MÉTODOS MICROSCÓPICOS PARA LA ESTIMACIÓN DE EDAD A LA MUERTE:

ANÁLISIS HISTOMORFOMÉTRICO

Desántolo, B.; García Mancuso, R.; Plischuk, M.; Salceda, S.; Inda, A.

I TALLER NACIONAL DE BIOARQUEOLOGÍA Y PALEOPATOLOGÍA

La histomorfometría o histología cuantitativa

(Robling y Stout, 2000) es la cuantificación de la microestructura del tejido óseo. A través del recuento y medición de las características histomorfológicas se puede obtener información acerca del recambio óseo (remodelación), de la microarquitectura y de la actividad celular dinámica y estática (Crowder y Stout, 2012).

La estimación histológica de la edad se basa en el grado de remodelación ósea…

Unidad Estructural Básica (BSU)u osteona

Fuchs et al. 2012

Dado que la remodelación es un proceso que

transcurre durante toda la vida, desde el nacimiento

hasta la muerte, permite observar la asociación entre

el número de osteonas y la edad cronológica

constituyendo la base primaria de los métodos

histológicos de estimación de edad (Stout 1989,

Robling y Stout 2008).

Robling y Stout, 2008Robling y Stout, 2008

Robling y Stout, 2008

Robling y Stout, 2008

MATERIAL y MÉTODOS La muestra analizada pertenece a la “Colección

Lambre” FCM- UNLP (Salceda et al. 2009 RAAB 11 (1): 133; Salceda et al., 2012 HOMO 63 (4).

Está integrada por 71 fémures de individuos adultos con datos fehacientes de edad y sexo.

Las piezas que presentaron algún signo de patología fueron excluidas.

Sexo N = 71 Rango Media

Femenino 21 26 - 88 59.68

Masculino 50 22 - 91 58.67

ANÁLISIS HISTOMORFOMÉTRICO

I. Extracción II. Preparación de la muestra III. Observación y cuantificación de variables

histomorfométricas.

I. EXTRACCIÓN

Las muestras se obtuvieron a partir de la remoción de tejido cortical de la mitad anterior de la diáfisis femoral, tal y como sugieren estudios previos analizados (Thompson 1979; Ericksen 1991, Maat et al. 2001, 2006; Keough 2007).

II. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Fueron procesadas por técnica de desgaste modificada en adecuación a los estudios histomorfométricos (Vasallo y Restelli, 2000) y siguiendo las recomendaciones de Maat y col. (2001).

TÉCNICA DE DESGASTE MANUAL (Maat y col. 2001)

La misma consiste en la reducción del espesor del tejido duro (hueso) a fin de poder observarlo microscópicamente:

Corte de lámina con sierra manualLavado Pulido (piedra de afilar y lija al agua n° 220)Control periódico al microscopio Espesor óptimo Montaje Secado (48 hs a 37° C aprox.)

III.EVALUACIÓN HISTOMORFOMÉTRICA

Para la observación microscópica se empleó microscopio de campo claro Iroscope (Mod. BW 3T) y los preparados se examinaron con objetivo 10X y ocular 10X provisto de una grilla de 10 mm de lado y acondicionada con una escala micrométrica (Zeiss). Para el análisis y cuantificación de las variables se seleccionaron cuatro campos microscópicos subperiostiales.

VARIABLES MICROESTRUCTURALES

nº total de osteonas fragmentarias ost_frag

nº promedio de lamelas por osteona lam_ost

promedio del diámetro del canal de Havers (µm) hav_can

espacios de resorción res_spac

porcentaje de osteonas fragmentarias % ost_frag

porcentaje del área osteonal % ost_bone

porcentaje de hueso fragmentado % frag_bone

nº total de osteonas tot_ost_meaKerley y Ubelaker 1978; Singh y Gunberg 1970; Ericksen 1991, Vasallo et al. 2000

DIFICULTADES

T. DESGASTE MANUAL

• Deterioro del material.• Pérdida de información. • Sesgo en la observación

y cuantificación. • Microfracturas y

microgrietas. • Restos con buen estado

de conservación.

OBSERVACIÓN Y CUANTIFICACIÓN

• Poco precisa• Cambios en los oculares• Movimientos de la

platina • Limitada en cuanto a la

cuantificación de ciertas variables.

• Imposibilidad de medir el mismo campo.

SEGUNDA ETAPA Debido a las dificultades especificadas

testeamos otra técnica de preparación para hueso calcificado: la inclusión en medios plásticos duros (resina epoxi)

Entrenamiento en el uso de programas informáticos para el procesamiento de imágenes y cuantificación de variables histomorfométricas.

TÉCNICA INCLUSIÓN EN RESINA Procesamiento de las muestras• Infiltración: la muestra se sumerge en un molde con

resina epoxi (Dicast LY 554 con endurecedor HY 554) 24 a 36 hs.

• Pulido con abrasivos en polvo (carburo de silicio, corindón, alúmina) de diferentes granulometrías.

• Secado: Horno a 35° C, 3 horas. Obtención de las secciones• Se realiza mediante sistemas de corte (disco

diamantado), desbastado y pulido (1 mm). • Montaje: la lámina se cubre con resina epoxi o un

adhesivo plástico fotosensible para evitar la formación de burbujas. Laboratorio Geológico del Lic. Ricardo Ponti

EVALUACIÓN HISTOMORFOMÉTRICA

Fotomicroscopio Trinocular Nikon (Mod. Eclipse E200) equipado con una cámara digital Nikon (Mod. Coolpix S10).

Se seleccionaron y fotografiaron cuatro campos microscópicos por sección.

Las microfotografías se procesaron y analizaron con un analizador de Imágenes, Software Image Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics).

T. Inclusión en resina

• Mantiene la integridad de la muestra, por lo tanto no se producen grietas ni hay perdida de información.

• Estabilidad de los preparados durante períodos largos de almacenamiento.

Microfotografías

• Documento verificable• permanente• libre de cambios de los

oculares y de movimientos de la sección delgada, que hacen confundir el campo visual original.

DISCUSIÓN Los métodos microscópicos requieren más

tiempo, equipamiento y mayor conocimiento específico de técnicas histológicas; además, implican destrucción parcial del material.

A diferencia de los métodos macroscópicos, los microscópicos son de gran utilidad aun cuando los restos se encuentren fragmentados o incompletos (Bednarek, 2008; Franklin, 2010).

Diferenciación interespecífica entre hueso humano-no humano.

En contextos arqueológicos…

Limitaciones en cuanto al área de muestreo: Desgaste superficial por agentes tafonómicos.

Alternativa: Análisis de la región endostial (Hauser et al.

1980, Pfeiffer et al. 1995).

CONSIDERACIONES FINALES Describir detalladamente la muestra de referencia (edad, sexo,

n, composición étnica).

Identificar precisamente el hueso analizado y el área seccionada.

Considerar las tasas diferenciales de remodelación para cada pieza ósea analizada.

Indagar sobre los factores que afectan la remodelación, y consecuentemente las estimaciones: sexo, actividad física, variación poblacional y condiciones patológicas.

Considerar a la histomorfometría como un método complementario auxiliar de los análisis macroscópicos.

CONSIDERACIONES FINALES

Validar los métodos de estimación de edad en muestras independientes y de edad conocida a fin de determinar su exactitud y precisión.