inhibicion de aspergillus sp. por aceites esenciales

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE PUEBLA

PROGRAMA ACADEMICO DE INGENEIRIA EN BIOTECNOLOGIA

INHIBICION DE ‘’ASPERGILLUS SP’’ POR ACEITES ESENCIALES

PROYECTO DE GRADO

PRESENTADO POR:

JOSÉ LUIS HUELITL ESPINOSA

PARA OBTENER EL DIPLOMA DE:

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR DEL PROYECTO:

D.C. RICARDO MUNGUIA PEREZ

REVISORES:

D.C. RICARDO MUNGUIA PEREZ

DR. EDUARDO MOLINA GAYOSSO

DR. JORGE LOZADA LECHUGA

Estancia Profesional realizada, dentro del marco de la Carrera de Ingeniería en Biotecnología, en los laboratorios del Centro de Investigación de Ciencias Microbiológicas (ICUAP-BUAP) de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edificio 103J Ciudad Universitaria, San Manuel, Puebla C.P. 72592.

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El presente proyecto de investigación titulado: INHIBICIÓN DE ‘’ASPERGILLUS SPECIES’’ POR ACEITES ESENCIALES y realizado por JOSÉ LUIS HUELITL ESPINOSA, ha sido revisada y aprobada por el siguiente consejo particular, para obtener el Diploma de:

MICROBIOLOGO INDUSTRIAL

Consejo Particular: firma:

Director: D.C. RICARDO MUNGUIA PEREZ ___________________________

Revisor: DR. EDUARDO MOLINA GAYOSSO ____________________________

Revisor: DR. JORGE LOZADA LECHUGA _____________________________

San Mateo Cuanalá, Puebla, México. 18 de Octubre de 2012

2 | P á g i n a

ContenidoRESUMEN................................................................................................................................................4

ABSTRACT............................................................................................................................................5

INTRODUCCION.......................................................................................................................................6

OBEJTIVOS...............................................................................................................................................7

OBJETIVO GENERAL:............................................................................................................................7

OBJETIVO ESPECIFICO:........................................................................................................................7

MARCO TEORICO.....................................................................................................................................8

GENERALIDADES DE ASPERGILLUM SP................................................................................................8

MICOTOXINAS.....................................................................................................................................9

AFLATOXINAS....................................................................................................................................10

OCRATOXINAS...................................................................................................................................11

MANIFESTACIONES CLINICAS............................................................................................................11

ACEITES ESENCIALES..........................................................................................................................12

MATERIALES Y METODOLOGIA.............................................................................................................13

MICROORGANISMOS, MODELOS PARA ENSAYOS.............................................................................13

ACEITES ESENCIALES Y MEDIOS DE CULTIVO NECESARIOS................................................................13

TÉCNICA DE DILUCIÓN EN TUBO.......................................................................................................13

MÉTODO DE ENSAYO........................................................................................................................14

RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS............................................................................................14

RESULTADOS.....................................................................................................................................15

Ensayos adicionales...............................................................................................................................19

CONCLUSION.........................................................................................................................................22

ANEXOS.................................................................................................................................................23

Anexo A .- Agar Czapek Dox..................................................................................................................23

Anexo B.- Medio de cultivo: Agar dextrosa-Sabouraud.........................................................................23

Anexo C.- Técnica de dilución seriada logarítmica decimal base 10......................................................24

Anexo D.- McFarland.............................................................................................................................24

3 | P á g i n a

Anexo E.- Técnica de sembrado por extensión superficial en placa......................................................25

GLOSARIO..............................................................................................................................................26

Referencias............................................................................................................................................27

RESUMENEste trabajo de investigación, surgió en respuesta a la necesidad de conocer la efectividad

fungicida de diferentes aceites esenciales como son los de la cascara de naranja (Citrus

Sinensis), hoja lanceolada o lanza (Salix Humboldtiana), Azalea (Rhododendron Simsii),

sobre el crecimiento de algunos modelos fúngicos de Aspergillus, como son: Aspergillus

Flavus, Aspergillus Fumigatus, y Aspergillus Nidulans, hongos contaminantes oportunistas

importantes, responsables de el deterioro de muchos alimentos, y causantes de enfermedades

como la micotoxicosis debido a la producción de micotoxinas entre las cuales destacan las

aflatoxinas y ocratoxinas así como Aspergilosis, Aspergilomas, Otomicosis, miocarditis,

sinusitis, entre otras, principalmente en personas con: Anemia, EPOC, e

inmunocomprometidas.

Como método de ensayo de este trabajo de investigación se realizaron varios enfrentamientos,

en el cual se colocaron iguales volúmenes de solución de esporas con aceite esencial, en este

caso se colocaron 100μL de solución de esporas de 1:10’000 y 1:100’000 en diferentes tubos

eppendorf con igual volumen de aceite esencial, a intervalos de tiempo de 15 y 30 minutos,

con sus respectivos duplicados, y finalmente sembrando por extensión superficial en agar, con

la finalidad de contar las células viables.

Se demostró que el aceite esencial de cáscara de naranja (Citrus sinensis), fue el más efectivo

en la inhibición de Aspergillus Nidulans, en diluciones de 1:10’000 y 1:100’000, con un

promedio del 100% en la actividad antifúngica, mientras que para Aspergillus Fumigatus en

diluciones de 1:10’000 y 1:100’000, el aceite esencial más efectivo fue el de hoja lanceolada o

lanza (Salix humboldtiana) con un promedio del 68.47%. Así mismo se realizaron otros

ensayos de inhibición con aceite de cascara de naranja (Citrus sinensis), con 2 cepas de

‘’Aspergillus sp’’ diferentes, en diluciones de 1:10’000 y 1:100’000, demostrando que para la

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cepa 1 de ‘’Aspergillus sp’’ la actividad fungicida de este aceite fue del 100%, por otro lado

para la cepa número 2 del mismo hongo demostró solo un 53% de efectividad.

Palabras clave: Aceites esenciales, actividad fungicida, Aspergilosis, hongos oportunistas.

ABSTRACTThis work of investigation emerged in response to the need to know the effectiveness

fungicide of different essential oils such as the orange peel (Citrus sinensis), on the growth of

fungal models Aspergillus sp, such as: Aspergillus Flavus, Aspergillus Fumigatus, Aspergillus

Niger and Aspergillus Nidulans. Significant opportunistic fungal contaminants, responsible for

the deterioration of many foods, and cause diseases as mycotoxicosis due to mycotoxin

production among which aflatoxin such as aspergillosis, aspergiloma, Otomycosis,

myocarditis, sinusitis, among others, mainly in people with: anemia, COPD, and

immunocompromised.

As this test method research conducted several clashes, which were placed in equal volumes

of solution with essential oil spores, in this case placed 100µL of solution of spores, of

1:10’000 y 1:100’000, in different eppendorf tubes with equal volume of essential oil, at time

intervals of 15 and 30 minutes, with their duplicates, and finally spreading through agar

surface area, in order to count viable cells.

It was demonstrated that the essential oil of orange peel (Citrus sinensis), was most effective

in the inhibition of Aspergillus Nidulans, in dilutions of 1:10’000 and 1:100 '000 with an

average 100% activity antifungal, while for Aspergillus Fumigatus in dilutions of 1:10’000

and 1:100'000, the essential oil was the most effective lanceolate or lance-leaf (Salix

humboldtiana) with an average of 68.47%. Likewise others were performed inhibition assays

with orange peel oil (Citrus sinensis). Using two strains of ´´Aspergillus sp´´ different. at

dilutions of 1:10’000 and 1:100 '000, showing that for one strain of Aspergillus sp'''' fungicidal

activity of the oil was 100%, on the other hand to the strain of the same fungus No. 2 showed

only 53% effective.

5 | P á g i n a

Keywords: Essential oils fungicide, Aspergillosis, opportunistic fungi.

INTRODUCCION

Los hongos del género “Aspergillus sp.’’ Fueron descritos por primera vez con el termino de

‘’Aspergillus’’, al comparar el conidióforo de esta especie con el ‘’Aspergillum’’ que es un

artefacto ceremonial usado para rociar agua bendita.

Se conocen alrededor de 900 especies dentro del género ‘’Aspergillus.’’ Y este es también el

hongo más común en todos los ambientes, ya que se encuentra casi en cualquier lado, como es

el suelo, alimentos en descomposición, y todo tipo de desechos orgánicos alrededor de todo el

mundo, sin embargo se ha revelado como uno de los principales causantes de infecciones

mortales en seres humanos, principalmente en personas con problemas inmunológicos como

son los potadores del VIH, EPOC, Anemia, entre otras. (Arenas R. Y Arenas G. R. 2008,

Micología médica ilustrada, 265-275)

Este género de hongo produce la enfermedad llamada ‘’Aspergilosis’’ que a su vez esta

engloba un gran número de enfermedades infecciosas, mayoritariamente de tipo oportunistas.

Siendo los hongos: Aspergillus Fumigatus, Aspergillus Flavus, Aspergillus Nidulans,

Aspergillus Níger y Aspergillus Terreu ,( Arenas R. y Arenas G. R. 2008, Micología médica

ilustrada, 265-275) los principales causantes de estas enfermedades infecciosas en un 95% de

los casos aproximadamente.

Así mismo los géneros Aspergillus Flavus y Aspergillus Fumigatus, son de los principales

productores de micotoxinas como son la Afratoxina, Ocratoxina, Patulina y Acido penicilico,

mostrándose en mayor cantidad la Aflatoxina y la Ocratoxina (Acevedo T. D. Micotoxinas,

casos clínicos y efectos nutricionales), (Larondelle I. 2000, Curso de micotoxinas).

6 | P á g i n a

OBEJTIVOS

OBJETIVO GENERAL:

Conocer la actividad antifúngica de aceites esenciales como son los de: cascara de naranja,

hoja lanza y azalea, usados como desinfectante natural.

OBJETIVO ESPECIFICO:

Conocer el aceite esencial con mayor actividad antifúngica en ciertas especies de Aspergillus

para su posible uso en artículos de limpieza por su origen natural y en silos, tomando en

cuenta el tiempo de exposición entre el aceite y el microorganismo en cuestión.

7 | P á g i n a

MARCO TEORICO

GENERALIDADES DE ASPERGILLUM SP.

El color es una de sus características principales en su morfología macroscópica para

identificar a esta especie de hongo, poseen distintas tonalidades de verde, amarillo, gris y

negro. En cuanto a su morfología microscopia, esta especie de hongo presenta 4 formas de

cabezas conidiales que son: global, radiada, columnar y claviforme (figura 1) (Carrillo L

Hongos de alimentos y forrajes)

Cabe mencionar que para realizar una correcta identificación sobre un hongo es necesario

conocer diferentes características, como es la morfología tanto macroscópica como

microscópica. (Tabla1) (Alcalá et al. Aspergillus y Aspergilosis.)

Figura 1.- Formas conidiales de Aspergillus

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Tabla 1.- características más importantes de la especie Aspergillus

MICOTOXINAS

Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por gran cantidad de hongos, los

cuales están clasificados en 2 grupos, el primero que son ‘’Hongos de campo’’ que involucra a

especies como Alternaría, Cladosporium, Fusarium y Helminthosporium, y son llamados así

ya que invaden a los granos antes o durante la cosecha. Y el segundo grupo llamado ‘’Hongos

de almacenamiento’’ (Larondelle, 2000, Curso de micotoxinas) ya que como su nombre lo

indica invaden a los granos en el almacenamiento, y está conformado principalmente por

Aspergillum (Aspergillum Flavus y Aspergillum Fumigatus) y Penicillium.

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AFLATOXINAS

Las principales micotoxinas producidas por la especie de Aspergillus son las aflatoxinas y las

ocratoxinas, también se llegan a producir Patolina y Acido penicilico, pero en menor cantidad

que las aflatoxinas.

Se conocen hasta el momento 18 tipos de aflatoxina que son producidas principalmente por

Aspergillus Flavus, de las cuales las mas toxicas son la aflatoxina B1 (AFB1) y M1 (AFM1)

siendo la ultima derivado metabólico de B1 (Acevedo T. D. Micotoxinas, casos clínicos y

efectos nutricionales).

Estas aflatoxinas son encontradas como contaminantes naturales en granos y tiene gran

actividad carcinógena, teratogenica y mutagenica, de allí la gran importancia que tiene su

control y mas a un su prevención.

Figura 2.- Estructura de las aflatixinas.

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OCRATOXINASAl igual que las aflatoxinas las ocratocinas también son micotoxinas, y solo se conocen hasta

el momento 7 tipos de ocratoxina, la más toxica es la ocratoxina A (OTA). Al igual que la

anterior también se le puede encontrar como contaminante natural de granos, además de

alimentos humanos como café crudo, carnes ahumadas, legumbres, quesos, etc. (Acevedo,

Micotoxinas, casos clínicos y efectos nutricionales)

Los principales efectos de esta micotoxina son nefrotoxicos, y pueden provocar lesiones

hepáticas y al igual que las aflatoxinas, las ocratoxinas son inmunodepresoras.

MANIFESTACIONES CLINICAS.

Se reconoce que la especie de Aspergillum spp. Puede ser colonizador, causar enfermedades

alérgicas, infección local, o ser responsable de cuadros clínicos invasivos de gran gravedad,

(López 1995, Micología médica: Procedimientos para el diagnóstico de laboratorio; Alcalá et

al. Aspergillus y Aspergilosis)

Entre las principales manifestaciones clínicas encontramos a las siguientes:

Onicomicosis: no son muy frecuentes, es causado por ciertas especies de Aspergillus

Fumigatus, casando endurecimiento, uñas distrofias y cambio de coloración.

Otomicosis: Son principalmente producidas por Aspergillus Fumigatus y Aspergillus

Níger y provocan prurito local.

Aspergilomas: Producidas por colonización de cavidades por Aspergillum.

Aspergilosis pulmonar invasiva: Se puede presentar en cualquier órgano, aunque es

más frecuente en pulmones, se caracteriza por presencia de de filamentos entre los

tejidos del huésped.

Aspergilosis nasoorbital: En este cuadro clínico el hongo se desarrolla en los senos

paranasales y puede alcanzar la órbita del ojo y otras cavidades.

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Aspergilosis otica: En este cuadro clínico el hongo crese formando una colonia sobre

el conducto auditivo externo.

ACEITES ESENCIALES.

Los aceites esenciales son las fracciones liquidas volátiles, responsables de dar el aroma a las

plantas y de gran importancia en la industria como son la cosmética (perfumes y

aromatizantes), alimentos (saborizantes y condimentos) y la farmacéutica (saborizantes).

Los aceites esenciales suelen ser mezcla de aproximadamente 100 sustancias diferentes

alcoholes, acetonas, cetonas, éteres, aldehídos, y son producidos y almacenados en los canales

secretores de las plantas. (MAHECHA M. 2010; Martínez, 2003)

En gran mayoría los aceites esenciales son de olor agradable, aunque existen otros de olor

desagradable como son el ajo y la cebolla, ya que contienen compuestos azufrados.

Los aceites esenciales se pueden clasificar en base a diferentes criterios como son:

consistencia, origen y naturaleza química de sus compuestos mayoritarios.

De acuerdo con sus consistencia los aceites esenciales se clasifican en:

o Esencias fluidas: Son líquidos volátiles a temperatura ambiente.

o Balsámicos: Son de consistencia más espesa y poco volátiles

o Oleorresinas: Estos aceites tienen el aroma de las plantas de forma concentrada,

normalmente son muy viscosos.

De acuerdo a su origen, son clasificados como

o Naturales: Se obtienen directamente de la plana y no sufren modificaciones

físicas ni químicas.

o Artificiales: Se obtienen a través de procesos de enriquecimiento de la misma

esencia.

12 | P á g i n a

o Sintéticos: Producidos por la combinación de sus componentes, normalmente

producidos por procesos de síntesis química.

Con este trabajo de investigación se busca evaluar el efecto antifúngico de ciertos aceites

esenciales en la inhibición de la especie de hongo que es ‘’Aspergillus sp.’’ ya que se sabe que

uno de los compuestos de los aceites esenciales son los grupos fenólicos y este es un potente

fungicida, y no se ha demostrado hasta este momento que esta sustancia produzca efectos

cancerígenos sobre seres vivos, esto haría finalmente del empleo de aceites esenciales como

desinfectante uno de los métodos más seguros de desinfección.

MATERIALES Y METODOLOGIA

MICROORGANISMOS, MODELOS PARA ENSAYOS

Para esta investigación fue necesario el uso de diferentes cepas de hongos como son:

Aspergillus sp, Aspergillus Flavus, Aspergillus Fumigatus, y Aspergillus Nidulans,

Proporcionados por el cepario del laboratorio de micología ambiental y médica del Centro de

Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, de la Benemérita Universidad Autónoma de

Puebla (ICUAP-BUAP).

ACEITES ESENCIALES Y MEDIOS DE CULTIVO NECESARIOS.

Para este trabajo de investigación fue necesario el uso de aceites esenciales tales como: aceite

esencial de naranja (Citrus sinensis), hoja lanceolada o lanza (Salix humboldtiana) y Azalea

(Rhododendron simsii), con pureza no especificada, proporcionados por el laboratorio de

micología ambiental y médica del Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, de

la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (ICUAP-BUAP).

Medio de cultivo: Agar Czapek Dox (ver anexo A)

Medio de cultivo: Agar dextrosa-Sabouraud. (ver anexo B)

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TÉCNICA DE DILUCIÓN EN TUBO

Se necesita de diluciones seriadas logarítmicas decimales de base 10 (ver anexo C), (1:10,

1:100, 1:1000, 1:10’000 y 1:100’000) con la cepa de interés para realizar el ensayo, con ayuda

de tubos con reactivo de McFarland (ver anexo D), para verificar la densidad óptica de la

primera dilución (1:10) y así obtener una concentración inicial de hongos de aproximadamente

3X108.

MÉTODO DE ENSAYO

Para realizar este ensayo se necesita colocar dentro de tubos eppendorf (estériles) 100 µL de

las diluciones 1:10’000 y 1:100’000, y adicionarles el mismo volumen de aceite esencial,

manteniéndolos en contacto durante 15 y 30 minutos (colocar volúmenes en tubos diferentes

para cada intervalo de tiempo), al termino de estos tiempos de contacto se tomaran con ayuda

de una micropipeta con puntas estériles 200 µL de cada intervalo de tiempo para su posterior

siembra por método de extensión superficial descrita por Camacho (Camacho et al. 2009) (ver

anexo E) en cajas petri con agar Czapek Dox o Sabouraud, e incubarlos durante 7 días a una

temperatura de 28°C, con sus respectivas replicas y sus respectivos controles (sin adicionarles

aceite y solo tomando 100 µL de la solución directa), para su posterior conteo de células

viables tomando en cuenta los parámetros de conteo celular descritas por Camacho (Camacho

et al. 2009).

RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS.Luego de concluir los días de incubación a las condiciones necesarias para que el hongo en

cuestión pueda desarrollarse en el medio, se realizara un conteo total de UFC que crecieron en

las cajas Petri, y así mismo se tomara el diámetro de las UFC, tanto de las placas control como

de los ensayos, para poder así obtener el porcentaje de actividad antifúngica de los aceites

esenciales por medio de la siguiente fórmula:

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Donde: N0 - Numero de microorganismos iniciales (placa control); Nt - Numero de

microorganismos sobrevivientes a tiempo (ensayos); E – Porcentaje de actividad antifúngica.

Donde: T – Porcentaje del crecimiento del micelio inhibido, cm; Dk – Diámetro del colonias

control (placas control); D0 – Diámetro de colonias en experimento.

RESULTADOS

Obteniendo los siguientes resultados:

Tabla1. Resultados de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Nidulans’’ y Aceite de Azalea

(Rhododendron simsii).

Figura 1.1.- conteo promediado de UFC de Aspergillus Nidulans y aceite de azalea.

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Aspergillus Nidulans y Aceite de Azalea Diluciones Porcentaje de efectividad Promedio de efectividad

Serie. Dup. 10´000 Promedio 100´000 Promedio 10'000 100'000 10'000 100'000Control 526 526 Valor estimado 120 120 12.3574144 18.75

15 min A 442 461 Valor estimado 109 97.5 12.1673004 13.3333333B 480 86Control 526 526 Valor estimado 120 120 11.9771863 7.916666667 General= 12.7503169

30 min A 536 463 Valor estimado 138 110.5B 390 83

Como resultado de este enfrentamiento se muestra gráficamente el crecimiento promediado de

la placa control y la placa del enfrentamiento, dando como resultado solo el 12% de actividad

antifúngica para este aceite.

Tabla2. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Fumigatus’’ y Aceite de Azalea

(Rhododendron simsii).

Figura 2.1 conteo promediado de UFC de Aspergillus Fumigatus y aceite de azalea.


la placa control y la placa del enfrentamiento, dando como resultado el 54.81% de actividad

antifúngica para este aceite y este genero de hongo.

16 | P á g i n a

Aspergillus Fumigatus y Aceite de Azalea Diluciones Porcentaje de efectividad Promedio de efectividad

Serie. Dup. 10´000 Promedio 100´000 Promedio 10'000 100'000 10'000 100'000Control 524 524 Valor estimado 0 0 50.95419847 0

15 min A 255 257 0 0 Cresimiento ext. 54.8187023 0B 259 0Control 524 524 Valor estimado 0 0 58.68320611 0 General= 54.8187023

30 min A 219 216.5 0 0 Cresimiento ext.B 214 0

Tabla 3. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Fumigatus’’ y Aceite de Hoja Lanza (Salix

humboldtiana)

Figura 3.1. conteo promediado de UFC de Aspergillus Fumigatus y aceite de Hoja lanza.



antifúngica para este aceite y este género de hongo.

Tabla 4. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Flavus’’ y Aceite de Hoja Lanza (Salix

humboldtiana)

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Aspergillus Fumigatus y Aceite de Hoja lanza Diluciones Porcentaje de efectividadPromedio de efectividad

Serie. Dup. 10´000 Promedio 100´000 Promedio 10'000 100'000 10'000 100'000Control 525 525 Valor estimado 525 525 Valor estimado 90.6666667 98.8571429

15 min A 43 49 4 6 Valor estimado 75.7142857 93.9047619B 55 8Control 525 525 Valor estimado 525 525 Valor estimado 60.7619048 88.952381 General= 84.8095238

30 min A 198 206 63 58B 214 53

Aspergillus Flavus y Aceite de Hoja lanza Diluciones Porcentaje de efectividad Promedio de efectividad

Serie. Dup. 10´000 Promedio 100´000 Promedio 10'000 100'000 10'000 100'000Control 294 294 59 59 31.97278912 98.3050847

15 min A 200 200 1 1 Valor estimado 48.8095238 88.1355932B 0 0Control 294 294 59 59 65.6462585 77.9661017 General= 68.4725585

30 min A 91 101 5 13 Valor estimadoB 111 21

Figura 4.1 conteo promediado de UFC de Aspergillus Flavus y aceite de Hoja lanza.



antifúngica para este aceite y este género de hongo.

Tabla 5. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Flavus’’ y Aceite de Azalea (Rhododendron

simsii).

Figura 5.1 conteo promediado de UFC de Aspergillus Flavus y aceite de azalea.

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Aspergillus Flavus y Aceite de Azalea Diluciones Porcentaje de efectividad Promedio de efectividad


15 min A 244 263 20 21.5 6.46258503 61.0169492B 282 23Control 294 294 Valor estimado 59 59 2.380952381 58.47457627 General= 33.7397671

30 min A 273 287 13 24.5B 301 36


la placa control y la placa del enfrentamiento, dando como resultado solo el 33.73% de

actividad antifúngica para este aceite y este genero de hongo.

Ensayos adicionales.Se realizaron otros ensayos adicionales, pero debido a la duración de este trabajo de investigación no se pudieron completar en su totalidad, dando solo los siguientes resultados:

Tabla 6. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Nidulans’’ y Aceite de naranja (Citrus

sinensis).

Figura 6.1 Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Nidulans’’ y Aceite de naranja (Citrus

sinensis).

19 | P á g i n a

Aspergillus Nidulans y Aceite de Nranja Diluciones Porcentaje de efectividad Promedio de efectividad

Serie. Dup. 10´000 Promedio 100´000 Promedio 10'000 100'000 10'000 100'000Control 37 37 Valor estimado 19 19 100 100

15 min A 0 0 0 0 100 100B 0 0Control 37 37 Valor estimado 19 19 100 100 General= 100

30 min A 0 0 0 0B 0 0


la placa control y la placa del enfrentamiento, dando como resultado 100% de actividad


Tabla 7. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Fumigatus’’ y Aceite de naranja (Citrus

sinensis).

Figura 7.1. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus Fumigatus’’ y Aceite de naranja (Citrus

sinensis).




20 | P á g i n a

Aspergillus Fumigatus y Aceite de Nranja Diluciones Porcentaje de efectividad Promedio de efectividad

Serie. Dup. 10´000 Promedio 100´000 Promedio 10'000 100'000 10'000 100'000Control 100 100 Valor estimado 130 130 30 57.69230769

15 min A 50 70 50 55 27.5 46.1538462B 90 60Control 100 100 Valor estimado 130 130 25 34.61538462 General= 36.8269231

30 min A 80 75 70 85B 70 100

Tabla 8. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus sp. ’’ Numero 1 y Aceite de naranja (Citrus

sinensis).

Figura 8.1. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus sp. ’’ Numero 1 y Aceite de naranja

(Citrus sinensis).

Como resultado de este enfrentamiento se muestra graficamente el cresimiento promediado de

la placa control y la placa del enfrentamiento, dando como resultado el 100% de actividad

antifungica para este aceitey este genero de hongo.

21 | P á g i n a

Aspergillus sp N1 y Aceite de Nranja Diluciones Porcentaje de efectividad Promedio de efectividad

Serie. Dup. 10´000 Promedio 100´000 Promedio 10'000 100'000 10'000 100'000Control 460 460 Valor estimado 322 322 100 100

15 min A 0 0 0 0 100 100B 0 0Control 460 460 Valor estimado 322 322 100 100 General= 100

30 min A 0 0 0 0B 0 0

Tabla 9. Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus sp. ’’ Numero 2 y Aceite de naranja (Citrus

sinensis).

Figura 9.1 Resultado de enfrentamiento entre ‘’Aspergillus sp. ’’ Numero 2 y Aceite de naranja (Citrus

sinensis).



antifúngica para este aceite este genero de hongo.

22 | P á g i n a

Aspergillus sp N2 y Aceite de Naranja Diluciones Porcentaje de efectividad Promedio de efectividad


15 min A 321 220 39 23 42.2101449 64.28571429B 119 7Control 414 414 Valor estimado 70 70 37.56038647 61.42857143 General= 53.24792961

30 min A 237 258.5 33 27B 280 21

CONCLUSION.

Finalmente obteniendo estos resultados podemos concluir lo siguiente:

El aceite esencial de cascara de naranja (Citrus sinensis), fue el mas efectivo en la inhibición

de Aspergillus Nidulans, con una actividad fungicida del 100%, mientras que para Aspergillus

Fumigatus, el aceite esencial más efectivo fue el de hoja lanza (Salix humboldtiana) con una

actividad antifúngica de 68.47%.

Así mismo en los ensayos adicionales con cepas de ‘’Aspergillus sp’’ diferentes,

demostramos que para la cepa 1 de ‘’Aspergillus sp’’ la actividad fungicida de este aceite fue

del 100%, por otro lado para la cepa número 2 del mismo hongo demostró solo un 53% de

efectividad.

Es importante mencionar también que los ensayos adicionales se realizaron en ‘’Aspergillus

sp’’, por lo tanto no es posible tener una respuesta exacta sobre el tipo de hongo que fue

inhibido en tu totalidad por el aceite de naranja.

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ANEXOS.

Anexo A.- Agar Czapek Dox.Es un medio empleado para el aislamiento y conservación de algunos Actinomycetes, se utiliza también para la identificación de Aspergillus spp Y Penicillium spp.

Su composición es la siguiente:

Sacarosa 30 g Nitrato de sodio 2 g Fosfato dipotasico 20g Sulfato de magnesio 0.5g Cloruro potásico 0.5g Sulfato ferroso 15g Agar 15g Agua destilada 1000 ml

Procedimiento:1. Disolver los ingredientes en el agua.2. Se deja reposar durante 10 minutos.3. Se esteriliza durante 15 minutos a 121 °C.

Anexo B.- Medio de cultivo: Agar dextrosa-Sabouraud. Es un medio de utilizado para el aislamiento, identificación y mantenimiento de la gran mayoría de los hongos patógenos.

Su composición es la siguiente:

Peptona 10 g Glucosa 20g Agar-agar 20g Agua destilada 1000 ml

Procedimiento:4. Disolver los ingredientes en el agua.5. Se deja reposar durante 10 minutos.6. Ajustar pH a 5.67. Se esteriliza durante 15 minutos a 121 °C.

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Anexo C.- Técnica de dilución seriada logarítmica decimal base 10.

Se necesitan:

1 tubo con rosca y 10 ml de agua destilada (esterilizado a 121 °C por 15 minutos)

5 tubos con rosca y 9 ml de agua destilada (esterilizado a 121 °C por 15 minutos)

Procedimiento:

Teniendo los hongos sembrados en Agar ya sea Sabouraud o Czapek dox, con una aza

bacteriológica de raspa repetidas veces la superficie del agar a donde se encuentra la cepa, con

la finalidad de separar las esporas del agar y poder posteriormente ser adicionadas a el tubo

con agua de 10 ml, el cual se debe comparar con el reactivo de McFarland y su estándar de 1,

debido a que este estándar tiene una concentración de partículas de 3X108 que es

aproximadamente la misma cantidad de esporas que necesitamos para los ensayos

Anexo D.- McFarland.

El reactivo de McFarland (Pro-lab Diagnostic. 2012; Biolife Italiana S.r.l. 2004) está

constituido originalmente con una combinación de cloruro de bario y ácido sulfúrico, que

produce un floculo, el cual tiene una densidad de 600 o 625 nm. Existen varios estándares del

reactivo de McFaland los cuales tiene diferentes densidades como son:

Tabla estándar McFarland. El cual está compuesto por los estándares de McFarland (0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 y

5.0) y en la otra columna el conteo bacteriano aproximado x 108

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Anexo E.- Técnica de sembrado por extensión superficial en placa

Procedimiento:

1. Distribuir las cajas con el medio Czapek o Sabouraud estéril en la mesa de trabajo.

Marcar las cajas petri con los datos necesarios antes de inocularlas.

2. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilución 1:10’000 y 1:100’000 en cada caja,

mediante pipeta estéril.

3. Para distribuir de manera homogénea, extender el inoculo utilizando una varilla de

vidrio estéril (en forma de escuadra) haciendo girar la placa de manera perpendicular al

medio con la mano izquierda, hasta lograr la completa incorporación del inoculo en el

medio.

Figura 1.- técnica de sembrado superficial en agar.

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GLOSARIO.

PLURITO: picor, picazón o comezón, de todo el cuerpo o área local.

NEFROTOXICO: Efecto toxico sobre el riñón.

TERATOGENICA: Sustancia toxica que puede producir o aumentar la posibilidad de producir alteraciones al feto.

CARCINOGENA: Sustancia que puede producir o aumentar la posibilidad de contraer cáncer.

Referencias.

- Acevedo Trujillo Daniel, Micotoxinas, casos clínicos y efectos nutricionales.

- Alcalá Luis, Muñoz Patricia, Peláez Teresa y Bouza Emilio, Aspergillus y Aspergilosis.

- Arenas Roberto y Arenas Guzmán Roberto, 2008, Micología médica ilustrada, (Ed.)

McGraw-Hill, 265-275.

- Biolife Italiana S.r.l. 2004, Scheda Tecnica. STANDARD McFARLAND B I- 0

- Camacho, A., M. Giles, A. Ortegón, M. Palao, B. Serrano y O. Velázquez. 2009. Técnicas

para el Análisis Microbiológico de Alimentos.

- Carrillo Leonor, Hongos de alimentos y forrajes

- Larondelle Iván, 2000, Curso de micotoxinas, Agronomía UNLPam

- López Martínez Rubén, 1995, Micología médica: Procedimientos para el diagnóstico de

laboratorio, (Ed.) Trillas, 116-120, 151-175.

- MAHECHA MAHECHA CAMILO ANDRES, 2010, ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y

ANTIBACTERIANA DE ACEITES ESENCIALES EXTRAIDOS DE HOJAS Y FRUTOS

DE Siparuna sessiliflora

- Martínez M. Alejandro, 2003, Aceites esenciales,

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- M. en C. Laura Elena Santana Contreras, M. en C. Poncio Acosta Ma. Zulema, 2011,

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL, 14-19

- NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos

para su análisis microbiológico.

-M.V.Z. Noé M. Laura patricia, Manual de Laboratorio Para Preparación de Soluciones.

- Ona Montiejûnaité, Dalia Peciulyte, 2004, Fungicidal properties of Pinus sylvestris L. For

improvement of air quality.

-Pro-lab Diagnostic. 2012, MCFARLAND STANDARDS.

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inhibicion de aspergillus sp. por aceites esenciales

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