1

INDHOLDSFORTEGNELSE

FORKORTELSER 2

ABSTRACT 3

RESUMÉ 3

1. INDLEDNING 4

1.1 GlcNAc i et biologisk perspektiv 4

1.2 Glycosylering med GlcNAc som donor 5 1.2.1 Beskyttelse af kvælstof 5 1.2.2 Den anomere leaving-gruppe 7

1.3 Reaktivitet og stereokemi 8

1.4 Oxazoliner som glycosyl-donorer 9

1.5 Katalysator 10

1.6 Projektidé 11

2. RESULTATER OG DISKUSSION 12

2.1 Fremstilling af donor 12

2.2 Glycosyleringsreaktionerne 14

2.3 Potentielle acceptorer 17

3. KONKLUSION 20

4. EXPERIMENTAL SECTION 22

4.1 General methods 22

4.2 Preparation of glycosyl donor 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose [3] 22

4.3 Preparation of allyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside [5] 23

4.4 Preparation of benzyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside [6] under various conditions

24

4.5 α/β-mixture as glycosyl donor resulting in benzyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside

[6] and 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranose [7] 26

4.6 Preparation of potential acceptor N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-serine methyl ester (Fmoc-L-serine

methyl ester) [8] 27

4.7 Preparation of potential acceptor methyl 2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranoside [10] 27

2

Forkortelser

aa aksiel-aksiel

Ac acetyl

ae aksiel-ækvatoriel

br bred

Bn benzyl

d dublet

DCE 1,2-dichloroethan

DCM dichloromethan

dd dobbel dublet

ddd dobbel dobbel dublet

dt dobbel triplet

eq ækvivalent

Et3N triethylamin

Et2O diethylether

EtOAc ethylacetat

EtOH ethanol

h time

J koblingskonstant

M molær

m multiplet

Me methyl

mp melting point

MS massespektroskopi

NMR nuclear magnetic resonance

OTf triflat

ppm parts per million

RE rare earth metal

Rf retentionsfaktor

rt stuetemperatur

s singlet

t triplet

t-Bu tert-butyl

TfOH triflinsyre

THF tetrahydrofuran

TLC thin layer chromatography

TMSOTf trimethylsilyl triflat

3

Abstract

The focus of the project was on β-glycosides with N-acetylglucosamine

(GlcNAc) as the donor. A stereoselective reaction, like this, demands neighbouring-group

participation from the C-2 substituent. This gives various possibilities, but the 2-acetamido-

group was used directly, and so no use of any special nitrogen-protecting group was made

here. 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose, that can form an

oxazoline by means of activation, was used as donor in the glycosylation reactions. The

purpose was to optimize the reaction conditions, with regard to catalyst and solvent, in

order to speed the glycosylations up and to get high yields. Furthermore the use of different

acceptors was to be exploited, with the synthesis of the important disaccharide as the final

goal. Benzyl alcohol proved to be an excellent acceptor for the many test experiments,

which were carried out. Sc(OTf)3 as catalyst and DCM or DCE as solvent proved to give

the best results.

Resumé

Projektets fokus var på β-glycosider med N-acetylglucosamin (GlcNAc) som

donor. En sådan stereoselektiv reaktion kræver nabo-gruppe deltagelse fra C-2

substituenten. Dette giver forskellige valgmuligheder, men her blev 2-acetamido-gruppen

anvendt direkte, og der blev altså her ikke gjort brug af særlig kvælstof-beskyttelse. 2-

acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose, der ved hjælp af aktivering

kan danne en oxazolin, blev benyttet som donor i glycosyleringsreaktionerne. Formålet var

at optimere reaktionsbetingelserne mht. katalysator og solvent, således at reaktionstiden for

glycosylering blev lav og udbyttet højt. Ydermere skulle anvendelsen af forskellige

acceptorer udforskes med det endelige mål at syntetisere det vigtige disaccharid chitobiose.

Benzyl alkohol viste sig at være en udmærket acceptor til de mange testforsøg, der blev

udført. Sc(OTf)3 som katalysator og DCM eller DCE som solvent viste sig at give de bedste

resultater.

4

1. Indledning

1.1 GlcNAc i et biologisk perspektiv

N-acetylglucosamin (GlcNAc) (Figur 1), er et monosaccharid med stor

biologisk betydning, idet denne sukker-forbindelse er en vigtig komponent i eksempelvis

mange glycoproteiner, glycolipider og glycosaminoglycaner.

O

OH

HOHO

NHAc

OH

Figur 1 N-acetyl-β-D-glucosamin

Bl.a. har -formen en stor rolle i den kemiske postmodificering af proteiner, hvor

denne sukker-forbindelse bindes kovalent til ilt i threonin og serin sidekæder (O-GlcNAc

glycosylering) samt til kvælstof i asparagin sidekæder (N-GlcNAc glycosylering). Der er

foretaget studier, som taler for, at O-GlcNAc glycosyleringen har lignende egenskaber med

phosphoryleringen – altså at en dynamisk påsætning og fjernelse af β-O-GlcNAc, til

specifikke steder i proteinet, har indflydelse på den cellulære regulering af protein-aktivitet1.

En anden vigtig egenskab ved GlcNAc, er dets rolle i ABO-blodtype-systemet, hvor dette

monosaccharid indgår i alle de tre forskellige oligosaccharid-kæder, der kan sidde på

overfladen af de røde blodlegemer, og som definerer blodtypen2.

Polysaccharidet chitin består udelukkende af GlcNAc-enheder, sammensat i en lang

uforgrenet kæde med β-1,4-bindinger, i analogi med cellulose. Chitin, som er et elastisk og

forholdsvist stærkt materiale, er hovedkomponent i svampes cellevægge, indgår i

exoskelettet i mange leddyr (bl.a. insekter) og kan kirurgisk benyttes som bionedbrydelig

tråd3. Chitobiose (GlcNAcβ-4GlcNAc), et disaccharid, som udskilles af edderkopper og af

nogle planter, er den mindste ”repeating unit” i chitin. Netop to β-1,4-bundne GlcNAc

molekyler er de første to enheder i den kerne af monosaccharider, der er bundet til peptid-

kæden ved N-GlcNAc glycosylering. Dette er en af grundene til at, chitobiose kan være

interessant at kunne syntetisere.

1 Zachara, N, E.; Hart, G. W., Chem. Rev., 2002, 102, 431-438

2 Berg, J. M.; Tymoczko, J. L.; Stryer, L., Biochemistry, W. H. Freeman and Company, 2002, 305

3 http://en.wikipedia.org/wiki/Chitin

5

1.2 Glycosylering med GlcNAc som donor

Som beskrevet ovenfor, har glycosider indeholdende GlcNAc en stor biologisk

betydning, og syntesen af sådanne forskellige glycosider har derfor været – og er stadig – et

område, der forskes meget indenfor. Der findes adskillige metoder til at danne β-glycosider

af GlcNAc. Den umiddelbart mest oplagte måde, ville være at benytte en donor, der

allerede har acetamido-funktionaliteten på C-2, men dette kan volde problemer. Med en 2-

acetamido-2-deoxy-glycosyl donor, ses – ved hjælp fra en aktivator – nabo-gruppe

deltagelse, hvilket medfører dannelsen af først et oxazolinium-intermediat og dernæst en

oxazolin (Skema 1)4,5

. En indlysende fordel ved anvendelse disse oxazoliner som donorer,

er at den ønskede stereoselektivitet (1,2-trans) opnås, idet nukleofilt angreb fra acceptoren

(R’OH) kun kan ske ”ovenfra”, resulterende i ækvatoriel position. En ulempe, er derimod at

de kan være ustabile overfor hydrolyse, hvilket især er problematisk ved kromatografi.

Ydermere udviser disse oxazoliner forholdsvis lav reaktivitet, hvorfor der kræves relativt

hårde reaktionsbetingelser, i form af stærk syre og høje temperaturer, når glycosyleringen

udføres med dem som donor. Dette kan føre til nedbrydning af både oxazolin og glycosid5,

hvilket selvsagt ikke er hensigtsmæssigt.

O

OR

RORO

ONH

O

OR

RORO

ON

O

OR

RORO

HNX

O

Aktivator

Oxazolinium Oxazolin

O

OR

RORO

NHAc

OR'

R'OH

Skema 1 Omdannelsen af O-beskyttet GlcNAc til oxazolin og i sidste ende glycosid

1.2.1 Beskyttelse af kvælstof

Der er derfor udviklet en række metoder, hvor kvælstof beskyttes før

glycosyleringen udføres, så oxazolin-dannelsen undgås. En af de meget benyttede

beskyttelsesgrupper, er phtalimido-gruppen (Figur 2).

4 Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og

Blackwell Science, 2000, 123 5 Wittmann, V.; Lennartz, D., Eur. J. Org. Chem, 2002, 1363-1367

6

N OO

Figur 2 Phtalimido-gruppen

Ligeledes her, er en af fordelene, at det udelukkende er den ønskede diastereomer,

β-glycosidet, der dannes. Denne stereoselektivitet skyldes til dels sterik, da gruppen har en

betragtelig volumen. Forklaringen er dog i højere grad den anchimeriske assistance til det

anomere kulstof, der udføres fra en af carbonyl-grupperne4, hvilket øger hastigheden af

leaving gruppens udtrædelse. Ulempen ved denne beskyttelsesgruppe, er besværligheder

omkring afbeskyttelsen. Idet phtalimido-gruppen kløves med overskud af base, kan dens

afbeskyttelse nemt påvirke andre base-følsomme funktionelle grupper.

Carbamater (-NHCOOR) er en anden klasse af N-beskyttelsesgrupper, der er nabo-

gruppe deltagende, og som derfor skaber preference for 1,2-trans glycosider. Troc (R =

trichloroethyl), Boc (R = t-Bu) og Cbz (R = benzyl) er nogen af de jævnligt anvendte

carbamater4. Deres afbeskyttelse sker under relativt sure betingelser. En anden mulighed,

som Yeung og co-workers har benyttet sig af, er at anvende methyl carbamat (R = Me), der

kan afbeskyttes under væsentligt mildere betingelser (MeSiCl3), hvilket betyder at

eventuelle andre beskyttelsesgrupper ikke påvirkes af dette6.

En alternativ metode, til dannelsen af rene β-glycosider, er enzymatisk

glycosylering. F.eks. har Kobayashi og co-workers7 fået koblet to GlcNAc enheder sammen

vha. enzymet chitinase, som er det fordøjelsesenzym, der bryder glycosidbindingerne i

chitin. Oxazolinet af GlcNAc benyttes her som donor, GlcNAc benyttes som acceptor, og

herudfra dannes chitobiose enzymatisk ved svagt basisk pH. En bemærkelsesværdig

kvalitet ved denne fremgangsmåde er muligheden for ubeskyttede hydroxylgrupper i de

anvendte saccharider. I de andre beskrevne metoder anvendes beskyttelsegrupper på ilt,

men med den enzymatisk katalyserede proces, er dette overflødigt, og eventuelle problemer

med senere afbeskyttelse kan herved undgås.

6 Yeung, B. K. S. et al., Org. Lett., 2000, vol. 2, 3135-3138

7 Kobayashi, S.; Kiyosada, T.; Shoda, S., Tetrahedron Letters, 1997, vol. 38, 2111-2112

7

De ovennævnte metoder har alle været stereoselektive overfor β-anomeren.

Når der benyttes en ikke-deltagende nabo-gruppe, vil α-glycosidet typisk også dannes.

Azido-gruppen (-N3) er en af disse beskyttelses-grupper, der er meget anvendt. Fordele er,

at den er nem at introducere i molekylet, nem at afbeskytte vha. reduktion og er stabil

overfor både ret sure og ret basiske betingelser. Den indlysende ulempe, når det er β-

glycosidet, vi er interesserede i, er naturligvis den manglende stereoselektivitet. Ofte

dominerer dannelsen af α-anomeren pga. anomer-effekten (omtales senere), selvom

selektiviteten afhænger meget af andre forhold, såsom den anvendte aktivator, den anomere

leaving-gruppe osv8.

1.2.2 Den anomere leaving-gruppe

Valget af leaving-gruppe (X) på det anomere kulstof (Skema 1) er en faktor,

der har stor indflydelse på reaktiviteten og stabiliteten af donoren. Koenigs og Knorr er

blevet kendt for deres anvendelse af glycosyl halider (X = Br-/Cl

-), typisk med aktivering

fra et sølv-salt, hvor kompleks-dannelse mellem halid og sølv forbedrer leaving-gruppe-

udtrædelsen8,9

. Haliderne følger den normale trend for leaving-gruppe-evne, og bromiderne

er altså mest reaktive, men derfor også ustabile. Chloriderne er derimod mere stabile, men

udviser til gengæld lavere reaktivitet. Den generelle reaktivitet af glycosyl haliderne

afhænger i høj grad af valget af beskyttelsesgrupper på sukkerens hydroxyl-grupper, hvilket

også påvirker stabiliteten. Et peracetyleret glycosyl-bromid er et udmærket valg, da det er

ret stabilt og samtidig udviser god reaktivitet ved tilstedeværelsen af en aktivator.

Thioglycosider (X = -S-R, R = alkyl/aryl) er en gruppe af donorer, der bruges

meget, da de har en række fordele8,10

. Deres aktivering kan ske med mange forskellige

promotorer, eksempelvis MeOTf, men et fællestræk for disse er, at den aktive del er en

kation af den ene eller anden art, eksempelvis Me+ i fald MeOTf anvendes. På denne måde

dannes en sulfonium-ion (+SR3), således at den anomere leaving gruppe (SR2) udtræder

som et neutralt molekyle. Thioglycosider udviser en høj stabilitet, og kan derfor tåle mange

forskellige reaktionsbetingelser, hvilket er en stor fordel.

8 Banoub, J. et al., Chem. Rev., 1992, 92, 1167-1195

9 Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og

Blackwell Science, 2000, 105 10

Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og

Blackwell Science, 2000, 109

8

Trichloroacetamidater (X = -OC(NH)CCl3) er endnu en leaving-gruppe, der

har fundet bred anvendelse i glycosyleringsreaktioner. Deres aktivering sker typisk med

BF3 • Et2O eller TMSOTf8,11

, idet disse Lewis syrer kobler til kvælstof, hvorved en bedre

leaving gruppe dannes. Trichloroacetamidater har derudover en rimelig stabilitet.

En knap så anvendt anomer leaving-gruppe er acetat-gruppen (X = -OCOCH3),

pga. den relativt lave reaktivitet sådanne glycosyl-donorer udviser. Ikke desto mindre

benyttes acetat ofte som beskyttelses-gruppe på sukkerens hydroxyl-grupper, idet det

syntese-mæssigt er nemt og selv meget sterisk hindrede hydroxyl-grupper kan acetyleres12

.

Når dette udføres på en ubeskyttet sukker, bliver også den anomere hydroxyl-gruppe

acetyleret. Det er derfor en fordel at kunne anvende acetat som leaving gruppe, da der i så

fald ikke er behov for efterfølgende selektiv reaktion på det anomere kulstof, ved

fremstillingen af glycosyl-donoren. Ved aktivering fra en Lewis syre, f.eks. SnCl4 eller BF3

• Et2O8, kan acetat udmærket benyttes som leaving-gruppe.

1.3 Reaktivitet og stereokemi

I forhold til elektronegative substituenter på det anomere kulstof, er der en

generel regel, som siger at aksielle anomerer er mere stabile end ækvatorielle anomerer,

hvilket er i modstrid med den normale trend, hvor ækvatorielle substituenter generelt er

mest stabile. Dette fænomen inden for sukker-kemien skyldes den såkaldte anomer-effekt,

der kan forklares ud fra et kig på orbitaler13

. Kort fortalt skyldes anomer-effekten den

stabiliserende effekt en elektronegativ substituent (X) har, når den er placeret aksielt, som

følge af positiv orbital-interaktion mellem en lonepair-orbital (n) fra det endocykliske ilt og

en anti-bindende orbital (σ*) fra C1-X-bindingen (Figur 3). Denne hyperkonjugation sker

ikke i β-anomeren, hvor substituenten sidder ækvatorielt. Ydermere gælder det at jo mere

elektronegativ substituenten er, jo mere udpræget er præferencen for den aksielle

konfiguration.

11

Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og

Blackwell Science, 2000, 107 12

Davis, B. G.; Fairbanks, A. J., Carbohydrate Chemistry, Oxford University Press, 2002, 21 13

Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og

Blackwell Science, 2000, 11-13

9

Figur 3 Anomer-effekten

En anden væsentlig effekt, der påvirker reaktiviteten af glycosyl-donoren, er

konfigurationen af de andre substituenter i sukkeren. Jensen og Bols har forsket indenfor

dette felt, hvor det har vist sig at donorer med aksielle elektron-tiltrækkende grupper er

mere reaktive end med ækvatorielle14

.

1.4 Oxazoliner som glycosyl-donorer

Oxazoliner har som nævnt behov for aktivering, i form af syre-katalyse fra enten en

Brønsted syre eller en Lewis syre, for at glycosyleringen finder sted. I nogle af de første

forsøg udført med oxazolin-donorer, blev forholdsvist skrappe betingelser anvendt,

eksempelvis p-toluensulfonsyre i nitrometan og toluen under refluks8. Forbedringer af

reaktionsbetingelser; herunder valg af katalysator; førte til brugen af Lewis syrer som FeCl3

eller TMSOTf som aktivatorer med DCE som solvent. Som Banoub konstaterer, har det

netop været de barske reaktionsbetingelser (stærk syre, høje temperaturer), der har været

den primære begrænsende faktor i forhold til glycosylering med disse donorer8.

I forsøg udført af Wittmann og Lennartz5, er der fundet mildere og stadigt effektive

betingelser, der tillader at benytte oxazoliner som donorer. Denne mildere aktiverings-

metode, omfatter brugen af Cu(II) salte (CuBr2, CuCl2), da oxazoliner er kendt som gode

ligander i Cu(II)-komplekser. Der rapporteres dog om ineffektivitet ved brugen af andre

Cu(II) salte, eksempelvis Cu(OTf)2. Katalysator-mængden er i de beskrevne forsøg

forholdsvist høj, da der tilsættes 1 eq. i forhold til mængden af donor. Mht. solventer, blev

THF, MeCN, DCE og CHCl3 screenet, hvor sidstnævnte viste sig at give de bedste

resultater.

I en anden metode, beskrevet af Crasto og Jones15

, bruges ligeledes oxazoliner som

donorer, men i stedet for Cu(II) salte benyttes her lanthanid triflater som katalysator – af

14

Jensen, H. H.; Bols, M., Acc. Chem. Res, 2006, 39, 259-265 15

Crasto, C. F.; Jones, G. B., Tetrahedron Letters, 2004, 4891-4894

10

økonomiske årsager vælges Yb(OTf)3. En umiddelbar fordel i forhold til Wittmann og

Lennartz er mængden af anvendt katalysator, idet der her opnås gode resultater ved brug af

30 mol%. Ved tilsætning af Et3N ophører glycosyleringen, hvilket afspejler vigtigheden af

tilstedeværelsen af TfOH i den katalytiske cyklus, som de formoder forløber som vist i

Skema 2. TfOH har altså rollen som proton-donor, for at opnå acetamido-funktionalitet og

OTf- er med til gendannelsen af katalysatoren.

Skema 2 Katalytisk cyklus ved brugen af Yb(OTf)3 foreslået af Crasto og Jones15

1.5 Katalysator

Brugen af forskellige RE triflater, heriblandt lanthanoid triflater, som aktivatorer i

glycosyleringsreaktioner er ikke noget fuldstændigt nyt fænomen, og udover den

ovennævnte metode fra Crasto og Jones, er der opnået flere gode resultater. Bl.a. har

Adinolfi og co-workers udført forsøg med Yb(OTf)3 som aktivator16

. Glycosyl

trichloroacetamidater og trifluoroacetamidater er her anvendt som donorer og forskellige

beskyttede glycosider er anvendt som acceptorer. På denne måde har de fået dannet både

di- og tri-saccharider, hvor sidstnævnte blev fremstillet fra tre monosaccharider i ”one-pot”

syntese. Yb(OTf)3 er anvendt i meget små mængder (3 mol% i tilfældet med

trichloroacetamidater), men der er her anvendt et co-solvent i form af pivalonitril (t-BuCN),

som synes at have positiv effekt på både reaktionshastighed og β-stereoselektivitet.

16

Adinolfi, M. et al., Synlett, 2006, no. 4, 583-586

11

Også Yamanoi og co-workers har haft succes med brugen af RE triflater som

promoter, i deres tilfælde primært Sc(OTf)317

. Glycosyldonorerne er her 1-C-alkyl-α-D-

glucopyranoser, hvor den anomere leaving gruppe er acetat, som altså her sidder på et

tertiært kulstof. Som acceptor anvendes enten en simpel primær alkohol eller galactose med

en fri 6-OH. Ligeledes her anvendes katalysatoren i små mængder (5-7.5 mol% afhængig af

acceptor). De resulterende glycosider fås med fine udbytter og med α-stereoselektivitet.

Reaktionerne er udført ved lav temperatur (0 °C) og reaktionstiderne er korte (1-3 h).

Et stort stykke arbejde, der afdækker brugen af RE triflater indenfor organisk

syntese, er udført af Kobayashi og co-workers18

. Med udgangspunkt i et udpluk af de

adskillige organiske reaktioner, der er Lewis syre katalyserede, har de undersøgt brugen af

RE(OTf)3 som nye katalysatorer. Fordelen ved disse, frem for de traditionelt anvendte

Lewis syrer, såsom AlCl3, BF3 og SnCl4, er bl.a. deres stabilitet ved tilstedeværelsen af

vand. I langt de fleste tilfælde er en katalytisk mængde nok til at reaktionerne forløber til

ende og disse katalysatorer kan nemt genvindes efter brug og genbruges. Dette gør alt i alt

disse RE triflater til betydeligt mere gunstige katalysatorer end de hidtil anvendte.

Mht. katalyse af glycosylering, har de undersøgt effektiviteten af primært Sc(OTf)3

og Yb(OTf)3 som aktivatorer i en række reaktioner. Selv med meget små mængder (ned til

0.5 mol%), opnås gode udbytter med kort reaktionstid ved lave temperaturer (højst 53 °C)

og udmærket stereoselektivitet, hvor β-anomeren i de fleste tilfælde dannes i stort overskud,

med mindre LiClO4 er tilsat.

1.6 Projektidé

I stedet for at beskytte kvælstof i GlcNAc, for efterfølgende at afbeskytte, udnyttes

den nabo-gruppe deltagelse 2-acetamido funktionaliteten kan udføre via oxazolin-formen.

Dog vil oxazolinen ikke blive isoleret og anvendt som donor, men derimod vil peracetyleret

GlcNAc blive anvendt direkte som glycosyl-donor. Ved tilsætning af en aktivator, vil

oxazolin-formen dannes og selv samme aktivator skal så katalysere

glycosyleringsreaktionen mellem den dannede oxazolin-donor og den tilsatte acceptor, som

pga. anchimerisk assistance vil være 100 % stereoselektiv overfor β-glycosidet. Aguilera og

co-workers har udført samme forsøg, netop med peracetyleret GlcNAc og med benzyl

17

Yamanoi, T. et al., Letters in Organic Chemistry, 2005, 2, 242-246 18

Kobayashi, S. et al., Chem Rev., 2002, 102, 2227-2302

12

alkohol som acceptor, men ved anvendelsen af FeCl3, ZnCl2 eller kamfersulfonsyre som

syre-promoterer19

.

Fordele ved denne metode er, at man undgår N-beskyttelse med eksempelvis

phtalimido-gruppen, som kan give problemer mht. afbeskyttelse og derudover undgås

isolering af ustabilt oxazolin. I projektet skal effektiviteten af forskellige katalysatorer –

primært RE triflater, der ikke er så vandfølsomme – og solventer undersøges med henblik

på øget udbytte og nedsat reaktionstid. Formålet er ligeledes at udforske anvendelsen af

forskellige alkoholer – herunder andre sukre – med det endelige mål at syntetisere

disaccharidet chitobiose.

2. Resultater og diskussion

2.1 Fremstilling af donor

O

OH

HOHO

NH2

OH

O

OAc

AcOAcO

NH2

OAc

O

OH

HOHO

N

OH

O

O

OAc

AcOAcO

N

OAc

O

O

OAc

AcOAcO

NHAc

OAc

HCl

HCl

1 2

3

a b

c d

a. 1 M aq NaOH, p-anisaldehyd; b. pyridin, eddikesyre-anhydrid;

c. varm acetone, HCl; d. Et3N, eddikesyre-anhydrid

Skema 3

Fremstilling af donor 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose

2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose [3] blev

anvendt som glycosyl-donor i den række af forsøg, der blev udført. Første trin i

fremstillingen, er imin-beskyttelse af den primære amin i D-glucosamin hydrochlorid [1]

(Skema 3). Imin-dannelsen udføres med p-anisaldehyd i en vandig opløsning af NaOH, for

at neutralisere overskydende syre. Den nødvendige syre-katalyse udføres af det HCl der

19

Aguilera, B., Jiménez-Barbero, J., Fernández-Majoralas, A.; Carbohydrate Research, 1998, 308,

19-27

13

frigives ved opløsning af sukker-forbindelsen, idet der ikke tilsættes yderligere syre.

Mekanismen for den syre-katalyserede imin-dannelse fra en primær amin og et aldehyd ses

i Skema 4.

O

NH2

OHHO

O

H Ar

O

NH2

OHHO

Ar

O

O

NH

OHHO

Ar

HO

+/- H H

O

NH

OHHO

Ar

H2O

O

NH

OHHO

Ar

-H O

N

OHHO

Ar

Skema 4 Mekanisme for imin-dannelsen. (Ar = p-methoxyphenyl)

Beskyttelsen medvirker først og fremmest, at aminen ikke påvirkes af acetyleringen

af ilt, og når det udføres med p-anisaldehyd, resulterer volumenet af beskyttelsesgruppen i,

at kun β-formen dannes når ilt beskyttes. Dette er favorabelt, idet anomer-effekten

indebærer at β-anomeren, er mere reaktiv end α-anomeren, som forklaret ovenfor. En anden

fordel ved en imin med en aromatisk substituent på dobbeltbindingen, er at disse er

betydeligt mere stabile end andre iminer20

.

Acetylering af de frie hydroxyl-grupper foretages med eddikesyre-anhydrid og

pyridin. Sidstnævnte har først og fremmest den opgave at ”fange” den ækvivalente mængde

eddikesyre, der dannes under reaktionen. Derudover kan pyridin katalysere reaktionen ved

enten generel base-katalyse eller nukleofil katalyse12

. Efter O-acetyleringen skal iminen

afbeskyttes med syre i form af HCl med varm acetone som solvent, for at få saltet af O-

acetyleret glucosamin. 2-acetamido funktionaliteten kan fremstilles med eddikesyre-

anhydrid og Et3N som base21

.

Da dette blev forsøgt udført i praksis, opstod et problem, idet N-beskyttelsesgruppen

faldt af ved acetyleringen af ilt. Iminer er syre-labile, og hydrolyseres let ved

tilstedeværelsen af syre og vand, hvilket må være hvad der er sket. Det faktum at

opløsningen var sur efter reaktionsforløbet, tyder ligeledes på at neutraliseringen af

20

Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic chemistry, Oxford University Press,

2001, 350 21

Kiso, M.; Anderson, L, Carbohydrate Research, 1985, 136, 309-323 brugt som inspiration

14

overskydende syre ikke har været tilstrækkelig. En mulig løsning på dette problem, kunne

være tilsætning af et større overskud af base (pyridin).

Udover at beskyttelsesgruppen var mistet, viste NMR, at kvælstof var blevet

acetyleret i samme ombæring og tilmed at ren β-form var dannet, hvilket tyder på at det

anomere kulstof blev acetyleret mens iminen stadig var intakt. At det var ren β-anomer, der

var dannet, kunne ses fra NMR, idet signalet fra H-1 for det første lå ved 5.69 ppm, hvilket

er lavere end for den tilsvarende α-anomer og for det andet havde en koblingskonstant til

det aksielle hydrogen-atom på C-2 på 8.8 Hz, som svarer til en aa-kobling og ikke en ae-

kobling. Det ønskede produkt blev altså dannet, trods problemer med den syre-labile imin,

hvilket var et overraskende resultat.

2.2 Glycosyleringsreaktionerne

2-acetamido funktionaliteten blev anvendt på glycosyl-donoren, pga. den

anchimeriske assistance der udføres, hvilket som nævnt danner oxazolin-formen og hermed

styrer stereoselektiviteten. Oxazolin-dannelsen starter med udtrædelse af leaving-gruppen,

der her er acetat, hvilket lettes ved hjælp fra en aktivator. Aktivatoren er her den samme

Lewis syre, som katalyserer selve glycosyleringen, muligvis med en positiv ladning. Ved

leaving-gruppe-udtrædelsen dannes en oxocarbenium-ion som intermediat. Det anomere

kulstof angribes af carbonylen i amidet, hvilket forårsager dannelsen af et nyt intermediat;

en oxazolinium-ion. Efter deprotonering fås oxazolinen [4] (Skema 5).

OAcOAcO

HN

OAc

O

Yb(OTf)2AcOOAcO

AcO

AcO

OAcOAcO

AcO

HN O

OTf

OAcOAcO

AcO

N OHN

O3 4

Skema 5 Dannelsen af oxazolin, her med +Yb(OTf)2 som aktivator

Det er oxazolinen [4], der indtræder som donor i den katalytiske cyklus, som vist i

Skema 2. Katalysatoren, i sin kationiske form (her +Yb(OTf)2), koordinerer til kvælstof, og

der dannes et kontakt-ionpar mellem dette kompleks og katalysatorens modion (her -OTf). I

et sådant kontakt-ionpar, er der intet solvent mellem de to modioner. Man siger at ionerne

15

er fanget i et ”solvent-bur”22

. Når en glycocyl-acceptor i form af en alkohol (ROH) angriber

det reaktive ion-par, er den aksielle side af det anomere kulstof blokeret, således at kun det

ønskede β-glycosid dannes. Udover den fordel nabo-gruppe-deltagelsen giver mht.

stereoselektivitet, har donoren den kvalitet, at den anomere leaving-gruppe sidder

ækvatorielt, hvilket øger reaktiviteten pga. anomer-effekten.

Alle glycosyleringsreaktionerne blev udført i tørt solvent under nitrogen-atmosfære

for at undgå angreb fra vand på det anomere kulstof. Der blev benyttet 3 eq. acceptor og

~16 mol% katalysator i reaktionerne.

Første test-forsøg med den fremstillede donor blev udført med allyl alkohol som

acceptor, Yb(OTf)3 som katalysator og DCM som solvent ved 45 °C, således at refluks blev

opnået. Valget af donor viste sig at være mindre hensigtsmæssigt, idet der ved kromatografi

på silica kun var ringe adskillelse af glycosidet og alkoholen. Bortset fra det, forløb

reaktionen som forventet med nogenlunde godt udbytte (80 %) og 100 % stereoselektivitet.

Det varede dog 30 h, før reaktionen var forløbet til ende, hvilket er lang tid. Flere forsøg

blev derfor udført for at finde reaktionsbetingelser, der kunne reducere reaktionstiden.

O

OAc

AcOAcO

NHAc

OAcO

OAc

AcOAcO

NHAc

OR5 R = Allyl6 R = Benzyl3

Katalysator

3 eq. alkohol

Skema 6 Den katalyserede glycosyleringsreaktion

I den næste række af forsøg blev benzyl alkohol anvendt som acceptor (Tabel

1), idet der pga. dennes apolære karakter, var fin adskillelse fra glycosidet med TLC og

søjle kromatografi. I første omgang blev en række RE triflater testet som aktivatorer i DCM

ved 45 °C. La(OTf)3, Sc(OTf)3, Sm(OTf)3 og Yb(OTf)3 (indgang a, b, c og d) gav

nogenlunde ens udbytter (75-84 %), men hvad der var værd at bemærke, var varigheden af

forsøget med Sc(OTf)3, da reaktionstiden her var helt nede på 4 h, i modsætning til

forsøgene med de andre tre katalysatorer, som alle var ~22 h om at få reaktionen til at løbe

til ende.

22

Anslyn, E. V.; Dougherty, D. A., Modern Physical Organic Chemistry, University Science Books,

2006, 640

16

I de næste fire forsøg, anvendtes Sc(OTf)3 derfor som katalysator, men med

solventet som variationsparameter. Temperaturen blev holdt ved 45 °C, for at de opnåede

resultater kunne sammenlignes. DCE, THF, toluen og MeCN blev screenet som solventer

(indgang e, f, g og h), hvor DCE gav det bedste resultat med en reaktionstid på 6 h, hvilket

dog stadig ikke var bedre end med DCM. Alle fire reaktioner gav noget lavere udbytter (48-

69 %) end de foregående forsøg med DCM, hvilket eventuelt kan skyldes at ingen af de fire

solventer havde kogepunkter lave nok til at refluks blev opnået ved 45 °C.

Da DCM tilsyneladende var det bedste af de afprøvede solventer, blev de næste fire

forsøg med nye katalysatorer udført i DCM og stadig ved samme temperatur. De fire

katalysatorer, der blev testet for at runde katalysator-delen af, var CuBr2, Cu(OTf)2,

Dy(OTf)3 og Nd(OTf)3 (indgang i, j, k og l), altså to RE triflater mere samt to kobber-salte.

Dy(OTf)3 og Nd(OTf)3 udviste omtrent samme effektivitet, som de tidligere afprøvede

lanthanid triflater (La, Sm og Yb) med udbytter på hhv. 83 % og 88 % og en reaktionstid på

20 h. CuBr2 katalyserede reaktionen udmærket, hvilket også var forventet på baggrund af

resultaterne fra Wittmann og Lennartz5, dog var udbyttet betydeligt lavere end for RE

triflaterne (57 %) og varigheden af reaktionen var på > 24 h. Det lave udbytte, kan muligvis

forklares med den vandfølsomhed CuBr2 udviser. Reaktionsblandingen var, f.eks. ved

udtag til TLC, i kontakt med atmosfærisk luft, hvilket kan have haft betydning for

stabiliteten af CuBr2. Cu(OTf)2 var ligeledes en succesfuld katalysator, hvilket umiddelbart

er i modstrid med resultater fra nævnte artikel, idet Wittmann og Lennartz betegner

Cu(OTf)2 som ”essentially ineffective”. Denne aktivator gav bestemt udmærkede resultater

med en lav reaktionstid (8 h) og et acceptabelt udbytte på 69 %. De nævner da også selv

oxazoliners glimrende evne til at danne komplekser til Cu(II)-salte5.

Hernæst udførtes et forsøg med DCE under refluks (indgang m). Ved at hæve

temperaturen til 90 °C blev reaktionstiden betydeligt sænket (1½ h). En forøget temperatur,

havde altså en positiv effekt på både udbytte og reaktionstid, hvilket også var forventeligt.

Til sidst blev et kontrolforsøg udført (indgang n), for at bekræfte at reaktionen ikke ville

forløbe uden tilsætning aktivator. Selv ved høj temperatur (90 °C) skete ingen

glycosylering, heller ikke efter 30 h. Anvendelsen af katalysator var altså nødvendig for

glycosyleringen.

Der blev ydermere udført to forsøg hvor donoren var en blanding af diastereomere i

forholdet α/β ≈ 13:1, for at undersøge om den mindre reaktive α-anomer ville undergå

glycosylering ved de anvendte reaktionsbetingelser (Skema 7). Benzyl alkohol blev også

17

her anvendt som acceptor og Sc(OTf)3 hhv. Yb(OTf)3 blev anvendt som katalysator i de to

forsøg. TLC viste at kun en lille del af donoren reagerede, hvilket må anses som en klar

indikation af, at kun β-anomeren reagerede. Efter søjle-kromatografi blev kun én organisk

fraktion opsamlet, og dette blev identificeret som uomdannet α-anomer af udgangsstoffet.

Der har tilsyneladende været så lidt dannet β-glycosid, at dette er forsvundet ved

oparbejdning og oprensning. Kun 35 % ureageret α-anomer blev opsamlet efter

kromatografi ifølge beregninger. Der var dog stadig en del solvent i α/β-blandingen, da det

blev afvejet inden starten på reaktionerne, hvilket naturligvis gjorde det beregnede udbytte

lavere end det faktiske. Tilstedeværelsen af solvent ved afvejning, reducerede ydermere den

mængde β-glycosid, der potentielt kunne dannes, hvilket gør det mere rimeligt at det ikke

var at finde efter oprensning. Ikke desto mindre må det konkluderes, at det kun var β-

anomeren af donor, der blev koblet med acceptoren og at reaktionsbetingelserne altså ikke

var kraftige nok til at lade α-anomeren reagere.

O

OAc

AcOAcO

NHAc

Katalysator

O

OAc

AcOAcO

NHAc

OBnOAc 3 eq. benzyl alkohol

= 13:1

O

OAc

AcOAcO

AcHNOAc

+

Major Minor7 6

Skema 7 Forsøg på glycosylering af α/β-blanding

Uanset valget af solvent og katalysator, var reaktionerne 100 % stereoselektive og

det var således kun β-glycosidet, der blev dannet.

2.3 Potentielle acceptorer

Idet de optimale reaktionsbetingelser var fundet, kunne der i højere grad

fokuseres på anvendelse af forskellige acceptorer i glycosyleringen. Allyl alkohol og benzyl

alkohol er ”almindelige” primære alkoholer og blev anvendt blot for at teste metoden. Som

beskrevet i indledningen, er GlcNAc et monosaccharid, der forekommer mange steder i

naturen, og det ville derfor være interessant at udforske muligheden for at anvende

eksempelvis aminosyrer og andre sukre som acceptorer.

Aminosyren serin, er et potentielt site for O-glycosylering i peptider og

proteiner, og koblingen af GlcNac til serin-sidekæden, er derfor ikke uvæsentlig at kunne

18

udføre syntetisk. Da serin i sin naturlige form (L-serin), har en fri amin, som også kan være

et potentielt acceptor-site, er det nødvendigt med en N-beskyttelsesgruppe når denne skal

benyttes som acceptor. Her valgtes den meget anvendte fluorenylmethyloxycarbonyl

(Fmoc), der beskytter mod elektrofiler, og som ikke kan tabes ved substitution som Cbz og

t-Boc kan23

, idet fluorenylmethyl-delen er en dårlig leaving-gruppe. L-serin blev anvendt i

methyl-ester formen. Mekanismen bag beskyttelsen er nukleofil substitution på carbonyl-

kulstof, med et tetraedrisk intermediat, som vist i Skema 8.

H2NO

OH

O

O Cl

O

FmocNH

O

OH

O

- HCl

8

O NH2

O ClOH

O

O

O N

OH

O

O

O

Cl

H H

Skema 8 Dannelsen af Fmoc-L-serin methyl ester

Beskyttelsen blev udført med 9-Fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc-Cl),

som Fmoc-donor og med L-serin methyl ester hydrochlorid i 1,4-dioxan. Der blev tilsat

vandig Na2CO3 for at neutralisere overskydende syre. Efterfølgende afbeskyttelse af Fmoc

skal ske med base, f.eks en amin, idet den alifatiske proton i fluorenyl-delen, er sur (pKa≈

25). Efter deprotonering fås et 14-elektron aromatisk system, hvorpå der sker elimination,

således at et fulven-derivat dannes. Efter decarboxylering fås den frie afbeskyttede amin23

(Skema 9).

O NH

O

R

HO N

H

O

R

BaseO N

H

O

R

+

Base-HCO2

+ NH2-R

Skema 9 Afbeskyttelse af Fmoc

23

Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic chemistry, Oxford University Press,

2001, 656-657

19

At Fmoc-L-serin methyl ester [8] kan anvendes som acceptor, understøttes af forsøg

udført af Wittmann og Lennartz5, hvor allyl esteren af Fmoc-L-serin anvendes som

acceptor. Dette forløber med fint udbytte, men reaktionstiden er temmelig lang i

sammenligning med alkoholer som 2-propanol og cyklohexanol. Også pentafluorophenyl

(Pfp) esteren af serin med Fmoc-beskyttelse kan udmærket anvendes i glycosylering24

.

En potentiel sukker-acceptor, skal optimalt være et saccharid med kun en fri

hydroxyl-gruppe og beskyttelsesgrupper på de resterende. En sådan kunne være methyl

2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid [10], som kan fremstilles ved ringåbning af den

tilsvarende benzyliden-beskyttede sukker [9], således at 4-OH-gruppen blottes. Dette blev

gjort ved selektiv reduktion med NaCNBH3 som hydrid-donor og med HCl i Et2O som

Lewis syre. CNBH3- er mindre voluminøs end eksempelvis AlH4

- og regioselektiviteten

styres derfor af elektroniske faktorer. På denne måde vil Lewis syren (her H+) koordinere til

det mere basiske ilt (O-4), resulterende i en fri hydroxyl-grupe på C-4 og O-benzyl på C-625

.

Mekanismen er angivet i Skema 10.

OOBnO

BnOOMe

OPhO

O

HOBnO

BnOOMe

Ph

H

H

BC H

H H

N

O

OBn

HOBnO

BnOOMe9 10

Skema 10 Regioselektiv ringåbning af 4,6-benzyliden acetal

Desværre var omdannelsen langt fra fuldstændig. Der blev ikke tilsat nok syre i

første omgang og heller ikke tilstrækkeligt NaCNBH3, så begge dele skulle tilsættes igen i

løbet af reaktionsforløbet. Reaktionen blev stoppet efter to dage og efter oparbejdning og

søjlekromatografi blev der opsamlet to faser. Disse blev som forventet identificeret som

hhv. uomdannet udgangsstof [9] og produkt [10]. Dog var der kun genvundet 11 % af

udgangsstoffet og udbyttet blev kun 13 %, hvilket må siges at være et skuffende resultat.

24

Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og

Blackwell Science, 2000, 162 25

Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og

Blackwell Science, 2000, 43

20

Den dannede sukker-forbindelse er en potentiel acceptor, hvor den frie 4-OH-

gruppe er det ”reaktive site”. Denne hydroxyl-gruppe er ofte den mindst reaktive i

glycosyleringsreaktioner, men ikke desto mindre, kan den anvendes som ”koblings-site” til

en glycosyldonor. Eksempelvis anvender Yeung og co-workers en acceptor med en fri 4-

OH-gruppe, hvor donoren er et trichloroacetamidat6. Også Dasgupta og Anderson benytter

flere forskellige acceptorer med en fri hydroxyl-gruppe på C-4 i både aksiel og ækvatoriel

position26

. Deres erfaring var, at udbyttet blev højest når acceptorerne blev tilsat som det

sidste til reaktionsblandingen.

Tiden tillod desværre ikke forsøg på kobling mellem de to fremstillede acceptorer

og donoren. Andre udførte forsøg giver dog et fingerpeg om at det bør kunne lade sig gøre,

selvom det muligvis giver knap så høje udbytter og kræver betydeligt længere

reaktionstider. Forhåbentlig og formodentlig kan de optimerede betingelser også anvendes

med acceptorer, som de to omtalte og lignende, således at det vil være muligt at koble en

sukkerforbindelse til et peptid, eller i det mindste en aminosyre, samt at fremstille

disaccharider med denne metode.

3. Konklusion

26

Dasgupta, F.; Anderson, L., Carbohydrate Research, 1990, 202, 239-255

21

Peracetyleret GlcNAc blev med succes anvendt som donor i en række

glycosyleringsreaktioner, der må formodes at gå gennem en oxazolin, som dernæst indgår i

en katalytisk cyklus, hvorved det ønskede β-glycosid dannes. Både allyl alkohol og benzyl

alkohol var udmærkede acceptorer, men benzyl alkohol blev foretrukket af praktiske

årsager. Alle de afprøvede katalysatorer var i en vis udstrækning effektive, dog var RE (La,

Sc, Sm, Yb, Dy, Nd) triflaterne, de aktivatorer, der gav de højeste udbytter. DCM, som er

det lavest kogende af de screenede solventer, gav gode resultater ved refluks (45 °C). Da

DCE blev anvendt ved dobbelt så høj temperatur (90 °C), blev reaktionstiden mere end

halveret. De optimale rektionsbetingelser må konkluderes at være Sc(OTf)3 som katalysator

med enten DCM eller DCE som solvent. Dette giver højt udbytte og lav reaktionstid, hvor

en høj temperatur er en forbedrende faktor.

Der er dog også et økonomisk aspekt at overveje. Mht. prisen på de forskellige

katalysatorer (se Tabel 1), er Sc(OTf)3 nemlig klart den dyreste (1671.12 DKK/5g), hvilket

gør det økonomiske aspekt værd at anskue. Til langt færre penge, fås Nd(III)(OTf)3 (294.48

DKK/5g), Sm(III)(OTf)3 (333.36 DKK/5g) eller Dy(III)(OTf)3 (455.76 DKK/5g), som alle

gav lignende udbytter under de samme forhold og med meget ens reaktionstider (20-22 h).

Tiden for at få reaktionerne til at løbe til ende er altså væsentligt længere, men til gengæld

er udgiften betragteligt mindre. I forhold til hvilken katalysator, der bør anvendes, skal der

altså træffes et valg mellem tid og penge. På baggrund af andre publicerede resultater, kan

de udviklede reaktionsbetingelser formodentlig anvendes til koblingen af GlcNAc med en

aminosyre eller et andet monosaccharid.

22

4. Experimental section

4.1 General methods

When needed, solvents were distilled and equipment was dried before use. Reactions were

followed using TLC. The TLC plates were developed using a suitable staining system

followed by heating. Columns for flash chromatography were packed with silica gel (60 Å)

and an appropriate proportion between EtOAc and pentane was used as eluent.

1H and

13C NMR experiments were recorded in deuterated chloroform, CDCl3 (signals at

7.26 and 77.16 in 1H and

13C NMR respectively), on a Varian Mercury 400 NMR

instrument. 1H NMR was recorded at 400 MHz and

13C NMR at 100 MHz. The spectra

were analyzed partly by means of comparison with data from the literature on equivalent or

similar compounds. Low-resolution mass spectral analyses were made on a Micromass LC-

TOF instrument. Optical rotation was measured on a PE-314 polarimeter. Melting points

were measured on a Büchi B-540.

4.2 Preparation of glycosyl donor 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-

deoxy-β-D-glucopyranose [3]27

O

OAc

AcOAcO

NHAc

OAc

D-glucosamine hydrochloride [1] (25 g, 116 mmol) was dissolved in a freshly prepared aq.

solution of 1 M NaOH (120 mL). p-anisaldehyde (17 mL, 140 mmol) was added while

stirring. After ~1 h crystallization began. The mixture was cooled. The precipitation was

filtered and washed with cold water and subsequently with a 1:1 mixture of EtOH/Et2O.

The product (2-deoxy-2-[p-methoxybenzylidene(amino)]-D-glucopyranoside [2]) was

evaporated. (Crude yield: 42.1 g, 122 %). This intermediate product was dissolved in

pyridine (135 mL), the solution was cooled (ice bath) and Ac2O (75 mL, 793 mmol) was

added successively. The mixture was left overnight. The yellow solution was poured into

500 mL of ice-water and another 1000 mL was added. No precipitation observed.

Neutralization with NaHCO3. The mixture was extracted 3 times with DCM. 10 % of the

organic extract was evaporated with toluene and allowed to stand at rt. After several

27

procedure inspired by: Myszka, H. et al., Carbohydrate research, 2003, 338, 133-141

23

minutes precipitation could be observed. The precipitated product was washed with a 2:1

mixture of pentane/EtOAc and filtered. Subsequently the remaining organic extract was

evaporated with toluene, precipitation by addition of Et2O. Filtration of the product. This

product was surprisingly identified as the per-acetylated GlcNAc (with impurities). It was

washed with DCM and purified by flash column chromatography, resulting in [3]. (11.56 g,

26 %)

Rf: 0.34; mp: 186-189 °C; 1H-NMR: δ (ppm) 5.69 (d, J1,2 = 8.8 Hz, 1H, H-1), 5.44 (br d,

JNH,2 = 10.0 Hz, 1H, NH), 5.17-5.09 (m, 2H, H-3+H-4), 4.33-4.24 (m, 2H, H-2+H-6a), 4.13

(dd, J5,6b = 2.4 Hz, J6b,6a = 6.2 Hz, H-6b), 3.79 (ddd, J5,6b = 2.4 Hz, J5,6a = 4.8 Hz, J4,5 = 9.6

Hz, 1H, H-5), 2.11 (s, 3H, CH3), 2.08 (s, 3H, CH3), 2.04 (s, 3H, CH3), 2.03 (s, 3H, CH3),

1.92 (s, 3H, CH3); 13

C-NMR: δ (ppm) 171.44 (CO), 170.89 (CO), 170.31 (CO), 169.79

(CO), 169.46 (CO), 92.86 (C-1), 73.18, 72.83, 67.93, 61.87, 53.27, 23.41 (CH3), 21.11

(CH3), 20.94 (CH3), 20.85 (CH3), 20.79 (CH3); MS: 412.1 ([3]+Na+ = 412.34) (data in

accordance with references28,29

)

4.3 Preparation of allyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-

glucopyranoside [5]

O

OAc

AcOAcO

NHAc

O

Per-acetylated GlcNAc [3] (212 mg, 0.54 mmol) and Yb(III)(OTf)3 (50 mg, 0.08 mmol)

were dissolved in dry DCM (2.5 mL) and allyl alcohol (0.11 mL, 1.6 mmol) was added.

Reflux (45°C) under nitrogen for ~30 h. The mixture was diluted with DCM, washed with

water, extracted 2 times with DCM and dried over anhydrous MgSO4. Purification by flash

column chromatography with EtOAc gave white crystals (168 mg, 80 % yield) identified as

the desired product [5].

28

mp from: Horton, D.; J. Org. Chem, 1964, 1776-1782 29

SDBS used as reference for NMR-spectra: http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-

bin/direct_frame_top.cgi

24

Rf (EtOAc): 0.46 ; mp: 160-162 °C; 1H-NMR: δ (ppm) 5.90-5.81 (m, 1H, CH=CH2), 5.55

(br s, 1H, NH), 5.31-5.18 (m, 3H, H-3+CH=CH2), 5.07 (t, J3,4 ≈ J4,5 = 9.2 Hz, 1H, H-4),

4.71 (d, J1,2 = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.33 (dd, JO-CH2,HC=C = 4.4 Hz, Jgem,O-CH2 = 12.8 Hz, 1H, O-

CH2), 4.25 (dd, J5,6a = 4.8 Hz, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-6a), 4.13 (d, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-

6b), 4.08 (dd, JO-CH2,HC=C = 6.2 Hz, Jgem,O-CH2 = 12.8 Hz, 1H, O-CH2) 3.87 (k, JNH,2 ≈ J1,2 ≈

J3,4 = 9.2 Hz, 1H, H-2), 3.70-3.68 (m, 1H, H-5), 2.08 (s, 3H, CH3), 2.03 (s, 3H, CH3), 2.02

(s, 3H, CH3), 1.95 (s, 3H, CH3); 13

C-NMR: δ (ppm) 171.10 (CO), 170.93 (CO), 170.45

(CO), 169.62 (CO), 133.77 (CH=CH2), 118.00 (CH=CH2) 99.87 (C-1), 72.60, 72.01, 70.16,

68.92, 62.39, 54.96 (C-2), 23.54 (CH3), 20.96 (CH3), 20.91 (CH3), 20.85 (CH3); MS: 410.1

([5]+Na+ = 410.37) (data in accordance with reference

30)

4.4 Preparation of benzyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-

glucopyranoside [6] under various conditions

O

OAc

AcOAcO

NHAc

OBn

General procedure: Per-acetylated GlcNAc [3] (200 mg, 0.51 mmol) and catalyst (0.081

mmol) were dissolved in dry solvent (2.5 mL) and benzyl alcohol (0.17 mL, 1.6 mmol) was

added. The mixture was heated with condenser under nitrogen, until complete conversion

or until no more possible conversion. Reaction work-up was made by dilution with DCM

and wash with water, followed by extraction with DCM. The mixture was then dried over

anhydrous MgSO4 and purified by flash column chromatography with gradient, starting at a

1:1 mixture of pentane/EtOAc as eluent.

30

Aguilera, B., Jiménez-Barbero, J., Fernández-Majoralas, A.; Carbohydrate Research, 1998, 308,

19-27

25

Reaction Temp

[°C] Solvent

Bp

[°C] Catalyst

m

[mg]

Priceb

[DKK/5g] Duration Yield

a 45 DCM 39.8 La(OTf)3 47.5 1026.00 22 h 81 %

b 45 DCM 39.8 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 4 h 78 %

c 45 DCM 39.8 Sm(III)(OTf)3 48.4 333.36 22 h 84 %

d 45 DCM 39.8 Yb(III)(OTf)3

50.2 602.64c

22 h 75 %

e 45 DCE 83.5 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 6 h 69 %

fa

45 THF 67.0 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 >28 h 48 %

g 45 Toluene 110.6 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 11½ h 54 %

ha

45 MeCN 81.6 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 7½ h 62 %

i 45 DCM 39.8 CuBr2 18.1 144.72 >24 h 57 %

j 45 DCM 39.8 Cu(II)(OTf)2 29.3 578.16 8 h 69 %

k 45 DCM 39.8 Dy(III)(OTf)3 49.4 455.76 20 h 83 %

l 45 DCM 39.8 Nd(III)(OTf)3 47.9 294.48 20 h 88 %

m 90 DCE 83.5 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 1½ h 82 %

n 90 DCM 39.8 NONE!! - - >30 h 0 %

Tabel 1 The reactions performed with [3] as donor and benzyl alcohol as acceptor resulting

in [6]. aIn the case of the solvents THF and MeCN, the organic extracts were washed with a

saturated aq. solution of NaCl. bPrices were found on www.sigmaaldrich.com 7/8 2007.

cThe price for

Yb(III)(OTf)3 was only found for the hydrate (• xH2O)

Rf (EtOAc): 0.58; mp: 165-167 °C; 1H-NMR: δ (ppm) 7.35-7.26 (m, 5H, 5 Ar-H), 5.55 (br

s, 1H, NH), 5.20 (t, J2,3 ≈ J3,4 = 9.6 Hz, 1H, H-3), 5.07 (t, J3,4 ≈ J4,5 = 9.6 Hz, 1H, H-4), 4.88

(d, Jgem,CH2Ph = 12 Hz, 1H, CH2Ph), 4.64 (d, J1,2 = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.59 (d, Jgem,CH2Ph = 12

Hz, 1H, CH2Ph), 4.26 (dd, J5,6a = 4.8 Hz, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-6a), 4.15 (dd, J5,6b = 2.4

Hz, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-6b), 3.96 (k, J1,2 ≈ J2,3 ≈ JNH,2 = 8.4 Hz, 1H, H-2), 3.67 (ddd, 1H,

H-5), 2.10 (s, 3H, CH3), 2.01 (s, 6H, 2 CH3), 1.90 (s, 3H, CH3); 13

C-NMR: δ (ppm) 171.15

(CO), 170.96 (CO), 170.34 (CO), 169.60 (CO), 137.11 (C-ipso), 128.72 (Ar-C), 128.31

(Ar-C), 128.27 (Ar-C), 99.66 (C-1), 72.66, 72.10, 70.89, 68.84, 62.37, 54.75 (C-2), 23.51

26

(CH3), 20.99 (CH3), 20.90 (CH3), 20.84 (CH3); ( MS: 460.2 ([6]+Na+ = 460.43) (data in

accordance with reference31

)

4.5 α/β-mixture as glycosyl donor resulting in benzyl 2-acetamido-3,4,6-

tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside [6] and 2-acetamido-1,3,4,6-

tetra-O-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranose [7]

O

OAc

AcOAcO

NHAc

OBn

O

OAc

AcOAcO

AcHNOAc

Before synthesis, the α/β-mixture was purified by flash column chromatography with

EtOAc as eluent. Identified as a ~13:1 α/β-mixture. 1H-NMR: δ (ppm) 6.08 (d, J1,2 = 3.6 Hz,

1H, H-1α) (integral = 3.36), 5.64 (d, J1,2 = 8.8 Hz, 1H, H-1β) (integral = 0.25), 3.36/0.25 =

13.4.

The product was placed in two flasks (o: 162.9 mg, 0.42 mmol (0.39 mmol α-anomer); p:

171.2 mg, 0.44 mmol (0.41 mmol α-anomer)), catalyst was added (o: Sc(OTf)3, 30.9 mg,

0.063 mmol; p: Yb(III)(OTf)3, 40.9 mg, 0.066 mmol) and dry DCM (2.5 mL for each) was

added for dissolution. Addition of benzyl alcohol (0.14 mL, 1.3 mmol for each) and the

reactions were set to reflux (45°C) under nitrogen. Reactions stopped after 48 h. Work-up

as described above. Flash column chromatography of “o” in a 3:1 mixture of

pentane/EtOAc, resulting in only one organic fraction. This was identified as the α-anomer

of starting material [7] (52.8 mg, 35 % recovered).

Rf (EtOAc): 0.45; mp: 136-138 °C; 1H-NMR: δ (ppm) 6.14 (d, J1,2 = 3.6 Hz, 1H, H-1), 5.70

(br d, JNH,2 = 9.2 Hz, 1H, NH), 5.24-5.15 (m, 2H, H-3 + H-4), 4.45 (dt, J1,2 = 3.6 Hz, J2,3 ≈

JNH,2 ≈ 9.2, 1H, H-2), 4.22 (dd, J5,6a = 4.4 Hz, J6a,6b = 12.8 Hz, 1H, H-6a), 4.04 (dd, J5,6b =

2.4 Hz, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-6b), 3.97 (m, 1H, H-5), 2.16 (s, 3H, CH3), 2.14 (s, 3H, CH3),

2.06 (s, 3H, CH3), 2.02 (s, 3H, CH3), 1.91 (s, 3H, CH3) (data in accordance with reference31

)

31

Aguilera, B., Fernández-Mayoralas, A., Jaramillo, C.; Tetrahedron, 1997, vol. 53, 5863-5876

27

4.6 Preparation of potential acceptor N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-

L-serine methyl ester (Fmoc-L-serine methyl ester) [8]32

FmocNH

O

OH

O

9-Fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc-Cl) (1.1058 g, 4.27 mmol) was dissolved in 1,4-

dioxane (10 mL) and 10 % aq Na2CO3 (10 mL) and the mixture was placed on ice bath. L-

serine methyl ester hydrochloride (600 mg, 3.86 mmol) was added while stirring. The

reaction mixture was left at rt for 2¼ h, then diluted with water and extracted 2 times with

DCM. The extract was dried with anhydrous MgSO4 and purified with flash column

chromatography in a 1:1 mixture of pentane/EtOAc to give the protected amino acid [8]

(907.2 mg, 69 %).

Rf (EtOAc): 0.46; mp: 128-130 ˚C; [α]D295K

: + 6.9 ° (c 1, CHCl3); 1H-NMR: δ (ppm) 7.77

(d, J = 7.2 Hz, 2H, Ar-H (ortho)), 7.60 (br s, 2H, Ar-H (ortho)) 7.41 (t, J = 7.2 Hz, 2H, Ar-

H (meta/para), 7.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H, Ar-H (meta/para), 5.73 (br s, 1H), 4.44 (m, 3H),

4.23 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.96 (br d, 2H), 3.79 (s, 3H, CH3), 2.20 (br s, 1H); 13

C-NMR: δ

(ppm) 171.15 (CO), 143.90 (ipso), 141.54 (ipso), 127.99 (Ar-C), 127.32 (Ar-C), 125.29

(Ar-C), 120.24 (Ar-C), 67.43, 63.53, 56.24, 53.02, 47.39 (one signal missing from a C=O);

MS: (____) (data in accordance with references33,34

)

4.7 Preparation of potential acceptor methyl 2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-

glucopyranoside [10]35

O

OBn

HOBnO

BnOOMe

32

Procedure inspired by: Hale, K. J. et al., Tetrahedron Letters, 1996, vol. 37, 9345-9348 33

mp from: Lapatsanis, L. et al.; Synthesis, 1983, 8, 671-673 34

NMR of Fmoc-D-Ser methyl ester from: Rush, J; Bertozzi, C. R., Org. Lett., 2006, vol 8, 131-134

(found in supporting information) 35

Procedure from: Garerr, P. J.; Hultberg, H., Carbohydrate Research, 1981, 93, C10-C11

28

Methyl 2,3-di-O-benzyl-4,6-O-benzylidene-α-D-glucopyranoside [9] (2.3445 g, 5.1 mmol)

was dissolved in dry THF with activated 3 Å molecular sieves. Sodium cyanoborohydride

(2.9290 g, 46.6 mmol) was added and the mixture was cooled to 0°C (ice bath). HCl (1 M

in Et2O) (~8 mL) was added drop wise to the reaction. After ~1 h, more NaCNBH3 (0.4071

g, 6.5 mmol) and more acid (~25 mL) was added. The reaction was stopped after 2 days

(incomplete conversion). Mol. sieves and some precipitation were filtered out and washed

with DCM. The filtrate was poured into ice-water and allowed to stand at rt. Extraction 2

times with DCM. The organic extract and the DCM-fase from washing were collected.

Flash column chromatography resulting in two organic fractions. One identified as

unconverted starting material [9] (248.0 mg, 11 % recovered). The other identified as the

opened benzylidene [10] (296.8 mg, 13 % yield)

DATA [9]: Rf (EtOAc/pentane 1:2): 0.80; 1H-NMR: δ (ppm) 7.43 (m, 15H, Ar-H), 5.48 (s,

1H, CH-Ph), 4.86-4.75 (m, 3H, 3 CH2-Ph), 4.63 (d, J = 12.4 Hz, 1H, 1 CH2-Ph), 4.53 (d,

J1,2 = 3.6, 1H, H-1), 4.20 (dd, J4,5 = 4.4 Hz, J3,4 = 10 Hz, 1H, H-4), 3.98 (t, J2,3 ≈ J3,4 ≈ 9.2

Hz, 1H, H-3), 3.76 (dt, J4,5 = 4.4 Hz, J5,6a ≈ J5,6a ≈ 10.4 Hz, 1H, H-5), 3.64 (t, J5,6a = 10.4

Hz, 1H, H-6a), 3.53 (t, J5,6b = 9.6 Hz, 1H, H-6b), 3.49 (dd, J1,2 = 3.6 Hz, J2,3 = 9.2 Hz, 1H,

H-2), 3.33 (s, 3H, O-CH3); 13

C-NMR: δ (ppm) 138.96 (ipso), 138.39 (ipso), 137.64 (ipso),

129.14-126.26 (Ar-C), 101.50, 99.48, 82.37, 79.42, 78.83, 75.57, 74.02, 69.30, 62.56, 55.58;

MS: (___) (data in accordance with reference36

)

DATA [10]: Rf (EtOAc/pentane 1:2): 0.54; 1H-NMR: δ (ppm) 7.40-7.31 (m, 15H, 15 Ar-H),

5.03 (d, J = 11.6 Hz, 1H, CH2-Ph), 4.81-4.55 (m, 6H, 5 CH2-Ph + H-1), 3.83 (t, J2,3 ≈ J3,4 ≈

9.2 Hz, 1H, H-3), 3.76-3.71 (m, 3H, H-5 + H-6a + H-6b), 3.63 (t, J3,4 ≈ J4,5 ≈ 9.2 Hz, 1H,

H-4), 3.57 (dd, J1,2 = 3.2 Hz, J2,3 = 9.6 Hz, 1H, H-2), 3.42 (s, 3H, OCH3), 2.51 (br s, 1H, 4-

OH); 13

C-NMR: δ (ppm) 139.14 (ipso), 138.38 (ipso), 138.34 (ipso), 128.84-127.90 (Ar-C),

98.45 (C-1), 81.78, 79.93, 75.68, 73.85, 73.41, 71.00, 70.30, 69.80, 55.52; MS: (___) (data

in accordance with reference37

)

36

1H-NMR from: Elhalabi, J.; Rice, K. G., Carbohydrate Research, 2001, 335, 159-165

37 NMR from Elhalabi, J.; Rice, K. G., Carbohydrate Research, 2001, 335, 159-165