Alberto Varela San Pedro

Carmen Torres Manrique

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Grado en Química

2014-2015

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Identificación y caracterización del fenotipo y genotipode resistencia a antibióticos en aislados de

Enterococcus de la microbióta intestinal del ganado vacuno

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2015

publicaciones.unirioja.esE-mail: publicaciones@unirioja.es

Identificación y caracterización del fenotipo y genotipo de resistencia aantibióticos en aislados de Enterococcus de la microbióta intestinal del ganado

vacuno, trabajo fin de gradode Alberto Varela San Pedro, dirigido por Carmen Torres Manrique (publicado por la

Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.

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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA GRADO EN QUÍMICA

Identificación y caracterización del fenotipo

y genotipo de resistencia a antibióticos en

aislados de Enterococcus de la microbiota

intestinal de ganado vacuno

Tutora: Carmen Torres Manrique

ALBERTO VARELA SAN PEDRO

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso académico 2014/ 2015

RESUMEN

La resistencia bacteriana a los antibióticos y su diseminación es un problema en salud pública,

presente no sólo en el ámbito clínico sino también en el veterinario o el agroalimentario, entre

otros. En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterización de 36 cepas de Enterococcus

aisladas previamente de la microbiota intestinal de 33 vacas de una granja en explotación

extensiva de la Rioja. Dichas cepas han sido identificadas en este trabajo a nivel de especie

mediante técnicas microbiológicas, bioquímicas y de la Biología Molecular (reacción en cadena

de la polimerasa o PCR, especie-específicas) con los siguientes resultados: Enterococcus hirae

(18 cepas), Enterococcus casseliflavus (6 cepas), Enterococcus faecium (5 cepas) y

Enterococcus spp (7 cepas). Asimismo se llevó a cabo el estudio fenotípico y genotípico de la

resistencia a antibióticos en dicha colección bacteriana.

Diez de las 36 cepas (27,8%) presentaron resistencia frente al menos a un antibiótico de los 12

testados. Se demostraron resistencias frente a los antibióticos: trimetoprim-sulfametoxazol

(SXT, 8 cepas, 22,2%), kanamicina (3 cepas, 8,3%) y linezolid (1 cepa, 2,8%). Dos de las cepas

de la especie E. hirae presentaron resistencia a SXT y kanamicina conjuntamente. Por otro lado,

se llevó a cabo el estudio de los genes responsables de los principales mecanismos de resistencia

mediante la técnica de PCR y secuenciación posterior de los amplicones obtenidos. Se detectó el

gen de resistencia dfrK y asimismo mutaciones en el gen codificante de RNA ribosómico

(rRNA) 23S, responsables de la resistencia a trimetoprim y linezolid, respectivamente. Siete

cepas mostraron sensibilidad disminuida a vancomicina (categoría intermedia), siendo seis de

ellas E. casseliflavus (con el gen vanC2) y una E.hirae.

Conclusión. Se detecta E. hirae como especie de enterococo predominante en la microbiota

intestinal de ganado vacuno. En general se detectan bajos niveles de resistencia para la mayor

parte de los antibióticos testados, aunque destaca la identificación de un aislado E. hirae con

resistencia a linezolid, cuyo mecanismos de resistencia podría estar relacionado con mutaciones

en el gen codificante del rRNA 23S.

ABSTRACT

Bacterial resistance to antibiotics and its dissemination is an issue of great importance in public

health, present not only in the clinical field but also in the veterinary or agroalimentary, among

others. In this work, characterization of 36 strains of Enterococcus previously isolated from the

intestinal microbiota of 33 cows from a farm in extensive exploitation in La Rioja was carried

out. These strains have been identified to species level by microbiological, biochemical and

molecular biology techniques (polymerase chain reaction or PCR, species-specific) with the

following results: Enterococcus hirae (18 strains), Enterococcus casseliflavus (6 strains),

Enterococcus faecium (5 strains) and Enterococcus spp (7 strains). Also, a genotypic and

phenotypic study of antibiotic resistance of our bacterian collection were carried out.

Ten of the 36 strains (27.8%) showed resistance to at least one antibiotic of the 12 tested. It was

demonstrated resistance to the following antibiotics: trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT, 8

strains, 22.2%), kanamycin (3 strains, 8,3%) and linezolid (1 strain, 2.7%). Two strains (E.

hirae) presented a SXT and kanamycin resistant phenotype simultaneously. On the other hand,

study of resistant mechanisms by PCR technique and sequencing of amplicons obtained was

carried out. It were detected the dfrK resistance gene and likewise mutations in the gene

encoding the ribosimal RNA (rRNA) 23S, responsible for resistance to trimethoprim and

linezolid, respectively, in E. hirae strains. Seven strains showed diminished susceptibility for

vancomicin, being six of them E. casseliflavus with (vanC2gene) and one E. hirae.

Conclusions: E. hirae is detected as the predominant specie of Enterococcus in the intestinal

microbiota of cattle. In general, low resistance levels are detected for most of the antibiotics

tested, but an E. hirae´s strain stands out for his linezolid resistance, whose resistance

mechanism could be associated to mutations in the enconding gene rRNA 23S.

ÍNDICE

Lista de tablas ............................................................................................................................. 1

Lista de figuras ............................................................................................................................ 2

Abreviaturas ................................................................................................................................ 3

1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 5

1.1 DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTIBIÓTICOS Y

PROBLEMÁTICA DE LA RESISTENCIA A LOS MISMOS ................................... 5

1.2 EL GÉNERO Enterococcus ........................................................................................... 6

1.2.1 Características generales, filogenia y taxonomía. .................................................. 6

1.2.2 Hábitat .................................................................................................................. 7

1.3 ELEMENTOS GENÉTICOS DE ADQUISICIÓN Y DISEMINACIÓN

DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS .................................................. 7

1.4 MECANISMOS GENERALES DE RESISTENCIA A LOS

ANTIBIÓTICOS ............................................................................................................ 9

1.4.1 Resistencia a Glucopéptidos .................................................................................. 9

1.4.2 Resistencia a β-lactámicos .................................................................................. 14

1.4.3 Resistencia a Aminoglucósidos ........................................................................... 14

1.4.4 Resistencia a Macrólidos, Lincosamidas y Estreptograminas (MLS) ................... 16

1.4.5 Resistencia a Quinilonas ..................................................................................... 17

1.4.6 Resistencia a Oxazolidinonas .............................................................................. 18

1.4.7 Resistencia a Cloranfenicol y Tetraciclinas ....................................................... 19

1.4.8 Resistencia a Trimetoprim................................................................................... 19

2. OBJETIVOS................................................................................................................... 21

3. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................... 22

3.1 CEPAS INCLUÍDAS EN EL ESTUDIO .................................................................... 22

3.2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ............................................................. 22

3.2.1 Medios de cultivo .......................................................................................... 22

3.2.2 Condiciones de cultivo ................................................................................. 23

3.2.3 Conservación de las cepas ........................................................................... 23

3.3 TINCIÓN DE GRAM .................................................................................................. 23

3.4 TEST CATALASA ...................................................................................................... 26

3.5 BILIS ESCULINA ....................................................................................................... 27

3.6 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS POR EL

MÉTODO DEL ANTIBIOGRAMA ........................................................................... 27

3.7 EXTRACCIÓN DE DNA: Protocolo InstaGeneTM Purification

Matrix ......................................................................................................................... 29

3.8 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ..................................... 29

3.9 ELECTROFORÉSIS EN GEL DE AGAROSA ......................................................... 34

3.10 SECUENCIACIÓN ..................................................................................................... 35

4. RESULTADOS .............................................................................................................. 37

5. DISCUSIÓN ................................................................................................................... 43

CONCLUSIONES ............................................................................................................... 46

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 47

1

LISTA DE TABLAS.

Tabla 1. Función y proteína codificada por cada uno de los genes del operón vanA.

Tabla 2. Estructura química de los antibióticos glucopeptídicos.

Tabla 3. Características de los diferentes genotipos de resistencia a vancomicina (López, M., Tesis 2011)

Tabla 4. Estructura química de los antibióticos β-lactámicos.

Tabla 5. Estructura química de los antibióticos aminoglucosídicos.

Tabla 6. Estructura química de los antibióticos macrolidos, lincosaminas y estreptograminas.

Tabla 7. Estructura química de los antibióticos del grupo de las quinolonas.

Tabla 8. Estructura química de los antibióticos oxazolidinónicos.

Tabla 9. Estructura química de cloranfenicol y tetraciclina.

Tabla 10. Estructura química de trimetoprim y sulfametoxazol.

Tabla 11. Estructura química del peptidoglicano, del colorante cristal violeta y del colorante safranina.

Tabla 12. Carga de los discos de antibiótico empleados en antibiogramas y puntos de corte de los halos de

inhibición según el CLSI (2015).

Tabla 13. Componentes de los reactivos utilizados en la técnica de PCR.

Tabla 14. Secuencia nucleotídica de cebadores empleados para la identificación de especies de Enterococcus y

condiciones de amplificación.

Tabla 15. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la detección de

genes relacionados con la resistencia a antibióticos.

Tabla 16. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la

caracterización de la resistencia a trimetoprim y el entorno del gen dfrK.

Tabla 17. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la detección de

genes asociados a la producción de bacteriocinas.

Tabla 18. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para amplificación

del rRNA 23S.

Tabla 19. Resumen del estudio Gram, test catalasa, gen especie-específico e identificación de las cepas de

Enterococcus.

Tabla 20. Halos de inhibición (expresados en mm) producidos por los distintos antibióticos testados en las

cepas de Enterococcus y estudio de su resistencia según los puntos de corte asignados por el CLSI

(2015).

Tabla 21. Resumen del estudio fenotípico y genotípico de las cepas de Enterococcus estudiadas.

2

LISTA DE FIGURAS

Fig. 1. Evolución de la resistencia antibiótica a través de la selección natural (modificada de:

University of California Museum of Paleontology's - Understanding Evolution

http://evolution.berkeley.edu).

Fig. 2. Relación filogenética de las distintas especies de Enterococcus (López, M., Tesis 2011).

Fig. 3. Mecanismos de transferencia genética horizontal (Essential Biochemistry, Chapter 20;

http://www.wiley.com).

Fig. 4. Mecanismos de acción y de resistencia a los antibióticos (Mulvey, M.R., 2009).

Fig. 5. Esquema de los distintos operones van (López M., Tesis 2011).

Fig. 6. Rutas enzimáticas de desactivación de un antibiótico aminoglucósido, acetilación por acetil-

CoA, fosforilación mediada por ATP y adenilación mediada por ATP (Walsh, 2003).

Fig. 7. Cultivo en estrías de una cepa de Enterococcus y obtención de colonias aisladas.

Fig. 8. Procedimiento de la tinción Gram

(https://compendiomicrobiologia.wordpress.com/tag/endocarditis).

Fig. 9. Diferencias estructurales de la pared bacteriana entre bacterias Gram positivas (izq) y Gram

negativas (dcha) (modificación de: http://www.generasibiologi.com/2012/09/dinding-sel-

bakteri.html).

Fig. 10. Observación microscópica de las tinciones de bacterias Gram positivas y negativas

(https://www.studyblue.com/notes/note/n/staining-/deck/14490231).

Fig. 11. Representación de la estructura cuaternaria de la catalasa

(http://maestradelia.files.wordpress.com/2012/10/474px-catalase_structure-by-vossman.png).

Fig. 12. Reacción catalítica de la catalasa (Modificada de: McFaddin, J.F., 2003)

Fig. 13. Reacción negativa (A) y positiva (B) de la catalasa

(http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/file.php/743/Bacteriologia/Pruebas_de_labora

torio/Prueba_de_catalasa.html)

Fig. 14. Reacción de hidrolisis de la esculina (McFaddin, J.F., 2003)

Fig. 15. Reacción y formación del complejo esculetina-Fe3+ en placa (Modificada de: McFaddin, J.F.,

2003 ; https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bile_esculin_agar.jpg)

Fig. 16. Antibiograma de una cepa de Enterococcus.

Fig. 17. Fases de la amplificación por PCR (Andy Vierstraete, 1999).

Fig. 18. Termociclador T3 Biometra.

Fig. 19. Resultados para la PCR de identificación para Enterococcus casseliflavus.

Fig. 20. Resultados para la PCR del gen dfrK.

Fig. 21. Distribución de especies en la colección de Enterococcus estudiada.

Fig. 22. Comparación de las cepas según el antibiótico al que muestran resistencia.

Fig. 23. Potenciales vías de propagación de bacterias resistentes a antibióticos de animales a humanos

(http://www.gao.gov).

3

ABREVIATURAS

AAC Acetiltransferasa

Ala Alanina

AMP Ampicilina

ANT Nucleotidiltransferasa

APH Fosfotransferasa

ATP Adenosín trifosfato

BEA Bilis Esculina Agar

BHI Brain Heart Infusion

ºC Grado centígrado

CHL Cloranfenicol

CIP Ciprofloxacina

CLSI Clinical and Laboratory Standars Institute

dATP Desoxiadenosina trifosfato

dCTP Desoxicitidina trifosfato

dGTP Desoxiguanosina trifosfato

DNA Ácido desoxirribonucleico

dNTPs Desoxinucleotidos trifosfato

dTTP Desoxitimidina trifosfato

DHFR Dihidrofolato reductasa

EGM Elementos Genéticos Móviles

ERV Enterococos resistentes a vancomicina

ERY Eritromicina

g Gramo

GEH Gentamicina (alta carga)

KAH Kanamicina (alta carga)

l Litro

Lac Lactato

LZD Linezolid

M Molar (mol/l)

MHA Müeller-Hinton Agar

min Minuto

ml Mililitro

4

mm Milímetro

MLSb Macrólidos-lincosamidas-estreptograminas B

mM Milimolar

p/V Relación peso/volumen

pb Pares de bases

PBPs Penicillin binding protein (proteínas de unión a penicilina)

PCR Polymerase chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa)

pH Potencial de hidrógeno

R Resistente

RAN Resistencia de alto nivel

r.p.m. Revoluciones por minuto

rRNA Ácido ribonucleico ribosómico

S Susceptible

seg Segundos

Ser Serina

SI Secuencia de Inserción

STH Estreptomicina (alta carga)

SXT Trimetoprim-sulfametoxazol

TBE Tris/Ácido Bórico/EDTA

TE Tris/EDTA

TEI Teicoplanina

TET Tetraciclina

Tn Transposón

UFC Unidades Formadoras de Colonias

μg Microgramo

μl Microlitro

μM Micromolar

V Voltios

VAN Vancomicina

INTRODUCCIÓN

5

1. INTRODUCCIÓN

1.1 DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTIBIÓTICOS Y PROBLEMÁTICA

DE LA RESISTENCIA A LOS MISMOS.

Alexander Fleming (1881-1955) en el año 1928 descubrió de manera fortuita la penicilina,

producida por el hongo Penicillium notatum, el cual contaminó unas placas en las que estaba

cultivando la bacteria Staphylococcus aureus, inhibiendo su crecimiento. Dicha sustancia fue el

primer compuesto natural descubierto con actividad antibacteriana. En 1939, tras este

descubrimiento, la penicilina comenzó a producirse a nivel industrial y a utilizarse a nivel

clínico lo cual supuso el impulso en busca de nuevos fármacos con actividad antibiótica.

Dicho uso a nivel clínico, supuso un importante descenso de la mortalidad a nivel mundial. Sin

embargo, transcurrido poco tiempo, las bacterias comenzaron a adquirir y diseminar diferentes

mecanismos de resistencia a los antibióticos.

Esta diseminación de mecanismos de resistencia no es única del ámbito hospitalario, ya que el

uso y abuso de antibióticos en animales (muy especialmente en animales de consumo) ha

supuesto en los últimos años un incremento del número de bacterias resistentes en dichos

animales, en los alimentos y en su entorno. Estas bacterias resistentes pueden diseminarse en el

ambiente a través del aire, del agua, hasta llegar a cultivos cercanos a los animales y de esta

manera puedan incorporarse en la cadena alimentaria, hasta llegar al ser humano dificultando el

tratamiento de las infecciones en las que se ven implicadas (Torres et al., 2006; Torres et al.,

2010; López et al., 2010).

El alarmante incremento de la resistencia bacteriana a los antibióticos es, sin duda, uno de los

grandes problemas actuales de salud pública ya que estos compuestos constituyen una de las

principales herramientas para controlar y tratar las infecciones bacterianas, tanto en medicina

humana como en veterinaria.

Figura 1. Evolución de la resistencia antibiótica a través de la selección natural (modificada de: University of

California Museum of Paleontology's - Understanding Evolution http://evolution.berkeley.edu).

Bacteria normal

Bacteria resistente

Bacteria muerta

Un grupo de bacterias que incluye una variedad resistente…

….son expuestas a un antibiótico. La mayoría de las bacterias normales mueren.

La bacteria resistente se multiplica y se vuelve más común.

Finalmente, toda la infección se convierte en una cepa resistente.

INTRODUCCIÓN

6

1.2 EL GÉNERO Enterococcus.

1.2.1 Características generales, filogenia y taxonomía

Los enterococos son cocos Gram positivos, que se pueden encontrar aislados, formando parejas

o cadenas cortas. Son anaerobios facultativos y crecen a una temperatura óptima de 35ºC,

aunque la mayoría son capaces de crecer en un rango de temperatura de 10 a 45ºC. Pueden

crecer a pH 9,6 y en presencia de concentraciones de hasta 6,5% de cloruro sódico. Son

quimiorganotrofos, y presentan un metabolismo fermentativo, siendo el ácido láctico el

producto final mayoritario de la fermentación de la glucosa. Como características bioquímicas

utilizadas para su identificación destaca que hidrolizan la esculina y son catalasa negativos.

El término enterococo fue utilizado por Thiercelin en 1899 para describir unas bacterias con

forma de cocos, Gram-positivas, aisladas del intestino humano. Posteriormente se renombraron,

debido a su hábitat en intestino, como Streptococcus faecalis por Andrewer y Hoder en 1906.

Sherman en 1937 clasificó el género Streptococcus en 4 grupos: pyogenes, viridans, lactis y

enterococos. En 1984, se produjo la separación del género bacteriano Enterococcus del género

Streptococcus, cuando Schleifer y Klipper-Bälz propusieron la inclusión de las especies S.

faecium y S. faecalis en un nuevo grupo al que se transfirieron más tarde las especies E. avium,

E. casseliflavus, E. durans, E. gallinarum y E. malodoratus, así como otras especies descritas

posteriormente: E. hirae, E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus y E. solitarius (Collin et al.,

1984).

Figura 2. Relación filogenética de las distintas especies de Enterococcus (López, Tesis 2011).

INTRODUCCIÓN

7

1.2.2 Hábitat

Los enterococos están ampliamente distribuidos en la naturaleza. Colonizan el tracto intestinal

del hombre y de otros mamíferos, pero también se encuentran frecuentemente en alimentos,

vegetales, agua, suelo, insectos, etc. (Deibel & Siliker, 1963).Los enterococos forman parte de

la microbiota gastrointestinal aunque también pueden colonizar la cavidad bucal o el tracto

genital. A partir de estas localizaciones puede colonizar otros tejidos donde actúa como

patógeno oportunista como es el caso de tejidos blandos, cavidad peritoneal, sistema nervioso

central, flujo sanguíneo o tejido cardíaco, entre otros.

La presencia de enterococos en alimentos es común. La colonización del tracto gastrointestinal

de animales puede llevar a la contaminación de la carne, a través de la contaminación de las

plantas de elaboración y procesos de contaminación cruzada. Los enterococos son también

aislados en aguas y suelos, posiblemente como resultado de la diseminación proveniente de

fuentes fecales, y su capacidad para sobrevivir en diferentes nichos ecológicos (Robredo et al.,

2000).

1.3 ELEMENTOS GENÉTICOS DE ADQUISICIÓN Y DISEMINACIÓN

DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS.

Existen dos tipos de resistencia a los antibióticos (Mulvey, 2009):

Intrínseca: Este tipo de resistencia la poseen de forma innata todos los microorganismos

de un determinado grupo, género o especie bacteriana, y casi siempre son de

localización cromosómica.

Adquirida: La resistencia antibiótica surge a causa de una mutación en sus propios

genes o gracias a la adquisición de nuevos genes que otorgan una resistencia no poseída

previamente.

Existen diferentes elementos genéticos móviles (EGM) que permiten la adquisición y

diseminación de genes de resistencia a los antibióticos, entre los que cabe destacar los

siguientes:

Plásmidos

Son moléculas de DNA de doble cadena y cíclicas, capaces de replicarse de forma autónoma,

que generalmente no poseen genes esenciales para la bacteria sino genes que aportan ventajas

adaptativas como pueden ser genes de resistencia a ciertos antibióticos.

Transposones y Secuencias de inserción

Son secuencias de DNA, generalmente más pequeñas que un plásmido, que poseen la

capacidad de moverse dentro de la misma molécula de DNA o de incorporarse a otra molécula

de DNA diferente. Esta movilización puede ocurrir entre dos plásmidos o entre un plásmido y el

cromosoma.

INTRODUCCIÓN

8

Integrones

Los integrones son unidades o fragmentos genéticos que se caracterizan por su capacidad de

captación de genes denominados genes cassette, los cuales contienen un gen y un lugar de

recombinación genética.

Cabe resaltar la transferencia genética horizontal como el mecanismo mayoritario para adquirir

nuevos genes de resistencia. Ésta se produce entre bacterias de un mismo entorno, bien sean del

mismo género como entre bacterias muy diferentes (no siendo una descendiente de la otra). Los

posibles mecanismos se explican a continuación (Tenover, 2006):

Conjugación: Consiste en la transmisión de plásmidos y transposones entre dos

bacterias (dadora-receptora) a través de los pili sexuales. Se puede producir entre

bacterias presentes en ecosistemas complejos como el intestinal.

Transformación: Consiste en la introducción, absorción y expresión del material

genético (DNA o RNA) del entorno, que puede quedar libre como consecuencia de lisis

bacteriana.

Transducción: Consiste en la transferencia de DNA exógeno a una bacteria receptora

mediante un bacteriófago (virus bacteriano).

Figura 3. Mecanismos de transferencia genética horizontal

(Essential Biochemistry, Chapter 20; http://www.wiley.com).

INTRODUCCIÓN

9

1.4 RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS EN Enterococcus.

Figura 4. Mecanismos de acción y de resistencia a los antibióticos (Mulvey, 2009).

1.4.1 Resistencia a Glucopéptidos.

Los glucopéptidos inhiben la síntesis de la pared celular al unirse a los precursores

pentapeptídicos del peptidoglicano, de forma que la pared bacteriana pierde su integridad

estructural y se produce la muerte bacteriana.

El mecanismo bioquímico de resistencia a los glucopéptidos en enterococos se basa en la

modificación de la diana: el pentapéptido de la pared celular terminado en D-Ala-D-Ala. El

pentapéptido modificado puede contener D-Ala-D-lactato (D-Lac) o bien D-Ala-D-serina (D-

Ser), poseyendo una afinidad 1.000 veces menor o 7 veces menor por la vancomicina,

respectivamente.

Se han descrito 8 operones distintos que intervienen en la resistencia adquirida a glucopéptidos

en enterococo denominados vanA, vanB, vanD, vanE, vanG, vanL, vanM y vanN, y uno que

interviene en la resistencia intrínseca, denominado vanC, con las variantes vanC-1, vanC-2 y

vanC-3, que es una característica intrínseca de algunas especies de enterococos (Enterococcus

gallinarum, Enterococcus casseliflavus y Enterococcus flavescens, respectivamente) (Torres &

Cercenado, 2010; Lozano et al., 2015a).

INTRODUCCIÓN

10

Figura 5. Esquema de los distintos operones van (López, Tesis 2011)

En los tipos VanA, VanB, VanD y VanM, el precursor alternativo es D-Ala-D-Lac, mientras

que en los tipos VanC, VanE, VanG, VanL y VanN, el precursor alternativo es D-Ala-D-Ser.

De los mecanismos de resistencia a vancomicina adquiridos, los que más relevancia y más

frecuentemente se encuentran a nivel clínico son los codificados por los genes vanA y vanB.

(López et al., 2012a; López et al., 2012b).

Operón vanA

El operón vanA codifica resistencia inducible de alto nivel a vancomicina y a teicoplanina y se

adquiere generalmente a través del transposón Tn1546. Este operón contiene 7 genes: tres

(vanH, vanA, vanX) responsables de la resistencia, dos (vanR y vanS) son los responsables de la

regulación de la resistencia, y uno (vanY) es el responsable de eliminar los precursores normales

de la pared celular. Se desconoce la función de un séptimo gen (vanZ) (tabla 1) (Murray, 1997).

INTRODUCCIÓN

11

Tabla 1. Función y proteína codificada por cada uno de los genes del operón vanA.

Gen Proteína Función

vanH Deshidrogenasa Convierte piruvato a lactato.

vanA Ligasa Liga alanina a lactato formando el D-Ala-D-Lac

vanX Dipeptidasa Rompe el D-Ala-D-Ala que pudiera formarse

vanR Regulador de respuesta Activa la vía de la transcripción de la resistencia

vanS Proteinquinasa Sensor de presencia de glucopéptido que fosforila a vanR

vanY Carboxipeptidasa Hidroliza el dipéptido D-Ala-D-Ala de cualquier pentapéptido

precursor

vanZ Desconocida Desconocida. ¿¿Resistencia a teicoplanina??

Se han hallado estructuras de Tn1546 idénticas en cepas de origen animal y humano (Jensen et

al., 1998; Woodford et al., 1998; López et al., 2010).

Operón van B

El operón vanB produce resistencia inducible de bajo o alto nivel a la vancomicina, pero no a

teicoplanina. Tanto el mecanismo de resistencia como la estructuración del operón, es similar a

la del vanA. En base a las diferencias en la secuencia del gen que codifica la ligasa, el clúster

génico vanB puede corresponder a tres subtipos: vanB1, vanB2 y vanB3 (Cetinkaya et al.,

2000).

Este operón suele estar presente en el cromosoma, aunque también se puede diseminar por

plásmidos (Zheng et al., 2009) o transposones conjugativos (Dahl et al., 2003). La diseminación

de esta resistencia se produce por la transferencia de elementos genéticos grandes que contienen

el transposón Tn1547. La transmisión de la resistencia de tipo vanB junto con la resistencia a

ampicilina se ha encontrado en el transposón Tn5382.

Se está observando en los últimos años un incremento en la detección de enterococos vanB2 a

nivel hospitalario (López et al., 2012) y asimismo se está evidenciando también su presencia en

el ámbito animal (Torres et al., 2003; López et al., 2009; Lozano et al., 2015a).

Operón vanC

El operón vanC es una propiedad intrínseca de determinadas especies de enterococos produce

bajo nivel de resistencia a la vancomicina y sensibilidad a teicoplanina. Como se indicó

anteriormente, los genes que codifican el fenotipo de resistencia VanC son endógenos en E.

gallinarum (vanC-1), E. casseliflavus (vanC-2) y E. flavescens (vanC-3).

INTRODUCCIÓN

12

La disposición de estos genes es similar en las 3 especies, pero cada gen es específico de

especie. El tipo de resistencia VanC es de codificación cromosómica y se expresa

constitutivamente. Se diferencia de los vanA y vanB en la situación de los genes reguladores en

el operón (Courvalin et al., 2006; Lozano et al., 2015a; Lozano et al., 2015b).

Tabla 2. Estructura química de los antibióticos glucopeptídicos.

Glucopéptidos Estructura

Vancomicina

Teicoplanina

Las características de los distintos fenotipos de resistencia a glucopéptidos de los enterococos se

muestran en la tabla 3.

INTRODUCCIÓN

13

Tabla 3. Características de los diferentes genotipos de resistencia a vancomicina.

Fenotipo Especies Sensibilidada Genes ligasa (producto)

Tipo de resistencia

Expresión de la resistencia

Resistencia transferible (Elemento asociado)

Localización

Van Tei

Van A E. faecium, E. faecalis, E. avium, E. durans, E. gallinarum, E. casseliflavus, E. mundtii, E. hirae, E. raffinosus

R R Van A (D-Lac)

Adquirida Inducible (Van, Tei)

SI (Tn1546) Plásmido (cromosoma)

Van B E. faecium, E. faecalis r-R S Van A (D-Lac)

Adquirida Inducible (Van)

SI (Tn1547-Tn5382) Plásmido (cromosoma)

Van C E. gallinarum (Van C-1), E. casseliflavus (Van C-2/3),

R S Van C-1 (D-Ser)

Van C-2/3 (D-Ser)

Intrínseca Inducible o constitutiva

NO Cromosoma

Van D E. faecium, E. faecalis R S Van D (D-Lac)

Adquirida Constitutiva NO Plásmido (cromosoma)

Van E E. faecalis R S Van E (D-Ser)

Adquirida Inducible (Van)

NO Cromosoma

Van G E. faecalis R S Van G (D-Ser)

Adquirida Inducible Cromosoma-cromosoma ¿?

Van L E. faecalis R S Van L (D-Ser)

Adquirida Inducible NO Cromosoma

Van N E. faecium R S Van N (D-Ser)

Adquirida Constitutiva SI Plásmido (cromosoma)

Van M E. faecium R R Van M (D-Lac)

Adquirida ¿? SI

a: Resistencia a glicopéptidos ; R: alto nivel; r: bajo nivel; S: susceptible

INTRODUCCIÓN

14

1.4.2 Resistencia a β-lactámicos

Los enterococos poseen cierta resistencia natural intrínseca a los β-lactámicos, debido a la baja

afinidad de sus proteínas de unión a penicilinas (PBPs o penicillin-binding proteins).

Dentro de estos β-lactámicos, las penicilinas tienen mayor actividad frente a los enterococos y,

en menor medida, las cefalosporinas, puesto que, para éstas, poseen un nivel intrínseco de

resistencia tan elevado que no son aptas para el uso en pacientes con infecciones por

enterococos. (Torres & Cercenado, 2010; Zhou et al., 2008)

La resistencia de alto nivel (RAN) a penicilinas es debida mayoritariamente a la

hiperproducción de la PBP5, que posee una baja afinidad natural por las penicilinas y la

capacidad para sustituir las funciones de las PBP sensibles a β-lactámicos, pero también es

debida a mutaciones en el gen pbp5, por lo que las cepas no presentan sustituciones de

aminoácidos cerca del sitio activo de las PBP que implican una todavía menor afinidad por las

penicilinas y por tanto son las responsables del aumento de la resistencia. (Klibi et al., 2008;

Fontana et al., 1984)

La síntesis de β-lactamasas como mecanismo de resistencia frente a penicilinas y

cefalosporinas, producen la inhibición de dichos antibióticos por pérdida de su estructura activa.

Tabla 4. Estructura química de los antibióticos β-lactámicos.

1.4.3 Resistencia a Aminoglucósidos.

Los enterococos poseen intrínsecamente una resistencia de bajo nivel a los aminoglucósidos que

es debida a un deficiente transporte del antibiótico aminoglucosídico al interior de la bacteria.

Sin embargo, con la asociación de un antibiótico que actúe en la pared celular, se produce un

β-lactámicos Estructura

Penicilinas

Ampicilina

Cefalosporinas

Cefalexina

INTRODUCCIÓN

15

efecto sinérgico que aumenta la captación del aminoglucósido (Murray, 1990; Torres &

Cercenado, 2010).

Esta sinergia bactericida es capaz de ser evitada mediante la adquisición de genes que codifican

la producción de enzimas que inhiben la actividad aminoglucosídica llegando a producirse una

RAN. Estas enzimas son fosfotransferasas (APH), acetiltransferasas (AAC) o

nucleotidiltransferasas (ANT) (Gavaldá et al., 1999; del Campo et al., 2005).

Figura 6. Rutas enzimáticas de inactivación de un antibiótico aminoglucósido, acetilación por

acetil-CoA, fosforilación mediada por ATP y adenilación mediada por ATP (Walsh, 2003).

Las APH inactivan los aminoglucósidos, de forma que se transfiere el γ-fosfato del ATP a un

grupo hidroxilo en el aminoglucósido, las AAC utilizan la acetil-coenzima A como dador y

acetilan un grupo amino, y las ANT utilizan el ATP como dador y adenilan un grupo hidroxilo

en el aminoglucósido.

La resistencia a estreptomicina en los enterococos se produce por modificaciones en la

subunidad ribosómica 30S que conlleva una disminución de la unión de la estreptomicina. No se

ha documentado resistencia a aminoglucósidos en enterococos asociada con cambios

ribosómicos, excepto para la estreptomicina. La RAN a estreptomicina implica resistencia

solamente a ésta, mientras que la RAN a gentamicina conlleva RAN al resto de los

aminoglucósidos a excepción de la estreptomicina.

INTRODUCCIÓN

16

Tabla 5. Estructura química de los antibióticos aminoglucosídicos.

1.4.4 Resistencia a Macrolidos, lincosaminas y estreptograminas (MLS)

Puesto que los enterococos son intrínsecamente resistentes a las lincosamidas (como la

clindamicina) y frecuentemente a los macrólidos, no se utilizan para el tratamiento de las

infecciones enterocócicas.

Uno de los mecanismos de resistencia más frecuentes frente a macrólidos (eritromicina,

azitromicina y claritromicina), que también está presente frente a lincosamidas y

estreptograminas B, es la metilación, por medio de una enzima, de un residuo de adenina en la

subunidad 23S del RNA ribosómico, reduciendo su unión al ribosoma. Este mecanismo es

producido por la presencia del gen erm(B) y por el gen erm(A) en menor medida (Portillo et al.,

2000). Este fenotipo se denomina MLSb (macrólidos-lincosamidas-estreptograminas B) y

produce RAN a todos los macrólidos.

Aminoglucósidos Estructura

Estreptomicina

Gentamicina

Kanamicina

INTRODUCCIÓN

17

Tabla 6. Estructura química de los antibióticos Macrolidos, lincosaminas y estreptograminas.

1.4.5 Resistencia a Quinolonas.

La actividad antimicrobiana de las quinolonas se basa en la inhibición de la topoisomerasa IV y

de la DNA girasa, codificadas por los genes parC y gyrA respectivamente, esenciales para la

replicación del DNA.

Los mecanismos de resistencias frente a estas quinolonas (mayoritariamente fluoroquinolonas)

se basan en la modificación de sus dianas y en la disminución de permeabilidad de la membrana

por pérdida de porinas (Chow & Kak, 2002; López et al., 2011).

MLS Estructura

Macrólidos

Eritromicina

Lincosaminas

Clindamicina

Estreptograminas

Quinupristina

INTRODUCCIÓN

18

Tabla 7. Estructura química de los antibióticos del grupo de las quinolonas.

1.4.6 Resistencia a Oxazolidinonas.

Esta resistencia, debida la mutación G2576T en la subunidad 23S del rRNA, es poco frecuente y

ha sido descrita en E. faecium y E. faecalis.

En la mayoría de los casos descritos era procedente de pacientes que recibieron linezolid

durante largos periodos de tiempo y fueron seleccionados en presencia del antibiótico, aunque

también se ha descrito la diseminación clonal.

También existen cepas de enterococo que poseen un mecanismo de resistencia transferible a

linezolid, que es expresado por el gen cfr, el cual codifica una metilasa ribosómica (Meka &

Gold, 2004; Cercenado et al, 2010).

Tabla 8. Estructura química de los antibióticos oxazolidinónicos.

Oxazolidinonas Estructura

Linezolid

Torezolid

Quinolonas Estructura

Ciprofloxacina

Ácido Nalidíxico

INTRODUCCIÓN

19

1.4.7 Resistencia a Cloranfenicol y Tetraciclinas.

El cloranfenicol inhibe la síntesis de proteínas a nivel de la subunidad ribosómica 50S. El

mecanismo de resistencia a cloranfenicol se basa en la producción de acetiltransferasas

codificadas por genes cat.

Respecto a tetraciclinas, su mecanismo de resistencia se basa en modificaciones en la diana

codificadas por los genes tet, siendo tet(M) y tet (L) los más frecuentes. (Bentorcha et al., 1991;

Klare et al., 2003).

Tabla 9. Estructura química de Cloranfenicol y Tetraciclina.

Cloranfenicol

Tetraciclina

1.4.8 Resistencia a trimetoprim

El trimetoprim es un compuesto bacteriostático (que provoca la inhibición del crecimiento

microbiano, pero no su muerte) que inhibe la actividad de la enzima dihidrofolato reductasa

(DHFR), quedando la bacteria deficiente en ácido di- y tetrahidrofólico, cofactor esencial en la

biosíntesis de purinas, y por tanto de DNA (Wisell et al., 2008). Habitualmente, se combina con

sulfamidas (sulfametoxazol) ya que presenta una actividad sinérgica

Su eficacia frente a enterococos es controvertida, ya que poseen la capacidad de incorporar

folatos del exterior (di- y tetrahidrofolato) (Frosolono et al., 1991; Wisell et al., 2008). El

mecanismo de resistencia más frecuente frente a este antibiótico son las mutaciones en los genes

dfr, los cuales codifican las DHFR, produciéndose enzimas DHFR resistentes al trimetoprim

(Huovinen, 2001; López et al., 2012c).

Los genes dfr descritos en bacterias gram positivas son dfrA (Rouch et al., 1989), dfrD

(Charpentier & Courvalin, 1997) (Dale et al., 1995), dfrG, dfrF (Cattoir et al., 2009) y dfrK

(Kadlec & Schwarz, 2009 ; Kadlec & Schwarz, 2010; López et al., 2012c).

INTRODUCCIÓN

20

Tabla 10. Estructura química de trimetoprim y sulfametoxazol.

Bacteriostáticos Estructura

Trimetoprim

Sulfametoxazol

OBJETIVOS

21

2. OBJETIVOS

Objetivo general

Utilizar y aplicar diferentes técnicas microbiológicas, bioquímicas y de la biología molecular para el

estudio de la resistencia a los antibióticos en una colección de cepas de Enterococcus de origen

animal.

Objetivos específicos

1) Identificar por diferentes técnicas una colección de cepas de Enterococcus previamente

aisladas de muestras fecales de ganado vacuno.

2) Estudiar en dicha colección el fenotipo de resistencia a diferentes clases de antibióticos.

3) Determinar los mecanismos de resistencia a antibióticos en aquellas cepas que mostraron un

fenotipo resistente.

.

MATERIAL Y MÉTODO

22

3. MATERIAL Y MÉTODO

3.1 CEPAS INCLUÍDAS EN EL ESTUDIO

Se partió de una colección de 36 aislados bacterianos, previamente obtenidos por el grupo de

investigación donde se ha desarrollado este trabajo, y que fueron obtenidos de la microbiota intestinal

de vacas de una granja en explotación extensiva en La Rioja. Dichos aislados bacterianos presentaban

la morfología compatible con ser enterococo, aunque no habían sido identificados previamente y se

mantenían conservados en congelación (-80ºC). En este trabajo de fin de grado, se ha partido de esta

colección bacteriana para llevar a cabo su identificación por técnicas microbiológicas, bioquímicas y

de la biología molecular y caracterización en cuanto a la resistencia a los antibióticos. Para ello, en

primer lugar se realizó un cultivo y reaislamiento en estria de los cultivos bacterianos conservados en

congelación para verificar que se encontraban en cultivo puro y de esta manera obtener a través de

varios pases consecutivos, colonias aisladas a partir de las cuales poder realizar las distintas pruebas de

caracterización.

Figura 7. Cultivo en estrías de una cepa de Enterococcus y obtención de colonias aisladas.

3.2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO

3.2.1 Medios de cultivo

Infusión de cerebro y corazón Agar (BHI) (Conda): utilizado para el crecimiento de

enterococos. Composición (g/l):

Cerebro de ternera 7,5

Corazón de vaca 10,0

Bacto proteasa peptona 10,0

Bacto dextrosa 2,0

Cloruro sódico 5,0

Fosfato disódico 2,5

Agar 15,0

MATERIAL Y MÉTODO

23

Muller-Hinton Agar (MHA) (Difco): utilizado para los estudios de sensibilidad a antibióticos.

Composición (g/l):

Infusión de ternera 2,0

Bacto casaminoácidos 17,5

Almidón 1,5

Agar 15,0

Bilis Esculina Agar (BEA) (Difco): utilizado para el aislamiento y presunta identificación de

enterococos. Composición (g/l):

Bilis 40,0

Extracto de carne 3,0

Peptona de caseína 5,0

Esculina 1,0

Citrato Férrico 0,5

Agar 15,0

Leche deshidratada (Difco): utilizada para congelar cepas para su conservación. 100% leche

descremada.

3.2.2 Condiciones de cultivo

Todos los medios se prepararon siguiendo las recomendaciones del fabricante. La esterilización se

llevó a cabo en autoclave. Los cultivos se realizaron, en general, a 37ºC durante 24 horas.

3.2.3 Conservación de las cepas

Todas las cepas se conservaron en leche descremada estéril al 10% (Difco) y congeladas a -80ºC.

3.3 TINCIÓN GRAM

La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleada en microbiología para la visualización y

diferenciación de bacterias. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la

técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para

poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacteria Gram

positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria Gram negativa a las que se

visualizan de color rosa.

MATERIAL Y MÉTODO

24

Para su realización partimos del frotis del microorganismo preparado y fijado y seguimos los

siguientes pasos:

1. Cubrir con cristal violeta y mantener durante 1 minuto.

2. Lavar con agua del grifo.

3. Cubrir con lugol y mantener 30 segundos.

4. Lavar con agua.

5. Decolorar con etanol-acetona.

6. Lavar con agua.

7. Cubrir con safranina y mantener 1 minuto.

8. Lavar con agua, secar al aire y observar al microscopio con aceite de inmersión y el objetivo de 100X.

Figura 8. Procedimiento de la tinción Gram

(https://compendiomicrobiologia.wordpress.com/tag/endocarditis).

Los fundamentos de esta técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias.

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de

dos clases de ácidos teicoicos: el ácido lipoteicoico y el ácido teicoico (Bartholomew, 1952).

Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida, por

medio de lipoproteínas, a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la

interna). La membrana exterior está hecha de proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas

de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared

celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

MATERIAL Y MÉTODO

25

Figura 9. Diferencias estructurales de la pared bacteriana entre bacterias Gram positivas (izq) y Gram negativas

(dcha) (modificación de: http://www.generasibiologi.com/2012/09/dinding-sel-bakteri.html)

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de

las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos. La capa de peptidoglicano que posee es

demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se forma

previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea.

Por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor

proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, por lo que éste

actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal

violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

Figura 10. Observación microscópica de las tinciones de bacterias Gram positivas y negativas.

(https://www.studyblue.com/notes/note/n/staining-/deck/14490231)

Tabla 11. Estructura química del peptidoglicano, del colorante cristal violeta y del colorante safranina.

Estructura del peptidoglicano Estructura del cristal violeta Estructura de la safranina

MATERIAL Y MÉTODO

26

3.4 TEST CATALASA

La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en

oxígeno y agua.

2 H2O2 (l) 2 H2O (l) + O2(g)

Esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. El género Enterococcus, al contrario que la

mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, no posee la enzima.

Figura 11 . Representación de la estructura cuaternaria de la catalasa

(http://maestradelia.files.wordpress.com/2012/10/474px-catalase_structure-by-vossman.png).

La reacción química se produce en dos etapas:

Figura 12. Reacción catalítica de la catalasa (Modificada de: McFaddin, J.F., 2003).

La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa, colocando 2 o 3 gotas al cultivo, resultando positivo si en la colonia hay efervescencia debida a la liberación de O2(g).

Figura 13. Reacción negativa (A) y positiva (B) de la catalasa

(http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/file.php/743/Bacteriologia/Pruebas_de_laboratorio/Prueba_de_catalasa.html).

MATERIAL Y MÉTODO

27

3.5 BILIS ESCULINA

Esta prueba se realiza para diferenciar entre Enterococcus y Streptococcus mediante su cultivo en

BEA, ya que las bacterias del género Enterococcus son capaces de crecer en presencia de un 4% de

bilis y, como ya se ha mencionado anteriormente en la introducción, son capaces de hidrolizar la

esculina para formar glucosa y esculetina.

Figura 14. Reacción de hidrolisis de la esculina (McFaddin, J.F., 2003).

La esculina generada se combina con iones de hierro formando un complejo de color negro

Figura 15. Reacción y formación del complejo esculetina-Fe3+ en placa (Modificada de: McFaddin, J.F., 2003 ; https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bile_esculin_agar.jpg).

3.6 ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS POR EL MÉTODO DEL

ANTIBIOGRAMAS

Se recogieron una o dos colonias de un cultivo puro de 24 horas en BHI agar (Conda), y se realizó una

suspensión en 3ml de solución salina estéril (0,9% NaCl) hasta obtener una turbidez equivalente a 0,5

McFarland (que supone una concentración de bacterias de aproximadamente 1,5·108 UFC/ml).

Posteriormente, se llevó a cabo la inoculación en placa. Se introdujo un hisopo estéril de algodón en la

suspensión bacteriana, y se extendió, sobre la superficie de una placa de MH agar homogéneamente,

MATERIAL Y MÉTODO

28

colocándose seguidamente los discos de antibiótico, con una separación suficiente que permita

distinguir los halos posteriormente.

Figura 16. Antibiograma de una cepa de Enterococcus.

Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 horas. En el caso del estudio de las resistencias de alto nivel

a kanamicina, los discos de antibiótico fueron preparados añadiendo a discos estériles (Difco) las

cantidades necesarias de antibióticos (120 μg/disco). Tras las 24 horas de incubación se midió el

diámetro del halo de inhibición producido y se interpretó el resultado de acuerdo con los criterios del

CLSI (2015).

Tabla 12. Carga de los discos de antibiótico empleados en antibiogramas y puntos de corte de los halos de inhibición según el CLSI (2015).

Antibiótico Carga por disco (μg)

Punto de corte del halo de inhibición (mm)

R I S

Vancomicina (VAN) 30 ≤14 15-16 ≥17

Teicoplanina (TEI) 30 ≤10 11-13 ≥14

Ampicilina (AMP) 10 ≤16 - ≥17

Eritromicina (ERY) 15 ≤13 14-22 ≥23

Tetraciclina (TET) 30 ≤14 15-18 ≥19

Ciprofloxacina (CIP) 5 ≤15 16-20 ≥21

Cloranfenicol (CHL) 30 ≤12 13-17 ≥18

Trimetoprim-sulfametoxazol (SXT)a 1,25 + 23,75 ≤21 22-49 ≥50

Gentamicina alta carga (GEH)a 120 6 7-9 ≥10

Estreptomicina alta carga (STH)a 300 6 7-9 ≥10

Kanamicina alta carga (KAH)a 120 6 7-9 ≥10

Linezolid 120 ≤20 21-22 ≥23 a Puntos de corte no definidos.

MATERIAL Y MÉTODO

29

3.7 EXTRACCIÓN DE DNA: Protocolo InstaGeneTM Purification Matrix.

Para la extracción del DNA en Enterococcus se utilizó el sistema InstaGene Matrix (BioRad), una

matriz que absorbe los productos de la lisis celular, que interfieren en la reacción de PCR, facilitando

la preparación de DNA válido para amplificación por PCR y permitiendo además eliminar los pasos

correspondientes a la extracción con fenol/cloroformo. El protocolo seguido fue el siguiente:

Se tomó una colonia de la bacteria crecida durante las 24 horas en medio sólido BHI (Difco), y se

inoculó en 1 ml de agua miliQ estéril. Se centrifugó 1 minuto a 12.000 r.p.m. y se eliminó el

sobrenadante. Se resuspendió el precipitado con 200 μl de InstaGene Matrix y se incubó durante 20

min. a 56ºC. Tras este periodo se vorteó y se introdujo en un baño a 100ºC durante 8 min. Se vorteó de

nuevo y se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 3 min. El sobrenadante se recogió en tubos limpios,

pudiendo ser utilizado para técnicas de PCR.

3.8 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).

La reacción en cadena de la polimerasa se define como una técnica que amplifica in vitro un

fragmento de DNA que suele corresponder a la expresión de un gen específico. (Mullis & Faloona.

1987)

Para ello, se deben seleccionar los cebadores (o también denominados primers) específicos que

delimitarán la región a amplificar y, con los cuales, la DNA polimerasa comenzará la réplica del DNA

mediante ciclos repetitivos. Del mismo modo, se precisa de la presencia de 4 desoxynucleótidos

(dNTPs): dATP, dGTP, dTTP y dCTP; y de unas condiciones buffer para que se lleve a cabo.

La ADN polimerasa utilizada es la llamada Taq-Polimerasa, la cual es aislada de la bacteria thermus

aquaticus, puesto que debe ser capaz de soportar elevadas temperaturas (Kaledin A.S. et al, 1980).

Los ciclos repetitivos constan de 3 etapas diferenciadas:

Desnaturalización.

Hibridación.

Enlongación.

Desnaturalización:

La mezcla de reacción se calienta aproximadamente a 95ºC, produciéndose que las hebras

complementarias se separen en un proceso de desnaturalización.

Las hebras obtenidas tras cada uno de los ciclos sirven de molde para las siguientes. El resultado final

de cada ciclo consiste en un fragmento de DNA de doble hebra determinado por la secuencia de los

oligonucleótidos cebadores y la distancia entre éstos.

MATERIAL Y MÉTODO

30

Hibridación:

Se reduce la temperatura a 55ºC produciéndose la unión de los cebadores (primers) al DNA en un

proceso denominado hibridación. Los enlaces resultantes son estables sólo si la cadena del cebador y

del segmento de DNA es complementaria.

Elongación:

Se aumenta la temperatura hasta 72ºC. Se alcanza la temperatura óptima de trabajo de la taq-

polimerasa y se favorece produce la unión de los dNTPs con la ayuda de los iones Mg2+, formando

complejos solubles con éstos.

Figura 17. Fases de la amplificación por PCR (Andy Vierstraete, 1999).

La técnica de PCR se utilizó para llevar a cabo la amplificación de genes de Enterococcus para su

identificación, y estudio de genes de resistencias o del gen codificante del rRNA. De manera general,

la mezcla de reacción de PCR se preparó en un volumen final de 25μl, utilizando los componentes

indicados en la Tabla 14.

MATERIAL Y MÉTODO

31

Tabla 13. Componentes de los reactivos utilizados en la técnica de PCR.

Componentes Concentración del

stock

Volumen por

tubo

Concentración final de

reacción

*Cebador forward 25μM 0.5μl 0,5μM

*Cebador reverse 25μM 0.5μl 0,5μM

Tampón de reacción NH4 (Bioline) 10X 2.5μl 1X

MgCl2 (Bioline) 50mM 0.75μl 1,5mM

dNTPs (Sigma-Aldrich) 2,5mM 0.5μl 0,5mM

BioTaq DNA polimerasa (Bioline) 5U/μl 0.15μl 1,5U

DNA --- 5μl ---

Agua miliQ estéril --- Hasta 25 μl ---

* Los cebadores fueron sintetizados por Sigma-Aldrich. A partir de un stock de 100μM, preparamos nuestro

stock de trabajo de 25μM.

En todos los casos se incluyó una muestra control positivo y una muestra control negativo. Las

reacciones de PCR se realizaron en los termocicladores siguientes: Perkin Elmer (GeneAmp PCR

System 2400, Applied Biosystems) y T3 y T3000 Thermocycler (Biometra). Las secuencias de los

cebadores, las condiciones de amplificación y los tamaños de los fragmentos de DNA amplificados en

cada caso se describen en las tablas 15-19.

Figura 18. Termociclador T3 Biometra.

MATERIAL Y MÉTODO

32

Tabla 14. Secuencia nucleotídica de cebadores empleados para la identificación de especies de Enterococcus y

condiciones de amplificación.

Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia

(tamaño del amplicón)

ddlE. faecalis

F: ATCAAGTACAGTTAGTCT

R: ACGATTCAAAGCTAACTG

94ºC 2 min 1 ciclo

94ºC 1 min

54ºC 1 min 30 ciclos

72ºC 1 min

72ºC 10 min 1 ciclo

Dutka – Malen et al., 1995

(941 pb)

aac(6´)-Ii E. faecium

F: GCGGTAGCAGCGGTAGACCAAG

R: GCATTTGGTAAGACACCTACG

94ºC 2 min 1 ciclo

94ºC 1 min

55ºC 2 min 35 ciclos

72ºC 3 min

72ºC 7 min 1 ciclo

Costa et al., 1993

(323 pb)

VanC1 (E. gallinarum)

F: GCTGAAATATGAAGTAATGACC

R: CGGCATGGTGTTGATTTCGTT

94ºC 3 min 1 ciclo

94ºC 30 seg

58ºC 2 min 40 ciclos

72ºC 2 min

72ºC 6 min 1 ciclo

Miele et al., 1995

(811 pb)

vanC2/C3 (E. casseliflavus)

F: CTCCTACGATTCTCTTG

R: CGAGCAAGACCTTTAAG

94ºC 3 min 1 ciclo

94ºC 1 min

58ºC 1 min 30 ciclos

72ºC 1 min

72ºC 10 min 1 ciclo

Dutka – Malen et al., 1995

(439 pb)

mur-2ed (E. durans)

F: AACAGCTTACTTGACTGGACGC

R: GTATTGGCGCTACTACCCGTATC

94ºC 2 min 1 ciclo

94ºC 1 min

60ºC 15 seg 30 ciclos

72ºC 1min 30seg

72ºC 7 min 1 ciclo

Robredo et al., 1999

(176 pb)

mur-2 (E. hirae)

F: CGTCAGTACCCTTCTTTTGCAGAGTC

R: GCATTATTACCAGTGTTAGTGGTTG

94ºC 2 min 1 ciclo

94ºC 1 min

61ºC 15 seg 30 ciclos

72ºC 1min 30seg

72ºC 7 min 1 ciclo

Arias et al., 1992

(521 pb)

MATERIAL Y MÉTODO

33

Tabla 15. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la detección de

genes relacionados con la resistencia a antibióticos.

Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia

(tamaño del amplicón)

vanA

F: ATGGCAAGTCAGGTGAAGATGG

R: TCCACCTCGCCAACAACTAACG

96ºC 2 min 1 ciclo

94ºC 30 seg

50ºC 30 seg 35 ciclos

72ºC 1 min

72ºC 10 min 1 ciclo

Woodford et al 1993

(399pb)

vanB

F: CAAAGCTCCGCAGCTTGCATG

R: TGCATCCAAGCACCCGATATAC

94ºC 3 min 1 ciclo

94ºC 30 seg

58ºC 2 min 40 ciclos

72ºC 2 min

72ºC 6 min 1 ciclo

Dahl et al., 1999

(484 pb)

aph(3’)-IIIa

F: GCCGATGTGGATTGCGAAAA

R: GCTTGATCCCCAGTAAGTCA

94ºC 5 min 1 ciclo

94ºC 30 seg

60ºC 2 min 30 ciclos

72ºC 2 min

72ºC 7 min 1 ciclo

Van de Klundert and Vliegenthart, 1993

(292 pb)

Tabla 16. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la

caracterización de la resistencia a trimetoprim y el entorno del gen dfrK.

Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia

(tamaño del amplicón)

dfrK

F: GAGAATCCCAGAGGATTGGG

R: CAAGAAGCTTTTCGCTCATAAA

94ºC 5 min 1 ciclo

94ºC 1 min

58ºC 2 min 40 ciclos

72ºC 3min

72ºC 7 min 1 ciclo

Kadlec and Schwarz 2009

(422 pb)

MATERIAL Y MÉTODO

34

Tabla 17. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la detección de

genes asociados a la producción de bacteriocinas.

Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia

(tamaño del amplicón)

cfr (Ent1071A/B)

F: ATAATTAGGGGGAACGATAA

R: ATACATTCTTCCACTTATTTTT

97ºC 2 min 1 ciclo

94ºC 45 seg

51ºC 30 seg 35 ciclos

72ºC 20 seg

72ºC 7 min 1 ciclo

Franz et al., 2002

(403pb)

Tabla 18. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para amplificación del

rRNA 23S.

Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia

(tamaño del amplicón)

rRNA 23S

F: GCGGTCGCCTCCTAAAAG

R: ATCCCGGTCCTCTCGTACT

97ºC 5 min 1 ciclo

94ºC 1 min

54ºC 1 min 30ciclos

72ºC 1 min

72ºC 7 min 1 ciclo

Dibo et al., 2004

(420pb)

3.9 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA.

Para la visualización del DNA de los fragmentos amplificados por PCR, se utilizó la técnica de

electroforesis en gel de agarosa. Para la preparación del gel se debe previamente preparar TBE 5X (54

g/l Tris-base; 27,5 g/l Ácido bórico; 20 ml EDTA 0,5M pH=8). A continuación se mezcla 1 g de

agarosa con 20 ml de TBE 5X y 80 ml de agua destilada. Tras calentar la mezcla hasta ebullición

durante 2 minutos, se adiciona 6 µl de Midori Green (agente intercalante del DNA que emite

fluorescencia con luz UV) y se vierte sobre una cubeta de electroforesis, la cual se debe sellar

previamente con cinta de carrocero para evitar fugas, provista con unos peines que formarán los

pocillos (tras solidificar el gel) donde se cargaran los productos de PCR.

Una vez se ha solidificado el gel, se retiran los peines y se cargan los pocillos con 10μl de producto de

PCR mezclado con tampón de carga (10% sacarosa (p/v), 0,0025% azul de bromofenol en TE [10mM

Tris(hidroximetil) aminometano, 1mM EDTA pH8]).

MATERIAL Y MÉTODO

35

Una vez se termine de cargar todos los productos de PCR, se retira la cinta de carrocero y el gel se

sumerge totalmente en una cámara de electroforesis con TBE 1X, en la que se somete a un campo

eléctrico de 75-100V durante 45 min para que los fragmentos amplificados se separen según su peso

molecular. Posteriormente, se visualizan las bandas obtenidas con luz ultravioleta en un

transiluminador, y se fotografian utilizando el captador de imágenes (Image Store 5000, UPV).

Figura 19. Resultados para la PCR de identificación para Enterococcus casseliflavus.

Figura 20. Resultados para la PCR del gen drfK.

3.10 SECUENCIACIÓN

Se llevó a cabo la secuenciación del gen codificante del rRNA 23S obtenido a través de la técnica de

PCR en la cepa resistente a linezolid.

Reacción de secuenciación

Los amplicones obtenidos en la reacción de PCR fueron purificados y posteriormente secuenciados

utilizando el mismo cebador forward que se empleó en la PCR. Dicha secuenciación se llevó a cabo en

una empresa externa (Beckman Coulter Genomics, Reino Unido). Una vez recibidos en el laboratorio

los cromatogramas y las secuencias de nucleótidos resultantes, estos fueron analizados y verificados.

.Análisis de las secuencias

Para el análisis de las secuencias se emplearon diversas herramientas bioinformáticas a través de

diferentes páginas web:

NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Attotron Biosensor Corporation: (http://www.attotron.com/cybertory/analysis.htm)

C+ 422pb Cepas positivas

C- C+ 439 pb

Cepas positivas

Cepas

negativa

s

MATERIAL Y MÉTODO

36

EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute):

(http://www.ebi.ac.uk/Information/tools_sitemap.html).

ExPASy Proteomics Server:

(http://expasy.org/tools/dna.html).

Las secuencias obtenidas se compararon con las incluidas en la base de datos del GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando para ello el programa BLAST Basic Local Aligneame

desarrollado por el NCBI que muestra los alineamientos entre la secuencia problema y las incluidas en

la base de datos.

RESULTADOS

37

4. RESULTADOS Se estudiaron 36 aislados morfológicamente compatibles con el género Enterococcus, que

habían sido previamente aislados de 33 vacas de una granja de ganadería extensiva de La

Rioja. En primer lugar se llevó a cabo la identificación de estas cepas por técnicas

microbiológicas/bioquímicas (tinción de Gram, test catalasa y reacción de bilis esculina) y

también por técnicas moleculares (PCR especie-específicas). Asimismo se determinó los

fenotipos y genotipos de resistencia a antibióticos. Todas las cepas presentaron las siguientes

características: tinción Gram positivo, actividad catalasa negativa y reacción bilis esculina

positiva.

La identificación de las 36 cepas mediante la técnica de PCR se realizó mediante la

detección de genes especie-específicos lo cual permitió la adscripción final de la especie

bacteriana (ver tabla 20). En este sentido, 18 cepas fueron identificadas como E. hirae (50%)

al poseer el gen mur-2, 6 cepas como E. casseliflavus (16,7%) al poseer el gen vanC2, 5

cepas como E. faecium (13,9%) al poseer el gen aac(6´)-Ii, y 7 cepas como Enterococcus

spp (19,4%). En las 7 cepas Enterococcus spp no se pudo llegar a nivel de especie y solo

fueron identificadas a nivel de género.

Tabla 19. Estudio del Gram, test catalasa, gen especie-específico e identificación de las cepas de Enterococcus.

Cepa Gram Catalasa Gen especie-específico por PCR Identificación por PCR G3-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G5-A Positivo Negativo Enterococcus spp G9-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae

G10-A-1 Positivo Negativo mur-2 E. hirae G11 Positivo Negativo mur-2 E. hirae

G12-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G13-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G15-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G16-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae

G17-A-1 Positivo Negativo mur-2 E. hirae G18-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae

G19-A-1 Positivo Negativo mur-2 E. hirae G20-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G21-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G23-B Positivo Negativo Enterococcus spp G24-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus

G24-A* Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium G25-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus G26-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G27-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus G28-A Positivo Negativo Enterococcus spp G29-B Positivo Negativo Enterococcus spp G30-A Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium

G31-A*2 Positivo Negativo Enterococcus spp G32-A-1 Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium

G32-VAN Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium G33-A Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium G34-A Positivo Negativo Enterococcus spp G35-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus G36-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus

G36-VAN Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus G37-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G38-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae

G39-A-1 Positivo Negativo mur-2 E. hirae G40 Positivo Negativo Enterococcus spp

G41-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae

RESULTADOS

38

Figura 21. Distribución de especies en la colección de Enterococcus estudiada.

A continuación se realizó el estudio fenotípico de resistencia mediante la realización del

antibiograma con 12 antibióticos diferentes correspondientes a diferentes familias

(glucopéptidos, beta-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, fluoroquinolonas,

oxazolidinonas, cloranfenicol, tetraciclina, y SXT). Diez de las 36 cepas (27,8%)

presentaron resistencia a al menos uno de los antibióticos testados. De éstas, 8 cepas

presentaban resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol (SXT, 22,2%), 3 cepas resistencia a

kanamicina de alta carga (KAH, 8,33% ) y 1 cepa resistencia a linezolid (LZD, 2,77%). Dos

de las cepas de la especie E. hirae presentaron resistencia a SXT y KAH, conjuntamente.

Los datos correspondientes a los halos de inhibición producidos por los antibióticos en

contacto con las diferentes bacterias se pueden ver en la tabla 21.

Se realizó el estudio genotípico de las cepas que presentaron alguna resistencia mediante

PCR y posterior electroforesis en gel de agarosa. En las cepas que presentaron resistencia a

SXT se estudió la presencia de los genes drfF, dfrG y dfrK (codificante de DHFR); en las

que presentaron resistencia a KAH se estudió la presencia del gen aph(3´)-IIIa (codificante

de la fosfotransferasa APH(3´)-III); y en la cepa que presentó resistencia a LZD se estudió la

presencia del gen cfr (codificante de una metilasa ribosómica) .

En 2 de las cepas resistentes a SXT se constató la presencia del gen dfrK (cepas: E. hirae

G17A1 y G19A1). En el resto de cepas estudiadas, no se obtuvo ningún resultado positivo

frente a los genes estudiados. También se observó una resistencia intermedia a VAN en todas

las especies E. casseliflavus y en la cepa G-21A (resistente a LZD) (E.hirae) (tabla 22). Las

cepas de E. casseliflavus con resistencia intermedia a vancomicina portaban el gen vanC2,

especifico de esta especie bacteriana, y que sirve asimismo para su identificación molecular

al ser un mecanismo intrínseco de esta especie. En la cepa E. hirae G-21a con resistencia

intermedia a vancomicina no se detectó ninguno de los genes van estudiados.

En la tabla 21 se pude observar que otras cepas presentaron sensibilidad disminuida

(resistencia intermedia) frente a otros antibióticos (eritromicina, SXT, tetraciclina,

cloranfenicol, kanamicina, ciprofloxacina).

18

5

6

7

Identificación de las Cepas

E. hirae

E. faecium

E. casseliflavus

Enterococcus spp

RESULTADOS

39

Tabla 20. Halos de inhibición (expresado en mm) producidos por los distintos antibióticos testados en las cepas de Enterococcus y estudio de su resistencia según los puntos

de corte asignados por el CLSI (2015)*.

*No sombreado: categoría sensible; sombreado en naranja: categoría intermedia; sombreado en verde: categoría resistente. En la parte superior de las columnas se indican los

puntos de corte de resistencia y de sensibilidad para cada antibiótico, de acuerdo con el CLSI 2015

≤14 ≥17 ≤10 ≥14 ≤16 ≥17 ≤13 ≥23 ≤14 ≥19 ≤15 ≥21 ≤12 ≥18 ≤21 ≥50 <6 ≥10 <6 ≥10 <6 ≥10 ≤20 ≥23

Cepas \ Antibióticos VAN TEI AMP ERY TET CIP CHL SXT GEH STH KAH LZD E. hirae G3-A 20 20 30 25 30 24 20 26 22 22 18 28

Enteroccus spp G5-A 22 22 34 16 30 28 26 16 26 24 20 30 E. hirae G9-A 24 20 28 26 30 24 26 32 26 26 20 28

E. hirae G10-A-1 26 26 36 32 30 19 30 0 26 20 0 34 E. hirae G11 24 26 38 30 30 22 30 0 20 20 0 32

E. hirae G12-A 20 20 24 20 30 24 28 34 24 22 18 32 E. hirae G13-A 24 22 28 26 30 24 24 32 26 24 16 29 E. hirae G15-A 22 22 26 23 34 22 24 32 18 22 20 30 E. hirae G16-A 24 22 34 32 32 28 24 34 26 24 22 28

E. hirae G17-A-1 26 26 38 24 34 22 28 0 26 24 10 30 E. hirae G18-A 24 20 26 26 28 26 22 32 20 18 14 26

E. hirae G19-A-1 23 21 23 28 26 25 24 0 20 21 17 29 E. hirae G20-A 24 24 32 26 26 18 20 30 24 16 18 26 E. hirae G21-A 16 22 38 24 18 20 18 30 20 16 14 14

Enteroccus spp G23-B 22 22 31 32 34 16 32 24 22 18 12 26 E. faecium G24-A 16 21 24 18 30 21 24 34 26 27 22 28

E. casseliflavus G24-A* 20 20 28 20 26 19 24 28 27 16 18 28 E. casseliflavus G25-A 15 20 30 26 28 16 24 20 16 22 18 24

E. hirae G26-A 23 16 30 26 24 20 22 26 18 18 17 26 E. casseliflavus G27-A 16 19 27 19 28 19 28 24 25 24 18 30 Enteroccus spp G28-A 26 24 40 24 30 22 32 0 22 22 14 32 Enteroccus spp G29-B 26 22 36 22 34 28 34 0 20 25 20 34

E. faecium G30-A 30 24 40 28 34 24 18 20 24 26 10 34 Enteroccus spp G31-A*2 24 21 28 21 33 22 26 28 25 23 20 30

E. faecium G32-A-1 26 22 38 30 24 20 30 26 18 17 10 22 E. faecium G32-VAN 24 22 35 28 30 24 30 20 22 24 0 26

E. faecium G33-A 24 24 31 22 32 19 34 24 24 24 18 32 Enteroccus spp G34-A 30 22 32 23 20 20 22 22 18 18 12 32 E. casseliflavus G35-A 16 40 31 20 29 22 31 38 25 21 15 34 E. casseliflavus G36-A 15 25 36 22 38 32 30 36 32 30 20 36

E. casseliflavus G36-VAN 16 16 30 18 24 18 20 28 26 26 18 28 E. hirae G37-A 22 22 34 30 28 28 24 34 23 24 18 30 E. hirae G38-A 24 20 24 22 26 21 24 32 25 24 20 26

E. hirae G39-A-1 24 20 26 22 28 22 25 32 22 24 20 30 Enteroccus spp G40 26 21 34 34 28 24 28 20 22 20 14 34

E. hirae G41-A 26 22 30 24 30 22 23 34 24 26 24 26

DISCUSIÓN

40

Tabla 21. Resumen del estudio fenotípico y genotípico de las cepas de Enterococcus.

Cepa Especie Fenotipo de resistencia* Genotipo de resistencia

G3-A E. hirae Sensible a Todo

G5-A Enterococcus spp Sensible a Todo

G9-A E. hirae Sensible a Todo

G10-A-1 E. hirae SXT y KAH

G11 E. hirae SXT y KAH

G12-A E. hirae Sensible a Todo

G13-A E. hirae Sensible a Todo

G15-A E. hirae Sensible a Todo

G16-A E. hirae Sensible a Todo

G17-A-1 E. hirae SXT dfrK

G18-A E. hirae Sensible a Todo

G19-A-1 E. hirae SXT dfrK

G20-A E. hirae Sensible a Todo

G21-A E. hirae LZD** / VAN

G23-B Enterococcus spp Sensible a Todo

G24-A E. casseliflavus VAN vanC2

G24-A* E. faecium Sensible a Todo

G25-A E. casseliflavus SXT / VAN vanC2

G26-A E. hirae Sensible a Todo

G27-A E. casseliflavus VAN vanC2

G28-A Enterococcus spp SXT

G29-B Enterococcus spp SXT

G30-A E. faecium Sensible a Todo

G31-A*2 Enterococcus spp Sensible a Todo

G32-A-1 E. faecium Sensible a Todo

G32-VAN E. faecium KAH

G33-A E. faecium Sensible a Todo

G34-A Enterococcus spp Sensible a Todo

G35-A E. casseliflavus VAN vanC2

G36-A E. casseliflavus VAN vanC2

G36-VAN E. casseliflavus VAN vanC2

G37-A E. hirae Sensible a Todo

G38-A E. hirae Sensible a Todo

G39-A-1 E. hirae Sensible a Todo

G40 Enterococcus spp SXT

G41-A E. hirae Sensible a Todo

* Naranja: Fenotipo con resistencia intermedia; Verde: fenotípo resistente **En esta cepa se detectaron mutaciones en el gen codificante del rRNA 23S.

DISCUSIÓN

41

Figura 22. Comparación de las cepas de Enterococcus que mostraron resistencia a antibióticos.

También se decidió realizar en la cepa resistente a LZD (G21A; E. hirae), a la vista de que

no se constató la presencia del gen cfr, una amplificación del RNA ribosómico (rRNA) 23S

para su posterior secuenciación en busca de mutaciones que explicaran dicha resistencia.

La secuencia obtenida se comparó con la secuencia base en busca de mutaciones:

S.base CGGTCGCCTCCTAAAAGGTAACGGAGGCGCTCAAAGGTTCCCTCAGAATGGTTGGAAATC

S.G21 ------------------------------------------------ATGGTTGGAATC

* * * ****

S. base ATTCATAGAGTGTAAAGGCATAAGGGAGCTTGACTGCGAGACCTACAAGTCGAGCAGGGT

S. G21 ATTCGAAGAGTGTAAAGGCAGAAGGGAGCTTGACTGCGAGACCAACAAGTCGAGCAGGGA

**** ************** ********************** ***************

S. base CGAAAGACGGACTTAGTGATCCGGTGGTTCCGCATGGAAGGGCCATCGCTCAACGGATAA

S. G21 CGAAAGTCGGGCTTAGTGATCCGGTGGTTCCGCATGGAAGGGCCATCGCTCAACGGATAA

****** *** *************************************************

S. base AAGCTACCCCGGGGATAACAGGCTTATCTCCCCCAAGAGTTCACATCGACGGGGAGGTTT

S. G21 AAGCTACCCTGGGGATAACAGGCTTATCTCCCCCAAGAGTCCACATCGACGGGGAGGTTT

********* ****************************** *******************

S. base GGCACCTCGATGTCGGCTCATCGCATCCTGGGGCTGTAGTCGGTCCCAAGGGTTGGGCTG

S. G21 GGCACCTCGATGTCGGCTCGTCGCATCCTGGGGCTGTAGTCGGTCCCAAGGGTTGGGCTG

******************* ****************************************

8

3

1

2

0

7

0

10

SXT KAH LZD SXT + KAH VAN

36 cepas aisladas

KAH

VAN

Fenotipo resistente

Fenotipo de resistencia intermedia

DISCUSIÓN

42

S. base TTCGCCCATTAAAGCGGTACGCGAGCTGGGTTCAGAACGTCGTGAGACAGTTCGGTCCCT

S. G21 TTCGCCCATTAAAGCGGCACGCGAGCTGGGTTCAGAACGTCGTGAGACAGTTCGGTCCCT

***************** ******************************************

S. base ATCCGTCGTGGGCGTAGGAAATTTGAGAGGAGCTGTCCTTAGTACGAGAGGACCGGGATG

S. G21 ATCCGTCGCGGGCGTTGGAAATTTGAGAGGAGCTGTCCTTAGTACGAG------------

******** ****** ********************************

Se encontraron 18 mutaciones, las cuales se detallan a continuación:

1. Mutación T2323A (T2296A según la numeración de Escherichia coli).

2. Mutación G2324T (G2297T según la numeración de Escherichia coli).

3. Mutación T2326G (G2299T según la numeración de Escherichia coli).

4. Mutación G2328T (G2301T según la numeración de Escherichia coli).

5. Mutación A2330G (A2303G según la numeración de Escherichia coli).

6. Mutación A2339G (A2312G según la numeración de Escherichia coli).

7. Mutación T2340A (T2313A según la numeración de Escherichia coli).

8. Mutación T2355G (T2328G según la numeración de Escherichia coli).

9. Mutación T2378A (T2351A según la numeración de Escherichia coli).

10. Mutación T2394A (T2367A según la numeración de Escherichia coli).

11. Mutación A2401T (A2374T según la numeración de Escherichia coli).

12. Mutación A2405G (A2388G según la numeración de Escherichia coli).

13. Mutación C2464T (C2447T según la numeración de Escherichia coli).

14. Mutación T2495C (T2478C según la numeración de Escherichia coli).

15. Mutación A2534G (A2517G según la numeración de Escherichia coli).

16. Mutación T2598C (T2571C según la numeración de Escherichia coli).

17. Mutación T2649C (T2622C según la numeración de Escherichia coli).

18. Mutación A2656T (A2629T según la numeración de Escherichia coli).

DISCUSIÓN

43

5. DISCUSIÓN

En las últimas décadas ha existido una gran preocupación por la transferencia de bacterias resistentes a

antibióticos del animal al hombre.

Los animales de granja han sido considerados en algunos casos como reservorios de ciertos genes de

resistencia. Las bacterias intestinales pueden diseminarse a través de las heces en diferentes ambientes

como es el caso de las aguas residuales, la tierra, el abono orgánico, etc (Radhouiani et al., 2014)

Además, algunos mecanismos de resistencia altamente preocupantes podrían haber surgido en

ecosistemas naturales y, posteriormente, podrían haber pasado al ambiente hospitalario (Martínez,

2009) puesto que existe una continua diseminación e intercambio de bacterias resistentes y de genes de

resistencia entre los diferentes ecosistemas (humano, animal, acuático, terrestre, etc) favorecida por la

globalización.

Figura 23. Potenciales vías de propagación de bacterias resistentes a antibióticos de animales a humanos (Antibiotic Resistance: Agencies Have Made Limited Progress Addressing Antibiotic Use in Animals -

http://www.gao.gov)

Un ejemplo de dicha transferencia animal-hombre de bacterias resistentes a antibióticos, fue la

detección de Enterococcus resistentes a vancomicina (ERV) (genotipo vanA) fuera del ámbito

hospitalario (Robredo et al., 2000; Radhouiani, 2010; Lozano et al., 2015b). Este hecho se relacionó

con el uso de avoparcina (antibiótico muy similar a la vancomicina) como promotor del crecimiento en

animales de abasto (Robredo, 1999). La avoparcina fue el primer antibiótico que se prohibió como

promotor del crecimiento en animales y posteriormente, en 2006, se produjo la prohibición total de

todos ellos. A partir de esta prohibición se puso de manifiesto una disminución en la frecuencia de

DISCUSIÓN

44

detección de cepas ERV (Hammerum et al., 2010) aunque estas cepas aún prevalecen, detectándose en

animales de abasto y salvajes.

Hoy en día se considera a la transferencia de bacterias multirresistentes del animal al hombre, a través

de la cadena alimentaria, un problema de seguridad alimentaria. Por ello, el problema global de la

resistencia de bacterias a antibióticos no se refiere sólo en el ámbito clínico, sino que toma fuerza en

los ámbitos veterinario y alimentario.

En este trabajo se realizó la identificación de 36 cepas de enterococos aisladas previamente de

muestras fecales de una granja de vacuno de ganadería extensiva de La Rioja. Un total de 18 cepas

fueron identificadas como E. hirae, 6 cepas como E. casseliflavus, 5 cepas como E. faecium y 7 cepas

como Enterococcus spp. Estudios previos llevados a cabo en aislados de enterococcos fecales de vaca

detectan las especies E. faecalis, E. hirae, E. casseliflavus y E. faecium (Devriese, 1987; Devriese,

1992), identificando la especie E. faecium como la más prevalente, lo cual difiere de nuestro estudio

donde E. hirae es la más prevalente aunque la especie E. faecium es también detectada. Estas

diferencias pueden ser reflejo de diferencias en la microbiota intestinal de ganado vacuno de diferentes

razas (como las analizadas en los diferentes estudios), aunque se requieren estudios con un mayor

número de cepas y de animales testados para poder llegar a conclusiones claras al respecto.

Además se detectaron 6 cepas de E. casseliflavus con resistencia intermedia a la vancomicina y una

cepa de E. hirae con resistencia intermedia a este antibiótico. La resistencia intermedia a vancomicina

en E. casseliflavus es intrínseca de especie y se debe a la presencia a nivel cromosómico del gen

vanC2 en los aislados de esta especie (Lozano et al., 2015b). En el caso de la cepa de E. hirae no se

detectó ningún gen van que pudiese justificar el fenotipo intermedio. En un futuro se estudiará en

profundidad esta cepa por si pudiese presentar un mecanismo nuevo de resistencia. Conviene destacar

que esta cepa presentó asimismo resistencia al linezolid.

El porcentaje total de bacterias resistentes ha sido moderado, pero es importante destacar que las cepas

fueron aisladas de una granja de vacas en explotación extensiva, y estos animales en general presentan

un porcentaje de bacterias resistentes a antibióticos menor que otros animales de granja como pueden

ser los pollos o los cerdos en explotaciones intensivas (Chantziaras et al., 2014), y puede ser un reflejo

del diferente uso relativo de antibióticos en los diferentes sectores de la producción animal.

En cuanto al estudio genotípico de las cepas, en 2 de las cepas resistentes a SXT se constató la

presencia del gen dfrK, el cual codifica la producción de enzimas DHFR que confieren resistencia al

SXT. Este gen se describió por primera vez en el género Staphylococcus (Kadlec & Schwarz, 2010) y

se relacionó con cepas de origen porcino. En un estudio de 2012 se describió por primera vez en el

género Enterococcus (López et al., 2012c) lo que sugirió un intercambio de este gen de resistencia

entre ambos géneros bacterianos. Hay que destacar que los géneros Enterococcus y Staphylococcus

son Gram positivos y comparten otros muchos genes de resistencia a antibióticos, como los

relacionados con la eritromicina, aminoglucosidos etc., cuya transferencia probablemente se ha

producido a través de plásmidos o transposones conjugativos (Torres& Cercenado, 2010).

DISCUSIÓN

45

Por otro lado, respecto a la cepa resistente a LZD, ésta no poseia el gen cfr, por lo que se amplificó el

gen codificante del rRNA 23S y se secuenció en busca de posibles mutaciones que explicaran dicha

resistencia.

Al no encontrarse la mutación inusual G2603T (G2576T según la numeración de E. coli) que se suele

asociar con la resistencia a LZD, se estudiaron las 18 mutaciones encontradas en nuestra cepa en

dicho gen, a través de un análisis exhaustivo de la bibliografia y de la base de genes, resultando

únicamente una de ellas, ligada a la resistencia a LDZ:

Mutación T2598C

(T2571C según la numeración de Escherichia coli)

Dicha mutación se ha encontrado en S. aureus, aunque siempre acompañada por la mutación G2576T

(según E. coli) (Locke et al., 2010). En enterococos, solo hay constancia de cepas de E. faecalis y E.

faecium que presenten la mutación G2576T proporcionando su resistencia LZD (Ntokou et al., 2012)

y, no hay casos publicados en los que se haya dado una resistencia a LZD sin formar pareja con la

mutación G2576T, ni en los que se haya dado en la especie E. hirae. En un futuro se deberían llevar a

cabo estudios de mutagénesis dirigida para determinar en cepas de E. hirae isogéncias que presenten

solo esta mutación de diferencia para determinar si esta única mutación es capaz de provocar la

resistencia al linezolid y explicar por tanto de manera irrefutable el fenotipo de resistencia detectado

en nuestra cepa. El aislamiento de esta cepa resistente es de gran relevancia ya que el linezolid es un

antibiótico que se utiliza para el tratamiento de infecciones graves por Enterococcus o Staphylococcus,

cuando las cepas presentan resistencia a otros antibióticos que puedan ser de primera elección. La

emergencia de estas cepas resistentes en ámbitos extrahospitalarios debe ser monitorizada y evaluada

para determinar los puntos críticos y factores de selección y las medidas de control.

CONCLUSIONES

46

6. CONCLUSIONES

1.- La especie E. hirae es la más abundante en la colección de enterococos fecales aislados de vacas de

explotación extensiva, seguido de las especies E. casselifavus y E. faecium.

2.- Se detectan moderados niveles de resistencia a antibióticos en la colección de enterococos, que

afectan al linezolid (1 cepa), kanamicina (3 cepas), y trimetoprim-sulfametoxazol (8 cepas).

3.- Siete cepas presentan sensibilidad disminuida a la vancomicina (categoría intermedia), siendo 6 de

ellas E. casseliflavus (portadores del gen especie-específico vanC2) y una E. hirae

4.- La cepa de E. hirae con sensibilidad disminuida a vancomicina podría presentar un nuevo

mecanismo adquirido de resistencia a vancomicina.

5.- Se detecta el gen dfrK en dos cepas de E. hirae resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol, siendo

este gen inusual en esta especie bacteriana.

6.- La cepa de E. hirae resistente a linezolid, que carece del gen cfr, presenta 18 mutaciones en el gen

codificante del rRNA 23S, pudiendo estar una de ellas relacionada con la resistencia a este antibiótico

(T2598C); dicha mutación no ha sido detectada previamente en enterococos.

BIBLIOGRAFÍA

47

BIBLIOGRAFÍA

Arias, C.A., Robredo, B., Singh, K.V., Torres, C., Panesso, D. & Murray, B.E. Rapid identification of Enterococcus hirae and Enterococcus durans by PCR and detection of a homologue of the E. hirae mur-2 Gene in E. durans. J. Clin. Microbiol. 2006; 44:1567-1570.

Bartholomew, J.W. & Mittwer, T. The gram stain. Bacteriol. Rev. 1952; 16:1–29. Bentorcha, F., De Cespédès, G. & Horaud, T.. Tetracycline resistance heterogeneity in Enterococcus

faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 1991; 35:808-812. Cattoir, V., Huynh, T.M., Bourdon, N., Auzou, M. & Leclercq R. Trimethoprim resistance genes in

vancomycin-resistant Enterococcus faecium clinical isolates from France. Int. J. Antimicrob. Agents 2009 ; 34:390-392.

Cercenado, E., Marín, M., Insa, R. & Bouza, E. Emerging linezolid resistance: dissemination of the cfr gene among Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis and inability of the Etest method for detection. 50th Interscience Conference on Antimicrob.Agents Chemother. 2010; ASM, Abstract C2-1490.

Cetinkaya, Y., Falk, P. & Mayhall, C.G. Vancomycin-resistant enterococci. Clin. Microbiol. Rev. 2000; 13:686-707

Coudron, P.E., Markowitz, S.M. & Wong, E.S. Isolation of a beta-lactamase producing strain of Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 1992; 36:1125-1126.

Chantziaras, I., Boyen, F., Callens, B. & Dewulf, J. Correlation between veterinary antimicrobial use and antimicrobial resistance in food-producing animals: a report on seven countries. J. Antimicrob. Chemother. 2014; 69:827-834.

Charpentier, E. & Courvalin, P. Emergence of the trimethoprim resistance gene dfrD in Listeria monocytogenes BM4293. Antimicrob. Agents Chemother. 1997; 41:1134-1136.

Chow, J.W. Aminoglycoside resistance in enterococci. Clin. Infect. Dis. 2000; 31:586-589. Chow, J.W. & Kak, V.. Acquired antibiotic resistances in enterococci. 2002 Ed. ASM Press; The

enterococci: pathogenesis, molecular biology and antibiotic resistance. Chu, C.P., Kariyama, R., Daneo-Moore, L. & Shockman, G.D. Cloning and sequence analysis of the

muramidase-2 gene from Enterococcus hirae. J. Bacteriol. 1999; 174:1619-1625. Collin M.D., Jones, D., Farrow, J.A.E., Klipper-Bälz, R. & Schleifer K.H. Enterococcus avium nom.

Rev., comb. nov., E. gallinarum comb. nov., and E. malodoratus sp. Nov. Int. J. Os. Syst. Bacteriol. 1984; 34:220-223.

Costa, Y., Galimand, M., Leclercq, R., Duval, J. & Courvalin, P. Characterization of the chromosomal aac(6')-Ii gene specific for Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 1993; 37:1896-1903.

Courvalin P. Vancomycin resistance in gram-positive cocci. Clin. Infect. Dis. 2006; 42:25-34. Dahl, K.H., Simonsen, G.S., Olsvik, O. & Sundsfjord, A. Heterogeneity in the vanB gene cluster of

genomically diverse clinical strains of vancomycin-resistant enterococci. Antimicrob. Agents Chemother. 1999; 43:1105-1110.

Dahl, K.H., Røkenes, T.P., Lundblad, E.W. & Sundsfjord, A. Nonconjugative transposition of the vanB containing Tn5382-like element in Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 2003; 47:786-789.

Dale, G.E., Langen, H., Page, M.G., Then, R.L. & Stüber, D. Cloning and characterization of a novel, plasmid-encoded trimethoprim-resistant dihydrofolate reductase from Staphylococcus haemolyticus MUR313. Antimicrob. Agents Chemother. 1995; 39:1920-1924.

Deibel R.H. & Siliker, J.H. Food poisoning potential of the enterococci. J. Bacteriol. 1963; 85: 827-832. Del Campo, R., Galán, J.C., Tenorio, C., Ruiz-Garbajosa, P., Zarazaga, M., Torres, C. & Baquero,

F. New aac(6')-I genes in Enterococcus hirae and Enterococcus durans: effect on {beta}-lactam/aminoglycoside synergy. J. Antimicrob. Chemother. 2005; 55:1053-1055.

BIBLIOGRAFÍA

48

Devriese, L.A., Van de Kerckhove, A., Kilpper-Bälz, R. & Scheleifer, K.H. Characterization and identification of Enterococcus species isolated from the intestines of animals. Int. J. Syst. Bacteriol. 1987; 37:257-259.

Devriese, L.A., Laurier, L., De Herdt, P. & Haesebrouck, F. Enterococcal and streptococcal species isolated from faeces of calves, young cattle and dairy cows. J. Appl. Bacteriol. 1992; 72:29-31.

Dibo, I., Pillai, S.K., Gold, H.S., Baer, M.R., Wetzler, M., Slack, J.L., Hazamy, P.A., Ball, D., Hsiao, C.B., McCarthy, P.L. Jr & Segal, B.H. Linezolid-resistant Enterococcus faecalis isolated from a cord blood transplant recipient. J. clin. microbial. 2004; 42:1843-1845.

Dutka-Malen, S., Evers, S. & Courvalin, P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. J. Clin. Microbiol. 1995; 33:24-27.

Essential Biochemistry, Bacterial drug resistance, chapter 20; www.wiley.com Fontana, R., Bertolini G., Amalfitano, G. & Canepari, P. Characterization of penicillinresistant

Streptococcus faecium mutants. FEMS Microbiol. Lett. 1984; 25:21-25 Franz, C.M., van Belkum, M.J., Holzapfel, W.H., Abriouel, H. & Gálvez, A. Diversity of enterococcal

bacteriocins and their grouping in a new classification scheme. FEMS Microbiol. Rev. 2007; 31:293-310. Frosolono, M., Hodel-Christian, S.L., Murray, B.E. Lack of homology of enterococci which have

high-level resistance to trimethoprim with the dfrA gene of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 1991; 35:1928-1930.

Gavaldà, J., Torres, C., Tenorio, C., López, P., Zaragoza, M., Capdevila, J.A., Almirante, B., Ruiz, F., Borrell, N., Gomis, X., Pigrau, C., Baquero, F. & Pahissa, A. Efficacy of ampicillin plus ceftriaxone in treatment of experimental endocarditis due to Enterococcus faecalis strains highly resistant to aminoglycosides. Antimicrob. Agents Chemother. 1999; 43:639-646.

Hammerum, A.M., Lester, C.H. & Heuer O.E. Antimicrobial-resistant enterococci in animals and meat:a human health hazard? Foodborne Pathog. Dis. 2010;7:1137-1146.

Houvinen, P. Resistance to trimethoprim-sulfamethoxazole. Clin. Infect. Dis. 2001; 32:1608-1614 Jensen, L.B., Ahrens, P., Dons, L., Jones, R.N., Hammerum, A.M. & Aarestrup, F.M. Molecular

analysis of Tn1546 in Enterococcus faecium isolated from animals and humans. J. Clin. Microbiol. 1998; 36:437- 442.

Kadlec, K. & Schwarz, S. Identification of a novel ABC transporter gene, vga(C), located on a multiresistance plasmid from a porcine methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 strain. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53:3589–3591.

Kadlec, K. & Schwarz, S. Identification of the novel dfrK-carrying transposon Tn559 in a porcine methicillin-susceptible Staphylococcus aureus ST398 strain. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54:3475-3477.

Kaledin, A.S., Sliusarenko, A.G., Gorodetskiĭ, S.I. Isolation and properties of DNA polymerase from extreme thermophylic bacteria Thermus aquaticus YT-1. Biokhimiia, 1980; 45:644-651.

Klare, I., Konstabel, C., Mueller-Bertling, S., Werner, G., Strommenger, B., Kettlitz, C., Borgmann, S., Schulte, B., Jonas, D., Serr, A., Fahr, A.M., Eigner, U. & Witte W. Spread of ampicillin/vancomycin-resistant Enterococcus faecium of the epidemic-virulent clonal complex-17 carrying the genes esp and hyl in German hospitals. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2005; 24:815-825.

Klibi, N., Sáenz, .Y, Zarazaga, M., Ben Slama, K., Masmoudi, A., Ruiz-Larrea, F., Boudabous, A. & Torres, C. Polymorphism in pbp5 gene detected in clinical Enterococcus faecium strains with different ampicillin MICs from a Tunisian hospital. J. Chemother. 2008; 20:436-440.

Locke, J.B., Finn, J., Hilgers, M., Morales, G., Rahawi, S., Kedar, G. C., Picazo, J.J., Im, W., Shaw, K.J. & Stein, J.L. Structure-Activity Relationships of Diverse Oxazolidinones for Linezolid-Resistant Staphylococcus aureus Strains Possessing the cfr Methyltransferase Gene or Ribosomal Mutations. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54: 5337-5343.

BIBLIOGRAFÍA

49

López, M., Sáenz, Y., Rojo-Bezares, B., Martínez, S., del Campo, R., Ruiz-Larrea, F., Zarazaga, M. & Torres, C. Detection of vanA and vanB2-containing enterococci from food samples in Spain, including Enterococcus faecium strains of CC17 and the new singleton ST425. Int. J. Food Microbiol. 2009; 133:172-178.

López, M., Sáenz, Y., Alvarez-Martínez, M.J., Marco, F., Robredo, B., Rojo-Bezares, B., Ruiz-Larrea, F., Zarazaga, M. & Torres, C. Tn1546 structures and multilocus sequence typing of vanA-containing enterococci of animal, human and food origin. J. Antimicrob. Chemother. 2010; 65:1570-1575.

López, M. Prevalencia, caracterización genética y estructura poblacional de Enterococcus resistentes a vancomicina de diversos orígenes. Tesis Doctoral. Universidad de La Rioja. 2011.

López, M., Tenorio, C., del Campo, R., Zarazaga, M. & Torres, C. Characterization of the mechanisms of fluoroquinolone resistance in vancomycin-resistant enterococci of differents origins. J. Chemother. 2011; 23:87-91.

López, M., Cercenado, E., Tenorio, C., Ruiz-Larrea, F. & Torres, C. Diversity of clones and genotypes among vancomycin-resistant clinical Enterococcus isolates recovered in a Spanish hospital. Microb. Drug Resist. 2012a; 18:484-491.

López, M., Rezusta, A., Seral, C., Aspiroz, C., Marne, C., Aldea, M.J., Ferrer, I., Revillo, M.J., Castillo, F.J. & Torres, C. Detection and characterization of a ST6 clone of vanB2-Enterococcus faecalis from three different hospitals in Spain. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2012b; 31:257-260.

López, M., Kadlec, K., Schwarz, S. & Torres, C. First detection of the staphylococcal trimethoprim resistance gene dfrK and the dfrK-carrying transposon Tn559 in enterococci. Microb. Drug Resist. 2012c; 18:13-18.

Lozano, C., González-Barrio, D., García, J.T., Ceballos, S., Olea, P.P., Ruiz-Fons, F. & Torres, C. Detection of vancomycin-resistant Enterococcus faecalis ST6-vanB2 and E. faecium ST915-vanA in faecal samples of wild Rattus rattus in Spain. Vet. Microbiol. 2015a; 177:168-174.

Lozano, C., Gonzalez-Barrio, D., Camacho, M.C., Lima-Barbero, J.F., de la Puente, J., Höfle, U. & Torres, C. Characterization of fecal vancomycin-resistant enterococci with acquired and intrinsic resistance mechanisms in wild animals, Spain. Microb. Ecol. 2015b (en prensa).

Martínez, J.L. The role of natural environments in the evolution of resistance traits in phatogenic bacteria. Proc. R. Soc. B. 2009; 276: 2521-2530

Miele, A., Bandera, M. & Goldstein B. P. Use of primers selective for vancomycin resistance genes to determine van genotype in enterococci and to study gene organization in VanA isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 1995; 39:1772-1778.

Meka, V.G. & Gold, H.S.. Antimicrobial resistance to linezolid. Clin. Infect. Dis. 2004; 39:1010-5. Mullis, K.B & Faloona, F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain

reaction. Methods Enzymol. 1987; 155: 335–350. Mulvey, M.R. & Simor, A.E. Antimicrobial resistance in hospitals: How concerned should we be?

CMAJ, 2009; 180:408-415. Murray, B.E. The life and time of the Enterococcus. Clin. Microbiol. Rev. 1990; 3:46-65 Murray, B.E. Vancomycin-resistant enterococci. Am. J. Med. 1997; 102:284-293. Ntokou, E., Stathopoulos, C., Kristo, I., Dimitroulia, E., Labrou, M., Vasdeki, A., Makris, D.,

Zakynthinos, E., Tsakris, A. & Pournaras, S. Intensive care unit dissemination of multiple clones of linezolid-resistant Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. J. Antimicrob. Chemother. 2012; 67:1819-1823.

Portillo, A., Ruiz-Larrea, F., Zarazaga, M., Alonso, A., Martinez, J.L. & Torres, C. Macrolide resistance genes in Enterococcus spp. Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44:967-971.

Radhouani, H., Poeta, P., Pinto, L., Miranda, J., Coelho, C., Carvalho, C., Rodrigues, J., López, M., Torres, C., Vitorino, R., Domingues, P. & Igrejas G. Proteomic characterization of vanA-containing

BIBLIOGRAFÍA

50

Enterococcus recovered from Seagulls at the Berlengas Natural Reserve, W Portugal. Proteome Sci. 2010; 8:48.

Radhouani, H., Silva, N., Poeta, P., Torres, C., Correia, S. & Igrejas, G. Potential impact of antimicrobial resistance in wildlife, environment and human health. Front. Microbiol.2014; 5:23

Robredo, B. Influencia del uso de antibióticos como promotores del crecimiento de animales en la selección de resistencias en Enterococcus. Tesis Doctoral. Universidad de La Rioja. 1999.

Robredo, B., Singh, K. V., Baquero, F., Murray, B. E. & Torres, C. From vanA Enterococcus hirae to vanA Enterococcus faecium: a study of feed supplementation with avoparcin and tylosin in young chickens. Antimicrob. Agents Chemother. 1999; 43:1137-1143.

Robredo, B., Singh, K.V., Baquero, F., Murray, B.E. & Torres, C. Vancomycin-resistant enterococci isolated from animals and food. Int. J. Food Microbiol. 2000 ; 54:197-204.

Rouch D.A., Messerotti, L.J., Loo, L.S., Jackson, C.A. & Skurray, R.A. Trimethoprim resistance transposon Tn4003 from Staphylococcus aureus encodes genes for a dihydrofolate reductase and thymidylate synthetase flanked by three copies of IS257. Mol. Microbiol. 1989; 3:161-175.

Tenover, F.C. Mechanisms of Antimicrobial Resistance in Bacteria. Am. J. Med. 2006; 119:7 Torres, C., Tenorio, C., Portillo, A., García, M., Martínez, C., Del Campo, R., Ruiz-Larrea, F. &

Zarazaga, M. Intestinal colonization by vanA- or vanB2-containing enterococcal isolates of healthy animals in Spain. Microb. Drug Resist. 2003; 9:47-52.

Torres, C., Escobar, S., Portillo, A., Torres, L., Rezusta, A., Ruiz-Larrea, F., Revillo, M.J., Aspiroz, C. & Zarazaga, M. Detection of clonally-related vanB2-containing Enterococcus faecium strains in two Spanish Hospitals. Journal of Medical Microbiology. 2006. 55:1237-1243.

Torres, C. & Cercenado, E. Lectura interpretada del antibiograma de cocos grampositivos. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2010; 28:541-53.

Van de Klundert, J.A.M. & Vliegenthart, J.S. PCR detection of genes coding for aminoglycoside-modifying enzymes, 1993. In Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and applications. Ed. Persing, Smith D.H., T.F., Tenover F.C., Wite T.J. ASM Press.

Walsh, C., Antibiotics. Actions, origins, resistance. 2003, Ed. ASM Press; Section III Antibiotic Resistance, 91-143.

Wisell, K.T., Kahlmeter, G., & Giske, C.G. Trimethoprim and enterococci in urinary tract infections: new perspectives on an old issue. J. Antimicrob. Chemother. 2008; 62:35-40.

Woodford, N., Morrison, D., Johnson, A.P., Briant, V., George, R. C. & Cookson, B. Application of DNA probes for rRNA and vanA genes to investigation of a nosocomial cluster of vancomycin-resistant enterococci. J. Clin. Microbiol. 1993; 31:653-658.

Zheng, B., Tomita, H., Inoue, T. & Ike, Y. Isolation of VanB-type Enterococcus faecalis strains from nosocomial infections: first report of the isolation and identification of the pheromone-responsive plasmids pMG2200, Encoding VanB-type vancomycin resistance and a Bac41-type bacteriocin, and pMG2201, encoding erythromycin resistance and cytolysin (Hly/Bac). Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53:735-747.

Zhou, Q., Moore, C., Eden, S., Tong, A. & McGeer, A. Factors associated with acquisition of vancomycin-resistant enterococci (VRE) in roomate contacts of patients colonized or infected with VRE in a tertiary care hospital. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 2008; 29:398-403.