-Haddawi et al. 2000; Lehmanna et al., 2006).

La inhibición de la adhesión de P. multocida por las lectinas Con A, DSL, GSL II y SBA corrobora lo reportado por Glorioso y col. (1987); Sharon el al. (1987); Ofek y Doyle (1994); y Ruffolo et al. (1997) quienes reportan que sobre la superficie bacteriana existen residuos de D-manosa, D-glucosa, D-galactosa, N-acetil-D-glucosamina, N-acetil-D-galactosamina probablemente localizados en la capsula o en la cadena O del LPS, y que la bacteria aprovecha entre otros procesos para interactuar con el moco, reconocer sustancias con propiedad de lectinas ubicadas sobre el epitelio y debido a esta característica dichas lectinas pueden reconocer aglutinar y precipitar al microorganismo (Pistole, 1981; Payne et a., 1992; Sharon and Lis 2003), un ejemplo de ellos son las colectinas que se ha reportado que interactúan con el antígeno O del LPS de Bordetella bronchiseptica (Sheaffer et al., 2004). Y de acuerdo con esto, una propuesta aún más interesante consecuente con los estudios realizados por Sharon y Lis, 2003 y como resultado del análisis de los efectos causados por los tratamientos en el experimento PmL se puede utilizar como estrategia terapéutica o profiláctica estos mismo CHOs que como en los estudios reportados por Al-Haddawi y colaboradores en 2000, la inhibición de la adhesión de Pasteurella multocida a cultivos de células HeLa se dio por la previa aplicación de N-acetil-D-glucosamina a la células.

Conforme al propósito original del presente estudio, se puede concluir que existen glicoproteínas con propiedades de lectinas con las cuales es posible bloquear la unión de la P. multocida al epitelio respiratorio de septo nasal de conejos y a través de tal bloqueo impedir que el patógeno induzca lesiones sobre dichas células; como consecuencia de ello, es probable que las mismas células epiteliales al no sufrir daño por el patógeno estén en capacidad de ejercer sus funciones protectoras innatas, de manera sobresaliente el barrido mucociliar. Todavía más, existen CHOs que son reconocidos por las lectinas de la bacteria que resultaron eficaces en este estudio y que tendrían efectos similares a los de las lectinas demostradas con características protectoras, particularmente en el experimento PmL. Bajo las anteriores circunstancias es dable iniciar experimentos con conejos in vivo utilizando los CHOs antes citados que bloqueen las lectinas de la P. multocida e impidan su acceso a los CHOs receptores homólogos en la superficie apical de las células epiteliales.

A. ANEXO: Resultados estadísticos IPI – EL

1

LECTINA MEDIA AGRUPAMIENTO DE DUNCAN

C (+) 99% A

PSA 83% B A

Jacalina 79% B A

GSL II 77% B A C

ECL 66% B A C

SJA 66% B A C

DSL 66% B A C

STL 58% B A C

LEL 55% B A C

SBA 55% B A C

VVA 53% B D C

UEA I 50% B E D C

GSL I 44% B E D C

Con A 44% B E D C

LCA 33% F E D C

PNA 33% F E D C

WGA 11% F E D

RCA 120 8% F E

DBA 8% F E

C (-) 0% F

1 Medias con la misma letra no son significativamente diferentes

34 Inhibición in situ de la adhesión de Pasteurella multocida a receptores del


B. ANEXO: Resultados estadísticos IPI – PmL

2

LECTINA MEDIA AGRUPACIÓN DE DUNCAN

C (+) 66% A

RCA 120 50% B A

VVA 50% B A

WGA 50% B A

Jacalina 50% B A

STL 50% B A

UEA I 46% B A

DBA 41% B A

SJA 33% B A

PNA 33% B A

GSL I 17% B A

LEL 17% B A

PSA 17% B A

LCA 17% B A

ECL 11% B

SBA 8% B

DSL 0% B

C (-) 0% B

Con A 0% B

GSL II 0% B

2 Medias con la misma letra no son significativamente diferentes

Anexos 35

C. ANEXO: Resultados Estadísticos - Muerte Celular – EL

3

LECTINAS MEDIA DIFERENCIA ENTRE MEDIAS CON C(+)

C (+) 9,3% 0,000

ECL 7,7% 0,016

Jacalina 6,6% 0,027

Con A 6,0% 0,033

UEA I 5,1% 0,042

VVA 4,9% 0,044

GSL II 3,9% 0,054

STL 3,6% 0,057

DSL 3,5% 0,058

PNA 2,7% 0,066 ***

GSL I 2,3% 0,070 ***

DBA 2,1% 0,072 ***

WGA 2,1% 0,072 ***

SBA 2,1% 0,072 ***

LEL 2,1% 0,072 ***

LCA 1,8% 0,075 ***

PSA 1,7% 0,076 ***

RCA 120 1,0% 0,083 ***

C (-) 1,0% 0,083 ***

SJA 0,9% 0,084 ***

3 *** comparaciones significativas al nivel 0,01



D. ANEXO: Resultados Estadísticos - Muerte Celular – PmL

4


C (+) 4,6% 0,00000 RCA 120 6,1% -0,01521 UEA I 5,0% -0,00414 LCA 4,1% 0,00494 GSL II 4,0% 0,00568 GSL I 3,0% 0,01576 DBA 2,8% 0,01770 Jacalina 2,6% 0,02008 LEL 2,4% 0,02162 STL 2,3% 0,02319 SBA 2,2% 0,02342 ECL 1,9% 0,02638 SJA 1,9% 0,02686 Con A 1,8% 0,02740 PSA 1,8% 0,02783 WGA 1,8% 0,02808 PNA 1,8% 0,02826 VVA 1,6% 0,03000 DSL 1,3% 0,03309 C (-) 0,9% 0,03670


Anexos 37

E. ANEXO: Resultados Estadísticos - Vacuolización Intracitoplasmática – EL

5


C (+) 5,6% 0,0000

UEA I 3,7% 0,0193

DSL 2,2% 0,0345

GSL I 2,0% 0,0367

LEL 1,4% 0,0420 ***

Jacalina 1,4% 0,0421 ***

ECL 1,3% 0,0436 ***

VVA 1,1% 0,0449 ***

LCA 0,9% 0,0472 ***

SJA 0,8% 0,0485 ***

PSA 0,7% 0,0496 ***

WGA 0,5% 0,0517 ***

GSL II 0,4% 0,0520 ***

Con A 0,4% 0,0525 ***

STL 0,3% 0,0530 ***

SBA 0,2% 0,0547 ***

RCA 120 0,1% 0,0554 ***

C (-) 0,0% 0,0559 ***

PNA 0,0% 0,0562 ***

DBA 0,0% 0,0563 ***




F. ANEXO: Resultados Estadísticos – Vacuolización Intracitoplasmática

6


C (+) 1,0% 0,00000 UEA I 0,6% 0,00420 DBA 0,6% 0,00432 Jacalina 0,6% 0,00438 LEL 0,6% 0,00438 ECL 0,3% 0,00683 PSA 0,3% 0,00750 RCA 120 0,3% 0,00750 LCA 0,2% 0,00766 GSL I 0,2% 0,00809 GSL II 0,2% 0,00809 Con A 0,2% 0,00833 PNA 0,2% 0,00858 SJA 0,1% 0,00887 STL 0,1% 0,00936 C (-) 0,0% 0,01013 DSL 0,0% 0,01013 SBA 0,0% 0,01013 VVA 0,0% 0,01013 WGA 0,0% 0,01013


Anexos 39

G. ANEXO: Resultados Estadísticos- Aumento de Espacios Intercelulares – EL

7


C (+) 21,3% 0,000000000

UEA I 17,6% 0,037523350

GSL I 8,3% 0,130468850 ***

Con A 6,5% 0,148489850 ***

Jacalina 5,2% 0,161534740 ***

VVA 5,1% 0,162842690 ***

DBA 4,2% 0,171870180 ***

WGA 3,8% 0,175296080 ***

PSA 3,4% 0,179080200 ***

PNA 3,3% 0,180635430 ***

ECL 3,0% 0,183542890 ***

LEL 2,8% 0,185023770 ***

GSL II 2,8% 0,185768780 ***

SJA 2,1% 0,192745350 ***

STL 1,2% 0,201292340 ***

RCA 120 1,1% 0,202448800 ***

SBA 0,8% 0,205728900 ***

C (-) 0,4% 0,209359040 ***

LCA 0,3% 0,210678560 ***

DSL 0,0% 0,213391320 ***




H. ANEXO: Resultados Estadísticos - Aumento de Espacios Intercelulares – PmL

8


C (+) 4,9% 0,00000 LCA 1,7% 0,03204 *** UEA I 0,9% 0,03943 *** RCA 120 0,8% 0,04094 *** Jacalina 0,7% 0,04173 *** PNA 0,6% 0,04233 *** PSA 0,3% 0,04569 *** DSL 0,3% 0,04613 *** WGA 0,2% 0,04653 *** GSL II 0,2% 0,04679 *** DBA 0,1% 0,04728 *** C (-) 0,1% 0,04789 *** SBA 0,1% 0,04812 *** STL 0,0% 0,04849 *** Con A 0,0% 0,04867 *** ECL 0,0% 0,04867 *** GSL I 0,0% 0,04867 *** LEL 0,0% 0,04867 *** SJA 0,0% 0,04867 *** VVA 0,0% 0,04867 ***


Anexos 41

I. ANEXO: Resultados Estadísticos - Aumento en la Actividad de CC – EL

9


C (+) 16,7%

LEL 11,0% 0,056962700

PSA 9,4% 0,072698070

GSL I 7,2% 0,095493280

GSL II 7,2% 0,095604980

LCA 5,7% 0,110133010

Jacalina 3,8% 0,128962330

Con A 3,4% 0,132896910

STL 3,3% 0,133939930

VVA 3,0% 0,136743410

DBA 2,0% 0,147452240

RCA 120 1,8% 0,149053610

SJA 1,5% 0,151811790

UEA I 1,2% 0,155627630

WGA 1,0% 0,157625400

DSL 0,8% 0,159535060

SBA 0,7% 0,160635290 ***

C (-) 0,2% 0,165453300 ***

ECL 0,1% 0,166368570 ***

PNA 0,0% 0,166817650 ***




J. ANEXO: Resultados Estadísticos - Aumento en la Actividad de CC – PmL

10


C(+) 1,0% GSL I 0,7% -30,03 PSA 0,7% -34,58 LEL 0,6% -42,67 GSL II 0,5% -49,50 WGA 0,5% -52,53 *** SJA 0,5% -53,16 *** VVA 0,4% -55,40 *** DBA 0,4% -56,90 *** Con A 0,4% -57,81 *** Jacalina 0,4% -58,26 *** UEA I 0,3% -65,33 *** SBA 0,3% -65,48 *** LCA 0,3% -68,71 *** STL 0,3% -68,92 *** RCA 120 0,2% -79,92 *** DSL 0,2% -80,58 *** ECL 0,1% -89,10 *** C(-) 0,0% -96,56 *** PNA 0,000 -96,83 ***


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