Il Genoma mitocondriale (mtDNA) umano

Il genoma umano 23 coppie di cromosomi + mtDNA

mtDNA

16569 bp

DNA

mitocondriale

Localizzato nei

mitocondri

htt

p:/

/ww

w.n

cb

i.n

lm.n

ih.g

ov/g

en

om

e/g

uid

e/

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

Cromosomi

sessuali

Autosomi

DNA nucleare

3,2 x 109 bp

Nucleo della cellula

(sequenziato “completamente” nel 2001) (sequenziato completamente nel 1981)

DNA mitocondriale umano (mtDNA)

• Genoma circolare extra-nucleare di 16569 coppie di basi (bp)

• Filamento leggero-L – ricco in citosine

• Filamento pesante-H – ricco in guanine

• Regione codificante (37 geni) – 2 rRNA (12S e 16S)

– 22 tRNA

– 13 proteine (OXPHOS)

• ND1-ND6 e ND4L (complesso I: NADH-Ubichinone ossidoreduttasi)

• Cyt b (complesso III: ubichinolo-citocromo b ossidoreduttasi)

• COI-COIII (complesso IV: citocromo c ossidasi)

• ATP 6, ATP 8 (complesso V: ATP sintetasi)

DNA mitocondriale umano (mtDNA) Regione di controllo

(16024-00576) 1

I complessi della catena respiratoria nel mitocondrio

Regione di controllo (16024-00576)

– HVS-I (16024 - 16400)

– HVS-II (00044 - 00340)

– HVS-III (00438 – 00576)

– CSB1, CSB2, CSB3 • sequenze conservate

– Origine di replicazione filamento H

nt 200 nt 400 nt 500

tRNA Phe CSB 1 CSB 2 CSB 3

TFAM TFAM TFAM TFAM

LSP

nt 100

OH tRNA Pro

nt 16000 nt 300

HVS-I (16024–16400)

HVS-II (44–340)

ITL

HSP1

ITH1

TFAM

HVS-III (438–576)

OH

Replicazione dell’mtDNA

• La replicazione è semi-conservativa ed indipendente dalla fase del ciclo cellulare – il turn-over dei mitocondri richiede sintesi del DNA anche in

cellule in G0 mentre l’nDNA si replica solo in fase S

• Coinvolte: – DNA polimerasi g, Fattori TF, RNA primers – no proofreading

• Il modello classico della replicazione del DNA mitocondriale (Clayton) descritta nell’Uomo (valido per tutti i Vertebrati)

• La modalità di replicazione secondo il modello è asincrona – entrambi i filamenti si replicano come leading strand, ma in

tempi diversi, formando una struttura detta D-loop (ansa) – dapprima inizia a replicarsi il filamento pesante (da OH) – l’origine del filamento leggero entra in funzione quando la

replicazione del filamento H giunge a tre quarti, dove incontra una struttura a forcina che viene riconosciuta dalla DNA polimerasi, attivando una particolare primasi ->inizio replicaz.

• Modello alternativo: nei mammiferi è stata proposta una modalità bidirezionale sincrona di replicazione, che parta contemporaneamente dalla regione OriH, oppure nelle immediate vicinanze (Holt et al.2000; Bowmaker et al.2003).

• La replicazione di entrambe le eliche richiede la presenza di

RNA primer di innesco. A livello dell' OH i primer sono

prodotti dall'RNA polimerasi mitocondriale, mentre

a livello dell'OL sono prodotti da una RNA primasi specifica.

• L’RNA polimerasi ha bisogno di TFAM per aprire il DNA, e due fattori TFBM.

• Si può formare una struttura ibrida a tripla elica (R-loop), su cui agisce una endoribonucleasi (Mitochondrial RNA-processing, MRP) che la processa a livello delle CSB (conserved sequence blocks). La proteina MRP lascia un primer per la DNA polimerasi γ (POLG) – Questa è formata da due subunità, quella maggiore ha attività polimersica ed esonucleasica 3’5’, che

inizia la replicazione del filamento pesante. La subunità minore aumenta la processività

• Intervengono proteine accessorie, come un’importante DNA elicasi (TWINKLE) e una Topoisomerasi che mantiene aperto il DNA – che deve rimanere svolto a lungo dato il sistema di replicazione – chiamata mtSSB (single strand binding protein), che presenta un’elevata similarità di sequenza con l’omologa in E. coli.

Replicazione dell’mtDNA (basi molecolari)

Replicazione dell’mtDNA (basi molecolari)

Regione di controllo (16024-00576)

– HVS-I (16024 - 16400)

– HVS-II (00044 - 00340)

– HVS-III (00438 – 00576)

– CSB1, CSB2, CSB3 • sequenze conservate

– LSP promotore filamento L

– HSP1 primo promotore filamento H

– ITL sito d’inizio della trascrizione per L

– ITH1 sito maggiore d’inizio della trascrizione per H

– TFAM siti di legame per fattore di trascrizione mitocondriale A

nt 200 nt 400 nt 500

tRNA Phe CSB 1 CSB 2 CSB 3

TFAM TFAM TFAM TFAM

LSP

nt 100

OH tRNA Pro

nt 16000 nt 300

HVS-I (16024–16400)

HVS-II (44–340)

ITL

HSP1

ITH1

TFAM

HVS-III (438–576)

OH

Variazione nel codice genetico barriera al trasferimento ulteriore di geni dal genoma mitocondriale a quello nucleare

• Si osservano deviazioni dal codice genetico universale in molti gruppi tassonomici. Il codice genetico universale è mantenuto nei protisti (es. Reclinomonas americana) e nelle piante.

• La deviazione più frequente si osserva per in codone UGA che invece di essere un codone di stop codifica per il Triptofano.

Mutazione e Fissazione

• Gli “errori” nella trasmissione genetica – Mutazioni puntiformi

– Inserzioni

– Delezioni

– Riarrangiamenti di vario tipo

sono alla base dei processi evolutivi che da una forma di vita

primitiva hanno prodotto la diversità delle forme di vita attuali

• La fissazione all’interno di una popolazione può risultare da: – selezione naturale

• capacità differenziata di riproduzione di individui geneticamente distinti (o genotipi) all’interno di una popolazione determinata dal proprio livello di adattamento all’ambiente rispetto ad altri individui della stessa specie

• contrasta la fissazione di mutazioni svantaggiose; favorisce la fissazione di mutazioni vantaggiose e non ha alcuna influenza sulle mutazioni neutrali

– deriva genica casuale (neutral genetic drift) • può produrre la fissazione di mutazioni neutrali attraverso un processo

stocastico per cui la frequenza dell’allele mutato può aumentare nel tempo in seguito ad un processo di tipo esclusivamente casuale

Mutazioni del DNA mitocondriale Il DNA mitocondriale può andare incontro a mutazioni genetiche di due categorie

riarrangiamenti strutturali o mutazioni puntiformi.

I riarrangiamenti strutturali osservati riguardano spesso delezioni

più raramente duplicazioni derivate da eventi di ricombinazione fra molecole diverse

Per quanto riguarda le delezioni, il D-loop viene sempre conservato, in quanto indispensabile per la replicazione.

Si possono avere mutazioni puntiformi, generalmente sostituzioni o delezioni di singoli nucleotidi. Singole mutazioni possono causare la perdita di funzionalità del tRNA.

Somatiche

Numerose, non vengono trasmesse alla generazione successiva

Rilevanti per la salute solo quando si accumulano in grande quantità

Aumentano con l’età

Sia mutazioni puntiformi che delezioni

Conseguenze differenti nei diversi tessuti (cervello, muscolo)

Germinali

Rare e vengono trasmesse alla generazione successiva

Polimorfismi o mutazioni patogene

Mutazioni del DNA mitocondriale

Mutazioni della linea germinale Mutazioni neutrali

Possono essere perse per deriva genetica

Possono fissarsi e raggiungere frequenze polimorfiche

• Secondo la definizione classica di polimorfismo l’allele più raro dovrebbe avere una frequenza minima pari a 1%

Esistono da molto tempo

Omoplasmia

Mutazioni “lievi”

Non riducono significativamente la fitness dell’individuo

Possono fissarsi

Mutazioni lievi + Mutazioni somatiche Effetti clinici

Mutazioni “gravi”

Effetti clinici

Eliminate per selezione

Eteroplasmia Eventi recenti

PATOLOGIE ASSOCIATE ALL’mtDNA

F

V

LUUR

T

P

E

LCUN

SAGY

H

ND5ND6

ND4

ND4L

ND3R

COIII

G

KCOIID

SUCN

COI

AN

CY

W

ND2

I

M

Q

ND1

16S

12S

D-loopCyt.b

3460G-A

11778G->A

14484T->C

LHON

DDEE

LL

EE

TT

II

OO

NN

3243A->G

MELAS

CPEO

DDM

8344A->G

MERRF

tRNA-Ser mutations

DEAFNESS

cyt. b mutations

MYOGLOBINURIC

MYOPATHY

8993T->G

NARP/MILS

PEO, KSS, Pearson

1555A->G

DEAFNESS (aminoglycosides)

tRNA-Ile mutations

CARDIOPATHY

ATPase6/8

F

V

LUUR

T

P

E

LCUN

SAGY

H

ND5ND6

ND4

ND4L

ND3R

COIII

G

KCOIID

SUCN

COI

AN

CY

W

ND2

I

M

Q

ND1

16S

12S

D-loopCyt.b

3460G-A

11778G->A

14484T->C

LHON

DDEE

LL

EE

TT

II

OO

NN

3243A->G

MELAS

CPEO

DDM

8344A->G

MERRF

8344A->G

MERRF

tRNA-Ser mutations

DEAFNESS

cyt. b mutations

MYOGLOBINURIC

MYOPATHY

8993T->G

NARP/MILS

8993T->G

NARP/MILS

PEO, KSS, Pearson

1555A->G

DEAFNESS (aminoglycosides)

tRNA-Ile mutations

CARDIOPATHY

ATPase6/8

I meccanismi associati sono tuttora spesso sconosciuti

Mutazioni nei geni coinvolti nella sintesi proteica

A1555G nel gene per l’rRNA 12S

Sordità neurosensoriale non sindromica di tipo familiare

A3243G nel gene per il tRNALeu(UUR)

MELAS - Encefalomiopatia mitocondriale con acidosi lattica ed episodi di ictus

CPEO - Sindrome esterna progressiva cronica di oftalmoplegia (paralisi dei muscoli oculari)

Cardiomiopatia (elevata % mutante)

Diabete senile e sordità (bassa % mutante)

A8344G nel gene del tRNALys

MERRF - epilessia mioclonica con le fibre rosse “stracciate” e progressivo indebolimento muscolare

T4291C nel gene tRNAIle

Vasta gamma di disordini metabolici quali epilessia, ipercolesterolemia e ipomagnesemia (Wilson et al. 2004)

Mutazioni missenso ND1-G3460G; ND4-G11778A e ND6-T14484C

LHON - neuropatia ottica di Leber

ND6-G14459A:

Distimia (nevrosi depressiva) in associazione con la LHON

ATP6-A8993G in funzione del livello di eteroplasmia:

NARP – sindrome con neuropatia, atassia e retinite pigmentosa

Degenerazione maculare, ritardo mentale etc.

MILS - sindrome di Leigh ad eredità materna (grave forma di NARP)

DELEZIONI

CPEO - oftalmoplegia (paralisi dei muscoli oculari) esterna cronica progressiva

KSS - sindrome di Kearn-Sayre (oftalmoplegia, retinite pigmentosa e miopatia cardiaca)

Sindrome di Pearson (anemia sideroblastica, pancitopenia ed insufficienza del pancreas esocrino con malassorbimento intestinale)

Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON)

colpisce generalmente uomini tra i venti e i trent’anni

fu descritta nel 1871 da Theodore Leber (oculista tedesco)

colpisce prima un occhio con comparsa di uno scotoma centrale in poche settimane, poi l’altro, dopo 1-2 mesi

dopo alcune settimane di peggioramento nella fase acuta, la funzione visiva si stabilizza e soltanto in rari casi la vista può migliorare o riprendersi in buona parte

in alcuni casi si ha un esordio più fulmineo

descritte mutazioni mitocondriali associate alla LHON

solo tre sono comuni: la G3460A-ND1, la T14484C-ND6 e la G11778A-ND4 del complesso I

altre mutazioni, inizialmente associate alla patologia, sono in realtà dei polimorfismi popolazionistici

tra i fattori ambientali predisponenti la malattia, o che possono determinare una certa variabilità clinica: • forte consumo di tabacco e di alcolici

Trasmissione materna

Modelli di studio della genetica mitocondriale “CIBRIDI” di cellule di mammifero in coltura

• È interessante studiare le interazioni tra genoma mitocondriale e nucleare

• A questo scopo vengono prodotte e analizzate linee transmitocondriali, in cui il DNA mitocondriale proviene da un’altra linea cellulare

• Giuseppe Attardi ottenne linee ρ0, ovvero prive di mtDNA trattando con etidio bromuro (concentrazione nanomolare) cellule in coltura. – Questo è un forte inibitore della DNA polimerasi mitocondriale (γ), e porta

pertanto nel tempo a completa deplezione di mtDNA

• Non tutti i tipi cellulari rispondono allo stesso modo con trattamento con etidio bromuro, alcune DNA polimerasi γ sono meno sensibili a questo inibitore

– cellule ρ0 hanno nuove esigenze nutrizionali

• richiedono un maggiore apporto di glucosio, di piruvato per riossidare il NADH ridotto durante la glicolisi, e pirimidine – specialmente Uracile (nucleotide Uridina monofosfato UMP)– neosintetizzate nel mitocondrio.

Citoplasto • Piastrine

• Sinaptosomi (terminali presinaptici isolati da tessuto omogeneizzato)

• Enucleazione fisica o chimica (es. actinomicina D, un antibiotico prodotto dallo Streptomyces, si lega alla doppia elica del DNA)