Herramientas para el diagnóstico, seguimiento y tratamiento en

Hepatitis B

Fabián Fay

CIBIC

Rosario – Argentina

ffay@cibic.com.ar

HBV - Marcadores Serológicos

� HBsAg: Antígeno de Superficie

� Anti-HBc (total): Anticuerpo anti-core total

� Anti-HBc (IgM): Anticuerpo anti-core a clase IgM

� Anti-HBs: Anticuerpo anti-HBs

� HBeAg: Antígeno e

� Anti-HBeAg: Anticuerpo anti-e

HBV - Marcadores Moleculares

► HBV-DNA cualitativo.

► HBV-DNA cuantitativo – Carga Viral.

► Mutantes de Resistencia a antivirales.

► Genotipos de HBV.

► TAN en banco de sangre.

HBV - Marcadores Moleculares

Hepatitis B

• Importante establecer:

– Hepatitis Aguda vs Hepatitis crónica

– En Hepatitis crónicas: estratificación del – En Hepatitis crónicas: estratificación del

estado de replicación viral

– Respuesta a tratamiento antiretrovirales y

desarrollo de resistencia

– Estado de replicación residual.

– Marcadores subrogantes del ccc-DNA del

HBV

Ciclo Replicativo del HBV

Marcadores de HBV

HBV Aplicación

Anti-HBs Inmunidad

Anti-HBcore ExposiciónAnti-HBcore Exposición

HBsAg Infección

HBeAg Replicación

IgM-Anti-HBcore Infeccion aguda -Enfermedad

HBV-DNA

HBV-DNA

HBV-DNA

HBsAg y antiHBc

¿ Cómo comenzar el diagnóstico de una infección por HBV ?

1) HBsAg -anti-HBc -

2) HBsAg +antiHBc +

3) HBsAg +antiHBc -

4) HBsAg -antiHBc +

1) HBsAg -anti-HBc -

Sin contacto con HBVcon HBV

Analizar Vacunación

2) HBsAg +antiHBc +

Caso confirmado de

Hepatitis B.

Anti HBc IgM

Reactivo

Infección aguda por

HBV

No reactivo

Infección crónica por

HBV

3) HBsAg +antiHBc -

Repetir en nueva muestra y/o en 30

dias HBsAg

anti-HBc

Caso probable de infección por HBV

Resultado reactivo para ambos marcadores, pasa al esquema anterior

HBsAg +antiHBc -

Evaluar status replicativo

Resultado negativo para ambos marcadores

Caso DESCARTADO

4) HBsAg -antiHBc +

antiHBs

Reactivo

Hepatitis B resuelta (infección pasada)

No reactivo

Vacunar

Síntomas

HBeAg anti-HBe

anti-HBc (Total)

IgM anti-HBcanti-HBsHBsAg

HBV-DNA

Repetir Anti HBs a los 30 días post primera dosis.

Reactivo

Hepatitis B resuelta (infección pasada)

No reactivo

(Puede repetirse el proceso con una segunda dosis de vacuna)

antiHBc"aislado"

Carga viral HBV

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100

Diagnóstico de Hepatitis BMarcadores de Tamizaje: HBsAg y Anti-HBc

IgGHBsAg (-)Anti-HBCore (-)

HBsAg (+)Anti-HBCore (+)

HBsAg (+)Anti-HBCore (-)

HBsAg (-)Anti-HBCore (+)

Sin contacto Con HBVEvaluar

Ampliar los estudios(*1)

Poco probableInfección agudaTemprana o

Infección por HBVVer si es agudaAnti-HBc IgMEvaluar

VacunaciónTemprana o Falso Positivo oContaminación

Anti-HBc IgMSi Anti-HBc IgM (-)

Evaluar status crónico de la infección

¿Qué marcadores usar para caracterizar una

Hepatitis B crónica?

• HBeAg

• Anti HBeAg

• HBV-DNA cuantitativo.• HBV-DNA cuantitativo.

Las 4 Fases de la infección Crónica por HBV

� Fase de Inmuno-tolerancia

◦ HBeAg positivo; alto HBV DNA (2 x 108-11 IU/mL); ALT normal

� Hepatitis Crónica HBeAg-positivo (inmuno clearance)

◦ Intermedio a alto HBV DNA (200,000 - 2 x 109 IU/mL); ALT alta o fluctuante; inflamación activa en biopsia hepática

� Portador Inactivo de HBsAg (fase de baja replicación)◦ HBeAg negativo; bajo HBV DNA (< 2000 IU/mL); ALT normal

◦ HBsAg puede volverse indetectable

� Hepatitis Crónica HBeAg-negativo (fase de reactivación)

◦ Intermedio a alto HBV DNA (200,000 - 2 x 109 IU/mL); ALT alta o fluctuante; inflamación activa en biopsia hepática. HBeAg negativo con o sin Anti-HBe.

Lok AS, et al. Hepatology. 2007;45:507-539.

Pungpapong S, et al. Mayo Clin Proc. 2007;82:967-975.

< <> >HBeAg+ HBeAg-/anti-HBe+ (precore/core promoter variants)

HBV DNA

Immune

Tolerance

Immune

Clearance

Low Replicative

Phase

Reactivation

Phase

< 2000 IU/mL

> 2000 IU/mL

2 x 108 -2 x 1011 IU/mL 200,000 - 2 x 109 IU/mL

Las 4 Fases de la infección Crónica por HBV

ALT

Normal/mild CH

Moderate/severe CH Moderate/severe CHNormal/mild CH

CirrhosisCirrhosis Inactive cirrhosis

2 x 1011 IU/mL 200,000 - 2 x 109 IU/mL

Inactive-carrier state HBeAg-chronic hepatitis

HBeAg+ chronic hepatitis

Estratificación de las Hepatitis

crónicas a HBV

Hepatitis Crónica HBeAg-Negativo

Portador Inactivo

HBsAg positivo � �

Anti-HBe positivo � �

HBV Crónica HBeAg-Negativo vs Status de portador inactivo

Anti-HBe positivo � �

Anti-HBc positivo � �

HBV DNA > 2000 IU/mL* < 2000 IU/mL

ALT Elevada† Normal

*Fluctuaciones menores a < 2000 IU/mL pueden ocurrir.† Pueden ser elevadas en forma permanente o intermitente.

Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2008;6:1315-1341.

Niveles de HBV-DNA en suero en diferentes status de la infección

Herramientas moleculares en HBV

• Detección del HBV-DNA

– Cualitativo

– Cuantitativo – Carga Viral

• Detección de mutaciones de resistencia al • Detección de mutaciones de resistencia al tratamiento con antivirales

• Determinación del Genotipo de HBV

• Nuevos horizontes: ccc-DNa, marcador subrogante del ccc-DNA, poblaciones minoritarias, fenotipos de HBV y su impacto en el tratamiento

Detección del HBV-DNA en suero

• Métodos cualitativos: HBV-DNA PCR

– Resultado de tipo SI-NO

• Métodos cuantitativos: Carga Viral de HBV• Métodos cuantitativos: Carga Viral de HBV

– Resultado númérico expresado en UI/ml

Sondas y primers para la detección de HBV-DNA en suero

Deben estar dirigidas a regiones altamente conservadas del genoma de HBV

Estas regiones no deben contener ninguna porción del gen S o del gen de la polimerasa que potencialmente pueden ser afectadas por mutaciones que aparezcan como consecuencia de la resistencia a drogas

Detección de HBV-DNA cualitativo

• Aplicaciones:– Definición de replicación activa del HBV en pacientes con

patrón compatible con infección crónica

– Definición de infección HBV oculta (HBsAg negativa)

– Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral– Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral

• Métodos: comerciales, no comerciales

• Límites de detección: 5 - 50 copias/ml (contra que standards? Como se compara entre laboratorios?)

• Aplicación principal: TAN en bancos de sangre con métodos comerciales específicos para este objetivo diagnóstico

Detección de HBV-DNA cuantitativo –

Carga Viral

� Permite detectar y cuantificar la viremia

� Sólo se utilizan métodos comerciales

� Estandardización de las unidades de cuantificación delHBV DNA en UI/ml

� La alta sensibilidad de métodos como Taqman permiten usarlo como test cualitativos (Sensibilidad analítica de 6 UI/ml)

Carga Viral de HBVEnsayos HBV DNA disponibles

Aspectos importantes a tener en cuenta en métodos cuantitativos

• Siempre usar el mismo método cuando se maneja a un mismo paciente.

• Nunca informar valores mayores a un límite, sino realizar diluciones hasta obtener el valor real.realizar diluciones hasta obtener el valor real.

• El ensayo es lineal en log/log. Si bien los ensayos se informan en copias el valor a comparar debe ser el valor en logs. Diferencia de carga viral con implicancia clínica: > a 1 log.

Utilidad clínica de la medición del HBV-DNA durante el tratamiento

Predecir respuesta

Eleccion del tratamiento

Monitorear eficacia Monitorear respuesta

Ciclo Replicativo del HBV

SITIO DE ACCIÓN DE LOSANTIVIRALES

Los análogos nucleósidos son moléculas virostáticas.

Al inhibir la acción de la polimerasa del HBV, impiden la

liberación de nuevos virus, pero no frenan la síntesis de

proteínas virales ni atacan el pool de ccc-DNA

La eliminación definitiva del HBV sólo puede llevarse a cabo

Acción de los antivirales (inhibidores de la RT)

La eliminación definitiva del HBV sólo puede llevarse a cabo

si la respuesta inmune del paciente es los suficientemente

fuerte en el contexto de una potente inhibición de la

producción del HBV.

Toda variante de escape de la polimerasa al antiviral,

permite aumentar el pool de ccc-DNA pero además,

conteniendo dichas variantes de escape

Acción de los antivirales (inhibidores de la RT)

Pre-Rx Intra Rx Fin Rx SeguimientoR NR RS Resistencia

HBsAg + + + + +/- +

HBeAg + + - + - +

Efecto de análogos nucleosídicos sobre los marcadores virales. Ejemplo: HBeAg(+)

HBeAg + + - + - +

Anti-HBe - - + - + -

Carga Viral Alta ND ND Alta ND Alta

Anti-HBc + + + + + +

Anti-HBs - - - - -/+ -

Breaktrough virológico: rebote de la carga viral sérica en mas de

1 log10 por encima del límite de detección (nadir)

Resistencia genotípica: detección de mutaciones conocidas por

conferir resistencia durante la terapia

Breaktrough virólogico con resistencia genotípica: rebote en la

Evaluación de respuesta en análogos de alta barrera genética - Definiciones

Breaktrough virólogico con resistencia genotípica: rebote en la

carga viral, asociado a mutaciones causantes de resistencia

antiviral.

No Respuesta primaria (fracaso primario): la carga viral luego de

los 3 meses de tratamiento, no disminuyó mas de 1 log10

respecto al valor normal.

Respuesta parcial o sub-óptima: la dismunición de la carga viral

durante el tratamiento no lo transforma en no detectable Zoulim & Perillo, J Hepatol 2008; EASL CPG, J Hepatol 2009

Evaluación de respuesta en análogos de alta barrera genética

-HB

V

0

-1.0

1.0

“breakthrough”virológico

Drogas antivirales

Respuesta primaria o fracaso primario

Lok AS, et al. Hepatology. 2007;45:507-539.

1 logCam

bio

s e

n e

l DN

A-

(lo

g 10

UI/

mL)

-1.0

-2.0

-3.0

-4.0 Nadir

Meses

60 12 18

Respuesta subóptima

Respuesta Virológicacompleta o subótima

3

Mutaciones asociadas a desarrollo de resistencia a antivirales

Virológica

Bioquímica

Resistencia

22

ALTHBVDNA

33

DNA

Limite dedetección

Año 1 Año 2 Año 3Início

Genotípica11

Aumento>1 log

Resistencia fenotípicaConfirmaçión in vitro de que una mutación disminuye su eficacia al tratamiento

Tecnologías utilizadas para el seguimiento de pacientes con

antivirales y definición de patrones de resistencia

Secuenciación : gold-standardSecuenciación : gold-standard

INNO-LiPA HBV Drug Resistance Assay

PCR-RFLP para búsqueda de

mutaciones mas comunes en el sitio

YMDD

INNO-LiPA HBV DR Assay

– Puede detectar polimorfismos en:

• codones 528, 552 y 555 de HBV pol

• codones 171, 172, 195, 196, • codones 171, 172, 195, 196, 198 y 199 de HBsAg

– Altamente sensible y fácil de usar

• Permite detectar mutaciones YMDD 3-6 semanas antes de la secuenciación

Mutaciones del HBsAg secundario a mutaciones en la polimerasa

Cepas resistentes a Drogas y su implicancia en la Salud Pública general

Pueden infectar a personas no vacunadas (naïve) (anti-HBs-)

Individuo con HBV Crónica tratado con análogos de nucleós(t)idos

Selección de mutantes que no son protegidos por la vacunación

Pueden infectar a personas inmunizadas contra la Hepatitis B (anti-HBs+)

1 Thibault V, et al. AIDS 2002; 16: 131-133

2 Torresi J, et al. Virology 2002; 293: 305-313

Genotipos HBVExisten descriptos 8 genotipos de

HBV: A – H

Para su definición debe existir una

diferencia > 8% en su secuencia

completa.

Difieren en la distribución Difieren en la distribución

geográfica

Están asociados a diferentes

frecuencia y patrones de

mutaciones del HBV

Contribuye a las variaciones

epidemiológicas, de historia

natural, resolución clínica, eficacia

del tratamiento en diferentes

partes del mundo

Genotipos HBV

Potenciales diferencias biológicas entre los

genotipos de HBV

Tasa de replicación del HBV

Eliminación natural del HBeAg.

Expresión y reconocimiento de los epitopes inmunes.

Evolución de la enfermedad Hepática

Patogénesis

Asociación con desarrollo de cirrosis y hepatocracinoma

Sensibilidad a la terapia antiviral.

Genotipo HBV

• Metodología de determinación:– Gold Standart: secuenciación,

puede ser tanto del genoma completo como de una región

HBV Genotyping

Line Probe Assay

marker line conj. control amp. control

Genotype A

12345completo como de una región

particular (HBsAg, HBCore/HBeAg, HBV-pol)

– Para la aplicación clínica se utilizan técnicas mas simples como RFLP o InnoLipa.

Genotype B

Genotype C

Genotype D

Genotype E

Genotype F

Genotype G

56789

101112131415161718Genotype H

La determinación del genotipo de HBV no tiene hoy

aplicación clínica

No se ha incluido su determinación en ninguna guía

de consenso

Su aplicación como herramienta prospectiva en el

Genotipo HBV

Su aplicación como herramienta prospectiva en el

seguimiento de la historia natural y la respuesta a los

tratamientos disponible demostrará en un futuro si

puede alcanzar la importancia potencial que se le

asigna.

La utilización de la secuenciación para resistencia

permite definir el genotipo de HBV infectante

Nuevos horizontes en la biología molecular aplicada al HBV

Detección y cuantificación del ccc-HBV-DNA

HBsAg cuantitativo: Marcador subrogante de ccc-

HBV-DNA?

Detección de variantes minoritarias de escape al

tratamiento

Fenotipo HBV – Ensayo biológico

Valores indetectables de HBV-DNA sérico, aún con

ensayos de alta sensibilidad, no implican la ausencia o

clearence de los virus ni de la infección viral

La evaluación de la carga viral en diferentes

¿ HASTA DONDE HEMOS LLEGADO HOY EN LA APLICACIÓN DE LABIOLOGÍA MOLECULAR

EN EL MANEJO CLÍNICO?

La evaluación de la carga viral en diferentes

momentos del tratamiento es utilizada como

marcador de efectividad de la actividad antiviral y la

persistencia de la respuesta

Hasta el momento, no existen marcadores que

identifiquen el logro de que el sistema inmune del

paciente logra controlar efectivamente la infección

viral y el progreso de la enfermedad

ccc-HBV-DNASu detección es dificultosa

– Tipo de muestra: biopsia de hígado

– Cuantificación: copias/células

– Estandarización técnica

– Homogeneidad de su expresión en tejido.

NECESIDAD DE UN MARCADOR SÉRICO SUBROGANTE

ALTERNATIVA EN ESTUDIO HBsAg CUANTITATIVO

Serum

HBV-DNA HBsAg

Viriones Viriones

Replicación

+ Partículas defectivas

(exceden a los viriones por un factor de 103 a 105)

Replicación Transcripción del ccc-DNATraslación del mRNATraslación del mRNA

Disminución del nivelDel HBV-DNA sérico

Reducción de la replicación

Disminución del nivelDel HBsAg sérico

Reducción de la cantidad de ccc-DNAReducción de la transcripción de ccc-DNA

Reducción de la traslación del m-RNA

MARCADOR DE REPLICACIÓN VIRAL

MARCADOR DEccc-DNA ACTIVO

Nuevos Horizontes

Detección de variantes minoritarias: impacto de las

nuevas tecnologías (Next Generation Sequencing)

que permitirán detectar poblaciones en % inferiores

al 1%al 1%

Ensayos biológicos de fenotipos del HBV, permitirán

correlacionar los hallazgos genotípicos minoritarios

con respuesta biológica y sentido clínico de las

mismas.

Muchas Gracias.