hoilam pcr.ppt

7/31/2019 Hoilam PCR.ppt

http://slidepdf.com/reader/full/hoilam-pcrppt 1/24

Tên bài giảng: PHƯƠNG PHÁP PCR

Giáo viên : LÊ QUỐC HỘI



1.Khái quát chung về PCR

1.1 Khái niệm

- PCR (Polymerase chain reactions) là một phương pháp tạo

dòng in vitro nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một

đoạn DNA trong ống nghiệm mà không cần sử dụng các sinh

vật sống..



PCR được phát minh năm 1985

Giải Nobel Hóa học 1993

Kary Mullis



- Tách dòng gene.

- Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm

- Chuẩn đoán những bệnh

- Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu

- Phát hiện đột biến

- Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử - Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm

- Chọn giống vật nuôi, cây trồng

- Xác định các loài mới, các loài đặc hữu- Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR


1.2. Ứng dụng



Tạo dòng gen sử dụng Plasmid


1.2. Ứng dụng



2. Nguyên tắc và quy trình PCR 2.1 Nguyên tắc PCR

+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase.

+ Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng

hợp DNA mới trong môi trường thích hợp.+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt, chủ động.

- Tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những

nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng

có sự khác biệt:



Bước 1

30s-1phút,

94-960

Bước 2

30s-1phút,

40-700

Bước 3

30s-

1phút,

720

94-96° 94-96°

40°-70o

72°

2. Nguyên tắc và quy trình PCR 2.2 Quy trình PCR



Các bước của 1chu kỳ của PCR

Nhiệt độ Các diễn biến Thờigian

Bước 1:

Bước 2:

Bước 3:

Biến tính 94-96 °C

Mẫu DNA và mồi được

phân tách hoàn toàn và

chỉ còn dạng sợi đơn.

30s-1 phút

Gắn mồi30s-1 phút

40-70 °C Mồi bắt cặp với khuôn

theo chiều 5 / -3 /

DNA polymerase gắn tiếp vào đoạn mồi. Nó

bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA,

tổng hợp chuỗi DNA mới

giống chuỗi DNA gốc.

720 C

Kéo

dài 30s

đếnnhiềuphút

Tổng hợphay kéo dài




Lượng bản sao tăng theo cấp số nhân

2 4 8 16 32 64128 256 512 1028




4.1Thành phần phản ứng Buffer

Ổn định pH DNA khuôn

Mồi

Xuôi và Ngược

Nucleotides

Để tổng hợp DNA

Men polymerase

Taq polymerase

MgCl2 Tăng hoạt lực của men

Cần nhiệt độ chính xác

Máy PCR

Tự động điều chỉnh nhiệt đ

theo chu kỳ

3. Các yêu cầu trong PCR

3.1 Thành phần môi trường

* Nước

- Nước sử dụng cho phản

ứng PCR phải thật tinhkhiết, không chứa ion nào,không chứa DNAase,

RNAase, enzim cắt giớihạn…



3. Các yêu cầu trong PCR 3.1 Thành phần môi trường

- Là mẫu DNA mà chúng ta sẽ

khuếch đại. Có thể là DNA kép,đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu.

DNA khuôn có độ nguyên vẹn

cao, thật tinh sạch tránh lẫn tạp

chất.



Mồi PCR

Tại sao cần có mồi PCR

Polymerase chỉ có thể bắt đầu quá trình tổng hợp từ sợi đôi Bắt đầu tại nơi mồi gắn vào

Mồi PCR là gì?

Các đoạn DNA ngắn, được tổng hợp nhân tạo

18-28 Nu

3. Các yêu cầu trong PCR 3.1 Thành phần môi trường

- Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến

phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Chúng nhận ra phần DNA cầnđược nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vịtrí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồixuôi và một mồi ngược.



- Trong phương pháp PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính :

+ Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể

bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi

nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi

+ Quyết định nên tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là

chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp

được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản

phẩm PCR càng đặc hiệu



Thermus aquaticus

Vi khuẩn Thermus aquaticus được phát hiện lần đầu tiên ở một con suối

nước nóng ở khu vực Great Fountain của the Lower Geyser Basin tại công viên quốc gia Yellowstone. Taq polymerase được tách chiết từ vi

khuẩn này

Taq polymerase cần 30-60s để tổng hợp 1 kilo base. Vì vậy thời gian kéo

dài phụ thuộc vào kích thước sản phẩm



Hoạt động của men DNA polymeraseluôn theo hướng 5’ 3’

3’

5’ 3’

5’

5’

5’

3’

3’



Điều kiện PCR chuẩn

Hầu hết DNA có thể được khuếch đại dưới điều kiện chuẩn

Thành phần cho phản ứng 100 µLDNA khuôn 103 – 104 phân tử

Mồi 0,2 uM mỗi mồi

MgCl2 1.5 mMdNTP 50 µM mỗi loại Taq DNA polymerase 2 units

Chương trình PCR 30-40 chu kỳ:

Biến tính 94ºC, 30 giâyMồi bắt cặp 55ºC, 30 giây

Kéo dài 72ºC, 30 giây

Chu kỳ cuối: kéo dài lần cuối ở 72ºC, 5 phút



Kinh nghiệm PCR

• Không bao giờ pha 1 phản ứng PCR duy nhất – Nên chuẩn bị hỗn hợp chủ (master mix)• Buffer, mồi, MgCl2, nước, dNTPs, Taq

– Khi tính thể tích master mix, nên trừ hao thêm 1 mẫu vì

hao hụt trong quá trình hút bằng pipet • Chứng âm

– Không có DNA khuôn

• Kiểm tra sự nhiễm

• Chứng dương

– Để kiểm tra hoạt động của mix pha

Điện đi: http://207.207.4.198/pub/flash/4/4.html

http://207.207.4.198/pub/flash/4/4.html

http://207.207.4.198/pub/flash/4/4.html



Các vần đề thường gặp khi làm PCR

• Nhiễm • Không có sản phẩm hoặc nồng độ

sản phẩm yếu

• Mồi tự bắt cặp

• Sản phẩm phụ



Vấn đề tệ nhất – NHIỄM Sự sao chép quá mức DNA

khuôn

Quá nhạy

Một lượng rất nhỏ chất nhiễm có thể gây ra nhiều trục trặc

Thủ phạm chính

Sản phẩm PCR

Các đoạn DNA ngắn hoàn

toàn tương ứng Nồng độ quá cao

Có thể lấn át khuôn DNAmới



Giải pháp cho vấn đề nhiễm Dùng hóa chất tiệt trùng Tách khu vực tiền PCR

và hậu PCR

Luôn dùng chứng âm

Chia hóa chất thànhnhiều ống nhỏ

Có thể bỏ đi khi có

trục trặc Dùng đầu côn lọc

Hút cẩn thận bằng pipet



Sản phẩm không có hoặc yếu Quên một thành phần nào đó

Kiểm tra lại sổ thí nghiệm Lặp lại thí nghiệm

Nồng độ sai DNA khuôn

Mồi Taq

MgCl2

Sai mồi Kiểm tra trình tự Thay mồi khác

Dùng chứng dương

Mẫu DNA không tốt Kiểm tra mẫu trên

gel agarose

Xem sự táchđoạn

Chất ức chế PCR

Bổ sung quá nhiều Điều kiện phản ứng sai

Giảm tính chính xác

Giảm nhiệt độ bắt cặp

Tăng lượngMgCl2

Nhuộm không tốt Kiểm tra hình ảnh

Dùng thang chuẩn



Mồi tự bắt cặp Mồi tự bắt cặp với nhau

Sản phẩm nhỏ 50-100 bp

Thường do vần đề DNA khuôn

Mồi luôn cố gắn vào trình tựnào đó

Giải pháp

Chứng dương

Thiết kế lại mồi Dùng Hot Start

Dimer

Hairpin loops



Sản phẩm không đặc hiệu Cách phát hiện

Điện di trên gel agarose

Kích thước sản phẩm sai

Luôn dùng thang chuẩn

Biết kích thước

Giải pháp

Tăng độ chính xác

Tăng nhiệt độ bắt cặp

Giảm lượng MgCl2

Thay đổi chương trình

Thời gian kéo dài

Dùng nhiều mồi khác nhau

Giảm số chu kỳ



Ưu khuyết điểm của PCR: Ưu điểm:

Hiệu quả cao: hoạt động trên một lượng DNA cực nhỏ Tính đặc hiệu cao Nhiều mồi hoạt động trên phạm vi đối tượng rộng (thực

vật, động vật, nấm mốc) Đơn giản hóa quá trình giải trình tự DNA

Khuyết điểm: Khó khăn và tốn kém khi tạo mồi PCR Gặp trục trặc khi phản ứng thất bại

hoilam pcr.ppt

Documents