hplc ii - · pdf filespektrofluorometri; 2. proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan...
TRANSCRIPT
HPLC II
Indah Solihah
2 HPLC-2011
Teknik Elusi
Isokratik: - teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak tetap (polaritas tetap) selama proses
kromatografi berlangsung
Gradien: - teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah)
selama proses kromatografi berlangsung
3 HPLC-2011
Teknik Isokratik
4 HPLC-2011
Eluen= campuran A + B
50 % B
40 % B
5 HPLC-2011
30 % B
35 % B
6 HPLC-2011
Teknik Gradien
Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas,
kemudian dilakukan
teknik elusi gradien
7 HPLC-2011
Hasilnya
8 HPLC-2011
Normal-Phase HPLC [ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]
Senyawa polar:
- terelusi belakangan (tR panjang)
- semakin non-polar fase gerak, tR senyawa polar makin panjang
Solven:
- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform
Eluent strength:
- dimodifikasi dengan n-heksan
9 HPLC-2011
Reversed-Phase HPLC
Senyawa polar:
- terelusi lebih dahulu
Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar
lebih kuat tertahan
Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra-
hidrofuran
Eluent strength:
- dimodifikasi dengan air (Kellner dkk., 1998)
Reversed-Phase HPLC [ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]
Detektor
Bagaimana
Memilih detektor
dan
Apa pertimbangannya
???
Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Detektor HPLC
Bulk property detector (BPD) :
- mengukur sifat solute dan fase gerak
contoh : detektor indeks bias ( RI )
Solute property detector (SPD) :
- hanya mengukur sifat solute
- 1000 kali ≥ sensitif dibanding BPD
Contoh : detektor UV
Syarat Detektor :
• Cukup sensitif
• Stabilitas dan reprodusibilitas tinggi
• Respon linear terhadap solut
• Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung flow rate (kec.alir)
• Mudah digunakan
• Tidak merusak sampel
Detektor UV
• Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut sedangkan sampel menyerap dengan kuat.
• Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor dengan λ yg dapat diubah ubah antara 200-700 nm
• Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar
• Detektor ini hanya bekerja jika senyawa mempunyai kromofor
Kromofor UV-HPLC
Kromofor UV-HPLC
Detektor UV
Untuk keperluan analisis komponen utama dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan
minimal nilai senyawa harus ≥ 10 M-1. cm-1 pada ≥ 185 nm.
Untuk keperluan trace analisis secara HPLC-
UV diperlukan minimal nilai senyawa harus ≥ 1000 M-1. cm-1
Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV,
senyawa dengan nilai senyawa 100 M-1. cm-1 tidak mungkin dilakukan
UV / Visible detector
Advantages
• High sensitivity & small sample volume required
• Can be used with gradient elution
• Is relatively cheap and not sensitive to temperature
• Sensitive to large number of organic compounds
Disadvantages
• Does not work with compounds that do not absorb light at this wavelength region
• Cannot be used with the solvents having large absorption in the UV region
• Cannot be used for the sample components which cannot be absorbed in the UV region
19
Detektor PDA
• Mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yg berbeda dlm sekali proses (single run)
• Pada kromatogram dapat pula ditampilkan spektrum UV shg dpt digunakan untuk memilih λmaks utk sistem HPLC
• Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi, panjang gelombang, dan waktu)
Detektor Fluoresensi
• Merupakan detektor yg paling peka, tetapi hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa berfluorisensi, karena itu kadang2 solut diubah menjadi turunan senyawa yg berfluorisensi sebelum dikromatografi
24 HPLC-2011
Detektor UV vs Fluorescen
UV
Fluorescen
25 HPLC-2011
Luminescence
Bagaimana terjadinya fluorescensi ???
Fluorescensi
Fluorescene detection
• Compared to UV-VIS detectors fluorescence detectors offer a higher sensitivity and selectivity that allows to quantify and identify compounds and impurities in complex matrices to extremely low concentration levels (trace level analysis)
• Fluorescence detectors sense only those substances that fluoresce
excitation
Mobile phase
emission
basic principles of HPLC - 1 suwedo hadiwiyoto 26
Detektor Indeks Bias
• Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda
• Detektor mengukur perbedaan antara indeks bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan oleh adanya solut.
• Detektor ini tidak dapat dipakai untuk elusi bergradien karena indeks bias sistem berubah selama kromatografi
• Sangat sensitif terhadap perubahan suhu
Refractive index (RI) detection
• The ability of a compound or solvent to deflect light provides a way to detect it
• The RI is a measure of molecule’s ability to deflect light in a flowing mobile phase in a flow cell relative to a static mobile phase contained in a reference flow cell
• The amount of deflection is proportional to concentration
• The RI detector is considered to be a universal detector but it is not very sensitive
basic principles of HPLC - 1 28
Detektor Elektrokimia
• Detektor ini menggunakan sifat redoks solut untuk mengukur kehadiran solut tersebut.
• Memiliki kepekaan yg tinggi
• Fase gerak harus polar dan mengandung elektrolit pendukung
Detektor Spektrometri Massa
• Untuk identifikasi senyawa murni
• GC-MS : terjadi pola fragmentasi
• LC-MS : tdk terjadi pola fragmentasi
• Data berupa berat molekul, terkadang ditambah berat molekul pelarut
HPLC-2011 31
Derivatisasi
Apa arti derivatisasi … ?
Apa tujuannya … ?
Bagaimana caranya … ?
Derivatisasi Post-/Pre-column … ?
32 HPLC-2011
Tujuan Derivatisasi
Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs
Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-kromofor senyawa berkromofor)
Meningkatkan daya deteksinya (senyawa berkromofor UV senyawa berkromofor fluorescensi)
Syarat reaksi derivatisasi
1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri;
2. Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %);
3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi;
4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi.
34 HPLC-2011
Captopril
N
HS
COOH
CH3
O
Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC dengan detektor UV ?
35 HPLC-2011
Derivatisasi dg p-Br fenacylbromide
Etilamin
Captopril p -Br fenacylbromide
N
HS
COOH
CH3
O
C-CH2-BrBr
O
+
36 HPLC-2011
Hasil derivatisasi :
Captopril + p -Br Fenacylbromide
N
HS CH3
O
Br
OO
C-O-CH2-C
Dapat dideteksi secara UV
37 HPLC-2011
Gabapentin
C
OH
O
H2N
Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan detektor UV atau Fluorescen ?
R-NH2
HPLC-2011 38
Derivatisasi dg Dansilklorid
Fluorescent derivative
+ R-NH2
O=S=O
Cl
N
CH3H3C
- HCl
O=S=O
NH
N
CH3H3C
R
Dansil klorid
Contoh Senyawa
Asli
Yang
Berfluorescensi
40 HPLC-2011
Kunang-kunang
41 HPLC-2011
Fluorescensi
Asam Salisilat
C
O
OH
OH
As.Salisilat - Fluorescensi
C
O
OH
OH
Papaverin HCl
N
CH2
OCH3
OCH3
H3CO
H3CO .HCl
Riboflavin
N
N
NH
N O
OH OH OH
CH2-CH-CH-CH-CH2OH
O
H3C
H3C
46 HPLC-2011
47 HPLC-2011
Bentuk Kromatogram
Bentuk kromatogram (peak) ada berma-
cam-macam, a.l:
- tailing, fronting (leading)
- asimetri, simetri
- pecah
- lainnya
HPLC-2011 48
Peak asymmetry - tailing
USP
HPLC-2011 49
Peak Asymmetry vs Tailing
Baca:
Snyder dkk., 1997
HPLC-2011 50
Kriteria Peak
51 HPLC-2011
Pengatasan Peak Tailing
Tambahkan 30 mM:
- Trietilamin (utk seny. basa)
- Amonium asetat (utk seny. asam)
Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietil-
amin dengan:
10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktil-
amin asetat
Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g
Bagaimana mekanisme kerja
TEA mencegah tailing ?
52 HPLC-2011
Tailing Senyawa Basa
Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam
kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat
dengan senyawa basa [ R-NH2 ] yang melewati
kolom tersebut.
Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin
modifier ke dalam campuran fase gerak, misal:
trietilamin [ TEA ].
TEA akan me-masking residu Si-OH, sehingga
saat senyawa basa melewati kolom tidak terjadi
ikatan yang terlalu kuat, hingga akhirnya dapat
memperkecil terjadinya tailing.
53 HPLC-2011
Penggunaan TEA
Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak.
Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi
residu silanol pada kolom RP-18.
Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !
Perhatikan:
pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan
fase gerak yang mengandung TEA