ĐẠi hỌc huẾ trƯỜng ĐẠi hỌc khoa hỌcnuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu...

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN HỮU THUẦN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR

LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE

Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO

(Solanum hainanense Hance)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

HUẾ - 2016

Công trình được hoàn thành tại: Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa

học, Đại học Huế và Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài

nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huê (2011-2014).

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc

PGS.TS. Cao Đăng Nguyên

Phản biện 1: ............................................................................................................

............................................................................................................

Phản biện 2: ............................................................................................................

............................................................................................................

Phản biện 3: ............................................................................................................

............................................................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp

tại:

................................................................................................................................

Vào hồi ............ giờ ........ ngày ....... tháng .......... năm ..........................................

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trường đại học Khoa học, Đại học

Huế

1

MỞ ĐẦU

T n cấp t iết c a đề t i

Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam

tiêu thụ từ 30 - 50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong

y học cổ truyền làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu .

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) có tên khoa học

khác là Solanum procumben Lour. thuộc họ Cà (Solanaceae). Trong

thành phần h a học của cà gai leo, solasodine là hợp chất ch nh, c

hoạt t nh kháng vi m và ảo vệ gan, chống ại tế ào ung thư. Ngoài

ra solasodine đã được nghiên cứu cho thấy có nhiều tác dụng trong y

dược. Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai eo được khai thác chủ yếu

từ nguồn hoang dại, nguồn nguyên liệu này không đủ để đáp ứng cho

việc nghiên cứu và điều trị.

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là phương pháp có những ưu

điểm vượt trội mở ra tiềm năng ớn để tăng thu sinh khối trong thời

gian ngắn, hàm ượng hợp chất thứ cấp cao, chủ động dễ điều khiển

quy trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các

hoạt chất sinh học trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết

những kh khăn n i tr n.

Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp,

bổ sung vào môi trường nuôi cấy à phương thức để thu được các sản

phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất,

vừa có thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao.

uất phát từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh

ưởng c a một số elicitor lên khả năng t c lũy solasodine ở tế

bào in vitro c a cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance). p

dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù tạo nguồn nguyên liệu

cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự nhiên

2

cho các nghiên cứu trong ĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ

àm cơ sở cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh

khối tế ào để ứng dụng trong ĩnh vực dược phẩm sau này.

M c tiêu c a đề t i

Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi

cấy in vitro tế bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).

ng a oa ọc v t c tiễn

: Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung

cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về khả năng t ch ũy

solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung các

elicitor. Đồng thời luận án cũng à tài iệu tham khảo hữu ích cho

nghiên cứu và giảng dạy về ĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học

bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật.

: Đề tài à hướng nghiên cứu có tiềm năng

ứng dụng trong ĩnh vực sản xuất hoạt chất sinh học dùng àm dược

liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào việc bảo vệ và chăm

sóc sức khỏe cộng đồng.

N ng đ ng g p i c a lu n n

Đây à công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ảnh

hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine

trong nuôi cấy tế bào cà gai leo. Kết quả của luận án à đáng tin cậy

và có thể sử dụng để tiếp tục nghiên cứu phát triển sản xuất

solasodine ở quy mô lớn hơn.

P ạ vi ng iên cứu

Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro

tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguy n, Môi trường

và Công nghệ sinh học, Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng

11 năm 2014.

3

C ương 1.

T NG QUAN T I LIỆU

1.1. SẢN UẤT C C H P CHẤT THỨ CẤP TỪ NU I CẤY

TẾ O THỰC VẬT

Nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các

hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương iệu và màu nhuộm mà

không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp

bằng phương pháp h a học. Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào

thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết

một tỷ lệ lớn ượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy.

Các sản phẩm trao đổi thứ cấp thường chiếm một ượng nhỏ

(nhỏ hơn 1% trọng ượng khô) và độc lập cao trong thời kỳ sinh lý và

phát triển của thực vật. Mặc dù hợp chất thứ cấp dường như không

được thừa nhận vai trò trong việc duy trì quá trình sống cơ ản của

thực vật - nơi mà chúng được tổng hợp, chúng có vai trò quan trọng

trong sự tương tác giữa thực vật với môi trường.

1. . ỨNG D NG CHẤT KÍCH KH NG ĐỂ CẢI THIỆN KHẢ

NĂNG TÍCH LŨY H P CHẤT THỨ CẤP TRONG NU I CẤY

TẾ O THỰC VẬT

Elicitor thực vật có thể được định nghĩa như à một chất cơ

bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì

khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Sự

cảm ứng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng

hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm ượng của

elicitor. Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các

chất được tiết ra từ thực vật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor

4

nội sinh). Tr n cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor có thể được phân

thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học.

Tại Việt Nam, việc sử dụng elicitor trong các nghiên cứu cải

thiện khả năng t ch ũy các hợp chất thứ cấp khi nuôi cấy tế bào mới

được quan tâm trong thời gian gần đây. Trên thế giới cho đến nay đã

có rất nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của elicitor lên sự

sinh trưởng và khả năng t ch ũy hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào

thực vật. Hầu hết các nghiên cứu cho thấy hàm ượng hợp chất thứ

cấp tăng n khi ổ sung elicitor.

1. . C Y C GAI LEO

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà

(Solanaceae), còn có tên khoa học khác là Solanum procumbens, mọc

rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đường, ở độ cao dưới 300

m. Cà gai leo là một cây thuốc quý, rễ được dân gian dùng làm thuốc

chữa thấp khớp, ho, dị ứng, đau nhức xương, đau răng, trị rắn cắn,

đau ưng, cảm cúm… Gần đây, nhiều tác dụng khác của cà gai leo

được phát hiện như: kháng vi m, ức chế xơ gan giai đoạn kịch phát,

giảm nhẹ khối u.

Solasodine là một loại steroid alkaloid có trong các cây họ

Cà, nó có thể thay thế cho diosgenin để tổng hợp thương mại các loại

hormon steroid khác nhau. Solasodine đã được báo cáo là có thể

chống ung thư, ức chế độc hại nhiều loài sinh vật. Solasodine

alkaloid ức chế acetylcholinsterase - một enzyme quan trọng trong

việc truyền xung động thần kinh. Gần đây, so asodine được biết như

một tác nhân hóa trị liệu mới cho điều trị ung thư đặc biệt là ung thư

da.

5

C ương

ĐỐI TƯ NG, NỘI DUNG V PHƯ NG PH P NGHI N CỨU

.1. ĐỐI TƯ NG NGHI N CỨU

Tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) nuôi cấy in

vitro.

. . NỘI DUNG NGHI N CỨU

- ác định khả năng sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế

bào cà gai leo.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor đến khả năng

sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo:

+ Nồng độ elicitor: MeJA (25-250 µM, 1-5 g/L YE, 50-250

µM SA)

+ Thời gian nuôi cấy: 7 tuần

+ Thời điểm cảm ứng: 7-21 ngày

- Khảo sát sơ ộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine

n khả năng ức chế co agenase.

- Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế

bào in vitro của cây cà gai leo.

. . PHƯ NG PH P NGHI N CỨU

. .1. P ương p p nuôi cấy ô v tế o t c v t

2.3.1.1. Nuôi cấy cây in vitro

2.3.1.2. ấ

2.3.1.3 ấ

2.3.1.4. Xử lý cảm ứng t bào

Bổ sung methyl jasmonate (25-250 µM), dịch chiết nấm men

(1-5 g/L), và salicylic acid (50-250 µM) ở dạng riêng rẽ hoặc phối

hợp các nồng độ tối ưu của chúng vào môi trường nuôi cấy tế bào với

6

thời điểm cảm ứng từ 7 đến 21 ngày sau khi nuôi cấy.

2 3 1 4 Xá định sinh khối t bào

. . . P ương p p a sin

2.3.2.1. Chi t Soxhlet

2.3.2.2. Sắc ký lỏng hiệ ă g cao

2 3 2 3 ức ch collagenase của solasodine

. . . l số liệu

T t t sơ đồ t ng iệ

Thăm dò nồng độ elicitor

Thăm dò thời điểm ổ sung elicitor

Thu sinh khối tế ào

Định ượng

Tách chiết so asodine

Thử nghiệm hoạt t nh sinh học

Nuôi cấy tế ào

Nuôi cấy callus

Nhân callus

Cây cà gai leo in vitro

ử ý các elicitor khác nhau

7

C ương

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

.1. SINH TRƯỞNG V TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ

BÀO CÀ GAI LEO

.1.1. Sin trưởng c a tế bào

Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo

.1. . T c lũy solasodine c a tế bào

Hình 3.2. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

8

3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR L N SINH TRƯỞNG VÀ

TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ BÀO CÀ GAI LEO

3.2.1. Ản ưởng c a methyl jasmonate

3.2.1.1. Nồ độ methyl jasmonate

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của MeJA n sinh trưởng của tế bào cà gai leo

Nồng độ MeJA

(µM)

K ối lượng tế o (g) GI

Tươi Khô

25 3,89b 0,37

b 1,30

50 3,38d 0,35

bc 1,13

100 3,57c 0,34

c 1,19

150 2,96e 0,36

bc 0,99

200 2,40f 0,34

bc 0,80

250 2,29g 0,35

bc 0,76

ĐC 4,98a 0,45

a 1,66

ĐC: Tế bào không xử lý elicitor. Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ

sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các trung bình mẫu ở p < 0,05

(Duncan's test). Chú thích này dùng chung cho tất cả các bảng.

Dịch chiết tế bào 4 tuần tuổi được phân t ch HPLC để khảo

sát ảnh hưởng của nồng độ MeJA (25-250 µM) n t ch ũy

solasodine.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào

cà gai leo

Nồng độ MeJA (µM) Solasodine (mg/g)

25 127,5c

50 159,0a

100 138,0b

150 98,0e

200 38,0f

250 36,5f

ĐC1 123,5d

ĐC2 23,5g

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi

3.2.1.2. Thời gian nuôi cấy

9

Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM

MeJA

Hình 3.6. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung

50 µM MeJA

3.2.1.3. Thờ đ ểm cảm ứng

Dựa vào kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ MeJA lên

khả năng t ch ũy so asodine trong tế bào cà gai leo, 50 µM MeJA

được chọn để khảo sát thời điểm cảm ứng trong nuôi cấy tế bào.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời điểm xử ý MeJA 50 µM n sinh trưởng của

10

tế bào cà gai leo

Ngày cả ứng K ối lượng tế o (g)

GI Tươi Khô

7 3,39b 0,31

b 0,88

14 3,43b 0,33

ab 0,84

21 3,71a 0,34

a 0,99

ĐC 3,38b 0,35

a 1,13

ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng t ch

ũy so asodine của tế bào cà gai leo

T ời điể (ng y) H lượng ( g g)

7 108,5b

14 79,5c

21 74,5d

ĐC 159,0a

ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy

3.2.2. Ản ưởng c a dịch chiết nấm men

3.2.2.1. Nồ độ dịch chi t nấm men

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo

Nồng độ YE

(g/L)


Tươi Khô

1 9,30a 0,54

a 3,10

2 9,20b 0,53

a 3,07

3 8,80c 0,48

b 2,93

4 8,08d 0,43

c 2,69

5 7,94e 0,41

c 2,65

ĐC 4,98f 0,45

bc 1,66

ĐC: Tế bào không xử lý elicitor

11

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà

gai leo

Nồng độ YE (g L) H lượng ( g g)

1 125,5d

2 165,0c

3 220,5a

4 198,0b

5 112,0e

ĐC1 123,5d

ĐC2 23,5f

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor. ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm

tuổi


Từ kết quả thăm dò nồng độ, 3 g/L YE được chọn để bổ sung

vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy và khảo sát thời điểm t ch ũy

solasodine cao nhất của tế bào cà gai leo trong suốt 7 tuần.

Lượng sinh khối tế bào cũng như hàm ượng solasodine đều

tăng dần từ tuần thứ 1 và đạt cực đại vào tuần thứ 4.

Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L YE

12


3g/L YE

3.2.2.3. Thời đ ểm cảm ứng

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng sinh

trưởng của tế bào cà gai leo

T ời điể

(ng y)


Tươi Khô

7 8,79a 0,45

a 2,93

14 8,41a 0,36

b 2,80

21 5,66b 0,35

b 1,89

ĐC 8,80a 0,48

a 2,93

ĐC: 3 g/L YE được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng

t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

T ời điể (ng y) H lượng ( g g)

7 110,5b

14 96,0c

21 92,0d

ĐC 220,5a

ĐC: 3 g/L YE được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

13

3.2.3. Ản ưởng c a salicylic acid

3.2.3.1. Nồ độ salicylic acid

SA ở các nồng độ từ 50-250 µM được bổ sung vào môi

trường lúc bắt đầu nuôi cấy để khảo sát khả năng sinh trưởng của tế

bào cà gai leo sau 4 tuần.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của SA n sinh trưởng của tế bào cà gai leo

Nồng độ SA

(µM)


Tươi Khô

50 12,03a 0,81

a 4,01

100 8,05b 0,68

ab 2,68

150 7,61bc

0,64ab 2,54

200 5,99bc

0,53bc

2,00

250 5,21c 0,51

c 1,74

ĐC 4,98c 0,45

c 1,66

ĐC: Tế bào không xử lý elicitor

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của SA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào

cà gai leo

Nồng độ SA (µM/L) H lượng (mg/g)

50 133,5d

100 186,5b

150 245,0a

200 162,0c

250 51,0f

ĐC1 123,5e

ĐC2 23,5g

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi

Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp

solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn cả MeJA và YE. Ở môi

trường có bổ sung 150 µM SA, ượng solasodine trong tế ào đạt cao

nhất (245 mg/g khối ượng khô), cao hơn khi xử ý 50 μM MeJA

khoảng 1,5 lần và 3 g/L YE khoảng 1,1 lần.


14

Hình 3.11. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA

150 µM.


150 µM SA.


Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA n sinh trưởng

của tế bào cà gai leo

T ời điể

(ng y)


Tươi Khô

7 8,12c 0,68

b 2,71

14 8,90b 0,69

b 2,97

21 9,13a 0,74

a 3,04

ĐC 7,61d 0,68

b 2,54

ĐC: SA 150 μM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

15

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA lên khả năng t ch


T ời điể (ngày) H lượng (mg/g)

7 117,0b

14 101,5c

21 82,5d

ĐC 245,0a

ĐC: SA 150 μM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

3.2.4. Ản ưởng kết hợp c a các elcitor

3.2.4.1. Nồ độ các elicitor

3.2.4.1.1. Kết hợp hai elicitor

Chúng tôi chọn nồng độ thích hợp nhất của chất này kết hợp

với các nồng độ khác nhau của chất kia để tìm hiểu ảnh hưởng phối

hợp chúng n sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai

leo. Cụ thể như sau: 50 µM MeJA kết hợp với YE (1-5 g/L) hoặc SA

(50-250 µM); 3 g/L YE kết hợp với MeJA (25-250 µM) hoặc SA

(50-250 µM); 150 µM SA kết hợp với MeJA (25-250 µM) hoặc YE

(1-5 g/L). Các elicitor được bổ sung vào môi trường vào lúc bắt đầu

nuôi cấy.

Bảng 3.13. Ảnh hưởng kết hợp của từng cặp elicitor n sinh trưởng và tích


Elicitor K ối lượng tế o (g)

GI Solasodine

(mg/g) SA

(µM)

MeJA

(µM)

YE

(g/L) Tươi Khô

- 50 2 4,56f 0,43

e 1,52 186,0

b

50 50 - 5,17d 0,42

f 1,72 165,5

e

150 25 - 5,37c 0,49

b 1,79 173,0

c

150 - 3 7,74a 0,47

c 2,58 197,5

a

- 25 3 5,91b 0,55

a 1,97 170,5

d

ĐC 4,98e 0,45

d 1,66 123,5

f

16

3.2.4.1.2. Kết hợp ba elicitor

Bảng 3.14. Ảnh hưởng kết hợp của 3 elicitor n sinh trưởng và t ch ũy

solasodine của tế bào cà gai leo

Nồng độ elicitor K ối lượng tế o (g)

GI Solasodine

(mg/g) SA

(µM)

MeJA

(µM)

YE

(g/L) Tươi Khô

150 50 5 4,82b 0,31

c 1,61 153,0

c

150 150 3 4,24c 0,32

c 1,41 160,0

b

100 50 3 4,05d 0,39

b 1,35 180,5

a

ĐC 4,98a 0,45

a 1,66 123,5

b


Nồng độ xử lý kết hợp của 2 chất SA 150 µM và YE 3 g/L

cho hàm ượng solasodine cao nhất đã được sử dụng để nghiên cứu.

Hình 3.15. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA

150 µM và YE 3 g/L


150 µM SA và 3 g/L YE

17


Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến

khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo

T ời điể

(ngày)


Tươi Khô

7 6,62b 0,45

ab 2,21

14 5,35cd

0,39b 1,78

21 5,13d 0,32

c 1,71

ĐC 7,74a 0,47

a 2,58

ĐC: SA 150 μM và YE 3 g/L được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi

cấy.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến

khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

T ời điể (ng y) Solasodine (mg/g)

7 11,8b

14 51,0c

21 46,0d

ĐC 197,5a

ĐC: SA 150 μM và YE 3 g/L được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi

cấy

3.3. Khảo s t sơ ộ hoạt tính c a solasodine từ dịch chiết tế bào

cà gai leo

Bảng 3.17. Hoạt tính của dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo trên

collagenase

Thí nghiệm

Chiều dài cột

gel an đầu

(mm)

Chiều dài cột

gel sau 24 giờ

(mm)

Chiều cao cột

gel bị tiêu

(mm)

Dịch chiết

solasodine 119 ± 2,1 104,0 ± 1,5 15,0 ± 0,6

ĐC 118 ± 1,8 50,3 ± 1,2 67,7 ± 1,6

ĐC: dung dịch collagenase 0,1 mg/mL.

18

3.4. Quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro

cây cà gai leo

Hình 3.20. Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao

từ tế bào in vitro của cây cà gai leo ở quy mô phòng thí nghiệm

Cây cà gai leo tự nhiên

1. Kh trùng:

- Ethanol 70% trong 1 phút

- HgCl2 0,1% trong 8 phút

- Rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng 2. Tạo cây in vitro từ đoạn thân có mắt lá trong

môi trường S0

Cây cà gai leo in vitro

Tạo callus

3. Tạo callus từ đoạn thân, đoạn rễ và cuống

lá của cây in vitro trên môi trường S1

Nhân callus

4. Nhân callus trong môi trường S2

Nuôi tế bào huyền phù

5. Nuôi 3 g callus trong 50 mL môi trường

S2 (không agar) tốc độ lắc 120 vòng/phút

6. Nuôi 20 mL dịch tế bào trong 50 mL môi

trường S3 tốc độ lắc 150 vòng/phút

Tăng sinh so asodine

7. Bổ sung 150 µM salicylic acid vào môi

trường S3 lúc bắt đầu nuôi cấy tế bào, tốc độ

lắc 150 vòng/phút, 4 tuần.

Dịch chiết solasodine

8. Tách chiết solasodine từ tế bào theo

p ương p p Sox let.

9. Địn lượng dịch chiết solasodine bằng sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

10. c định hoạt tính trên cột collagen gel.

19

C ương 4

BÀN LUẬN

4.1. ẢNH HƯỞNG CỦA METHYL JASMONATE

4.1.1. Ản ưởng c a nồng độ methyl jasmonate

Thông thường, khi bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy

đều ức chế khả năng sinh trưởng của tế bào, kết quả này được công

bố trên nhiều công trình nghiên cứu trước đây. Trong nghi n cứu của

chúng tôi, trong môi trường c MeJA sinh trưởng của tế bào cà gai

eo kém hơn so với đối chứng không bổ sung elicitor, nồng độ

elicitor càng cao thì sự sinh trưởng của tế bào càng giảm. Kết quả

này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về sự ức chế của elicitor

n sinh trưởng của tế bào thực vật.

Nồng độ elicitor đ ng vai trò rất quan trọng trong quá trình

cảm ứng, sự t ch ũy các hợp chất thứ cấp sẽ đạt cao nhất ở nồng độ

elicitor thích hợp. Nồng độ chất k ch kháng cao gây ra hiện tượng

đáp ứng quá ngư ng, dẫn đến chết tế bào. Trong nghiên cứu của

chúng tôi, sự t ch ũy so asodine đạt cao nhất khi được xử lý MeJA ở

nồng độ 50 µM (159 mg/g, gấp 1,3 lần tế ào đối chứng không bổ

sung MeJA).

4.1.2. Ản ưởng c a thời gian x lý methyl jasmonate

Thời điểm xử lý elicitor cũng à một yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến khả năng sinh trưởng và t ch ũy các sản phẩm thứ cấp của

tế bào thực vật. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sinh

trưởng và tích lũy solasodine của tế bào ở các thời gian xử lý elicitor

khác nhau đều giảm so với xử lý ở thời điểm an đầu của quá trình

nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự như kết quả

nghiên cứu của Chong và cs (2005) về ảnh hưởng của các elicitor

20

khác nhau và thời điểm bổ sung elicitor vào mẫu nuôi cấy tế bào

Morinda elliptica.

4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM MEN

4.2.1. Ản ưởng c a nồng độ dịch chiết nấm men

Không giống như khi xử lý bằng MeJA, khi bổ sung YE vào

môi trường nuôi cấy, sinh khối tươi và khô thu được đều cao hơn so

với đối chứng không bổ sung elicitor. Có nghiên cứu cho rằng, khi bổ

sung vào môi trường nuôi cấy, YE có vai trò hoạt động như một

nguồn nitrogen và dưới áp lực dinh dư ng này có thể cũng đ ng một

vai trò quan trọng trong sinh trưởng và kích thích tế bào thực vật tăng

cường sản xuất hợp chất thứ cấp. Từ kết quả nghiên cứu của chúng

tôi cho thấy, cả sinh khối và hàm ượng solasodine của tế bào cà gai

eo đều tăng ở nồng độ thích hợp (2-4 g/L). Kết quả nghiên cứu của

chúng tôi tương tự như kết quả nghiên cứu của Jain và cs (2015) trên

một đối tượng khác của họ cà là S. melongena.

4.2.2. Ản ưởng c a thời gian x lý dịch chiết nấm men

Đối với cây cà gai leo, thời gian xử lý elicitor càng dài càng

kích thích sinh khối tế bào phát triển. Khi bổ sung YE vào thời điểm

bắt đầu nuôi cấy cũng như sau 7 ngày tế bào có khả năng sinh trưởng

tương đương nhau, ở thời điểm cảm ứng là 14 ngày chỉ số sinh

trưởng tế bào bắt đầu giảm và mạnh nhất là ở 21 ngày. Kết quả

nghiên cứu của Jain và cs (2015) trên cây S. melongena cũng cho

thấy thời gian cảm ứng 28 ngày là tốt nhất cho phát triển sinh khối

cũng như hàm ượng so asodine như trong nghi n cứu của chúng tôi.

Phân tích hàm ượng so asodine t ch ũy trong tế bào cây cà

gai leo cho thấy thời điểm cảm ứng tốt nhất vẫn là lúc bắt đầu nuôi

cấy giống như đối với MeJA (so asodine đạt 220,5 mg/g khối ượng

khô).

21

4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA SALICYLIC ACID

4.3.1. Ản ưởng c a nồng độ salicylic acid

Trong nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ 50 và 100 µM SA

đã c ảnh hưởng kích thích rõ rệt lên sinh khối tế bào so với đối

chứng, tương tự như YE và ngược với MeJA. Hiện nay, không c

nhiều công trình nghi n cứu ghi nhận hiện tượng này ngoại trừ ở họ

cà. Trên họ cà, nghiên cứu của Jain và cs (2015) cho thấy khi xử lý

50 µM SA trên nuôi cấy rễ tơ cây S. melongena sinh khối thu được

cao hơn đối chứng khoảng 1,5 lần sau 28 ngày (5,16 g so với 3,39 g),

trong khi đ hàm ượng so asodine cao hơn đối chứng khoảng 13,5

lần (89,03 µg/g khô so với 6,5 µg/g khô).

Kết quả phân tích hàm ượng solasodine trong tế bào cà gai

leo cho thấy sự t ch ũy tăng dần khi bổ sung SA từ 50-150 μM, sau

đ giảm mạnh ở 200-250 μM SA. Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên

khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn

cả MeJA và YE.

4.3.2. Ản ưởng c a thời gian x lý salicylic acid

Tương tự với khi xử lý MeJA, thời gian xử lý bằng SA càng

dài thì càng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào cây cà gai leo.

Thời gian cảm ứng ngắn (7 ngày) ít ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế

bào. Tế ào đối chứng có thời gian cảm ứng dài nhất, do đ sinh khối

chỉ được 7,61 g tươi và 0,68 g khô.

Ảnh hưởng của thời gian xử lý SA lên khả năng tổng hợp

so asodine cũng tương tự như đối với MeJA và YE, thời gian cảm

ứng càng dài khả năng t ch ũy so asodine càng cao. Kết quả khảo sát

cho thấy xử ý 150 μM SA vào thời điểm 7-21 ngày sau khi nuôi cấy

không đủ thời gian cảm ứng để tế bào có thể sản xuất một ượng

solasodine cao. Xử lý SA ngay từ lúc bắt đầu nuôi cấy vẫn cho kết

22

quả tốt nhất, cao hơn các trường hợp khác từ 2-3 lần.

4.4. ẢNH HƯỞNG PHỐI H P CÁC ELICITOR

Nhìn chung, xử lý kết hợp các elicitor ở các nồng độ khác

nhau ở nghiên cứu này đều có tác dụng tăng t ch ũy so asodine trong

tế bào cà gai leo so với đối chứng. Công thức kết hợp tốt nhất cho

ượng so asodine cao hơn khoảng 1,6 lần so với tế ào không được

xử lý và khoảng 8,4 lần so với rễ cây tự nhi n 1 năm tuổi. Tuy nhiên,

xử lý kết hợp chỉ cao hơn chỉ xử lý với 50 μM MeJA, và thấp hơn xử

lý riêng rẽ với 3 g/L YE hay 150 μM SA.

Tương tự như xử lý riêng rẽ MeJA, YE và SA, xử lý kết hợp

các elicitor cũng cho thấy thời điểm bổ sung thích hợp nhất là lúc bắt

đầu nuôi cấy, hay nói cách khác thời gian cảm ứng dài (4 tuần) có

hiệu quả nhất. Sinh trưởng của tế ào và ượng so asodine đều cao

hơn so với các thời điểm cảm ứng khác (7-21 ngày sau khi nuôi cấy)

tương ứng với thời gian cảm ứng là 21-7 ngày. So với kết quả nghiên

cứu ở tế bào của phần lớn các loài thực vật khác, tế ào cà gai eo đòi

hỏi thời gian cảm ứng dài ngày hơn.

4.5. SO SÁNH HIỆU QUẢ GIỮA CÁC ELICITOR

Trong nghiên cứu này, cả 3 elicitor đều àm tăng khả năng

sinh tổng hợp solasodine trong tế ào cây cà gai eo, trong đ SA c

vai trò cao nhất, tiếp đến là YE và cuối cùng là MeJA, ảnh hưởng của

các chất này lên sự phát triển của sinh khối cũng tương tự.

SA là elicitor phi sinh học có giá thành rẻ, dễ dùng n n được

nhiều tác giả sử dụng, nhiều công trình cũng cho thấy SA có hiệu quả

cao nhất trong kích khảng tổng hợp các HCTC ở thực vật.

23

KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Sự sinh trưởng và t ch ũy so asodine trong tế bào huyền

phù cà gai eo đạt cao nhất sau 4 tuần nuôi cấy, sinh khối tươi đạt

4,98 g/bình, sinh khối khô đạt 0,45 g/ ình và hàm ượng solasodine

đạt 123,5 mg/g khối ượng khô, cao hơn trong rễ tự nhiên khoảng 5,3

lần.

2. Ảnh hưởng của các e icitor đến khả năng t ch ũy

solasodine trong tế bào in vitro của cây cà gai leo:

2.1. Hàm ượng so asodine t ch ũy cao nhất khi tế bào cà gai

eo được xử lý 150 µM salicylic acid ở thời điểm bắt đầu nuôi cấy

(245 mg/g khối ượng khô).

2.2. Khi bổ sung các elicitor riêng lẽ hay phối hợp,

so asodine tăng dần từ tuần thứ 2-3, đạt cực đại ở tuần thứ 4 và sau

đ giảm dần từ tuần 5-7.

3. Solasodine từ tế bào huyền phù cà gai leo có khả năng kháng vi m,

thể hiện qua khả năng ức chế collagenase của chúng.

4. Đề xuất quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in

vitro tế bào của cây cà gai leo có xử lý 150 µM salicylic acid từ

nguồn cây tự nhiên.

ĐỀ NGHỊ

1. Nghiên cứu cải thiện sản xuất solasodine từ tế bào cà gai leo

trong hệ lên men bioreactor.

2. Nghiên cứu cơ chế tác động của elicitor đến con đường

chuyển hóa solasodine trong tế bào cà gai leo.

24

DANH M C C C C NG TRÌNH ĐÃ C NG Ố

1. Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Le Thi Minh

Khuyen, Ton Nu Thuy An (2014). Effects of yeast extract and methyl

jasmonate on the enhancement of solasodine biosynthesis in cell

cultures of Solasodine hainanense Hance. J. BioSci. Biotech. 2014,

3(1): 1-6.

2. Nguyễn H u Thuần Anh, Tôn Nữ Thùy An, Lê Thị Hà Thanh,

Võ Thị Viên Dung, Nguyễn Thuần Nho, Đinh Hồng Kim Cương,

Nguyễn Ngọc Hiếu, Nguyễn Thanh Giang, Nguyễn Hoàng Lộc

(2015). Nghiên cứu ảnh hưởng của methyl jasmonate và dịch chiết

nấm men n sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo

(Solasodine hainanense Hance). Tạp chí Công nghệ sinh học 13(2A):

1-7.

3. Nguyen Huu Thuan Anh, Ton Nu Thuy An, Nguyen Thuan Nho,

Vo Thi Vien Dung, Nguyen Hoang Loc (2015). Effect of salicylic

acid on the biosynthesis of solasodine in cell suspension culture of

Solanum hainanense Hance. Plant Cell Biotechnology and Molecular

Biology 17(1-2): 14-20.

HUE UNIVERSITY

UNIVERSITY OF SCIENCES

NGUYEN HUU THUAN ANH

STUDY ON EFFECT OF SOME ELICITORS ON

SOLASODINE ACCUMULATION IN IN VITRO

CELLS OF SOLANUM HAINANENSE HANCE

DOCTOR OF PHYLOSOPHY PLANT PHYSIOLOGY

HUE - 2016

This research is complete at: Biology Department, University of

Sciences, Hue University and Secondary Synthesis Compound

Laboratory, Institute of Resources, Environment and Biotechnology,

Hue University (2011-2014).

Advisor: Prof. Dr. Nguyen Hoang Loc

Assoc. Prof. Dr. Cao Dang Nguyen

Judge #1: .................................................................................................................

.............................................................................................................

Judge #2: .................................................................................................................

.............................................................................................................

Judge #3: ...............................................................................................................

.............................................................................................................

The author defends this thesis at Thesis Evaluation Council, Hue

University at:

................................................................................................................................

A copy of the thesis is available at Library of University of Science, Hue

University

1

PREFACE

Urgent need of the research

According to statistical data from Vietnam Health Care

organizations, Vietnam market consumes from 30 tons to 50 tons of

medical material for traditional medical care, for medical industry

and export.

Solanum hainanense Hance, also known as scientific name SPL, is a

member of Solanaceae family. Among chemical composition of

Solanum hainanense Hance, solasodine is the major element which

has protesting nature against inflammation, liver protection, or

resistence against cancer cells. Moreover, researches on solasodine

show that it has many other benefits in medial and pharmaceutical

fields. However, Solanum hainanense Hance has been exploited from

natural sources that is limited in volume as material for research and

medical treatment.

To overcome the shortage of Solanum hainanense Hance

above, we apply in vitro and botanical cell method. This method has

superior advantages that can offer three potentials. First , it generates

living mass in short time with high portion of secondary compounds.

Second, it offers flexibility to manage production processes to have

material for extracting biological active elements in mass production.

Adding Botanical Elicitor, the signal of generating secondary

compounds, in culture medium is the most efficient method to gain

secondary compounds having highest active elements with both

benefits of shorter time and higher yield.

From the necessity above, we conduct the research “Study on effect

of some elicitors on the solasodine biosynthesis in in vitro cell of

Solanum hainanense Hance”. We apply culturing method to

2

suspension cells to create material for solasodine extraction and

provide natural pharmaceutical material for research in medicine

field. We will apply the results of this study as the foundation for

solasodine production processes from cell mass living to future

supply in pharmaceutical fields.

Research objectives

Establish solasodine high-yield production processes from culturing

in vitro cell of Solanum hainanense Hance.

Scientific and practical benefits

Scientific benefits: The results of this research will be new valued

scientific information on the capability of solasodine accumulation in

Solanum hainanense Hance in elicitor-added medium. Besides, this

research will be useful reference for study and instruction in the area

of producing active elements by botanical cell culture.

Practical benefits: This study opens the potential application of

botanical cell culture to generate biological active elements for

medicine, contributing in health care and protect to human

community.

New contribution of the research

This is the first research in Vietnam on the influence of elicitor to

solasodine accumulation capability in the Solanum hainanense Hance

cell culture. The reliable results from this research can be further

studied and developed for mass production.

Research scope

WE conducted the experiment in this study in in vitro condition of

Secondary Compound Laboratory, Natural Resource and Medium

and Biotechnology Institute, Hue University from November 2011 to

November 2014.

3

Chapter 1

RESEARCH OVERVIEW

1.1 PRODUCTION OF SECONDARY COMPOUNDS FROM

BOTONICAL CELL CULTURE

Botanical cell culture represents the improving capability against

compounds for medicine, ingredients, spices, dye that we cannot

create these compounds from biological cells or by chemical

collection. The advantage of botanical cell cultivation techniques is

its ability to continuously supply material for mass extraction of

active elements from culturing botanical cells.

Secondary exchange products occupies small percentage (below 1%

dry weight) and high independence during physiology and

development of botany.

Even the secondary elements is not recognized as factor to

maintain basic living condition of botany where they are synthesized,

they have important roles in the interaction between botany and

medium.

1.2 USING ELICITOR TO IMPROVE SECONDARY

COMPOUND SYNTHESIS CAPABILITY IN BOTANY

CELL CULTURING

We define botanical elicitor as basic element with which we add

small concentration into living cell system, it activates or improves

secondary compound synthesis. Botanical induction is the inducing

or increasing biological synthesis of secondary transformation

elements depending on volume of adding elicitor. Elicitor includes

element from disease sources and material extracted from botany by

reacting of desease (self-generated elicitor). We can divide elicitors

4

into two groups: non-biological elicitor and biological elicitor based

on their natural substances.

In Vietnam, using elicitor for study on improving secondary

synthesis accumulation in cellular plant is just got special interest

recently. Globally, there have been a number of researches on the

effect of elicitor on growth and secondary synthesis accumulation

from cell plant. Most researches show an increase of portion of

secondary synthesis when integrating with elicitor.

1.3 SOLANUM HAINANENSE HANCE

Solanum hainanense, a member of Solanaceae family, has its

scientific name as Solanum procumbers. It lives sprately in the forest

side, bust, road-side open area whose height is below 300m. Solanum

hainanense is a precious medical herb. Its root is used to cure

rheumatism, cought, allergy, bone pain, dental issue, against

vernomous snakes, back-ache, and flu... Recently, more benefits of

Solanum hainanense are discovered suceh as inflamation resistance,

quarantee cirrhosis in exploding moment, reduce tumor.

Solasodine, a steroid alkaloid having in Solanum genus, can be

used to substitute diosgenin in synthesising different hormon steroid

for commercial purpose. Solasodine is reprorted to be able to cure

cancer, quarantee poison from animals. Solasodine alkaloid restrains

acetylcholinsterase, an important enzyme for neural touch

transmission. Recently, solasodine is also know as a new chemical

therapy method against cancer, especially skin cancer.

5

Chapter 2

OBJECT, CONTENT AND RESEARCH METHOD

2.1 RESEARCH OBJECT

Solanum hainanense Hance grown in vitro medium

2.2 RESEARCH CONTENT

- Define solasodine growth and accumulation of Solanum

hainanense

- Research on the effect of some elicitor on soladine growth and

accumulation of Solanum hainanense:

+ elicitor concentration: MeJA (25-250 µM, 1-5 g/L YE, 50-250

µM SA)

+ Duration: 7 weeks

+ Induction point: 7 weeks ~ 21 weeks

- Preliminary survey on biological activator of solasodine on

restriction collagenase

- Build the process for solsodine generation at high efficiency of in

vitro method on Solanum hainanense

2.3 RESEARCH METHODOLOGY

2.3.1. Plant Cell and Tisue culture method

2.3.1.1. In vitro plant culture

2.3.1.2. Callus culture

2.3.1.3. In vitro cell culture

2.3.1.4. Manage cellular induction

Provide methyl jasmonate (25-250 µM), yeast extract (1-5 g/L),

and salicylic acid (50-250 µM) in separation or combination of

optimal concentration into cell plant medium with indution period

from 7 to 21 days after being planted.

6

2.3.1.4. Identify living mass of cells

2.3.2. Biochemical method

2.3.2.1. Soxhlet extraction

2.3.2.2. Quantification of solasodine by High Performance Liquid

Chromatography (HPLC).

2.3.2.3. Determination of solasodine activity

2.3.3. Data processing

Summary of experiment diagrams

Probe elicitor concentration

Probe time to add elicitor

Cell culture

Callus culture

Callus stem

Solanum hainanense in vitro

Process different elicitor

Collect cellular living mass

Quantity measurement

Separate solasodine

Test biological activation

7

Chapter 3

RESEARCH RESULTS

3.1. SOLASODINE GROWTH AND ACCUMULATION OF

SOLANUM HAINANENSE

3.1.1. Cellular growth

Picture 3.1. Cell biomass production of S.hainanense cells

3.1.2. Solasodine accumulation of cells

Picture 3.2. Dymamic of solasodine accumulation of S.hainanense cells

8

3.2. EFFECT OF ELICITOR ON SOLASODINE GROWTH

AND ACCUMULATION SOLANUM HAINANENSE CELLS

3.1.2. Effect of methyl jasmonate

3.2.1.1. Methy jasmonate concentration

Table 3.1. Effect of MeJA concentration on the growth of S.hainanense

cells

MeJA

(µM)

Cell weight (g) GI

Fresh Dry

25 3,89b 0,37

b 1,30

50 3,38d 0,35

bc 1,13

100 3,57c 0,34

c 1,19

150 2,96e 0,36

bc 0,99

200 2,40f 0,34

bc 0,80

250 2,29g 0,35

bc 0,76

Control 4,98a 0,45

a 1,66

Control: Non-elicited cells. Different letter in a column indicate

significantly differences means (Duncan’s test, p<0.05). This legend is

applied for all tables.

Four-week old extracted liquid is analyzed using HPLC to

survey the effect of MeJA concentration (25-250 µM) on solasodine

accumulation.

Table 3.2. Effect of MeJA concentration on solasodine production of

S.hainanense

MeJA (µM) Solasodine (mg/g)

25 127,5c

50 159,0a

100 138,0b

150 98,0e

200 38,0f

250 36,5f

Control1

123,5d

Control2

23,5g

Control1: Non-elicited cells; Control

2: in planta 1-year-old root

9

3.2.1.2. Culture time

Table 3.5. Cell biomass production of S.hainanense cells in a batch culture

added 50 µM MeJA at the beginning of culture

Table 3.6. Dymamic of solasodine accumulation of S.hainanense cells

elicited by 50 µM MeJA

3.2.1.3. Elicitation time

Based on research results of MeJA effect on solasodine

accumulation in S.hainanense, 50 µM MeJA was selected for survey

the induction time during cell cuture.

10

Table 3.3. Effect of elicitation day of MeJA (50 µM) on the growth of

S.hainanense cells

Elicitation day Cell weight (g)

GI Fresh Dry

7 3,39b 0,31

b 0,88

14 3,43b 0,33

ab 0,84

21 3,71a 0,34

a 0,99

Control 3,38b 0,35

a 1,13

Control: Adding MeJA 50 µM to medium at the beginning of cell culture

Table 3.4. Effect of elicitation day of MeJA (50 µM) on solasodine

production of S.hainanense cells

Elicitation day Solasodine (mg/g)

7 108,5b

14 79,5c

21 74,5d

Control 159,0a

Control: Adding MeJA 50 µM to medium at the beginning of cell culture

3.2.2. Effect of yeast extract

3.2.2.1. Yeast extract concentration

Table 3.5. Effect of YE concentration on the growth of S.hainanense cells

YE

(g/L)

Cell weight (g) GI

Fresh Dry

1 9,30a 0,54

a 3,10

2 9,20b 0,53

a 3,07

3 8,80c 0,48

b 2,93

4 8,08d 0,43

c 2,69

5 7,94e 0,41

c 2,65

Control 4,98f 0,45

bc 1,66

Control: Non-elicited cells

11

Table 3.6. Effect of YE concentration on solasodine production of

S.hainanense

YE (g/L) Solasodine (mg/g)

1 125,5d

2 165,0c

3 220,5a

4 198,0b

5 112,0e

Control1

123,5d

Control2

23,5f



3.2.2.2. Couture time duration

From the survey on content, 3 g/L YE is selected to add in

medium when started cuturing and survey the moment of maximum

solasodine of ssh in seven-week time.

Both cell living mass as well as solasodine content increase

gradually from 1st week and maximized in 4

th week.


added 3 g/L YE at the beginning of culture

12


elicited by 3g/L YE


Table 3.7. Effect of elicitation day of YE (3 g/L) on the growth of

S.hainanense cells


GI Fresh Dry

7 8,79a 0,45

a 2,93

14 8,41a 0,36

b 2,80

21 5,66b 0,35

b 1,89

Control 8,80a 0,48

a 2,93

Control: 3 g/L YE add to medium at the beginning of cell culture

Table 3.8. Effect of elicitation day of YE (3 g/L) on solasodine production

of S.hainanense cells


7 110,5b

14 96,0c

21 92,0d

Control 220,5a

Control: 3 g/L YE add to medium at the beginning of cell culture

13

3.2.3. Effect of salicylic acid (SA)

3.2.3.1. Salicylic acid concentration

SA at various concentrations (50 µM ~ 250 µM) is added into

medium at the beginning of culture to study the growth capability of

S.hainanense after 4 weeks.

Table 3.9. Effect of SA concentration on the growth of S.hainanense cells

SA (µM) Cell weight (g)

GI Fresh Dry

50 12,03a 0,81

a 4,01

100 8,05b 0,68

ab 2,68

150 7,61bc

0,64ab 2,54

200 5,99bc

0,53bc

2,00

250 5,21c 0,51

c 1,74

Control 4,98c 0,45

c 1,66


Table 3.10. Effect of SA concentration on solasodine production of

S.hainanense

SA (µM/L) Content (mg/g)

50 133,5d

100 186,5b

150 245,0a

200 162,0c

250 51,0f

Control1

123,5e

Control2 23,5

g



In general, SA effects on solasodine synthesis in S.hainanense

more clearly than MeJA and YE. In the medium of adding 150 µM

SA, solasodine amount in cell is maximum (245 mg/g dry weight),

approximate 1.5 times higher than when processed with 50 μM MeJA

and approximate 1.1 times when processed with 3 g/L YE.

14

3.2.3.2. Culture duration


added 150 µM SA at the beginning of culture


elicited by 150 µM SA.


Table 3.11. Effect of elicitation day of SA (150 µM) on the growth of

S.hainanense cells


GI Fresh Dry

7 8,12c 0,68

b 2,71

14 8,90b 0,69

b 2,97

21 9,13a 0,74

a 3,04

Control 7,61d 0,68

b 2,54

Control: 150 μM SA add to medium at the beginning of cell culture

15

Table 3.12. Effect of elicitation day of SA (150 µM) on solasodine

production of S.hainanense cells


7 117,0b

14 101,5c

21 82,5d

Control 245,0a

Control: 150 μM SA add to medium at the beginning of cell culture

3.2.4. Consolidated effect of elicitors

3.2.4.1. Concentration of elicitors

3.2.4.1.1. Combining two elicitors

We select the most proper concentration of an elicitor and

combine with different contents of the other elicitor to study their

combining effects on solasodine growth and accumulation of

S.hainanense. Here is the detail: combine 50 µM MeJA with (1-5

g/L) YE or (50-250 µM) SA; combine 3 g/L YE with (25-250 µM)

MeJA or (50-250 µM) SA; combine 150 µM SA with (25-250 µM)

MeJA or (1-5 g/L) YE. All elicitors are added to medium at the

beginning of cell culture.

Table 3.13. Effect by combining each pair of elicitor on solasodine growth

and accumulation of S.hainanense

Elicitor Cell weight(g)

GI Solasodine

(mg/g) SA

(µM)

MeJA

(µM)

YE

(g/L) Fresh Dry

- 50 2 4,56f 0,43

e 1,52 186,0

b

50 50 - 5,17d 0,42

f 1,72 165,5

e

150 25 - 5,37c 0,49

b 1,79 173,0

c

150 - 3 7,74a 0,47

c 2,58 197,5

a

- 25 3 5,91b 0,55

a 1,97 170,5

d

Control 4,98e 0,45

d 1,66 123,5

f


16

3.2.4.1.2. Combining three elicitors

Table 3.14. Effect by combining three elicitors on solasodine growth and

accumulation of S.hainanense

Elicitor Cell weight (g)

GI Solasodine

(mg/g) SA

(µM)

MeJA

(µM)

YE

(g/L) Fresh Dry

150 50 5 4,82b 0,31

c 1,61 153,0

c

150 150 3 4,24c 0,32

c 1,41 160,0

b

100 50 3 4,05d 0,39

b 1,35 180,5

a

ĐC 4,98a 0,45

a 1,66 123,5

b

3.2.4.2. Culturing time

Picture 3.15. Cell biomass production of S.hainanense cells in a batch

culture added 150 µM SA and 3 g/L YE at the beginning of culture

Picture 3.16. Dymamic of solasodine accumulation of S.hainanense cells

elicited by 150 µM SA and 3 g/L YE

17


Table 3.15. Effect of elicitation day of SA (150 µM) and YE (3 g/L) on the

growth of S.hainanense cells


GI Fresh Dry

7 6,62b 0,45

ab 2,21

14 5,35cd

0,39b 1,78

21 5,13d 0,32

c 1,71

Control 7,74a 0,47

a 2,58

Control: 150 μM SA and 3 g/L YE add to medium at the beginning of cell

culture

Table 3.16. Effect of elicitation day of SA (150 µM) and YE (3 g/L) on

solasodine production of S.hainanense cells


7 11,8b

14 51,0c

21 46,0d

Control 197,5a

Control: 150 μM SA and 3 g/L YE add to medium at the beginning of cell

culture

3.3. Determination of solasodine acitivity

Table 3.17. Solasodine activity analysis

Test

Length of gel

column (mm)

before

treatment

Length of gel

column (mm)

after after

treatment

Height of gel

column when

dismissed

(mm)

Solasodine of cell 119 ± 2,1 104,0 ± 1,5 15,0 ± 0,6

Control 118 ± 1,8 50,3 ± 1,2 67,7 ± 1,6

Control: collagenase solution 0.1 mg/mL

18

3.4. High efficient solasodine process from in vitro cell of Solanum

hainanense Hance

Natural S.hainanense

1. Sterialization:

- Ethanol 70% in 1 minute

- HgCl2 0,1% in 8 minute

- Wash by sterile pure water: 5 times 2. Create in vitro from body part which has

leaf-stem in S0 medium

In vitro S.hainanense

Enhancement callus

3. Create callus from body part, root part, and

leaf stem of cây in vitro in S1 medium

Multiply callus

4. Multiply callus in S2 medium

Raise suspension cells

5. Raise 3 g callus in 50 mL S2 medium (no

agar) shaking speed 120 round/minute

6. Raise 20 mL cellular liquid in 50 mL S3

medium, shaking speed 150 round/minute

Increase solasodine generation

7. Add 150 µM salicylic acid into S3

medium when start cell culturing, shaking

speed 150 round/minute, 4 weeks

Extracted solasodine liquid

8. Extract solasodine from cell using Soxhlet

method

9. Quantify extracted solasodine liquid by HPLC.

10. Determination of solasodine activity on collagen

gel column

19

Chapter 4

DISCUSSION

4.1. EFFECT OF METHYL JASMONATE

4.1.1. Effect of methyl jasmonate concentration

Normally, adding elicitor into culturing medium restricts growth

capability of cells, this results have been declare in many of previous

scientific publication. In our study, in MeJA medium, growth of S.

hainanense is less than the counting experiment which does not have

elicitor, the higher elicitor concentration, the less growth of cell. This

result fits with other previous study on restriction of elicitor on

growth of botanical cells.

Elicitor concentration takes important role in induction process,

the accumulation of secondary synthesis will be at proper elicitor

concentration. High concentration of resistance element causes over-

threshold response, and cells dead. In our study, solasodine

accumulation is maximized when it is processed with MeJA

concentration of 50 µM (159 mg/g, 1.3 times of counter cells which

we did not add MeJA).

4.1.2. Effect of elicitation time

The time to process elicitor is a crucial factor which effects

growth and accumulation of secondary synthesis of botanical cells.

Our study shows that all solasodine growth and accumulation of cells

at different elicitor processing time decrease in comparison with

those at the beginning of culture process. Our research output is

similar to that of Chong et. cs (2005) study on effect of different

20

elicitors and time to add elicitor into Morinda elliptica culturing cell

sample.

4.2. EFFECT OF EXTRACTED YEAST EXTRACT

4.2.1. Effect of concerntration of yeast extract

Unlike when being processed by MeJA, when adding YE into

culturing medium, we collect fresh and dry living mass more than

counter element that we do not add elicitor. Some study mentions

that when adding YE into culturing medium, YE works as nitrogen

source and under pressure, this nutrition can take an important role in

growing and stimulating botanical cells to increase secondary

synthesis generation. Our result shows that both solasodine living

mass and content of S. hainanense increase at suitable concerntration

(2-4 g/L). Our output is closest to the study of Jain et cs (2015) on the

different family named S. melongena.


With S. hainanense, the longer elicitor processing time, the more

stimulation to cellular living mass to grow. When adding YE at

starting culture or after seventh day, cells have similar growth

capability, at induction moment is 14 days, the cell growth indicator

starts decreasing and reach maximum decrease on 21st day. The

results of Jain et cs (2015) using S. melongena also shows the

induction time on 28th day is best for living mass development and

solasodine content that is similar to result of our research.

Analyzing accumulated solasodine content using S. hainanense

shows that the best induction time is the start culturing time as with

MeJA (solasodine achieves 220.5 mg/g dry weight).

21

4.3. EFFECT OF SALICYLIC ACID

4.3.1. Effect of salicylic acid concerntration

In our research, SA of concentration from 50µM to 100µM has

clear stimulating effect on cell living mass in comparison with

counter SA; similar to YE and opposite to MeJA. In present, there are

not many researches report this syndrome except research on S.

hainanense. Using S. hainanense, the research of Jain et al. (2015)

shows that by adding 50 µM SA in planting baby roots of S.

melongena, collecting living mass higher than counter part 1.5 times

after 28 days (5.16g and $3.39). Meanwhile, solasodine content is

higher than counter part about 13.5 times (89.03 nano µg/g - 6,5

µg/g)

The result of solasodine content analysis in S. hainanense cell

shows that the accumulation gradually increases when adding SA

from 50 μM to 150 μM, then decreases dramatically when SA is from

200 μM to 250 μM. In general, SA effects on the capability of

solasodine synthesis in S. hainanense cell more visible than MeJA

và YE.


Similar to MeJA processing, the longer time process with SA,

the more effect on growth of S. hainanense cells. Short induction

time (7 days) has less effect on the cell growth. Counter cell has

longest induction time, then the living mass is only 7.61g fresh and

0.68g dry weight.

The effect of SA processing time on solasodine synthesis is

similar to MeJA and YE, the longer processing time, the more

capability to accumulate solasodine. The survey result show that

processing 150 μM SA from 7 to 21 days after culturing is not

22

enough induction time for cell to produce high solasodine level. SA

process right at beginning of culture time show best consequence,

higher than other cases from 2 to 3 times.

4.4. EFFECT OF COMBINING ELICITORS

In general, processing of combining elicitors at different content

in this research increases solasodine accumulation in S. hainanense in

comparison with counter sample. The best combination formula

returns solasodine level 1.6 times higher than unprocessed cells and

8.4 times comparing to one-year old natural roots. However,

processing with combination only returns higher than processing with

50 μM MeJA, and lower than separate processing with 3 g/L YE or

150 μM SA.

Similar to separately processing of MeJA, YE and SA, the

processing of elicitor combination also shows that the most proper

time to add elicitor is the moment of starting culture, or long

induction time (4 weeks) and this is most effective. Cell growth and

solasodine content are both higher than other induction periods (from

7 to 21 days after culturing) equivalent to period from 21 to 7 days.

Comparing to study results on cells of most of other botanical

species, S. hainanense cells need longer induction time.

4.5. COMPARING EFFICIENCY OF AMONG ELICITORS

In this study, all three elicitors increase the solasodine bio-

synthesis in S. hainanense cells, in which SA has first role, second is

YE and last is MeJA. The effect of these elements on living mass is

similar.

SA is cheap non-biological elicitor, easy to use then become

popular to many authors; many outputs also show SA is most

efficient among stimulator systhesis of HCTC in botany.

23

CONCLUSION AND PROPOSAL

CONCLUSION:

1. SOLASODINE growth and accumulation in suspension S.

hainanense cell gets highest after 4 weeks, fresh weight is 4.98

g/jar, dried living mass is 0.45 g/jar, solasodine content is 123.5

mg/g dry weight, higher than in natural root 5.3 times

2. Effect of elicitors on solasodine accumulation capabilit in vitro

cell of S. hainanense

2.1. Solasodine content accumulation is highest when process S.

hainanense at 150 µM salicylic acid at culture time (245 mg/g

dry weight).

2.2. When adding separate or combined elicitors, solasodine increase

gradually from second to third week, maximum in week 4 and

then gradually reduced from 5th to seventh week.

3. Solasodine from suspension cells has inflamation resistance,

showing by their collagenase limitation.

4. Propose a high efficient solasodine producing process from in

vitro cell culture of S. hainanense with processing 150 µM

salicylic acid from natural sources.

PROPOSAL

1. Study to improve solasodine production of S. hainanense in

biocreator system

2. Study the influence scheme of elicitor on solasodine

transformation in S. hainanense

24

REFERENCE

1. Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Le Thi Minh Khuyen,

Ton Nu Thuy An (2014). Effects of yeast extract and methyl jasmonate on

the enhancement of solasodine biosynthesis in cell cultures of Solasodine

hainanense Hance. J. BioSci. Biotech. 2014, 3(1): 1-6.

2. Nguyễn Hữu Thuần Anh, Tôn Nữ Thùy An, Lê Thị Hà Thanh, Võ Thị

Viên Dung, Nguyễn Thuần Nho, Đinh Hồng Kim Cương, Nguyễn Ngọc

Hiếu, Nguyễn Thanh Giang, Nguyễn Hoàng Lộc (2015). Nghiên cứu ảnh

hưởng của methyl jasmonate và dịch chiết nấm men lên sinh trưởng và tích

lũy solasodine của tế bào cà gai leo (Solasodine hainanense Hance). Tạp chí

Công nghệ sinh học 13(2A): 1-7.

3. Nguyen Huu Thuan Anh, Ton Nu Thuy An, Nguyen Thuan Nho, Vo

Thi Vien Dung, Nguyen Hoang Loc (2015). Effect of salicylic acid on the

biosynthesis of solasodine in cell suspension culture of Solanum hainanense

Hance. Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology 17(1-2): 14-20.

ĐẠi hỌc huẾ trƯỜng ĐẠi hỌc khoa hỌcnuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu...

Documents