1

Identificazione delle mutazioni

Diagnosi pre-impianto – prenatale – postnatale – eterozigoti

Terapia malattia minima residua – terapia specifica –

disegno di nuovi farmaci

Prevenzione screening eterozigoti – geni oncosoppressori -

SNPs

2

3

Systems biology is the study of an organism, viewed as an integrated and interacting

network of genes, proteins and biochemical reactions which give rise to life.

Systems Biology: the 21st Century Science

Whole-istic biology

4

Genes and proteins almost never work alone. They interact with each other and

with other molecules in highly structured but incredibly complex ways, similar to the

complex interactions among the countless computers on the Internet.

Systems biology aims at explaining the properties and behavior of complex

biological systems such as the cell or its molecular machineries

5

ANALOGY If you wanted to study an

automobile, and focused on

identifying the engine, seat

belts, and tail lights, and

studied their specific

functions, you would have

no real understanding of

how an automobile

operates.

More important, you would have

no understanding of how to

effectively service the vehicle

when something malfunctions.

?

?

6

So too, a traditional approach to studying biology and human health has left us with

a limited understanding of how the human body operates, and how we can best

predict, prevent, or remedy potential health problems.

Researchers have had limited success in curing complex diseases such as

cancer, HIV, and diabetes because traditional biology generally looks at only

a few aspects of an organism at a time.

7

8

9

10

11

12

Metodologie High-Throughput

(HT)

Microarray

Next Generation Sequencing (NGS)

Comparative Genomic Hybridization (CGH)

13

Metodologie High-Throughput

(HT)

RT² Profiler™ PCR Array System

TaqMan® Assays in 384-Well Microfluidic Cards

Nanostring

14

Induction of Apoptosis:

Death Domain Receptors: CRADD, FADD, TNF, TNFRSF10B (DR5).

DNA Damage: ABL1, CIDEA, CIDEB, TP53, TP73.

Extracellular Signals: CFLAR (CASPER), DAPK1, TNFRSF25 (DR3).

Other: BAD, BAK1, BAX, BCL10, BCL2L11, BID, BIK, BNIP3, BNIP3L,

CASP1 (ICE), CASP10 (MCH4), CASP14, CASP2, CASP3, CASP4, CASP6,

CASP8, CD27 (TNFRSF7), CD70 (TNFSF7), CYCS, DFFA, DIABLO (SMAC),

FAS (TNFRSF6), FASLG (TNFSF6), GADD45A, HRK, LTA (TNFB), NOD1

(CARD4), PYCARD (TMS1/ASC), TNFRSF10A, TNFRSF9, TNFSF10

(TRAIL), TNFSF8, TP53BP2, TRADD, TRAF3.

Anti-Apoptosis: AKT1, BAG1, BAG3, BAX, BCL2, BCL2A1 (Bfl-1/A1),

BCL2L1 (BCL-X), BCL2L10, BCL2L2, BFAR, BIRC3 (c-IAP1), BIRC5,

BIRC6, BNIP2, BNIP3, BNIP3L, BRAF, CD27 (TNFRSF7), CD40LG (TNFSF5),

CFLAR (CASPER), DAPK1, FAS (TNFRSF6), HRK, IGF1R, IL10, MCL1,

NAIP (BIRC1), NFKB1, NOL3, RIPK2, TNF, XIAP (BIRC4).

Regulation of Apoptosis:

Negative Regulation: BAG1, BAG3, BCL10, BCL2, BCL2A1 (Bfl-1/A1),

BCL2L1 (BCL-X), BCL2L10, BCL2L2, BFAR, BIRC2 (c-IAP2), BIRC3 (c-

IAP1), BIRC6, BNIP2, BNIP3, BNIP3L, BRAF, CASP3, CD27 (TNFRSF7),

CD40LG (TNFSF5), CFLAR (CASPER), CIDEA, DAPK1, DFFA, FAS

(TNFRSF6), IGF1R, MCL1, NAIP (BIRC1), NOL3, TP53, TP73, XIAP

(BIRC4).

Positive Regulation: ABL1, AKT1, BAD, BAK1, BAX, BCL2L11, BID, BIK,

BNIP3, BNIP3L, CASP1 (ICE), CASP10 (MCH4), CASP14, CASP2, CASP4,

CASP6, CASP8, CD40 (TNFRSF5), CD70 (TNFSF7), CIDEB, CRADD, FADD,

FASLG (TNFSF6), HRK, LTA (TNFB), LTBR, NOD1 (CARD4), PYCARD

(TMS1/ASC), RIPK2, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B (DR5), TNFRSF25

(DR3), TNFRSF9, TNFSF10 (TRAIL), TNFSF8, TP53, TP53BP2, TRADD,

TRAF2, TRAF3.

DEATH Domain Proteins: CRADD, DAPK1, FADD, TNFRSF10A, TNFRSF10B

(DR5), TNFRSF11B, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF25 (DR3),

TRADD.

Caspases and Regulators:

Caspases: CASP1 (ICE), CASP10 (MCH4), CASP14, CASP2, CASP3, CASP4,

CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CFLAR (CASPER), CRADD,

PYCARD (TMS1/ASC).

Caspase Activators: AIFM1 (PDCD8), APAF1, BAX, BCL2L10, CASP1 (ICE),

CASP9, NOD1 (CARD4), PYCARD (TMS1/ASC), TNFRSF10A, TNFRSF10B

(DR5), TP53.

Caspase inhibitors: CD27 (TNFRSF7), XIAP (BIRC4).

15

TaqMa

n®

Array

Number

of

Targets

and

Control

s

Number

of Assay

Replicat

es

Number

of

Samples

per

Card

Minimu

m

Order

Size

Part

Number

Format

12 11 + 1 4 8 10 4342247

Format

16 15 + 1 3 8 10 4346798

Format

24 23 + 1 2 (4) 8 (4) 10 4342249

Format

32 31 + 1 3 4 10 4346799

Format

48 47 + 1 1 (2) 8 (4) 10 4342253

Format

64 63 + 1 3 2 10 4346800

Format

96a 95 + 1 1 (2) 4 (2) 10 4342259

Format

96b 95 + 1 4 1 10 4342261

Format

192 191 + 1 2 1 10 4346802

Format

384 380 + 1 1 1 10 4342265

16

49 - 400

chips/wafer

DNA microarrays consist of thousands of individual gene sequences bound to

closely spaced regions on the surface of a glass microscope slide.

1.28cm

up to ~ 400,000 features/chip

Millions of identical oligonucleotide

probes per feature

20 - 50 µm

20 - 50 µm

17

Esistono di fatto due tecnologie per la produzione di

microarrays: la prima denominata a spotting e la

seconda detta in situ.

18

Nella tecnologia spotting, le sonde da

ancorare al supporto solido, normalmente un

vetrino da microscopia, sono sintetizzate a

parte e quindi depositate sul supporto.

Tali sonde possono essere costituite da

molecole di cDNA lunghe alcune migliaia di

paia di basi le cui sequenze possono essere

ricavate da banche dati genomiche

(GenBank, dbEST o UniGene)

19

Selezionate le sequenze da studiare, il cDNA

relativo viene prodotto mediante PCR

ottenendo così sonde della dimensione da

600 a 2400 bp.

Più recentemente, le sonde che vengono

depositate sono rappresentate non tanto da

frammenti di materiale genomico ottenuto via

PCR, quanto piuttosto da sequenze sintetiche

di oligonucleotidi lunghe 50-70 paia di basi.

20

Una volta prodotte, le sonde vengono depositate sul supporto solido, in

genere costituito da un vetrino. La deposizione viene effettuata da

sistemi robotizzati che mediante l’utilizzo di pennini prelevano le sonde

direttamente dalle piastre utilizzate per la PCR e le depositano sul

vetrino formando spots di circa 100-150 µm di diametro, distanziati l’uno

dall’altro 200-250 µm.

Durante la deposizione, il sistema di controllo del robot registra

automaticamente tutte le informazioni necessarie alla caratterizzazione

ed alla completa identificazione di ciascun punto della matrice (identità

del cDNA, coordinate sul supporto, ecc.). Una volta sul vetrino, il probe

viene legato covalentemente ai gruppi amminici del supporto attraverso

una reazione innescata dall’irragiamento con luce ultravioletta, mentre il

cDNA in eccesso viene rimosso con semplici lavaggi dell’array. Infine, il

cDNA sul supporto viene reso a catena singola attraverso una

denaturazione termica o chimica.

21

L’altra tecnica utilizzata per la produzione di

microarrays è quella detta in situ che,

sviluppata da Affimetrix, è frutto

dell’interazione di due tecnologie particolari, la

fotolitografia e la sintesi diretta in fase solida di

oligonucleotidi.

La sintesi delle sonde avviene direttamente

sulla superficie del supporto solido

22

23

I targets, ovvero gli acidi nucleici da ibridizzare alle catene

di cDNA ancorate al supporto solido,

sono normalmente ottenuti dalla marcatura dell’mRNA

proveniente da un dato organismo per mezzo di molecole

fluorescenti.

Probes e targets vengono poi messi a contatto per fare

avvenire la reazione di ibridazione e dopo alcuni lavaggi per

rimuovere i prodotti aspecifici, l’array viene passato

attraverso uno scanner per la misura dei segnali

fluorescenti.

L’intensità dei pixel di ciascuna immagine è proporzionale al

numero di molecole di tracciante presenti sullo spot e quindi

al numero di targets che hanno ibridizzato le sonde

ancorate al supporto.

24

25 Array

Before labelling

Schematically

26 Array

Labelled but before hybridization

Schematically

27

After hybridization

Schematically

Array

28

4 2 0 3

Quantification

Schematically

Array

29

cDNA clones

oligonucleotide arrays

30

Hybridize

RNA

Tumor sample

cDNA

RNA

Reference sample

cDNA

31

emission

excitation

red laser

green laser

overlay images and normalise

32

Di fatto, livelli diversi di fluorescenza indicano livelli diversi di

ibridizzazione e quindi di espressione genica.

Il segnale rilevato dallo scanner viene poi sottoposto ad

algoritmi di filtrazione e di pulizia del segnale e convertito in

valori numerici .

In generale, quindi, un esperimento di analisi dei profili di

espressione fornisce come risultato una matrice di dati, in cui le

righe rappresentano i geni monitorati e le colonne corrispondono

alle diverse condizioni sperimentali, quali punti temporali,

condizioni fisiologiche, tessuti.

Ogni elemento della matrice rappresenta quindi il livello di

espressione di un particolare gene in uno specifico stato

fisiologico.

Ciascuna colonna è data da un vettore che ha tante dimensioni

quanti sono i geni o le sequenze immobilizzate sull’array.

33

34

35

36

È necessario, quindi, avere a disposizione

tutta una serie di tecniche computazionali

capaci di gestire ed interpretare questi

enormi database nonché di interfacciarsi

con gli strumenti bioinformatici per l’analisi

funzionale (database mining).

37

Si definiscono tecniche di database mining tutta una serie di strumenti informatici per

l’esplorazione e l’analisi di grandi quantità di dati al fine di estrarre motivi caratteristici e

persistenti (patterns) e regole. Gli algoritmi che costituiscono il database mining derivano

da campi quali la statistica, la pattern recognition, l’intelligenza artificiale e l’analisi dei

segnali; essi sfruttano le informazioni ricavate direttamente dai dati per creare dei modelli

empirici in grado di descrivere il comportamento di un sistema complesso. Nel caso dei

profili di espressione genica, le tecniche di database mining rappresentano un utile

strumento per identificare ed isolare particolari pattern di espressione che di fatto

rappresentano delle vere e proprie impronte digitali genetiche di un determinato stato

fisiologico. L’analisi dei dati degli array di cDNA è normalmente basata sull’uso sinergico

di test di ipotesi (hypothesis testing) e di sistemi per l’estrazione della conoscenza

(knowledge discovery). I metodi di hypothesis testing sono sostanzialmente degli approcci

di tipo top-down con i quali si ricercano nei dati le conferme sperimentali ad ipotesi

precedentemente formulate. La knowledge discovery può essere intesa invece come un

approccio bottom-up nel quale sono i dati stessi che forniscono le indicazioni necessarie alla

formulazione di nuove ipotesi. Un aspetto cruciale dell’applicazione di queste procedure è

l’identificazione di tutti quei geni che manifestano un’elevata attività in un determinato

stato fisiologico. Questi geni attivi, e le loro relazioni, possono essere identificati attraverso

tecniche quali Mean Hypothesis Testing (MHT), Cluster Analysis (CA), Principal

Component Analysis (PCA) e Decision Tree (DT).

38

Microarrays may be used to assay gene expression within a single

sample or to compare gene expression in two different cell types or

tissues samples, such as in healthy and diseased tissue.

Follow population of (synchronized) cells over time, to see how expression changes (vs. baseline)

Expose cells to different external stimuli and measure their response (vs. baseline)

Take cancer cells (or other pathology) and compare to normal cells.

39

•Developmental stage-specific gene expression

40

•Gene expression during differentiation - investigation of how gene

expression patterns are altered during differentiation.

41

Gene expression during tumorigenesis - cells can be sampled at

different recognized stages during the progression to cancer

42

ADVANTAGES

Microarray analysis offers the advantage of profiling expression levels

of hundreds or thousands of genes simultaneously using a single RNA

preparation

Yeast ~ 6200 genes E. coli ~ 4200 genes

Human ~ 25,000 genes Mouse ~ 25,000 genes

Phage T4 ~ 20 genes Influenza ~ 12 genes

High speed

Easy to use

Theorycally, all genes of an organism can be analyzed by a single array

43

This technology is a very dynamic one and is currently spawning

a variety of derivative technologies including the development of

protein and antibody microarrays and cell microarrays

44

LIMITS

Obviously, this is an expression-based technology, capable only

of monitoring cellular responses at the RNA level. Some critical

signaling changes may occur only at the protein or post-

translational level and therefore would not be detected with gene

arrays.

The correlation between the number of mRNA and protein molecules is

generally not strong enough to predict one value from the measurement

of the other

Protein

mRNA

DNA

transcription

translation

45

Punto 1

Organizzazione della cromatina

Inizio della trascrizione

Regolazione dell’espressione genica

46

47

LIMITS

High cost technology

No quantitative: 3 fold variations are experimental

Data interpretation represent a complex problem:

mRNA profiling data (as other applications) typically consist of many

thousands of measurements for each array

Needs verification by other approach (i.e., Real time PCR)

48

49

50

51

52

•screening of polymorphisms and mutation

•There is also huge potential for assaying for mutations in known disease

genes, as recently exemplified in the case of the breast cancer

susceptibility gene, BRCA1. In addition, there have been vigorous efforts

to identify and catalog human single nucleotide polymorphism (SNP)

markers

53

54

Experimental Space:

The Relevancy of “Classic” Techniques

Differential Gene Expression

• Northern blotting (1977) : 1 Probe – 20 samples

• Dot Blots (1987) : 100s of probes – 1 sample

• RT-PCR (1992) : 100s of probes – 10 -100 samples

• Microarrays (1995 ) : 100,000s of probes – 1 sample

• Next-gen sequencing (2005) : 10-100 x 106 reads – 1 sample

1a generazione sequenziamento del DNA

secondo il metodo Sanger

Il sequenziamento automatico secondo il metodo Sanger ha dominato nella scienza e nell’industria per almeno 20 anni e ha consentito il sequenziamento del genoma umano e la scoperta di almeno 2.500 malattie genetiche

Il sequenziamento automatico secondo il metodo Sanger è considerato la tecnologia di “prima generazione”, mentre I nuovi metodi di “deep sequencing” sono denominati “next-generation sequencing (NGS)”

Sanger sequencing

• DNA is fragmented

• Cloned to a plasmid

vector

• Cyclic sequencing

reaction

• Separation by

electrophoresis

• Readout with

fluorescent tags

2a generazione

“next-generation sequencing (NGS)”

Il principale vantaggio è la possibilità tecnica di produrre un

volume enorme di dati a costi estremamente più bassi ed in

tempi estremamente più rapidi

Il potenziale dell’NGS è simile ai primi tempi della PCR

Advantages of RNA-Seq

• Not limited to the existing genomic

sequence

• Very low (if any) background signal

• Large dynamic detecting range

• Highly reproducibility

• Highly accurate

• Less sample

• Low cost per base

Wang et al. Nature Reviews Genetics 2009

62

63

64

65

66

67

EPIGENETICA

• Key part in regulating gene

expression

• Chip: technique to study DNA-

protein interaccions

• Recently genome-wide ChIP-

based studies of DNA-protein

interactions

• Readout of ChIP-derived DNA

sequences onto NGS platforms

• Insights into transcription

factor/histone binding sites in

the human genome

• Enhance our understanding of

the gene expression in the

context of specific environmental

stimuli

69

L’ibridazione genomica comparativa (Comparative Genomic

Hybridization, CGH) convenzionale è una tecnica di

rilevazione che consente di analizzare l’intero genoma del

soggetto che si vuole esaminare, grazie ad in un unico

esperimento in grado di identificare anomalie del corredo

genetico quali riarrangiamenti inter– ed intracromosomici,

regioni di amplificazione genica e regioni con delezioni.

Comparative Genomic Hybridization

CGH

70

Il principio della tecnica si basa su una competizione per il

legame di 2 DNA genomici, marcati con fluorocromi diversi, a

cromosomi in metafase, non marcati e provenienti da un

soggetto sano.

Il primo DNA è estratto dal paziente in esame mentre l'altro

costituisce il DNA genomico di riferimento proveniente da un

soggetto sano.

Tale processo prende il nome di ibridazione in situ su

cromosomi e, grazie allo stato altamente condensato dei

cromosomi metafisici, la risoluzione di questa tecnica (vale a

dire la capacità di riconoscere alterazioni nelle sequenze del

genoma) è nell’ordine delle 5 Mb (1 Mb = 1 milione di basi).

71

Figura 1.

Nelle immagini si vede la stessa preparazione di cromosomi (metafase) di un soggetto

normale, fatta ibridare con

(a) il DNA estratto da cellule tumorali marcate con uno specifico fluorocromo verde, e

(b) il DNA delle cellule normali di riferimento marcati con uno specifico fluorocromo

rosso.

(c) La sovrapposizione delle immagini dimostra l’intensità relativa della fluorescenza

verde e di quella rossa, riflettendo le variazioni del numero di copie di geni che si

riscontra nel genoma tumorale. Una perdita di geni in aree più o meno estese del

DNA tumorale conferisce al DNA di riferimento un vantaggio nella competizione per

il legame al DNA normale. Proprio per questo motivo in tali aree il microscopio rileva

un aumento della fluorescenza rossa.

Viceversa, duplicazioni ed amplificazioni di geni del DNA tumorale corrispondono al

prevalere della fluorescenza verde.

72

73

BANDEGGI

• Bandeggi generali:

identificazione di TUTTI i cromosomi per mezzo di una serie di bande

lungo tutto l’intero cromosoma, diverse da un cromosoma all’altro

Bande G → varie tecniche, combinate a colorazione Giemsa

Bande Q → bande fluorescenti visibili con mostarda

quinacrina o composti simili

Bande R → dopo denaturazione al calore

• Bandeggi particolari:

limitati ad aree di ogni singolo cromosoma o gruppi di cromosomi

Bande T → regioni telomeriche

Bande C → regioni pericentromeriche

Bande AgNOR → regioni dell’organizzatore nucleolare

Bande Da-DAPI → tratto prossimale braccio corto n.15,

costrizioni secondarie n.1,9,16 e tratto distale Yq

74

75

76

Il principio della CGHarray è identico a quello della CGH

convenzionale.

La differenza sta nel fatto che i due DNA (test e reference)

vengono ibridati su un microarray di frammenti di DNA

genomico ben caratterizzati, invece che su un vetrino

contenente metafasi.

CGHarray

77

Risoluzione

CGH convenzionale 10 Mb

CGH array 1 Mb

78

79