identifikation humaner gallensteingene mittels

IdentifikationhumanerGallensteingene

mittelskomparativerGenetik

Dissertation

zurErlangungdesakademischenGrades

Dr.med.

anderMedizinischenFakultät

derUniversitätLeipzig

eingereichtvon:

SheilaRathgeber,geb.Mirzakhyl

geborenam08.05.1985inWesel

angefertigtander

UniversitätLeipzig,MedizinischeFakultät

KlinikundPoliklinikfürGastroenterologieundRheumatologie

Direktor:Prof.Dr.med.J.Mössner

Betreuer:Prof.Dr.rer.med.PeterKovacs

Co-Betreuer:PDDr.med.HenningWittenburg

BeschlussüberdieVerleihungdesDoktorgradesvom:20.11.2018

2

BibliographischeBeschreibung

Mirzakhyl,Sheila

IdentifikationhumanerGallensteingenemittelskomparativerGenetik

UniversitätLeipzig,Dissertation

94S.,214Lit.,7Abb.,28Tab.

Referat:

Die vorliegende Arbeit untersucht das individuelle Risiko der Entwicklung von Gallensteinen

beimMenschen.DieEntstehungvonGallensteinenistmultifaktoriell,unddasindividuelleRisiko

wird durch die Interaktionen von Umweltfaktoren und genetischen Risikofaktoren, so

genannten LITH-Genen, bestimmt. Im Inzuchtmausmodell des Cholesterin-Gallensteinleidens

wurden zuvor bereits eine Reihe muriner Lith-Gene identifiziert. Für den Menschen wurde

jedochbislangnurdieD19H-VariantedesABCG8-GensalshumanesLITH-Genbestätigt.

UmweiterehumaneLITH-Genezuidentifizieren,führtenwireinegenomweiteAssoziationsstu-

die (GWAS) zur Cholelithiasis in einer sorbischen Population durch. Das Studiendesign hatte

zumZiel,mithilfederbereitsvalidiertenmurinenLith-LociprädisponierendeGenvarianten im

humanen Genom zu identifizieren und in einer Kontrollkohorte zu replizieren. Für die

komparative Analyse wurden Kandidatengene ausgewählt, die SNPs enthalten, welche in der

GWAS eine Assoziation zu Gallensteinen aufweisen und sich in konkordanten murinen

Genregionen befinden. Die potentiellen LITH-Gene wurden in einer zweiten unabhängigen

Kontrollkohortemit184Gallensteinträgernund184Kontrollpersonenweiteruntersuchtund

unterVerwendungvonrepräsentativenSNPsmittelsTaqMan-Methodegenotypisiert.

Damit konntenwir drei repräsentative SNPs bestätigen und die GeneGAD2 (rs3781117, p =

0,051),KLF3(rs337623,p=0,021)undPTPN11(rs7953150,p=0,048)alshumaneLITH-Gene

identifizieren. Des Weiteren wurden im Rahmen der GWAS in der sorbischen Population

signifikanteAssoziationenzuAlter(p<0,0001),Geschlecht,BodyMassIndex(p<0,0001)und

AnzahlderSchwangerschaften(p=0,001)bestätigt.

Inderin-silico-AnalysebezüglicheinerfunktionellenKonsequenzderSNPskonntenzwarkeine

statistisch signifikanten Zusammenhänge gezogen werden, jedoch wurden Risikoallele

identifiziert,diezumindividuellenGesamtrisikoderEntwicklungvonGallensteinenbeitragen.

Die entsprechenden Schlüsselgene dieser Varianten könnten auf potentielle Moleküle für die

innovative Prophylaxe, Diagnostik und Therapie des Gallensteinleidens bei genetisch

prädisponiertenPatientenhinweisen.

3

1 Einleitung................................................................................................................................7

1.1 DasGallensteinleiden...................................................................................................................................................7

1.2 PathogenesederCholelithiasis................................................................................................................................8

1.3AllgemeineRisikofaktoren........................................................................................................................................9

1.4 GenetischeKomponente..........................................................................................................................................101.4.1 GallensteinleidenalsoligogeneErkrankung...........................................................................................111.4.2 GallensteinleidenalskomplexepolygeneErkrankung.......................................................................12

1.5 Kopplungsstudien........................................................................................................................................................121.5.1 MurineKopplungsstudien................................................................................................................................131.5.2 HumaneKopplungsstudien..............................................................................................................................18

1.6 GenetischeAssoziationsstudien...........................................................................................................................181.6.1 SNPsalsgenetischeVariation........................................................................................................................181.6.2 Studiendesign.........................................................................................................................................................191.6.3 ABCG5/8...................................................................................................................................................................20

1.7HumaneLITH-Gene....................................................................................................................................................22

1.8Zielsetzung/Aufgabenstellung..............................................................................................................................24

2 MaterialundMethoden.....................................................................................................25

2.1 Studienaufbau................................................................................................................................................................252.1.1 CharakterisierungderStudienkollektive..................................................................................................25

2.2GenomweiteAssoziationsstudiezurIdentifizierunghumanerLITH-Loci.....................................26

2.3 KomparativeAnalyse.................................................................................................................................................272.3.1 ÜbertragungderGallensteinkartederMausvoncMinMb.............................................................272.3.2 IdentifizierungderkonkordantenhumanenRegionenmitEnsembl.org..................................272.3.3 VergleichderkonkordantenhumanenRegionenmitdenErgebnissendergenomweitenAssoziationsstudie...............................................................................................................................................................28

2.4 SelektionundReplikationderKandidatengeneinderAachenerKohorte....................................282.4.1 BestimmungvonTag-SNPszurReplikation............................................................................................282.4.2 GenotypisierungderTag-SNPs......................................................................................................................292.4.3 StatistischeAnalyse.............................................................................................................................................312.4.4 In-silicoAnalysederfunktionellenKonsequenzenderSNPs............................................................31

3 Ergebnisse............................................................................................................................33

3.1Studienaufbau................................................................................................................................................................33

3.2 Studienpopulation.......................................................................................................................................................343.2.1KlinischeCharakterisierungderSorben....................................................................................................343.2.2 AnzahlderSchwangerschaften.....................................................................................................................35

3.3 KomparativeAnalyse.................................................................................................................................................36

3.4 Assoziationsanalyse...................................................................................................................................................373.4.1SelektionvonKandidatengenenundihrerTag-SNPszurReplikation........................................37

4

3.4.2 LogistischeRegressionsanalyse.....................................................................................................................38

3.5 Post-hocPower-Analyse..........................................................................................................................................44

4 Diskussion............................................................................................................................46

4.1 Zusammenfassung.......................................................................................................................................................46

4.2 MultifaktorielleGenesederCholelithiasis......................................................................................................474.2.1 GeschlechtundSchwangerschaft..................................................................................................................474.2.2 Alter............................................................................................................................................................................484.2.3 Adipositas.................................................................................................................................................................49

4.3 Kandidatengene............................................................................................................................................................504.3.1 GAD2(Glutamat-Decarboxylase2)..............................................................................................................504.3.2 KLF-3(Krüppel-like-factor-3)........................................................................................................................514.3.3 PTPN11(Protein-tyrosinephosphatase,non-receptor-type11)...................................................51

4.4 FunktionelleKonsequenzenderSNPs..............................................................................................................534.4.1 rs3781117................................................................................................................................................................534.4.2 rs337623...................................................................................................................................................................544.4.3 rs7953150................................................................................................................................................................564.4.4 ZusammenfassungfunktionelleKonsequenzen.....................................................................................57

4.5 Limitationen...................................................................................................................................................................58

4.6 PerspektiveundklinischeRelevanz..................................................................................................................59

5 Zusammenfassung..............................................................................................................62

6 Anlagen..................................................................................................................................64

7 Literaturverzeichnis..........................................................................................................81

8Selbständigkeitserklärung...............................................................................................94

9 Lebenslauf............................................................................................................................96

10 Danksagung........................................................................................................................98

5

Abkürzungsverzeichnis

ABCB4 ATPbindingcassettetransportersubfamilyBmember4ABCB11 ATPbindingcassettetransportersubfamilyBmember11ABCG8 ATPbindingcassettetransportersubfamilyGmember8ABCG5 ATPbindingcassettetransportersubfamilyGmember5APOA1 ApolipoproteinA1APOB ApolipoproteinBAPOC1 ApolipoproteinC1APOE ApolipoproteinEAR AndrogenrezeptorARDB3 ß3adrenergicreceptorATP AdenosintriphosphatBMI Body-Mass-IndexCA,USA Californien,UnitedStatesofAmericaCCK1R Cholezystokinin-1-RezeptorCETP Cholesterinester-TransferproteinChr ChromosomcM CentimorganCST8 Cystatin8CYP7A1 CytochromP4507A1dbSNPID Database-SNP,numberofidentificationDNA Deoxyribonucleicacid,DesoxyribonukleinsäureEDTA EthylendiamintetraessigsäureESR1 Östrogenrezeptor-1ESR2 Östrogenrezeptor-2F1 NachkommeninersterGenerationGABA gamma-AminobuttersäureGAD2 Glutamat-Decarboxylase2GAD65 65kDa-IsoformderGlutamat-DecarboxylaseGATA3 GATABindingProtein3GBD1 GallbladderDisease1GCKR Glucokinase(Hexokinase4)RegulatorGS GallensteineGWAS GenomweiteAssoziationsstudieHapMapProject Haplotype-Map-ProjectHWE Hardy-Weinberg-EquilibriumHMG-CoA-Reduktase 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-ReduktaseIDH2 IsocitratDehydrogenase2IL4R Interleukin-4-RezeptorIZKF InterdisziplinäresZentrumfürKlinischeForschungkDa KilodaltonKLF3 Krüppel-like-Faktor3LD LinkageDisequilibrium

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LOD-Score LogarithmoftheOdds-ScoreLPAC-Syndrom low-phospholipid-associatedcholelithiasis-SyndromeLRPAP1 LRPassociatedprotein1M,Mb MegabasenpaareMAF Minor-Allel-FrequenzMDR3-Gen Multiple-Drug-Resistance-3-GenMHz MegahertzMit-Marker MikrosatellitenmarkerMUC1 Mucin1MUC2 Mucin2MUPCDH Mucin-likeprotocadherinN1 ersteRückkreuzungs-GenerationNBFs nucleotide-binding-foldsNID1 Nidogen1Nkx3 nkhomeobox3NPC1L1 NPC1-Like1NR1H4 FarnesoidXRezeptorOR OddsRatiop-Wert probabilityvalue,SignifikanzniveauPCNXL2 PecanexHomolog2PCR PolymerasekettenreaktionPDE4B Phosphodiesterase4BPDE8A Phosphodiesterase8APPARg Peroxisom-ProliferatoraktivierterRezeptorgammaPTPN11 Protein-tyrosinephosphatase,non-receptor-type11QTL QuantitativeTraitLocusr2 KorrelationskoeffizientSetd1b SETdomaincontaining1BShp2 rezeptorfreieProtein-Tyrosin-Phosphatase2SLC10A2 Sodium-dependentbileacidtransporterSLCO1B1 Solutecarrierorganicaniontransporterfamilymember1B1SNP SingleNucleotidePolymorphism,EinzelnukleotidpolymorphismusSULT2A1 Sulfotransferasefamily2Amember1Tag-SNP Tagging-SNPTAS Trait-associatedSNPTLR1 TolllikeRezeptor1TM4SF4 Transmembrane4Lsixfamilymember4TMEM116 Transmembran-Protein116TMDs transmembranedomainsTPCN2 TwoporesegmentChannel2TTC39B Tetratricopeptiderepeatdomain39BUGT1A1 UDPglucuronosyltransferase1A195%-CI 95%-Konfidenzintervall

7

1 Einleitung

1.1 DasGallensteinleiden

DasGallensteinleidenstelltmiteinerPrävalenzvon15–20%einesehrhäufigeErkrankungin

Deutschlanddar,miteinemFrauenanteilvonca.60%(AQUA–Institut,2015).ImRahmendes

natürlichenVerlaufsdieserErkrankungbleibenca.70–80%derPatientenbeschwerdefreiund

werdennurzufälligalsGallensteinträgeridentifiziert(Barbara,etal.,1987)(Angelico,DelBen,

Barbato,Conti,&Urbinati,1997).DasjährlicheRisiko,einebiliäreSymptomatikzuentwickeln,

beträgt indenersten5 JahrennachDiagnosestellung4–6%(Friedmann,Raviola,&Fireman,

1989); ca. 25%der Gallensteinträger werden in den ersten 10 Jahren nach Diagnosestellung

symptomatisch (Attili, De Santis, Capri, Repice, & Maselli, 1995). Die jährliche Inzidenz von

biliärenKomplikationenbeträgt ca. 0,3–0,65%,unddasRisiko, einGallenblasenkarzinomzu

entwickeln, beträgt bei asymptomatischen Gallensteinträgern ca. 0,015% pro Jahr (Attili, De

Santis, Capri, Repice, & Maselli, 1995). Das klinische Erscheinungsbild der Erkrankung ist

vielgestaltigundkannsich alsunkomplizierte aber schmerzhafteGallenkolikoderals kompli-

ziertesGallensteinleiden,beispielsweisemitCholezystitis,Cholangitis,biliärerPankreatitisoder

Gallensteinileus,manifestieren.

Über228.000Patientenwerden jährlich inDeutschlandaufgrundvonGallensteinen stationär

behandelt,mitsteigenderTendenz(StatistischesBundesamt,2015).ImRahmenderAnamnese

und klinischen Untersuchung werden beim symptomatischen Gallensteinleiden charakteris-

tischeSymptomewieSchmerzenimEpigastriumoderrechtenOberbauch,ggf.mitAusstrahlung

in den Rücken oder die rechte Schulter, sowie begleitend oftmals Übelkeit und Erbrechen

beschrieben (Lammert, et al., 2007). Die Beschwerdesymptomatik wird häufig durch einen

steinbedingten, temporären Verschluss des Ductus cysticus mit daraus resultierendem

Gallenstauund–beiFortbestehendesVerschlusses–EntzündungderGallenblaseverursacht.

BeiasymptomatischenGallensteinenistinallerRegeleinabwartendesVorgehengerechtfertigt.

Die symptomatische Cholelithiasis hingegen stellt, den S 3-Leitlinien zur Diagnostik und

Therapie von Gallensteinen entsprechend, eine Indikation zur operativen Therapie dar

(Lammert, et al., 2007). So wurden allein in Deutschland im Jahr 2014 insgesamt 176.097

Gallenblasenoperativ entfernt (AQUA– Institut, 2015).Bei klinischerBeschwerdefreiheit von

mehr als 5 Jahren gilt der vormals symptomatische Patient erneut als asymptomatischer

Gallensteinträger und eine Cholezystektomie ist nichtmehr indiziert (Lammert, et al., 2007).

Trotz Verbesserung der chirurgischen Möglichkeiten durch die Einführung der laparoskopi-

schen Cholezystektomie mit resultierender Verkürzung der stationären Verweildauer und

Reduktion der postoperativen Komplikationen sind die krankheitsbedingten Kosten für das

8

deutsche Gesundheitssystem hoch. Eine konservative Therapie ist aufgrund der häufigen

TherapieresistenzundhohenRezidivratenlangfristigder(laparoskopischen)Cholezystektomie

unterlegen. Lediglich die cholesterinreichen und calciumfreien Gallensteine sind prinzipiell

eineroralenlitholytischenTherapiezugänglich(Portincasa,DiCiaula,Bonfrate,&Wang,2012).

1.2 PathogenesederCholelithiasis

BeidenGallenblasensteinenunterscheidetmanprinzipiellCholesteringallensteinevondensehr

viel selteneren Bilirubin- oder Pigmentgallensteinen. Die Galle ist eine wässrige Lösung, die

Cholesterin, Phospholipide, Gallensalze und den Gallefarbstoff Bilirubin enthält (Mirzakhyl &

Wittenburg,2010).

DashydrophobeCholesterinbildetmitdenPhosholipideneineFormationvonwasserlöslichen

VesikelnundwirdindieserFormvonderLebersezerniert.DurchHydroxylierungundoxidati-

verVerkürzungeinerSeitenketteerfolgtindenHepatozytendieSynthesevonGallensäurenaus

Cholesterin, wobei die primären Gallensäuren Cholsäure und Chenodesoxycholsäure von be-

sonderer Bedeutung sind. Die Aufnahme von Gallensäuren während ihres Transports in den

Gallenwegen führt zu einer Stabilisierungder Vesikel in FormgemischterMizellen. (Jüngst&

Kullak-Ublick,2007)

Bei einemÜberangebot anCholesterinmolekülenwirddieAufnahmekapazitätder gemischten

Mizellen überschritten. Es resultiert eine Übersättigung der Galle mit Bildung von

cholesterinreichenmultilamellären Vesikeln, die in der Gallenblase auskristallisieren können.

Diese Cholesterinmonohydratkristalle stellen die obligaten Vorstufen der Choleste-

ringallensteinedar.(Jüngst&Kullak-Ublick,2007)

EineweiterewesentlicheVoraussetzungfürdieFormationvonCholesteringallensteinenisteine

verlängerteVerweildauerderGalleinderGallenblaseaufgrundeinerGallenblasenhypomotilität

(Wang,Cohen,&Carey,2009).DesWeiterensezernierendieGallenblasenepithelzellenMuzin-

Glykoproteine,dieeinMuzin-GelbildenundsomitdieAusfällungvonCholesterinmonohydrat-

kristallen sowiederenFormation zuCholesteringallensteinen fördern (Wang,Cohen,&Carey,

2009)(Jüngst&Kullak-Ublick,2007).

Pigmentsteine resultieren aus einer StörungdesBilirubinstoffwechsels.DurchHämolyse, dem

Abbau größerer Hämatome oder ineffektiver Erythropoese bei Vitamin B12- oder Folsäure-

mangel (Aydogdu, Sari, Ulu, & Sevinc, 2001) entsteht Bilirubin als Abbauprodukt der Häm-

Proteine(Jüngst&Kullak-Ublick,2007).Es isthydrophobundwirdanAlbumingebundenzur

Lebertransportiert(indirektesBilirubin).IndenHepatozytenwirddasaufgenommeneBilirubin

durch Konjugation mit Glucuronsäure enzymatisch in wasserlösliches Bilirubinmono- und

diglucuronid,direktesBilirubin,umgebaut(Bosma,Seppen,Goldhoorn,Bakker,OudeElferink,&

Chowdhury, 1994), welches nun aktiv in die Gallengänge sezerniert werden kann (Nies &

9

Keppler,2007).Infolge Hydrolyse des konjugierten Bilirubins durch endogene β-Glucuronidasen entsteht

wiederum unkonjugiertes Bilirubin, das ebenso wie freies Kalzium durchMizellen in Lösung

gehalten werden muss. Bei einem Ungleichgewicht mit Übersättigung der Galle in der

Gallenblase fälltdasBilirubin alsamorphesKalziumsalz aus, eineFormationmitMuzingelals

NukleationsmatrixführtdannzurEntstehungvonBilirubingallensteinen.(Ostrow,1984)

Gallensalze werden größtenteils im terminalen Ileum resorbiert und dem enterohepatischen

Kreislauf zugeführt. Nach einer Resektion oder bei einer Erkrankung dieses Darmabschnittes

kommteshierzueinervermindertenAufnahmevonGallensalzen,dienuninsKolonübertreten.

Die Gallensäuren binden Calcium sowie unkonjugiertes Bilirubin und bringen Letzteres in

Lösung.EskannsoeininduzierterenterohepatischerKreislaufvonBilirubinresultieren,durch

denvermehrtBilirubinderLeberzugeführtundentsprechendeinehöhereKonzentrationvon

Bilirubin in die Galle sezerniert wird. Dieser Mechanismus erklärt u.a. die erhöhte

Gallensteinprävalenz bei z.B. Morbus Crohn des terminalen Ileums. (Brink, et al., 1999)

(WittenburgH.,Gallensteine,2008)

Von den Cholesterin- und Bilirubingallensteinen wird eine dritte Form der Cholelithiasis

unterschieden. Die Entstehung von sogenannten braunen Pigmentsteinen wird durch eine

Kolonisierung der Gallengänge mit anaeroben Bakterien aufgrund einer biliären Obstruktion

und/oder StaseunterschiedlicherGenesebegünstigt (Kaufman,Magnuson,Lillemoe, Frasca,&

Pitt, 1989). Die Bakterien produzieren ß-Glucuronidase und Phospholipase A1, so dass

konjugiertes Bilirubin hydrolysiert und freie Fettsäuren von Phospholipiden abgespalten

werden(Maki,1966)(Siegenthaler&Blum,2006)(Wu,Uchiyama,&Fan,2007).Hauptbestand-

teilederPigmentsteine sindCalciumbilirubinat, Calciumsalze vonFettsäuren, Cholesterinund

Muzin(Siegenthaler&Blum,2006).SietreteninallerRegelindenGallengängenundnichtinder

Gallenblaseselbstauf.

IndenwestlichenLändernbeträgtderAnteilderCholesteringallensteine90%.Dieverbleiben-

den10%entfallenaufPigmentsteine,diebrauneundschwarzeSteineumfassen(Schafmeyer,et

al.,2006).

1.3 AllgemeineRisikofaktoren

ZuwichtigenursächlichenFaktorenundDeterminanten,diedasAuftreteneinerGallensteiner-

krankungbegünstigen,zählennebendemweiblichenGeschlecht,Alter,einerunausgewogenen,

fetthaltigenErnährung,Schwangerschaft,diversenErkrankungen,herabgesetzterGallenblasen-

motilitätundeinigenMedikamenten(Paigen&Carey,2002)aucheinrascherGewichtsverlust

(Li,Pulido,Fajnwaks,Szomstein,&Rosenthal,2009)(Liddle,Goldstein,&Saxton,1989).

10

1.4 GenetischeKomponente

DieTheorie vonderExistenzeinergenetischenKomponentederCholelithiasis istGegenstand

zahlreicher aktueller Studien, welche die Interaktionen zwischen Umweltfaktoren und

genetischenVariationenuntersuchen.VondiesbezüglichebensogroßerBedeutungsinddieim

Rahmen von Ultraschall-Screeninguntersuchungen beobachteten Unterschiede in der

Gallenstein-Prävalenz in verschiedenen geographischen Regionen, die auf eine genetische

Komponentehindeutenkönnen(Kratzer,Mason,&Kachele,1999).

Ein potentieller Faktor für das gehäufte Auftreten von Cholesteringallensteinen in den

IndustrieländernimVergleichzuEntwicklungsländernistdiesogenannte„westerndiet“,eine

Form der Lebens- und Ernährungsgewohnheiten mit chronisch erhöhter Kalorienaufnahme,

insbesondere in Form von Fetten, Monosacchariden und/oder Cholesterinmit vermindertem

AnteilanBallaststoffen(Attili,Scafato,Marchioli,Marfisi,Festi,&TheMICOLGroup,1998)(Lee,

et al., 1985). Durch die u.a. resultierendeAdipositas und verzögerte Darmpassage kanndiese

„lithogeneDiät“dieFormationvonGallensteinen,vorallembeieinerPersonmitentsprechender

genetischer Prädisposition, begünstigen (Kesäniemi, Koskenvuo, Vuoristo, &Miettinen, 1989)

(Stokes,Krawczyk,&Lammert,2011).

AuchweltweiteUnterschiedeinderPrävalenz,dienebendergeographischenVariabilitätauch

auf Unterschiede zwischen ethnischen Gruppen hinweisen, unterstützen die Rolle der

genetischen Faktoren. In Südwest-Arizona konnte bereits sehr früh eine Häufung der

CholelithiasisbeiindianischenStämmenfestgestelltwerden(Sievers&Marquis,1962)(Carey&

Paigen, 2002). Des Weiteren ergab eine umfassende Studie an Pima-Indianern eine stark

erhöhteGallenstein-PrävalenzabeinemAltervonbereits20JahrenmitstarkerProgredienzim

ErwachsenenalterundeinermaximalenPrävalenzvon80%beiFrauenund70%beiMännern,

unabhängig von den bekannten Risikofaktoren Adipositas, Diabetes mellitus und Zahl der

Schwangerschaften(Carey&Paigen,2002)(Sampliner,Bennett,Comess,Rose,&Burch,1970).

Neben geographischen Unterschieden und hoher Gallensteinprävalenz in speziellen

Populationen gab es frühzeitig auch Berichte über die familiäre Häufung der Cholelithiasis

(Carey&Paigen,2002).DaFamilienmitgliederabermöglicherweiseähnlichenUmweltfaktoren

ausgesetzt sind, könnenFamilienstudienohneKorrekturhierfür eine genetischeKomponente

nichtbeweisen.EineMöglichkeit,diefamiliärePrädispositionzubelegen,istderVergleichdes

gemeinsamen Auftretens (Konkordanz) von Gallensteinen bei eineiigen (monozygoten) und

zweieiigen (dizygoten) Zwillingen. Monozygote Geschwister sind genetisch identisch und

ZwillingspaareinderRegelvergleichbarenUmweltfaktorenausgesetzt.

Eine finnische Zwillingsstudie konnte bereits 1989 einen signifikanten Einfluss genetischer

Faktoren auf die biliäre Cholesterinkonzentration, Gallensäurenzusammensetzung,

Cholesterinsynthese, Cholesterinsättigung der Galle und Gallensteinformation belegen

11

(Kesäniemi,Koskenvuo,Vuoristo,&Miettinen,1989).DierelativegenetischeBeteiligungander

RegulationderSerum-Cholesterinkonzentrationwurdehierbeiauf25%berechnet,wobeider

Effekt vonUmweltfaktoren, insbesonderedie diätetische Fettzufuhr, dengrößten Einfluss auf

die Konzentration besitzt (Kesäniemi, Koskenvuo, Vuoristo, & Miettinen, 1989). Eine

wahrscheinlichegenetischeBeteiligungbeiderEntwicklungvonGallensteinenwurdevorallem

aber dadurch bestärkt, dass die monozygoten Zwillingspaare im Ergebnis eine 40%ige

Konkordanz für das Gallensteinleiden und die dizygoten Paare eine komplette Diskordanz

aufwiesen, obwohl durch die bewusste Selektion der monozygoten Paare identische

Umweltfaktoren eindeutig ausgeschlossen wurden (Kesäniemi, Koskenvuo, Vuoristo, &

Miettinen,1989).

EinegroßeschwedischeZwillingsstudieuntersuchtedasZusammenwirkenvonUmweltfaktoren

undgenetischenFaktorenzurEntwicklungvonsymptomatischenGallensteinenmultifaktoriell,

wobei43.141Zwillingspaare,geborenzwischen1900und1958undzuvergleichbarenAnteilen

mono-unddizygot, indieUntersuchungeingeschlossenwurden.Eszeigtesicheinesignifikant

höhereKonkordanzfürmonozygoteZwillingspaareimVergleichzudizygotenPaarenmiteiner

Korrelation von 38 % im Vergleich zu 8 % (Katsika, Grjibovski, Einarsson, Lammert,

Lichtenstein, &Marschall, 2005). Entsprechend resultierte eine Heritabilität des symptomati-

schenGallensteinleidensvon25%(95%CI,9-40%).IdentischeUmweltfaktorentragenzu13

%(95%CI,1-25%)und individuelleUmweltfaktorensogarzu62%(95%CI,56-68%)zur

VarianzdesPhänotypenbei(Katsika,Grjibovski,Einarsson,Lammert,Lichtenstein,&Marschall,

2005).

Eine weitere Assoziationsstudie von Nakeeb et al. mit über 1.000 Studienteilnehmern

berechnete die additive genetische Heritabilität auf ca. 29%, mit Alter und Geschlecht als

signifikante Kovariaten (Nakeeb, et al., 2002). Diese Daten bestätigen zusammengenommen

einengenetischenAnteilamRisikoeinerCholelithiasisvonca.30%.

1.4.1 GallensteinleidenalsoligogeneErkrankung

MutationeneinzelnerSchlüsselgeneimSinneeiner„oligogenen“Erkrankungsindseltenfürdie

Cholelithiasisverantwortlich.ZurPathogenesedesGallensteinleidensalsoligogeneErkrankung

gibtesentsprechendwenigehumaneStudien.

DieBeschreibungvonRosmorducetal.zuMutationeninABCB4imRahmendesLPAC-Syndroms

(LowPhospholipidAssociatedCholelithiasisSyndrome)ist jedochwegweisend.Sieisteineder

ersten Untersuchungen, die diesbezüglich einen Gendefekt eindeutig als ursächlich für die

EntstehungvonGallensteinenidentifizierthat(Rosmorduc&Poupon,2007).Dienachgewiese-

nenMutationen inABCB4 führen zu einer Funktionsstörung der Phosphatidylcholin-Flippase

(ABCB4) mit resultierender verminderter Phospholipidkonzentration in der Galle und

12

entsprechend erhöhtem Cholesterin-Phospholipid-Quotienten (Rosmorduc, Hermelin, &

Poupon, 2001).Klinisch zeichnet sichdasLPAC-SyndromdurchCholezystitis, Cholangitis und

intrahepatische Gallensteine mit oder ohne akute Pankreatitis aus (Rosmorduc & Poupon,

2007).

EinweiteresBeispielfüreinemonogeneFormderCholelithiasisistdiebenignerekurrierende

intrahepatischeCholestaseTyp2,beiderMutationendesGallensäure-TransportergensABCB11

ineinemhohenProzentsatzzurAusbildungvonGallensteinenführen(vanMil,etal.,2004).

1.4.2 GallensteinleidenalskomplexepolygeneErkrankung

InderMehrzahlderFälle istdieÄtiopathogenesederErkrankungmultifaktoriell,wobeieiner

InteraktionzwischenUmweltfaktorenundzahlreichenlithogenenGenenmitgeringenEffekten

eine besondere Bedeutung zuerkannt wird (Lammert & Sauerbruch, 2005). Die potentiell

ursächlichenGenvariantenkommenzwarhäufiginderBevölkerungvor,könnenaberaufgrund

desgeringenEffektesnurunzureichend identifiziertwerdenundsinddurchunklareGenotyp-

Phänotyp-Beziehungenausgezeichnet.

Die„commondisease–commonvariant“–Hypothesebesagt,dassfürErkrankungenmithoher

Prävalenz in der Bevölkerung, wie das Gallensteinleiden, multiple, häufig vorkommende

Polymorphismenverantwortlichsind.TrotzihresehermoderatenEffektsalseinzelneVariante

können sie durch Interaktion untereinander und in Verbindung mit entsprechenden

Umweltfaktoren zur Manifestation einer Erkrankung führen (polygenetische Determination)

(Risch&Merikangas,1996).

1.5 Kopplungsstudien

Sogenannte Kopplungsstudien basieren auf der Analyse von der Wahrscheinlichkeit der

gemeinsamen Vererbung eines krankheitsprädisponierenden Gens und eines genetischen

Markers in Familien. Sie werden besonders erfolgreich zur Identifizierung von ursächlichen

Genen für monogene Krankheiten und wesentlichen Genen mit starken Effektgrößen bei

komplexenKrankheitenverwendet.FürdieAnalysekönnenzweiverschiedeneAnsätzegenutzt

werden.(Bickeböller&Fischer,2007)

In der genomweiten Analyse wird das komplette Genom im Rahmen eines hypothesenfreien

Ansatzes anhand von engmaschig verteilten genetischenMarkern auf prädisponierende Gene

hinuntersucht,ohnedassgenauereInformationenüberdenPathomechanismusvorliegen.Der

zweite Ansatz bezeichnet die Untersuchung von Kandidatengenen. Kann anhand des

funktionellen Zusammenhanges ein Gen als prädisponierendes Kandidatengen bestimmt

13

werden,wirddasGenaufseineBeteiligunganderKrankheitundeineDefinitiondesvermuteten

Vererbungsmodusuntersucht.(Bickeböller&Fischer,2007)

Es besteht eine Kopplung zwischen zwei Genloci, wenn sie häufiger als erwartet gemeinsam

vererbtundinderPopulationaufdemselbenHaplotypenbeobachtetwerden(Teare&Barrett,

2005). Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Genloci gemeinsam vererbt werden, korreliert mit

ihrer Entfernung auf dem Chromosom. Benachbarte Genloci werden durch Rekombination

seltener getrennt und entsprechend häufiger gemeinsam vererbt (Teare & Barrett, 2005).

MittelsKartierungvonGenmarkernaufdemkomplettenGenomkanndurchdieIdentifizierung

eines bereits bekannten Markers auf krankheitsprädisponierende Varianten in der

unmittelbaren Nachbarschaft geschlossen werden. Entsprechend kann im Rahmen der

KopplungsanalysedurchVerarbeitungdergenetischenInformationenvonVerwandtenaufeine

gemeinsame Vererbung von chromosomalen Regionen und phänotypischen Merkmalen

geschlossenwerden(Kruglyak,Daly,Reeve-Daly,&Lander,1996).

1.5.1 MurineKopplungsstudien

1.5.1.1 QuantitativeTraitLocus

Ein quantitatives phänotypisches Merkmal beschreibt eine Eigenschaft, die in Individuen in

unterschiedlicher Erscheinung auftreten kann. Der Phänotyp ist häufig das Resultat von

multiplen Geninteraktionen, Unterschieden in der Allelverteilung und darauf einfluss-

nehmenden Umweltfaktoren bei zwei sich unterscheidenden Individuen. Somit entsteht ein

Merkmal,dasnichtspezifischfestgelegtist,sondernohneAbstufungaufeinerkontinuierlichen

Skala gemessen werden kann, wie z.B. die Körpergröße. Der Genabschnitt, welcher für die

Ausprägung eines quantitativen phänotypischen Merkmals verantwortlich ist, wird als

QuantitativeTraitLocus(QTL)bezeichnet.

Für die Grundlagenforschung und vergleichende Studien auf diesem Gebiet sollten die

entsprechenden Umweltfaktoren, wie z. B. Lebensbedingungen und Ernährungsverhalten,

komplett normiert und identisch sein, wie es zum Beispiel in einem Experiment in einem

Mausmodell möglich ist. Nach derartig erfolgter Eliminierung externer, einflussnehmender

Störfaktoren ist davon auszugehen, dass die individuelle Darstellung eines Phänotyps auf

genetischerVariationberuht.

14

1.5.1.2 DieGallensteinkartederMaus

Anstatt genetische Untersuchungen direkt amMenschen durchzuführen, kann der genetische

HintergrundeinerErkrankungzunächstimMausmodelluntersuchtwerden,umdieErgebnisse

dann basierend auf der engen genetischen Verwandtschaft zwischen Maus und Mensch auf

humane Studien zu übertragen (Paigen K. , 1995). Hierfür ist jedoch ein geeignetesmurines

ModellderErkrankungerforderlich.

Bei einer vergleichenden Studiewurde einer Reihe von Inzuchtmausstämmen eine fettreiche,

sog. lithogene Diät verabreicht, woraufhin eindeutige Unterschiede in der Prävalenz von

Cholesteringallensteinen zwischen den Mausstämmen als Ausdruck einer differenten

phänotypischen Ausprägung beobachtet wurden (Khanuja, et al., 1995). Da alle Tiere sehr

ähnlichen Umweltbedingungen ausgesetztwaren, kann von einer genetischen Ursache dieser

phänotypischenUnterschiedeausgegangenwerden.Umdie chromosomalenRegionen,welche

dieGenemitdenursächlichenGenvariantentragen,genauer lokalisierenund identifizierenzu

können, wurden genetische Untersuchungen in Kreuzungen von Inzuchtmausstämmen

durchgeführt, die sich hinsichtlich ihrer Gallensteinprävalenz unterschieden (Wittenburg H. ,

Lyons,Paigen,&Carey,2003).EinMausstammderElterngenerationwiesdabeieineResistenz

bezüglichderEntwicklungvonCholesteringallensteinenauf, der zweite Stammhingegeneine

deutlich höhere Prävalenz. Die Nachkommen (F1) wiederum wurden erneut mit dem

gallensteinresistenten Elternstamm gekreuzt, so dass eine Rückkreuzungsgeneration (N1)

entstand,welcheeineAuswahlanHaplotypblöckenbeiderElternstämmeenthielt (Wittenburg

H. , Lyons, Paigen,&Carey, 2003). Somitwiesnur einTeil derNachkommen imRahmender

Rekombination die lithogenen Allele auf (Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003).

Nachfolgend wurde der Rückkreuzungsgeneration die lithogene Diät (1% Cholesterin, 0,5%

Gallensäuren, 15% Fett) verabreicht, um die Entstehung einer Cholelithiasis zu provozieren.

EntsprechendderAllelverteilungentwickeltendieNachkommenGallensteineoderwieseneine

Resistenz gegenüber der Entwicklung von Gallensteinen unter der fettreichen Diät auf

(Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003). Anschließend erfolgte eine systematische

Genotypisierung von sogenannten Mit-Markern, die sich über das gesamte Genom der

Nachkommen verteilen und zwischen den Elternstämmen aufgrund ihrer unterschiedlichen

Suszeptibiliät differieren. Mithilfe von standardisierten Computerprogrammen wurde das

individuelle Auftreten von Gallensteinen mit dem Genotyp in Verbindung gebracht und

Genregionen identifiziert, welche eine Assoziation zu gesuchten Phänotypen aufwiesen

(WittenburgH.,Lyons,Paigen,&Carey,2003).AlsIndikatorfürdieAssoziationdesgenetischen

Markers zum untersuchten phänotypischen Merkmal wurde der sogenannte LOD-Score

(logarithm of the odds) genutzt (Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003). Die erste

bestätigte lithogeneRegion,dieLith1genanntwurde, istaufdemChromosom2desmurinen

15

Genoms lokalisiert und wird durch die beiden Mit-Marker D2Mit11 und D2Mit66 definiert

(Khanuja,etal.,1995).

In der Folge wurden zahlreiche weitere QTL-Kreuzungen zwischen gallensteinempfänglichen

und gallensteinresistenten Inzuchtmausstämmen durchgeführt, zunächst weitere

Rückkreuzungen,dannF1xF1Kreuzungen,umauchrezessiveLocidetektierenzukönnen.Als

Resultat entstand die Gallensteinkarte der Maus, die einen Überblick über alle Cholesterin-

CholelithiasisassoziiertenGenregionenaufdemmurinenGenomgewährt.DieGenregionenmit

der stärksten statistischen Signifikanz, sowie bestätigter Assoziation in einem kongenen

MausstammwurdenalsLith-Genedefiniert.Bislangkonnten23murineLith-Geneauffastallen

Chromosomenidentifiziertwerden(Abbildung1)(Lyons&Wittenburg,2006).

16

Abbildung1:GallensteinkartederMaus(Lyons&Wittenburg,2006)

17

1.5.1.3 Syntenie

DasPrinzipderkonserviertenSynteniebeschreibt,dassdefinierteBereicheinderDNAzweier

verschiedener Arten, Gene in der gleichen Reihenfolge und in Blöcken beinhalten können.

Dementsprechend könnenmehr als 90% desmurinen und des humanen Genoms in syntene

Bereiche angeordnet und ihre Gensequenzenmiteinander verglichenwerden. (Alberts, et al.,

2012)

DieGendatenbank„TheEnsemblGenomeBrowser“fokussiertsichaufVertebratenundumfasst

die InformationenüberdaskompletteGenomvon ca.50verschiedenenArten,unteranderem

des Menschen, der Maus und des Zebrafisches (Herrero, et al., 2016). Durch graphische

Darstellung der Chromosomen mit den entsprechenden syntenen Regionen der zu

vergleichendenSpeziesisteinekomparativeAnalysedeskomplettenGenomsmöglich.

Im Folgenden (Abbildung 2) ist

beispielhaft zentral im Bild das

humane Chromosom 1, flankiert

von murinen Chromosomen mit

den enthaltenen syntenen Gen-

regionen,dargestellt.

DiefarblichgekennzeichnetenGenregionendeshumanenChromosoms1werdendenmurinen

ChromosomenabschnitteninBlöckenzugeordnet.AufdieseWeisekönnendieentsprechenden

syntenengenetischenAbschnitteundihrechromosomaleLokalisationidentifiziertwerden.

Anhand der Gallensteinkarte der Maus können Kandidatengene in den syntenen humanen

Genregionenbestimmtwerden,dessenAssoziationzudemgesuchtenPhänotypen imRahmen

vonweiterführendenUntersuchungenbestätigtwerdenmuss(Lyons&Wittenburg,2006).

HumanesChromosom1:933238–58547094MMus_musculusChr1:130.4M-174.4M

Homo_sapiensChr1:158.5M-207.4M

Abbildung2:HumanesChromosom1mitdensyntenenGenabschnittenverteiltaufdenjeweiligenmurinenChromosomen(Ensembl)(Herrero,etal.,2016)

18

1.5.2 HumaneKopplungsstudien

IndererstengenomweitenKopplungsstudiezur IdentifizierunghumanerGallenstein-Locivon

Puppala et al. wurden Untersuchungen mit 715 Studienteilnehmern von insgesamt 39

mexikanisch-amerikanischen Familien durchgeführt. Für die Studie wurden eine Karte von

genetischen Markern mit einem Abstand von ca. 10 Centimorgan (cM) und die Daten aus

Ultraschalluntersuchungen zur Phänotypisierung der Probanden genutzt. Nach Berücksichti-

gungderKovariatenGeschlecht,AlterundRisikofaktorendesmetabolischenSyndromskonnten

zwei bedeutende prädisponierende Faktoren auf Chromosom1p in derNähe derMit-Marker

D1S1597undD1S407identifiziertwerden.DiesebeidenLociweisenzudemeineKonkordanzzu

dembestätigtenmurinenGallenstein-GenLith8auf,wasentsprechendalsweitereBestätigung

derErgebnisseangesehenwurde.(Puppala,etal.,2006)

1.6 GenetischeAssoziationsstudien

1.6.1 SNPsalsgenetischeVariation

DasmenschlicheGenomenthältca.3Mrd.Basenpaare(Manolio,Brooks,&Collins,2008).Die

phänotypische Vielfalt zwischen einzelnen Individuen resultiert aus genetischen Variationen

innerhalbdesGenoms,dieu.a.durchSequenzpolymorphismenzustandekommen.Diehäufigste

ArteinesSequenzpolymorphismusistdersogenannteSNP(„SingleNucleotidePolymorphism“)

(Consortium, 2003). Er charakterisiert den Einzelnukleotidaustausch in der Gensequenz des

ChromosomsundtrittinderRegelbiallelauf.DemzufolgekanneinIndividuumhomozygotoder

heterozygotfürdiesenPolymorphismussein.

DieSNP-Frequenzbeträgt1auf300Basenpaare,sodassdashumaneGenomca.10Mio.SNPs

beinhaltet(Kruglyak&Nickerson,2001).PolymorphismentretenmiteinerHäufigkeitvon≥1%

in der Bevölkerung auf und erklären über 90% der genetischen Varianten (Kruglyak &

Nickerson,2001).JedesneueAllel,dasaufderBasiseinerMutationentstandenist,istzunächst

mitdenbenachbartenAllelenaufdemChromosomassoziiertundwirdaufdemGenabschnittals

Haplotyp gemeinsam weiter vererbt. Im Rahmen von Rekombination, die einen zufälligen

VorgangdarstelltunddiegenetischeVariabilitätderentsprechendenRassedefiniert,kommtes

nun zu einerTrennungder SNPs.DieWahrscheinlichkeit, dasszwei SNPsgemeinsamvererbt

werden, korreliert negativ zum Abstand auf dem jeweiligen Chromosom auf dem die beiden

SNPs lokalisiert sind (Consortium, 2003). Demgegenüber ist dieWahrscheinlichkeit, dass sie

durchRekombinationgetrenntwerden,umsohöher,jegrößerderAbstandzwischendenbeiden

SNPs ist (Consortium, 2003). Das Kopplungsungleichgewicht (Linkage Disequilibrium, LD)

19

beschreibt hierbei dieWahrscheinlichkeit der gekoppelten Vererbung zweier Allele in einem

gemeinsamen Haplotypblock in einer Population (Consortium, 2003). Diese Kopplung wird

durch Rekombination im Rahmen derMeiose innerhalb vonmehreren aufeinanderfolgenden

Generationen schrittweise voneinander getrennt, vorzugsweise in sogenannten Hot-Spot-

RegionendesChromosoms(Manolio,Brooks,&Collins,2008)(McVean,Myers,Hunt,Deloukas,

Bentley, & Donnelly, 2004). Das Maß der Korrelation zwischen zwei SNPs wird durch den

Maßstabr²festgelegt.ZweiSNPsstehenineinemperfektenLDzueinander,beieinemr²von1.0,

wasbedeutet,dasssiestarkmiteinanderkorrelierenundimmerzusammenbeobachtetwerden

(Manolio,Brooks,&Collins,2008).RückschließendkannsomitbeiderGenotypisierungvonSNP

AaufdenGenotypvonSNPBgeschlossenwerden,wennesineinemhohenLDzumSNPAsteht.

1.6.2 Studiendesign

Im Rahmen von Assoziationsstudien wird der Zusammenhang zwischen dem Genotyp einer

genetischen Variante und dem Phänotyp einer Erkrankung analysiert (Bickeböller & Fischer,

2007).EineAssoziationwirdvermutet,wenneinPolymorphismusüberdurchschnittlichhäufig

mit einem phänotypischen Merkmal beobachtet wird. Hierfür bestehen verschiedene

Studienansätze:

Der sogenannte enge Kandidatengenansatz wird vor allem bei monogenen Krankheiten oder

Mendelschen Subformen komplexer Erkrankungen verwendet. Hierbei werden wenige Gene

undMarkeruntersucht,diez.B.zuvordurchKopplungsanalysenselektioniertwurdenoder im

RahmenvonvorhergehendenfunktionellenTestsoderinTiermodelleneineAssoziationzuder

untersuchten Erkrankung aufweisen. Der erweiterte Kandidatengenansatz überprüft Gene,

welcheaufgrundihrerFunktionEinflussaufdiePathophysiologiederuntersuchtenErkrankung

haben könnten. Zusätzlich werden genetische Marker in den genregulatorischen Bereichen

untersucht,umfunktionelleEinflüssedurchgenetischeVarianteninflankierendenRegionenauf

dieKandidatengenezuentdecken.(Bickeböller&Fischer,2007)

Die Kopplungsanalyse weist Einschränkungen für die Untersuchung von komplexen

Erkrankungenauf, da disponierende Genemit geringemEffekt nicht ausreichend identifiziert

werden können (Teare & Barrett, 2005). Mithilfe von eng verteilten Markern wird in einer

genomweitenAssoziationsstudie(GWAS),ohnegezielteUntersuchungeineszuvorselektierten

GensodereinerGenregion,eineAssoziationmitderErkrankunguntersucht.Entsprechend ist

diese Form der Assoziationsanalyse, im Gegensatz zum Kandidatengen-basierten Ansatz,

hypothesenfreiundidentifiziertebenfallsPolymorphismenmitgeringerEffektstärke.Fallseine

statistisch relevante Assoziation zwischen einem Polymorphismus und der Erkrankung

gefunden wird, ist entweder die Variante selbst kausal beteiligt, oder sie befindet sich im

Kopplungsungleichgewicht mit einer bislang nicht identifizierten, disponierenden Variante.

20

(Bickeböller&Fischer,2007)

Genomweite Assoziationsstudien ermöglichen eine schnelle, kosteneffiziente Analyse und

Identifizierung einer hohen Anzahl an genetischen Varianten sowie die Untersuchung ihrer

AssoziationmitkomplexenMerkmalenoderErkrankungen.DieGenotypisierungderProbanden,

dieimRahmenvorangegangenerUntersuchungenexaktphänotypisiertwurden,erfolgtmitHilfe

von speziell entwickelten Gen-Chips. Die DNA-Microarrays bestehen aus tausenden Slots, die

jeweils synthetische DNA-Sequenzenmit einem spezifischen SNP enthalten. Nach Hinzufügen

dergereinigtenhumanenDNA,zusammenmiteinerLösungausOligonukleotidenundEnzymen,

findeteineHybridisierungaufdemMicroarraystatt,wobeieinstabilerHybridentsteht(Grimm,

Blum,&Thimme,2011). JenachHomo-oderHeterozygotiedesProbanden fürdengesuchten

SNP entsteht ein spezifisches Fluoreszenzmuster, das automatisiert ausgelesen und

dokumentiertwird(Grimm,Blum,&Thimme,2011).DieAllelfrequenzzwischendenFällenund

Kontrollen wird verglichen, eine signifikante Differenz im Auftreten von SNPs bei der

erkrankten Population im Vergleich zur Kontrollkohorte wird als Assoziation mit der

untersuchten Erkrankung gewertet (Need & Goldstein, 2010). Schlussfolgernd wird der neu

entdecktePolymorphismusalsdirektursächlich(direktdisponierend)füreinErkrankungsrisi-

kooderalsMarkerfüreinebenachbartegenetischeVariationgewertet(indirektdisponierend)

(Need&Goldstein,2010).AbschließendwirddieKorrelationzwischenGenotypundPhänotyp

ineinemsogenanntenManhattanPlotdargestellt(Grimm,Blum,&Thimme,2011).

Aufgrund der Assoziation zwischen einzelnen SNPs, basierend auf Haplotypblöcken und

Kopplungsungleichgewicht, ist es möglich, Kandidatengen-basierte- und genomweite

Assoziationsstudienwenigerzeit-undkostenintensivzugestalten(Manolio,Brooks,&Collins,

2008).DurchdieGenotypisierungrepräsentativerSNPs(Tag-SNPs)könnenInformationenüber

benachbarte SNPs einer Genregion und somit deren spezifischen Haplotypblöcken gewonnen

werden (Consortium, 2003). Die Zusammenstellung dieser Tag-SNPsmit präziser Darstellung

ihrer Kopplung und die Entwicklung einer Karte mit engmaschig auf dem Genom verteilten

MarkernwardieZielsetzungdesInternationalenHapMapProjektes(Consortium,2003).

1.6.3 ABCG5/8

Eine der ersten humanen lithogenen Genregionen, die zunächst alsLith-Gen (Lith 9) aufdem

Chromosom17beiderMausidentifiziert(WittenburgH.,Lyons,Li,Churchill,Carey,&Paigen,

2003) und im Rahmen einer genomweiten Assoziationsstudie auch beimMenschen bestätigt

wurde,istdieGenvarianteD19HimGenABCG8(Buch,etal.,2007).

DieATP-binding-cassette-TransporterbildeneineGruppevon7Subfamilien,zudenenauchdie

ABCG-Familie gehört (Vasiliou, Vasiliou, & Nebert, 2009). Sie sind ein Beispiel fürmembran-

ständige Transporter, die Bindung und Hydrolyse von ATP nutzen, um spezifische Substrate

21

aktiv über die Zellmembran zu transportieren (Rees, Johnson, & Lewinson, 2009). Die ABCG-

Subfamilie besteht aus sechs „reverse“-Semi-Transportern, welche typischerweise eine NBF

(nucleotide-binding-folds) am Amino-Ende und eine TMD (Transmembran-Domäne) am

Carboxyl-Endeaufweisen(Dean,2002).DieNBFssindimZytoplasmalokalisiertundnutzendie

durch ATP-Hydrolyse gewonnene Energie, um das Substrat aktiv über die Membran zu

transportieren(Dean,2002).DiekodierendenGenederbeidenTransporterABCG5(Sterolin-1)

und ABCG8 (Sterolin-2) sind auf dem Chromosom 2p21 in kurzem Abstand voneinander

lokalisiert (Yu, Qian, Jiang, Zheng, Cayabyab, & Tang, 2013) und werden überwiegend in

EnterozytendesDünndarmesundHepatozyten exprimiert (Repa,Berge, Pomajzl,Richardson,

Hobbs,&Mangelsdorf,2002).BeideProteinefungierennuralsfunktionsloserSemi-Transporter,

wennsieseparatexprimiertwerden.EineTransportfunktioninderPlasmamembrankönnensie

nurdannausüben,wennsieeinfunktionstüchtigesHeterodimerbilden,dessenFunktioninder

Einschränkung der intestinalen Absorption und Erleichterung der biliären Sekretion von

CholesterinundPhytosterolenbesteht(Yu,Qian,Jiang,Zheng,Cayabyab,&Tang,2013)(Graf,et

al.,2002)(vonKampen,etal.,2013).

Bei der autosomal-rezessiv vererbbaren Erkrankung Sitosterolämia bewirken Mutationen

innerhalbderABCG5/ABCG8GeneeinenFunktionsverlustdesHeterodimersABCG5/8,wodurch

eineerhöhteAbsorptionundvermindertebiliäreSekretionvonSterolenresultiert(Berge,etal.,

2000). Eine massive Resorptionssteigerung von pflanzlichen und neutralen Sterolen sowie

Cholesterinmit bis zu 50-fach erhöhten Sitosterol-Plasmaspiegeln sind die Folge (Keller, von

Eckardstein, & Hersberger, 2007). Zusätzlich konnte bei Sitosterolämie-Patienten eine

verminderte HMG-CoA-Reduktase-Konzentration als Ausdruck einer verminderten

TranskriptionmitentsprechendstarkreduzierterCholesterinsyntheseundeinerverminderten

Cholesterinsekretion in die Galle nachgewiesenwerden (Salen, Shefer, Nguyen, Ness, Tint, &

Shore,1992).PatientenmitdieserErkrankungweisennurseltenGallensteineauf,wasaufdie

reduzierte biliäre Cholesterinsekretion im Verhältnis zu Gallensäuren und Phospholipiden

zurückzuführen ist, und auf eine relative Resistenz hinweisen könnte (Salen, Shefer, Nguyen,

Ness,Tint,&Shore,1992).

Nachdem bereits eine Assoziation vonUnterschieden im Plasmalipidspiegel von Geschwister-

paarenmitGallensteinenundeinerVarianteinABCG5/8beschriebenwurde(Acalovschi,etal.,

2006), konnte letztendlich eine genomweite Assoziationsstudie die Genvariante D19H im

ABCG8-Gen als humanen genetischen Risikofaktor für die Entstehung von Gallensteinen

identifizieren (Buch, et al., 2007). Zeitgleich wurde diese Schlussfolgerung durch eine

Kandidatengen-basierteLinkage-undAssoziationsstudiebestätigt(Grünhage,etal.,2007).

Im Rahmen einer umfangreichen Studie mit insgesamt 4381 Gallensteinträgern und 3765

Kontrollen aus Deutschland, Chile, Dänemark, Indien und China konnte eine Assoziation des

SNPs rs11887534 (ABCG8-D19H) mit einer allelspezifischen erhöhten Effizienz des

22

Cholesterintransportsdurch den heterodimerenABCG5/8-Transporter als Pathomechanismus

der Entstehung von Cholesteringallensteinen identifiziertwerden (vonKampen, et al., 2013).

Damitkonnteerstmaligbelegtwerden,dassdieGenvariantezueinerbiliärenCholesterinhyper-

sekretion und somit zur Cholesterinübersättigungder Gallemit resultierender Prädisposition

füreineGallensteinbildungführt(vonKampen,etal.,2013).

1.7 HumaneLITH-Gene

BisdatowurdenPolymorphismenin25Genenidentifiziert,dieeineAssoziationzuCholesterin-

Gallensteinen aufweisen. Ein Großteil davon wurde im Rahmen von Assoziationsstudien

identifiziert,wobeieinigeauchinunabhängigenStudienkollektivenrepliziertwerdenkonnten.

InderfolgendentabellarischenZusammenfassung(Tabelle1)sinddiemitdenobengenannten

StrategienbislangidentifiziertenGenvariantenaufgeführt.

Gen Gensymbol Poly-morphismus Population Studien-

design Studie

ATPbindingcassette

transporterB4

ABCB4(GBD1) Multiple Frankreich AS

(Rosmorduc,Hermelin,&Poupon,2001)

ATBbindingcassette

transporterB11ABCB11 Multiple Holland AS (vanMil,etal.,

2004)

ATPbindingcassette

transporterG5/G8

ABCG8/ABCG5

rs11887534

rs4148217rs6720173

China

China

GWAS

AS

AS

(Buch,etal.,2007)

(Wang,etal.,2007)

(Kuo,Shin,Chen,Yang,Yang,&Hsiao,2008)

ß3adrenergicreceptor ARDB3

rs4944

190T.C

Deutschland

Indien

AS

AS

(Klass,Lauer,Hay,Kratzer,&Fuchs,2007)

(Srivastava,Mishra,Singh,Rai,Srivastava,&Mittal,2013)

ApolipoproteinA1 APOA1 -75G>A,RFLP Indien AS

(DixitM.,Choudhuri,

Saxena,&Mittal,2007)

ApolipoproteinB APOB c.2488C>T,c.4154G>A China AS (Han,Jiang,Suo,

&Zhang,2000)

ApolipoproteinC1 APOC1 RFLP Indien AS(Dixit,

Choudhuri,&Mittal,2006)

ApolipoproteinE APOE e4 Spanien AS (Bertomeu,et

23

al.,1996)Androgen-rezeptor AR c.172(CAG)n Griechen-

land AS (Kitsiou-Tzeli,etal.,2007)

Cholezystokinin1Rezeptor CCK1R A1A1 Indien AS

(Srivastava,Pandey,Dixit,Choudhuri,&Mittal,2008)

Cholesterin-esterTransfer-protein CETP TaqIB Finnland AS

(Juvonen,Savolainen,Kairaluoma,Lajunen,

Humphries,&Kesäniemi,1995)

CytochromP4507A1

CYP7A1

PromotorSNP-204A>C’

rs6471717

China

AS

GWAS-Meta-analyse

(Jiang,etal.,2004)

(Joshi,etal.,2016)

Östrogen-rezeptor1 ESR1

IVS1-397C.T

IVS1-351A.G Indien AS

(Srivastava,Mishra,Singh,Rai,Srivastava,&Mittal,2013)

Östrogen-rezeptor2 ESR2 c.1092+3607

(CA)nGriechen-land AS (Kitsiou-Tzeli,et

al.,2007)Glukokinase(Hexokinase4)Regulator

GCKR rs1260326 Europa,Frauen AS (Rodriguez,et

al.,2016)

LRPassociatedprotein1 LRPAP1 rs11267919 Indien AS

(Dixit,Choudhuri,&Mittal,2006)

Mucin1 MUC1 rs4072037 China,Männer AS (Chuang,etal.,

2011)

Mucin2 MUC2 rs7396030 China,Männer AS (Chuang,etal.,

2011)

Mucin-likeprotocadherin MUPCDH rs3758650 China,

Männer AS(Chuang,Hsi,

Wang,Yu,Lee,&Juo,2011)

NPC1-Like1 NPC1L1

rs17655652

rs2072183

Dänemark AS

(Lauridsen,Stender,Frikke-

Schmidt,Nordestgaard,&

Tybjaerg-Hansen,2015)

FarnesoidXRezeptor NR1H4

20647T>G,1G>TundIVS731A>T

Mexiko AS (Kovacs,etal.,2008)

Sodium-dependentbileacidtransporter

SLC10A2 rs9514089 Deutschland AS (Renner,etal.,2009)

24

Solutecarrierorganicaniontransporter

family,member1B1

SLCO1B1 rs11045819 Indien AS

(Srivastava,Srivastava,Srivastava,Choudhuri,&Mittal,2011)

Sulfotrans-ferasefamily2Amember1

SULT2A1 rs2547231 GWAS-Meta-analyse

(Joshi,etal.,2016)

Trans-membrane4Lsixfamilymember4

TM4SF4 rs9843304 GWAS-Meta-analyse

(Joshi,etal.,2016)

Tetratrico-peptiderepeatdomain39B

TTC39B rs686030:C>A

Europa,Frauen AS (Rodriguez,et

al.,2016)

UDPglucuronosyltransferase1A1 UGT1A1 rs6742078 Deutschland AS (Buch,etal.,

2010)Tabelle1:AuflistungderbislangidentifiziertenhumanenLITH-Gene;(Marschall,Katsika,Rudling,&Einarsson,

2010)(Lammert&Miquel,2008),AS:Assoziationsstudie

1.8 Zielsetzung/Aufgabenstellung

ZieldervorliegendenArbeitwardieCharakterisierungvonPrädiktorenundIdentifizierungvon

genetischen Risikofaktoren, die das Gallensteinrisiko des Menschen beeinflussen. Die

GallensteinträgerineinersorbischenPopulationwurdendurcheineAbdomensonographieoder

der Anamnese einer Cholezystektomie aufgrund einer Cholezystolithiasis identifiziert. Durch

einegenomweiteAssoziationsstudiewurdenPolymorphismenidentifiziert,dieeinesignifikante

Assoziation aufweisen. Basierend auf der Konkordanz zwischen dem murinen und dem

menschlichen Genom, wurden die plausibelsten Varianten aus beiden Spezies in einer

unabhängigenKohorterepliziert.

25

2 MaterialundMethoden

2.1 Studienaufbau

2.1.1 CharakterisierungderStudienkollektive

2.1.1.1 DieSorben

ZurIdentifizierungvonSNPs,diemitderCholelithiasisassoziiertsind,wurdeeinegenomweite

Assoziationsstudie in einer sorbischen Population in der Oberlausitz durchgeführt. Die

katholischen Sorben sind eine Bevölkerungsgruppe in Sachsen, die sich eine kulturelle und

sprachliche Eigenständigkeit in den umliegenden deutschsprachigen Regionen bewahrt hat.

Entsprechend befinden sich ca. 15.000 sorbisch sprechende Einwohner in den Dörfern der

Lausitz,dieaufgrundihrerseitca.1000JahrenbestehendenAbgeschiedenheitmithomogenen

Umweltfaktoren und weitestgehend fehlender Migration eine eingeschränkte genetische

Heterogenitätvermutenlassen(Gross,etal.,2011)(Veeramah,etal.,2011).Allerdingsergaben

UntersuchungenzudemAusmaßdergenetischenIsolationderSorbenalsBevölkerungsgruppe

nurgeringeUnterschiedezudernicht-isolierteneuropäischenBevölkerung,wassiealsmoderat

isoliert gelten lässt (Veeramah, et al., 2011). Dies kann unter anderem auf die jüngst

zurückliegendeGründungderBevölkerungsgruppe(9. Jahrhundert)undeinelediglichrelative

Abgeschiedenheit aufgrund von sprachlichen und religiösen Unterschieden ohne topographi-

scheIsolationzurückgeführtwerden(Veeramah,etal.,2011).

Insgesamt wurden 932 Sorben in die Studie einbezogen, 176 Gallensteinträger und 756

Kontroll-Probanden ohne Nachweis von Sludge oder Gallensteinen in der Ultraschall-

untersuchung.DieGallensteinträgerwurdenbeisonographischemNachweisvonKonkrementen

in der Gallenblase oder infolge einer anamnestisch angegebenen Cholezystektomie bei

symptomatischerCholezystolithiasisidentifiziert.DieabdominelleUltraschalluntersuchungzur

Phänotypisierung des jeweiligen Probanden erfolgte mittels einer 3,5 MHz Ultraschallsonde

durcheinenerfahrenenUntersucher.

Von allen Probanden erfolgte die Entnahme von Vollblut in einem EDTA-Blutröhrchen zur

laborchemischenUntersuchungundExtrahierungderDNA.DesWeiterenwurdenderNüchtern-

Blutzuckerwert gemessen, u.a. ein oraler Glucosetoleranztest durchgeführt und anthropo-

metrischeDatenerhoben.AlleTeilnehmerderStudiehabenvorBeginnderUntersuchungeinen

standardisierten Anamnesebogen ausgefüllt und eine schriftliche Einverständniserklärung

abgegeben. Die Durchführung der Studie wurde durch die Ethik-Kommission an der

MedizinischenFakultätderUniversitätLeipziggenehmigt.

26

2.1.1.2 DieAachenerReplikations-Kohorte

Die Replikationskohorte besteht aus 368 Probanden, die in der Klinik für Innere Medizin,

MedizinischeKlinikIII,undderKlinikfürChirurgieamUniversitätsklinikumAachenerfasstund

untersucht wurden. Nach stationärer Aufnahme in der gastroenterologischen Abteilung der

Klinik für Innere Medizin wurden entsprechende laborchemische Parameter und der

Gallensteinstatusbestimmt.PatientenmitStatinenindertäglichenMedikationoderbekannter

familiärer Hypercholesterinämie wurden von den weiteren Untersuchungen ausgeschlossen.

Drei erfahrene Untersucher führten eine sonographische Untersuchung des Abdomens unter

Verwendung eines 3,5 Mhz Schallkopfs bei den Probanden durch. Bei einem Nachweis von

Sludge oder Gallensteinen in der Gallenblase oder einer positiven Anamnese auf eine

stattgehabte Cholezystektomie aufgrund einer Cholelithiasis wurde der Proband als

Gallensteinträgergewertet.ChirurgischerseitswurdenPatientenmitelektiverlaparoskopischer

CholezystektomieindieStudieaufgenommen.DiePatientenwurdennachAlter,Geschlechtund

BMI gematcht und in zwei gleich große Gruppen von Gallensteinträgern und Kontrollen

aufgeteilt. Entsprechend beinhaltet die Kohorte 184 Gallensteinträger und 184 Kontroll-

probanden,miteinemAltersmedianvon64Jahren(30–89Jahren),davon162männlicheund

206weiblicheTeilnehmer.AlleTeilnehmerderStudiehabenvorBeginnderUntersuchungeine

schriftlicheEinverständniserklärungabgegeben.DieDurchführungderStudiewurdedurchdie

zuständigeEthik-Kommissiongenehmigt.(Mella,etal.,2007)

2.2 GenomweiteAssoziationsstudiezurIdentifizierunghumanerLITH-Loci

Nach erfolgter Blutentnahme der sorbischen Probanden wurde die genomische DNA mittels

QIAmpDNABloodMidiKit(QiagenInc.,Valencia,CA,USA)entsprechendderHerstelleranleitung

extrahiertund fürdieGenotypisierungvorbereitet.FürdieDurchführungderGenotypisierung

durch die „Core Unit DNA-Technologien“ des Interdisziplinären Zentrums für Klinische

Forschung (IZKF, Universität Leipzig) und ATLAS Biolabs GmbH, Berlin, wurden zwei SNP

Arraysverwendet:GeneChipHumanMapping500KArraySet(Affymetrix,Inc.),sowieGenome-

WideHumanSNPArray6.0(Affymetrix, Inc.).EswurdeneineQualitätskontrolledurchgeführt

und SNPs selektiert, welche folgende Kriterien erfüllten: missing rate per SNP < 5%, Hardy-

Weinberg-Equilibrium (HWE) p>0,0001 und minor allele frequency (MAF) > 0,01. Nach

erfolgreichemBestehenderKontrollewurdeninsgesamt390.619SNPsderbeidenGenchipsfür

dieweiterenUntersuchungenausgewählt.(Tönjes,etal.,2010)

ErstelltwurdeeineTabellemit417SNPs,welcheeineAssoziationzurCholelithiasismiteinem

p-Wert von < 0.0001 aufwiesen und die entsprechende chromosomale Lokalisationdes SNPs

einschließlichdesdortbefindlichenGensmitentsprechenderGenregionzugeordnet.

27

2.3 KomparativeAnalyse

2.3.1 ÜbertragungderGallensteinkartederMausvoncMinMb

UmdieimRahmendergenomweitenAssoziationsstudieidentifiziertenSNPsfürweiterführende

UntersuchungeneinzugrenzenwurdenSNPsselektiert,diesichineinerkonkordantenRegionzu

Gallensteinregionen des Mausmodells befanden. Zunächst erfolgte die Auflistung aller

validiertenmurinenLith-QTLsmithilfederpubliziertenvonLyonsetal. (Lyons&Wittenburg,

2006). Hierzu erfolgte die tabellarische Erfassung der QTLs sowie Lith-Gene mit dem

entsprechenden Chromosom, den gekreuzten elterlichen Mausstämmen mit Hinweis auf den

gallensteinempfänglichen Stamm, den Peaks der QTL-Lokalisation und dem jeweiligen

KonfidenzintervallderRegion.

DiemurineQTL-AnalyseberuhtaufeinergenetischenKopplungsanalyse.Entsprechend istdie

Lokalisation der Genregionen in der Maßeinheit centiMorgan angegeben, welche die

Rekombinationsfrequenzen zweier Genloci bezeichnet. Da die genetische Lokalisation nicht

direkt in eine physikalische Entfernung übertragenwerden kann,wurden zur Kartierungder

Lith-QTLsMikrosatellitenmarkergenutzt,dieinihrerjeweiligenchromosomalenPositiongenau

definiert und entsprechend als genetische Marker geeignet sind. Mithilfe derMouse Genome

Informatics Database (Update 10/9/2008, MGI_4.12) erfolgte die gezielte Identifizierung der

Konfidenzintervalle der einzelnen murinen QTLs durch die Lokalisation der Mikrosatelliten-

marker(Eppig,Blake,Bult,Kadin,Richardson,&MouseGenomeDatabaseGroup,2015).Somit

konntendieGenregionen inMegabasenpaarenübertragenwerden,sodasseinevergleichende

UntersuchungmitdemhumanenGenommöglichwurde.

2.3.2 IdentifizierungderkonkordantenhumanenRegionenmitEnsembl.org

ZurIdentifizierungderzudenmurinenLith-QTLskonkordantenhumanenGenregionenausder

genomweiten Assoziationsstudie wurde die Multi-Spezies Gendatenbank Ensembl.org

herangezogen(MusmusculusBuild37mouseassembly,(strainC57BL/6J,ensemblrelease50))

(Herrero, et al., 2016). Nach Auswahl des zu überprüfendenmurinenChromosomswird eine

Gegenüberstellung mit den jeweiligen konkordanten Genregionen auf den humanen

Chromosomen angezeigt. In der Übersicht können die einzelnen Abschnitte des murinen

Chromosoms,welche das Konfidenzintervall des zu vergleichendenLith-QTLs beinhalten, den

entsprechenden syntenen chromosomalen Abschnitten blockweise zugeordnetwerden. Somit

konnten zu allen murinen Gallensteinsuszeptibilitätsregionen korrespondierende humane

GenregionenmitpotentiellenLITH-Locibestimmtwerden.

28

2.3.3 VergleichderkonkordantenhumanenRegionenmitdenErgebnissender

genomweitenAssoziationsstudie

NachderIdentifizierungderzumurinenLith-LocikonkordantenhumanenRegionenerfolgteder

Vergleich mit den Ergebnissen der genomweiten Assoziationsstudie. Eine tabellarische

Gegenüberstellungwurdeerstellt, indemdieSNPsderGWAS,dieeinesignifikanteAssoziation

zur Cholelithiasismit einem Signifikanzniveau von p < 0,0001 aufwiesen, entsprechend ihrer

chromosomalenLokalisationdenkonkordantenGenregionenzugeordnetwurden.

Entsprechend konnte eine Übersicht erstelltwerden, ausder Informationen zumurinenLith-

Loci, die zu ihnen entsprechenden konkordanten humanen Regionen und in dieser Region

befindlichen Cholelithiasis-assoziierten SNPs aus der GWAS gezogen werden können. Eine

Aufstellung der Genregionen ist jeweils für die Chromosomen in Tabellenform erfasst (Siehe

Anhang,Tabellen7-28).

2.4 SelektionundReplikationderKandidatengeneinderAachenerKohorte

2.4.1 BestimmungvonTag-SNPszurReplikation

DievorliegendeArbeitfokussiertsichaufzehnGene,dieinkonkordantenLith-Regionenliegen

undmindestensdreiSNPsausdergenomweitenAssoziationsstudiebeinhalten.Einzelnuklidpo-

lymorphismen und entsprechende Gene, welche sich nicht im Konfidenzintervall einer

Genregion konkordant zu einem verifiziertenmurinen Lith-Lokus befanden, wurden von den

folgendenUntersuchungenausgeschlossen.

NachfolgendwurdeeineReplikationderKandidatengeneinderAachenerKohortedurchgeführt.

Um die Anzahl der zu replizierenden SNPs einzuschränken, wurden für jedes Gen Tag-SNPs

ausgewählt,welchediegenetischeVariabilitätderGeneabbilden.HierfürwurdedieDatenbank

Haploview(Version4.1)verwendet(Barrett,Fry,Maller,&Daly,2005).DurchAuswahlderTag-

SNPs können Informationen zu allen SNPs im Gen, entweder durch direkte Analyse oder

aufgrundihreshohenLDs(r²>0,8)zuanalysiertenTag-SNPs,repräsentativdurcheinekleine

GruppeanSNPsgewonnenwerden(Carlson,Eberle,Rieder,Yi,Kruglyak,&Nickerson,2004).

Für jedesKandidatengenwurdenentsprechendTag-SNPs selektiert, die einenhohenLD (r²>

0,8)zudenrestlichenSNPsundeineMAF(minorallelefrequency)vonmind.5%aufwiesenund

somitdieLD-GruppenderpotentiellenLITH-Generepräsentieren.SomitwurdedieAnzahlder

zugenotypisierendenGenvariantenreduziert.

29

2.4.2 GenotypisierungderTag-SNPs

2.4.2.1 DNA-Extraktion

Für die Genotypisierung wurden die entnommenen Blutproben der Replikationsprobanden

freundlicherweise zur Verfügung gestellt und das Blut bei 4°C in EDTA-Röhrchen gelagert.

Nachfolgend wurde die DNA von den insgesamt 368 Vollblutproben mittels QIAGen DNeasy

Blood and Tissue Kit®nach Angaben derHerstelleranleitung extrahiert. Die Probenaufberei-tung wurde nach dem angegebenen Protokoll durchgeführt (DNeasy® Blood & Tissue

Handbook,July2006).

Die Blutproben werden zunächst auflysiert. Die Pufferbedingungen sind entsprechend

angepasst,umoptimaleBedingungenfüreineDNA-Bindungzuschaffen.Nachfolgendwirddas

Lysat in eineDNeasyMini spin column (Teströhrchen) gegeben.Während der Zentrifugation

bindet die DNA selektiv an die DNeasy-Membran, und die restlichen Blutbestandteile

sedimentierenungehindertaufdenBodendesTeströhrchens.Dieverbliebenenkontaminieren-

den Bestandteile und Enzyminhibitoren werden im Rahmen von zwei Waschdurchgängen

entfernt.DieDNAkannnuninWasseroderPufferlösungaufgelöstwerdenundistfertigfürdie

Nutzung.(Qiagen)

2.4.2.2 AlleldiskriminierungmittelsTaqManPCRAssay

Die Genotypisierung wurde mittels eines TaqMan PCR Assays durchgeführt. Der verwendete

MastermixisteinvorgefertigtesundstandardisiertesProduktderFirmaAppliedBiosystemsInc.

(FosterCity,CA,USA).DerMastermixenthältsequenzspezifischeforward-undreverse-Primer,

welche sich an die gesuchte DNA-Sequenz anlagern; des Weiteren sind die AmpliTaq-DNA-

PolymeraseundBasenzurAmplifizierungenthalten.DerwichtigsteBestandteilderAssayssind

die vorgefertigten Sonden, welche entsprechend des zu genotypisierenden SNPs auf der

InternetseitederFirmaLifeTechnologiesGmbHangefordertwurden(ThermoFisherScientific).

Die jeweils farbmarkierten Sonden sind so konstruiert, dass der zu untersuchende

PolymorphismusinbeidenAllelausführungenvoneinerkurzenBasensequenzflankiertistund

exaktmitderuntersuchtenDNAhybridisierenkann.

AlsBeispielwirdhierderTag-SNPfürdasKandidatengenGAD2aufgeführt:

Eingabe der dbSNP ID rs3781117, Position Chromosom10: 26512044Mb, GRCh37 (Genome

ReferenceConsortium,ReleaseMarch2009).

GAGGAATCTAGAAGTTAATTAGATA[A/G]GCCTTGCGATGGACTAATCAGTCGA

Die erste Position, beschreibt das Allel 1 (A), welches in der nachfolgenden TaqMan-

GenotypisierungmitdemFarbstoffVICmarkiertist.DiezweiteSondemitdemAllel2(G)istmit

dem Farbstoff FAMmarkiert. Die Sondenwerden als Paarmit den beiden Allelvarianten zur

30

Reaktionslösunggegeben,uminjedemAssaydiebeidenmöglichenVariantengenotypisierenzu

können.

VorbereitungderMikrotitrierplatten(96Wells):

- 1µlDNAproWell

- Plattezentrifugieren

- MasterMixfüreinePlatte(96Wells)vorbereiten

o 250µlMasterMix(ABI)

o 250µlH2O(DNaseundRNasefrei)

o 6µlSonde(40-facheKonzentration)

- 5µlMasterMixproWellzurDNAhinzufügen

- MattezumSchutzaufdiePlattelegen

- Plattezentrifugieren

ZurQualitätskontrollewerdenfolgendeKontrollendurchgeführt:

- Reagenzien-Blindwert/Negativ-Kontrolle: In einem Teströhrchen wird lediglich

MastermixmitWasserversetzt,ohnejeglicheDNAhinzuzufügen.DieProbewirddurch

sämtliche Extraktionsschritte mitgeführt. Die Auslesung des Teströhrchens muss ein

negativesErgebnis zeigen,da ansonstenvoneinerKontaminierungdesMastermixmit

DNAauszugehenist.

- Positiv-Kontrolle: Das Teströhrchen enthält den Mastermix und die DNA von einer

anderenPlatte,diebereitsamplifiziertundausgewertetwurde.DieAuslesungmusseine

sichere Amplifikation mit dem gleichen Ergebnis der ursprünglichen Platte haben,

ansonstenistvoneinemFehlerwährendderPCRauszugehen.

- Falls die Kontrollen nicht das erwartete Ergebnis erzielen, müssen die Resultate der

VersuchsreiheverworfenunddieUntersuchungwiederholtwerden.

DurchführungdesCycler-ProgrammsmitABI2720ThermalCycler(AppliedBiosystemsInc.):

- AmpliTaqGoldAktivierung:10minbei95°CàHold

- Denaturierung:15Sekbei92°C

- Anneal/Extend:1minbei60°C

- Temperaturauf4°Creduzieren

AuslesungderErgebnissemittelsABIPrism7500sequencedetector(AppliedBiosystems,Inc.)

undanschließendeAuswertungmitderSDSSoftware(Abbildung3):

VIC®-Farbstoff àHomozygotiefürAllel1

FAM™-Farbstoff àHomozygotiefürAllel2

BeideFarbstoffsignale àHeterozygotiefürbeideAllele

40Zyklen

31

Abbildung3:ErgebnisderGenotypisierungdesSNPsrs3781117(GAD2)

2.4.3 StatistischeAnalyse

ZunächstwurdendieGenotypverteilungenallerTag-SNPsaufdasHardy-Weinberg-Equilibrium

hin geprüft. Nach erfolgter Genotypisierung wurde jeder SNP einzeln im additiven Modell

mittelslogistischerRegressionsanalyseaufeineAssoziationmitCholelithiasisgetestet;mitdem

SNPalsunabhängigeunddemGallensteinstatusalsabhängigeVariable.DasSignifikanzniveau

wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt. Eine Adjustierung von prädisponierenden Variablenwar nicht

erforderlich, da die Fall-Kontroll-Gruppen bereits auf Alter, Geschlecht und BMI gematcht

wurden.ImadditivenModellwurdendieGenotypenentsprechendihrerFluoreszenzmarkierung

infolgendenumerischeVariablenübertragen:homozygoteProbandenfürdasAllel1(11)=0;

heterozygoteProbanden(12)=1undhomozygoteProbandenfürdasAllel2(22)=2.Fürdie

BerechnungenwurdedieSoftwareSPSS(Version20)verwendet.

2.4.4 In-silicoAnalysederfunktionellenKonsequenzenderSNPs

Fürdiein-silico-AnalysewurdenfünföffentlichzugänglicheInternet-Datenbankenausgewählt,

umInformationenanhanddesaktuellenForschungstandeszudenSNPszusammentragenund

nachfolgendinterpretierenzukönnen.

Allel1

Allel2

BeideAllele

NTC

32

ZunächstwurdenalleindergenomweitenAssoziationsstudiealssignifikantidentifiziertenSNPs

mitderDatenbankfürnicht-synonymeSNPs(nsSNPs)abgeglichen.Nicht-synonymeSNPssind

genomische Varianten in kodierenden Sequenzen welche als Resultat einen Aminosäuren-

austausch nach sich ziehen und dadurch Veränderungen in der Proteinstruktur induzieren

können. Sie könnendemnacheinendirektenEffekt aufdie individuelleEmpfänglichkeit einer

KrankheitoderMedikamentenresponsehaben(Karchin,etal.,2005).Indersogenannten„Large

Scale annotation data base of coding non-synonymous SNPs“ sind alle annotierten nsSNPs

einzusehen (Karchin, et al., 2005). Es erfolgte der Vergleich der SNPs aus der genomweiten

Assoziationsstudie mit der Auflistung der annotierten nsSNPs in der o.g. Datenbank, jedoch

konntekeinerderPolymorphismenalsnsSNP identifiziertwerden.Entsprechend ist zunächst

nichtvoneinerstrukturellenVeränderungderKandidatengenedurchdieSNPsauszugehen.

Anhand des „Ensembl Variant Effect Predictors“ wurden des Weiteren die funktionellen

Konsequenzen anhand der Lokalisation der einzelnen SNPs evaluiert (McLaren, et al., 2016).

NachEingabederrepliziertenTag-SNPsindieSuchmaskewerdendieTranskriptionsfaktoren,

die sich im Bereich des zu untersuchenden SNPs befinden, aufgelistet. Ihre Funktion,

Lokalisation (ggf. mit Entfernung zum Gen) und weitere Informationen werden angegeben.

EntsprechendkannderEffektder genetischenVariante aufdieTranskriptionsfaktoren inder

entsprechendenchromosomalenPositionbeurteiltwerden.

Die Datenbank RegulomeDB wurde entwickelt, um Varianten im humanen Genom

interpretieren zu können. Sie trägt Daten von verschiedenen Quellen zusammen, um

regulatorischesPotential oder funktionelleVarianten effektivund inkurzerZeit identifizieren

und interpretieren zu können. Eswird eine Übersichtmitden Informationen erstellt und ein

Scorevergeben,derdieWahrscheinlichkeiteinesfunktionellenEinflussesaufdasGenomangibt.

(Boyle,etal.,2012)

Das Broadinstitute hat zusammen mit dem Massachusetts Institute of Technology (MIT) das

ProgrammHaploRegv4.1entwickelt,mit dessenHilfe Informationen, auch aus anderenGen-

Datenbanken, über den zu untersuchenden SNP zusammengetragen werden (Ward & Kellis,

2012). Die Informationen zielen auf den möglichen Einfluss einer nicht-kodierenden

genomischen Variante auf den bekannten Phänotypen und enthalten Aussagen zu

gewebespezifischenChromatinzuständensowieHistonmodifikationen.

Das sogenannte GTEx-Portal stellt Zusammenhänge zwischen einem SNP und der

Genexpression in verschiedenen humanen Gewebearten her (The GTEx Consortium, 2013).

Expressions-QTL, oder Locimit stark verändertermRNA-Expression, unterliegen häufig einer

ursächlichengenetischenVarianteundkönnendurchUntersuchungengezieltdetektiertwerden

(The GTEx Consortium, 2013). Es könnengewebespezifische Effekte von SNPs und somit ggf.

bislangunentdecktepathophysiologischeAspekteidentifiziertwerden.

33

BestandeneQualitätskontrolleundAssoziationzurCholelithiasis(p≤0.0001)

Gene,diemindestensdreiderassoziiertenSNPsausderGWASbeinhalten

3 Ergebnisse

3.1 Studienaufbau(Abbildung4)

Abbildung4:FlussdiagrammdesStudienaufbaus

GenomweiteAssoziationsstudie:500KAffymetrixGeneChipund

AffymetrixGenome-WideHumanSNPArray6.0

417SNPsLokalisationinnerhalbderKonfidenzintervallevonhumanenGenregionenkonkordantzubestätigtenmurinenLith-Regionen

89potentielleKandidatengene

10Kandidatengene

22Tag-SNPs

SelektierungvonTag-SNPsmitdenKriterien:Korrelationskoeffizientr²>0.8füralleSNPs

ReplikationineinerunabhängigenKohorteausAachen

3SNPs(p≤0,05)

GenotypisierungmittelsTaqManundLogistischeRegressionsanalyse

rs3781117GAD2p=0,051

rs337623KLF3p=0,021

rs7953150PTPN11p=0,048

34

3.2 Studienpopulation

3.2.1 KlinischeCharakterisierungderSorben

DieVerteilungdergrundlegendenklinischenCharakteristikazwischenFall-undKontrollgruppe

sindinderTabelle2aufgeführt.

CharakteristikGallensteinträger

(n=189)

Kontrollen

(n=833)p-Wert

Geschlecht(w/m) 144/45 467/366 <0,0001

BMI(kg/m²) 29,95±0,40 26,21±0,15 0,0001

Alter(Jahre) 60,56±0,84 45,04±0,54 <0,0001

Tabelle2:klinischeCharakteristikaderSorben,inMittelwert±StandardfehlerdesMittelwertes(SD),sowie

Anzahl(n)angegeben;w:weiblich,m:männlich

Vondeninsgesamt1022sorbischenProbandenwurden189alsGallensteinträgeridentifiziert,

dieweiteren833SorbensindgallensteinfreieKontroll-Probanden,waseinerGesamtprävalenz

von 18,5% in der untersuchten Population entspricht. Bei Frauen konnte ein signifikant

erhöhtesAuftretenmiteinerGesamtprävalenzvon23,6%beobachtetwerden,imVergleichzu

11%beidenmännlichenProbanden(p<0,0001,OR(95%CI)=2,508(1,747–3,601)).

Ein signifikanter Unterschied zeigte sich ebenfalls bei der Häufigkeit des Vorkommens von

GallensteinleidenbeiadipösenProbanden.SowarbeidenGallensteinträgerneinmittlererBMI

von29,95kg/m²berechnetworden,imVergleichzudenKontrollprobandenmiteinemBMIvon

26,21kg/m²(p=0,0001).

DasAlterderStudienpopulationlagzwischen18und88JahrenmiteinemMittelwertvon47,9

Jahren. Die Analyse zeigt, dass eine Korrelation des Phänotypen zum ansteigendenAlter der

Probanden besteht und damit die Prävalenz des Gallensteinleidens zunimmt. Entsprechend

weisendieGallensteinträgermiteinemMittelwertvon60,6JahreneinhöheresAlteraufalsdie

Kontrollen. Probanden ohne Nachweis von Gallensteinen oder Cholezystektomie in der

Anamnesesindsignifikantjüngermit45Jahren(p<0,0001).VergleichtmandieAltersgruppen

der Gallensteinträger, ist ein Maximum in der Gruppe der 70 – 79- jährigen Probanden zu

verzeichnen(Abbildung5).

35

Abbildung5:Prävalenz(%)derCholelithiasisindenjeweiligenAltersgruppen;GS:Gallenstein

3.2.2 AnzahlderSchwangerschaften

Weiterhin konnte eine erhöhte Prävalenz in Zusammenhang mit der Anzahl der Schwanger-

schaften beobachtet werden, mit einem deutlichen Anstieg bei Multiparität im Vergleich zu

ProbandinnenmitkeinerodernureinerSchwangerschaft(Abbildung6).

Abbildung6:VergleichderPrävalenz(%)derGallensteinträgerinnenundgallensteinfreienKontrollenin

BezugaufdieAnzahlderSchwangerschaften

Zur weiteren Untersuchung der beobachteten Korrelation des Gallensteinleidens mit Multi-

parität wurde eine multivariable Analyse mittels logistischer Regression durchgeführt. Nach

Adjustierung,jeweilsaufdasAlterundBMIderProbandinnen,konntediesteigendeAnzahlder

0 4,512,8

23,1

38,5 43,637,5

100 9587,2

76,9

61,5 56,362,5

18-29Jh 30-39Jh 40-49Jh 50-59Jh 60-69Jh 70-79Jh 80Jh

Prävalenzin%

AlterinJahren

GS-Träger Kontrollen

4,8 6,923,6 29,3 33,7 33,3 33,3 28,6

40

95,2 93,176,4 70,7 66,3 66,7 66,7 71,4

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8+

Prävalenzin%

AnzahlderSchwangerschaften

Gallensteinträgerinnen

36

SchwangerschaftenalseigenständigerRisikofaktormiteinemSignifikanzniveauvonp=0,043

undp=0,001bestätigtwerden(Tabelle3).

Risikofaktor p-Wert OR(95%CI)

AnzahlderSchwangerschaftenadjustiertaufAlter p=0,043 1,171(1,005–1,365)

AnzahlderSchwangerschaftenadjustiertaufBMI p=0,001 1,235(1,096–1,392)

Tabelle3:KorrelationdesGallensteinleidens

3.3 KomparativeAnalyse

AlsBeispielfürdiekomparativeAnalysesindinderuntendargestelltenTabelle4alleSNPsder

genomweitenAssoziationsstudiedeshumanenChromosoms4mitdenjeweiligenkonkordanten

murinenLith-Regionenaufgeführt. Die Darstellung erfolgte für jedes humane Chromosom, so

dass die Genregionen der assoziierten SNPs mit den murinen Regionen gegenübergestellt

werdenkönnen(sieheTabelle7–28).

Human Murin

Chr.Position(Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-

Region

Lokalisation(Chr.,Peak,CIincM)

Lokalisation(Mb)

chr4:7666095 rs17368264 C/G SORCS2 Intron

Lith13

Gbvq1

Lith17

QTL

Chr5,30cM,95%CI10-45

Chr5,30cM,95%CI20-50cM



35.8-73.8M

chr4:14467439 rs1389999 A/G

chr4:17561306 rs6845078 C/T MLR1 Intron

chr4:38293153 rs922334 A/G FLJ13197 Intron

chr4:38311539 rs337628 A/T FLJ13197 Intron

chr4:38380129 rs17582575 A/C KLF3 Downstream

chr4:38400008 rs17616338 C/T

chr4:38474271 rs4624663 A/G TLR1 Downstream

chr4:40734492 rs7674811 A/C APBB2 Intron

chr4:58396887 rs13134527 A/G Lith13

QTL

Gbvq1

Lith17

Chr5,30cM,95%CI10-45




73.9-105.0M

chr4:61688491 rs1449622 A/G

chr4:85188128 rs17007921 A/G

chr4:88139044 rs4693155 C/G AFF1 Promoter

37

chr4:143042611 rs7677292 A/G QTL

Lith11



77.8-86.0M

chr4:169687887 rs4323069 C/T PALLD Intron

QTL Chr8,69cM,95%CI31-79cM 42.5-69.9M

chr4:169693682 rs10009813 C/G PALLD Intron



chr4:175707244 rs1365625 G/T

Tabelle4:HumanesChromosom4,DarstellungderkomparativenAnalysezwischendenSNPsausderGWAS

unddenmurinenLith-Regionen

3.4 Assoziationsanalyse

3.4.1 SelektionvonKandidatengenenundihrerTag-SNPszurReplikation

Die Selektion ausdenassoziiertenGenender genomweitenAssoziationsstudie ergab folgende

13 Kandidatengene: PDE4B, PCNXL2, NID1, KLF3, TLR1, PALLD, GAD2, TPCN2, PTPN11, IDH2,

CST8,IL4R,PDE8A.

Die Gene TLR1, IL4R und PDE8A wurden im Rahmen von anderen Studien des Universitäts-

klinikumsLeipzigweiteruntersuchtundsindnichtGegenstanddervorliegendenArbeit.

DieTabelle5zeigtdiezehnselektiertenKandidatengene,ihrejeweiligechromosomalePosition

unddie gewählten repräsentativenTag-SNPs (insgesamt22)durchdasProgrammHaploview,

dieimweiterenVerlaufgenotypisiertwurden.

Kandidatengen ChromosomalePosition(Chromosom,Mb) Tag-SNPszurGenotypisierung

CST8 chr20:23419766-23424655 rs3004100

IDH2 chr15:88428218-88446712 rs4553601

PTPN11 chr12:111319256-111410436 rs7953150,rs7976467

TPCN2 chr11:68572926-68614648 rs3168115

GAD2 chr10:26545242-26633497 rs3781117

KLF3 chr4:38488356-38525695 rs17582575,rs337623,rs17500878

NID1 chr1:232465182-232554522 rs3738533

38

PCNXL2 chr1:229426617-229738194 rs3820118,rs6676202,rs2477857,rs10910660

PDE4B chr1:65970877-66552282 rs11208794,rs12043568,rs507956

PALLD chr4:169792953-170220958 rs3109202,rs11726512,rs4323069,rs4144994,rs9993632

Tabelle5:AuflistungderrepräsentativenTag-SNPsderjeweiligenKandidatengene

3.4.2 LogistischeRegressionsanalyse

Nach der Genotypisierung der Tag-SNPs wurde eine logistische Regressionsanalyse

durchgeführt,wobeieinadditivesgenetischesModellbeiderAuswertunggenutztwurde.

Die folgendenDiagramme (Abbildung7) stellendie jeweiligeAnzahlderProbandenmit oder

ohneGallen-steineaufgeteiltinihrejeweiligenGenotypen,einschließlichderMinorallelfrequenz

(MAF),dementsprechendenp-Wert,OddsRatio,sowie95%-Konfidenzintervalldar.

45 40

94 86

43 54

020406080100

Gallensteine keineGallensteine

CST8 rs3004100(MAF48,34%) A/AG/AG/G

8 558 54

117 123

0

50

100

150


IDH2 rs4553601(MAF18,9%) G/GT/GT/T

p=0,234

OR(95%CI)=0.837(0,625-1,121)

p=0,363

OR(95%CI)=1,188(0,819-1,724)

39

8 1766 72

106 92

020406080100120


PTPN11 rs7953150(MAF26,04%) A/AG/AG/G

0 23 5

178 172

0

50

100

150

200


PTPN11 rs7976467 (MAF1,67%) C/CG/CG/G

25 1166

8390 85

020406080100


TPCN rs3168115 (MAF30,69%) T/TT/AA/A

2 343 24

136 152

0

50

100

150

200


GAD2 rs3781117(MAF10,69%) G/GA/GA/A

p=0,048

OR(95%CI)=0,713(0,509-0,998)

p=0,150

OR(95%CI)=0,413(0,124-1,375)

p=0,436

OR(95%CI)=1,132(0,828-1,549)

p=0,051

OR(95%CI)=1,616(0,999-2,616)

40

6 253 47

123 132

0

50

100

150


PDE4B rs11208794 (MAF15,98%) G/GA/GA/A

0 05 7

177 170

0

50

100

150

200


PDE4B rs12043568 (MAF1,67%) C/CT/CT/T

0 016 13

166 165

0

50

100

150

200


PDE4B rs507956 (MAF4,03%) A/AA/GG/G

7 562 60113 117

0

50

100

150


PCNXL rs3820118 (MAF20,05%) A/AA/GG/G

p=0,162

OR(95%CI)=1,337(0,890-2,007)

p=0,527

OR(95%CI)=0,686(0,214-2,203)

p=0,605

OR(95%CI)=1,224(0,570-2,625)

p=0,570OR(95%CI)=1,114(0,768-1,615)

41

2 034 33

146 147

0

50

100

150

200


PCNXL rs6676202 (MAF9,81%) G/GA/GA/A

49 5280 78

52 51

020406080100


PCNXL rs2477857 (MAF50,28%) T/TA/TA/A

10 1271 68

102 101

020406080100120


PCNXL rs10910660 (MAF25,14%) C/CT/CT/T

6 341 40

136 139

0

50

100

150


NID1 rs3738533 (MAF13,56%) C/CT/CT/T

p=0,556

OR(95%CI)=1,163(0,703-1,923)

p=0,779

OR(95%CI)=1,039(0,790-1,368)

p=0,863

OR(95%CI)=0,971(0,692-1,360)

p=0,479

OR(95%CI)=1,161(0,767-1,757)

42

10 751 61120 113

0

50

100

150


KLF3 rs17582575 (MAF20,17%) A/AC/AC/C

10 1545 62

126 103

0

50

100

150


KLF3 rs337623(MAF21,75%) A/AG/AG/G

21 17

71 7689 87

020406080100


KLF3 rs17500878(MAF30,89%) G/GA/GA/A

1 341 38

141 141

0

50

100

150


PALLD rs3109202(MAF11,92%) C/CT/CT/T

p=0,716

OR(95%CI)=0,936(0,655-1,337)

p=0,021

OR(95%CI)=0,669(0,476-0,941)

p=0,851

OR(95%CI)=1,030(0,756-1,403)

p=0,886

OR(95%CI)=0,967(0,614-1,524)

43

Abbildung7:ErgebnissederlogistischenRegressionsanalysedereinzelnenTag-SNPs

7 952 56

123 117

0

50

100

150


PALLD rs11726512(MAF19,23%) T/TC/TC/C

27 26

72 8683 68

020406080100


PALLD rs4323069(MAF36,46%) T/TC/TC/C

17 34

95 8070 67

020406080100


PALLD rs4144994 (MAF38,15%) G/GA/GA/A

11 22

85 7785 80

020406080100


PALLD rs9993632(MAF31,67%) G/GA/GA/A

p=0,462

OR(95%CI)=0,873(0,608-1,253)

p=0,313

OR(95%CI)=0,859(0,640-1,154)

p=0,128

OR(95%CI)=0,789(0,582-1,070)

p=0,213

OR(95%CI)=0,815(0,590-1,124)

44

Beidreider22untersuchtenTag-SNPs(rs3781117inGAD2,rs337623inKLF3undrs7953150

in PTPN11) konnte eine signifikante Assoziation im additiven Modell nachgewiesen werden,

wobeiderstärksteEffekt imSNPrs337623desGenesKLF3 (p-Wert0,021;OR0,669 [0,476–

0,941])beobachtetwurde.

3.5 Post-hocPower-Analyse

Die statistische Power einer Studie beschreibt die Wahrscheinlichkeit, dass ein durch eine

Genvariante ausgelöster Effekt durch die Studie erfasst wird, und sie hängt von mehreren

Parameternab(Bickeböller&Fischer,2007).

Die 22 Tag-SNPs wurden jeweils einzeln mittels der Software Quanto (Version 1.2.4) zur

Prüfung der Power untersucht. Hierbei wurde als Signifikanzniveau p = 0,05 festgelegt, ein

dichotomes Outcomemit dem Gallensteinleiden als Erkrankung im gematchten Fall-Kontroll-

Design gewählt unddieHypothese aufgestellt, dass der jeweils angegebene SNP imadditiven

VererbungsmodelldieErkrankungauslösenkann.DieProbandenzahlbetrug für jedenSNPca.

180jeFall-undKontrollgruppe.FürjedenSNPwurdediejeweiligeMinor-Allel-Frequenzinder

Tabellemitangegeben.

UnterAnnahmedesadditivenModells,miteinemSignifikanzniveauvonp=0,05,zeigtdieTabelle

6die statistische Power fürdie Detektiondes Risikos der Entwicklung von Gallensteinenmit

einerEffektgrößevon1,0bis2,0bei dengetestetenSNPs.Ausder farblichenMarkierungder

Tabellewirdersichtlich,dassabeinerMAFvonca.16%,OddsRatiosvon1,7miteinerPower

von >80% bei den SNPs identifiziert werden konnten, mit einer Ausnahme. SNPs mit einer

größerenMAFkonntenbereitsbeieinerEffektgrößevon1,6identifiziertwerden.

45

SNP,MAF Effektgröße(OddsRatio)

1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0rs120435681,67% 5 5 6 8 9 12 15 18 21 25 29

rs79764671,67% 5 5 6 8 10 12 15 18 21 25 29

rs5079564,03% 5 6 8 11 16 21 28 35 42 49 56

rs66762029,81% 5 7 12 20 30 41 53 64 74 82 88

rs378111710,69% 5 7 12 21 32 44 56 67 77 84 90

rs310920211,92% 5 7 13 22 34 48 60 72 81 87 92

rs373853313,56% 5 7 14 24 38 52 65 76 84 90 94

rs1120879415,98% 5 8 15 27 41 56 70 80 88 93 96

rs455360118,9% 5 8 17 30 46 62 75 85 91 95 98

rs1172651219,23% 5 8 17 30 46 62 75 85 92 96 98

rs382011820,05% 5 7 12 21 32 44 56 67 77 84 90

rs1758257520,17% 5 8 17 31 47 63 76 86 92 96 98

rs33762321,75% 5 8 18 32 49 65 78 87 93 97 98

rs1091066025,14% 5 9 19 35 53 69 82 90 95 98 99

rs795315026,04% 5 9 19 35 53 70 82 90 95 98 99

rs316811530,69% 5 9 21 38 56 73 85 92 96 98 99

rs1750087830,89% 5 9 21 38 57 73 85 92 96 98 99

rs999363231,67% 5 9 21 38 57 73 85 92 96 98 99

rs432306936,46% 5 9 22 40 59 75 87 93 97 99 99

rs414499438,15% 5 10 22 41 60 76 87 94 97 99 99

rs300410048,4% 5 10 23 42 61 77 87 94 97 99 99

rs247785749,72% 5 10 23 42 61 77 87 94 97 99 99

Tabelle6:Post-hocPowerkalkulationfürdieAachenerKohorte(n=368)mittelsQuantov1.2.4.Dargestelltist

die SNP-Annotation mit Minorallelfrequenz (MAF) und die Power (in %) des SNPs entsprechend der

Effektgröße

46

4 Diskussion

4.1 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden die Hintergründe des Gallensteinleidens mit speziellem

Fokus auf die genetische Prädisposition, die Rolle sogenannter LITH-Gene, untersucht. Zur

Identifizierung von genetischen Varianten, die eine Assoziation zur Cholelithiasis aufweisen,

wurdeeinekomparativeAnalysedurchgeführt.DasStudiendesignhattezumZiel,mithilfeder

bereitsvalidiertenmurinenLith-LociprädisponierendeGenvariantenineinerKohorteauseiner

sorbischenBevölkerungsgruppezuidentifizierenundineinerKontrollkohortezureplizieren.

Die zugrundeliegende Hypothese der vorliegenden Arbeit basiert auf der Annahme einer

KonkordanzmurinerGallenstein-LocimitbislangnichtidentifiziertenhumanenLITH-Regionen.

DurchdieakribischeKartierungderlithogenenLociaufdemmurinenGenom(„Gallensteinkarte

derMaus“)waresmöglich,eineSelektionvonkonkordantenhumanenRegionendurchzuführen,

die zudem eine Assoziation in unserer genomweiten Analyse aufwiesen. Dies führte zur

Bestimmung von potentiellen humanen Kandidatengenen, ein Ansatz, der bis dato für das

GallensteinleidenaufgenomweiterBasisnochnichtuntersuchtwurde.

ImerstenSchrittwurdenimRahmeneinergenomweitenAssoziationsstudiemitinsgesamt1022

Sorben390.619SNPsaufihreAssoziationmitCholelithiasisuntersucht.NachAdjustierungauf

Alter,GeschlechtundBMI ergabsich für417SNPs ein signifikanterUnterschied (p≤0.0001)

zwischen der Gallensteinträger- und der Kontrollgruppe. Nach komparativer Analyse der

bestätigtenmurinenLith-Locimit den signifikanten SNPs ausder genomweitenAssoziations-

studie wurde die Anzahl auf 282 SNPs reduziert, die sich in Regionen von 89 potentiellen

Kandidatengenen befinden. Zur weiteren Eingrenzung der zu untersuchenden Gene wurden

Kriterienaufgestellt(siehe2.4SelektionundReplikationderKandidatengene inderAachener

Kohorte),nachdenen10Top-Kandidatengene fürdieReplikationselektiertwurden.Fürdiese

Kandidatengene wurden insgesamt 22 repräsentative Tag-SNPs in der Kontrollkohorte, den

Aachenern,untersucht.EskonntendabeidreiSNPsindreiunterschiedlichenGenen(GAD2,KLF3

undPTPN11)repliziertwerden.

47

4.2 MultifaktorielleGenesederCholelithiasis

4.2.1 GeschlechtundSchwangerschaft

Bei einer Gesamtprävalenz der Cholelithiasis von ca. 18% konnte ein deutlich gehäuftes

Auftreten von Gallensteinen bei Frauen (ca. 24%) im Vergleich zu Männern (ca. 11%)

beobachtet werden. Dasweibliche Geschlecht als prädisponierende Variable zur Entwicklung

vonGallensteinenwurdebereits inmehrerenStudienbestätigt (Nakeeb,etal.,2002)(Ansari-

Moghaddam, Khorram, Miri-Bonjar, Mohammadi, & Ansari, 2016) und wird u.a. auf einen

Östrogen-bedingtenEinfluss(Scragg,McMichael,&Seamark,1984)unddasgesteigerteRisiko

durchSchwangerschaften(Attili,DeSantis,Capri,Repice,&Maselli,1995)zurückgeführt.Diese

Korrelation wurde bereits 1979 in der Arbeit von Bennion et al. in einer Studie mit Pima-

Indianern beschrieben. Des Weiteren wurden in einer Studie von Uhler et al. die Östrogen-

ErsatztherapiebeipostmenopausalenFrauensowieihreAuswirkungaufbiliäreErkrankungen

untersucht und ein erhöhtes Auftreten von Gallensteinen bei weiblichen Probanden in den

Gruppen mit transdermaler und oraler Östrogensubstitution beobachtet. Pathophysiologisch

wurde dies durch eine signifikant erhöhte Cholesterinsättigung der Galle sowie reduzierter

NukleationszeitzuCholesterinkristallendurchdieHormontherapieerklärt(Uhler,Marks,Voigt,

& Judd, 1998). Auch im Mausmodell der Cholelithiasis wurde der Effekt beschrieben.

UntersuchungenvondeBarietal. zuexogenerÖstrogenzufuhr imSinneeinerHormonersatz-

therapie bestätigten, dass das Gallensteinrisiko bei ovarektomierten Mäusen durch den

lithogenen Effekt von 17β-Estradiol durch Aktivierung des ERα-Rezeptors in der Gallenblase

induziert wird. Durch eine Erhöhung der hepatischen Synthese und biliären Sekretion von

Cholesterin sowie Störung der Gallenblasenentleerung mit resultierender Stase wird die

AuskristallisierungvonCholesterinmonohydratkristallenundihreNukleationzurGallensteinen

gefördert (de Bari, Wang, Portincasa, Liu, & Wang, 2015). Jedoch ist bei diesem Thema die

Studienlagekontrovers.

In diesem Zusammenhang erwähnenswert ist, dass ein signifikanter Anstieg der Gesamt-

prävalenzanCholelithiasisinunsererweiblichenStudienpopulationkorrelierendmitsteigender

AnzahlanSchwangerschaftenbeobachtetwurde.EineähnlicheBeobachtungwurdeauchinder

1988 publizierten GREPCO-Studie beschrieben (GREPCO - The RomeGroup for Epidemiology

and Prevention of Cholelithiasis, 1988). Studienteilnehmerinnen mit keiner oder nur einer

SchwangerschaftwarenimVergleichsignifikantwenigerhäufigvonderCholelithiasisbetroffen.

Nebendem o.g. pathophysiologischenAspektwirddesWeiteren einhormonalerEffektdurch

Progesteron vermutet, welches als Relaxans für glatte Muskelzellen fungiert und zu einer

verzögertenGallenblasenentleerungführt(Kern,etal.,1981).IneinerStudieüberPatientinnen

mitsubkutanerLangzeit-ProgesterontherapiewurdeimRahmenderHormongabeeineerhöhte

48

biliäreStaseaufgrundeinerbeeinträchtigtenEntleerungderGallenblase,einerseitsdurcheine

Reduktion der Motilität des Sphinkter Oddi, andererseits durch eine Beeinflussung der

Cholezystokinin-induzierten Gallenblasenkontraktilität (Tierney, et al., 1999) beobachtet. Die

Beobachtung,dassca.1/3derwährendderSchwangerschaftdiagnostiziertenGallensteinenoch

vor der Geburt spontan dissolvieren, lässt vermuten, dass die Gallenblase sich von der

ProgesteronwirkungnachpostpartalemAbsinkendesSerumspiegelserholenkann(Valdivieso,

Covarrubias,Siegel,&Cruz,1993).BeiProgesteronimplantatenwirddielithogeneWirkungtrotz

niedrigerer Serumspiegel auf eine kontinuierliche und länger andauernde Exposition zurück-

geführt(Tierney,etal.,1999).EinegeänderteGallensäuren-Zusammensetzungsollebenfallsim

RahmenderSchwangerschaftdieLithogenitätderGalleerhöhen(Kern,etal.,1981).

Bei genauerer Betrachtung der Probandinnen unserer Studie konnte jedoch auch eine

Korrelation zum Alter der Gallensteinträgerinnen nachgewiesen werden. So waren die

erkranktenStudienteilnehmerinneninjederGruppeälteralsdiegesundenTeilnehmerinnenmit

dergleichenAnzahlanSchwangerschaften.ZurweiterführendenUntersuchungderKorrelation

wurdeentsprechendeinemultivariableAnalysedurchgeführt.NachAdjustierungaufdasAlter

und BMI der Probandinnen konnte die Anzahl der Schwangerschaften als eigenständiger

RisikofaktormitsignifikanterAssoziationzurCholelithiasisbestätigtwerden.

4.2.2 Alter

InBezugaufdasAlterwurdeeinAnstiegderGesamtprävalenzindenjeweiligenAltersgruppen

verzeichnet,mit einemMaximum inder Altersgruppe der70- bis79-jährigen Studienteilneh-

mern.AuchdasAlterwurdebereitsalsprädisponierendeVariablefürGallensteineinmehreren

Studien diskutiert und bestätigt (Nakeeb, et al., 2002). Eine steigende Prävalenz in beiden

GeschlechterninKorrelationzumsteigendenAlterwurdemehrfachbeobachtet.DieserEffektist

unabhängig vom ethnischen Hintergrund (Shaffer E. , 2006) (Barbara, et al., 1987). In einer

kürzlich veröffentlichten Studie wurde die Konzentration an Gallensäuren im Körper in

AbhängigkeitverschiedenerFaktorenu.a.vonGeschlechtundAlteruntersucht(Frommherz,et

al.,2016).Dabeiwurdefestgestellt,dassbeijungenMännern(20–35Jahre)diePlasmakonzent-

rationvoneinigenGallensäurenamhöchsten ist undmit steigendemAlterdieKonzentration

erneut abfällt (Frommherz, et al., 2016). Dies basiert auf einem alternativen Weg zum

klassischenSynthesemechanismusvonGallensäurenundentsprechendhöherenSerumkonzent-

rationen bei jungen Männern (Frommherz, et al., 2016) und könnte u.a. Einfluss auf die

Diskrepanz zwischen der beobachteten Prävalenz von Gallensteinen bei jungen Frauen und

Männernsein,welcheimsteigendenAlterabnimmt(Everhart,Khare,Hill,&Maurer,1999).Eine

weitere Erklärungder erhöhten Gallensteinprävalenzmit steigendem Lebensalter ist, dass es

sich bei der Cholelithiasis um einen kumulativen Phänotyp handelt und sich entsprechend

49

gebildete Gallensteine nicht wieder auflösen, abgesehen von Sondersituationen wie der

Schwangerschaft.

Zusammenfassend kann das erhöhte Gallensteinrisiko im Alter auf eine erhöhte hepatische

Cholesterinsekretion in Zusammenhang mit einer erniedrigten Gallensäureproduktion

(Einarsson,Nilsell,Leijd,&Angelin,1985)(Bertolotti,etal.,2007),einereduzierteGallenblasen-

kontraktilität sowie die Tatsache, dass es sich um einen kumulativen Phänotypen handelt,

zurückgeführt werden. Eine Assoziation des Alters zum Gallensteinleiden wurde in der

vorliegendenStudiemiteinemSignifikanzniveauvonp<0,0001bestätigt.

4.2.3 Adipositas

Als weiterer Risikofaktor für die Entstehung von Gallensteinen konnte im Rahmen der

vorliegenden Studie ein erhöhter BMI bestätigt werden. Mit einem mittleren BMI von 29,95

kg/m²warderBMIbeiGallensteinträgernsignifikanthöheralsbeidenKontrollprobandenmit

einem BMI von 26,21 kg/m² (p = 0,0001). Ein erhöhter BMI wurde bereits mehrfach als

unabhängiger Risikofaktor beschrieben (Völzke, et al., 2005) und eine lineare Assoziation

zwischenBMIunddemAuftretenvonGallensteinennachgewiesen(Stampfer,Maclure,Colditz,

Manson,&Willett,1992).

Untersuchungen zufolgewird vermutet, dass eine erhöhte Aktivität derHMG-Co-A-Reduktase

(Novacek, 2006) und entsprechend erhöhte Cholesterinsekretion bei stark übergewichtigen

Menschenvorliegt (Shaffer&Small,1977).EineÜbersättigungderGallemitCholesterin führt

nicht nur zu einer Auskristallisierung von Cholesterinmonohydratkristallen sondern auch zu

einerBeeinträchtigungderGallenblasenmotilitätundsomitprolongierterStasederlithogenen

Galle(Portincasa,DiCiaula,&vanBerge-Henegouwen,2004).

Der BMI berücksichtigt jedoch nichtdie Fettverteilung imKörper, sonderngibt lediglich eine

Information über das Gewicht im Verhältnis zur Körpergröße an. Der Hüftumfang oder die

„Waist-to-Hip-Ratio“ ermöglicht einen genaueren Anhalt auf die Fettverteilung. Aufgrund des

bekannten Risikofaktors Adipositas wurden bereits weiterführende Untersuchungen zur

Assoziation der körperlichen Fettdistribution und dem Auftreten von biliären Symptomen

durchgeführtundeinerhöhtesRisikofürdieabdominelleFettverteilungbeiMännern,gemessen

durch Hüftumfang und Hüft-Taillen-Index, nachgewiesen (Tsai, Leitzmann, Willett, &

Giovannucci,2004). IneinerStudievonZhangetal.2014, inwelcherMRT-morphologischdas

intraabdominelle (sog. viszerale) Fett quantifiziert wurde, konnte eine Korrelation zu einem

erhöhtenRisiko fürdieEntwicklungvonCholesteringallensteinenbestätigtwerden(Zhang, et

al.,2014).EntsprechendwirdvorallemdieintraabdominelleFettdistributionalsprädispositio-

neller Faktor angesehen. Dies sollte in zukünftigen Studiendesigns berücksichtigt werden,

sodassvorzugsweisederHüftumfangundHüft-Taillen-IndexanstattdesBMIalsAnhaltfürdas

50

Ausmaß der Adipositas herangezogenwerden, auch wenn dabei nicht zwischen subkutanem

undintraabdominellemFettdifferenziertwird.

4.3 Kandidatengene

Der kombinierte Ansatz einer humanen GWAS zur Detektion von LITH-Genen mit einer

komparativen Analyse aller detektierten murinen Lith-Loci führte in dieser Arbeit zur

Identifizierung von 22 repräsentativen SNPs in zehn Genen. Drei dieser Polymorphismen

(rs3781117inGAD2,rs7953150inPTPN11undrs337623inKLF3)wurdenerfolgreichineiner

unabhängigenKohorteausAachenrepliziert.

4.3.1 GAD2(Glutamat-Decarboxylase)

DasGenGAD2 istaufdemChromosom10p11-p12 lokalisiert undkodiertdie65-kDa-Isoform

der Glutamat-Decarboxylase (GAD65), welche die Formation von Gamma-Amino-Buttersäure

(GABA) aus L-Glutamat durch Decarboxylierung katalysiert (Boutin, et al., 2003).GAD2 wird

überwiegendinHirngewebe(insbesondereimHypothalamus)undindenß-ZellenimPankreas

exprimiert (Esclapez, Tillakaratne, Tobin, & Houser, 1993) (Okada, Taniguchi, & Schimada,

1976).

DiverseStudienhabeneinepotentielleAssoziationzwischenEinzelnukleotidpolymorphismenin

derGAD2-GenregionundAdipositassowiederInsulinsekretiondiskutiert(Boutin,etal.,2003)

(Shi Y. , et al., 2000) (Li, et al., 2015). Ein bedeutender SNP ist die -234A>G Variante

(rs2236418),alsFolgeeinerInduktionderGAD2-Promoter-AktivitätumdenFaktor6durchden

Risiko-SNP kommt es zu einer vermehrten synaptosomalen GABA-Ausschüttung in der

Hypothalamus-Region, was durch eine resultierende erhöhte Nahrungsaufnahme zu

Fettleibigkeit führenkann (Boutin, et al., 2003).Die Studie vonPrakash et al. beschreibt eine

deutliche Korrelation zwischen dem Risiko-SNP und krankhafter Adipositas in der nord-

indischenBevölkerung(Prakash,Mittal,Awasthi,&Srivastava,2016).

Im menschlichen Gewebe wird Glutamatdecarboxylase GAD65 als einzige Isoform in den

insulinproduzierendenBeta-ZellenderLangerhans-InselndesPankreasexprimiert(Petersen,et

al., 1993) (Kim, et al., 1993). Entsprechend der aktuellen Studienlage wird eine Glukose-

induzierte Sekretion desNeurotransmitters vermutet (Braun, et al., 2004),mit nachfolgender

AktivierungderGABAa-RezeptorenderpankreatischenAlpha-Zellenunddarausresultierender

Glukagon-Sekretion (Wendt, et al., 2004), wobei der genaue Vorgang auf molekularer Ebene

sowiederdefinitiveEinflussvonGABAaufdenInsulin-Glukose-Haushaltbislangunklarbleiben.

51

4.3.2 KLF-3(Krüppel-like-factor-3)

Die Krüppel-like-Faktoren sind eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die verschiedene

biologische Prozesse wie Proliferation, Differenzierung, Entwicklung und Apoptose durch

Bindung an CACCC-Elemente oder GC-reiche DNA-Regionen mittels ihrer drei hoch-

konservierten C²H²-Zinkfinger regulieren (Pearson, Fleetwood, Eaton, Crossley, & Bao, 2008).

Dieses DNA-Bindungsmotiv befindet sich am Carboxylende und wird mittels der „Krüppel-

Links“,kurzeAminosäurensequenzenzwischendenFingern,miteinanderverbunden(Pearson,

Fleetwood,Eaton,Crossley,&Bao,2008)(Dang,Pevsner,&Yang,2000).

Außer der zwei charakteristischen Eigenschaften am Carboxylendedes Proteins variierendie

Mitglieder der KLF-Familie in der restlichen Gensequenz, wodurch sie unterschiedliche

biologischeFunktionenausübenkönnen(Pearson,Fleetwood,Eaton,Crossley,&Bao,2008).Der

NamederTranskriptionsfaktorenwirdvoneinerHomologiederDNA-Bindungsregionzudem

Protein„Krüppel“imGenomderDrosophilamelanogasterabgeleitet(Feinberg,Lin,Fisch,&Jain,

2004).HomozygoteEmbryoswiesendeformiertethorakaleundanterioreabdominaleSegmente

aufmit letalen Folgen aufgrundder Deformitäten (Feinberg, Lin, Fisch, & Jain, 2004) (Preiss,

Rosenberg,Kienlin,Seifert,&Jäckle,1985).

WeitereFunktionenscheinenEinflussaufdenFettstoffwechselzuhaben.IndenStoffwechselun-

tersuchungen von KLF3-knock-out-Mäusen, welche sich durch einen schlanken Phänotyp

auszeichneten,wurdeeineveränderteAdipogenesebeobachtet(Bell-Anderson,etal.,2013).In

weiterenUntersuchungenkonntediesaufeinegeringereMengeanweißemFettgewebemitin

Anzahl und Größe verminderten Fettzellen in denMäusen zurückgeführtwerden (Sue, et al.,

2008).DerTranskriptionsfaktorKLF3wurdealseinRegulatordesGenesFam132aidentifiziert,

welches für den Insulin-Sensitizer-Faktor „Adipolin“ kodiert (Bell-Anderson, et al., 2013). In

Studienwurdebeobachtet,dassdieFam132a-GenexpressioninMäusenmitdemGenotypKLF-/-

signifikant gesteigert ist, v.a. inHerz-, Lungen-, Darm-, Knochenmark- undMilzgewebe (Bell-

Anderson,etal.,2013)(Funnell,etal.,2012).EntsprechendweisenMäusemitMangelanKLF3

einen signifikant erhöhten Plasmalevel anAdipolin auf, unabhängig vonder Ernährung (Bell-

Anderson, et al., 2013), und zeichnen sich durch einen schlanken Habitus aus. Zudem ist

AdipolinalsAdipokininderLage,Glukose-toleranzundInsulinsensitivitätzuverbessern(Wei,

etal.,2012).

4.3.3 PTPN11(Protein-tyrosinephosphatase,non-receptor-type11)

Das Gen PTPN11 kodiert das Enzym “rezeptorfreie Protein-Tyrosin-Phosphatase (Shp2)”,

welches jeweils amN-undamC-Terminus eine Src-Homologie-2-Domänebesitzt (Neel,Gu,&

Pao,2003).DesWeiterenenthältdiePhosphataseeinekatalytischeDomane,einprolinreiches

DNA-BindungsmotivsowieamCarboxyl-EndezweiTyrosin-Phosphorylierungsstellen(Neel,Gu,

52

&Pao,2003).DieTyrosinphosphataseübernimmtwichtigeFunktioneninderSignaltransdukti-

on u.a. von Wachstumsfaktoren, Hormonen und Zytokinen, mit resultierendem Einfluss auf

Wachstum, Differenzierung, Migration und Apoptose der Zelle sowie dem Informationsaus-

tauschzwischendenZellen(Feng,1999).

Das autosomal dominant vererbte Noonan-Syndrom wird durch eine Missense-Mutation in

PTPN11 verursacht die zu einer Destabilisierung der katalytisch inaktiven Konformation und

entsprechendzueinerexzessivenAktivierungderFunktionsfähigkeitvonShp2führt(Tartaglia,

et al., 2001). EineAssoziation zwischender Keimbahnmutation undder Entwicklungsstörung

wird in ca. 50% der Fälle beschrieben (Tartaglia, et al., 2001), für das seltenere Leopard-

Syndrom(Noonan-Syndromwithmultiplelentigines)sogarinca.90%derPatienten(Keren,et

al.,2004).CharakteristischfürdasNoonan-Syndromsindu.a.einetypischefazialeDysmorphie,

Herzfehler, hämatologische Erkrankungen und skeletale Malformationen (Tartaglia & Gelb,

2005).VerschiedeneStudienidentifizierenShp2alsSubstratvonPTPN11alsProto-Onkogenim

Rahmenvon somatischenMutationenmit resultierendenhämatoonkologischenErkrankungen

(Tartaglia,etal.,2003)(Loh,etal.,2004)(Chan,Kalaitzidis,&Neel,2008).

DesWeiterenwirdShp2imzentralenNervensystemmiteinerRegulationderNahrungsaufnah-

me,gestörtenEnergiebilanzunddemMetabolismusinZusammenhanggebracht,entsprechend

wurde bei Mäusen mit einer Neuronen-spezifischen Deletion des Proteins eine erhöhte

KalorienaufnahmemitFettleibigkeitundresultierendemDiabetesbeobachtet(Krajewska,etal.,

2008). Als pathophysiologisch ursächlich wird vermutet, dass durch den reduzierten Shp2-

Proteinspiegel in homozygotenMäusen der hypothalamische Leptin-Signalweg alteriertwird,

was in erhöhten Leptin-Spiegeln sowie Resistenzen resultiert (Zhang, Chapeau, Hagihara, &

Feng,2004)(Feng,2006).

IneinerStudievon Jamshidietal.2007mit2771weiblichenZwillingenwirdeineAssoziation

vonTag-SNPs inPTPN11,dieeinenEinflussaufdieShp2-Aktivitäthaben,miterhöhtenApoB-

Serumspiegelnbeschrieben (Jamshidi, et al., 2007).Bereits in vorhergehendenStudienwurde

eine insulininduzierte Beeinflussungdes ApoB-Lipoprotein-Metabolismus über zwei bekannte

Signalwege diskutiert (Sparks & Sparks, 1990) (Sparks, Phung, Bolognino, & Sparks, 1996).

Durch eine gesteigerte Phosphorylierung von IRS-1, scheint Shp2 beide Signalwege zu

beeinflussen und damit eine Überexprimierung indirekt zu erhöhten ApoB-Serumspiegeln zu

führen(Ugi,Maegawa,Kashiwagi,Adachi,Olefsky,&Kikkawa,1996)(Noguchi,Matozaki,Horita,

Fujioka,&Kasuga,1994)(Jamshidi,etal.,2007).

In der Pathogenese von krankhaftem Übergewicht und Diabetes spielen die Insulin- und

LipoproteinhaushaltewichtigeRollen.DieseErkrankungenwiederumstellenRisikofaktorenfür

dieEntstehungvonGallensteinendar.MutationeninPTPN11mitresultierenderBeeinflussung

derAktivitätderTyrosinphosphatasebirgt lautdeno.g.StudieneinPotentialzurEntwicklung

derErkrankungen.

53

4.4 FunktionelleKonsequenzenderSNPs

Ein Großteil der genetischen Varianten, welche mit komplexen und häufig vorkommenden

Erkrankungenassoziiertsind,befindensichinnicht-codierendenGenregionen(Zerbino,Wilder,

Johnson,Juettemann,&Flicek,2015)(Hindorff,etal.,2009).DiverseepigenetischeMarkerdes

GenomsundihreregulatorischenElementenehmenjedochEinflussaufdieGenexpressionund

können durch Einzelnuklidpolymorphismen, die sich in den Regionen befinden, in ihrer

Funktion alteriertwerden. Beispielsweisewurden im genfreien Chromosomenabschnitt 8q24

funktionelle Varianten mit bestätigten Assoziationen zu u.a. Prostata-, Mamma- und

kolorektalenKarzinomendurchEinflussderPolymorphismenaufdassogenannteMYC-Onkogen

nachgewiesen (Amundadottir, et al., 2006) (Tomlinson, et al., 2007) (Ghoussaini, et al., 2008)

(Wasserman,Aneas,&Nobrega,2010)(Ward&Kellis,2012).

ZurPrüfungeinereventuellen funktionellenKonsequenzderEinzelnuklidpolymorphismenauf

dieEntstehungvonGallensteinenwurdeeinein-silico-Analysedurchgeführt.

4.4.1 rs3781117

DasGenGAD2wurdebereitsmitdenprädisponierendenRisikofaktorenAdipositasundDiabetes

in mehreren Studien in Zusammenhang gebracht. Für den SNP rs3781117 wurde in der

vorliegenden Studie ein erhöhtes Risiko für das Gallensteinleiden beobachtet. Die erkrankten

Probanden tragen gehäuft das Risiko-Allel G als heterozygoter oder homozygoter Träger. Ein

FehlendesAllelsscheintvorderErkrankungzuschützen.

InderDatenbankRegulomeDBVersion1.1.weistderSNPrs3781117einenrelevantenScorevon

2bauf.EineBeeinflussungderregulatorischenElementeindiesemBereichdurchdieVariante

wird als wahrscheinlich eingestuft. Die Hypothese der Datenbank stützt sich auf die

ZusammenfassungverschiedenerFaktoren,diefüreineeingegebeneGen-Lokalisationvorliegen.

Diesbezüglichangegebensind:einTranskriptionsfaktorbindetindiesemAbschnittandieDNA,

eswurde ein Sequenzmotivnachgewiesen (ob alsBindungsstelle aufderDNA selbst oder als

Bestandteil eines Transkriptionsfaktors wurde nicht spezifiziert), und es besteht eine

sogenannte Hypersensitivität für das Enzym Desoxyribonuclease I (Boyle, et al., 2012). Im

ZelltypSH-SY5Y(Neuroblastom-Zell-Linie) istderSNPrs3781117 inderDNA-Bindungsregion

des Transkriptionsfaktors GATA3 (GATA binding protein 3) lokalisiert (Boyle, et al., 2012).

Studien zufolge ist GATA3 in der Suppression der Adipozytendifferenzierung involviert, u.a.

durcheineHemmungdesEnzymsPPARy(Tong,Dalgin,Xu,Ting,Leiden,&Hotamisligil,2000)

(Tong,Tsai,&Hotamisligil,2003).

Weitere Informationen wurden aus der Datenbank Haploreg gewonnen, in welcher die

gewebespezifischen Histonmodifikationen sowie funktionelle Chromatin-Zustände aufgelistet

wurden.DerSNPbefindetsichineinerkonserviertenGenregionunddiechromosomalePosition

54

überlapptmit Histon-Markern, die auf eine Chromatinzugänglichkeit u.a. imHirngewebe und

pankreatischen Inselzellen hinweisen. Der stärkste Nachweis von Enhancer- sowie bivalente

Promotor-Aktivitätwurde jedoch in entodermalen Zellkulturen gefunden. Aus demEntoderm

bildet sich u.a. das Epithelium von Pankreasgewebe. Durch die Lokalisation des SNPs indem

DNA-AbschnittwerdenlautderDatenbank17verschiedeneregulatorischeMotivebeeinflusst,

u.a.vondiversenTranskriptionsfaktorendiemittelsHomöoboxenandieDNAbinden(Ward&

Kellis, 2012). Zusammenfassend wird in diesem Genabschnitt eine erhöhte Aktivität von

regulatorischen Elementen sowie Chromatin-Zugänglichkeit festgestellt; eine explizite

Konsequenzkannhierausnichtgezogenwerden.

Die zuGAD2 konkordantemurineLith-Region beinhaltet lediglich einenQTL, über den keine

weiteren Informationenvorliegen.AuchdieUntersuchungdesSNPsanhanddesVariantEffect

PredictorssowiedieAnalysederLD-SNPsergabkeineKonsequenz.

Insgesamt ergab die in-silico Untersuchung des SNPs ein möglicherweise relevantes

regulatorisches Potential. In weiteren Studien sollten eine Assoziation zum Diabetes und zur

AdipozytendifferenzierungalsGrundlageeinerpathophysiologischenFunktionvonrs3781117,

diezueinemgesteigertenRisikoeinerCholelithiasisführt,untersuchtwerden.

4.4.2 rs337623

Der identifizierte SNP rs337623 im Gen KLF3 weißt in der vorliegenden Studie einen

protektiven Effekt für das Gallensteinleidenauf. ImRahmen der Untersuchungenwurden bei

hetero- und homozygoten Trägern desMinor-Allels A signifikantweniger häufig Gallensteine

beobachtetalsbeihomozygotenTrägerndesWildtyps(G/G).

Obwohl es keine Hinweise auf eine relevante funktionelle Konsequenz in der Datenbank

RegulomeDB oderVariant Effect Predictor gab,wird der SNP in der DatenbankHaploRegmit

einer aktiven DNA-Region in Zusammenhang gebracht. Der detaillierten Darstellung der

Aktivitätszustände des Chromatins in den entsprechenden Gewebegruppen ist zu entnehmen,

dassderchromosomaleAbschnittinvielenGewebenu.a.Fett-,Muskel-undHirngewebesowie

pankreatischenInselzellenfürregulatorischeElementezugänglichistundalsEnhancer-Region

fungiert. Zellspezifisch konnte eine sehr hohe Aktivität u.a. in Hirn-, Darmmukosa- und

FettzellenverzeichnetwerdenmitHinweisaufeinetranskriptionellaktiveRegion.

EswirdaußerdemeineBeeinflussungdesDNA-BindungsmotivsdesTranskriptionsfaktorsNkx3

angegeben. Das Synonym „NK3 homeobox 1“ verweist auf die Homöodomäne als DNA-

BindungsmotivdesTranskriptionsfaktors.Nkx3-1kannalsRepressorfungierenundspielteine

Rolle in der regulären Prostata-Entwicklung, eineMutation istmit einem Fortschreiten eines

bestehendenProstatakarzinomsassoziiert(Zhang,etal.,2010).BislangwurdekeineAssoziation

desTranskriptionsfaktorszuGallensteinenbeschrieben.

55

Die Datenbank HaploReg listet bei Anfrage zur Untersuchung eines SNPs ebenfalls die

gekoppeltenSNPsmitr2>0,8auf.AlleSNPswurdenzunächstinderDatenbankRegulomeDbauf

ihreWahrscheinlichkeitfürfunktionelleKonsequenzenhinuntersucht.IndemLD-Blockwiesen

lediglichrs139880082(Score2b)undrs337620(Score3b)eineerwähnenswerteRelevanzauf.

ImRahmenderweiterführendenUntersuchungkonnte fürdenSNP rs139880082 lediglich in

Darmmukosazellen schwache Enhancer-Aktivitäten sowie die Bindung von mehreren

TranskriptionsfaktorenindemDNA-Abschnittnachgewiesenwerden.DerSNPrs337620weist

u.a.inDarmmukosa-,Fett-undPankreaszellenaktiveEnhancer-Nachweiseauf,miteineraktiven

„Transcription-Start-Site“ (TSS) in glatten Muskelzellen des Duodenums sowie Aktivität

flankierend zu TSS in Darmmukosazellen. Auch in dieser chromosomalen Region wird die

BindungvonTranskriptionsfaktorenbeeinflusst, u.a. vonGATA2,welcherwieGATA3Einfluss

aufdieAdipozytendifferenzierungnimmt(Tong,Dalgin,Xu,Ting,Leiden,&Hotamisligil,2000)

(Tong, Tsai, & Hotamisligil, 2003). Eine nachgewiesene aktive Enhancer-Aktivität in

Fettzellkernen in Zusammenhangmit der Beeinflussungder GATA2-Bindung könntemit dem

Hintergrund des protektiven Effektes des SNPs Hinweise über einen bislang unbekannten

pathophysiologischenMechanismusgeben.

KLF3 liegt in einer chromosomalen Regiondie laut der komparativen Analyse konkordant zu

den murinen Lith-Regionen Lith13, Lith17 und Gbvq1 ist. Im Rahmen der murinen Analysen

wurden als potentielle Kandidatengene für dieseLith-Loci u.a. Cckar (Gen kodierend für den

Cholezystokinin A-Rezeptor) und Ppargc1a (Peroxisom proliferator-aktivierter Rezeptor

Coaktivator1a)identifiziert.IneinerStudievonBertolottietal.wurdeeineprotektiveRolledes

Coaktivators basierend auf einer Interaktion mit dem Gallensäurenrezeptor FXR, vermutet

(Bertolotti, et al., 2006). GATA2 und GATA3 üben ihren suppressiven Effekt auf die

Adipozytendifferenzierung u.a. durch Hemmung von PPARg aus (Tong, Tsai, & Hotamisligil,

2003).CCKARwurdeebenfallsbereitsinhumanenStudienmitderPathogenesedesCholesterin-

Gallensteinleidens in Verbindung gebracht (Schneider, Sänger, & Hanisch, 1997) (Srivastava,

Pandey, Dixit, Choudhuri, & Mittal, 2008). Gbvq1 ist ein murines QTL welches mit einem

erhöhtenGallenblasenvolumenassoziiertist(LyonsM.,etal.,2003).Diein-silico-Analyseergab

jedochinBezugaufdieo.g.murinenLocikeineeindeutigenhumanenKorrelationen.

WievorbeschriebenreguliertKLF3dieKodierungvonAdipolinundkannentsprechendzueiner

verbesserten Glukosetoleranz und Insulinsensitivität führen, resultierend zu einem

verminderten Risiko für Diabetes. In diesem pathophysiologischen Zusammenhang sowie in

Bezug auf die Adipozytendifferenzierung durch GATA2 sollten weitere Untersuchungen zur

potentiellenAssoziationvonKLF3unddemGallensteinleidendurchgeführtwerden.

56

4.4.3 rs7953150

IndervorliegendenStudiewurdefürdenSNPrs7953150imGenPTPN11einprotektiverEffekt

für das Gallensteinleiden nachgewiesen. Probanden mit einem hetero- und homozygoten

GenotypdesMinor-AllelsAweiseneinesignifikantgeringereHäufigkeitfürdasAuftreteneiner

CholelithiasisaufalsProbandenmitHomozygotiefürdenWildtyp.

DerVariantEffectPredictorweistaufeinepotentielleregulatorischeFunktiondesSNPshin,da

erineinerzugänglichenChromatin-Regionlokalisiertist.

Durch eine detaillierte Darstellung inder DatenbankHaploReg wird ersichtlich, dass sich der

Abschnitt des Chromatins v.a. in Fett-, Muskel- und Hirnzellen in einem aktiven Zustandmit

HinweisaufEnhancer-Aktivitätenbefindet.DienachgewieseneMotiv-Beeinflussungbetrifftdie

Histon-Lysin-N-Methyltransferase Setdb1 (SET domain bifurcated 1), welche durch die

Enzymaktivität resultierenden Histonmodifikationen Einfluss auf die Chromatinstruktur

nehmenkann.DasEnzymwirdu.a.durchPPARg(Peroxisom-Proliferator-aktivierterRezeptorg)

reguliert und agiert in der Differenzierung von Adipozyten durch Chromatinmodifizierung

(Wakabayashi,etal.,2009).EskonnteeineDownregulierungvonSetdb1inadipösenMäusenim

Vergleich zu Kontrollen nachgewiesen werden, mit dem Enzym als entsprechenden Anti-

adipogenenFaktor(Wakabayashi,etal.,2009)(Okamura,Inagaki,Tanaka,&Sakai,2010).

Weitere Informationen von HaploReg zu dem SNP weisen auf sogenannte eQTLs u.a. im

viszeralen und subkutanen Fettgewebe hin. Wird eine Assoziation von SNPs mit mRNA-

ExpressiondesentsprechendenGensnachgewiesen,bestehtdieMöglichkeit,dassderSNPeinen

regulatorischen Einfluss auf die Transkriptionsaktivität des Genes nimmt (Cookson, Liang,

Abecasis, Moffatt, & Lathrop, 2009). Die Regulation der Expression könnte im viszeralen

Fettgewebe TMEM116 (Transmembran-Protein 116) auf Chromosom 12 in der Nähe zum

untersuchtenSNP(Aken,etal.,2016)betreffenundweisteinencis-EffektmiteinerEffektgröße

von0,32beieinemp-Wertvon0.000018auf(TheGTExConsortium,2013).DerTranskriptions-

faktorGATA-3bindetinderPromotorregiondesGenes(Qiagen,sabiosciences.com).Wiebereits

erwähnt, ist GATA-3 in der Adipozytendifferenzierung involviert (Tong, Tsai, & Hotamisligil,

2003). ImsubkutanenFettgewebewirdu.a.HECTD4 (Synonym:C12orf51)aufChromosom12

als beeinflusstes Gen erwähnt, mit einer Effektgröße von -0,20 und einem p-Wert von

0.0000099(TheGTExConsortium,2013).LauteinerStudievonGoetal.wurdeeineAssoziation

von C12orf51 mit einem pathologischen 1-Std-Plasmaglukosewert als prädisponierenden

RisikofaktorfürdieEntstehungvonDiabetesmellitusTyp2identifiziert(Go,etal.,2013).

DieDatenbankRegulomeDBmisstderpotentiell regulatorischenFunktiondesSNPs indiesem

Chromosomenabschnitt jedoch nur eine geringe Bedeutung (Score 5) zu. Auch den weiteren

SNPsimLD-BlockkonntekeinerelevanteKonsequenzzugesprochenwerden,rs7953150weist

selbstdasgrößtePotentialauf.InderkomparativenAnalyseistderSNPrs7953150konkordant

57

zuLith17,jedochkonntebislangkeinadäquatesKandidatengenfürdenmurinenLocusgefunden

werden(Lyons&Wittenburg,2006).

Aufgrund der vor der Genotypsierung der SNPs durchgeführten Adjustierung auf Alter,

Geschlecht und BMI der Probanden, wurde ein BMI-unabhängiger Effekt gefunden.

Entsprechend istdernachgewieseneEffektderGenvariante aufdieGallenstein-Suszeptibilität

eher nicht auf den BMI der Probanden zurückzuführen. Die Assoziation zu den eQTLs im

viszeralen und subkutanen Fettgewebemit entsprechender Beeinflussungder Expression der

o.g.GeneistjedocheinHinweisfürbislangunbekanntezugrundeliegendePathomechanismen.

Eine eindeutige funktionelle Konsequenz für den SNP konnte nicht nachgewiesen werden,

weitere Analysen sollten jedoch gezielt denZusammenhang zu einer reduzierten Adipozyten-

differenzierungsowieDiabetesmellitusuntersuchen.

4.4.4 ZusammenfassungfunktionelleKonsequenzen

Zusammenfassendkannnachderin-silico-AnalyseweiterhinkeinedefinitiveAussageüberdie

KausalitätoderfunktionellenKonsequenzenderSNPsgemachtwerden.Trotzdersignifikanten

Assoziation sind weitere Untersuchungen zur Interpretation der Kausalität der Tag-SNPs

erforderlichmitnachfolgenderExpressions-undFunktionsanalysen.

Der Polymorphismus rs11887534 im Gen ABCG5/8 ist eine missense-Mutation und führt

entsprechend zu einer Aminosäurenveränderung. Durch die Datenbank RegulomeDb wurde

demSNP jedochnur einenRelevanz-Score von4 (minimalbinding evidence) erteilt, trotzder

mehrfach in Studien bestätigten Assoziation zur Cholelithiasis. Der SNP rs3781117 aus der

vorliegenden Studie wies einen relevanten Score von 2b auf und wurde bislang in keiner

weiterenUntersuchungidentifiziert.EntsprechendkannkeineindeutigerRückschlussdesdurch

dieDatenbankerrechnetenScoresmitdertatsächlichenpotentiellenRelevanzdesSNPsgezogen

werden.

DasGallensteinleidenisteinekomplexeErkrankungmitseltenmonogenetischerÄtiologie.Der

EinflussvonUmweltfaktorenaufIndividuenmitgenetischerPrädispositionaufgrundvonhäufig

vorkommenden Polymorphismen mit einem geringen bis moderaten Einfluss auf die

Entwicklung der Erkrankung entspricht der aktuellen Vorstellung der Pathophysiologie der

„common diseases“, u.a. auch des Gallensteinleidens. Eine Untersuchung der bislang

identifizierten „trait-associated SNPs“ (TAS) ergab, dass sie sehr häufig in der Bevölkerung

auftreten, mit einer Minorallelfrequenz von durchschnittlich ca. 36% und lediglich einer

geringenEffektgrößevonOR~1,3(Hindorff,etal.,2009).

NachEtablierungderAnwendungundDurchführunggenomweiterAssoziationsstudienwirddas

Augenmerknunverstärktaufdie InterpretationderErgebnissegerichtet,umpräventiveoder

therapeutische Konsequenzen aus den Studien ziehen zu können. Eine Identifizierung der

58

assoziierten Genvarianten ist nicht ausreichend, da nur in wenigen Fällen eine funktionelle

Konsequenz anhand der Lokalisation des SNP oder der Pathophysiologie der Erkrankung

gefundenwerdenkann.DieStudievonHindorffetal.ergab,dasssich45%derTASin Intron-

Regionenund43%zwischenzweiGenenbefinden,lediglichca.10%derimRahmenvonGWAS

identifiziertenGenvariantenbefindensichdementsprechenddirekt inkodierendenSequenzen

oder führen zu Aminosäureänderungen (Hindorff, et al., 2009). Die Ergebnisse der Studie

bestätigtenzwar,dassdieintergenenDNA-RegionendengeringstenQuotientenanfunktioneller

zu totaler DNA besitzen, der Autor wies jedoch darauf hin, dass sich in der Region wichtige

regulatorische Komponenten befinden (Hindorff, et al., 2009). Des Weiteren kann durch die

systematische Kartierung von Chromatin-Markern des nicht-kodierenden Genoms in

verschiedenen Zelltypen durch Ernst et al. ein Rückschluss auf potentielle regulatorische

FunktionenderimRahmenvonGWASidentifiziertenSNPsgezogenwerden(Ernst,etal.,2011).

HistonmarkerundDNaseI-Hypersensitivitäts-LociweisenaufaktiveChromatinregionenhinmit

enthaltenenPromotorenundEnhancern als regulatorischeElementedesnachfolgendenGens.

DurchdieErgänzungvonInformationenzueQTLswurdedieInterpretationzurFunktionalität

von SNPs erweitert und weitere Hinweise zum zugrundeliegenden Pathomechanismus der

Erkrankunggewonnen.

DiegezielteUntersuchungdesChromatinabschnittes,welcherdenassoziiertenSNPbeherbergt,

kannentsprechendHinweiseaufzugrundeliegendePathomechanismenundFunktionalitätdes

SNPs ergeben, wobei die gewebespezifischen Regulationen in der vorliegenden Studie rein

spekulativbleiben.

4.5 Limitationen

Durchdie Durchführungderpost-hocPoweranalysekonnte eineAussageüberdieTeststärke

der vorliegenden Replikationsstudie gemacht werden. Die Ergebnisse der Studie sind jedoch

kritischzubetrachten.ZwarkonntenaufgrundderausreichendenTeststärkeRisikosvonOR>

1,6 (SNP MAF mind. 15%) zu ca. 70-80% detektiert werden, die Probandenzahlen reichen

jedoch nicht aus, um Effekte von geringerer Größe sicher zu detektieren und falsch-negative

Ergebnissesindentsprechendanzunehmen.

Zum Vergleich: die mehrfach replizierte Variante p.D19H des Gens ABCG8/5 wurde in der

LiteraturmiteinemOddsRatiovon2-3angegebenundträgtlautderLiteraturumca.10%zur

Heritabilität des Gallensteinleidens bei (Buch, et al., 2007) (Grünhage, et al., 2007). Die

TeststärkederStudiewäremiteinerPowervonüber80%jedochfürdieseEffektevonSNPs,mit

einerMAFvonmind.15%,ausreichendgewesen.GeringereEffekteundseltenereVariantensind

aufgrund der limitierten Power der Studie nicht detektiert worden. Die Negativ-Ergebnisse

59

sollten jedoch in einer nachfolgenden Replikationsstudie mit einer größeren Kohorte erneut

untersuchtwerden.

Zur Vermeidung eines Fehlers erster Ordnung durchmultiples Testenwäre eine Bonferroni-

Korrekturerforderlich.Entsprechendwürdederkorrigiertep-WertbeiderUntersuchungvon

22SNPswie folgtberechnetwerden:0,05/22=0,002.DasSignifikanzniveauwürdep=0,002

entsprechen und die vorliegenden Ergebnisse laut der Bonferroni-Korrektur nicht in den

Signifikanzbereich fallen. Nach unserer Interpretation der Ergebnisse, nach erfolgreicher

Replikation der SNPs in einer zweiten Kohorte mit ausreichender Teststärke, wären die

Ergebnisse jedoch falsch-negativ. Weiterführende Untersuchungen im Sinne einer erneuten

Replikation mit a-priori-Poweranalyse sowie nachfolgenden Funktionsuntersuchungen der

SNPssinderforderlichumeineeindeutigeRelevanzderPolymorphismenfestlegenzukönnen.

DesWeiterenistzubedenken,dasspopulationsspezifischeEffekteaufgedecktseinkönntenund

eine Replikation der Ergebnisse unserer „Sorben-GWAS“ in anderen genomweiten Unter-

suchungenbislangnichterfolgenkonnte.DievorliegendeStudiekonntewiederumaufgrundder

heterogenenStudienpopulationundniedrigenProbandenzahleninderReplikationskohortemit

begrenzter Power die bislang identifizierten LITH-Polymorphismen nicht entdecken. Die

fehlende Identifizierungweitererprädisponierender SNPskönnte evtl. durchdie eingegrenzte

AuswahlderKandidatengenezurReplikationbegründetsein.

DurchdieSelektionvonKandidatengenen,diesich inRegionenmitdreiodermehrSNPs(p>

0,001)ausderAssoziationsstudiebefinden, istnichtauszuschließen,dass indervorliegenden

Untersuchung weitere signifikante SNPs unentdeckt geblieben sind. Es wurden durch die

Selektionu.a.GenemitgrößerenLD-Gruppenbevorzugtuntersucht,umdieChancezuerhöhen,

eine Assoziation zu identifizieren, ohne dass dies jedoch eine Aussage über die Signifikanz

ergibt. Größere Studien sind erforderlich, in welchen diese Gene in die Replikationsanalyse

miteinbezogenwerden, ohne dass eine Selektiondurchgeführtwird, um das Risiko für falsch

negativeErgebnisseweiterzureduzieren.

4.6 PerspektiveundklinischeRelevanz

Das inderwestlichenGesellschaft häufig vorkommendeGallensteinleidenhatalsErkrankung,

verbunden mit teilweise schwerwiegenden Komplikationen, im deutschen Gesundheitswesen

einenhohenStellenwert.AufgrundderLebensgewohnheiten indenindustrialisiertenLändern

miterhöhterKalorienaufnahmeundmangelnderBewegung istdasGallensteinleidenmiteiner

Prävalenzvonca.20%einederhäufigstenErkrankungeninDeutschland.

Derzeit ist die einzige nicht operative Therapie der unkomplizierten Cholelithiasis die

medikamentöseLitholysemitUrsodeoxycholsäure,dieaberweitestgehendverlassenist.Andere

60

Verfahren wie die extracorporale Stoßwellen-Lithotripsie von Gallenblasensteinen werden

ebenfalls nichtmehr regulär eingesetzt. Beide Verfahrenweisen ein hohes Rezidivrisiko auf,

letzteres sogar von über 20%, so dass erneut Komplikationen durch Steinabgänge oder

temporäreGallengangsverschlüsse auftretenkönnen (Muratori, etal., 2017)(Carrilho-Ribeiro,

Pinto-Correia,Velosa,&CarneiroDeMoura,2006)(Yamamoto,etal.,2016).

Im Rahmen der mittlerweile fortgeschrittenen Möglichkeiten in der genetischen Forschung

werdenneuemolekulareMechanismenvonweitverbreitetenErkrankungenidentifiziert.Durch

die Entdeckung krankheitsauslösender oder –verstärkender Polymorphismen ist es möglich,

individuelle Risikoprofile von Patienten zu erstellen und durch Behandlung der wiederum

beeinflussbaren Risikofaktoren, das Risiko für das Auftreten derartiger Erkrankungen zu

limitieren.

Durch die sogenannte „Personalisierte Medizin“ können mit gezielten Untersuchungen die

genetischen Besonderheiten des Patienten vor dem Beginn einer speziellenmedikamentösen

Behandlung eingeschätzt werden, ob die Therapie eine Wirksamkeit aufweisen wird, ob

relevanteNebenwirkungenaufdasMedikamentauftretenwerdenundinwelcherDosierunges

appliziertwerdensollte(www.vfa.de).DiesesbesondereTherapiekonzeptfindetzumaktuellen

Zeitpunkt vor allem in der Behandlung der HIV-infizierten und bei Karzinom-Patienten

Anwendung(www.vfa.de).

Weitere Untersuchungen zu LITH-Genen sind entsprechend nicht nur erforderlich, um die

gesamteKomplexitätderPathophysiologiedesGallensteinleidens zu verstehen, sondern auch

umneueAnsatzpunktefürdiepersonalisierteMedizinzufindenundPatientenmiteinemhohen

Risikoprofil für die Cholelithiasis, einem nichtoperativen und effektiven prophylaktischen

Therapiekonzept zuführen zu können. Andererseits könnten Patienten mit einem niedrigen

genetischen Risiko aber starken lithogenen Umweltfaktoren, wie Multiparität oder einem

raschenGewichtsverlust,voneinermedikamentösenTherapiederCholelithiasisprofitieren.

DesWeiteren können durch die sogenannte kombinierte Risikoeinschätzung („combined risk

assessment“) individualisierte Risikoprofile erstellt werden. Geninteraktionen und das

Geschlecht beeinflussen die Prädisposition für Gallensteine in einem anderen Ausmaß im

Vergleich zum alleinigen Effekt einer einzelnen Risiko-Mutation. Diesbezüglich konnte eine

Interaktion zwischen den beiden LITH-Genen UGT1A1 und ABCG8 beschrieben werden, die

durch den gemeinsamen Nachweis in Kombination mit dem männlichen Geschlecht ein

Gallensteinrisikovonca.21,1%ergibt(Buch,etal.,2010).

Obwohl die in dieser Studie identifizierten Polymorphismen keine direkten Zielmoleküle zur

Prävention von Gallensteinen darstellen, konnte unsere systematische Untersuchung jedoch

sowohl klinische als auch genetische Risikofaktoren des Gallensteinleidens bestätigen bzw.

erstmals detektieren. Weiterführende Studien, basierend auf dem murinen Modell der

Cholelithiasis in größeren Populationen, versprechen die Identifizierung von weiteren

61

ZielmolekülenfürdieinnovativeProphylaxe,DiagnostikundTherapiedesGallensteinleidensbei

prädisponiertenPatienten.

62

5 Zusammenfassung

DissertationzurErlangungdesakademischenGrades�Dr.med.

IdentifikationhumanerGallensteingenemittelskomparativerGenetik

eingereichtvon: SheilaMirzakhyl

angefertigtander: KlinikundPoliklinikfürGastroenterologieundRheumatologie,

UniversitätLeipzig,MedizinischeFakultät

betreutvon: Prof.Dr.rer.med.PeterKovacs

PDDr.med.HenningWittenburg

EinreichungDezember2017

InunsererGesellschaftstelltdasGallensteinleiden,miteinerPrävalenzvonfast20%undeinem

vielfältigen klinischen Erscheinungsbild, eine hohe Belastung für das Gesundheitssystem dar.

Aus Mangel an vergleichbaren konservativen Methoden kommt bei dem symptomatischen

Gallensteinleiden die operative Therapie präferiert zum Einsatz. Die Pathogenese der

Cholelithiasis ist ein komplexes Zusammenspiel aus Umweltfaktoren und einer individuellen

genetischenPrädisposition,wobei sowohlmono- als auchpolygeneFormenderCholelithiasis

bereitsbeschriebenwurden.

IndervorliegendenArbeitwurdeaufdieIdentifizierungsogenannterLITH-Genefokussiertund

als Ansatz eine Analyse basierend auf komparativer Genetik gewählt. Die zugrundeliegende

Hypothese basiert auf der Annahme einer Konkordanz muriner Gallenstein-Loci mit bislang

nicht identifizierten humanen LITH-Regionen. Ziel des Studiendesigns war es, mithilfe der

bereitsvalidiertenmurinenLith-LociprädisponierendeGenvariantenineinerKohorteauseiner

sorbischen Bevölkerungsgruppe zu identifizieren und in einer Kontrollkohorte zu replizieren.

Durch die „Gallensteinkarte der Maus“ war es möglich, konkordante humane Regionen zu

selektieren,diezudemeineAssoziationinunserergenomweitenAnalyseaufwiesen.

63

Es wurde eine genomweite Assoziationsstudie für das Gallensteinleiden in einer sorbischen

Population durchgeführt. Im Ergebnis wiesen insgesamt 417 SNPs eine Assoziation zur

Cholelithiasis mit einem p-Wert von < 0.0001 auf und wurden in den vorliegenden

Untersuchungenverwandt.

NachÜbertragungderGallensteinkartederMaus indieMaßeinheit „Megabasenpaare“konnte

mithilfederGendatenbankEnsembleinegezielteIdentifizierungderzudenvalidiertenmurinen

Lith-LocikonkordantenhumanenGenregionenerfolgen.IneinertabellarischenGegenüberstel-

lung wurde ein Vergleichmit den Ergebnissen der genomweiten Assoziationsstudie und den

konkordantenhumanenRegionendurchgeführt,wobeisich282der417SNPsinnerhalbderzu

murinenLith-LocikonkordantenGenabschnittenbefandenundsomit89Genenalspotentielle

humaneLITH-GeneinBetrachtgezogenwurden.

Eswurdeninsgesamt10KandidatengenefürdieweiterenUntersuchungenausgewählt(PDE4B,

PCNXL2, NID1, KLF3, PALLD, GAD2, TPCN2, PTPN11, IDH2, CST8). Für diese Kandidatengene

erfolgte die Bestimmung von insgesamt 22 repräsentativer Tag-SNPs (r²>0.8), welche in den

Aachenern als Kontrollkohorte genotypisiert wurden. Die anschließende logistische

Regressionsanalyse im additiven Modell ergab für die folgenden SNPs eine signifikante

Assoziation: rs3781117(GAD2,p=0,051), rs337623(KLF3,p=0,021)undrs7953150(PTPN11,

p=0,048).DesWeiterenkonntendieklinischenRisikofaktorenAlter,Geschlecht,BMIundAnzahl

derSchwangerschaftenmiteinersignifikantenAssoziationzurCholelithiasisbestätigtwerden.

Im Rahmen einer in-silico-Analyse konnten nur Hinweise auf eine potentiell regulatorische

KonsequenzderSNPsgefundenwerden,einespeziellefunktionelleKausalitätbleibtspekulativ.

WeitereUntersuchungenkönntenAufschlussüberdiepathophysiologischenMechanismenund

somittherapeutischeKonsequenzergeben.

Die vorliegendeUntersuchung führte zurBestimmungvonpotentiellenhumanenKandidaten-

genen, ein Ansatz, der bis dato für das Gallensteinleiden auf genomweiter Basis noch nicht

durchgeführt wurde. Im Ergebnis der Arbeit wurde für drei Genvarianten eine bislang nicht

beschriebene potentielle Beteiligung an der Risikomodifizierung des Gallensteinleidens

nachgewiesen.

64

6 Anlagen

Human KonkordantemurineRegionen

Chr.Position(Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation(Chr.,Peak,CIincM) Lokalisation(Mb)

chr1:19012104 rs12063142 C/T

QTL,

Lith8

Chr4,46cM,CI±10cMChr4,62cM,95%CI58-70cM

103.0-155.6M

chr1:19026556 rs6684577 C/T

chr1:36451197 rs272819 C/T

chr1:43199805 rs710218 A/T SLC2A1 Promoter

chr1:50748894 rs11581155 G/T FAF1 Intron

chr1:53890573 rs11206186 G/T GLIS1 Intron

chr1:53892895 rs12733756 A/G GLIS1 Intron

chr1:58872694 rs11579447 G/T

chr1:58877088 rs232905 C/T

chr1:58877848 rs232904 A/G

chr1:58878741 rs232902 C/T

chr1:58899264 rs232779 A/C

chr1:58909861 rs513436 C/T

QTL,

Lith8


94.6-103.0M

chr1:58910760 rs542750 C/T

chr1:66302457 rs12043568 C/T PDE4B Intron


chr1:66317656 rs12049155 G/T PDE4B Intron

chr1:66444438 rs507956 A/G PDE4B Intron


chr1:91063601 rs17131213 A/T Lith13,

Lith17

Chr5,30cM,95%CI10-45Chr5,60cM,95%CI40-68cM

105.8-108.7M

65

chr1:230204217 rs1754606 A/G DISC1 Intron

QTL Chr8,69cM,95%CI31-79cM 126.3-129.5M

chr1:230213553 rs866596 C/T DISC1 Intron



chr1:231338266 rs2477857 A/T PCNXL2 Intron

chr1:234245665 rs16833108 G/T NID1 IntronLith15 Chr13,16cM,95%CI0-30cM 9.9-14.3M

chr1:234253988 rs3738533 C/T NID1Intron

(boundary)

Tabelle7:Chromosom1



chr2:43792583 rs2888881 A/G PLEKHH2 Intron

Lith9Chr17,56cM,95%CI50-

60cM71.9-92.1Mchr2:48952201 rs6708130 C/T

chr2:48963897 rs10490127 A/T

chr2:65950134 rs11890665 A/G FLJ16124 Intron Lith23 Chr11,13cM,CI±10cM 16.9-31.0M

chr2:153539181 rs4664635 C/G Lith1Chr2,41.8cM/49.6cM,CI40-

60cM39.4-84.3M

chr2:216429063 rs4076919 A/T QTL,

QTL

und

QTL

Chr1,24cM,95%CI0-40cMChr1,8cM,95%CI0-40cMChr1,16cM,95%CI10-54cM

53.4-96.0Mchr2:217782373 rs13013676 C/G

chr2:228234344 rs2396465 A/G

chr2:239092118 rs752123 C/T

Tabelle8:Chromosom2

66



chr3:2072897 rs10510226 A/G Lith6,

Lith16Chr6,54cM,95%CI40-70cM 103.2-115.9M

chr3:2096865 rs12330388 A/T

chr3:23659405 rs11706670 A/G QTL Chr14,10cM,95%CI0-25cM 15.3-19.8M

chr3:32438998 rs17029455 A/C CMTM7 Intron Lith5 Chr9,43cM,95%CI30-60cM 111.0-118.4M

chr3:69429370 rs9863228 C/T Lith6,

Lith16und

QTL


92.2-103.3Mchr3:72783259 rs2679211 A/G

Tabelle9:Chromosom3



chr4:7666095 rs17368264 C/G SORCS2 Intron

Lith13,

Gbvq1,

Lith17,

QTL

Chr5,30cM,95%CI10-45Chr5,30cM,95%CI20-50cMChr5,60cM,95%CI40-68cMChr5,42cM,95%CI20-50cM

35.8-73.8M

chr4:14467439 rs1389999 A/G

chr4:17561306 rs6845078 C/T MLR1 Intron


chr4:38311539 rs337628 A/T FLJ13197 Intron

chr4:38380129 rs17582575 A/C KLF3 Downstream

chr4:38400008 rs17616338 C/T

chr4:38474271 rs4624663 A/G TLR1 Downstream

chr4:40734492 rs7674811 A/C APBB2 Intron

chr4:58396887 rs13134527 A/G Lith13, Chr5,30cM,95%CI10-45 73.9-105.0M

67

chr4:61688491 rs1449622 A/G QTL,

Gbvq1,

Lith17


chr4:85188128 rs17007921 A/G

chr4:88139044 rs4693155 C/G AFF1 Promoter

chr4:143042611 rs7677292 A/G QTL,

Lith11

Chr8,69cM,95%CI31-79cMChr8,58cM,95%CI48-60cM

77.8-86.0M


QTL Chr8,69cM,95%CI31-79cM 42.5-69.9M

chr4:169693682 rs10009813 C/G PALLD Intron



chr4:175707244 rs1365625 G/T

Tabelle10:Chromosom4


Chr.Position(Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region

Lokalisation(Chr.,Peak,CIincM) Lokalisation(Mb)

chr5:32854314 rs1501850 A/G QTL,

QTL

Chr15,5.5cM,CI±10cMChr15,29cM,95%CI0-40cM

3.2-32.7M

chr5:121063906 rs9327224 C/T QTL Chr18,45cM,95%CI31-50cM 44.5-60.3M

chr5:133058234 rs11242173 A/G Lith23,

QTL


51.5-54.7M

chr5:153544302 rs4958705 C/T GALNT10 Promoter Lith23,

QTL


54.7-58.0M

chr5:165238817 rs13436647 A/T Lith23,

QTL


32.2-48.5M

chr5:178687551 rs4700799 A/G ADAMTS2 Intron Lith23, Chr11,13cM,CI±10cM 48.9-51.5M

68

QTL Chr11,21cM,95%CI21-35cM




chr6:1653870 rs9405506 C/T GMDS IntronLith15 Chr13,16cM,95%CI0-30cM 30.7-48.6M

chr6:3476375 rs9328183 A/G

chr6:22406678 rs849877 A/G PRL Promoter

Lith15 Chr13,16cM,95%CI0-30cM 21.4-30.4Mchr6:22407025 rs12210179 C/T PRL Promoter

chr6:24949299 rs9366585 A/G C6orf32 Intron

chr6:37710438 rs1776447 C/T MDGA1 3'UTR QTL Chr17,26cM,95%CI10-40cM 27.1-31.1M

chr6:55385126 rs1979875 C/T UNQ9356Downstrea

m Lith5,

Lith20


75.6-78.2Mchr6:55388261 rs1354204 C/T

chr6:66756421 rs9445639 A/C QTL,

QTL


21.3-33.0M

chr6:79001258 rs6911854 C/T Lith5,

Lith20


78.2-88.4Mchr6:79001613 rs946138 A/G

chr6:88489371 rs2787938 C/T QTL,

QTL


21.4-34.9Mchr6:88490584 rs2754273 C/T

chr6:98139957 rs7356837 A/G

chr6:113810260 rs540391 A/G Lith21 Chr10,24cM,95%CI10-40cM 33.7-51.1M

chr6:128356297 rs11154433 A/C PTPRK IntronLith21 Chr10,24cM,95%CI10-40cM 3.0-33.4M

chr6:152181735 rs3844508 C/T ESR1 Intron

69




chr7:36837726 rs2006882 C/T

Lith15 Chr13,16cM,95%CI0-30cM 14.3-21.1M

chr7:36893366 rs2041801 A/G ELMO1 Intron

chr7:36909839 rs11769038 G/T ELMO1 Intron

chr7:36922366 rs1882080 A/G ELMO1 Intron

chr7:36936199 rs1882082 C/T ELMO1 Intron

chr7:36937360 rs10268319 C/T ELMO1 Intron

chr7:75845745 rs868269 C/T Lith17,

Lith18


134.6-136.5M

chr7:77545493 rs4590377 C/T MAGI2 Intron

Lith13 Chr5,30cM,95%CI10-45 4.2-21.0Mchr7:88833233 rs801873 A/G

chr7:88841520 rs10272660 A/G

chr7:129749650 rs2306848 C/T CPA4 CodingexonLith10,

QTL


29.2-48.5Mchr7:129752353 rs6955764 C/T CPA4 Downstream

chr7:130362315 rs17738298 A/G

chr7:150876967 rs1029949 C/G PRKAG2 Downstream

Lith13 Chr5,30cM,95%CI10-45 23.8-30.1M

chr7:150882696 rs2041634 A/G PRKAG2 Downstream

chr7:150883532 rs6952258 A/C PRKAG2 Downstream

chr7:150883551 rs4726044 A/C PRKAG2 Downstream

chr7:151119933 rs7796138 A/CPRKAG2

Intron


70



chr8:56317603 rs13438934 A/G XKR4 Intron QTL,

QTL


3.1-9.4M

chr8:60261552 rs10504287 A/G QTL,

QTL


3.6-9.7M3.6-9.7M

chr8:128672788 rs4247280 C/T QTL,

QTL,

QTL

Chr15,5.5cM,CI±10cMChr15,25.5cM,CI±10cM

Chr15,29cM,95%CI0-40cM32.7-76.8M

chr8:132422917 rs4596632 A/G

chr8:139892385 rs7838450 C/T COL22A1 Intron

chr8:142110882 rs4961315 C/T




chr9:12278602 rs7873941 G/T QTL,

Lith8


74.0-94.5M74.0-94.5M

chr9:73157763 rs11142806 A/G

Lith2 Chr19,50cM,95%CI±10cM 14.1-25.1M

chr9:73160842 rs4289879 A/C

chr9:73206593 rs1074670 A/G

chr9:77242670 rs7854515 C/T

chr9:77245570 rs1751805 C/T

chr9:79996438 rs7037778 A/G

chr9:82948468 rs997020 A/G QTL, Chr4,46.4cM,CI±10cM 70.3-73.5M

71

Lith8 Chr4,62cM,95%CI58-70cM

chr9:85230169 rs4636280 A/C FRMD3 Intron QTL,

Lith8


73.7-73.8M

chr9:102395933 rs1628249 C/T LOC347273 DownstreamQTL,

Lith8


45.9-70.2Mchr9:111710183 rs9886729 C/GPALM2-

AKAP2Intron

chr9:111908142 rs7026192 A/G AKAP2 Intron


chr9:136531674 rs11103034 A/G




chr10:1821930 rs4457675 C/T Lith15 Chr13,16cM,95%CI0-30cM 3.5-9.8M

chr10:4674916 rs17298157 C/T

chr10:21106987 rs2765841 G/T NEBL Downstream

QTL Chr2,8cM,95%CI0-20cM 11.9-22.9M

chr10:21209929 rs16921213 G/T NEBLIntron

(boundary)

chr10:26355103 rs11014917 A/T MYO3A Intron

chr10:26451099 rs4749092 C/T MYO3A Intron

chr10:26552050 rs3781117 C/T GAD2 Intron

chr10:34718906 rs2384222 A/T PARD3 Intron QTL Chr8,69cM,95%CI31-79cM 129.6-131.4M

chr10:42697172 rs3121323 A/G Lith6,

Lith16


116.2-118.4M

72

chr10:53349066 rs1937683 C/T PRKG1 Intron Lith2 Chr19,50cM,95%CI±10cM 30.3-32.5M

chr10:58024931 rs17577849 A/C


40cM58.8-74.3Mchr10:58136243 rs1949436 A/G

chr10:72147192 rs7093021 A/G ADAMTS14 Intron

chr10:78853158 rs3862501 C/G KCNMA1 Intron QTL Chr14,10cM,95%CI0-25cM 21.1-26.9M

chr10:83930772 rs1577624 A/C NRG3 IntronQTL Chr14,10cM,95%CI0-25cM 35.0-41.9M

chr10:88100227 rs1078789 C/T GRID1 Intron

chr10:90189797 rs10749585 C/T C10orf59 Intron

Lith2 Chr19,50cM,95%CI±10cM 32.5-61.2Mchr10:115320711 rs10885476 A/G HABP2 Intron

chr10:117867783 rs2530348 A/G GFRA1 Intron

chr10:126134955 rs908365 A/C LHPP Promoter

Lith22 Chr7,65cM,CI±10cM 135.5-147.5Mchr10:126502238 rs7097254 A/C KIAA0157 Intron

chr10:126533983 rs2086945 C/T




chr11:17329019 rs7928810 A/CDKFZp686O

24166Promoter Lith22 Chr7,65cM,CI±10cM 109.2-123.7M

chr11:19418229 rs2702648 C/T QTL,

Lith22

Chr7,26.5cM,CI±10cMChr7,65cM,CI±10cM

53.4-62.6Mchr11:21622692 rs11026144 G/T

chr11:23958869 rs10834254 C/T

chr11:30919924 rs163856 C/G FLJ46154 Intron

Lith1Chr2,41.8cM/49.6cMCI40-

60cM89.5-110.8M

chr11:31121135 rs7947992 A/G

chr11:31227920 rs1330719 A/G

chr11:31228161 rs1330714 C/T

73

chr11:31282908 rs3847588 C/T DCDC1 Intron

chr11:31606051 rs4922570 C/T ELP4 Intron

chr11:31635624 rs964111 A/G ELP4 Intron

chr11:31643519 rs4922876 C/T ELP4 Intron

chr11:34412551 rs208683 A/G CAT Promoter


chr11:36867235 rs4237669 C/G

chr11:36908532 rs1480548 C/T

chr11:68612530 rs4930265 A/G TPCN2 3'UTR

Lith22 Chr7,65cM,CI±10cM 151.0-152.5Mchr11:68614666 rs3168115 A/T TPCN2 Downstream

chr11:68617448 rs11228490 C/G TPCN2 Downstream

chr11:81622775 rs679370 A/G Lith22 Chr7,65cM,CI±10cM 94.3-109.2M

chr11:97731973 rs11214933 A/G

QTL Chr9,1cM,95%CI1-31cM 3.3-18.2Mchr11:97737484 rs12288530 A/C

chr11:97745273 rs7124636 C/T

chr11:97748441 rs1384206 G/T

chr11:113027921 rs10891578 A/T QTL,

Lith5


25.9-53.8Mchr11:113108252 rs10750028 C/T ZW10 Downstream

chr11:128197130 rs654169 C/T FLI1 Downstream




chr12:30594098 rs794174 A/C Lith6,

Lith16


129.2-149.5M

74

chr12:32644275 rs10129043 C/G FGD4 IntronQTL,

Lith14


16.2-16.6Mchr12:32644486 rs10844251 C/T FGD4 Intron

chr12:88771035 rs2722220 A/C


60cM86.1-129.8M

chr12:88779905 rs1946327 G/T

chr12:88790762 rs2553110 C/T

chr12:88820024 rs4635138 C/T

chr12:88921317 rs4453292 C/T

chr12:88948548 rs7313433 A/C

chr12:96966249 rs9669668 A/G

chr12:96976282 rs10860276 A/G

chr12:96994034 rs7968996 A/G

chr12:96999234 rs2160245 C/T

chr12:97058928 rs905749 G/T

chr12:110607667 rs601663 C/T BRAP Intron

Lith17 Chr5,60cM,95%CI40-68cM 115.3-123.1M

chr12:110614582 rs659964 C/G BRAP Promoter

chr12:110631347 rs608848 A/G ACAD10 Intron

chr12:110674821 rs6490294 A/C ACAD10 Intron

chr12:110717401 rs10744777 C/T ALDH2 Intron

chr12:110947679 rs4767293 A/G ERP29 Downstream

chr12:110971201 rs17696736 A/G C12orf30 Intron

chr12:111152058 rs1005902 G/T

chr12:111425954 rs7953150 A/G PTPN11 Intron

chr12:127138524 rs11059501 A/G Lith17,

Lith18


123.1-130.1M


75



chr13:103076020 rs1331535 A/G

Lith19 Chr8,0cM,95%CI0-8cM Chr13:102.3-114.1M

chr13:103076872 rs17314747 A/G

chr13:106408722 rs9514597 C/T

chr13:108755291 rs4134382 A/G

chr13:108760580 rs7335249 C/T




chr14:28580103 rs2758208 C/G

chr14:32438117 rs4246976 A/G

chr14:48204811 rs7492685 C/T

chr14:71010888 rs36528 G/T

chr14:81487024 rs1953408 C/G

chr14:86318354 rs1362721 A/G

chr14:86790859 rs1682561 A/C

chr14:88826249 rs17125613 C/T CHES1 Intron

chr14:94412516 rs6575471 A/C


76



chr15:29018482 rs565 C/T KIAA1018 Intron QTL,

Lith22


70.1-72.8M

chr15:33866710 rs12440810 C/T Lith1,

Lith12

Chr2,41.8cM/49.6cMCI40-60cM

Chr2,101cM,CI:95-110cM112.1-126.9Mchr15:35371235 rs16964884 C/G

chr15:53862207 rs10851595 A/G

QTL,

Lith5,

Lith20


56.7-75.5M

chr15:59101888 rs4774381 A/G RORA Intron

chr15:60074748 rs8034335 A/G VPS13C Intron

chr15:60074820 rs8034216 C/T VPS13C Intron

chr15:83390002 rs12909971 C/G PDE8A Intron

Lith22 Chr7,65cM,CI±10cM 88.0-91.9M

chr15:83407217 rs11632658 A/G PDE8A Intron


chr15:83419048 rs12438909 A/T PDE8A Intron



chr15:83427392 rs3816104 A/C PDE8A Intron

chr15:83436894 rs8032301 C/T PDE8A Intron


chr15:83440845 rs12904238 A/T PDE8A Intron

chr15:83445463 rs4843019 G/T PDE8A Intron



77



chr15:87204926 rs9630453 A/G AGC1 IntronQTL,

Lith22


82.5-87.4Mchr15:88448992 rs4553601 G/T IDH2 Promoter

chr15:88589912 rs3932 A/G LOC390637 Downstream

chr15:90571510 rs12440538 A/C QTL,

Lith22


72.8-82.5Mchr15:90573772 rs11632145 G/T

chr15:93463899 rs1471168 A/T




chr16:3807082 rs17199009 A/G CREBBP Intron

QTL Chr16,10cM,95%CI0-30cM Chr16:3.2-15.1M

chr16:7382495 rs17648389 C/T A2BP1 Intron

chr16:8110734 rs12929499 A/G

chr16:8131562 rs12926696 A/G

chr16:8132201 rs7202396 C/T

chr16:8132309 rs7203304 A/G

chr16:26074032 rs8053138 C/T

Lith22 Chr7,65cM,CI±10cM Chr16:21.5-28.2Mchr16:26085349 rs9938052 A/G

chr16:27281059 rs3024676 A/C IL4RIntron

(boundary)

chr16:81194829 rs3865182 A/C QTL,

Lith11


Chr16:68.7-88.6Mchr16:86166844 rs6540061 C/G

chr16:86167071 rs17699397 C/T


78



chr17:7914904 rs3935950 A/C ALOX12B DownstreamLith23,

QTL

Chr11,13cM,CI±10cMChr11,21cM,95%CI21-

35cM61.9-72.2Mchr17:14129518 rs8068798 C/T

chr17:36368165 rs3744389 A/G KA35 Downstream

QTLChr11,72cM,95%CI50-

80cM97.1-103.5M

chr17:36380188 rs8072395 C/T KA35 Promoter

chr17:36380630 rs1510078 A/G KA35 Promoter

chr17:36385766 rs1858209 G/T KA36 Downstream

chr17:36393181 rs7359525 C/T KA36 Intron

chr17:36393487 rs6503570 C/T KA36 Intron

chr17:41560151 rs2016730 C/T KIAA1267 Intron QTL Chr11,72cM,95%CI50-80cM 103.3-104.3M


chr17:61714923 rs9910760 A/T QTL Chr11,72cM,95%CI50-80cM 106.8-109.3M





chr18:45905374 rs2469479 G/T

QTLChr18,45cM,95%CI31-

50cM68.7-80.2M

chr18:45905535 rs2469478 A/G

chr18:51427587 rs10871582 G/T

chr18:51498256 rs1031831 G/T

79

chr18:52586782 rs8097197 A/G WDR7 Intron QTL Chr18,45cM,95%CI31-50cM 63.8-67.2M




chr19:34620901 rs10423566 C/G QTL,

Lith22


46.9-48.2M

chr19:35922510 rs929690 A/G QTL,

Lith22


24.9-39.1M




chr20:7208592 rs6085964 A/G

Lith1,

Lith12

Chr2,41.8cM/49.6cMCI40-60cM

Chr2,101cM,CI:95-110cM129.1-150.9M

chr20:15467047 rs6074913 C/G C20orf133 Intron

chr20:20792507 rs6082210 A/G

chr20:23422010 rs3004100 A/G CST8 Intron

chr20:23430396 rs3004110 C/T CST8 Downstream

chr20:23430430 rs3004111 A/G CST8 Downstream

chr20:36927175 rs208813 A/G PPP1R16B Intron

Lith12 Chr2,101cM,CI:95-110cM 152.4-174.7Mchr20:46054338 rs11086234 A/G

chr20:46061573 rs6063195 C/T

chr20:49536592 rs754285 C/T NFATC2 Intron

80




chr21:34726455 rs7279041 A/G


70cM75.5-98.2Mchr21:34734497 rs8129326 A/G KCNE1 Downstream




Chr.Position SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation(Chr.,Peak,CIincM) Lokalisation(Mb)

chr22:26261552 rs79880 C/T Lith17 Chr5,60cM,95%CI40-68cM 111.3-113.7M

chr22:26261842 rs137147 G/T

chr22:32383443 rs240343 C/T LARGE Intron

QTL,

Lith11


75.3-77.8M


chr22:32388812 rs240345 C/G LARGE Intron

chr22:32388890 rs240346 A/G LARGE Intron


chr22:32389719 rs240350 C/G LARGE Intron




81

7 Literaturverzeichnis

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8 Selbständigkeitserklärung

ErklärungüberdieeigenständigeAbfassungderArbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne unzulässige Hilfe

oderBenutzungandereralsderangegebenenHilfsmittelangefertigthabe. Ichversichere,dass

DrittevonmirwederunmittelbarnochmittelbareineVergütungodergeldwerteLeistungenfür

Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhangmit dem Inhalt der vorgelegtenDissertation

stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder

ähnlicherFormeineranderenPrüfungsbehördezumZweckeinerPromotionodereinesanderen

Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen

übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug

genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen

genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegendenArbeit beteiligtwaren. Die aktuellen

gesetzlichenVorgabeninBezugaufdieZulassungderklinischenStudien,dieBestimmungendes

Tierschutzgesetzes, die Bestimmungen des Gentechnikgesetzes und die allgemeinen

Datenschutzbestimmungen wurden eingehalten. Ich versichere, dass ich die Regelungen der

Satzung der Universität Leipzig zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis kenne und

eingehaltenhabe.

Leipzig,den04.12.2017

SheilaMirzakhyl

identifikation humaner gallensteingene mittels

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