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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR, CARACTERIZAÇÃO

BIOQUÍMICA E FENOTÍPICA DE LEVEDURAS DO COMPLEXO

Candida parapsilosis (C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis)

EDINA RAQUEL MENESES SILVA

Belém – Pará

2014


IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR, CARACTERIZAÇÃO



Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários do

Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará como

requisito parcial para a obtenção do

grau de Mestre em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientadora: Profª. Drª. Silvia Helena

Marques da Silva.

Belém – Pará

2014

Dados Internacionais de Catalogação na publicação (CIP)

Silva, Edina Raquel Meneses.

Identificação molecular, caracterização bioquímica e fenotípica de

leveduras do complexo Candida parapsilosis (C. parapsilosis,

C. orthopsilosis e C. metapsilosis) Edina Raquel Meneses Silva. - 2014.

Orientador: Silvia Helena Marques da Silva.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto

de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários, Belém, 2014.

1. Microbiologia médica. 2. Candidíase - Infecções. 3. Fungos.

I. Título.

CDD 22. ed. 616.9041

1


IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR, CARACTERIAÇÃO



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos

e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como

requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários.

Orientadora: Profª. Drª. Silvia Helena Marques da Silva

Instituto Evandro Chagas – SABMI / SVS / MS

Banca Examinadora: Profª. Drª. Karla Valéria Batista Lima

Instituto Evandro Chagas – SABMI – Lab. BioMol / SVS / MS

Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves

Universidade Federal do Pará – ICB / UFPA

Drª. Ana Roberta Fusco da Costa

Instituto Evandro Chagas – SABMI – Lab. BioMol / SVS / MS

Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado (Suplente)

Instituto Evandro Chagas – SAPAR / SVS / MS

Belém, 16 de maio de 2014

2

“Ó profundidade das riquezas, tanto da sabedoria,como da ciência de Deus!

Quão insondáveis são os seus juízos, e quão inescrutáveis os seus caminhos!”

Romanos 11:33

3

Dedico esta dissertação ao Ageu Júnior e à Sarah Meneses,

meus filhos, meus tesouros, minha inspiração, minha benção.

4

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, autor da vida e consumador da minha fé, por este tão

grande privilégio e por me sustentar em todos os momentos da minha caminhada. A Ele seja a

glória, o domínio e o louvor;

Aos meus filhos Ageu Júnior e Sarah Meneses por compreenderem minhas ausências e

ainda assim torcerem pelo meu sucesso;

A minha Mãe Anastácia, por seu exemplo, pelo seu amor e por suas orações;

As minhas irmãs e irmãos por seu amor e por sempre me motivarem a continuar;

Aos amados membros da minha Igreja Presbiteriana do Conjunto Maguari, pela

comunhão e por me sustentarem com suas orações;

Aos amigos do mestrado Jannyce Guedes, Eduardo Lana, Larissa Freitas e Andrea

Leal por todos os maravilhosos momentos que me proporcionaram, pela preciosa amizade e

incentivo;

A minha querida orientadora e mestra Dra. Silvia Marques pela oportunidade, pelo seu

exemplo de dedicação e amor à ciência, pelo saber compartilhado, pelo incentivo, pela

amizade, carinho e compreensão nos momentos difíceis;

As colegas do laboratório de Micologia pelo companheirismo, amizade e trocas de

experiências;

A todos os servidores da Seção de Bacteriologia e Micologia do Instituto Evandro

Chagas;

Ao Instituto Evandro Chagas por permitir o desenvolvimento desta pesquisa;

Aos membros da banca do plano de qualificação Dr. Edvaldo Loureiro e Dra. Daniela

Rocha pelas valiosas contribuições;

Aos membros da banca examinadora Dra. Karla Lima, Dra. Roberta Fusco e Dr.

Evonnildo Gonçalves por suas contribuições;

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da

Universidade Federal do Pará pela oportunidade da realização desta pesquisa;

Aos professores do PPG-BAIPUFPA, por seu conhecimento compartilhado.

5

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS E QUADROS 7

LISTA DE FIGURAS 8

LISTA DE ABREVIATURAS 9

RESUMO 10

ABSTRACT 11

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 12

1.1 HISTÓRICO, PERFIL TAXONÔMICO E MORFOLÓGICO DE Candida

parapsilosis................................................................................................................ 12

1.2 O COMPLEXO C. parapsilosis................................................................................ 13

1.2.1 Candida parapsilosis................................................................................................. 16

1.2.2 Candida orthopsilosis............................................................................................... 17

1.2.3 Candida metapsilosis................................................................................................ 17

1.3 EPIDEMIOLOGIA DAS ESPÉCIES DO COMPLEXO C. parapsilosis................. 19

1.4 FATORES DE RISCO.............................................................................................. 21

1.5 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS............................................................................... 22

1.6 FATORES DE VIRULÊNCIA.................................................................................. 23

1.6.1 Formação de Biofilme.............................................................................................. 23

1.6.2 Secreção de Enzimas................................................................................................ 26

1.7 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS INFECÇÕES POR ESPÉCIES DE

Candida...................................................................................................................... 28

1.7.1 Identificação Molecular........................................................................................... 29

1.7.2 Identificação Bioquímica......................................................................................... 29

1.8 SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS...................................................... 30

1.9 OBJETIVOS.............................................................................................................. 35

1.9.1 Objetivo Geral.......................................................................................................... 35

1.9.2 Objetivos Específicos............................................................................................... 35

2 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 36

2.1 DESENHO DO ESTUDO......................................................................................... 36

2.2 ISOLADOS FÚNGICOS E CRITÉRIO DE SELEÇÃO.......................................... 36

2.3 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA..................................................................... 37

6

SUMÁRIO

2.4 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DAS

LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis PELO VITEK®

2.................. 37

2.5 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR..................................................................... 37

2.5.1 Extração de DNA Genômico............................................................................. 37

2.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ........................................................ 38

2.6 PESQUISAS DE EXOENZIMAS....................................................................... 40

2.6.1 Atividade da Gelatinase..................................................................................... 40

2.6.2 Atividade da Lipase............................................................................................ 40

2.6.3 Atividade da Urease........................................................................................... 40

2.6.4 Atividade da Desoxirribonuclease (DNase) ..................................................... 41

2.6.5 Atividade da Caseinase...................................................................................... 41

2.6.6 Atividade da Fosfolipase.................................................................................... 42

2.6.7 Atividade da Proteinase..................................................................................... 42

2.7 CULTIVO EM ÁGAR EOSINA AZUL DE METILENO MODIFICADO....... 43

2.8 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO BIOFILME.................................................... 43

2.9 PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS.................................... 43

3 RESULTADOS................................................................................................. 46

3.1 REIDENTIFICAÇÃO DAS LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis

PELA METODOLOGIA VITEK®

2................................................................ 46

3.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DAS ESPÉCIES DO COMPLEXO C.

parapsilosis............................................................................................................... 48

3.3 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE EXOENZIMAS DAS ESPÉCIES DO

COMPLEXO C. parapsilosis................................................................................... 48

3.4 AVALIAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA APLICABILIDADE DO ÁGAR

EOSINA AZUL DE METILENO (EAM), COMO MEIO DE IDENTIFICAÇÃO

PRESUNTIVA PARA LEVEDURAS DO COMPLEXO C.

parapsilosis.............................................................................................................. 52

3.5 CARACTERIZAÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME POR LEVEDURAS

DO COMPLEXO C. parapsilosis............................................................................ 54

3.6 AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS........ 55

3.7 PARTICULARIDADE DO PERFIL FENOTÍPICO DE ISOLADOS DE

Candida parapsilosis................................................................................................ 56

4 DISCUSSÃO.......................................................................................................... 57

5 CONCLUSÕES...................................................................................................... 67

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 68

ANEXO................................................................................................................................ 79

7

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Página

Quadro 1 – Primers a serem utilizados e condições da Reação em Cadeia da

Polimerase (Garcia Martinez et al., 2010; Vercher et al., 2011). 39

Quadro 2 – Fármacos, diluentes e intervalos de concentrações utilizados (CLSI,

2002) 44

Quadro 3 – Diretrizes de Interpretação dos Testes de Sensibilidade in vitro das

espécies de Candida (CLSI, 2002). 45

Tabela 1 – Identificação de leveduras de C. parapsilosis por meio do Sistema

automatizado VITEK®

2. 46

Tabela 2 – Representação da assimilação de carboidratos por meio do Sistema

VITEK®

2, de isolados de C. parapsilosis. 47

Tabela 3 – Frequências relativas e absolutas da distribuição das espécies do

complexo: CP - C. parapsilosis, CO - C. orthopsilosis e CM - C. metapsilosis, de

acordo com o sítio anatômico e ou do material dos quais foram recuperadas

primariamente. 49

Tabela 4 – Secreção de exoenzimas por leveduras do complexo C. parapsilosis. 50

Tabela 5 – Frequência da atividade enzimática das leveduras do complexo C.

parapsilosis, conforme a intensidade da produção da exoenxima. 50

Quadro 4 – Descrição das características colorimétricas dos isolados do

Complexo C. parapsilosis, sobre o ágar EAM. 53

Tabela 6 – Frequências absoluta e relativa da susceptibilidade aos antifúngicos de

isolados do complexo C. parapsilosis. 56

8

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 – Perfis de isoenzimas definindo três grupos distintos de C. parapsilosis

(Lin et al. (1995).

14

Figura 2 – Padrões RAPD produzidos para amostras de C. parapsilosis (Tavanti

et al., 2005).

16

Figura 3 – Macromorfologia do complexo C. parapsilosis. 18

Figura 4 – Imagem de microscopia eletrônica de varredura mostrando a

arquitetura do biofilme de Candida parapsilosis em filtros microporosos de

policarbonato (Samaranayake et al, 2005). 24

Figura 5 – Produtos da amplificação de DNA de leveduras do Complexo C.

parapsilosis revelados por eletroforese em gel de agarose a 2%. 48

Figura 6 – Aspecto macromorfológico de um isolado (IEC 240) de C.

parapsilosis produtor da enzima hidrolítica Lipase. 51

Figura 7 – Aspecto macromorfológico de um isolado de C. parapsilosis produtor

da exoenzima DNAse. 51

Figura 8 – Aspecto macromorfológico da colônia de um isolado de C.

parapsilosis produtor da exoenzima Fosfolipase. 52

Figura 9 – Macromorfologia das colônias de leveduras do complexo C.

parapsilosis em ágar Eosina Azul de Metileno (EAM). 53

Figura 10 – Variações colorimétricas das colônias do complexo C. parapsilosis. 54

Figura 11 – Gráfico demonstrativo da produção de biofilme pelas cepas de CP -

C. parapsilosis, CO - C. orthopsilosis e CM - C. metapsilosis. 55

Figura 12 – Desenho esquemático do perfil fenotípico de isolados de C.

parapsilosis que exibiram alto grau de virulência por produzir biofilme, enzimas

hidrolíticas e resistência aos azóis. 56

9

LISTA DE ABREVIATURAS

AFLP – Amplification Fragment Lenght Polymorphism

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATCC – American Type Culture Collection

CIM – Concentração Inibitória Mínima

CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético

IEC – Instituto Evandro Chagas

ITS – Espaçador Transcrito Interno

MOPS – Ácido Morfopropileno Sulfônico

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

RAPD – Randomly Amplified Polymorphic DNA

RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

Rpm – Rotações por minuto

RPMI – Roswell Park Memorial Institute

SABMI – Seção de Bacteriologia e Micologia

SADH – secondary alcohol dehydrogenase

SAP – proteinase aspártica secretora

SYA1 – putative alanyltRNA synthetase

TBE – Tampão TRIS-BORATO-EDTA

TE – Tampão TRIS-EDTA

UFC – Unidade Formadora de Colônia

UTI – Unidade de Terapia Intensiva

10

RESUMO

A levedura Candida parapsilosis é um microrganismo emergente com potencial de

patogenicidade para candidíase superficial e sistêmica, elevada taxa de mortalidade e

importante impacto nos serviços de saúde. A heterogeneidade genotípica dos isolados clínicos

identificados como Candida parapsilosis levou à recente designação de três espécies

indistintas morfologicamente, mas com diferenças genotípicas suficientes para formar o

chamado Complexo C. parapsilosis: Candida parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis.

Estas espécies tem demonstrado diferenças epidemiológicas na Europa, Ásia e América

Latina, além de diferenças quanto à fatores de virulência e susceptibilidade aos antifúngicos

sendo recomendável, portanto, a identificação dos patógenos em nível de espécie para

melhorar o manejo das infecções e o adequado emprego da terapia antifúngica. A presente

pesquisa apresentou como escopo a identificação molecular e a descrição de aspectos

bioquímicos e fenotípicos de leveduras do complexo C. parapsilosis recuperadas de culturas

obtidas de diferentes espécimes clínicos de pacientes encaminhados ao Instituto Evandro

Chagas, Ananindeua – Pará, entre 2005 e 2012. Foram utilizados 52 isolados anteriormente

identificados como Candida parapsilosis por técnica semi-automatizada, os quais foram

reidentificados pelo sistema automatizado Vitek®

2. A identificação molecular das espécies

foi por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional utilizando iniciadores espécie-

específicos. Foi realizada prova colorimétrica em meio de cultura ágar Eosina Azul de

Metileno (EAM) como meio de identificação presuntiva. O perfil enzimático das espécies do

complexo C. parapsilosis foi determinado por protocolos que utilizam meios de cultura

específicos para cada enzima pesquisada quanto à sua atividade (Gelatinase, Lipase, Urease,

DNAse, Caseinase, Fosfolipase e Proteinase). Os isolados também foram testados quanto à

formação de biofilme e susceptibilidade aos antifúngicos itraconazol, fluconazol e

anfotericina B. Na reidentificação pelo Vitek®

2, 44/52 (85%) foram identificados como C.

parapsilosis, e 8 (15%) tiveram suas leituras como outras espécies do gênero Candida. Pela

PCR, 44/52 isolados foram identificados como C. parapsilosis, 5/52 (9%) C. orthopsilosis e

3/52 (6%) da espécie C. metapsilosis. As exoenzimas caseinase, urease e gelatinase não foram

secretadas pelas espécies do complexo C. parapsilosis. A exoenzima DNase foi produzida por

4/52 isolados, sendo todos de C. parapsilosis. As exoenzimas proteinase, fosfolipase e lipase

foram produzidas por 48/52, 27/52 e 51/52 dos isolados, respectivamente. Todos os isolados

do complexo C. parapsilosis foram hábeis na produção de biofilme variando na intensidade

deste fator de virulência. No teste de susceptibilidade in vitro aos antifúngicos, 89% dos

isolados de C. parapsilosis apresentaram sensibilidade ao fluconazol, 79% apresentaram

sensibilidade ao itraconazol e 100% foram sensíveis à anfotericina B. As espécies C.

orthopsilosis e C. metapsilosis apresentaram padrão de sensibilidade (100%) para todos os

isolados expostos à ação farmacológica do fluconazol e da anfotericina. Algumas amostras do

complexo demonstraram resistência ao itraconazol e pelo menos uma amostra de cada espécie

apresentou sensibilidade dose dependente a esta droga. Os resultados reforçam a necessidade

de vigilância para monitorar a incidência na região destes patógenos oportunistas.

Palavras-chaves: Complexo C. parapsilosis, Identificação Molecular, Identificação

Bioquímica, Fatores de Virulência.

11

ABSTRACT

The yeast Candida parapsilosis is an emerging pathogenic microorganisms with potential for

superficial and systemic candidiasis, high mortality and significant impact on health services.

The genotypic heterogeneity of clinical isolates identified as Candida parapsilosis led to the

recent appointment of three morphologically indistinguishable species, but with genotypic

differences sufficient to form the called C. parapsilosis Complex: Candida parapsilosis, C.

orthopsilosis and C. metapsilosis. These species have demonstrated epidemiological

differences in Europe, Asia and Latin America, as well as differences in virulence factors and

susceptibility to antifungal agents being recommended, therefore, the identification of

pathogens to the species level to improve the management of infections and the appropriate

use of therapy antifungal. This research presented as the scope the molecular identification

and description of biochemical and phenotypic aspects of yeast C. parapsilosis Complex

recovered from cultures obtained from different clinical specimens from patients referred to

the Institute Evandro Chagas, Ananindeua – Pará, between 2005 and 2012. Were used 52

isolates previously identified as Candida parapsilosis by semi-automated technique, which

were again identified by automated system Vitek®

2. The molecular identification of the

species was by conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) using species-specific

primers. Colorimetric test was carried out on agar plates Eosin Methylene Blue (EMB) as a

means of presumptive identification. The enzyme profile of the C. parapsilosis Complex

species was determined by using protocols specific to each culture media analyzed for its

enzyme activity (Gelatinase, Lipase, Urease, DNase, Caseinase, Phospholipase and

Proteinase). The isolates were also tested for biofilm formation and susceptibility to

antifungal agents itraconazole, fluconazole and amphotericin B. In re-identification by Vitek®

2 of 52 isolates, 44/52 (85%) were identified as C. parapsilosis, and 8 (15%) had their

readings as other species of Candida genus. By technique PCR, 44/52 isolates were identified

as C. parapsilosis, 5/52 (9%) C. orthopsilosis and 3/52 (6%) of the specie C. metapsilosis.

The caseinase exoenzymes, urease and gelatinase were not secreted by species of C.

parapsilosis Complex. DNase exoenzyme was produced by 4/52 isolates, all of C.

parapsilosis. The exoenzymes proteinase, phospholipase and lipase were produced by 48/52,

27/52 and 51/52 of the isolates, respectively. All isolates of the C. parapsilosis Complex were

able to produce biofilm varying the intensity of this virulence fator. In vitro susceptibility

testing to antifungal agents, 89% of C. parapsilosis isolates were susceptible to fluconazole,

79% were susceptible to itraconazole and 100% were susceptible to amphotericin B. The C.

orthopsilosis and C. metapsilosis species has presented the pattern of sensitivity (100%) for

all isolates exposed to pharmacological action of fluconazole and amphotericin B. Some

samples of the Complex were resistant to itraconazole and at least one sample of each species

showed dose-dependent sensitivity to the drug. The results reinforce the need for surveillance

to monitor the incidence of these opportunistic pathogens in the region.

Keywords: C. parapsilosis Complex, Molecular Identification, Identification Biochemistry,

Virulence Factors.

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 HISTÓRICO, PERFIL TAXONÔMICO E MORFOLÓGICO DE Candida

parapsilosis

A espécie Candida parapsilosis foi isolada pela primeira vez em 1928 por Asford, das

fezes diarreicas de um paciente em Porto Rico, sendo primeiramente denominada de Monilia

parapsilosis para distingui-la dos isolados mais frequentes de Monilia psilosis, hoje conhecida

como Candida albicans (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009). No ano de 1932, a espécie foi

reclassificada como Candida parapsilosis, nomenclatura esta utilizada atualmente (Langeron

& Talice, 1932).

No que concerne à classificação taxonômica, de acordo com o sitio oficial de

classificação de fungos, www.speciesfungorum.org, esta levedura pertence ao Reino Fungi,

Filo Ascomycota, Classe Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales, Gênero Candida

(Speciesfungorum, 2014). A classificação em nível de Família para a espécie C. parapsilosis

não foi atribuída até o presente momento, bem como para muitas outras (377 espécies) do

Gênero Candida, como Candida albicans e Candida tropicalis. O último escrutínio

taxonômico para C. parapsilosis ocorreu em 2010 (Catalogue of Life, 2014).

Quanto às características morfológicas, quando cultivada em ágar Sabouraud –

Dextrose e em outros meios micológicos como o ágar Batata, sob temperaturas entre 25ºC e

37ºC dentro de 48 horas (Sidrim & Rocha, 2010), C. parapsilosis exibe colônias com aspecto

variado: coloração de tonalidade branca ou bege, textura cremosa, superfície lisa, sulcada ou

enrugada, aparência brilhante ou opaca (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009; Sidrim &

Rocha, 2010). Na micromorfologia, as células de C. parapsilosis exibem formas ovais,

redondas ou cilíndricas (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009) e diferentemente das espécies

C. albicans e C. tropicalis que podem apresentar-se em múltiplas formas morfogenéticas

(Trofa et al., 2008), C. parapsilosis não forma hifas verdadeiras (Trofa et al., 2008; Nosek et

al., 2009). Esta levedura dimórfica quando cultivada em ágar-fubá (microcultivo em lâmina),

exibe pseudomicélio reto com células alongadas cujas ramificações muito regulares lhes

conferem aspecto de pinhos da floresta, com blastoconídios esféricos ou ovais formados nas

constrições das pseudohifas (Lacaz et al., 2002).

As variações que ocorrem na morfologia celular e das colônias de C. parapsilosis

estão relacionadas com mecanismos moleculares, com sua transição dimórfica e em resposta a

um conjunto de aminoácidos, especialmente citrulina (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009).

13

A patogenicidade de C. parapsilosis é limitada pela pele intacta, uma vez que se trata de

uma levedura comensal da microbiota humana (Trofa et al., 2008; Sidrim & Rocha, 2010). É

uma levedura oportunista com potencial de patogenicidade para candidíase superficial e

sistêmica, apesar de menos comum do que Candida albicans (Lacaz et al., 2002), contudo

tem emergido como patógeno de importante impacto nos serviços de saúde (Trofa et al.,

2008), alavancando diversos estudos para melhor caracterizar este microrganismo.

1.2 O COMPLEXO C. parapsilosis

Até a última década, as pesquisas considerando a frequência do gênero Candida nos

isolados de diferentes sítios corpóreos, além das demais espécies deste gênero, faziam

referência apenas à espécie C. parapsilosis não havendo conhecimento da existência das duas

outras espécies correlatas (Kuhn et al., 2004; Laupland et al., 2005), apesar de Scherer e

Stevens (1987) já terem demonstrado uma heterogeneidade genética em isolados clínicos de

C. parapsilosis através da técnica de RFLP, evidenciando três grupos distintos (Scherer &

Stevens,1987).

Cerca de dez anos após a publicação destes dados e com os avanços no campo da biologia

molecular, uma investigação de 45 amostras, das quais 32 foram provenientes de um surto de

infecção hospitalar em San Antonio – Texas tendo como agente etiológico C. parapsilosis,

revelou a presença de três grupos distintos entre os isolados clínicos identificados como C.

parapsilosis. A distinção foi estabelecida com base nos perfis de isoenzimas (Figura 1) e

através da análise da região 5,8S do DNA ribossomal e de suas regiões adjacentes ITS1

(espaçador transcrito interno) e ITS2. Os grupos foram então denominados como Grupo I,

Grupo II e Grupo III. Assim, a heterogeneidade genotípica dos isolados de C. parapsilosis

evidenciava diferenças suficientes para caracterizar duas novas espécies (Lin et al., 1995).

14

Figura 1 - Perfis de isoenzimas definindo três grupos distintos de C.

parapsilosis: Linhas 1 a 4 – Grupo I; linhas 5 a 8 – Grupo II; linhas 9 e 10 –

Grupo III. EST (esterase), SOD (superóxido dismutase), GDH (glicose 6-fosfato

desidrogenase), MDH (malato desidrogenase), CAT (catalase), ACP (fosfatase

ácida), β-Glu (β-glicosidase) (Lin et al., 1995).

15

Outros estudos confirmaram a existência de diferenças entre os subgrupos de C.

parapsilosis assinalando a possibilidade da designação de duas novas espécies (Roy &

Meyer,1998; Kato et al., 2001).

Finalmente, os estudos de Tavanti et al. (2005), utilizando 32 isolados de diversos

sítios (unhas, vagina, boca, mãos, sangue, cateter, válvula aórtica, entre outros) originados de

várias regiões do mundo (Reino Unido, Coréia, Portugal, Espanha, Estados Unidos, entre

outras) e submetidos à técnica molecular RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic

DNA – Reação em Cadeia da Polimerase) com o primer RPO2 (Figura 2) atestaram

importante nível de diferenças genotípicas dos isolados de C. parapsilosis. A PCR também

foi utilizada para amplificar fragmentos de DNA presentes somente no grupo I, nos grupos I e

II, nos grupos I e III e presentes nos três grupos totalizando dez genes que foram

posteriormente sequenciados. Adicionalmente, foram realizadas análises das sequências das

regiões ITS, ITS2 e das regiões variáveis D1 e D2 do rRNA. O elevado polimorfismo na

região ITS1 dos grupos, não justificava a continuidade da designação como subespécies e

validaram a separação dos grupos de C. parapsilosis I a III de outras espécies de leveduras,

possibilitando a designação formal de três espécies distintas. Com isso, a denominação

Candida parapsilosis ficou reservada para o Grupo I e foram propostas duas novas espécies,

Candida orthopsilosis (Grupo II) e Candida metapsilosis (Grupo III) (Tavanti et al., 2005).

As denominações anteriores por grupos foram substituídas surgindo, portanto, o que

tem sido denominado pelos pesquisadores de Complexo C. parapsilosis (Lockhart et al.,

2008; Chen et al., 2010; Sabino et al., 2011; Sai et al., 2011; Bonfietti et al., 2012; Feng et

al., 2012), Complexo Psilosis (Nosek et al., 2009; Bertini et al., 2013), Grupo Psilosis

(Vercher et al., 2011) e Família C. parapsilosis (Sabino et al., 2010). Para esta perquisa, o

termo adotado para referenciar as três espécies foi Complexo C. parapsilosis.

Para fazer referência quanto à espécie C. parapsilosis propriamente dita, no presente

estudo será utilizada a denominação C. parapsilosis (stricto sensu) tais quais alguns estudos

na literatura (van Asbeck et al., 2008; Sabino et al., 2010; Garcia-Effron et al., 2011; Feng et

al., 2012; Peman et al., 2012). Para mencionar a espécie C. parapsilosis antes da separação

das três espécies será utilizado nesta pesquisa o termo C. parapsilosis (lato sensu).

16

1.2.1 Candida parapsilosis

C. parapsilosis foi a primeira espécie do complexo a ser descrita (Langeron & Talice,

1932). Anteriormente conhecida como Grupo I (Lin et al., 1995), tem sido denominada por

alguns autores como C. parapsilosis stricto sensu (van Asbeck et al., 2008; Sabino et al.,

2010; De Toro et al., 2011; Garcia-Effron et al., 2011; Feng et al., 2012; Peman et al., 2012;

Souza et al., 2012) indicando a diferenciação das demais espécies do complexo.

Pelas características morfológicas é indistinguível das espécies C. orthopsilosis e C.

metapsilosis (Figura 3), sendo possível diferenciá-las somente com base nas características

genotípicas (Tavanti et al., 2005). A cepa de referência de C. parapsilosis é a ATCC 22019.

Figura 2 – Padrões RAPD produzidos para amostras de C.

parapsilosis. Linhas 1 e 2, perfis RAPD obtidos para C. parapsilosis

Grupo I (A); Linhas 3 a 11, C. parapsilosis Grupo II (B1 a B4);

Linhas 12 e 13, C. parapsilosis Grupo III (C); M, ladder 100pb

(Tavanti et al., 2005).

17

1.2.2 Candida orthopsilosis (Tavanti et al., 2005)

A nova espécie C. orthopsilosis outrora conhecida como C. parapsilosis grupo II, é

morfologicamente indistinguível das espécies C. parapsilosis e C. metapsilosis. A

diferenciação dá-se com base nas seguintes características de nucleotídeos, dado o gene, a

posição do nucleotídeo no gene e o nucleotídeo fixado em C. orthopsilosis: SYA1 (putative

alanyltRNA synthetase), 101, C; 299, T; e 311, T; e SADH (secondary alcohol

dehydrogenase), 10, A; 28, C; 58, T; 76, T; 128, T; 149, A; 170, A; 197, T; 260, T; 275, T;

341, A, 350 A; 422, T; 431, G; 512, G; 518, C, e 524, G. O holótipo ( cepa ATCC 96139) foi

originalmente isolado do surto em San Antonio, a partir da ponta de um catéter utilizado para

monitorar a pressão venosa central, e tem todas as referidas características.

A denominação orthopsilosis indica afinidade com C. parapsilosis e C. metapsilosis.

1.2.3 Candida metapsilosis (Tavanti et al., 2005)

Designada anteriormente como C. parapsilosis grupo III, a nova espécie C.

metapsilosis também não pode ser distinguida morfologicamente das duas outras do

complexo Psilosis. A espécie é diagnosticada pelas características baseadas em DNA, dada a

posição de nucleotídeos e de base específica para C. metapsilosis: SYA1 (putative alanyltRNA

synthetase), 101, T; 299, C; e 311, A; e SADH (secondary alcohol dehydrogenase), 10, G; 28,

T; 58, A; 76, A; 128, C; 149, T; 170, G; 197, C; 260 C; 275, G; 341, T; 350, G; 422, C; 431,

C; 512, A; 518, A; e 524, T. A Estirpe holótipo (ATCC 96144) tem todas as características

citadas. Foi originalmente isolada a partir de uma amostra de mão, em Tacoma, Washington.

A designação metapsilosis indica afinidade com C. parapsilosis e C. orthopsilosis. Os

autores abstiveram-se de propor nomes de espécies mais individualizados em virtude do

reconhecimento da indistinguibilidade fenotípica das três espécies nos testes utilizados,

optando pelos prefixos "orto" (originalmente significando "certo” ou correto”) e "meta"

(originalmente significando "com" ou "pós"), juntamente com "para" usados por químicos

para apontar diferentes posições no mesmo anel de seis membros.

18

Figura 3 – Macromorfologia do Complexo C. parapsilosis: a) Candida parapsilosis,

amostra IEC 9; b) Candida parapsilosis, amostra IEC 12CT; c) Candida orthopsilosis,

amostra IEC 237; d) Candida orthopsilosis, amostra IEC 276; e) Candida metapsilosis,

amostra IEC 114; f) Candida metapsilosis, amostra IEC 171; Semeio em ágar Batata e

incubação por 48 h a 30ºC. Laboratório de Micologia – IEC, 2014.

19

1.3 EPIDEMIOLOGIA DAS ESPÉCIES DO COMPLEXO C. parapsilosis

A levedura C. parapsilosis é um microrganismo ubíquo e contrastando com outras

espécies de Candida, não é um patógeno humano obrigatório, ocorrendo relatos inclusive do

isolamento a partir de fontes não humanas como animais domésticos, insetos, solo, plantas e

ambientes marinhos (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009; van Asbeck, et al., 2009).

Em se tratando do ambiente hospitalar, a epidemiologia de C. parapsilosis apresenta

singularidade uma vez que tem sido frequentemente isolada de superfícies físicas (van Asbeck

et al. (2009).

A incidência de fungemias por C. parapsilosis tem aumentado dramaticamente (Trofa

et al., 2008; Pemán, et al., 2012) sendo a segunda espécie de fungos oportunistas mais

comumente isolada de hemoculturas de várias áreas geográficas de acordo com Trofa et al.

(2008). Na Europa tem ocorrido uma mudança na epidemiologia das doenças fúngicas

invasivas com significativo aumento de infecções causadas por espécies não-albicans dentre

as quais C. parapsilosis (Lass-Flörl, 2009).

Um estudo de vigilância conduzido no Canadá por um período de cinco anos

evidenciou C. parapsilosis (lato sensu) como terceira espécie mais prevalente nas

candidemias invasivas (Laupland et al., 2005).

Na América Latina, poucos estudos têm sido conduzidos (Nucci et al., 2010;

Sifuentes-Osornio et al., 2012), sendo cogitado por Nucci et al. (2010) que a alta incidência

de candidíases por C. parapsilosis revelada nas pesquisas realizadas nos países latino-

americanos pode ser devida a um misto de fatores, dentre os quais, diferenças dos recursos

disponíveis para atendimento médico e programas de treinamentos, dificuldades na

implementação de programas de controle de infecção em hospitais de países emergentes, um

número limitado de profissionais de saúde disponíveis para assistência aos pacientes em

Unidade de Terapia Intensiva (UTI), e o uso empírico e profilático de drogas antifúngicas.

No Brasil são raros os estudos com Candida não-albicans, especialmente C.

parapsilosis. Segundo Colombo et al. (2006), a incidência de candidemia em hospitais

terciários é em grande parte desconhecida, e não há dados nacionais disponíveis, sendo as

pesquisas relacionadas a estudos observacionais em número limitado de centros médicos e

revisões retrospectivas. A predominância de C. parapsilosis foi demonstrada num estudo

multicêntrico nos anos de 2003 e 2004 em 11 centros médicos de nove cidades brasileiras

constatando-se que C. parapsilosis (lato sensu) representou a terceira espécie predominante

20

entre os casos, sendo a segunda causa de infecção nos casos pediátricos (Colombo et al.,

2006).

Em três estudos regionais brasileiros com pacientes provenientes dos Estados de

Pernambuco, Mato Grosso e São Paulo, C. parapsilosis (lato sensu) figurou como a segunda

espécie mais prevalente (Macêdo et al., 2009; Bruder-Nascimento et al., 2010; Favalessa et

al., 2010).

Após o reconhecimento formal das espécies do complexo C. parapsilosis, C.

parapsilosis (stricto sensu) tem emergido como um importante agente patogênico responsável

por infecções hospitalares, sendo a segunda causa mais comum de espécies de Candida

isoladas de infecções invasivas (Bonfietti et al., 2012; Feng et al., 2012).

Em pesquisa brasileira conduzida por Bonfietti et al. (2012), das 37 amostras

inicialmente classificadas como C. parapsilosis, após análise molecular pela técnica RFLP-

PCR usando a enzima de restrição BanI, 34 foram caracterizadas como C. parapsilosis, e 3

isolados foram reclassificados como C. orthopsilosis, não havendo ocorrência de C.

metapsilosis. Este resultado é similar ao encontrado num estudo multicêntrico de vigilância

realizado na Espanha, no qual a espécie C. parapsilosis foi a segunda mais predominante e C.

orthopsilosis foi a quinta espécie mais isolada dos espécimes clínicos (Pemán et al., 2012).

Uma coleção de 122 isolados de C. parapsilosis de um hospital universitário na

Espanha foi submetido à identificação molecular pela técnica RAPD com o primer RPO2 e

digestão do fragmento do gene SADH com a endonuclease BanI, sendo 91% classificados

como C. parapsilosis (stricto sensu), 8,2% das cepas reclassificadas como C. orthopsilosis e

0,8% como C. metapsilosis (de Toro et al., 2011).

Em estudo com isolados do Brasil e Espanha caracterizados por PCR em tempo real,

50 isolados foram classificados como C. parapsilosis (stricto sensu), 40 como C.

orthopsilosis e 10 como C. metapsilosis. A amostragem expressiva desta pesquisa valida a

espécie C. parapsilosis como a mais predominante do complexo C. parapsilosis (Souza et al.,

2012).

De fato, C. metapsilosis tem sido relatada como a espécie mais raramente recuperada a

partir de amostras clínicas (de Toro et al., 2011), além de que a prevalência de C. parapsilosis

em detrimento de C. orthopsilosis e C. metapsilosis já havia sido documentada ainda quando

designadas as espécies como grupos I, II, e III, respectivamente, sendo cogitado pelos autores

que a proeminência do grupo I seria devido à sua alta estabilidade no ambiente (Lin et al.,

1995).

21

Tais resultados parecem demonstrar que existem diferenças na epidemiologia das

fungemias pelos agentes do complexo C. parapsilosis, entre as diferentes áreas geográficas,

ressaltando-se a necessidade de vigilância contínua para monitorar tendências na incidência,

distribuição geográfica das espécies, e perfis de susceptibilidade aos antifúngicos (Colombo et

al., 2006).

1.4 FATORES DE RISCO

Na medicina contemporânea, as leveduras do gênero Candida denotam grande

importância devido à alta capacidade de colonizar e infectar o hospedeiro humano. Como

microrganismos comensais do homem, os fungos tornam-se patogênicos quando existem

mudanças nos mecanismos imunes do hospedeiro ou quando as barreiras anatômicas

secundárias estão comprometidas ou na ocorrência de procedimento médico invasivo

(Colombo et al., 2013).

Considerando os pacientes hospitalizados, as leveduras em questão são uma real

ameaça tendo as mãos dos trabalhadores de saúde como vetor para a aquisição de infecções

exógenas, e devido ao fato da inexecução dos protocolos de lavagem das mãos (Bonassoli et

al., 2005; Trofa et al., 2008). A pesquisa de um surto de candidíase em uma UTI neonatal

permitiu a identificação de dois genótipos principais de C. parapsilosis como a causa do surto

e como resultado de infecção cruzada com as mãos dos trabalhadores da saúde, evidenciando

a gravidade das consequências do descumprimento dos procedimentos de higiene das mãos

pela equipe de saúde (Hernández-Castro et al., 2010). Estudo regional brasileiro constatou

que C. parapsilosis foi a levedura mais frequentemente isolada (51%) das mãos de pessoas

saudáveis, incluindo os trabalhadores da unidade de terapia intensiva neonatal, aumentando

para os pacientes assistidos o risco de desenvolvimento de uma doença invasiva (Bonassoli et

al., 2005).

A doença invasiva causada por C. parapsilosis pode ocorrer sem a colonização prévia

e é frequentemente transmitida horizontalmente através de fontes externas contaminadas

(Trofa et al., 2008), sendo relatado por diversos autores os seguintes fatores de risco: o uso de

dispositivos, próteses e cateteres venosos centrais, uso de nutrição parenteral, internação em

UTI com necessidade para a admissão ou ventilação mecânica prolongada (Bonassoli et al.,

2005; Laupland et al., 2005; Trofa et al., 2008; Pappas et al., 2009; Sifuentes-Osornio et al.,

2012).

22

Quanto aos grupos mais suscetíveis tem sido descrito que neonatos, pacientes

imunocomprometidos, transplantados, queimados, neutropênicos, submetidos a

procedimentos cirúrgicos, pacientes em condições subjacentes e/ou diagnósticos tais como

hemodiálise, diabetes mellitus, neoplasias malignas, doenças do fígado e hematológicas, tem

risco aumentado para a ocorrência de fungemias de um modo geral (Laupland et al., 2005;

Trofa et al., 2008; Pappas et al., 2009), e no que concerne à C. parapsilosis como agente

patogênico, destacam-se como fatores de risco o uso de cateteres venosos, pacientes

recebendo nutrição parenteral total e neonatos de muito baixo peso (Kuhn et al., 2004;

Bonassoli et al., 2005; Trofa et al., 2008; Butler et al., 2009; Sifuentes-Osornio et al., 2012).

O uso de algumas terapias medicamentosas como antimicrobianos de espectro

estendido, terapia imunossupressora, uso de esteróides e bloqueadores H2 também tem sido

associados com risco de candidíases invasivas (Laupland et al., 2005; Lass-Flörl, 2009).

1.5 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

Conforme relatado anteriormente, C. parapsilosis é a segunda causa mais comum de

espécies de Candida isoladas de pacientes com infecções invasivas tais como fungemia e

endocardite (Trofa et al., 2008; Feng et al., 2012).

Outras graves manifestações clínicas relacionadas à C. parapsilosis são: meningite,

peritonite, artrite, infecção ocular, otomicose, onicomicose e infecções do trato urinário (Trofa

et al., 2008; Pappas et al., 2009; Bruder-Nascimento et al., 2010; Aguado et al., 2011). Chen

et al. (2012) pesquisando infecções fúngicas invasivas em paciente chineses com lúpus

eritematoso sistêmico constataram que um dos 18 casos estudados teve C. parapsilosis como

agente patogênico. Também relacionado a pacientes imunocomprometidos, no Brasil foi

relatado um caso raro de paciente com espondilodiscite causada por C. parapsilosis (Valiengo

et al., 2007).

A candidíase superficial é outra forma clínica comumente encontrada na prática

clínica, apresentando-se com os tipos clínicos: cutânea, das mucosas (oral, vulvovaginal, ou

balanoprepucial), mucocutânea, crônica e granulomatosa (Feng et al., 2012).

Uma destas manifestações clínicas superficiais, a candidíase vaginal, foi utilizada

como modelo num estudo experimental para avaliar comparativamente a capacidade in vivo

de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis para colonizar e causar uma infecção

sintomática. Os resultados demostraram que as espécies do complexo C. parapsilosis são

23

hábeis em induzir vaginite em ratas tratadas com estrogênio, ocorrendo, todavia, menor

patogenicidade com a espécie C. metapsilosis (Bertini et al., 2013).

A elevação do número de casos de micoses sistêmicas em diversos grupos de

pacientes tem despertado grande interesse da comunidade científica e profissionais de saúde

(Sidrim & Rocha, 2010), especialmente porque a candidíase invasiva tem maior impacto na

evolução do paciente, sendo estimado que a mortalidade atribuível da infecção invasiva seja

elevada, em torno de 47%, apesar das autoridades estimarem a mortalidade atribuível entre

15% a 25% para adultos e de 10% a 15% para neonatos (Pappas et al., 2009). As taxas de

mortalidade relatadas para C. parapsilosis variam entre 4% e 70% (Trofa et al., 2008;

Bonfietti et al., 2012; Sifuentes-Osornio et al., 2012).

No Brasil, os dados de um estudo multicêntrico no qual C. parapsilosis (lato sensu) foi

a segunda espécie não-albicans mais predominante, revelou que as candidemias são

importantes causas de morbidade, com uma substancial carga de doenças, mortalidade e

provavelmente elevando os custos associados (Colombo et al., 2006).

1.6 FATORES DE VIRULÊNCIA

As doenças invasivas têm sua patogênese facilitada por fatores de virulência, dos quais

pouco se conhece em se tratando de C. parapsilosis (Trofa et al., 2008). Quanto às demais

espécies do complexo C. parapsilosis, mais limitados são os dados sobre os determinantes de

virulência (Bertini et al., 2013), logo, este é um desafiador campo de pesquisa para melhorar o

diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças causada por C. parapsilosis, C. orthopsilosis

e C. metapsilosis.

1.6.1 Formação de Biofilme

Biofilmes são definidos como comunidades de microrganismos (Figura 4) e seus

produtos extracelulares (matriz adesiva protetora) associados em uma interface e, tipicamente,

ligados a uma superfície abiótica ou biótica. A colonização de superfícies pode permitir que

os microrganismos invadam células das mucosas, alterem o fluxo de cálcio nas células

epiteliais e liberem toxinas (Davey & O’Toole, 2000).

24

O passo inicial para C. parapsilosis no processo patogênico é a sua adesão às zonas

superficiais do hospedeiro (Lacaz et al., 2002; Kuhn et al., 2004; Trofa et al., 2008; Bertini et

al., 2013; Costa et al., 2013) e esta aderência a dispositivos médicos de longa duração, tais

como cateteres venosos e arteriais, válvulas cardíacas, dentre outros, facilita a formação de

biofilme (Trofa et al., 2008) e consequentes infecções fúngicas (Tavanti et al., 2010;

Sifuentes-Osornio et al., 2012). A ótima capacidade de adesão destes patógenos recuperados

de urina e sangue pode ainda facilitar a invasão ao sistema nervoso central ou estabelecer

infecção do trato urinário considerando o movimento destes fluidos (Bliss et al., 2012).

A habilidade de C. parapsilosis (lato sensu) para a formação de biofilme foi avaliada

em isolados da corrente sanguínea e da pele. A diferença estatisticamente significante na

positividade de biofilme nos isolados do sangue (59%) e da pele (19%) sugere que este fator

de virulência tem um importante papel no desenvolvimento de infecções de corrente

sanguínea (Ruzicka et al., 2007). Por outro lado, não foram encontradas diferenças

significativas quando comparada a formação de biofilme entre isolados de sangue e de outros

sítios, ao serem analisadas 122 amostras com positividade de 58,8% de produção de biofilme

por C. parapsilosis (de Toro et al., 2011).

Outra pesquisa com C. parapsilosis (lato sensu), constatou que biofilmes foram

produzidos por todos os isolados quando cultivados em uma solução contendo glicose

(Bonassoli et al., 2005). A capacidade das espécies de Candida para produzir biofilmes in

Figura 4 – Imagem de microscopia eletrônica de varredura

mostrando a arquitetura do biofilme de Candida parapsilosis em

filtros microporosos de policarbonato (diâmetro de 25 mm;

tamanho dos poros, 12 µm; Millipore) (Samaranayake et al,

2005).

25

vitro pode refletir o seu potencial para causar fungemias relacionadas com cateteres venosos

centrais em doentes que receberam nutrição parenteral total (Kuhn et al., 2004; Bonassoli et

al., 2005).

A capacidade de isolados clínicos das espécies do complexo C. parapsilosis em

formar biofilme foi averiguada por Lattif et al. (2010) sendo constatado que as três espécies

foram hábeis em formar biofilmes com topografia de superfície e arquitetura semelhantes.

Este estudo contrasta com os resultados de uma pesquisa posterior que comprovou que C.

parapsilosis (stricto sensu) foi a única espécie capaz de formar biofilmes (65 de 111

amostras), enquanto que nenhum dos 10 isolados de C. orthopsilosis nem o único isolado de

C. metapsilosis foram hábeis em produzir biofilme in vitro (de Toro et al., 2011).

Outra pesquisa avaliou se a produção de biofilme por espécimes clínicos de C.

parapsilosis (stricto sensu) seria influenciada pela temperatura (30ºC e 37ºC), considerando

que esta levedura é capaz de colonizar sítios anatômicos com temperaturas centrais diferentes.

Os resultados obtidos indicaram que este parâmetro não afeta significativamente a capacidade

de formação de biofilme in vitro, com pequenas diferenças na quantidade de matriz

extracelular produzida em diferentes temperaturas (Tavanti et al., 2010).

A detecção para a habilidade na formação de biofilme é importante para o prognóstico

da infecção, uma vez que a sua presença no foco de infecção geralmente caracteriza

cronicidade (Ruzicka et al., 2007).

Este fator de virulência torna-se importante ainda, na medida em que confere

resistência significativa aos fármacos antifúngicos limitando a penetração de substâncias

através da matriz e protegendo a célula a partir das respostas imune do hospedeiro (de Toro et

al., 2011). Os microrganismos em biofilmes também se tornam mais resistentes ao tratamento

do que aqueles na forma planctônica, ou seja, circulando livremente (Bonassoli et al., 2005;

Ruzicka et al., 2007).

Considerando a relevância clínica dos biofilmes, torna-se necessário ampliar os

conhecimentos sobre os mecanismos moleculares que levam a produção dos mesmos, assim

como a regulação genética e expressão de fatores genômicos que poderiam conduzir às

estratégias para impedir ou reduzir sua formação (Pasternak, 2009).

26

1.6.2 Secreção de Enzimas

As enzimas extracelulares secretadas por patógenos microbianos têm adquirido

atenção significativa por seu potencial papel na patogênese e como possível alvo para o

desenho de inibidores sintéticos para tratar a infecção, segundo Trofa et al. (2008), os quais

mencionam o papel de três enzimas secretadas por C. parapsilosis: proteinase aspártica

secretora (SAP), fosfolipases e lipases.

Em pesquisa analisando 26 isolados de C. parapsilosis recuperados da pele de

indivíduos, foi averiguado que todos foram produtores de proteinases (Bonassoli et al., 2005).

Similarmente, em um estudo brasileiro com espécimes de pacientes imunocomprometidos do

Estado de Pernambuco, cinco dos seis isolados de C. parapsilosis (secreção traqueal, lavado

brônquico, tecido ósseo e pele) foram produtores de proteases (Macêdo et al., 2009). Todavia,

Kuhn et al. (2004) investigando um surto de C. parapsilosis (lato sensu) concluíram em seus

resultados que a expressão de SAP não foi fator crítico para este agente patogênico.

As espécies do complexo C. parapsilosis, pesquisadas na ocasião como grupos I, II e

III, foram caracterizados por diferenças na atividade de proteinase com a maioria do grupo I

(hoje designada como C. parapsilosis) sendo moderadamente ou fortes produtores de

proteinases. Para os grupos II (C. orthopsilosis) e III (C. metapsilosis) Lin et al., (1995)

recomendaram mais estudos com isolados clínicos para confirmar a característica de baixa

atividade de SAPs (Lin et al., 1995).

Quando esta característica fenotípica foi analisada por Tavanti et al., (2010)

exclusivamente para C. parapsilosis (stricto sensu), observou-se que a maioria dos isolados

(66,1%) produziu SAP in vitro. Curiosamente neste estudo, foi constatada uma correlação

inversa estatisticamente significativa entre a atividade proteolítica e a capacidade de produção

de biofilme. A existência de uma nova via, controlaria a formação de biofilme mediada por

proteínas em que diferentes reguladores globais modulariam a formação de biofilmes pelo

controle da expressão de proteases extracelulares de Staphylococcus aureus. A correlação

inversa observada aliada ao conhecimento dessa nova via, pode indicar que o impacto

negativo de proteases extracelulares na formação do biofilme é multifatorial, podendo

promover desprendimento e liberação de um biofilme maduro, via degradação de adesinas de

C. parapsilosis e / ou componentes da matriz extracelular (Tavanti et al., 2010).

Quanto às fosfolipases, o papel na patogênese de C. parapsilosis não está bem

esclarecido. Estas enzimas são capazes de hidrolisar uma ou mais ligações éster em

glicerofosfolipídeos e os resultados para as investigações de atividade fosfolipásica de C.

27

parapsilosis são contraditórios podendo justificar-se pelo número relativamente pequeno das

amostras, bem como às diferenças biológicas entre as cepas testadas nos estudos investigados

na revisão sistemática realizada por Trofa et al. (2008).

Em relação às lipases, suas funções incluem a digestão de lipídeos para a aquisição de

nutrientes, adesão às células e tecidos do hospedeiro, interações sinérgicas com outras

enzimas, hidrólise inespecífica devido a outras atividades fosfolipolíticas, iniciação do

processo inflamatório por afetar as células do sistema imunológico e autodefesa mediada pela

lise da microbiota concorrente (Trofa et al.,2008).

Os genes CpLIP1 e CpLIP2 tem sido vinculados à patogênese das infecções fúngicas

especialmente em se tratando de pacientes recém-nascidos com muito baixo peso e pacientes

recebendo nutrição parenteral rica em lipídios totais. A expressão destes genes poderia

explicar o crescimento tardio de organismos em meio com azeite de oliva ou in vivo (Trofa et

al., 2008). As lipases parecem ser necessárias para a proliferação ótima de C. parapsilosis em

soluções lipídicas, sendo consideradas como fatores de colonização nesse ambiente rico em

gordura (Gácser et al., 2007). O gene CpLIP2 e o seu produto enzimático (lipases) são alvos

potenciais para o desenvolvimento de drogas antifúngicas, particularmente para pacientes

recebendo emulsões lipídicas (Gácser et al., 2007; Trofa et al., 2008).

Para a produção de gelatinase, poucos estudos são encontrados, mas pelo menos para o

microrganismo Enterococcus faecalis a atividade da gelatinase foi demonstrada por Park et al.

(2007) como importante fator de virulência, pois esta enzima degradou um peptídeo

antimicrobiano induzível (Gm cecropina), conhecido por desempenhar um papel crítico na

defesa do hospedeiro durante a fase inicial da infecção microbiana. A gelatinase de E. faecalis

também inibiu a opsonização e a formação do complexo de ataque à membrana resultante da

ativação da cascata do complemento, por hidrolisar o componente C3a do complemento (Park

et al., 2007)

A atividade de outra enzima, a ectofosfatase, foi averiguada por Bertini et al. (2013),

considerando a relação desta enzima com propriedades de adesão da espécie C. parapsilosis.

Os resultados obtidos no estudo demonstraram que C. parapsilosis e C.

orthopsilosis tiveram capacidade de aderência similar em detrimento de C. metapsilosis com

reduzida capacidade de invadir e alterar a estrutura das células epiteliais bucais humanas

testadas. A habilidade de adesão às células do hospedeiro como fator de virulência, entretanto,

não demonstrou correlação significativa com os níveis da enzima ectofosfatase encontrada

para as três espécies do complexo C. Parapsilosis (Bertini et al., 2013).

28

1.7 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS INFECÇÕES POR ESPÉCIES DE

Candida

A rápida identificação de agentes causadores de doenças infecciosas é de extrema

importância para o uso de terapia adequada. A identificação de espécies do gênero Candida

por métodos convencionais muitas vezes é difícil e frequentemente inconclusiva (Junior et al.,

2010).

Sistemas automatizados ou semi-automatizados e cromogênicos ainda são usados para

identificação de leveduras, e baseiam-se na capacidade assimilativa de substratos bioquímicos

e enzimáticos. A realização do método e interpretação dos resultados são fáceis e em menor

tempo, porém com algumas limitações que prejudicam o entendimento de peculiaridades

clínicas e epidemiológicas, como também a diferenciação da terapia adequada a cada espécie

de importância médica deste gênero (Silva & Candido, 2005; Chagas-Neto et al., 2008).

Os métodos disponíveis para a identificação de espécies de Candida são numerosos e

a escolha de um deles é determinada pelo nível de identificação requerida, aspectos clínicos,

número total de amostras examinadas rotineiramente e recursos disponíveis no laboratório

(Williams & Lewis, 2000). O diagnóstico pode ser realizado por meio de técnicas fenotípicas,

moleculares e sorológicas.

Para se chegar à identificação em nível de espécie, podem ser utilizadas primeiramente

metodologias de identificação presuntiva, baseadas nas características fenotípicas (prova do

tubo germinativo e a prova da filamentação em ágar fubá acrescido de tween 80) e por meio

da utilização de meios de cultura cromogênicos e/ou diferenciais (Sidrim & Rocha, 2010). O

meio de cultura CHROMagar®

se baseia na utilização do substrato β-glicosaminidase e

diferencia as leveduras do gênero Candida de acordo com as características morfológicas e de

coloração das colônias crescidas (de Col et al., 2009). Tais resultados presuntivos neste meio

tem demonstrado serem úteis para diferenciar apenas a espécie C. parapsilosis (lato sensu)

das demais espécies do gênero Candida (Araujo et al., 2005; de Col et al., 2009; Mímica et

al., 2009) não sendo, todavia, eficaz na distinção das espécies do complexo C. parapsilosis.

Outro meio cromogênico utilizado é o meio ágar Eosina Azul de Metileno (EAM), um

meio diferencial utilizado para o isolamento e detecção de bactérias da família

Enterobacteriaceae ou bacilos coliformes relacionados, com base na fermentação de lactose

(Koneman et al., 2008). Com o objetivo de identificar presuntivamente leveduras com base

nas propriedades tintoriais exibidas pelo crescimento das colônias sob este meio, foram

29

realizados estudos para algumas espécies do gênero Candida como Candida glabrata (Bale et

al.,1997) e Candida kefyr (Munson et al., 2002), contudo, para as espécies do complexo C.

parapsilosis, a literatura ainda não dispõe de dados sobre a utilização deste meio, o qual pode

ser um recurso laboratorial eficaz para diferenciar morfologicamente as espécies.

1.7.1 Identificação Molecular

A detecção precoce da infecção tem grande impacto sobre o quadro clínico, por isso,

atualmente, o uso de métodos moleculares está sendo utilizado extensivamente para

identificação de microrganismos (Turenne et al., 1999). Alguns autores sugerem que a

avaliação de sequências de nucleotídeos, pode ser um método preciso para resolver problemas

taxonômicos gerados por identificação inconsistente de espécies fúngicas crípticas (Chagas-

Neto et al., 2008; Colombo et al., 2011).

Várias técnicas moleculares têm sido empregadas confirmando a diferenciação das

espécies do complexo, tais como: Polimorfismo de Comprimento de Fragmento

Amplificado (Amplification Fragment Lenght Polymorphism – AFLP) (Tavanti et al., 2007;

2010), marcadores polimórficos de microssatélites (Sabino et al., 2010; Romeo et al., 2012),

Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (Randomly Amplified Polymorphic DNA –

RAPD) (van Asbeck et al., 2008; Hernández-Castro et al., 2010; de Toro et al., 2011),

seqüenciamento de genes ribossomais (Chen et al., 2010), Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR) baseada em análise de endonuclease de restrição (PCR-REA) (Garcia-Effron et al.,

2011); multiplex PCR em tempo real usando sondas moleculares específicas (Garcia-Effron et

al., 2011), PCR em tempo real (Hays et al., 2011; Souza et al., 2012) e também tem sido

utilizada a sequência do gene SADH e das suas regiões ITS (espaçador interno transcrito)

analisadas por PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Mirhendi et al.,

2010).

Adicionalmente, García Martínez et al. (2010) desenvolveram primers para a espécie

C. parapsilosis e posteriormente os primers para C. orthopsilosis e C. metapsilosis foram

desenvolvidos por Vercher et al. (2011) facilitando, portanto, a identificação das espécies do

complexo C. parapsilosis pela amplificação de um fragmento do intron do gene RPSO.

1.7.2 Identificação Bioquímica

Estes sistemas baseiam-se na capacidade de assimilação de diferentes compostos,

principalmente os carboidratos, destacando como os mais utilizados os sistemas manuais API

30

20C®

(bioMérieux, França) e o ID 32C®

(bioMérieux, França); e o sistema automatizado

VITEK®

2 (bioMérieux, França). As metodologias tradicionais são laboriosas e consomem

muito tempo. Com o aumento da susceptibilidade de diferentes espécies de leveduras, a

identificação rápida torna-se clinicamente importante (Verweij, 1999).

O VITEK®

2 é um sistema de identificação microbiológica automatizado,

apresentando três formatos (VITEK 2 compact, VITEK 2 e VITEK 2 XL) com todos os

passos necessários para executar teste de identificação e susceptibilidade, oferecendo maior

segurança e resultados mais rápidos. As placas contêm 64 poços com substratos, sendo 46

testes bioquímicos que avaliam a utilização de fonte de carbono, as atividades enzimáticas e

perfil de resistência e sensibilidade a drogas. Os cartões têm códigos de barras que contêm

informações sobre o tipo de produto, número do lote, data de validade e um identificador

exclusivo que pode ser ligado à amostra antes ou depois de carregar o cartão no sistema,

conforme informações do fabricante (bioMérieux, França).

1.8 SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS

O tratamento terapêutico das candidíases invasivas inclui a retirada de quaisquer

corpos estranhos removíveis e a administração de um antifúngico sistêmico (Trofa et al.,

2008; Pappas et al., 2009; Aguado et al., 2011).

A terapia farmacológica para candidíase compreende as seguintes classes de agentes

antifúngicos: polienos (anfotericina B nas formulações: desoxicolato, em complexo lipídico e

em dispersão coloidal), triazólicos (fluconazol, itraconazol, voriconazol, e posaconazol),

equinocandinas (caspofungina, anidulafungina e micafungina), e o fármaco flucitosina

(Pfaller et al, 2004; Pappas et al., 2009). A flucitosina ou fluocitosina não tem registro na

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), portanto não faz parte do arsenal

farmacoterapêutico do Brasil, até o presente momento. As demais drogas citadas têm registro

nesta agência reguladora, das quais o registro mais recente foi o concedido ao posaconazol em

outubro de 2011 (ANVISA).

Embora a suscetibilidade de Candida aos agentes antifúngicos atualmente disponíveis

geralmente seja previsível se a espécie infectante for conhecida, os isolados individuais em

geral não necessariamente seguem este padrão, evidenciando, portanto a relevância clínica

dos testes de susceptibilidade para orientar a conduta terapêutica, especialmente em situações

em que ocorre falta de resposta à terapia antifúngica inicial ou na suspeita de resistência

antifúngica aos azólicos (Pappas et al., 2009).

31

O Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tem empreendido constantes

esforços para desenvolver testes de susceptibilidade de leveduras, padronizados, reprodutíveis

e clinicamente relevantes e tem disponibilizado através de sua metodologia M27-A3, testes de

susceptibilidade das espécies de Candida ao fluconazol, itraconazol, voriconazol, flucitosina,

e às equinocandinas (Pappas et al., 2009; Jenkins, & Schuetz, 2012). O CLSI fornece o ponto

de corte para a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e dados interpretativos para Candida

spp. para estes agentes antifúngicos citados. Os pontos de corte do CLSI para o fluconazol,

voriconazol, e para as equinocandinas foram recentemente revisados (Jenkins & Schuetz,

2012).

O método de microdiluição em caldo é o teste de referência recomendado pelo CLSI,

contudo, vários outros testes têm sido utilizados e investigados tais como: Disco difusão

(Vasconcelos Jr et al., 2011), Etests®

(bioMérieux, França), Sensititre YeastOne®

(Trek

Diagnostic Systems, EUA), Neo-Sensitabs®

ensaio de difusão utilizando tabletes com discos

de papel (Rosco, Dinamarca), e sistemas automatizados como o VITEK 2®

(bioMérieux,

França) (Bourgeois et al., 2010; Peterson et al., 2011; Jenkins & Schuetz, 2012).

Muitos estudos têm sido empreendidos para análise dos padrões de resistência

antifúngica, tanto globalmente quanto regionalmente de acordo com Sifuentes-Osornio et al.

(2012), bem como tem sido publicadas diretrizes e recomendações para orientar o uso

racional dos antifúngicos de conhecida eficácia terapêutica (Pappas et al., 2009; Aguado et

al., 2011; Colombo et al., 2013).

Na América Latina, a anfotericina B desoxicolato é o antifúngico mais utilizado,

seguido pelo fluconazol (Sifuentes-Osornio et al., 2012), inclusive em vários hospitais

públicos terciários brasileiros a anfotericina B é a droga mais comumente usada em vários

tratamentos sistêmicos de micoses, em que os pacientes permanecem hospitalizados por

longos períodos (Bruder-Nascimento et al., 2010). Embora não exista ponto de corte do CLSI

atualmente aprovado para o padrão de resistência à anfotericina B (Jenkins, & Schuetz, 2012),

as pesquisas brasileiras em geral têm apontado uma alta sensibilidade de C. parapsilosis à

este fármaco (Colombo et al., 2006; Mímica et al., 2009; Bonfietti et al., 2012) apesar de já

existirem dados relatando resistência da espécie à droga em questão, nos estados de São Paulo

e Mato Grosso (Bruder-Nascimento et al., 2010; Favalessa et al., 2010).

Quanto aos triazólicos, Lass-Flörl (2011) discorre em sua revisão comparativa que os

medicamentos desse grupo de agentes antifúngicos têm uma boa atividade in vitro e in vivo

contra C. parapsilosis (lato sensu). Contudo, os resultados dos testes de susceptibilidade

32

publicados recentemente não têm demonstrado homogeneidade. Alguns trabalhos relatam que

todos os isolados de C. parapsilosis foram sensíveis aos triazólicos testados (Tavanti et al.,

2005; Colombo et al., 2006; Serefhanoglu et al., 2012). Por outro lado, a resistência ao

fluconazol, itraconazol ou voriconazol, bem como a susceptibilidade dose-dependente tem

sido descritas com relativa frequência (Bonassoli et al., 2005; Mímica et al., 2009; Bruder-

Nascimento et al., 2010; Favalessa et al., 2010; Tavanti et al., 2010; Pfaller et al., 2011,

Clinical breakpoints for voriconazole and Candida spp.; Pemán et al., 2012).

Entre as espécies do complexo C. parapsilosis, diferenças têm sido relatadas na

resposta ao fluconazol com CIMs próximos ao ponto de corte para C. orthopsilosis e C.

metapsilosis e isolados de ambas as espécies exigindo uma maior concentração de fluconazol

para inibir seu crescimento, enquanto que C. parapsilosis teve seu crescimento inibido com

concentrações próximas da CIM (Szabó et al., 2009).

Para Lass-Flörl (2009) o uso profilático de fluconazol bem como mudanças na

estratégia para tratamento de populações consideradas de risco na Europa são prováveis

razões para a modificação na epidemiologia de doenças fúngicas invasivas neste continente.

Também foi observado que exposição anterior ao fluconazol esteve relacionada à candidemia

causada por isolados do fungo resistentes a este fármaco (Bonfietti et al., 2012).

De acordo com Bonfietti et al. (2012) o isolado de C. parapsilosis (stricto sensu) que

exibiu alto CIM para fluconazol (4 mg/L) também foi resistente ao voriconazol (CIM de 0,25

mg/L). Tal fato evidencia o potencial problema de resistência cruzada entre azólicos.

(Colombo et al., 2006; Favalessa et al., 2010; Pfaller et al., 2011, Clinical breakpoints for

voriconazole and Candida spp.).

Para as equinocandinas (caspofungina, micafungina e anidulafungina) a espécie C.

parapsilosis (stricto sensu) tem evidenciado menor sensibilidade in vitro do que as demais

espécies do complexo C. parapsilosis (van Asbeck et al., 2008; Pappas et al., 2009; Bonfietti

et al., 2012). Tavanti et al. (2010) analisaram exclusivamente C. parapsilosis (stricto sensu) e

descreveram que todos os isolados apresentaram reduzida susceptibilidade às equinocandinas,

sendo cogitado que este aspecto fenotípico da levedura esteja relacionado à mudança do

aminoácido prolina por alanina na enzima glucano sintetase codificada pelo gene fks1

(Tavanti et al., 2010). A enzima glucano sintetase catalisa a biossíntese de β-1,3 glucano,

principal componente da parede celular das leveduras, sendo esta enzima o alvo do

mecanismo de ação das equinocandinas, cuja maior resistência da espécie C. parapsilosis a

estas drogas é devida à ocorrência natural de um polimorfismo na extremidade de HS1 no

33

gene fks1, de acordo com Pfaller et al. (2011, Clinical breakpoints for the echinocandins and

Candida revisited).

Embora in vitro esta susceptibilidade de C. parapsilosis às equinocandinas apresente-

se reduzida, ensaios clínicos tem demonstrado boa eficácia destas drogas às infecções por

estas leveduras, de acordo com recente protocolo brasileiro para o manejo das candidemias

(Colombo et al., 2013).

Outra característica fenotípica das espécies C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C.

metapsilosis observada em relação às equinocandinas, tem sido denominada de efeito

paradoxal ou crescimento paradoxal (van Asbeck et al., 2008; Bizerra et al., 2011),

caracterizado pelo crescimento fúngico em concentrações de equinocandinas (caspofungina)

bem acima da CIM (Stevens et al., 2004). Este efeito paradoxal está relacionado ao padrão

ultraestrutural e bioquímico da parede celular através de um mecanismo regulatório pela

redução significativa de -1,3-glucano e elevação considerável de quitina, ambos componentes

da parede celular da levedura. Este fenômeno tem sido estudado visando o esclarecimento da

sua significância clínica (Bizerra et al., 2011).

Finalmente, de Toro et al. (2011) pesquisaram os padrões de susceptibilidade aos

antifúngicos voriconazol, anfotericina B e anidulafungina contra isolados do complexo C.

parapsilosis tanto na forma planctônica (circulando livremente) quanto na forma de biofilme.

Os resultados revelaram que a anfotericina B e anidulafungina são moderadamente eficazes

contra biofilmes de C. parapsilosis (stricto sensu), enquanto que o voriconazol não degradou

o biofilme. Para as formas planctônicas das leveduras a CIM foi maior em relação à CIM para

os biofilmes de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis.

Todos estes resultados abordados corroboram a evidente necessidade da correta

identificação da espécie em associação com os testes de suscetibilidade (Bruder-Nascimento

et al., 2010), cujo valor clínico tem sido bem reconhecido como ferramenta para otimizar o

manejo das infecções fúngicas (Pfaller et al., 2011, Clinical breakpoints for the echinocandins

and Candida revisited), pois atrasos na terapia antifúngica implicam piora no prognóstico

com aumento da mortalidade (Pappas et al., 2009). Acrescenta-se a isto, o fato de que as

pesquisas farmacêuticas para o desenvolvimento de novos antimicrobianos são mais voltadas

para drogas antibacterianas em relação aos antifúngicos (Sidrim & Rocha, 2010), sendo

imperativa a adequada utilização das poucas drogas antifúngicas disponíveis no mercado.

A identificação de patógenos fúngicos em nível de espécie, particularmente isolados

clínicos é importante para melhorar o manejo das infecções e o adequado emprego da terapia

34

antifúngica. Atualmente, alguns dos isolados até então identificados como C. parapsilosis, e

conservados em coleções de cultura, podem ser C. parapsilosis, C. orthopsilosis ou C.

metapsilosis e, consequentemente, métodos para diferenciar corretamente estas espécies

devem ser estabelecidos, em vista da dificuldade e imprecisão dos testes fenotípicos na

determinação das mesmas. Neste contexto, abordagens moleculares, bem como a avaliação de

novos métodos estão sendo desenvolvidas para estabelecer uma identificação mais rápida e

segura destas espécies recentemente descritas (Abi-Chacra et al., 2013).

Por conseguinte, considerando as importantes diferenças entre as espécies do

complexo C. parapsilosis relacionadas aos fatores de virulência e na susceptibilidade aos

antifúngicos, acima relatados, bem como, considerando os pacientes de risco e a elevada

morbi-mortalidade causadas por estes patógenos, faz-se necessária a determinação da

distribuição das espécies deste grupo de leveduras, associada ao conhecimento de seus fatores

de virulência e padrões de sensibilidade e resistência aos antifúngicos disponíveis na prática

clínica. É válido ressaltar, ainda, que a região Norte do Brasil carece de tais informações

epidemiológicas que possam auxiliar na vigilância dessas infecções.

35

1.9 OBJETIVOS

1.9.1 Objetivo Geral

Realizar a identificação molecular e descrever os aspectos bioquímicos e fenotípicos

de leveduras do Complexo C. parapsilosis (C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C.

metapsilosis) recuperadas de diferentes sítios corpóreos, de pacientes encaminhados ao

Instituto Evandro Chagas para esclarecimento diagnóstico no período de 2005 a 2012.

1.9.2 Objetivos Específicos

Reidentificar as leveduras do Complexo C. parapsilosis pela metodologia

automatizada VITEK®

2;

Identificar as espécies do Complexo C. parapsilosis por meio da Reação em Cadeia da

polimerase (PCR) utilizando o intron do gene RPSO;

Determinar o perfil de exoenzimas (Gelatinase, Lipase, Urease, DNase, Caseinase,

Fosfolipase e Proteinase) das leveduras do Complexo C. parapsilosis;

Avaliar e determinar a aplicabilidade do ágar Eosina Azul de Metileno (EAM), como

meio de identificação presuntiva para leveduras do Complexo C. parapsilosis;

Caracterizar a formação de biofilme por leveduras do Complexo C. parapsilosis

semeadas em caldo Sabouraud e medido pela Densidade ótica (DO);

Avaliar o perfil de sensibilidade das leveduras do Complexo C. parapsilosis aos

antifúngicos (itraconazol, fluconazol e anfotericina B) pela metodologia M27-A2 do CLSI.

36

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 DESENHO DO ESTUDO

O estudo desenvolvido foi de caráter prospectivo, descritivo e transversal.

2.2 ISOLADOS FÚNGICOS E CRITÉRIO DE SELEÇÃO

Foram utilizados 52 isolados de leveduras identificadas anteriormente como C.

parapsilosis, por meio da metodologia semi-automatizada ID 32C®

(bioMérieux, França).

Estes isolados foram provenientes da coleção de culturas de leveduras do Laboratório de

Micologia da Seção de Bacteriologia e Micologia (SABMI) do Instituto Evandro Chagas

(IEC), localizado no município de Ananindeua, Estado do Pará, onde são mantidas congeladas

(em freezer a - 80ºC) em meio líquido Extrato de Malte com de 15% de glicerina.

Os isolados foram obtidos a partir de diversos espécimes clínicos (sangue, lavado

broncoalveolar, escamas epidérmicas e ungueais, biópsia de abdome e de pólipo nasal,

escarro, coprocultura, secreção de lesão e escarificado de lesão auricular) de pacientes

encaminhados ao Laboratório de Micologia da SABMI ∕ IEC para esclarecimento diagnóstico,

no período de 2005 a 2012. O estudo, portanto, partiu das culturas em estoque e não dos

espécimes clínicos.

O critério de inclusão consistiu de culturas constantes na micoteca da SABMI ∕ IEC

cujas leveduras foram previamente identificadas como C. parapsilosis, pelo método ID 32C®

(bioMérieux, França).

Os isolados fúngicos, após descongelamento, foram cultivados pelo menos três vezes

em ágar Batata - Dextrose (HIMEDIA, India) ou ágar Sabouraud - Dextrose (HIMEDIA,

India), antes de serem iniciados os ensaios, garantindo que todas as amostras estivessem

viáveis e reativadas após os cultivos e livre de contaminação.

Durante o período da pesquisa, todos os isolados foram mantidos em ágar Batata -

Dextrose (HIMEDIA, India) ou ágar Sabouraud - Dextrose (HIMEDIA, India), sob

temperatura de 27ºC. A cepa C. parapsilosis ATCC 22019 foi utilizada como referência.

37

2.3 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA

A pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do IEC e aprovada

sob o número 345.631 de 31 de julho de 2013, CAAE 18425713.9.0000.0019 (Anexo I).

2.4 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DAS LEVEDURAS

DO COMPLEXO C. parapsilosis PELO VITEK®

2

O VITEK®

2 (bioMérieux, França) é um sistema padronizado para identificação

automatizada de microrganismos, inclusive leveduras. Os microrganismos foram

primeiramente semeados em ágar Batata - Dextrose (HIMEDIA, India), incubados sob

temperatura de 27ºC e a partir de culturas recentes (24 - 48 horas) as colônias foram

transferidas para um tubo contendo 3 mL de solução salina, formando uma suspensão com

opacidade equivalente à escala 2 de McFarland (6,0 x 108 UFC/mL) , medida com o auxílio

de um densitômetro (bioMérieux, França). Posteriormente a suspensão fúngica foi inoculada

nos cartões em cartuchos de identificação e os resultados lidos após 18 h de incubação,

seguindo as orientações do fabricante (bioMérieux, França).

2.5 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR

2.5.1 Extração de DNA Genômico

Para a extração do DNA genômico foi seguido o protocolo descrito por Sambrook et al.,

(2001), com modificações, como descrito a seguir.

As amostras de leveduras do complexo C. parapsilosis foram cultivadas em ágar

Sabouraud - Dextrose (HIMEDIA, India) e incubadas por 24 a 48 horas em temperatura ambiente

(27oC). Após crescimento, as colônias foram transferidas para microtubos de 2 mL contendo 300

µL de tampão Tris-EDTA (TE – Tris-HCl 1M pH 7.5, EDTA 0,5 M pH 8.0), onde foram

adicionados 300 µL de tampão de lise (Tris-HCl 1M pH 9.0 na solução 300 mM, EDTA100 mM

na solução, Sacarose a 50%, Dodecil Sulfato de Sódio a 10%), 300 µL de tampão de

homogeneização (Tris-HCl 1 M, NaCl 1 M, EDTA 0,5 M e Sacarose) e 15 µL de proteinase K

(10 mg / mL), submetidos a 56oC em banho-maria por 12 horas para ação da enzima.

Na segunda etapa da extração, em temperatura ambiente, foram adicionados 600 µL de

fenol-clorofórmio-álcool isoamilico (25:24:1 [vol/vol/vol]). Os microtubos foram então

homogeneizados gentilmente e centrifugados a 13000 rpm por 10 minutos com remoção da

camada superior para novo microtubo, procedimento este repetido após adição de 600 µL de

38

clorofórmio-álcool isoamil (24:1). A fração aquosa foi tratada com 100 µL de acetato de sódio

gelado (3M pH 4.8) e 500 µL de isopropanol para precipitação do DNA, e após centrifugação a

13000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi desprezado gentilmente. Foram acrescentados 500

µL de etanol a 70% e novamente procedeu-se à centrifugação dos microtubos a 13000 rpm por 10

minutos. O sobrenadante foi desprezado gentilmente para não perder o DNA precipitado, o qual

foi seco em estufa a 37 oC, ressuspenso em 100 µL de tampão TE e congelado até o momento da

realização do ensaio molecular.

2.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A identificação molecular de leveduras do complexo C. parapsilosis foi realizada

baseando-se nos primers propostos por García Martínez et al. (2010) e Vercher et al. (2011),

utilizando-se primers espécie-específicos, que amplificam um fragmento do intron do gene

RPSO pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase, a qual apresenta as vantagens de

especificidade e sensibilidade e não envolve equipamentos complexos e dispendiosos (García

Martínez et al., 2010).

As sequências dos primers CP1(forward) e CP2 (reverse) (García Martínez et al,.

2010), os primers CM1 (forward) e CM2 (reverse) e os primers CO1 (forward) e CO2

(reverse) (Vercher et al., 2011) específicos para C. parapsilosis, C. metapsilosis e C.

orthopsilosis, respectivamente, bem como o perfil de termociclagem e o tamanho do

fragmento para cada espécie estão no quadro 1.

Todas as amostras foram submetidas à PCR com os primers espécie-específicos CP1 e

CP2, CO1 e CO2, bem como CM1 e CM2 em reações separadas.

A reação de amplificação foi realizada com 1 M de Betaína, 4 mM MgCl2, 0,4 mM de

cada dNTP (desoxinucleotídeo trifosfato), 1 mM dos primers (CP, CM ou CO), 0,1 µL de

Taq DNA polimerase (Platinum®

Taq, Invitrogen, Brasil) e 2 µL de DNA, com volume final

de 25 µL. As reações de PCR foram realizadas em termociclador (PX2 Thermo Hybaid, RU)

conforme as condições descritas no quadro 1. O produto da amplificação foi revelado por

eletroforese em gel de agarose a 2% (p/vol) corado com SyBR®

Safe, em tampão TBE 1X (90

mM Tris, 90 mM ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8.3), a 69 volts, 60 miliamperes, por 90

minutos usando o marcador de peso molecular (ladder) de 100 pb e de 1kb. A visualização do

DNA foi realizada com auxílio de um transiluminador (UV).

39

Quadro 1 – Primers a serem utilizados e condições da Reação em Cadeia da Polimerase. (a) Garcia Martinez et al., 2010. (b) Vercher et al., 2011.

Espécie Primer Sequência do Primer Desnaturação

Inicial

Ciclo

(Desnaturação,

Anelamento,

Extensão)

Extensão Final Fragmento

esperado

C. parapsilosis CP1 /

CP2

CP1 (5′ AGG GAT TGC CAA TAT GCC CA 3′)

CP2 (5′ GTG ACA TTG TGT AGA TCC TTG G 3′)

Referência (a)

95 ºC / 3 min 40 X

94 ºC / 60 seg

63 ºC / 30 seg

72 ºC / 45 seg

72 ºC/ 15min 120 pb

C. orthopsilosis CO1 /

CO2

CO1 (5′ TTT CAA TAT GCC TAG AGC CAC ATT

GTG AAT AC 3′)

CO2 (5′ GCA TTA GTT AGT ATC GTC TTT TAT

TAA ATA 3′)

Referência (b)

95 ºC / 3 min 40 X

94 ºC / 60 seg

63 ºC / 30 seg

72 ºC / 45 seg

72 ºC/ 15min 190 pb

C. metapsilosis CM1 /

CM2

CM1 (5′ AAT AGA GGA GAT GTT TTA TTT GAA

TTC 3′)

CM2 (5′ GCA GAA TCC GTA AGA ACT GGG G 3′)

Referência (b)

95 ºC / 3 min 40 X

94 ºC / 60 seg

63 ºC / 30 seg

72 ºC / 45 seg

72 ºC/ 15min 210 pb

40

2.6 PESQUISAS DE EXOENZIMAS

Para todos os ensaios de exoenzimas produzidas por leveduras do complexo C.

parapsilosis foram empregados cultivos de até 48 h mantidos à temperatura de 27ºC em ágar

Sabouraud - Dextrose (HIMEDIA, India) ou ágar Batata - Dextrose (HIMEDIA, India) e

todos os experimentos foram realizados em duplicata. Os meios de cultura específicos para

cada prova enzimática, após o preparo mantiveram-se conservados sob refrigeração a 4ºC até

o momento de sua utilização.

2.6.1 Atividade da Gelatinase

A produção da gelatinase foi avaliada semeando-se o fungo em meios de cultura

contendo 12% de gelatina (3 g Extrato de carne (OXOID, Inglaterra), 5 g Peptona (OXOID,

Inglaterra), 120 g gelatina (CRQ, Brasil), 1000 mL de água destilada, pH 7). O meio foi

distribuído em tubos de ensaio 16 x 150mm e autoclavados a 121ºC por 15 minutos. As

condições de incubação foram em temperatura a 25ºC durante 60 dias. Após esse período, os

cultivos foram colocados no refrigerador a 4ºC por 1 h. Um tubo contendo somente o meio

(não semeado) foi utilizado como controle negativo. Para verificação da hidrólise da gelatina

foi considerado meio liquefeito como prova positiva e meio não liquefeito como prova

negativa (Kurtzman & Fell, 1998).

2.6.2 Atividade da Lipase

A análise foi realizada em meio Lipase contendo: 10 g peptona (OXOID, Inglaterra), 5

g NaCl (VETEC, Brasil), 0,1 g CaCl2 (NUCLEAR, Brasil), 20 g ágar Base (Merck,

Alemanha), 10 mL Tween 20 (VETEC, Brasil), em 1000 mL água destilada. O meio foi

autoclavado a 121ºC por 15 minutos. Uma porção da colônia foi depositada sob uma placa de

Petri contendo meio ágar Lipase e em seguida incubada a 27ºC por 10 dias. Foram

consideradas produtoras de lipase as amostras que produziram um halo opaco ao redor da

colônia (Muhsin et al., 1997).

2.6.3 Atividade da Urease

Foi utilizado o meio de cultura ágar Uréia de Christensen (HIMEDIA, India),

autoclavado a 121ºC por 20 minutos e resfriado a 50ºC para o acréscimo de 50 mL de solução

estéril de uréia a 40%, conforme o protocolo de Christensen (1946). Os isolados foram

inoculados em tubos de ensaio com este meio de cultura e após 7 dias de incubação a 25ºC, a

41

produção de urease foi avaliada pela mudança de cor do meio que passa de amarelo para uma

tonalidade vermelha. Um isolado de Cryptococcus neoformans foi utilizado como controle

positivo.

2.6.4 Atividade da Desoxirribonuclease (DNase)

A produção de DNase extracelular foi avaliada inoculando uma porção da colônia

fúngica no centro de uma placa de Petri, contendo meio de cultura DNase (HIMEDIA, India),

esterilizado por autoclavagem a 121ºC por 15 minutos. Após 7 dias de inoculação a 25ºC, as

placas foram pulverizada com solução de Azul de Toluidina 0,1% (100mg de Azul de

Toluidina, 1000mL de água destilada), procedendo-se à observação quanto à presença ou

ausência de um halo de degradação ao redor da colônia. O halo foi identificado como um

círculo transparente ao redor da colônia em contraste com o restante da placa, caracterizando

a produção da enzima DNase. A ausência do halo indicou teste negativo (López-Martínez et

al., 1994).

2.6.5 Atividade da Caseinase

Os isolados foram semeados em placas contendo o meio de cultura ágar Caseína

(Meio I: 10 g Leite desnatado, 100 mL água destilada; Meio II: 2 g ágar Base (Merck,

Alemanha), 100 mL água destilada, autoclavados separadamente, resfriados e misturados) e

incubados a 25ºC por 15 dias, segundo Price et al. (1982). A hidrólise da caseína foi

verificada pela formação de um halo em torno da colônia.

A análise dos resultados foi realizada através do cálculo da razão entre o diâmetro da

colônia (dc) e o diâmetro mais o halo produzido (dcd), proposto por Price et al. (1982). Esta

razão representa a atividade enzimática da caseinase (CZ).

CZ = dc ÷ dcd

Segundo Price et al. (1982):

CZ = 1,0; indica que o microrganismo não é produtor da enzima;

CZ ≥ 0,64 < 1; indica que o microrganismo é positivo, produtor da enzima;

CZ < 0,64; indica que o microrganismo é fortemente positivo, produtor de enzima.

O diâmetro da colônia foi medido com o paquímetro digital (ABSOLUTE – Mitutoyo

Products, Brasil).

42

2.6.6 Atividade da Fosfolipase

A capacidade de Candida em produzir fosfolipase foi detectada pela técnica

preconizada por Price et al. (1982), realizada em meio de cultura preparado conforme abaixo

descrito:

Meio de emulsão de ovo: 16 g gema de ovo, 16 mL solução fisiológica estéril. Os

ovos foram criteriosamente lavados em água corrente e deixados de molho em álcool a 70%

por 60 minutos. As gemas foram homogeneizadas, misturadas à solução fisiológica, filtradas

em gaze estéril e acrescentadas ao meio ágar fosfolipase resfriado.

Meio Ágar fosfolipase: 2 g Peptona (OXOID, Inglaterra), 4 g Glicose (Difco,

França), 11,46 g Cloreto de sódio (VETEC, Brasil), 0,11 g Cloreto de cálcio (Nuclear, Brasil),

4,9 g ágar Base (Merck, Alemanha), 200 mL água destilada. O meio foi autoclavado por 15

minutos a 121ºC e resfriado a 50ºC para receber o meio de emulsão de ovo.

As amostras cultivadas por 24 horas a 37ºC em ágar Sabouraud - Dextrose

(HIMEDIA, India) foram inoculadas em placa de Petri contendo meio de cultura Ágar

fosfolipase enriquecido com a emulsão de gema de ovo. As placas testes foram incubadas a

37ºC, e a leitura realizada no décimo dia. Procedeu-se à análise da mesma maneira como para

a atividade da caseinase.

2.6.7 Atividade da Proteinase

A competência de leveduras do complexo C. parapsilosis em secretar proteinase foi

detectada pela técnica descrita por Rüchel et al. (1982). Amostras cultivadas por 24 horas a

37ºC em ágar Batata - Dextrose (HIMEDIA, India) foram inoculadas em placa de Petri

contendo meio de cultura ágar proteinase, preparado conforme segue: Meio I: 18 g ágar Base

(Merck, Alemanha), 900 mL água destilada; Meio II: 11,7 g Yeast Carbon Base (HIMEDIA,

India), 2 g Albumina bovina - Fração V (Sigma, EUA), 2,5 mL Protovit® (Roche, Brasil), 100

mL água destilada estéril. O meio I foi autoclavado por 15 minutos a 121ºC e resfriado a

50ºC. O meio II foi filtrado em membrana Millipore com porosidade de 0,45 µm e

acrescentado ao meio I.

As placas testes foram incubadas a 37ºC, e a leitura realizada no décimo dia. A

presença da enzima foi detectada pela formação de um halo transparente ao redor das

colônias. A detecção da produção da exoenzima proteinase e a medida desta atividade foram

semelhantes ao da caseinase e fosfolipase, conforme proposto por Price et al. (1982).

43

2.7 CULTIVO EM ÁGAR EOSINA AZUL DE METILENO MODIFICADO

Uma porção de colônias crescidas em ágar Batata – Dextrose (HIMEDIA, India) por

24 a 48 horas à 29ºC foi inoculada em placas contendo ágar EMB (OXOID, Inglaterra)

acrescido de 10 g/mL de dextrose (Difco, França) e incubadas a 29ºC por 72 a 96 horas

protegidas da luz direta. Depois deste período, os cultivos foram avaliados quanto às

características colorimétricas exibidas (padrão de coloração e pigmento).

2.8 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO BIOFILME

A produção de biofilme por leveduras do complexo C. parapsilosis foi avaliada como

previamente descrito por Tavanti et al. (2007). Para isto, foi realizada uma suspensão de

leveduras em caldo Sabouraud ajustada para 1,5 x 107 células/mL. Em seguida, 20 µL de cada

suspensão de leveduras foram adicionados a 180 µL de caldo Sabouraud suplementado com 8 %

de glicose em placas de 96 poços (Corning Inc. NY). Cada isolado foi inoculado em replicata

de 5 poços. Controles negativos foram representados por replicatas de 5 poços, misturando-se

20 µL de água destilada a 180 µL de caldo Sabouraud. As placas foram incubadas a 37ºC sem

agitação. Após 24 horas, o meio de cultura foi aspirado, os poços lavados 2 vezes com 200 µL de

água destilada e novamente completados com 200 µL de água destilada. A densidade ótica (DO)

foi medida utilizando filtro de 405-450 nm em leitora de placa (Microplate reader). A

produção de biofilme para cada isolado foi considerada como segue:

Ausente – nenhuma produção, quando a densidade ótica a 450 nm foi menor que 0,03;

Fraca 0,03 ≤ DO < 0,08;

Moderada 0,08 ≤ DO < 0,16;

Alta DO ≥ 0.16.

2.9 PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS

O perfil de sensibilidade de leveduras do complexo C. parapsilosis foi determinado

pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) conforme o protocolo M27-A2 do CLSI (CLSI,

2002) utilizando os agentes antifúngicos itraconazol (Invitrogen, Brasil), fluconazol

(Invitrogen, Brasil) e anfotericina B (Cristália, Brasil), pela técnica de microdiluicão. O meio

de cultura utilizado foi o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-Aldrich)

tamponado com ácido morfopropileno sulfônico (MOPS) 1,65 M (pH 7.2). Os fármacos

foram conservados sob refrigeração e ao abrigo da luz até o momento do uso. As diluições

44

dos antifúngicos foram realizadas a fim de se obter nas placas de microdiluição concentrações

que variaram conforme descrito no quadro 2. Os inóculos foram preparados a partir de

colônias com crescimento de 24 h em meio de ágar Sabouraud as quais foram ressuspensas

em 5 mL de solução salina estéril a 0,85%, a fim de se obter uma turbidez correspondente a

1x106 a 5x10

6 células por mL, ou seja, 0,5 na escala de McFarland.

Droga Diluente Concentração (μg / mL)

Fluconazol RPMI* 0,125 a 64

Itraconazol DMSO** 0,0313 a 16

Anfotericina B DMSO** 0,0313 a 16

A suspensão padrão de levedura foi misturada durante 15 segundos em vórtex, diluída

1:50 e depois 1:20 com o meio de cultura RPMI 1640, para se obter o inóculo 2X concentrado

usado no teste (de 1 x 103 a 5 x 10

3 UFC/mL). O inóculo (2X) foi diluído a 1:1 quando os

poços foram inoculados, chegando-se à concentração final desejada (de 0,5 x 103 a 2,5 x 10

3

UFC/mL).

O teste de microdiluição foi realizado em placas de microdiluição estéreis,

descartáveis, com múltiplos poços (96 poços em formato de U). As concentrações 2X da

droga foram dispensadas nos poços das fileiras 1 a 10 das placas de microdiluição, em

volumes de 100 μL, com uma pipeta multicanal. A fileira 1 continha a maior concentração da

droga e a fileira 10 a menor concentração da droga testada. Cada poço da placa de

microdiluição foi inoculado, no dia do teste, com 100 μL da correspondente suspensão 2X

concentrada do inóculo, levando às diluições das drogas e à concentração do inóculo antes

mencionados.

Os poços da fileira 11 foram usados para o controle de crescimento (controle positivo)

e continham 100 μL de meio estéril isento de droga, e 100 μL das suspensões 2X

concentradas dos inóculos. A fileira 12 da placa de microdiluição foi usada para efetuar o

controle da esterilidade com 100 μL do meio RPMI isento de drogas (controle negativo). As

Quadro 2 – Fármacos, diluentes e intervalos de concentrações utilizados

(CLSI, 2002)

* RPMI – Roswell Park Memorial Institute;

** DMSO – Dimetilsulfóxido

45

placas de microdiluição foram incubadas a 35°C por 48 h, observando presença ou ausência

de crescimento visível. Os poços de microdiluição receberam uma pontuação (escore) e o

crescimento em cada poço foi comparado com o do poço controle do crescimento (isento de

droga) com auxílio de um espelho de leitura. A seguir, cada poço da placa de microdiluição

recebeu um valor numérico, usando a seguinte escala:

0 = opticamente claro;

1 = crescimento indefinido;

2 = redução proeminente de crescimento;

3 = ligeira redução do crescimento;

4 = nenhuma redução do crescimento.

De forma complementar, foi realizada leitura em leitora de microplaca (Thermoplate,

Brasil) em filtro de comprimento de onda de 450 nm (Stoppa et al., 2009), registrando-se a

leitura de cada poço para uma leitura adicional considerando-se os critérios do CLSI de que

uma diminuição proeminente na turbidez observada visualmente corresponde à,

aproximadamente, 50% da inibição do crescimento, determinada espectrofotometricamente

(CLSI, 2002). Pelos critérios da norma de referência M27-A2 (CLSI, 2002), o valor de CIM

da anfotericina B é definido como a menor concentração em que observa o escore 0

(opticamente claro), ou seja, a CIM é distinguível como a menor concentração de droga que

impede qualquer grau de crescimento discernível, enquanto que para os azóis a CIM define-se

pela menor concentração em que observa o escore 2 (redução proeminente de crescimento).

Para a interpretação dos resultados foram utilizadas as diretrizes da norma de

referência M27-A2 (CLSI, 2002) descritas no quadro 3.

Agente antifúngico Suscetível (S)

Sensibilidade Dose-

Dependente (S-DD) Resistente (R)

Fluconazol ≤ 8 16 – 32 ≥ 64

Itraconazol ≤ 0,125 0,25 – 0,5 ≥ 1

Anfotericina B 0,25 – 1 -------- > 1

Quadro 3 – Diretrizes de Interpretação dos Testes de Sensibilidade in vitro das espécies de

Candida. Os valores correspondem aos pontos de corte (μg / mL) contra os agentes

antifúngicos (CLSI, 2002).

46

3 RESULTADOS

3.1 REIDENTIFICAÇÃO DAS LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis PELA

METODOLOGIA VITEK®

2

Cinqüenta e duas (52) amostras identificadas primariamente como C. parapsilosis por

meio de metodologia semi-automatizada ID 32®

foram reidentificadas pelo sistema VITEK®

2. Deste total, 44/52 (84%) isolados foram identificados como C. parapsilosis, e 8 (15%)

tiveram suas leituras como outras espécies do gênero Candida. Para estas amostras o teste foi

repetido e os resultados bioquímicos mantidos. A tabela 1 ilustra estes resultados.

Em relação à assimilação de carboidratos avaliada pelo VITEK®

2, os resultados

evidenciaram diferentes padrões de assimilação entre as espécies. Contudo, estas diferenças

não permitem separá-las por espécies (tabela 2).

As amostras IEC 167, IEC 171 e IEC 237, primariamente identificadas como C.

parapsilosis e posteriormente identificadas pela biologia molecular como C. parapsilosis, C.

metapsilosis e C. orthopsilosis, respectivamente, divergiram quanto à assimilação dos

carboidratos conforme demonstrado na tabela 2.

Espécie n % Probabilidade

C. parapsilosis 44 84 97%

C. albicans 3 6 94%

C. famata 3 6 85%

C. famata / C. guilermondii 1 2 Baixa

Discriminação

C. famata / C. tropicalis 1 2 Baixa

Discriminação

Tabela 1 – Identificação de leveduras de C. parapsilosis por meio

do Sistema automatizado VITEK® 2.

47

Nº ID

32

Bio

Mol

VITEK IML

Ta

AR

Ba

GE

Na

LA

Ca

dC

EL

a

dR

AF

a

dM

EL

a

dM

LZ

a

ISB

Ea

XL

Ta

dT

RE

a

IAR

Aa

dG

AT

a

ES

C

dX

YL

a

LA

Ta

CIT

a

GR

Tas

2K

Ga

NA

Ga

dG

NT

a

12 C P C P C famata /C.

tropicalis

+ - - - - - - + + - + - - - + - + + + + +

71 C P C P C famata - - - - - - - + - - + + - - + - + - + + - 115 C P C P C famata + - + - - - - + + - - - + - - - + - + + - 223 C P C P C famata + + + + + + + + + - + - + + - - + - + + + 38 C P C P C albicans - - - - - - - - - + + - + - - + - + + + + 39 C P C P C albicans - - - - - - - - - + + - + - - + - + + + + 112 C P C P C albicans - - - - - - - + - + + + + - + + + + + + + 114 C P C M C famata

/C. guilermon

dii

+ + + + + + + + - - + + + + + + + + + - +

17 C P C P C P + - - - - - - + + - + + - - + - + - + + - 98 C P C P C P + - - - - - - + - - + + + - - - + + + + + 220 C P C P C P - - - - - - - + - - - + + - + - + + + + + 167 C P C P C P - - - - - - - + + - - + + - - - + + + + + 171 C P C M C P - - - - - - - + - - + + - - - - + + + + + 237 C P C O C P - - - - - - - + + - + + - - - - + - - - -

Tabela 2 – Representação da assimilação de carboidratos por meio do Sistema VITEK® 2, de isolados de C. parapsilosis.

CP – C. parapsilosis, CO – C. orthopsilosis, CM – C. metapsilosis. (+), POSITIVO, (-), NEGATIVO. IMLTa: L-Malato, ARBa: Arbutina,

GENa: Gentiobiose, LACa: Lactose, dCELa: D-celobiose, dRAFa: D-Rafinose, dMELa: D-Melibiose, dMLZa: D-Melizetose, ISBEa: L-

Sorbose, XLTa: Xilitol, dTREa: D-trealose, IARAa: L-arabinose, dGATa: D-galacturonato, ESC: Esculina, dXYLa: D-xilose, LATa: DL-

lactato, CITa: Citrato de sódio, GRTas: glucuronato, 2KGa: 2 - ceto-D-gluconato, NAGa: N-acetil-glucosamina, dGNTa: D-gluconato.

48

3.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DAS ESPÉCIES DO COMPLEXO C.

parapsilosis

O resultado da PCR utilizando os primers espécie-específicos revelou a presença de 44

(85%) isolados da espécie C. parapsilosis stricto sensu, 3 (6%) da espécie C. metapsilosis, e 5

(9%) isolados da espécie C. orthopsilosis.

A figura 5 ilustra os produtos amplificados de duas amostras de cada espécie,

demonstrando o tamanho dos produtos obtidos na PCR, e reveladas por eletroforese em gel de

agarose a 2%.

A tabela 3 demonstra a distribuição das espécies do complexo C. parapsilosis de

acordo com o material e ∕ ou sítio anatômico de onde foram recuperadas.

Figura 5 – Produtos da amplificação de DNA de leveduras do complexo C.

parapsilosis separados por eletroforese em gel de agarose a 2%, corados com

SyBR Safe®. CP, Candida parapsilosis (120 bp); CM, Candida metapsilosis

(210 bp); CO, Candida orthopsilosis (190).

49

3.3 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE EXOENZIMAS DAS ESPÉCIES DO

COMPLEXO C. parapsilosis

Três das 7 exoenzimas pesquisadas não foram secretadas pelas espécies do complexo

C. parapsilosis das amostras analisadas, sendo elas as exoenzimas caseinase, urease, e

gelatinase (Tabela 4).

A exoenzima lipase foi a enzima hidrolítica mais intensamente produzida pelos

isolados de C. parapsilosis (Tabela 4, Figura 6). A intensidade da atividade enzimática é

demonstrada na tabela 5.

A exoenzima DNase (Figura 7) foi produzida por 4/52 isolados, sendo todos de C.

parapsilosis. As exoenzimas proteinase, fosfolipase (Figura 8) e lipase foram produzidas por

48/52, 27/52 e 51/52 dos isolados, respectivamente (Tabela 4).

SÍTIO ANATÔMICO ∕

ESPÉCIME CLÍNICO

CP CO CM

N % N % N %

Pele 29 66 0 0 2 67

Mucosa oral 3 7 3 60 0 0

Escarificado de lesão 3 7 0 0 0 0

Sangue 3 7 0 0 1 33

Lavado bronco-alveolar 2 4 1 20 0 0

Escarro 0 0 1 20 0 0

Outros 4 9 0 0 0 0

TOTAL 44 100 5 100 3 100

Tabela 3 – Frequências relativas e absolutas da distribuição das

espécies do complexo: CP - C. parapsilosis, CO - C. orthopsilosis e

CM - C. metapsilosis, de acordo com o sítio anatômico e ou do

material dos quais foram recuperadas primariamente.

50

Espécie Exoenzimas

Caseinase Urease Gelatinase DNAse Proteinase Fosfolipase Lipase

C. parapsilosis (n =44) - - - 4 (+) 42 (+) 22 (+) 43 (+) a,b

C. metapsilosis (n=3) - - - - 2 (+) 2 (+) 3 (+) b

C. orhtopsilosis (n=5) - - - - 4 (+) 3 (+) 5 (+) b

Total 0/52 0/52 0/52 4/52 48/52 27/52 51/52

( -), negativo; (+), positivo; a, formação de halo de precipitação moderado; b, formação de halo de precipitação

intensa

Espécie Proteinase *

Fosfolipase Lipase

Negativo Positivo Negativo Positivo Fortemente

Positivo

Negativo Positivo Fortemente

Positivo

N % N % N % N % N % N % N % N %

C. parapsilosis

(n =44)

2 5 42 95 22 50 18 41 4 9 1 2 4 11 38 87

C. metapsilosis

(n=3)

1 33 2 67 1 33 2 67 0 0 0 0 0 0 3 100

C. orthopsilosis

(n=5)

1 20 4 80 2 40 3 60 0 0 0 0 0 0 5 100

* Para a Proteinase, nenhum dos isolados apresentou atividade fortemente positiva.

Tabela 4 – Secreção de exoenzimas por leveduras do complexo C. parapsilosis.

Tabela 5 – Frequência da atividade enzimática das leveduras do complexo C. parapsilosis,

conforme a intensidade da produção da exoenxima.

51

Figura 6 – Aspecto macromorfológico de um isolado (IEC 240)

de C. parapsilosis produtor da enzima hidrolítica lipase (intenso

halo de precipitação ao redor da colônia).

Figura 7 – Aspecto macromorfológico de um

isolado de C. parapsilosis produtor da exoenzima

DNAse.

52

3.4 AVALIAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA APLICABILIDADE DO ÁGAR EOSINA

AZUL DE METILENO (EAM), COMO MEIO DE IDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA

PARA LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis

O crescimento dos isolados no ágar Eosina Azul de Metileno (EAM) demonstrou

pequena variabilidade quanto à coloração e pigmento, nas três espécies do complexo C.

parapsilosis, conforme observado nas figuras 9 e 10.

Inicialmente todas as colônias de leveduras do complexo C. parapsilosis apresentaram

coloração rosa. Após 24-48 horas de cultivo foram observadas mudanças colorimétricas sobre

a colônia. Estas características são descritas no quadro 4.

De maneira geral, a coloração rosa sobre o Agar EAM foi indicativa de leveduras do

complexo C. parapsilosis.

A B

Figura 8 – Aspecto macromorfológico da colônia de um isolado de C.

parapsilosis produtor da exoenzima fosfolipase. A, verso da colônia; B, halo

leitoso no reverso da colônia.

53

Código Característica Descrição

BR Borda Rosa centro

corado

Colônia de crescimento rugoso central e

corado em lilás. Borda da colônia permanece

rosa.

R Rosa Colônia de crescimento liso, totalmente rosa.

A Azul Colônia de crescimento liso, totalmente azul.

RM Rosa metálico Colônia de crescimento liso, de coloração

rosa, com discreto brilho metálico sobre a

colônia.

Figura 9 – Macromorfologia das colônias de leveduras do complexo C.

parapsilosis em ágar Eosina Azul de Metileno (EAM). a) BR – Borda

Rosa centro corado; b) R – Rosa; c) A – Azul; d) RM – Rosa metálico.

Quadro 4 – Descrição das características colorimétricas dos isolados do

complexo C. parapsilosis, sobre o ágar EAM.

54

3.5 CARACTERIZAÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME POR LEVEDURAS DO

COMPLEXO C. parapsilosis

Todos os isolados foram hábeis na produção de biofilme variando na intensidade deste

fator de virulência (Figura 11).

Dentre os isolados de C. parapsilosis 86% (38/44) exibiram moderada ou alta

formação de biofilme. Dos isolados de C. orthopsilosis 60% (3/5) foram altamente produtores

e 40% (2/5), moderadamente produtores. Enquanto que, em C. metapsilosis 67% (2/3)

exibiram alta produção e 33% (1/3) moderada produção de biofilme.

Figura 10 – Variações colorimétricas das colônias do complexo C.

parapsilosis: CP - C. parapsilosis; CO - C. orthopsilosis; CM - C.

metapsilosis, no teste Eosina Azul de Metileno (EAM). BR – Borda Rosa

centro corado; R – Rosa; A – Azul; RM – Rosa metálico.

55

3.6 AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS

No que concerne ao ensaio de susceptibilidade in vitro aos fármacos testados, 89% dos

isolados de C. parapsilosis apresentaram sensibilidade ao fluconazol, 79% apresentaram CIM

indicativa de sensibilidade ao itraconazol e 100% foram sensíveis à anfotericina B (tabela 6).

As espécies C. orthopsilosis e C. metapsilosis apresentaram padrão de sensibilidade

(100%) para todos os isolados expostos à ação farmacológica do fluconazol e da anfotericina

B. Algumas amostras do complexo demonstraram resultado de resistência ao itraconazol e

pelo menos uma amostra de cada espécie apresentou sensibilidade dose dependente a esta

droga (Tabela 6).

Figura 11 – Gráfico demonstrativo da produção de biofilme pelas cepas de

CP - C. parapsilosis, CO - C. orthopsilosis e CM - C. metapsilosis.

56

FLUCONAZOL ITRACONAZOL ANFOTERICINA B

S R S SDD R S R

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

CP 39 89 5 11 35 79 6 14 3 7 44 100 0 0

CO 5 100 0 0 3 60 1 20 1 20 5 100 0 0

CM 3 100 0 0 1 33 2 67 0 0 3 100 0 0

3.7 PARTICULARIDADE DO PERFIL FENOTÍPICO DE ISOLADOS DE C.

parapsilosis

Das 38 amostras de C. parapsilosis formadoras de biofilmes, 20 também foram

positivas para as exoenzimas lipase, fosfolipase e proteinase e destas 20 amostras com

importante padrão de virulência, 4 apresentaram resistência aos azóis testados no ensaio de

susceptibilidade, conforme desenho esquemático na figura 12.

Os espécimes clínicos relacionados a estes 4 isolados altamente virulentos eram

proveniente de escamas epidérmicas ( n= 3) e sangue (n=1).

CP – C. parapsilosis, CO – C. orthopsilosis, CM – C. metapsilosis, Nº – número absoluto.

S – Sensível, SDD – Sensibilidade dose dependente, R – Resistente.

Tabela 6 – Frequências absoluta e relativa da susceptibilidade aos antifúngicos de

isolados do complexo C. parapsilosis

Figura 12 – Desenho esquemático do perfil fenotípico de isolados de C.

parapsilosis que exibiram alto grau de virulência por produzir biofilme, enzimas

hidrolíticas e resistência aos azóis.

57

4 DISCUSSÃO

As espécies do complexo C. parapsilosis, embora comensais no homem tem

despertado interesse em virtude de sua alta incidência e relação com infecções hospitalares em

várias partes do mundo (Pfaller et al., 2008; Sabino et al., 2011), tanto candidíases sistêmicas

(Laupland et al., 2005; Trofa et al., 2008; van Asbeck et al., 2009; Mirhendi et al., 2010)

quanto superficiais (Feng et al., 2012; Bertini et al., 2013) em indivíduos comprometidos. As

particularidades das espécies do complexo e seu comportamento quanto à virulência e

susceptibilidade aos antifúngicos disponíveis na prática clínica reforçam a necessidade da

identificação do patógeno em nível de espécie (Abi-Chacra et al., 2013; Németh et al., 2013).

Uma interessante particularidade das espécies do complexo foi documentada por

Sabino et al. (2011), cujo trabalho comparou o potencial de virulência de isolados ambientais

e clínicos de C. parapsilosis stricto sensu quanto à citotoxicidade, liberação de fator de

necrose tumoral-α (TNF-α), produção de filamentos e de enzimas hidrolíticas. As cepas

ambientais revelaram-se mais virulentas do que as clínicas, com maior dano tecidual

especialmente nas fases iniciais da infecção. Os autores chamam a atenção para as medidas

preventivas de vigilância ambiental e aplicação rigorosa dos procedimentos de limpeza como

fator de prevenção do aparecimento de surtos hospitalares (Sabino et al., 2011).

E na vigência de tais casos de surtos de infecções hospitalares, é imperioso que se

conheça o microrganismo para o estabelecimento do manejo adequado do tratamento

(Hernández-Castro et al., 2010), sobretudo, considerando a emergência de fungos multidroga

resistentes que utilizam dentre outros mecanismos de resistência as bombas de efluxo,

complicando o tratamento durante as infecções fúngicas oportunistas (Thakur et al., 2008), e,

por conseguinte, elevando a mortalidade e os custos associados, a exemplo do que ocorre no

cenário brasileiro (Colombo et al., 2006).

O manejo adequado das candidemias, portanto, deve ser eficaz desde a profilaxia, uso

empírico dos antifúngicos e direcionamento do tratamento de acordo com a cultura e

susceptibilidade das drogas até a decisão para a retirada do cateter intravenoso, conforme

recomendações emanadas da Sociedade Americana de Doenças Infecciosas (Chahoud et al.,

2013).

Para o cumprimento dos propósitos desta pesquisa, as amostras utilizadas estavam

armazenadas na micoteca da SABMI ∕ IEC com a identificação de C. parapsilosis pelo

método ID 32®

(bioMérieux, França) e a reidentificação pela metodologia automatizada

58

VITEK 2®

(bioMérieux, França) não foi eficiente para a identificação das espécies crípticas

do complexo, uma vez que das 52 amostras apenas 44 apresentaram-se como C. parapsilosis,

e 8 isolados obtiveram resultado inconclusivo variando entre outras espécies do gênero

Candida (C. famata/C. tropicalis, C. famata, C. albicans, C. famata/C. guilermondii).

De igual forma, Abi-chacra et al. (2013) avaliaram os perfis enzimáticos metabólicos e

a assimilação de carboidratos de 11 isolados clínicos pelo sistema VITEK®

2, sendo todos

identificados como C. parapsilosis, mas posteriormente foram identificados molecularmente

como C. parapsilosis (n=9) e C. orthopsilosis (n=2). No citado estudo as divergências

ocorreram na assimilação de 7 carboidratos, enquanto que na presente pesquisa ocorreram

diferenças na assimilação de 21 carboidratos. Faz-se necessário, entretanto, considerar o

pequeno número amostral daquele (n=11) em relação à esta (n=52), bem como o fato aqui

demonstrado de que mesmo dentro do grupo de C. parapsilosis (posteriormente confirmadas

por biologia molecular como stricto sensu) existiram divergências de assimilação dos

sacarídeos.

Em outro estudo com 81 amostras de Candida submetidas à avaliação pelo sistema

Mini API®

(bioMérieux, França) observou-se que 37% das Candida não-albicans não

puderam ser identificadas (Nunes et al., 2011), corroborando os dados da presente pesquisa

quanto à limitação destes sistemas automatizados para a identificação em nível de espécie

para o complexo C. parapsilosis.

Semelhantemente, o ensaio para a avaliação da aplicabilidade do ágar Eosina Azul de

Metileno (EAM), como meio de identificação presuntiva para leveduras do complexo C.

parapsilosis não demonstrou um padrão específico de coloração e pigmento para cada

espécie, pois todos os isolados tiveram como coloração predominante o rosa, que em alguns

isolados se mantém ou modifica após 24 horas de cultivo. A identificação através do semeio

em ágar EAM seria uma escolha mais prática, relativamente rápida (leitura em 2 ou 3 dias) e

menos onerosa. Este é um método eficaz para a identificação fenotípica do complexo C.

parapsilosis, pois todas apresentaram coloração rosa. Por outro lado não permite a

identificação em nível de espécies do complexo C. parapsilosis.

A identificação presuntiva de espécies do gênero Candida a partir de meios

cromogênicos tem sido testada no ágar Müeller–Hinton com Glicose e Azul de Metileno

(Vasconcelos Jr et al., 2011) e no ágar Cromogênico Candida (Ghelardi et al., 2008;

Vasconcelos Jr et al., 2011), contudo, os dados de utilização do ágar EAM apresentados na

59

presente pesquisa para identificação de leveduras do complexo C. parapsilosis são inéditos na

literatura.

A identificação em nível de espécie foi realizada mediante a técnica molecular da PCR

utilizando os primers espécie-específicos, atestando a presença em maior número da espécie

C. parapsilosis stricto sensu (n=44, 85%), seguida da espécie C. orthopsilosis (n=5, 9%), e C.

metapsilosis (n=3, 6%) figurando em terceiro lugar em número de isolados da coleção de

leveduras estudadas. Estes dados estão de acordo com a epidemiologia internacional (Tavanti

et al., 2005; van Asbeck et al., 2008; Chen et al., 2010; de Toro et al., 2011; Hays et al.,

2011; Vercher et al., 2011; Pemán et al., 2012) e nacional (Bonfietti et al., 2012; Abi-chacra

et al., 2013) atestando a espécie C. parapsilosis como mais prevalente, seguida das espécies

C. orthopsilosis e C. metapsilosis.

Algumas peculiaridades regionais também têm sido observadas como num estudo

multicêntrico na Espanha no qual dentre o total de isolados (n 1357) de hemoculturas

analisadas, C. orthopsilosis foi a quinta mais comum causa de fungemia (Pemán et al., 2012).

Outro estudo, desta vez na China, observou uma frequência de isolamento significativamente

elevada de C. metapsilosis (35,5%) dentre os 31 isolados analisados, dos quais a maioria foi

recuperada de amostras cutâneas ou mucocutâneas (Ge et al., 2011). Todavia, número maior

de pesquisas tem ratificado a menor frequência de C. metapsilosis no complexo (Lockhart et

al., 2008; Chen et al., 2010; Bonfietti et al., 2012; Abi-chacra et al., 2013). Esta menor

frequência não significa menor significância clínica, pois sua ocorrência em infecções de

corrente sanguínea tem sido comprovada, não devendo, portanto, ser subestimada (Gomez-

Lopez et al., 2008).

Em relação aos espécimes clínicos ou sítios anatômicos de onde têm sido recuperadas

as espécies do complexo C. parapsilosis, os estudos são bastante divergentes, mas na maioria

das pesquisas os isolados de C. parapsilosis têm sido recuperados do sangue em maior

proporção (van Asbeck et al., 2008; Chen et al., 2010; Mirhendi et al., 2010; de Toro et al.,

2011; Romeo et al., 2012) em relação às amostras cutâneas ou mucocutâneas (Feng et al.,

2012; Abi-chacra et al., 2013; Bertini et al., 2013), cujos trabalhos realmente estão publicados

em menor número. Na pesquisa ora apresentada, as cepas cultivadas e armazenadas na

micoteca foram originadas de espécimes superficiais em grande parte em relação às amostras

de sangue, contudo, este dado pode ser explicado pelo caráter ambulatorial do atendimento do

laboratório de Micologia da SABMI ∕ IEC. As amostras sanguíneas ou de lavado bronco-

60

alveolar encaminhadas pelos hospitais da região são em menor quantidade em relação

àquelas.

Quanto à atividade das exoenzimas urease, caseinase e gelatinase, todas as leveduras

do complexo C. parapsilosis apresentaram resultado negativo, bem como a produção de

DNase foi observada apenas em 4 (9%) amostras do grupo de C. parapsilosis.

A exoenzima urease, que catalisa a conversão de uréia em amônia, já foi formalmente

demonstrada como um importante fator de virulência para fungos dimórficos como

Histoplasma, Coccidioides e Paracoccidioides (Rappleye & Goldman, 2006), assim como

para Cryptococcus neoformans (Singhet al., 2013). Para leveduras do gênero Candida não há

relatos na literatura.

A atividade da exoenzima caseinase tem sido demonstrada como fator de virulência

em bactérias da espécie Enterococcus faecalis. Furumura et al. (2006) realizaram estudo com

32 isolados de E. faecalis, sendo documentada produção desta exoenzima por 24 cepas (75%).

Os autores chamaram a atenção para a caseinase como fator de virulência causador de dano à

célula epitelial humana. Não existem dados na literatura para a atividade desta exoenzima em

Candida.

A produção de gelatinase também tem sido registrada em E. faecalis. Em um estudo

multicêntrico e prospectivo realizado nos EUA, foram recuperados 219 isolados de

Enterococcus faecalis de 398 pacientes com bacteremia enterocócica, resultando em que 64%

dos isolados produziram gelatinase, contudo a presença deste fator de virulência não foi

associada a um mau desfecho como a mortalidade (Vergis et al., 2002). Outro estudo com

número menor de isolados de E. faecalis, porém, não obteve resultados positivos para a

gelatinase (Furumura et al., 2006).

Quanto à DNase, um estudo na Turquia investigou a atividade da DNase em 851

isolados de estafilococos recuperados de amostras de leite e sinalizou a importância desta

enzima para a distinção entre estafilococos patogênicos e a flora residente não patogênica

(Citak et al., 2003). Ainda não se conhece o potencial desta enzima na patogênese das

candidemias, mas considerando que 9% dos isolados de C. parapsilosis produziram esta

enzima, serão necessários mais estudos que esclareçam sua relevância na patogenia fúngica.

Concernente às demais exoenzimas testadas, as amostras de C. parapsilosis, C.

orthopsilosis e C. metapsilosis, foram hábeis em produzir lipase (98%, 100%, 100%,

respectivamente), proteinase (95%, 80%, 67%, respectivamente), e a exoenzima fosfolipase

61

(50%, 60%, 67%, respectivamente). Destas exoenzimas, a lipase foi fortemente produzida

pelas espécies do complexo.

A lipase foi demonstrada como um fator de virulência determinante em C.

parapsilosis e o metabolismo de lipídeos e virulência fúngica são pouco compreendidos

(Nguyen et al., 2009), todavia, já é conhecida a relevância desta enzima na patogenicidade

devido à digestão de lipídeos provendo nutrientes para o fungo, bem como pelo seu papel no

inicio da inflamação devido à lise da microbiota concorrente e células do sistema de defesa do

hospedeiro (Trofa et al., 2008). De fato, Abi-chacra et al. (2013) conjecturam que o papel das

lipases e fosfolipases em fungos capazes de causar micoses cutâneas e subcutâneas é

provavelmente devido à esta capacidade de causar hidrolise de gorduras no tecido subcutâneo

utilizando os resíduo de ácido graxos como fonte de nutrientes.

Considerando que as leveduras do complexo C. parapsilosis são oportunistas afetando

pacientes imunocomprometidos e dentre estes, os recém-nascidos com muito baixo peso, faz-

se necessário conhecer os fatores que contribuem para o aumento da susceptibilidade para

candidíase invasiva nestes pacientes. Para tanto, Trofa et al. (2011), propuseram um modelo

experimental de filhotes de ratos visando avaliar o impacto de genes específicos na

patogênese da doença, como os genes CpLIP1e CpLIP2 que determinam a expressão das

lipases. Os resultados atestaram entre outras coisas que as lipases são importantes para a

invasão de órgãos do hospedeiro (Trofa et al., 2011).

Em outro modelo in vivo com larvas de Galleria mellonella, Németh et al (2013)

demonstraram que as lipases do complexo C. parapsilosis tiveram maior capacidade

prejudicial da célula hospedeira e foram mortos menos eficientemente por macrófagos, o que

indica que a atividade desta enzima proporciona uma vantagem seletiva às células de Candida

durante a infecção.

No presente trabalho as três espécies expressaram alta produção de lipases, enquanto

que Németh et al. (2013) consideraram a espécie C. metapsilosis menos virulenta quanto à

expressão de enzimas lipolíticas. As variações da atividade lipolítica do complexo C.

parapsilosis podem ser devidas ao uso de metodologias diversas, bem como devido às

variações biológicas próprias das cepas em estudo (van Asbeck et al., 2009 ; Ge et al., 2011).

Quanto à secreção de fosfolipases, em C. albicans seu papel já foi elucidado como

fator de virulência sendo considerada essencial para a invasão da mucosa epitelial do

hospedeiro, visto que catalisam a hidrólise dos fosfolipídeos das membranas celulares

(Ibrahim et al., 1995). Contudo, em C. parapsilosis são poucos os estudos para o

62

esclarecimento do seu papel na patogênese (Trofa et al.,2008). Num estudo realizado na

China com 31 amostras sendo a maioria da pele, demonstrou que 90,5 % de isolados de C.

parapsilosis e 91,7% de C. metapsilosis eram produtores de fosfolipase, mas não haviam

isolados de C. orthopsilosis (Ge et al., 2011). Também para esta enzima são necessários mais

estudos que investiguem sua relação com a patogenicidade das espécies do complexo C.

parapsilosis.

Referente à atividade proteolítica das proteinases, tanto em isolados de C. albicans

quanto não-albicans são capazes de produzi-las, sendo descritas como responsáveis pela

adesão, dano tecidual e invasão (Mohan & Ballal, 2008). Curiosamente, Tavanti et al. (2010)

sugerem que existe uma correlação inversa estatisticamente significativa entre a secreção de

proteinases e a formação de biofilme propondo que as proteinases promovem o

desprendimento do biofilme maduro, pois neste trabalho 66% dos isolados da espécie C.

parapsilosis (stricto sensu) produziram proteinase, porém não foram capazes de produzir

biofilme. Tais dados são contrários aos do presente estudo, uma vez que os isolados de C.

parapsilosis (stricto sensu) exibiram tanto atividade para proteinase (95%) quanto para matriz

extracelular (100%). Resultado análogo foi obtido em estudo brasileiro no qual a formação de

biofilme foi positivamente correlacionada com a produção de proteinase com 100 % das cepas

estudadas (n=11) produtoras de proteinase (Abi-chacra et al., 2013).

Algumas das proteinases de C. parapsilosis têm sido caracterizadas e já se conhece

pelo menos duas destas enzimas, Sapp1p e Sapp2p produtos dos genes SAPP1 e SAPP2, cujos

papeis têm sido investigados para elucidar seus potenciais efeitos patogênicos (Merkerová et

al., 2006).

Quanto aos biofilmes, segundo Pasternak (2009) pouco ainda se conhece das

implicações dos mesmos em patologia humana, especialmente considerando que a presença

deste fator de virulência nos focos infecciosos torna o tratamento com os antimicrobianos

mais complicado. Esta complicação é devida, entre outros fatores, à penetração limitada de

substâncias e de células inflamatórias através da matriz do biofilme (Estivill et al., 2011),

configurando resistência ao antifúngico utilizado (Kuhn et al., 2002).

Estruturalmente, os biofilmes de C. parapsilosis exibem maior heterogeneidade

estrutural e uma densidade de células menor, após 48 h de incubação em ágar nutriente em

comparação com os biofilmes de C. albicans, fato que os diferencia na penetração de

antifúngicos nas matrizes dos mesmos (Samaranayake et al., 2005).

63

No presente estudo, todos os isolados do complexo C. parapsilosis manifestaram

habilidade entre fraca, moderada e alta produção de biofilme. Apenas 6 isolados (13%) de C.

parapsilosis foram fracamente produtores. Todos os demais isolados de C. parapsilosis, C.

metapsilosis e C. orthopsilosis foram moderadamente ou fortemente produtores de biofilme.

Estes resultados estão condizentes com a pesquisa de Lattif et al. (2010), os quais testaram 10

amostras de cada espécie do complexo C. parapsilosis provenientes de vários países do

mundo e atestaram que todos os isolados foram hábeis em formar biofilme.

Contrastando com os dados do presente estudo, na pesquisa de Tavanti et al. (2007),

nenhum dos isolados de C. orthopsilosis produziram biofilme assim como 95% das cepas de

C. metapsilosis não formaram biofilme in vitro. A falha de C. orthopsilosis em produzir

matriz extracelular contribuiria, portanto, para a relativa baixa frequência desta espécie em

ambiente clínico (Tavanti et al., 2007)

A capacidade de formação de biofilme por C. parapsilosis lato sensu foi avaliada em

23 isolados num estudo espanhol cujos resultados demonstraram ótima habilidade de

formação de biofilme em três materiais comumente utilizados como matéria prima na

fabricação de cateteres: cloreto de polivinil (PVC), poliuretano e teflon. Este dado é de grande

relevância considerando a habilidade de C. parapsilosis em colonizar a pele e em aderir em

dispositivos plásticos médicos de longa permanência como os cateteres (Estivill et al., 2011).

E uma vez comprovada esta competência para a colonização de superfícies estranhas (Trofa et

al., 2008; Tavanti et al., 2010; Estivill et al., 2011; Sifuentes-Osornio et al., 2012), na prática

clínica esta colonização pode ser reduzida ou evitada com os devidos cuidados de antissepsia

na colocação destes dispositivos invasivos, e pela utilização dos mesmos no menor tempo

possível (Pasternak, 2009).

Alguns avanços têm ocorrido quanto ao conhecimento biomolecular da formação de

biofilmes, pois recentemente foi caracterizado um gene de C. parapsilosis, o Fas2,

comprovando-se que este gene CpFas2 é essencial para o crescimento do fungo e para a

formação de biofilme (Nguyen et al., 2009). Adicionalmente, foi demonstrado que em C.

parapsilosis o fator de transcrição BCR1 (Biofilm and Cell wall Regulator 1) é requerido para

este processo de formação in vivo do biofilme e que as proteínas CFEM (common in fungal

extracellular membranes) estão envolvidas na aquisição de ferro, um nutriente limitante e

essencial para sobrevivência do fungo patogênico (Ding et al., 2011). Estas descobertas são

promissoras para futuros alvos de ação de drogas antifúngicas, entretanto, muito ainda se

precisa avançar considerando que 44% dos genes promotores da regulação gênica em

64

biofilmes intermediários de Candida e 40% dos genes que têm sua regulação reprimida em

biofilmes maduros atualmente têm funções desconhecidas (Costa et al., 2013).

Pesquisas também têm sido conduzidas no sentido de se conhecer a perfusão de

antifungicos através dos biofilmes, como demostrado nos resultados de Samaranayake et al.

(2005) os quais avaliaram a perfusão dos agentes antifúngicos anfotericina B, fluconazol e

flucitosina em biofilmes de C. parapsilosis, C. albicans e C. krusei desenvolvidos em filtros

microporosos. O transporte de antifúngicos através do biofilme de C. albicans foi mais difícil

em relação aos biofilmes de C. parapsilosis e C. krusei e os níveis de perfusão de fluconazol e

flucitocina foram mais penetrantes do que anfotericina B, embora este tenha causado mais

danos estruturais nas células superficiais do biofilme em comparação com os outros dois

antifúngicos (Samaranayake et al., 2005). Do ponto de vista clínico estes resultados ratificam

a importância da identificação do agente infectante em nível de espécie para a melhor

condução do tratamento.

No que concerne ao ensaio de susceptibilidade, para o fluconazol, 11% dos isolados de

C. parapsilosis apresentaram perfil de resistência, enquanto que as espécies C. orthopsilosis e

C. metapsilosis foram sensíveis a este fármaco. As três espécies tiveram isolados com

sensibilidade dose-dependente ao itraconazol: 14%, 20% e 67%, respectivamente. A droga

anfotericina B apresentou ótima atividade in vitro contra as três espécies, pois 100% de todos

os isolados foram sensíveis.

Estes dados estão em consonância com um estudo com um amplo número de amostras

(n 1357) na Espanha, o qual revelou moderada alteração nas taxas de resistência nos isolados

de C. parapsilosis ao fluconazol (de 0% a 4,1%), mas os isolados de C. orthopsilosis foram

todos sensíveis aos fármacos testados (fluconazol, itraconazol, voriconazol, anfotericina B,

dentre outros) (Pemán et al., 2012). Outro estudo na Espanha obteve resultados semelhantes a

estes (Gomez-Lopez et al., 2008).

Um estudo de vigilância com isolados de diversos países coletados nos anos de 2001 a

2005, não evidenciou aumento da resistência aos azóis entre os isolados de C. parapsilosis

(Pfaller et al., 2008), tal como em várias partes do mundo tem sido documentada a

sensibilidade de C. orthopsilosis e de C. metapsilosis aos azólicos e à anfotericina B (Silva et

al., 2009; Miranda-Zapico et al., 2011; Romeo et al., 2012). Todavia, já se tem observada

ocorrência de C. parapsilosis multiazol resistente (Silva et al., 2009) e de C. metapsilosis

resistente ou sensibilidade dose-dependente ao fluconazol (van Asbeck et al., 2008; Chen et

al., 2010).

65

Um dado a ser evidenciado é que todas as espécies do complexo C. parapsilosis

tiveram cepas com sensibilidade dose-dependente in vitro ao itraconazol. Conforme Aguado

et al. (2011), o itraconazol não oferece vantagem em relação ao fluconazol devido entre

outros fatores, à sua concentração sérica ser imprevisível e muito variada. Outro resultado a

ser destacado foi a sensibilidade de todos os isolados do complexo C. parapsilosis analisados

no presente estudo, ao fármaco anfotericina B. Este dado é de grande relevância posto que

formulações lipídicas de anfotericina B têm demonstrado atividade até contra biofilmes de C.

parapsilosis (Kuhn et al., 2002).

Com relação ao Brasil, um estudo realizado com 100 isolados de hemoculturas

provenientes de um hospital universitário apontou que 94% dos isolados de C. parapsilosis

(stricto sensu) foram sensíveis ao fluconazol e 6% tiveram sensibilidade intermediária

(inclusive com um isolado apresentando alto valor de CIM), mas para o itraconazol 100% dos

isolados foram sensíveis. Os isolados de C. orthopsilosis foram todos sensíveis aos fármacos

testados, dentre os quais fluconazol e itraconazol. Neste estudo nenhum dos isolados foi

reclassificado como C. metapsilosis (Bonfietti et al., 2012).

Infelizmente os dados de perfil de susceptibilidade do complexo C. parapsilosis aos

antifúngicos são escassos no Brasil (Colombo et al., 2006; Sifuentes-Osornio et al., 2012) e

na Região Norte são mais exíguos ainda. Alguns estudos nacionais designam as amostras

como C. parapsilosis sem, contudo, procederem à devida diferenciação molecular das demais

espécies do complexo C. parapsilosis (Stoppa et al., 2009; Favalessa et al., 2010).

Recente estudo de Nunes et al. (2011) com 7 amostras (coletadas entre 2008 a 2010)

procedentes de colonização e de infecção hospitalar de um hospital universitário de referência

em Belém do Pará, apontou sensibilidade de C. parapsilosis (lato sensu) numa frequência de

100% aos antifúngicos fluconazol, itraconazol, voriconazol e anfotericina B. Entretanto, o

número amostral foi pequeno (n 7) bem como dentre estas amostras poderiam haver isolados

de C. orthopsilosis ou C. metapsilosis, uma vez que o estudo não utilizou a identificação

molecular.

Igualmente, outro estudo realizado no Nordeste, com 57 cepas de C. parapsilosis

provenientes de pacientes atendidos em Hospitais do Ceará, apontou que todos os

antifúngicos testados, dentre os quais fluconazol, itraconazol e anfotericina B, apresentaram

atividade contra C. parapsilosis, não sendo detectado nenhum isolado resistente às drogas

testadas (Menezes et al., 2012). Também neste trabalho não foi realizada a identificação

molecular das espécies do complexo.

66

A presente pesquisa, portanto, é pioneira no conhecimento da ocorrência das espécies

C. parapsilosis (stricto sensu), C. orthopsilosis e C. metapsilosis, assim como seus perfis de

virulência e susceptibilidade aos antifúngicos no Pará. Contudo, é necessária a ampliação do

estudo no sentido de se conhecer a incidência destas espécies nas UTIs dos hospitais da

região, sejam em espécimes clínicos relacionados a infecções superficiais ou sistêmicas,

sejam em amostras ambientais, bem como manter vigilância laboratorial pelo monitoramento

de resistência aos fármacos utilizados na prática clínica, visando, sobretudo, o uso racional do

limitado número de drogas antifúngicas disponíveis.

67

5 CONCLUSÕES

- Os sistemas semi-automatizados e automatizados não permitem diferenciar as

espécies do complexo C. parapsilosis;

- As espécies crípticas apresentam heterogeneidade quanto à assimilação de

carboidratos, variando neste aspecto bioquímico tanto intraespécie quanto interespécie;

- O meio ágar Eosina Azul de Metileno (EAM) sugere tratar-se de alguma espécie

pertencente ao complexo, porém não tem aplicação como meio de identificação presuntiva

para individualização das espécies propriamente ditas;

- A espécie C. parapsilosis é a mais prevalente, ocorrendo também no Pará as espécies

C. orthopsilosis e C. metapsilosis;

- As exoenzimas gelatinase, urease e caseinase parecem não fazer parte das estratégias

de patogenicidade e virulência das espécies do complexo C. parapsilosis, uma vez que não

foram secretadas pelas mesmas;

- As espécies do complexo C. parapsilosis exibiram alto grau de atividade hidrolítica

através da produção de fosfolipase, lipase e proteinase, as quais têm sido reconhecidas pelo

seu importante papel na virulência fúngica;

- A DNase foi secretada por um pequeno número de amostras de C. parapsilosis sendo

necessários mais estudos com maior número amostral para a investigação do seu potencial na

patogenicidade das espécies do complexo;

- Todos os isolados analisados foram produtores de biofilme demonstrando sua

potencialidade de virulência;

- Existe a necessidade de monitoramento local do perfil de susceptibilidade de C.

parapsilosis ao fluconazol, pois alguns isolados desta espécie apresentaram resistência a este

fármaco;

- O itraconazol deve ter seu uso analisado com critério, pois pelo menos uma amostra

de cada espécie apresentou sensibilidade dose-dependente a esta droga;

- A anfotericina B continua a ser uma escolha terapêutica eficaz do ponto de vista da

sua atividade antifúngica in vitro para as três espécies do complexo C. parapsilosis.

68

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABI-CHACRA, E.A., SOUZA, L.O.P., CRUZ, L.P., BRAGA-SILVA, L.A., GONÇALVES,

D.S., SODRÉ, C.L., RIBEIRO, M. D., SEABRA, S.H., FIGUEIREDO-CARVALHO,

M.H.G., BARBEDO, L.S., ZANCOPÉ-OLIVEIRA, R.M., ZICCARDI, M., SANTOS,

A.L.S. Phenotypical properties associated with virulence from clinical isolates belonging

to the Candida parapsilosis complex. Federation of European Microbiological

Societies Yeast Research 13 (8): 1-18, 2013.

AGUADO, J.M., RUIZ-CAMPS, I., MUNOZ, P., MENSA, J., ALMIRANTE, B.,

VÁZQUEZ, L., ROVIRA, M., MARTÍN-DÁVILA, P., MORENO, A., ÁLVAREZ-

LERMA, F., LEÓN, C., MADERO, L., RUIZ-CONTRERAS, J., FORTÚN, J.,

CUENCA-ESTRELLA, M. Recomendaciones sobre el tratamiento de la candidiasis

invasiva y otras infecciones por levaduras de la Sociedad Espanola de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Actualización 2011. Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica 29 (5): 345-361, 2011.

ANVISA – AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Disponível em:

<http://www7.anvisa.gov.br/datavisa/consulta_produto/rconsulta_produto_detalhe.asp>

Acesso em 20/02/2013.

ARAUJO, C.R., MIRANDA, K.C., PASSOS, X.S., SOUZA, L.K.H., LEMOS, J.A., KHRAIS,

C.H.A., COSTA, C.R., SILVA, M.R.R., FERNANDES, O.F.L. Identificação das

Leveduras do Gênero Candida por Métodos Manuais Convencionais e pelo Método

Cromógeno ChromagarTM

Candida. Revista de Patologia Tropical 34 (1): 37-42, 2005.

BALE, M.J., YANG, C., PFALLER, M.A. Evaluation of growth characteristics on blood agar

and eosin methylene blue agar for the identification of Candida (Torulopsis) glabrata.

Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases 28: 65-67.1997.

BERTINI, A., DE BERNARDIS, F., HENSGENS, L.A.M., SANDINI, S., SENESI, S.,

TAVANTI, A. Comparison of Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis, and Candida

metapsilosis adhesive properties and pathogenicity. International Journal of Medical

Microbiology 303: 98-103, 2013.

BIZERRA, F.C., MELO, A.S.A., KATCHBURIAN, E., FREYMÜLLER, E., STRAUS, A.H.,

TAKAHASHI, H.K., COLOMBO, A.L. Changes in Cell Wall Synthesis and

Ultrastructure during Paradoxical Growth Effect of Caspofungin on Four Different

Candida Species. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55 (1): 302-310, 2011.

BLISS, J.M., WONG, A.Y., BHAK, G., LAFORCE-NESBITT, S.S., TAYLOR, S., TAN, S.,

STOLL, B.J., HIGGINS, R.D., SHANKARAN, S., BENJAMIN, D.K. Candida Virulence

Properties and Adverse Clinical Outcomes in Neonatal Candidiasis. Journal of

Pediatrics 161: 441-447, 2012.

BONASSOLI, L.A., BERTOLI, M., SVIDZINSKI, T.I.E. High frequency of Candida

parapsilosis on the hands of healthy hosts. Journal of Hospital Infection 59: 159-162,

2005.

BONFIETTI, L.X., SZESZS, M.W., CHANG, M.R., MARTINS, M.A., PUKINSKAS,

S.R.B.S., NUNES, M.O., PEREIRA, G.H., PANIAGO, A.M.M., PURISCO, S.U.,

http://www7.anvisa.gov.br/datavisa/consulta_produto/rconsulta_produto_detalhe.asp

69

MELHEM, M.S.C. Ten-Year Study of Species Distribution and Antifungal

Susceptibilities of Candida Bloodstream Isolates at a Brazilian Tertiary Hospital.

Mycopathologia 174: 389-396, 2012.

BOURGEOIS, N., DEHANDSCHOEWERCKER, L., BERTOUT, S., BOUSQUET, P.-J.,

RISPAIL, P., LACHAUD, L. Antifungal Susceptibility of 205 Candida spp. Isolated

Primarily during Invasive Candidiasis and Comparison of the Vitek 2 System with the

CLSI Broth Microdilution and Etest Methods. Journal of Clinical Microbiology 1 (48):

154–161, 2010.

BUTLER, G., RASMUSSEN, M.D., LIN, M.F., SANTOS, M.A.S., SAKTHIKUMAR, S.,

MUNRO, C.A., RHEINBAY, E., GRABHERR, M., FORCHE, A., REEDY, J.L.,

AGRAFIOTI, I., ARNAUD, M.B., BATES, S., BROWN, J.P., BRUNKE, S.,

COSTANZO, M.C., FITZPATRICK, D.A., de GROOT, P.W.J., HARRIS, D., HOYER,

L.L., HUBE B., KLIS, F.M., KODIRA, C., LENNARD, N., LOGUE, M.E., MARTIN,

R., NEIMAN, A.M., NIKOLAOU, E., QUAIL, M., QUINN, J., SANTOS, M.C.,

SCHMITZBERGER, F.F., SHERLOCK, G., SHAH, P., SILVERSTEIN, K.A.T.,

SKRZYPEK, M.S., SOLL, D., STAGGS, R., STANSFIELD, I., STUMPF, M.P.H.,

SUDBERY, P.E., SRIKANTHA, T., ZENG, Q., BERMAN, J., BERRIMAN, M.,

HEITMAN J., GOW, N.A.R., LORENZ, M.C., BIRREN, B.W., LIS, M.K., CUOMO,

C.A. Evolution of pathogenicity and sexual reproduction in eight Candida genomes.

Nature 459: 657-662, 2009.

BRUDER-NASCIMENTO, A., CAMARGO, C.H., SUGIZAKI, M.F., SADATSUNE, T.,

MONTELLI, A.C., MONDELLI, A.L., BAGAGLI, E. Species distribution and

susceptibility profile of Candida species in a Brazilian public tertiary Hospital. BMC

Research Notes 3: 1, 2010.

CATALOGUE OF LIFE. Desenvolvido por ETI Naturalis. Disponível em

<http://www.catalogueoflife.org/col/browse/tree/id/15849793> Acesso em 20/01/2014.

CHAGAS-NETO, T.C., CHAVES, G.M., COLOMBO, A.L. Update on the Genus

Trichosporon. Mycopathologia 166: 121-132, 2008.

CHAHOUD, J., KANAFANI, Z.A., KANJ, S.S. Management of candidaemia and invasive

candidiasis in critically ill patients. International Journal of Antimicrobial Agents 425:

529-535, 2013.

CHEN Y-C., LIN, Y-H, CHEN K-W., LII, J., TENG H-J., LI, S-Y. Molecular epidemiology

and antifungal susceptibility of Candida parapsilosis sensu stricto, Candida orthopsilosis,

and Candida metapsilosis in Taiwan. Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases

68: 284-292, 2010.

CHEN, G-L., CHEN, Y., ZHU, C-Q., YANG, C., YE, S. Invasive fungal infection in Chinese

patients with systemic lupus erythematosus. Clinical Rheumatology 31: 1087-1091,

2012.

CHRISTENSEN, W.B. Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and

paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella types. Journal of

Bacteriology 52: 461-466, 1946.

http://www.catalogueoflife.org/col/browse/tree/id/15849793

70

CITAK, S., VARLIK, O., GUNDOGAN, N. Slime Production and Dnase Activity of

Staphylococci Isolated From Raw Milk. Journal of Food Safety 23:281-288, 2003.

CLSI/NCCLS - Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a

Determinação da Sensibilidade a Terapia Antifúngica das Leveduras. Norma

Aprovada – Segunda edição. Norma M27-A2 do NCCLS. Wayne, Pennsylvania, 2002.

COLOMBO, A.L., NUCCI, M., PARK B.J., NOUER, S.A., ARTHINGTON-SKAGGS, B.,

DA MATTA, D.A., WARNOCK, D., MORGAN, J. Epidemiology of Candidemia in

Brazil: a Nationwide Sentinel Surveillance of Candidemia in Eleven Medical Centers.

Journal of Clinical Microbiology 44 (8): 2816-2823, 2006.

COLOMBO, A.L., PADOVAN, A.C.B., CHAVES, G.M. Current Knowledge of

Trichosporon spp. and Trichosporonosis. Clinical Microbiology Reviews 24: 682-700,

2011.

COLOMBO, A.L., GUIMARÃES, T., CAMARGO, L.F.A., RICHTMANN, R., QUEIROZ-

TELLES, F., SALLES, M.J.C.S., CUNHA, C.A., YASUDA, M.A.S., MORETTI, M.L.,

NUCCI, M. Brazilian guidelines for the management of candidiasis – a joint meeting

report of three medical societies: Sociedade Brasileira de Infectologia, Sociedade Paulista

de Infectologia and Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. The Brazilian Journal of

Infectious Diseases 17 (3):283–312, 2013.

COSTA, A.C.B.P., PEREIRA, C.A., FREIRE, F., JUNQUEIRA, J.C., JORGE, A.O.C.,

Methods for obtaining reliable and reproducible results in studies of Candida biofilms

formed in vitro. Mycoses 56 (6): 614-622, 2013.

DAVEY, M.E., O’TOOLE, G.A. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics.

Microbiology and Molecular Biology Reviews 64 (4): 847-867, 2000.

DE COL, A.P., SAVI, D.C., ONOFRE, S.B. Identification of Candida yeast obtained from

patients with urinary tract infection by the CHROMagar® Candida chromogenic method.

Revista Brasileira de Análises Clínicas 41 (4): 279-281, 2009.

DE TORO, M., TORRES, M.J., MAITE, R., AZNAR, J. Characterization of Candida

parapsilosis complex isolates. Clinical Microbiology and Infection 17 (3): 418-424,

2011.

DING, C., VIDANES, G.M., MAGUIRE, S.L., GUIDA, A., SYNNOTT, J.M., ANDES, D.R.,

BUTLER, G. Conserved and Divergent Roles of Bcr1 and CFEM Proteins in Candida

parapsilosis and Candida albicans. PLoS ONE 6 (12): 1-11, 2011.

ESTIVILL, D., ARIAS, A., TORRES-LANA, A., CARRILLO-MUNOZ, A.J., ARÉVALO,

M.P. Biofilm formation by five species of Candida on three clinicals materials. Journal

of Microbiological Methods 86: 238-242, 2011.

FAVALESSA, O.C., MARTINS, M.A., HAHN, C. Aspectos micológicos e suscetibilidade in

vitro de leveduras do gênero Candida em pacientes HIV-positivos provenientes do Estado

do Mato Grosso. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 43 (6): 673-

677, 2010.

http://lattes.cnpq.br/7106567615656883

http://lattes.cnpq.br/1463249528959656

71

FENG, X., LING, B., YANG, G., YU, X., REN, D., YAO, Z. Prevalence and Distribution

Profiles of Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis

Responsible for Superficial Candidiasis in a Chinese University Hospital.


FURUMURA, M.T., FIGUEIREDO, P.M., CARBONELL, G.V., DA COSTA DARINI,

A.L., YANO, T. Virulence-associated characteristics of Enterococcus faecalis strains

isolated from clinical sources. Brazilian Journal of Microbiology 37 (3):230-236, 2006.

GÁCSER, A., TROFA, D., SCHÄFER, W., NOSANCHUK, J.D. Targeted gene deletion in

Candida parapsilosis demonstrates the role of secreted lipase in virulence. The Journal

of Clinical Investigation 117 (10): 3049-3058, 2007.

GARCIA-EFFRON, G., CANTON, E., PEMÁN, J., DILGER, A., ROMÁ, E., PERLIN, D.S.

Assessment of Two New Molecular Methods for Identification of Candida parapsilosis

Sensu Lato Species. Journal of Clinical Microbiology 49 (9): 3257-3261, 2011.

GARCIA MARTÍNEZ, J.M., VALENTÍN GÓMEZ, E., PEMÁN, J., CANTÓN, E., GÓMEZ

GARCÍA, M., DEL CASTILLO AGUDO, L. Identification of pathogenic yeast species

by polymerase chain reaction amplification of the RPS0 gene intron fragment. Journal of

Applied Microbiology 108: 1917-1927, 2010.

GE, Y.P., LU, G.X., SHEN, Y.N., LIU, W.D. In vitro evaluation of phospholipase, proteinase,

and esterase activities of Candida parapsilosis and Candida metapsilosis.


GHELARDI, E., PICHIERRI, G., CASTAGNA, B., BARNINI, S., TAVANTI, A., CAMPA,

M. Efficacy of Chromogenic Candida Agar for isolation and presumptive identification of

pathogenic yeast species. Clinical Microbiology and Infection 14 (2): 141-147, 2008.

GOMEZ-LOPEZ. A., ALASTRUEY-IZQUIERDO, A., RODRIGUEZ, D., ALMIRANTE, B.,

PAHISSA, A., RODRIGUEZ-TUDELA, J. L., CUENCA-ESTRELLA, M. Prevalence

and Susceptibility Profile of Candida metapsilosis and Candida orthopsilosis: Results

from Population-Based Surveillance of Candidemia in Spain. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy52 (4):1506-1509, 2008.

HAYS, C., DUHAMEL, C., CATTOIR, V., BONHOMME, J. Rapid and accurate

identification of species belonging to the Candida parapsilosis complex by real-time PCR

and melting curve analysis. Journal of Medical Microbiology 60:477-480, 2011.

HENSGENS, L.A.M., TAVANTI, A., MOGAVERO, S., GHELARDI, E., SENESI, S. AFLP

genotyping of Candida metapsilosis clinical isolates: Evidence for recombination. Fungal

Genetics and Biology 46: 750-758, 2009.

HERNÁNDEZ-CASTRO, R., ARROYO-ESCALANTE, S., CARRILLO-CASAS, E.M.,

MONCADA-BARRÓN, D., ÁLVAREZ-VERONA, E., HERNÁNDEZ-DELGADO, L.,

TORRES-NARVÁEZ, P., LAVALLE-VILLALOBOS, A. Outbreak of Candida

parapsilosis in a neonatal intensive care unit: a health care workers source. European

Journal of Pediatrics 169: 783-787, 2010.

IBRAHIM, A.S., MIRBOD, F., FILLER, S.G., BANNO, Y., COLE, G.T., KITAJIMA, Y.,

EDWARDS JR, J.E., NOZAWA, Y., GHANNOUM, M.A. Evidence implicating

72

phospholipase as a virulence factor of Candida albicans. Infection Immunity 63: 1993-

1998, 1995.

JENKINS, S.G., SCHUETZ, A.N., Current Concepts in Laboratory Testing to Guide

Antimicrobial Therapy. Symposium on Antimicrobial Therapy. Mayo Clinic

Proceedings 87 (3): 290-308, 2012.

JUNIOR, A.M.S., MIRANDA, M.A.B.R., CAMARGO, Z.P. Trichosporon species isolated

from the perigenital region, urine and catheters of a Brazilian population. Brazilian

Journal of Microbiology 41: 628-634, 2010.

KONEMAN, E.W., ELMER, W., JANDA, W.M., SCHREKENBERGER, P.C., PROCOP,

G.W., WOODS, G.L., WINN, W.C.J. Koneman’s Color Atlas and Textbook of

Diagnostic Microbiology. Sixth Edition. Publishing house, Lippincott Williams &

Wilkins, 2008.

KUHN, D.M., GEORGE, T., CHANDRA, J., MUKHERJEE, P.K., GHANNOUM, M.A.

Antifungal susceptibility of Candida biofilms: unique efficacy of amphotericin B lipid

formulations and echinocandins. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46:1773–

1780, 2002.

KUHN, D.M., MUKHERJEE, P. K., CLARK, T.A., PUJOL, C., CHANDRA, J., HAJJEH,

R.A., WARNOCK, D.W., SOLL, D.R., GHANNOUM, M.A. Candida parapsilosis

Characterization in an Outbreak Setting. Emerging Infectious Diseases 10 (6): 1074-

1081, 2004.

KURTZMAN, P. C., FELL, J.W. The yeasts: a taxonomic study. 4ª Edição, Amsterdam:

Elsevier: 1055 p., 1998.

LACAZ, C.S., PORTO, E., MARTINS, J.E.C, HEINS-VACCARI, E.M., MELO, N.T.

Tratado de Micologia Médica. São Paulo: SARVIER, 2002.

LANGERON, M., TALICE, R. Nouvelles méthodes d’étude et essai de classification des

champignons lévuriformes. Annales de Parasitologie Humaine Comparee 10: 1-80,

1932.

LASS-FLÖRL, C. The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in Europe.

Mycoses 52: 197-205, 2009.

LASS-FLÖRL, C. Triazole Antifungal Agents in Invasive Fungal Infections: A Comparative

Review. Drugs 71 (18): 2405-2419, 2011.

LATTIF, A.A, MUKHERJEE, P.K., CHANDRA, J., SWINDELL, K., LOCKHART, S.R.,

DIEKEMA, D.J., PFALLER, M.A., GHANNOUM, M.A. Characterization of biofilms

formed by Candida parapsilosis, C. metapsilosis, and C. orthopsilosis. . International

Journal of Medical Microbiology 300: 265-270, 2010.

LAUPLAND, K.B., GREGSON, D.B., CHURCH, D.L., ROSS, T., ELSAYED, S. Invasive

Candida species infections: a 5 year population-based assessment. Journal of

Antimicrobial Chemotherapy 56: 532-537, 2005.

73

LIN, D., WU, L-C., RINALDI, M.G., LEHMANN, P.F. Three Distinct Genotypes within

Candida parapsilosis from Clinical Sources. Journal of Clinical Microbiology 33 (7):

1815-1821, 1995.

LOCKHART, S.R., MESSER, S.A., PFALLER, M.A., DIEKEMA, D.J. Geographic

Distribution and Antifungal Susceptibility of the Newly Described Species Candida

orthopsilosis and Candida metapsilosis in Comparison to the Closely Related Species

Candida parapsilosis. Journal of Clinical Microbiology 46 (8):2659–2664, 2008.

LÓPEZ-MARTÍNEZ, R., MANZANO-GAYOSSO, P., MIER, T., MÉNDEZ-TOVAR, L.J.,

HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ, F. Exoenzymes of dermatophytes isolated from acute and

chronic tinea. Revista Latinoamericana de Microbiología 36 (1): 17-20, 1994.

MACÊDO, D.P.C., FARIAS, A.M.A., NETO, R.G.L., SILVA, V.K.A., LEAL, A.F.G.,

NEVES, R.P. Infecções oportunistas por leveduras e perfil enzimático dos agentes

etiológicos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 42 (2): 188-191,

2009.

MENEZES, E.A., VASCONCELOS JÚNIOR, A.A.; CUNHA, F.A., CUNHA, M.C.S.O.,

BRAZ, B.H.L., CAPELO, L.G., SILVA, C.L.F. Identificação molecular e suscetibilidade

antifúngica de Candida parapsilosis isoladas no Ceará, Brasil. Jornal Brasileiro de

Patologia e Medicina Laboratorial 48 (6): 415-420, 2012.

MERKEROVÁ, M., DOSTÁL, J., HRADILEK, M., PICHOVÁ, I., HRUSKOVÁ-

HEIDINGSFELDOVÁ, O. Cloning and characterization of Sapp2p, the second aspartic

proteinase isoenzyme from Candida parapsilosis. Federation of European

Microbiological Societies Yeast Research 6: 1018-1026, 2006.

MÍMICA, L.M.J., UEDA, S.M.Y., MARTINO, M.D., NAVARINI, A., MARTINI, I.J.

Diagnóstico de infecção por Candida: avaliação de testes de identificação de espécies e

caracterização do perfil de suscetibilidade. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina

Laboratorial 45 (1): 17-23, 2009.

MIRANDA-ZAPICO, I., ERASO, E., HERNANDEZ-ALMARAZ, J.L., LOPEZ-SORIA,

L.M., CARRILLO-MUNOZ, A.J., HERNANDEZ-MOLINA, J.M., QUINDOS, G.

Prevalence and antifungal susceptibility patterns of new cryptic species inside the species

complexes Candida parapsilosis and Candida glabrata among blood isolates from a

Spanish tertiary hospital. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 66: 2315-2322,

2011.

MIRHENDI, H., BRUUN, B., SCHØNHEYDER, H.C., CHRISTENSEN, J.J., FUURSTED,

K., GAHRN-HANSEN, B., JOHANSEN, H.K., NIELSEN, L., KNUDSEN, J.D.,

ARENDRUP, M.C. Molecular screening for Candida orthopsilosis and Candida

metapsilosis among Danish Candida parapsilosis group blood culture isolates: proposal

of a new RFLP profile for differentiation. Journal of Medical Microbiology 59 (4): 414-

420, 2010.

MOHAN, V., BALLAL, M. Proteinase and phospholipase activity as virulence factors in

Candida species isolated from blood. Revista Iberoamericana de Micologia 25: 208-

210, 2008.

74

MUHSIN, T.M., AUBAID, A.H., AL-DUBOON, A.H. Extracellular enzyme activities of

dermatophytes and yeast isolates on solid media. Mycoses 40: 465-469, 1997.

MUNSON, E.L., TROY, D.R., WEBER, J.K., MESSER, S.A., PFALLER, M.A. Presumptive

identification of Candida kefyr on Levine formulation of Eosin Methyele Blue agar.

Journal of Clinical Microbiology 40: 4281-4284, 2002.

NÉMETH, T., TÓTH, A., SZENZENSTEIN, J., HORVÁTH, P., NOSANCHUK, J.D.,

GRÓZER, Z., TÓTH, R., PAPP, C., HAMARI, Z., VÁGVÖLGYI, C., GÁCSER, A.

Characterization of Virulence Properties in the C. parapsilosis Sensu Lato Species. PLoS

ONE 8 (7):e68704, 2013.

NGUYEN, L.N., TROFA, D., NOSANCHUK, J.D. Fatty Acid Synthase Impacts the

Pathobiology of Candida parapsilosis In Vitro and during Mammalian Infection. PLoS

ONE 4 (12): 1-11, 2009.

NOSEK, J., HOLESOVA, Z., KOSA, P., GACSER A., TOMASKA, L. Biology and genetics

of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Current Genetics 55: 497-509, 2009.

NUCCI, M., QUEIROZ-TELLES, F., TOBON, A.M., RESTREPO, A., COLOMBO, A.L.

Epidemiology of Opportunistic Fungal Infections in Latin America. Clinical Infectious

Diseases 51 (5): 561-570, 2010.

NUNES, E.B., SOARES, J.C.M., NUNES, N.B., PAES, A.L.V. Perfil de sensibilidade do

gênero Candida a antifúngicos em um hospital de referência da Região Norte do Brasil.

Revista Pan-Amazônica de Saúde 2 (4):23-30, 2011.

PAPPAS, P.G., KAUFFMAN, C.A., ANDES, D., BENJAMIN, D.K.J., CALANDRA, T.F.,

EDWARDS, J.E.J., FILLER, S.G., FISHER, J.F., KULLBERG, B-J., OSTROSKY-

ZEICHNER, L., REBOLI, A.C., REX, J.H., WALSH, T.J., SOBEL, J.D. Clinical Practice

Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases

Society of America. Treatment Guidelines for Candidiasis 48: 503-535, 2009.

PARK, S.Y., KIM, K.M., LEE, J.H., SEO, S.J., LEE, I.H. Extracellular Gelatinase of

Enterococcus faecalis Destroys a Defense System in Insect Hemolymph and Human

Serum. Infection and Immunity 75 (4): 1861-1869, 2007.

PASTERNAK, J. Biofilmes: um inimigo (in)visível. Revista da Sociedade Brasileira de

Controle de Contaminação 39: 36-38, 2009.

PEMÁN, J., CANTÓN, E., QUINDÓS, G., ERASO, E., ALCOBA, J., GUINEA, J.,

MERINO, P., RUIZ-PÉREZ-DE-PIPAON, M.T., PÉREZ-DEL-MOLINO, L.,

LINARES-SICILIA, M.J., MARCO, F., GARCÍA, J., ROSELLÓ, E.M., GÓMEZ-G-DE-

LA-PEDROSA, E., BORRELL, N., PORRAS, A., YAGÜE, G. Epidemiology, species

distribution and in vitro antifungal susceptibility of fungaemia in a Spanish multicentre

prospective survey. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 67: 1181-1187, 2012.

PETERSON, J.F., PFALLER, M.A., DIEKEMA, D.J., RINALDI, M.G., RIEBE, K.M.,

LEDEBOER, N.A. Multicenter Comparison of the Vitek 2 Antifungal Susceptibility Test

with the CLSI Broth Microdilution Reference Method for Testing Caspofungin,

Micafungin, and Posaconazole against Candida spp. Journal of Clinical Microbiology

49 (5): 1765-1771, 2011.

75

PFALLER, M.A., DIEKEMA, D.J., GIBBS, D.L., NEWELL, V.A., NG, K.P., COLOMBO,

A., FINQUELIEVICH, J., BARNES, R., WADULA, J. Geographic and Temporal Trends

in Isolation and Antifungal Susceptibility of Candida parapsilosis: a Global Assessment

from the ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program, 2001 to 2005. Journal of

Clinical Microbiology 46 (3): 842-849, 2008.

PFALLER, M.A., ANDES, D., ARENDRUP, M.C., DIEKEMA, D.J., INGROFF, A.E,

ALEXANDER, B.D., BROWN, S.D., CHATURVEDI, V., FOWLER, C.L.,

GHANNOUM, M.A., JOHNSON, E.M., KNAPP, C.C., MOTYL, M.R., ZEICHNER,

L.O., WALSH, T.J. Clinical breakpoints for voriconazole and Candida spp. revisited:

review of microbiologic, molecular, pharmacodynamic, and clinical data as they pertain

to the development of species-specific interpretive criteria. Diagnostic Microbiology and

Infectious Disease 70: 330-343, 2011.

PFALLER, M.A., DIEKEMA, D.J., ANDES, D., ARENDRUP, M.C., BROWNS, S.D.,

LOCKHART, S.R., MOTYL, M., PERLIN, D.S. Clinical breakpoints for the

echinocandins and Candida revisited: Integration of molecular, clinical, and

microbiological data to arrive at species-specific interpretive criteria. Drug Resistance

Updates 14: 164-176, 2011.

PRICE, M.F., WILKINSON, I.D., GENTRY, L.O. Plate methods for detection of

phospholipase activity in Candida albicans. Sabouraudia 20 (1): 7-14, 1982.

RAPPLEYE, C., GOLDMAN, W.E. Defining virulence genes in the dimorphic fungi. Annual

review of microbiology 60:281-303, 2006.

ROMEO, O., DELFINO, D., CASCIO, A., LO PASSO, C., AMORINI, M., ROMEO, D.,

PERNICE, I. Microsatellite-based genotyping of Candida parapsilosis sensu stricto

isolates reveals dominance and persistence of a particular epidemiological clone among

neonatal intensive care unit patients. Infection, Genetics and Evolution 13: 105-108,

2012.

RÜCHEL, R., TEGELER, R., TROST, M.A. Comparison of secretory proteinases from

different strains of Candida albicans. Sabouraudia 20 (3): 233-244, 1982.

RUZICKA, F., HOLA, V., VOTAVA, M., TEJKALOVA, R. Importance of Biofilm in

Candida parapsilosis and Evaluation of its Susceptibility to Antifungal Agents by

Colorimetric Method. Folia Microbiologica 53 (3): 209-214, 2007.

SABINO, R., SAMPAIO, P., ROSADO, L., STEVENS, D.A., CLEMONS, K.V., PAIS, C.

New Polymorphic Microsatellite Markers Able to Distinguish among Candida

parapsilosis Sensu Stricto Isolates. Journal of Clinical Microbiology 48 (5): 1677-1682,

2010.

SABINO, R., SAMPAIO, P., CARNEIRO, C., ROSADO, L., PAIS, C. Isolates from hospital

environments are the most virulent of the Candida parapsilosis complex. BioMed

Central Microbiology 11: 1-10, 2011.

SAI, S., HOLLAND, L.M., McGEE, C.F., LYNCH, D.B., BUTLER, G. Evolution of Mating

within the Candida parapsilosis Species Group. Eukaryotic Cell 10 (4): 578-587, 2011.

76

SAMARANAYAKE, Y.H., YE, J., YAU, J.Y.Y., CHEUNG, B. P. K., SAMARANAYAKE,

L.P. In Vitro Method To Study Antifungal Perfusion in Candida Biofilms. Journal of

Clinical Microbiology 43 (2): 818–825, 2005.

SAMBROOK, J., RUSSEL, D. W., IRWIN, N. Molecular cloning: a Laboratory Manual. 3

ed. Vol 2: 9.16-9.19, 2001.

SCHERER, S., STEVENS, D.A. Application of DNA Typing Methods to Epidemiology and

Taxonomy of Candida Species. Journal of Clinical Microbiology 25 (4): 675-679,

1987.

SEREFHANOGLU, K., TIMURKAYNAK, F., CAN, F., ARSLAN, U.C.H., OZDEMIR, F.N.

Risk factors for candidemia with non-albicans Candida spp. in intensive care unit patients

with end-stage renal disease on chronic hemodialysis. Journal of the Formosan Medical

Association 111: 325-332, 2012.

SIDRIM, J.J.C., ROCHA, M.F.G. Micologia Médica à Luz de Autores Contemporâneos.

Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010.

SIFUENTES-OSORNIO, J., CORZO-LEÓN, D.E., PONCE-DE-LEÓN, L.A. Epidemiology

of Invasive Fungal Infections in Latin America. Current Fungal Infection Reports 6:

23-34, 2012.

SILVA, J.O., CANDIDO, R.C. Avaliação do sistema API20C AUX na identificação de

leveduras de interesse clínico. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical

38 (3): 261-263, 2005.

SILVA, A.P., MIRANDA, I.M., LISBOA, C., PINA-VAZ, C., RODRIGUES, A.G.

Prevalence, Distribution, and Antifungal Susceptibility Profiles of Candida parapsilosis,

C. orthopsilosis, and C. metapsilosis in a Tertiary Care Hospital. Journal of Clinical

Microbiology 47 (8): 2392-2397, 2009.

SINGH, A., PANTING, R.J., VARMA, A., SAIJO, T., WALDRON, K.J., JONG, A.,

NGAMSKULRUNGROJ, P., CHANG, Y.C., RUTHERFORD, J.C., KWON-CHUNGA,

K.J. Factors Required for Activation of Urease as a Virulence Determinant in

Cryptococcus neoformans. mBio 4 (3): e00220-13, 2013.

SOUZA, A.C.R., FERREIRA, R.C., GONÇALVES, S.S., QUINDÓS, G., ERASO, E.,

BIZERRA F.C., BRIONES, M.R.S., COLOMBO, A.L. Accurate Identification of

Candida parapsilosis (Sensu Lato) by Use of Mitochondrial DNA and Real-Time PCR.

Journal of Clinical Microbiology 50 (7): 2310-2314, .2012.

SPECIESFUNGORUM. Desenvolvido por CABI databases. Disponível em

<http://www.speciesfungorum.org/Names/NamesRecord.asp?RecordID=253819>.

Acesso em 20/01/2014.

STEVENS, D.A, ESPIRITU, M., PARMAR, R. Paradoxical effect of caspofungin: reduced

activity against Candida albicans at high drug concentrations. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy 48 (9): 3407-3411, 2004.

STOPPA, M.A., CASEMIRO, L.A., VINHOLIS, A.H.C., CUNHA, W.R., SILVA, M.L.A.,

MARTINS, C.H.G. Estudo comparative entre as metodologias preconizadas pelo CLSI e

http://www.speciesfungorum.org/Names/NamesRecord.asp?RecordID=253819

77

pelo EUCAST para avaliação da atividade antifúngica. Quimica Nova 32 (2): 498-502,

2009.

SZABÓ, Z., SZILÁGYI, J., TAVANTI, A., KARDOS, G., ROZGONYI, F., BAYEGAN, S.,

MAJOROS, L. In vitro efficacy of 5 antifungal agents against Candida parapsilosis,

Candida orthopsilosis, and Candida metapsilosis as determined by time–kill

methodology. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 64: 283-288, 2009.

TAVANTI, A., DAVIDSON, A.D., GOW, N.A.R., MAIDEN, M.C.J., ODDS, F.C. Candida

orthopsilosis and Candida metapsilosis spp. nov. to replace Candida parapsilosis groups

II and III. Journal of Clinical Microbiology 43: 284-292, 2005.

TAVANTI, A., HENSGENS, L.A.M., GHELARDI, E., CAMPA, M., SENESI, S. Genotyping

of Candida orthopsilosis Clinical Isolates by Amplification Fragment Length

Polymorphism reveals genetic diversity among independent isolates and strain

maintenance within patients. Journal of Clinical Microbiology 45: 1455-1462, 2007.

TAVANTI, A., HENSGENS, L.A.M., MOGAVERO, S., MAJOROS, L., SENESI, S.,

CAMPA, M. Genotypic and phenotypic properties of Candida parapsilosis sensu stricto

strains isolated from different geographic regions and body sites. BMC Microbiology 10:

203-214, 2010.

THAKUR, J.K., ARTHANARI, H., YANG, F., PAN, S-J., FAN, X., BREGER, J., FRUEH,

D.P., GULSHAN, K., LI, D.K., MYLONAKIS, E., STRUHL, K., MOYE-ROWLEY,

W.S., CORMACK, B.P., WAGNER, G., NAAR, A.M. A nuclear receptor-like pathway

regulating multidrug resistance in fungi. Nature 452 (3): 604-611, 2008.

TROFA, D., GÁCSER, A., NOSANCHUK, J.D. Candida parapsilosis, an Emerging Fungal

Pathogen. Clinical Microbiology Reviews 21: 606-625, 2008.

TROFA, D., SOGHIER, L., LONG, C., NOSANCHUK, J.D., GÁCSER, A., GOLDMAN,

D.L. A Rat Model of Neonatal Candidiasis Demonstrates THE Importance of Lipases as

Virulence Factors for Candida albicans and Candida parapsilosis. Mycopathologia 172:

169-178, 2011.

TURENNE, C.Y., SANCHE, S.E., HOBAN, D.J., KARLOWSKY, J.A., KABANI, A.M.

Rapid Identification of Fungi by Using the ITS2 Genetic Region and an Automated

Fluorescent Capillary Electrophoresis System. Journal of Clinical Microbiology 37 (6):

1846-1851, 1999.

VALIENGO, L.C.L., PETITTO, C.E., SAWADA, J.R., FONTES, R.B.V., PINTO, F.C.G.

Espondilodiscite causada por Candida parapsilosis: relato de caso e revisão da literatura.

Revista de Medicina 86 (2): 112-116, 2007.

VAN ASBECK, E.C, CLEMONS, K.V., MARTINEZ, M., TONG, A-J., STEVENS, D.A.

Significant differences in drug susceptibility among species in the Candida parapsilosis

group. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 62: 106-109, 2008.

VAN ASBECK, E.C., CLEMONS, K.V., STEVENS, D.A. Candida parapsilosis: a review of

its epidemiology, pathogenesis, clinical aspects, typing and antimicrobial susceptibility.

Critical Reviews in Microbiology 35 (4):283–309, 2009.

78

VASCONCELOS JR, A.A., MENEZES, E.A., CUNHA, F.A. Chromogenic Medium for

Direct Susceptibility Testing of Candida spp. Isolated from Urine. Mycopathologia

172:125-130, 2011.

VERCHER, M.P., MARTINEZ, J.M.C., CANTON, E., PEMAN, J., GARCIA, M.M.G.,

GOMEZ, E.V., AGUDO, L.C. Diferentiation of Candida parapsilosis, C. orthopsilosis,

and C. metapsilosis by specific PCR amplification of the RPS0 intron. International

Journal of Medical Microbiology 301: 531-535, 2011.

VERGIS, E.N., SHANKAR, N., CHOW, J.W., HAYDEN, M.K. , SNYDMAN, D.R.,

ZERVOS, M.J., LINDEN, P.K., WAGENER, M.M., MUDER, R.R. Association between

the Presence of Enterococcal Virulence Factors Gelatinase, Hemolysin, and Enterococcal

Surface Protein and Mortality among Patients with Bacteremia Due to Enterococcus

faecalis. Clinical Infectious Diseases 35 (5):570-575, 2002.

VERWEIJ, P.E., BREUKER, I.M., RIJS, A.J.M.M., MEIS, J.F.G.M. Comparative study of

seven commercial yeast identification system. Journal of Clinical Pathololy 52: 271-

273, 1999.

WILLIAMS, D.W., LEWIS, M.A.O. Isolation and identification of Candida from the oral

cavity. Oral Diseases 6: 3-11, 2000.

79

ANEXO I

DADOS DO PROJETO DE PESQUISA

Título da Pesquisa: IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE

LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis (Candida parapsilosis, C. orthopsilosis e C.

metapsilosis)

Pesquisador: Silvia Marques

Área Temática:

Versão: 2

CAAE: 18425713.9.0000.0019

Instituição Proponente: Instituto Evandro Chagas/SVS/MS

Patrocinador Principal: Instituto Evandro Chagas/SVS/MS

DADOS DO PARECER

Número do Parecer: 345.631

Data da Relatoria: 31/07/2013

Apresentação do Projeto:

Projeto de interesse para saúde pública, muito bem fundamentado e claramente justificado. Trata-se da

caracterização fenotípica e molecular de leveduras do complexo C. parapsilosis, com potencial

patogenicidade para humanos.

Objetivo da Pesquisa:

Os objetivos estão claros e possibilitam responder a hipótese proposta.

Avaliação dos Riscos e Benefícios:

O pesquisador deverá considerar como riscos àqueles relacionados aos participantes do estudo, dos

quais as amostras foram isoladas, incluindo perda de garantia de sigilo informações e os

procedimentos a serem utilizados para reduzi-la ou evitá-la. Aspectos relativos a biossegurança podem

ser colocados em item a parte.

Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:

Pesquisa relevante, claramente apresentada e metodologiamente adequada.

80

Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:

O pesquisador deverá considerar como justificativa de dispensa de TCLE a dificuldade de obtenção do mesmo devido ao tempo da coleta e dificuldade de acesso aos participantes, e não

meramente porque "os isolados fazem parte da coleção de cultura do laboratório de micologia". Este

comentário se faz importante para enfatizar que as amostras ou produtos delas obtidos são oriundos de

pessoas, portanto, é de propriedade dos participantes e sua utilização deverá respeitar a dignidade e

autonomia dos mesmos, sendo que o uso destas amostras deverão obedecer as diretrizes dispostas na

Resolução CNS 441/2011.

Recomendações:

Recomendamos que a coordenação mantenha atualizados todos os documentos pertinentes ao projeto.

Este CEP se incumbirá dos procedimentos de acompanhamento preconizados pela Resolução

466/2013 e suas complementares, do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde.

Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:

Deverá ser encaminhado relatório consolidado ao final, incluindo os resultados finais da pesquisa, em

um prazo máximo de 60 (sessenta) dias, após a finalização da pesquisa.

Situação do Parecer:

Aprovado

Necessita Apreciação da CONEP:

Não

Considerações Finais a critério do CEP:

ANANINDEUA, 31 de Julho de 2013

__________________________________

Assinado por:

HELOISA MARCELIANO NUNES

(Coordenador)

identificaÇÃo molecular, caracterizaÇÃo bioquÍmica e ... · romanos 11:33 . 3 dedico esta...

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