抗hla 抗体検査(flowprasquare.umin.ac.jp/jshi/qcws/file/proc_ab_flow...
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
QCWS 参考プロトコル
抗 HLA 抗体検査(FlowPRA)
2019 年度版
作成者
日本組織適合性学会 認定制度委員会 ワーキンググループ
抗 HLA抗体 WG
QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
制定・改訂履歴
版
数
制 定 日 制定理由
作成
責任者 施 行 日
初
版
日本組織適合性学会が開催する QCWS での HLA 検
査を実施する際に用いる QCWS 参考プロトコルと
して制定した。
WG
版
数
改 訂 日 改訂理由 改訂内容
改訂
責任者 施 行 日
2 2019 年 9月1日
表記の統一
記載ミス
「HLA抗体」を「抗 HLA 抗
体」の表記に変更
DTT処理での回転数 WG
QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
目 次
1.FlowPRA製品概要 ............................................................ 1
1.1 FlowPRA の使用目的・原理 .............................................. 1
1.2 FlowPRA の種類 ........................................................ 2
2.検査の準備 .................................................................. 3
2.1 検査機器の準備・キット内容・検体処理 .................................. 3
2.2 検体の処理 ............................................................ 5
2.3 検査の手順 ............................................................ 6
3. FlowPRA Screening Test のフローサイトメーター条件設定 .................... 10
3.1 FSC vs. SSC .......................................................... 10
3.2 FL2 vs. FSC .......................................................... 10
3.3 FL1ヒストグラム ..................................................... 11
3.3.1 NC血清を流す意義 ................................................... 11
3.3.2 PC血清を流す意義 ................................................... 11
3.3.3 コントロールビーズを流す意義 ........................................ 11
3.4 コンペンセーションの調整(蛍光補正) ................................. 12
4. マーカー設定の考え方 ..................................................... 12
5. FlowPRA Screening Test データ例 ......................................... 13
5.1 Class I & II、コントロールビーズと NC血清を反応させた場合のヒストグラム
............................................................................. 13
5.2 Class I ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム .................. 14
5.3 Class II ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム ................. 15
6. 機器設定の重要性 ......................................................... 16
FlowPRA Screening Test ケーススタディー【1】 ................................... 16
FlowPRA Screening Test ケーススタディー【2】 ................................... 17
日本組織適合性学会 QCWS 参加施設のデータ例 .................................... 18
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
1.FlowPRA製品概要
1.1 FlowPRA の使用目的・原理
FlowPRA は、フローサイトメーターを使用して血清中の抗 HLA 抗体を検出する為の研究用試
薬で、精製した HLA 抗原がコーティングされたマイクロビーズである。高感度に抗 HLA抗体
を検出する事ができる。
FlowPRAビーズと血清を反応後、FITC標識抗ヒト IgG 抗体で染色し、フローサイトメーター
により蛍光強度を測定し、抗 HLA抗体を検出する。
※本図における「HLA抗体」とは「抗 HLA 抗体」の事を示す
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
1.2 FlowPRA の種類
FlowPRAは FlowPRA Screening、FlowPRA Specific、FlowPRA Single Antigen の 3種類のキ
ットがある。FlowPRA Screening: 1ビーズに 1パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており、
抗 HLA抗体の有無及び%PRA*を確認できる。Class I、Class II用キットがあり、各 30種類
のビーズで全 HLA 抗原を網羅している。
1. FlowPRA Specific:1 ビーズに 1 パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており、抗 HLA
抗体の有無、%PRA とおよその特異性を確認できる。各 32 種類の抗原ビーズで全 HLA
抗原を 100%網羅している。ClassI、ClassII 用キットがあり、8 色のビーズと 1 つの
コントロールビーズが予め混合しているバイアルが 4本入っている。
2. FlowPRA Single Antigen:1ビーズに対しリコンビナント HLA抗原が 1 種類のみ結合
しており、抗 HLA 抗体の抗原特異性が分かる。
* %PRA(Panel Reactive Antibody):全パネル細胞の何%が陽性となるかの値。%PRA が高い程、様々な抗原に対
する抗体を保有している指標となる。
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
2.検査の準備
2.1 検査機器の準備・キット内容・検体処理
2.1.1 検査器具・資材の準備
機器 名称
フローサイトメーター
器具・資材 1.5 mL マイクロ遠心チューブ
1.5 mL マイクロ遠心チューブ用高速遠心機 (8,000-10,000 g が出せるもの)
ボルテックスミキサー
シェーカー
P-10 マイクロピペット・チップ
P-20 マイクロピペット・チップ
P-200 マイクロピペット・チップ
P-1000 マイクロピペット・チップ
50 mL ファルコンチューブ
プラスチック製ディスポピペット(先端ができるだけ細いもの) ※参考商品 1-4654-05 ピペット E-231(アズワン)
蒸留水(または精製水)
タイマー
アルミホイル
キムタオル
FACS チューブ
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2.1.2 キット内容と保存方法
未開封のキットは、-65℃以下で有効期限まで保存できる。一度解凍したあとの保存方法と
有効期限は下記のとおりである。
商品コー
ド キット内容 保存と有効期限
1検体あたりのビーズ使用
量
FL1-30
FlowPRA Class I ビー
ズ
10×Wash buffer
100×FITC anti-human
IgG
受領後、キットの箱を開封せずに使
用時まで-80℃~-65℃のフリーザー
に保管。製品は、この状態で保存期
間内は安定である(箱に記載された
有効期限を参照)。初回使用後およ
び/または製品の解凍後は、試薬を
2℃~5℃に保管する。一度解凍した
FlowPRA ビ ー ズ ま た は FITC
conjugated F(ab')2 anti-human IgG
は再凍結しない。解凍したビーズは、
3 ヵ月、または有効期限が 3 ヵ月以
内の場合はその有効期限まで 2℃~
5℃に保管する。Wash Buffer または
FITC conjugated F(ab')2 anti-
human IgG は、12ヵ月、または有効
期限が 12 ヵ月以内の場合はその有
効期限まで 2℃~5℃に保管する。
5 µL
FL2-30
FlowPRA Class II ビー
ズ
10×Wash buffer
100×FITC anti-human
IgG
5 µL
FL12-60
FlowPRA Class I ビー
ズ
FlowPRA Class II ビー
ズ
10×Wash buffer
100×FITC anti-human
IgG
5 µL + 5
µL
2.1.3 他に必要な試薬
商品コード 商品名 梱包単位 1検体あたりの血
清使用量
FL1-PC FlowPRAクラス IPC血清 10 tests 20 µL
FL2-PC FlowPRAクラス IIPC 血清 10 tests 20 µL
FL-NC FlowPRA クラス I & クラス IINC血
清
10 tests 20 µL
FLCNTBD FlowPRA コントロールビーズ 10 tests 1 µL
製品コード 品名 容量 1検体の使用量
LS-NC FlowPRA negative control serum 400 uL(20test) 20 uL
LS-AB2 FITC conjugatedgoat anti human
IgG
0.5 mg
(約 1000test)
×100 Stock を
1 uL
― PBS - -
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
2.2 検体の処理
2.2.1 検体前処理(必須)
1. 血清は必ず凍結融解する。融解後は、しっかり転倒混和を行ってから遠心を行う。(8,000
~10,000 g、10分間以上)。不純物が多い検体は遠心速度、時間を増やす。バックグラウ
ンドが高くなるため、血漿の使用は推奨しない。
2. 遠心後、上層、下層および壁面に凝固物が存在する可能性があるので、慎重に中間層か
ら検体を回収して使用する。
2.2.2 再検査の為の検体処理(QCWS部会推奨)
1. 非特異シフトが見られる場合:非特異物質の吸着操作
使用する試薬:AdsorbOut(製品コード:ADSORB、One Lambda)
AdsorbOut処理プロトコル(メーカープロトコル)
① (1テストあたり)血清 30 uLに対して Adsorb Out ビーズを 3 uL加え、ボルテックス
する。
② 室温で 30 分間、振とうしながら反応させ、15,000 rpmで 5分間遠心する。
③ 上清を、ビーズを吸わないように慎重に新しい別の 1.5 mLチューブに移す。
④ もし検体に Adsorb Out ビーズが混入した場合には、再度超遠心し、上清を移す。
2. ピークの波形がギザギザで、シフトしていない場合: DTT処理による IgM 抗体の除去
使用する試薬:DTT (dithiothreitol、メーカー不問)
DTT処理プロトコル(第 4回 アメリカ組織適合性学会 ASHI推奨プロトコル)
① DTT溶液(0.05 M) 10 uLに対して血清を 90 uL加える。(DTTの終濃度は 0.005 M)
② よく混ぜた後、37℃で 30-45分間反応させる。8,000-10,000 gで 10 分間遠心し上清を
使用する。
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
2.3 検査の手順
2.3.1 操作の流れ
•血清を凍結融解、転倒混和(血漿は不可)
•8,000~10,000gで10分間、遠心前処理
•NC血清、PC血清、サンプル血清とビーズを混合
•遮光、室温(20-25℃)、振とうで30分間反応反応
•洗浄バッファー1mL、遠心(9,000xg、2分間)
•上清除去、ドライボルテックス洗浄(3回)
•100倍希釈した二次抗体を100 uLずつ添加
•遮光、室温(20-25℃)、振とうで30分間反応FITC標識
•洗浄バッファー1 mL、遠心(9,000xg、2分間)
•上清除去、ドライボルテックス洗浄(2回)
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
2.3.2 標準プロトコル
注意
FlowPRA Screening Test で Class I と Class II を同時にスクリーニングする場合は、1
検体あたり Class I、Class II ビーズを各 5 µL、コントロールビーズ 1 µL をあらかじ
め必要検体数分混合しておき、混合したビーズを 1 テストあたり 11 µL 使用する。
操作
1. FlowPRAビーズを使用前によくボルテックスする。各 1.5 mL チューブに NC 血清、PC 血
清(Class I & II)、サンプル血清 20 µL を分注する。
2. 下記の量のビーズを入れてピペッティングで混合する。ビーズをチューブから取る際、
不均一になるのを防ぐために、ピペッティングしながら一定の動作で取る。検体の入っ
たチューブに血清を加える際にもピペッティングし混合する。
Class I ビーズ量 Class II ビーズ
量
コントロールビー
ズ量
Class Iのみ 5 µL - 1 µL
Class IIのみ - 5 µL 1 µL
Class I + Class
II
5 µL 5 µL 1 µL
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
3. シェーカーでゆっくりシェイクしながら暗所 20 - 25℃で 30 分間反応する。シェーカー
がない場合は、反応の間に数回軽くボルテックスする。
4. 10x Wash buffer を蒸留水(または精製水)で希釈し、1× Wash buffer を調製する。
5. 各チューブに 1x Wash buffer を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 gで 2分間遠
心後、先の細いピペットで上清をしっかり除去する。 ビーズを吸わないように注意する。
≪洗浄 1 回目≫
6. 上清を除いたペレットをほぐすために、2 秒~5 秒程度ボルテックスする。(ドライボル
テックスは、長くかけすぎ無い様に注意する。以下同様。)各チューブに 1x Wash buffer
を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 g で 2分間遠心後、先の細いピペットで上清
をしっかり除去する。 ≪洗浄 2回目≫
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
7. 上清を除いたペレットをほぐすために、ドライボルテックスする。
8. 各チューブに 1x Wash buffer を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 g で 2分間遠
心後、先の細いピペットで上清をしっかり除去する。 ビーズを吸わないように注意する。
≪洗浄 3 回目≫
9. 上清を除いたペレットをほぐすために、ボルテックスする。(ドライボルテックス)
10. 洗浄 3回目の遠心時に、1テストあたり 100x FITC anti-human IgG 1 µL を Wash buffer
99 µL で希釈し、1×FITC anti-human IgG を調製する。
11. 1x FITC anti-human IgG 100 µL をビーズに加えてボルテックスし、シェーカーでゆっ
くりシェイクしながら暗所、20-25℃で 30 分間反応する。シェーカーがない場合はイン
キュベーションの間に 1 回軽くボルテックスする。
12. 各チューブに 1x Wash buffer を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 g で 2分間遠
心後、先の細いピペットで上清をしっかり除去する。 ビーズを吸わないように注意する。
≪洗浄 1 回目≫
13. 上清を除いたペレットをほぐすために、ボルテックスする。(ドライボルテックス)
14. 各チューブに 1×Wash buffer を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 g で 2分間遠
心後、先の細いピペットで上清をしっかり除去する。ビーズを吸わないように注意する。
≪洗浄 2 回目≫
15. 上清を除いたペレットをほぐすために、ボルテックスする。(ドライボルテックス)
16. 1×Wash buffer 500 µL をチューブに加え、スポイトでフローサイトメーター用のチュ
ーブに移す。
17. すぐに測定する。あるいは遮光して 2-5℃で 24 時間までは保存可能。
初期設定時などゆっくり長く流したい時は、この最終液量は 500 µL 程度まではフレキシブ
ルに変更可能(また、機種によっても最低液量が異なることがあるので注意)。
翌日読む場合は Fixing solution: PBS with 0.5% formaldehyde (add 1.35 mL 37%
formaldehyde to 100 mL PBS)を使用すると良い。
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
3. FlowPRA Screening Test のフローサイトメーター条件設定
FlowPRA の測定では正しいデータをとるために、最初にフローサイトメーターの条件設定を
正しく行うことが非常に重要。この設定を保存し、以降呼び出して使用すれば、基本的には
微調整のみで測定できる。
FlowPRA Screening Test を読み取るためには、陰性コントロール血清、Class I 陽性コント
ロール血清、Class II 陽性コントロール血清、コントロールビーズを検体血清と同時に流す
必要がある。
3.1 FSC vs. SSC
3.2 FL2 vs. FSC
Class II ビーズ
Class I ビーズ
コントロールビーズ
Class I ビーズ
Class II ビーズ
コントロールビーズ
FlowPRA Screening Test Class
I、Class II、コントロールビーズ
の FSC vs. SSC ドットプロット
ビーズの半径は約 2 ~4 µm のた
め、「リンパ球向けのモード」で解
析している場合は感度を上げる。
FlowPRA Screening Test Class
I、Class II、コントロールビーズ
の FL2 vs. FSC ドットプロット
Class II ビーズおよびコントロ
ールビーズにはビーズに色素が
含まれているため、PEの蛍光強度
により領域を分けることができ
る。
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
3.3 FL1ヒストグラム
3.3.1 NC血清を流す意義 NC 血清を検体と同時に流す目的は、陰性血清を基準に陽性領域と陰性領域を決めるため。
Class I Class II
3.3.2 PC血清を流す意義
PC 血清を検体と同時に流す目的は、二次抗体が働いているかを確認するため。
Class I Class II
3.3.3 コントロールビーズを流す意義
コントロール
ビーズ
Class II ビーズ
Class I ビーズ
陰性コントロール血清に
Class I 、Class II とコン
トロールビーズを反応させ
た際の FL1 ヒストグラム
コントロールビーズを他の
ビーズと混合して流す目的
は、血清中の非特異反応の有
無を確認するため。抗 HLA抗
体陰性の検体にも関わらず
非特異反応によりヒストグ
ラムが右側にシフトする場
合があり、コントロールビー
ズのヒストグラムを基に非
特異か陽性反応かを判断す
る。
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
3.4 コンペンセーションの調整(蛍光補正)
コンペンセーションとは、2 種類以上の蛍光の測定において、それぞれの蛍光の波長が重な
り合う場合(例:FITC と PE)、互いの検出器にいわゆる「光漏れ」が起きるため、電気的に
補正するもの。
1:Class I ビーズ + NC 血清(FL-NC)、2:Class I ビーズ + Class I PC 血清(FL1-PC)、
3:Class IIビーズ + PBS を混合したビーズをフローサイトメーターに流し、集団の位置を
調整する。
集団 2 は上にずれる傾向なので、下に寄せて集団 1 と 2 が X 軸と並行な位置に来る
ように調整(FL2-%FL1 の値を上げる)
集団 3 は右にずれる傾向なので、左に寄せて集団 1 と 3 が Y 軸と並行な位置に来る
ように調整(FL1-%FL2 の値を上げる)
4. マーカー設定の考え方
Class I ビーズ・ Class II ビーズ・コントロールビーズと血清を反応させた場合の
Class I ヒストグラム
検体血清が図のようにネガティブピークがはっきり分かる形状の場合、NC 血清で設定し
た M1 をそのまま用いるのではなく、ネガティブピークのすぐ横のピーク谷間に合わせ
て M2 を再設定して%PRA を求める。
凡例
集団 1: Class I ビーズ + FL-NC (1)
集団 2: Class I ビーズ + FL1-PC (2)
集団 3: Class II ビーズ + PBS (3)
ネガティブ
コントロール血清
被検血清
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
5. FlowPRA Screening Test データ例
5.1 Class I & II、コントロールビーズと NC 血清を反応させた場合のヒストグラム
NC Class I
NC Class II
Cont.
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
5.2 Class I ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム
Class I抗体 陽性検体のヒストグラム例
②
①、②、③は波形が右側にシフトしており、明らかに多峰性を示している。
②は一番左側のピークの横に新たなライン(―線)を引き直し、%PRA を変更する。
④は小さい山が右側にシフトしており、弱陽性の抗 HLA 抗体があると思われる。
98.4%
0.9%
陰性検体
陽性検体
Class I の NC 血清(P14)のヒ
ストグラムと比較して、波形が
ほぼ同一の位置にあり、形状も
同一。
Class I の NC 血清(P14)のヒ
ストグラムと比較して、波形が
右側へシフトしており、多峰性
を示している。
① ②
③ ④
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
5.3 Class II ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム
Class II 抗体 陽性検体のヒストグラム例
①は波形が右側にシフトしており、明らかに多峰性を示している。
②は小さい山が右側に見える。また、ピークの右側の部分が少し膨らんでいる。
99.8%
0.3%
陰性検体
陽性検体
Class II の NC 血清(P14)の
ヒストグラムと比較して、波形
がほぼ同一の位置にあり、形状
も同一。
Class II の NC 血清(P14)の
ヒストグラムと比較して、波形
が右側へシフトしており、多峰
性を示している。
① ②
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
6. 機器設定の重要性
添付文書と同じプロットが描けているか、確認する。
添付文書より
FSC vs. SSC FSC vs. FL-2
機器の設定が出来ていない例
FSC vs. SSC FSC vs. FL2
(日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ 引用)
Class I
Class II
Control
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
FlowPRA Screening Test ケーススタディー【1】
同一検体(HLA Class I 抗体陰性の検体)を、FlowPRA Screening Test Class I で測定した
もの。異なる施設およびフローサイトメーターで測定した例を下図に示す。
説明:
ヒストグラムのパターンが大きく 2パターンに分かれた。すなわち、ネガティブコントロー
ルと同じ位置に検体血清のピークが出た施設、ネガティブコントロールよりも右側にシフト
した施設があった。さらに検体血清が右側にシフトした場合、陰性と判定した施設や陽性と
判定した施設があった。検体血清のヒストグラムは右側にシフトしているが、波形がシン
グルピークで、かつ NC 血清とほぼ同形のため陰性と判断する。検体血清が右側にシフトし
た原因として、①コンペンセーション調整が合っていない、②洗浄が悪い、③機器の差な
どが考えられる。
(日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ 引用)
陰性と判定した施設 陽性と判定した施設 ヒストグラムは 右側へシフトしているが 陰性と判定した施設
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
FlowPRA Screening Test ケーススタディー【2】
同一検体(HLA Class II 抗体弱陽性の検体)を、FlowPRA Screening Test Class II で測定
したもの。
異なる施設およびフローサイトメーターで測定した例を下図に示す。
説明:
陰性と判定とした 2施設について、「施設 I」は機器の適切なコンペンセーション調整が出
来ていない。「施設 II」はシングルピークのため陰性と判断している。「施設 II」はサンプ
ル調製の手技に問題があると考えられる。使用する血清をよく遠心し、ビーズと血清との反
応を行った後、洗浄や二次抗体のラベリングを正確に行うことをおすすめする。
保留と判定した「施設 III」、「施設 IV」、「施設 VI」は、右側に見られる小さなピークを陽
性と判断して構わない。
「施設 V」は多施設と比べてほとんど右側のピークがほぼ見えず、二次抗体のラベリングが
出来ていない可能性がある。洗浄時(特に二次抗体の添加前)は、上清をしっかり除去す
る。再度検査することをおすすめする。
(日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ 引用)
陰性と判定した施設 (2 施設) 正しいヒストグラム
陽性と判定した施設 (5 施
設)
保留と判定した施設 (4 施設)
施設 II 施設 I
施設 III 施設 IV 施設 V 施設 VI
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査
日本組織適合性学会 QCWS 参加施設のデータ例
同一検体を用いて FlowPRA Screening Test Class I を行った際の、QCWS 参加施設のヒスト
グラム(raw data)。同一の血清を用いたにもかかわらず、様々なヒストグラムが得られ
る。
各施設の機器においてピークの出方や波形の傾向を把握することによって、弱陽性の抗 HLA
抗体反応や非特異反応を見つけることができ、検査の精度を上げることができる。
(日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ 引用)