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Apresentação feita no Workshop sobre Ameaças Fitosanitárias em Campinas, 09/2013.TRANSCRIPT
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Universidade Estadual de CampinasCentro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
Identificação e Diversidade Genética de Populações Identificação e Diversidade Genética de Populações
de Helicoverpa armigera do Norte e Nordeste do Brasil
Dr. Thiago Mastrangelog g
Engº Agrônomo pela ESALQ/USPPhD pelo CENA/USPE-mail: [email protected]
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Sumário
1. Introdução– Crise Fitossanitária
– Identificação Morfológica de Helicoverpa armigera
– Novas incursões da praga no Brasil
– DNA barcoding
2. Material e Métodos– Extração de DNA Total
– PCR, Purificação e Sequenciamento
3. Resultados– Análises Filogenéticas
– Distâncias Genéticas
b d– DNA barcodes
– Rede de Haplótipos
– Diversidade Genética e Distribuição dos Haplótipos no Brasil
– Estrutura Genética das Populações Estrutura Genética das Populações
– Divergência Genética entre H. armigera e H. zea por 3 Genes Nucleares
4. Conclusões
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1. Introdução
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1. H. armigera x Crise Fitossanitária
• Praga de importância econômica no mundo:
- World: annual costs (control+yield losses) around US$ 5 billion (Lammers & MacLeod, 2007).
- China (1992): losses of US$ 1.3 billion in the Yellow River cotton region, North China (Sheng, 1993).
- India + China: 50% pesticides used to control H. armigera (Lammers & MacLeod, 2007).
- USA: 4,431 interceptions of H. armigera + Helicoverpa spp. since 1985 on fruits, vegetables and 4,43 p g p pp 9 5 , g
ornamentals (Venette et al., 2003).
- USA: 1,400 interceptions at US ports between 2000 and 2004 (Passoa, 2004).
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1.2. Identificação Morfológica
(Pogue, 2004)
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1.3. Novas incursões da praga
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Analysis of the Genetic Diversity and Structure of Cochliomyia hominivoraxPopulations from the Brazilian Amazon basin
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(Caterino et al. 2000; Hebert et al. 2003)
1. CATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAATAAACTGGGTGGGTTGTTGCTGTCCCTCTCGGGGGAACTGTGCACGCCTTACCTTTTTTGTTTTTCCA………….. Helicoverpa assulta
2. CATTATTGAATAAACTTGGTTAGGTTGCTGCTGGCTCCTTGGAGCATGTGCACACCTAGCACCNTTTTTACCACCTGTGCACCCTTTGTAGACCTGGATACCTCTCGAGGAAACTCGGTTTGAGGACTTTTTTCCA………….. Helicoverpa armigera
OU
1. …………………………………..…………………………………………………… Helicoverpa assulta2. ….…………………………………………………………………………………... Helicoverpa armigera
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2. Material e Métodos
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2. Extração de DNA Total
Método Fenol:Clorofórmio (Lyra et al. , 2009)
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2. Extração de DNA Total
Ressuspendidos em 100 µL de TE buffer Armazenados a -80 ºCRessuspendidos em 100 µL de TE buffer Armazenados a 80 C
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2. Amplificação por PCR
• Primers: • Mix para PCR:
- COIF e COIR (Li et al., 2011)
- A-tLEU e B-tLYS (Liu & Beckenbach, 1992)
- 25 ng de DNA total
- 2,5 mM de MgCl2
- 0,25 mg/mL de BSA
-0,5 mM de cada primer
- 1,5 U de TaqDNA polymerase
- 10 x TaqBuffer
- EF-1α, IDH e RpS5 (Wahlberg & Wheat, 2008)- 100 µM de dNTPs - Volume final: 25 µL
GeneAmp®PCR System 9700 thermal cycler
Condições94oC 3’94oC 30”
45 oC COI 2 µL
Gel agarose 1% em 1 x TAE
35 Ciclos45 C - COI
48 ºC – COII55 ºC - Nucleares
30”
70 oC
72 ºC – COII 1’ e 30”oC ’
µ
70oC 7’10oC forever
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2. Purificação e Sequenciamento
IllustraTMGFXTM kitABI3730xl DNA Analyzer sequencer
IllustraTMGFXTM kit
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3. Resultados
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http://blast.ncbi.nlm.nih.govBasic Local Alignment Search Tool
http://www.boldsystems.org/
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3. Análises Filogenéticas – COI (658 pb)
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3. Distâncias Genéticas - COI
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3. DNA barcodes DNASP.V5 software
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3. Rede de Haplótipos – 96 sequências COI
arm13PI‐7,16,17arm12arm11RR‐5
arm7
TCS version 1.21 software
arm 1
PI‐1,2,6,8,9,10,11,13,20,21,22, 25,27,29,30,32,33,39
BA‐1 3 4 5 6 7 9 12
PI‐14,26,35BA‐11RR‐12
PI‐3,4RR‐7
arm6
arm16
arm5
arm9BA‐2
BA‐1,3,4,5,6,7,9,12
RR‐1,2,3,6,8
arm 2
PI‐5,12,15,18,19,23,24,28, 31,36,37
arm10
arm8
arm3
arm4
BA‐8, 10
RR‐4,9,10,11,13,14arm15
PI‐38 arm14
PI‐34
13 mutations
11 mutations
H. gelotopoeon
10 mutations 6 mutations
6mutations5 mutations
H. zea
(Li et al., 2011)
H. virescens
H. hawaiiensis
H. punctigera
6 mutations
25 mutations
39 mutations
H. assulta
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3. Diversidade Genética das Populações e Distribuição dos Haplótipos – COI + COII
‒ 22 haplótipos
‒Alta Ĥ e baixa π
‒ Fluxo Gênico
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3. Estrutura Genética das Populações – COI + COII Arlequin v.3.5 software
As populações de H. armigera não estão estruturadas !
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Grande Capacidade de Dispersão
• Esse padrão de variação genética é comum em
pragas capazes de se dispersar por longas
distâncias, como H. armigera (Daly & Gregg, 1985;
Zhou et al., 2000; Endersby et al., 2007) .
- Mark-recapture experiments H. armigera
Moths can fly 200-300 km in a single night
(Pedgley, 1985)
y 3 g g
(Armes & Cooter, 1991).
- Barriers such as the Sahara desert had not prevented long
di i i i H i ( b h l )distance migration in H. armigera (Nibouche et al., 1998).
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3. Compatibilidade Reprodutiva entre H. armigera e H. zea
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Problemas
• Problemas de usar apenas mtDNA:
- Genes COI + COII são informativos apenas quanto à herança maternal.
- Os 65 espécimes podem pertencer à linhagem original introduzida ou um híbrido
proveniente do cruzamento entre uma fêmea de H. armigera e um macho de H. zea. p g
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3. Divergência Genética
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1.2. Identificação Morfológica
(Pogue, 2004)
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Cooperação Internacional
Austrália, China, Índia, Paquistão, Burkina Faso, Uganda ilUSA + Brasil
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Publicação Internacional
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4. Conclusões
1) Há fortes evidências genéticas de que as lagartas analisadas de Roraima, Piauí e
Bahia são Helicoverpa armigera.Bahia são Helicoverpa armigera.
2) Estudos futuros combinando mtDNA e novos marcadores nucleares com linhagens
puras e híbridos de H. armigera e H. zea são necessários para a elaboração de
protocolos de identificação para essas duas espécies.
3) Enquanto esses protocolos estão sendo desenvolvidos, sistemas de identificação
baseados em mtDNA podem continuar provendo informações diagnósticas e dep p ç g
origem geográfica que excedem aquelas que podem ser alcançadas utilizando-se
apenas chaves morfológicas.
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4. Conclusões
) á dê d fl ê l d d d l4) Há evidência de fluxo gênico entre as populações do Norte e Nordeste do Brasil.
5) H. armigera não está restrita apenas ao Brasil central ou Nordeste, tendo cruzado a5) H. armigera não está restrita apenas ao Brasil central ou Nordeste, tendo cruzado a
região amazônica.
6) Amostragens na Venezuela e Colômbia devem ser iniciadas o quanto antes para se
poder monitorar a entrada ou avanço dessa praga na América Central e EUA.
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Muito Obrigado !g