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Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 1
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 2
Eluenten
Einlassfritte 5-10 µm+ entfernt Partikel aus dem
Eluenten (Schutz der
Pumpenventile)
Mikrobieller Befall+ Insbesondere bei wässrigen
Eluenten ist auf zu achten!
Aus: Th. Welsch
Einführung in die HPLC
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 3
Eluenten
Die verwendeten
Eluenten
müssen
ineinander
mischbar sein
Aus V.R. Meyer
Praxis der Hochleistungsflüssigchromatographie
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 4
Eluenten - Reinheit
Der verwendete Detektor bestimmt die Reinheitsan-forderungen an die Eluenten
+ UV-Detektor:
• geringe Eigenabsorption
• geringer Gehalt UV-aktiver Verunreinigungen Spezifikation ‚HPLC-
grade‘, gradient grade‘
+ Fluoreszenz-Detektor
• geringe Eigenfluoreszenz bei den gewählten Ex/Em
• geringer Gehalt an Substanzen, die bei den gewählten Ex/Em eine Fluoreszenz zeigen
+ .....................
Solvent UV Cutoff (nm)
Acetonitrile 190
Water 190
Cyclohexane 195
Hexane 200
Methanol 210
Ethanol 210
Diethyl Ether 220
Dichloromethane 220
Chloroform 240
Carbon Tetrachloride 265
Tetrahydrofuran 280 (220)
Toluene 285
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Eluenten - Reinheit
Spezifikationen
+ Reinheit
+ Viskosität
+ Brechungsindex
+ Siedepunkt
+ Toxizität
+ UV-Durchlässigkeit/UV-Cutoff
+ Löslichkeit
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 6
Garantieschein
Gehalt (GC) min. 99,8 %
Abdampfrückstand max. 0,0005 %
Wasser max. 0,02 %
Acidität max. 0,0005 meq/g
Alkalität max. 0,0002 meq/g
gradient grade
bei 235 nm max. 2 mAu
bei 254 nm max. 1 mAu
Fluoreszenz
bei 254 nm max. 1 ppb
bei 365 nm max. 1 ppb
UV Durchlässigkeit
bei 220 nm min. 50 %
bei 235 nm min. 80 %
bei260 nm min. 98 %
Physikalische Daten von Methanol:
UV-Grenze: 260 nm
Brechungsindex: 1,3284
Viskosität 0,60 mPas
Polarität E° (Al2O3): 0,95
Dichte: 0,79 g/ml
Siedepunkt: 65° C
MAK-Wert: 200 ml/m3
Eluenten
aus: Merck HPLC-Training System
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 7
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 8
Entgaser / Degasser
Entfernung gelöster Luft
+ Probleme mit der Pumpe Druckschwankungen aufgrund von Luftblasen in den Ventilen
insbesondere bei Mischung bestimmter Lösungsmittel (Methanol/Wasser)
+ Detektorprobleme
• Amperometrischer Detektor (Sauerstoff)
• Entstehung von Gasblasen in der Detektorzelle
→ Brechungsindexdetektor
→ UV-/Fluoreszenzdetektor
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 9
Entgaser / Degasser
Prinzipien / Methoden+ Permeations-Vakuumentgaser
+ Helium-Spülung
+ Ultraschall / Vakuum-Ultraschall
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HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 11
Gradientenmischer
Prinzip+ entgaste Eluenten laufen durch Einwegeventile
+ es ist jeweils nur ein Ventil pro Zeiteinheit
geöffnet
+ die Ventile öffnen sich proportional zum Anteil
des jeweiligen Eluenten
+ Beispiel:
eine Mischung von A:B (80:20) wird erreicht,
wenn sich Ventil A 0,8s öffnet
und anschließend Ventil B für 0,2s
A B C
A B C
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HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 13
Pumpen-Typen
KolbenpumpeMit Abstand der Typ mit der weitesten
Verbreitung
+ Förderkolben wird von einer
exzentrischen Scheibe angetrieben
+ Kolbenmaterial: Saphir (inert) wird von
einer Dichtung umschlossen
+ Ein- und Austritt des Eluenten wird
durch 2 Einwegeventile geregelt
Fluss ist nur in eine Richtung
möglich
+ Mit dieser Technik sind Drucke bis
400 bar möglich
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Pumpe
Doppelkolbenpumpen –Prinzip der seriellen Schaltung
+ Es werden 2 Kolben zur pulsa-
tionsfreien Förderung eingesetzt
+ Eluentenein- und –ausstrom
werden beim ersten Kolben durch
Ventile geregelt
+ Restschwankungen der Pulsation
lassen sich über eine elektro-
nische Drehzahlregelung des
Schrittmotors regeln.
Auslass-
Einlass-
ventilaus: Merck HPLC-Training System
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Pumpe
Doppelkolben-
pumpe
(Praktikum)
Einlass-
ventil
Pumpen
-kopf
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 16
Pumpe
Ventile
+ Rubinkugel dichtet in einer
eingeschliffenen Saphirscheibe
+ Saphirkolben zieht sich zurück
• Einlassventil öffnet sich, im
Auslassventil fällt die Rubinkugel
durch den Systemdruck in die
Saphirscheibe und dichtet
Saphirkolben
Kolbendichtung
Einlassventil
Feder
Rubinkugel
Saphirscheibe
(geschliffen) Saphirkolben Saphirscheibe + Rubin
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
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HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Atmos-
phären-
druck
Hochdruckbereich (bis 400 bar)
Niederdruckbereich
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 18
Schäuche, Fittings, Kapillaren
Niederdruckbereich+ Verwendung von Schläuchen und Kapillaren
mit einem Aussendurchmesser von 1/8“
(3,175mm) und einem Innendurchmesser über
0,2 mm (Ausnahme Kapillare von der Säule zum Detektor
und vom Detektor in den Abfall)
+ Dichtung erfolgt über
• die geflanschte (‚aufgespreizte‘) Kapillare
• Einen Dichtkegel (Ferrule), der beim
Aufschrauben auf die Kapillare gedrückt wird
Geflanschte Kapillare
mit Schraube
‚flangeless fitting‘
Kapillare mit Dichtkegel
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 19
Schäuche, Fittings, Kapillaren
Hochdruckbereich+ Verwendung von Schläuchen und Kapil-
laren mit einem Aussendurchmesser von
1/16“ (1,588mm) und einem Innendurch-
messer von
• 0,5 mm zwischen Pumpe und Injektions-
ventil
• 0,25 mm zwischen Probenaufgabe und
Detektorausgang
+ Dichtung erfolgt über
• einen Dichtkegel (Ferrule), der beim Auf-
schrauben auf die Kapillare gedrückt wird
• Materialien→ Edelstahl
→ PEEK, PTFE: inerte, druckstabile Kunststoffe
‚fingertight fitting‘
Aus: Th. Welsch
Einführung in die HPLC
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 20
Schäuche, Fittings, Kapillaren
Hochdruck-
bereich
Aus: Th. Welsch
Einführung in die HPLC
Aus: G. Aced et al.
Liquidchromatographie
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 21
Druck- und Längeneinheiten
Druckeinheiten
1 bar 1 MPa 1 psi 1 mWS 1 mmHg
1 bar 0,1 14,5 10,2 750
1 MPa 10 145 102 7500
1 psi 0,0689 0,00689 0,7 51,7
1 mWS 0,0981 0,00981 1,42 73,6
1 mmHg 0,0013 0,00013 0,019 0,013
Umrechner: http://www.juwo.at/de/pressunits.htm#Definitions
Längeneinheiten (Zoll mm)
Zoll (inch, “) 1“ ½“ 3/8“ ¼“ 3/16“ 1/8“ 1/16“ 1/32“
mm 25,4 12,7 9,525 6,35 4,76 3,175 1,59 0,794
Umrechner: http://www.segelservice.com/service/entf_rech.htm
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 22
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 23
Spül-(Purge-)ventil
+ dient dem schnellen Spülen der Anlage bis einschließlich Pumpe,
ohne die Säule zu belasten (beliebig hohe Flussrate)
• Volumen in den Schläuchen und insbesondere im Entgaser kann
mehrere mL betragen
+ sinnvoll bei
• Inbetriebnahme
• Wechseln eines Eluenten
Purge-
ventil
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 24
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 25
Mischkammer
+ Eluenten werden
meist hochdruck-
seitig gemischt
+ Mischkammertypen• statisch
• dynamisch
statische Mischkammer dynamische Mischkammer (z.B. Knauer)
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 26
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 27
Probenaufgabe
2-Position-6-Port-
Schaltventil+ Load-Position
• HPLC-Spritze einführen
• gesamtes Volumen injizieren
(Überschuss gelangt in den
Abfall)
• Spritze noch nicht herausziehen
+ Drehen in Inject-Position
• Spritze herausziehen
• Probenschleife wird nun vom
Eluenten durchströmt
• ein integrierter Kontakt
übermittelt den Analysenstart
einem Integrator oder einer
HPLC-Software
Load – Inject
Stellung
HPLC-Spritze
- stumpfe Spitze
- Einspitzvolumen ca. 5x Volumen
der Probenschleife
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 28
Probenaufgabe
2-Position-6-Port-SchaltventilInjektionsport
für HPLC Spritze
Probenaufgabeschleife
zur Trennsäule/Detektor
von der Pumpe/Mischer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 29
Probenaufgabe
Funktionsweise+ in der LOAD-Position die Ports 2/3,
4/5 und 6/1 miteinander verbunden
+ nach dem Umschalten in die INJECT-
Position sind die Ports 1/2, 3/4 und
5/6 verbunden
+ dies wird durch eine Dichtung (rotor
seal) erreicht, die sich mit dem
Schalthebel dreht und jeweils zwei
Kanäle verbindet
Probenschleife
Rotor Seal
Kerben verbinden
jeweils 2 Kanäle
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 30
Probenaufgabe
Überfüllen der Probeschleife in
der Load-Stellung (5x Schleifen-
volumen)
+ HPLC-Spritze noch nicht
herausziehen
Durch Drehen des Ventils wird
die Probeschleife in den Eluen-
tenstrom gebracht (Inject-
Stellung)
+ jetzt Spritze herausziehen
Pumpe
Pumpe
Säule
Säule
Ladestellung (Load)
Injektionsstellung (Inject)
Probeschleife
aus: Merck HPLC-Training System
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 31
Probenaufgabe
Autosampler+ Ähnliches Prinzip, nur
dass die Probenappli-
kation durch einen
Roboter erfolgt
2. Probenapplikation
Pumpe
Säule
3. Injektion
Pumpe
Säule
1. Normalbetrieb
Pumpe
SäuleSchaltventil
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 32
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 33
Säulenofen
Säulenofen + soll Säulentemperatur konstant
halten, um reproduzierbare
Retentionszeiten zu erhalten
+ Funktionen
• Heizen (Raumtemperatur* (RT)
bis 80 – 100 °C)
• Kühlen (bis 20°C unter Raum-
temperatur nur bei Öfen mit
Peltierelement)
• Detektion von Leckagen
* man beachte, dass im Sommer die RT
beträchtlich variieren kann
mind. 40 °C für reproduzierbare Bedingungen
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 34
Packungsmaterial
Kieselgel+ Partikelgestalt/-geometrie
(sph./irr.)
+ Teilchengröße (3–10 µm)(vergl. Säulenchromatographie)
+ Porendurchmesser
(60-400 Å = 6-40 nm)
+ Porosität
+ Spezifische Oberfläche
Irregular
Silicagel
Sphärisch
Irreguläraus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 35
Packungsmaterial
Partikelgröße
+ Partikelgrößen sind gaussverteilt je nach Herstellung
+ Der Porendurchmesser beträgt nur etwa 1/1000 des Teilchendurchmessers
aus: Merck HPLC-Training System
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 36
Packungsmaterial
Spezifische Oberfläche
+ Kieselgele können mit verschiedenen Chlorsilanen
modifiziert werden
+ Cl Si R
CH3
CH3
Si OH
Si OH
Si OH
Si O
Si O
Si OH
Si R
CH3
CH3
Si R
CH3
CH3
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 37
Packungsmaterial
Modifizierte Kieselgele+ auch in den Poren sind die Silanolgruppen umgesetzt
+ Oberfläche ca. 170 m2/g
Si CH3H3C
O
O
Si
O
Si
O
OH
Pores
Brush-like
Carbon Chain
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 38
Packungsmaterial
RP-Phasen
aus: http://quimica.udea.edu.co/~carlopez/cromatohplc/column.html
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 39
Säule
Spezifikationen
CS-Chromatographie ServiceMultospher 120 RP-18 HP 5µ
Art.-Nr. xxxx HPLC-Säule 250x3 mmMultospher 120 RP-18 HP-5Ch. 70801Säulen-Nr. 0103-01 Flow --------Muster-ChromatographieTel., Fax, mail
Herstellername des Kieselgels
Porengröße (Angström)
Modifizierung des Kieselgels
Korngröße in µm
Säulendimension (Länge x ID)
Flussrichtung
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 40
Säule
+ Zum Schutz der Hauptsäule wird eine
kleine Vorsäule eingesetzt (oft als
Kartusche)
+ Equilibrierung der Säule mit der
mobilen Phase mit etwa 5-10
Säulenvolumen
• bei einer 3x250mm Säule, 0.5 ml/min:
4-8 min)
+ Säulen sollten nur in der angegebenen
Richtung betrieben
(Verlust an Auflösung)
+ Säulenmaterialien sind empfindlich
gegen Druckstöße
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 41
Säule
+ Kieselgelphasen nur in einem pH-
Bereich von 2.0 bis 7.0 betrieben
werden
+ Enden sind stets zu verschließen, um
ein Austrocknen der Säule zu
vermeiden
+ Lagerung der Säule muss in einem
geeigneten Lösungsmittel erfolgen
(Vermeidung von Hydrolyse,
mikrobieller Befall)
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 42
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 43
Detektoren
UV-Detektor+ Es gilt das Lambert-
Beer'sche Gesetz
+ E = · c · dE: Absorption
: molarer Absorptionskoeffi-
zient bei
c: Konzentration
d: Schichtdicke
+ Verwendete Lösungs-
mittel (und Puffersalze)
müssen für das UV-
Licht der gewählten
Wellenlänge durch-
lässig sein
UV Lamp
Grating
Flow cell
Reference diode
Sample
diode
Cut-off filter
Holmium oxide
filter
Slit
Mirror 2
Mirror 1
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 44
Detektoren
Sensitivität (Empfindlichkeit)
PAH's extracted from soil; Sup.LC-PAH 150x4.6mm;
Solv.: H2O/CH3OH= 10:90
Fluorescence
UV-signal
WL
241/
394
WL
270/
388
WL
248/
411
WL
302/
420
WL
247/
504
Pyren
e
Chryse
ne
Benzo
(e)p
yren
e
Peryle
ne
Benzo
(k)fl
uora
nthen
e
Benzo
(a)p
yren
e
Benzo
(ghi
)per
ylene
Inden
o(12
3-cd)p
yren
e
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 45
Detektoren
Selektivität
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 46
Detektoren
Selektivität
UV-spectrum
Chlortoluron
?Atrazine
?
Wavelength (nm)
44
68
58
96 132 138158
172
215
200MS-spectrum
104
Mass/Charge60 80 100 120 140 160 180 200 220
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 47
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 48
AD-Wandler
+ Kontinuierliches Span-
nungssignal des De-
tektors wird in digitale
Daten umgewandelt:
+ Aufnahmerate wird
vorgewählt (z.B. 2 Hz)
• Pro Sekunde wer-
den 2 Datenpunkte
aufgenommen
in 10 min 1200
Datenpunkte
• Die Datentabellen
können in Origin
bzw. Excel
verarbeitet werden
0
20
40
60
80
0 2 4 6 8 10 12 min
mV
Analog
Digitalisiert
Unterschiedliche DatenaufnahmerateAus: Th. Welsch
Einführung in die HPLC
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 49
HPLC-Anlage - Übersicht
Pumpe
70 mbar
Eluenten
Entgaser
Gradienten-
mischer
A
A
B
C
BC
A
B
C
A B C
A B C
Abfall
Spül-(Purge-)
ventil
Aufgabe-
ventil
Abfall
Auswerte-
software
A/D-Wandler
Detektor
Säulenofen,
Säule
Misch-
kammer
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 50
Integrator / Chromatographiesoftware
Integration+ Unterschiedliche
Integrationsmög-
lichkeiten in
einem
Chromatogramm
Aus: Th. Welsch
Einführung in die HPLC
A Bereich der Totzeit, negativer Peak
B Aufsetzer-(Schulter)peak auf Tailing
C vollständig getrennter Peak
D unvollständig getrennte Peaks (richtig: Vertikale zur Basislinie)
E kleiner Peak ( Peakerkennung)
F Aufsetzer-(Schulter)peak auf driftender Basislinie
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 51
Integrator / Chromatographiesoftware
Peakerkennung+ Sensitivität
gibt an die Minimalkriterien zur Erkennung eines Peaks an:
• S/N Signal-Rausch-
Verhältnis
(Rauschen = noise)
• Mindestfläche
1,10
1,20
1,30
1,40
1,50
1,60
8,0 9,0 10,0 11,0 12,0
min
mV
0
20
40
60
80
0 2 4 6 8 10 12
mV
noise
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 52
Integrator / Chromatographiesoftware
Peakerkennung+ Peakspitze
Messwerte werden miteinander verglichen: sobald
ein Messwert S(n+1) kleiner als Sn ist, wird Sn als
Peakspitze angenommen
+ Peakbasis
• der Anstieg des Signales (V/t) wird bei
aufeinanderfolgenden Messwerten verglichen
• wird ein Wert überschritten, wird der Peak
erkannt und hier die Peakbasis gelegt
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 54
System Check
Vorbereitung der Anlage+ HPLC-Anlage ist mit Eluenten gespült
+ Säule ist mit dem Eluentengemisch equilibriert
+ Detektor zeigt ein stabiles Signal
+ keine Lecks sichtbar
Probenvorbereitung+ Probe ist zur Injektion vorbereitet
• klare Lösung
• ggf. filtriert
• Kompatibel mit dem Eluenten
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 55
Probenvorbereitung
Filtration+ Entfernung von Partikeln aus der
Probelösung
+ Einmalfilter mit Membranen
unterschiedlicher Lösungsmittel-
stabilität
• Porengrößen 0,2 und 0,4 µm
• Je nach Probenmenge
unterschiedliche Gehäusegröße
• Gehäuse meist aus PP
• Luerlockanschluss
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 56
Probenvorbereitung
Filtration – Membranfiltermaterialien+ Celluloseacetat
• Hydrophile Membran, für wässrige bzw. polare Flüssigkeiten,
pH 4-8
+ PTFE / Polytetrafluorethylen / Teflon
• Hydrophobe Membran, für nicht-wässrige Proben, beständig
gegen Säuren und Basen
+ Polyamid / Nylon
• Hydrophile Membran, für wässrige und organisch/wässrige
Flüssigkeiten im Bereich von pH 3-10
+ Polyvinylidenfluorid (PVDF)
• Hydrophil, für wässrige Flüssigkeiten und Mischungen mit
max. 60% organischen LM-Anteil
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Injektionslösung
Kompatibilität zum Eluenten+ Probe sollte im Eluenten gelöst werden (bzw. Anfangszusammen-
setzung des Gradienten) oder in einem weniger starken Eluenten
+ der pH der Probe sollte insbesondere bei protonierbaren Analyten dem des Eluenten entsprechen
Probe in stärkerem Eluenten gelöst
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 min
mAU
Probe in mobiler Phase gelöst
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 min
mAU
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 58
RP-Phase
Elutionskraft - Umkehrphasen
Wasser
Methanol
Acetonitril
Isopropanol
Tetrahydrofuran
Elutionskraft
Starke Retention
an der Umkehrphase
Schwache Retention
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 59
OH
H
RP-Phase
Prinzip
Si
O
O
O
Si
O
O
O
Si
O
O
O
Si
OH
OH
O OH
Si
OH
OH
O OH
CH3
N
OH
H
OH
H
OH
H
COOH OH
H
CH3
N
OH
H
COOH
CH3
N
CH3
N
OH
H
OH
H
OH
H
OH
H
CH3
N
COOH
OH
H
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 60
Elutionskraft
+ Modifikation
durch unter-
schiedlich star-
ke Eluenten
oder deren
Mischungen
100% MeCN
80% MeCN
60% MeCN
50% MeCN
40% MeCN
45% MeCNmin.
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
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Elution
Isokratische ElutionZusammensetzung der mobilen Phase bleibt konstant
+ Vorteile
• Keine Equilibrierungszeit
• Keine Störungen durch Verunreinigun-gen in Lösungsmitteln
• Bei allen Detektoren anwendbar
+ Nachteile
• schlechte Auflösung der früh elu-
ierenden Substanzen
• zunehmende Breite und abnehmen-
de Höhe der spät eluierenden Peaks
• Lange Analysenzeiten bei einem
großen k’-Bereich
• Säulenverunreinigung durch stark
retardierte Probenbestanteile
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 min
0
10
20
30mAU % MeCN
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 62
Elution
GradientenelutionZusammensetzung der mobilen Phase ändert sich
+ Vorteile• verbesserte Auflösung
• Höhere Empflindlichkeit
(aufgrund schmalerer,
höherer Peaks)
• Trennung komplexer Proben
möglich
• Vermeidung von ‘verschlepp-
ten Substanzpeaks’ durch
stark retardierte Matrix-
bestandteile
isokratisch
Gradient
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 63
Elution
+ Nachteile• nicht anwendbar bei RI- und (den meisten) elektrochemischen Detektoren
• nach Abschluss des Gradienten ist eine Equilibrierung der Säule
erforderlich
• Verunreinigungen in Eluenten führen zu einer
→ Ansteigen oder Abfallen
der Basislinie
→ ‘Geisterpeaks’ im Blind-
chromatogramm
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 min
0
20
40
60
80mAU % MeCN
Peaks aus Eluentenverunreinigungen aus einem
‚Blindlaufaus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 64
Elution
Steilheit des
Gradienten+ Verbesserung
der Auflösung
+ Verkürzung der
Analysendauer
0 10 20 30 40min.
100% B
100% B
0% B
0% B
tG = 40
tG = 20
100% B
0% B
tG = 10
0 10 20 30 40min.
100% B
100% B
0% B
0% B
tG = 40
tG = 20
0 10 20 30 40min.
100% B
100% B
0% B
0% B
tG = 40
tG = 20
100% B
0% B
tG = 10
100% B
0% B
tG = 10
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 65
RP-HPLC
Temperatureinfluss
Erhöhte Temperatur führt
+ zu verringerten
Retentionszeiten
+ einem verminderten System-
druck (Abnahme der Viskosi-
tät)
+ Zu einer höheren Belastung
der Analyte und Säulen-
materialien
40C
100 5 min
65 C
aus: Agilent -Trainingsmaterialien
Mai 18 T.J. Simat, TU-Dresden, Inst. Lebensmittelchemie 66
RP-HPLC
pH-Einfluss+ Schwache Säuren/Basen liegen
in Abhängigkeit vom pH ionisiert
(-COO-, -NH3+) oder nicht
ionisiert (-COOH, -NH2) vor
+ Die ionisierten Formen eluieren
in der RP-HPLC deutlich früher
COOHCOOH
Benzoesäure (pKS=4,18) Sorbinsäure (pKs=4,76)
Aus: Th. Welsch
Einführung in die HPLC
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Ionenpaareffekt
Trennung von Basen+ Alkylsulfonate
+ Trifluoressigsäure (TFA)
+ Heptafluorbuttersäure (HFTBA)
+ Hexanesulfonsäure
Trennung von Säuren+ Quaternäre Alkyltriethylamine
+ Triethylamin (TEA)
+ Tetramethylammoniumphosphat (TMA)
+ Tetrabutylammoniumphosphat (TBA)
+ Triethylammoniumacetat (TEAA)
+ Nonylamine
SO3
SO3 N
R
R
R
H+
Na+
Bonded Phase Ion-Pair Reagent
Sample
N+
N+
O C R
O
H2PO4
aus: Agilent -Trainingsmaterialien