Helicobacter pylori pergeseran keseimbangan pemberantasan monosit reseptor Fcγ terhadap FcγRIIB hambat pada pasien purpura trombositopenik kekebalan

Atsuko Asahi 1, 2, Tetsuya Nishimoto 1, Yuka Okazaki 1, Suzuki Hidekazu 3, Tatsuhiro Masaoka 3, Yutaka Kawakami 4, Yasuo Ikeda 2 dan Masataka Kuwana 1

Pertama kali diterbitkan 24 Juli 2008

Diterima untuk publikasi November 14, 2007, dan diterima dalam bentuk revisi 14 Mei 2008.

Immune trombositopenia purpura (ITP) adalah gangguan perdarahan yang spesifik autoantibodies platelet menyebabkan kehilangan platelet. Dalam subset dari pasien dengan ITP dan terinfeksi dengan Helicobacter pylori, jumlah platelet pulih setelah pemberantasan H. pylori. Untuk menguji peran H. pylori infeksi pada patogenesis ITP, tanggapan dari 34 pasien ITP untuk pengobatan dengan standar H. pemberantasan pylori regimen, terlepas dari apakah mereka terinfeksi H. pylori, dievaluasi. Pemberantasan H. pylori dicapai di semua H. -Positif pasien pylori, dan peningkatan yang signifikan dalam platelet diamati dalam 61% dari pasien. Sebaliknya, tidak ada H. -Negatif pasien pylori menunjukkan platelet meningkat. Pada awal, monosit dari H. -Positif pasien pylori menunjukkan kapasitas fagositik ditingkatkan dan tingkat rendah hambat reseptor Fcγ IIB (FcγRIIB). Satu minggu setelah memulai H. rejimen pemberantasan pylori, ini fenotipe monosit aktif adalah ditekan dan perbaikan dalam parameter kinetik platelet dan autoimun diikuti. Modulasi saldo FcγR monosit juga ditemukan dalam hubungan dengan H. pylori infeksi pada orang yang tidak memiliki ITP dan pada tikus. Temuan kami sangat menyarankan agar pemulihan dalam jumlah trombosit yang diamati pada pasien ITP setelah H. pylori pemberantasan ditengahi melalui perubahan dalam keseimbangan FcγR menuju FcγRIIB hambat.

Lihat Komentar awal terkait pada halaman 2677 .

Pengenalan

Immune trombositopenia purpura (ITP) adalah gangguan otoimun yang disebabkan oleh clearance platelet-platelet meningkat autoantibodies anti ( 1 ). Pada tahun 1998, Gasbarrini et al. melaporkan peningkatan jumlah platelet pada pasien ITP terinfeksi Helicobacter pylori sukses pemberantasan setelah bakteri ini ( 2 ). mengumpulkan bukti terbaru di Italia dan Jepang menunjukkan bahwa pemberantasan H. pylori efektif dalam meningkatkan jumlah platelet dalam hampir setengah H. pylori pasien terinfeksi dengan ITP idiopatik ( 3 , 4 ). Selain itu, sebuah laporan baru-baru ini menunjukkan bahwa respon platelet berlangsung selama bertahun-tahun dan kasus kambuh sedikit ( 5 ). Berdasarkan kemanjurannya, profil keamanan yang baik, dan biaya rendah, H. pylori terapi untuk dewasa ITP pemberantasan menjadi sangat populer di beberapa negara. Beberapa peneliti telah menyarankan bahwa keberhasilan H. pemberantasan pylori pada pasien ITP ini dimediasi oleh H. pylori-independen mekanisme, seperti efek imunomodulator obat yang dipakai untuk rejimen tersebut ( 3 ), tapi kami baru-baru ini melaporkan tidak lengkap keberhasilan dalam H. pylori tidak terinfeksi ITP pasien dalam sebuah studi prospektif di mana pasien dirawat dengan standar H. pemberantasan pylori rejimen terlepas dari mereka H. infeksi pylori status ( 6 ). Penemuan ini jelas menunjukkan bahwa pemulihan platelet diamati pada pasien ITP setelah hasil rejimen pemberantasan dari hilangnya H. pylori sendiri.

Beberapa hipotesis telah diusulkan mengenai mekanisme oleh H. mungkin pylori menginduksi perkembangan ITP. Satu adalah bahwa Abs H. komponen pylori lintas bereaksi dengan antigen permukaan platelet. Dalam hal ini, Takahashi et al. melaporkan bahwa platelet eluat dari H. pylori-positif ITP pasien mengakui terkait gen cytotoxin A (CagA), salah satu H. pylori yang diturunkan dari protein yang menentukan virulensi bakteri ( 7 ), meskipun kelompok lain menunjukkan bahwa platelet eluat dari H. pylori-positif ITP pasien yang bereaksi dengan glikoprotein IIb / IIIA (GPIIb / IIIA) atau GPIB gagal mengenali H. pylori antigen ( 8 ). Mekanisme potensial lain adalah modulasi yang sistem kekebalan host oleh H. pylori dengan cara yang mendorong munculnya sel B autoreactive ( 9 ). Namun, tidak ada perbedaan yang signifikan antara H. pylori-positif dan H. -Negatif individu pylori telah ditemukan untuk organ-spesifik otoantibodi tanggapan-non, seperti anti-nuklir, microsome, atau anti-halus otot Abs-anti ( 10 ). Meskipun temuan ini, peran H. infeksi pylori dalam patogenesis ITP tetap jelas. Ini berfokus pada studi sebelumnya Ab produksi platelet anti-sama dengan H. pylori infeksi, tetapi potensi efek H. pylori infeksi pada proses clearance platelet pada pasien ITP belum dinilai. Dalam studi ini, untuk menjelaskan mekanisme yang bertanggung jawab untuk pemulihan trombosit pada pasien ITP setelah sukses pemberantasan H. pylori, kami melakukan studi prospektif di mana faktor-faktor lainnya yang berhubungan dengan proses patogenik dari ITP, yaitu, respon autoimun terhadap antigen platelet utama GPIIb / IIIA, parameter yang terkait dengan omset platelet, dan dan fungsional sifat fenotipik fagosit, adalah seri diukur ITP pada pasien yang diobati dengan rejimen standar pemberantasan, terlepas dari mereka H. pylori status infeksi. Temuan kami menunjukkan bahwa pemulihan platelet diamati pada pasien ITP setelah H. pemberantasan pylori berhubungan dengan modulasi dari saldo reseptor Fcγ monosit terhadap reseptor hambat Fcγ IIB (FcγRIIB).

Hasil

karakteristik pasien. Tiga puluh empat pasien berurutan dengan ITP (14 pria dan 20 wanita, usia 24-73 th) telah terdaftar dalam label-terbuka ini, penelitian prospektif. H. pylori infeksi terdeteksi pada 23 pasien (68%). Perbandingan pretreatment secara klinis karakteristik H. -Positif dan-negatif pasien pylori (Tabel 1 ) menunjukkan H. -Positif pasien pylori cenderung lebih tua dari H. pylori-negatif pasien (P = 0,08). Beberapa pasien mengambil prednisolone dosis rendah (≤ 7,5 mg setiap hari), tapi tidak ada perbedaan dalam frekuensi atau dosis berarti antara H. pylori-positif dan-negatif pasien. Sejarah splenektomi bermakna kurang sering di H. -Positif dibandingkan dengan pasien pylori H. pylori-negatif pasien, menunjukkan bahwa kasus-kasus refraktori lebih umum di H. pylori-negatif pasien.

Tabel 1

Karakteristik klinis dari 34 pasien ITP menurut ada atau tidak adanya H. pylori infeksi

Kekebalan dan parameter trombosit omset sebelum pengobatan pada pasien ITP dengan dan tanpa infeksi H. pylori. Sebanyak 11 kekebalan dan omset parameter trombosit, termasuk anti-GPIIb/IIIa memproduksi sel-Ab B, terkait anti-GPIIb/IIIa Abs-platelet, tanggapan sel T dipicu oleh GPIIb / IIIA dan toksoid tetanus, proporsi platelet Reticulated, yang thrombopoietin beredar (TPO) tingkat, tingkat ekspresi relatif dari FcγRI, FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB), FcγRIII, dan CD86 pada monosit sirkulasi, dan fagositosis monosit sirkulasi spesifik dibandingkan antara pasien ITP dengan dan tanpa H. pylori infeksi (Gambar 1 ). Kami mengevaluasi proporsi monosit mengungkapkan FcγRIII bukan tingkat ekspresi yang karena hanya sebagian kecil dari monosit darah perifer disajikan FcγR ini.

Gambar 1

Kekebalan dan parameter pergantian platelet sebelum pengobatan pada pasien ITP dengan atau tanpa H. pylori infeksi. anti-GPIIb/IIIa yang memproduksi sel-Ab B, platelet-asosiasi (PA) Abs anti-GPIIb/IIIa, GPIIb / IIIA-respon sel T spesifik, tetanus toksoid-spesifik (TT-spesifik) respon sel T, Reticulated platelet proporsi (% RP), beredar tingkat TPO, ekspresi tingkat FcγRI dan FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB) pada monosit, proporsi monosit FcγRIII-positif, tingkat ekspresi CD86 pada monosit, dan fagositosis spesifik dari monosit dibandingkan antara 23 ITP pasien terinfeksi H. ITP pylori dan 11 pasien yang tidak terinfeksi H. pylori. Ekspresi FcγRII telah diteliti dengan menggunakan klon MAB FLI8.26, yang bereaksi dengan baik FcγRIIA dan FcγRIIB. Perbedaan antara 2 kelompok dianalisis dengan menggunakan uji U-Mann Whitney.

Tidak ada perbedaan pada frekuensi anti-GPIIb/IIIa Ab-sel B memproduksi atau platelet-terkait anti-GPIIb/IIIa Ab tingkat antara 2 kelompok. Sebaliknya, H. Pylori positif pasien menunjukkan respons sel T lebih menonjol GPIIb / IIIA dibandingkan dengan H. -Negatif pasien pylori, dan tidak ada perbedaan dalam tingkat respon terhadap toksoid tetanus, yang mengingat antigen asing tidak relevan. Proporsi Reticulated platelet secara signifikan lebih besar di H. pylori-positif pasien daripada di H. pylori-negatif pasien. Dalam beredar monosit, ekspresi FcγRII, termasuk mengaktifkan FcγRIIA dan FcγRIIB hambat, lebih rendah di H. pylori-positif pasien daripada H. pylori-negatif pasien. Selain itu, ekspresi mengaktifkan FcγRI cenderung upregulated di H. pylori-positif pasien (P = 0,06). Akhirnya, monosit dari H. -Positif pasien pylori menunjukkan kapasitas fagositik disempurnakan dibandingkan dengan yang berasal dari H. pylori-negatif pasien, menyarankan suatu fenotipe monosit diaktifkan mendominasi H. pylori-positif pasien.

respon trombosit terhadap rejimen pemberantasan H. pylori. Semua 34 pasien menyelesaikan hari standar pemberantasan rejimen-7 yang terdiri dari amoksilin, klaritromisin, dan lansoprazole terlepas dari apakah mereka positif untuk H. pylori infeksi. Efek samping potensial yang terkait dengan terapi diamati pada 10 pasien (29%): sakit perut dan / atau diare pada 9 dan ruam kulit dalam 1. Semua gejala diselesaikan dengan cepat setelah rejimen berakhir. Pemberantasan berhasil di semua 23 H. pylori-positif pasien, dan 14 (61%) dari mereka diklasifikasikan sebagai responden. Sebaliknya, tak satu pun dari 11 H. -Pasien pylori negatif menunjukkan jumlah trombosit meningkat. Frekuensi ini berbeda secara nyata (P = 0,001). platelet menghitung 0, 12, dan 24 minggu setelah memulai rejimen pemberantasan di H. pylori-positif responden dan nonresponders, dan H. -Negatif pasien pylori diperlihatkan pada Gambar 2 . Beberapa H. -Positif nonresponders pylori menunjukkan sedikit peningkatan dalam jumlah platelet, tetapi hampir tidak ada fluktuasi jumlah platelet diamati di H. pylori-negatif pasien. Selama periode 24 minggu, dosis prednisolone berkurang dalam 2 responden pada 12 minggu (7,5-5 mg dan 5 sampai 2,5 mg), tetapi stabil dosis diberikan pada pasien yang tersisa.

Gambar 2

Serial jumlah platelet sebelum dan setelah inisiasi dari H. rejimen pylori pemberantasan dalam 14 H. pylori-positif ITP responden, 9 H. pylori-positif ITP nonresponders, dan 11 H. pylori-negatif ITP nonresponders dan. Perubahan secara absolut nilai 12 24 minggu dari nilai awal diambil di wk 0 dinilai dengan uji t berpasangan. * P <0,01 dibandingkan dengan minggu 0.

Serial perubahan dalam kekebalan dan omset parameter trombosit setelah eradikasi H. pylori dan. kekebalan parameter omset platelet diukur sebelum perlakuan diperiksa seri 12 dan 24 minggu setelah memulai rejimen pemberantasan di H. pylori-positif responden dan nonresponders dan di H. pylori-negatif pasien (Gambar 3 ). The Ab B memproduksi sel-anti-GPIIb/IIIa dan terkait anti-GPIIb/IIIa Abs-trombosit sangat berkurang pada 12 dan 24 minggu di H. pylori-positif responden. Proporsi platelet Reticulated juga sangat berkurang di H. pylori-positif responden. tetapi lemah tren yang serupa diamati di H. pylori-positif nonresponders tetapi tidak di H. pylori-negatif pasien. T sel darah perifer tanggapan terhadap GPIIb / IIIA cenderung ditekan dalam H. pylori-positif responden (P = 0,09), sedangkan tidak ada fluktuasi dalam penanggulangan toksoid tetanus. Dalam monosit dari H. -Positif responden pylori, dasar mereka upregulated ekspresi FcγRI menurun dan FcγRII downregulated (FcγRIIA ditambah FcγRIIB) ekspresi meningkat menjadi tingkat monosit dari H. pylori-negatif pasien setelah H. pemberantasan pylori. Sebaliknya, proporsi monosit FcγRIII-positif dan tingkat ekspresi CD86 pada monosit yang stabil dalam semua 3 kelompok selama masa studi. Kapasitas fagositosis monosit yang disempurnakan dalam H. -Positif responden pylori secara signifikan berkurang setelah H. pylori pemberantasan, mencapai tingkat H. pylori-negatif pasien. Perubahan-perubahan dalam monosit fenotipe tidak diamati dalam H. pylori-positif nonresponders atau di H. pylori-negatif pasien. IgG anti-CagA tingkat Ab dikurangi secara bertahap mengikuti rejimen pemberantasan di H. -Positif pasien pylori terlepas dari respon platelet, tetapi sampel masih positif untuk anti-CagA Ab bahkan pada 12 dan 24 minggu, waktu jumlah platelet hampir sepenuhnya pulih.

Gambar 3

Serial pengukuran parameter kekebalan dan omset platelet sebelum dan setelah H. pemberantasan H. pylori dalam 14 pylori-positif ITP responden, 9 H. pylori-positif ITP nonresponders, dan 11 H. pylori-negatif ITP nonresponders Ab. memproduksi B-sel Anti-GPIIb/IIIa, platelet-terkait anti-GPIIb/IIIa Abs, GPIIb / IIIA-respon sel T spesifik, tetanus toksoid-respon sel T spesifik, proporsi platelet Reticulated, beredar TPO tingkat, tingkat ekspresi FcγRI dan FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB) pada monosit, proporsi monosit FcγRIII-positif, tingkat ekspresi CD86 pada monosit, spesifik fagositosis monosit sirkulasi, dan Ab anti-CagA tingkat diukur sebelum perlakuan dan 12 dan 24 minggu setelah inisiasi dari H. pylori pemberantasan rejimen. Ekspresi FcγRII telah diteliti dengan menggunakan klon MAB FLI8.26, yang bereaksi dengan baik FcγRIIA dan FcγRIIB. Hasil akan ditampilkan sebagai SD + berarti. Perubahan nilai pada 12 dan 24 minggu dari nilai awal diukur pada minggu 0 dinilai dengan uji t berpasangan. garis putus-putus menunjukkan memotong-nilai: 2.0 untuk sel anti-GPIIb/IIIa B Ab-memproduksi; 3,3 U untuk Abs anti-GPIIb/IIIa platelet-asosiasi; 2,0% untuk% RP; dan 7,5 U untuk anti-CagA Ab. † P <0,1, * P <0,05, dan ** P <0,01 dibandingkan dengan minggu 0.

Dalam H. pylori-positif responden, setelah pemberantasan H. pylori, parameter untuk T dan tanggapan sel B untuk antigen platelet dan platelet omset meningkat, dan monosit fenotipe diaktifkan ditindas, karena jumlah trombosit meningkat. Untuk menguji parameter yang diubah pertama, kami lebih lanjut dievaluasi parameter tersebut pada 1 minggu, ketika pemberantasan rejimen baru saja berakhir, dalam 14 H. pylori-positif responden (Tabel 2 ). Hitungan platelet nyata meningkat pada 1 minggu, konsisten dengan laporan sebelumnya ( 5 ). Pada titik waktu ini, kapasitas fagositik monosit adalah parameter-satunya yang berubah dari tingkat pretreatment nya.

Tabel 2

Serial pengukuran terkait parameter ITP sebelum dan 1 minggu setelah H. rejimen pylori pemberantasan dalam 14 H. pylori-positif responden

Dalam 3 H. pylori-positif pasien yang tidak diobati dan yang platelet count adalah> 50 × 10 9 / l pada awal penelitian, 2 orang responden dan 1 sisanya nonresponder seorang. Saat ini 3 pasien dikeluarkan dari analisis, hasil sesuai mengenai perubahan fenotipe monosit diperoleh.

Perubahan FcγRIIA / saldo IIB dari monosit setelah pemberantasan H. pylori. Pada manusia, 2 jenis FcγRII disajikan pada monosit: suatu reseptor mengaktifkan, FcγRIIA, dan reseptor hambat, FcγRIIB ( 11 ). Karena domain ekstraselular dari FcγRIIA dan FcγRIIB sangat homolog, kami mengukur tingkat ekspresi mRNA dari FcγRIIA dan FcγRIIB pada monosit diurutkan secara independen, dengan PCR kuantitatif, menggunakan primer spesifik untuk domain intraseluler FcγRs ini. Hasil penelitian menunjukkan bahwa FcγRIIA / IIB rasio ekspresi mRNA secara signifikan lebih tinggi dalam H. pylori-positif daripada H. pylori-negatif pasien sebelum pengobatan (Gambar 4 A). Dalam H. pylori-positif responden, yang FcγRIIA / IIB rasio secara bermakna menurun pada 1 dan 12 minggu, tetapi perubahan ini tidak diamati di H. pylori-positif nonresponders atau di H. pylori-negatif pasien (Gambar 4 B). Ketika ekspresi protein pada monosit FcγRIIB diperiksa oleh flow cytometry menggunakan MABs spesifik ke domain intraseluler dari molekul ini, ekspresi FcγRIIB meningkat di 12 minggu di perwakilan H. pylori-positif responden tetapi tidak dalam nonresponder (Gambar 4 C). Akibatnya, ekspresi FcγRIIB nyata upregulated di 12 minggu di H. pylori-positif responden, tetapi perubahan ini tidak diamati di H. pylori-positif nonresponders atau di H. pylori-negatif pasien (Gambar 4 D). Temuan ini menunjukkan bahwa perubahan dalam keseimbangan FcγR menuju FcγRIIB hambat, bersama-sama dengan kapasitas fagositik berkurang dari monosit, adalah peristiwa pertama yang terjadi sebagai akibat dari H. pylori pemberantasan di responden.

Gambar 4

Perubahan tingkat ekspresi FcγRIIB yang bersirkulasi monosit dari pasien ITP sebelum dan setelah inisiasi dari H. pemberantasan pylori. (A) FcγRIIA / IIB ekspresi mRNA rasio pada monosit sebelum pengobatan ditentukan oleh TaqMan PCR kuantitatif pada 11 pasien ITP terinfeksi H. pylori dan 5 pasien terinfeksi ITP. Perbedaan antara 2 kelompok dianalisis dengan menggunakan uji U-Mann Whitney. (B) FcγRIIA / IIB ekspresi rasio pada monosit adalah serial diukur sebelum perlakuan dan pada 1 dan 12 minggu setelah inisiasi dari H. rejimen pylori pemberantasan di 6 H. pylori-positif ITP responden, 5 H. pylori-positif ITP nonresponders, dan 5 H. pylori-negatif ITP nonresponders. Hasil akan ditampilkan sebagai SD + berarti. Perubahan nilai pada 1 dan 12 minggu dari nilai awal diambil di wk 0 dinilai dengan uji t berpasangan. ** P <0,01 dibandingkan dengan pra-perawatan. Perwakilan RT-PCR hasil untuk ekspresi FcγRIIA, FcγRIIB, dan GAPDH ditampilkan untuk setiap kelompok pasien. (C) Ekspresi protein FcγRIIB pada monosit sebelum perlakuan dan 12 minggu setelah inisiasi dari H. rejimen pylori pemberantasan di perwakilan H. pylori-positif responden dan nonresponder. Buka histogram menunjukkan sel-sel diwarnai dengan pencocokan isotipe kontrol Ab, dan menutup histogram menunjukkan sel-FcγRIIB anti MAB-diobati. (D) Ekspresi tingkat FcγRIIB pada monosit diukur sebelum perlakuan dan 12 minggu setelah inisiasi dari H. rejimen pemberantasan pylori

dalam 5 H. pylori-positif ITP responden, 4 H. pylori-positif ITP nonresponders, dan 3 H. pylori-negatif ITP nonresponders.

Kami diteliti lebih lanjut peran potensial dalam mengatur keseimbangan Th1/Th2 profil ekspresi FcγR pada monosit dalam hubungannya dengan H. pylori infeksi ( 11 ), tapi tidak ada perubahan substansial dalam rasio IFN-γ CD4 + T + sel untuk IL-4 + sel T CD4 + dalam sirkulasi sebelum perlakuan dan 12 minggu setelah memulai rejimen pemberantasan dalam H . pylori-positif responden (2,6 ± 1,3 dan 2,7 ± 1,3, masing-masing), H. pylori-positif nonresponders (3,1 ± 0,6 dan 3,7 ± 1.0, masing-masing), atau H. pylori-negatif pasien (3,4 ± 1,1 dan 3,5 ± 1,5, masing-masing).

Parameter yang memprediksi respons platelet untuk pemberantasan H. pylori. Untuk menguji parameter yang memprediksi respons platelet untuk menghapuskan H. pylori pada pasien ITP, karakteristik pasien, kekebalan dan parameter omset trombosit tercantum pada Gambar 1 , serta IgG anti-CagA tingkat Ab dan FcγRIIA / IIB rasio ekspresi mRNA di monosit di pretreatment dibandingkan antara H. pylori terinfeksi responden dan nonresponders. Ekspresi FcγRII level pada monosit secara signifikan lebih rendah pada responden daripada di nonresponders (17,2 ± 4,8 23,4 ± 8,2 versus LKM, P = 0,03). Selain itu, kapasitas fagositosis dan / FcγRIIA rasio ekspresi IIB dari monosit secara signifikan lebih tinggi pada responden daripada di nonresponders (2,8 ± 1,5 vs 1,3 ± 0,3, 0,02 = P; dan 1,7 ± 0,6 vs 1,1 ± 0,4, P = 0,04 ).

Fenotipik dan sifat fungsional monosit sebelum dan sesudah pemberantasan H. pylori dalam mata pelajaran non-ITP. Untuk mengevaluasi apakah perubahan dan fungsional sifat fenotipik beredar monosit setelah pemberantasan H. pylori yang khusus untuk pasien ITP, 9-trombositopenik relawan non terinfeksi H. pylori diobati dengan regimen standar pemberantasan. Pemberantasan berhasil dalam 7 mata pelajaran, tetapi tidak dalam 2. Seperti yang diharapkan, tidak ada perubahan substansial dalam jumlah trombosit selama periode observasi dalam berbagai subjek. Dalam monosit dari individu diperlakukan berhasil, ada kecenderungan terhadap ekspresi FcγRI downregulated dan kapasitas fagositosis dan menuju upregulated FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB) ekspresi 12 minggu setelah pemberantasan, seperti diamati dalam H. ITP terinfeksi pylori responden, tetapi perubahan-perubahan ini secara statistik tidak signifikan (Gambar 5 ). Kurangnya penting tampaknya karena tanggapan sangat bervariasi di antara individu. Perlu dicatat bahwa subyek dengan fenotipe monosit diaktifkan, yaitu, tinggi FcγRI ekspresi, ekspresi FcγRII rendah, dan kapasitas fagositosis ditingkatkan, di pretreatment lebih cenderung untuk merespon dengan perbaikan kondisi atas pemberantasan H. pylori.

Gambar 5

Serial pengukuran fenotipe beredar monosit dan anti-CagA tingkat Ab sebelum dan setelah inisiasi dari H. pemberantasan pylori rejimen di 9-ITP individu yang tidak terinfeksi H. pylori menurut hasil rejimen tersebut. tingkat Ekspresi FcγRI, FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB), dan CD86, non-spesifik fagositosis monosit sirkulasi, dan anti-CagA tingkat Ab diukur sebelum perlakuan dan 12 minggu setelah inisiasi dari H. pylori pemberantasan rejimen. Ekspresi FcγRII telah diteliti dengan menggunakan klon MAB FLI8.26, yang bereaksi dengan baik FcγRIIA dan FcγRIIB. Hasil untuk 7 orang di mana H. pylori berhasil diberantas dan untuk 2 individu dalam pemberantasan yang gagal disajikan terpisah. Sebuah garis putus-putus menunjukkan cut off untuk anti-CagA Abs (7,5 U).

fenotipe FcγR pada monosit / makrofag dalam pylori yang terinfeksi dan tidak terinfeksi H. tikus. Kami siap 4 kelompok tikus (n = 5 dalam setiap kelompok): H. pylori terinfeksi tikus, tikus yang tidak terinfeksi, H. pylori terinfeksi tikus yang telah menerima terapi eradikasi, dan tikus yang tidak terinfeksi yang menerima pengobatan eradikasi. Pada tikus, hanya ada satu FcγRII, yang sesuai dengan FcγRIIB manusia. Seperti ditunjukkan pada Tabel 3 , ekspresi FcγRII diukur dengan menggunakan klon 2.4G2 MAB pada monosit / makrofag berasal dari darah tepi, sumsum tulang, dan limpa secara signifikan lebih rendah pada tikus yang terinfeksi dengan H. pylori dari pada tikus yang tidak terinfeksi, sedangkan ekspresi FcγRI cenderung lebih tinggi pada tikus yang terinfeksi dengan H. pylori (P <0,1). Baik tikus terinfeksi dan tidak terinfeksi diberi triple H. rejimen pylori pemberantasan, dan pemberantasan sukses telah dikonfirmasi di semua tikus yang terinfeksi oleh budaya bakteri perut pukul 6 minggu. Dalam monosit / makrofag berasal dari darah tepi, sumsum tulang, dan limpa dari H. -Diberantas tikus pylori, ekspresi FcγRII itu upregulated dan ekspresi FcγRI adalah downregulated setelah penghapusan. Sejak MAB klon 2.4G2 lintas bereaksi dengan FcγRIII, sampel darah perifer diperiksa lebih lanjut menggunakan MAB yang spesifik untuk FcγRII (Ly17.2 clone) ( 12 ). Tingkat ekspresi FcγRII kembali secara signifikan lebih rendah di H. Pylori tikus yang terinfeksi dibandingkan dengan-tikus diperlakukan mengejek (3,2 ± 0,4 vs 3,9 ± 0,2 LKM, P = 0,01). Dalam H. Tikus yang terinfeksi pylori, tingkat ekspresi FcγRII meningkat setelah terapi eradikasi (3,2 ± 0,4 vs 3,9 ± 0,3 LKM, P = 0,02).

Tabel 3

Ekspresi tingkat FcγRI dan FcγRII pada monosit / makrofag pada tikus yang tidak terinfeksi dan tikus terinfeksi H. pylori setelah rejimen pemberantasan

Diskusi

Dalam analisis komprehensif, kami menunjukkan bahwa pemulihan platelet diamati pada subset H. ITP terinfeksi pylori pasien setelah H. pemberantasan pylori ini mungkin dimediasi melalui perubahan saldo FcγR pada monosit / makrofag. Tingkat ekspresi FcγRII pada monosit pertama kali diidentifikasi sebagai salah satu faktor yang terkait dengan H. infeksi pylori pada pasien ITP oleh aliran cytometric analisis menggunakan MAB yang bereaksi dengan kedua FcγRIIA dan FcγRIIB, tetapi hubungan ini kemudian terbukti terutama disebabkan FcγRIIB hambat berdasarkan tes yang berbeda 2: PCR kuantitatif untuk penilaian ekspresi mRNA dan analisis aliran cytometric menggunakan MAB yang spesifik ke domain intraseluler dari FcγRIIB. Sifat fungsional monosit / makrofag, termasuk fagositosis dan presentasi antigen, dikendalikan oleh keseimbangan antara FcγRs mengaktifkan dan reseptor hambat, FcγRIIB ( 13 ). Beredar monosit dari H. pylori ITP pasien yang terinfeksi menunjukkan suatu fenotipe diaktifkan dengan kapasitas fagositik ditingkatkan, yang berpotensi menghasilkan dari FcγRIIB downregulated, dan fenotipe ini kembali ke H. pylori tidak terinfeksi ITP pasien setelah pemberantasan H. pylori, tetapi hanya di responden. Selain itu, perubahan fenotipe monosit didahului perbaikan dalam parameter kinetik autoimun dan platelet. Oleh karena itu, H. pylori infeksi memainkan peran penting dalam patogenesis ITP dengan mengubah keseimbangan FcγR dari monosit / makrofag mendukung mengaktifkan FcγRs, melalui downregulation dari FcγRIIB hambat reseptor.

Studi baru-baru ini kami di T sel yang autoreactive untuk GPIIb / IIIA pada pasien ITP mengungkapkan bahwa proses patogenik dari ITP dapat dijelaskan oleh loop terus menerus di mana sel-sel B memproduksi IgG autoantibodies anti-trombosit, makrofag dalam sistem retikuloendotelial (RES)

phagocytose opsonized platelet melalui FcγRs dan / GPIIb hadir berasal antigen peptida-IIIA, dan GPIIb / IIIA-reaktif sel T diaktivasi dan mengerahkan aktivitas pembantu mereka ( 14 , 15 ). Telah terbukti bahwa anti-GPIIb/IIIa Abs pada pasien ITP adalah dominan dari IgG1 subclass ( 16 ), yang memiliki afinitas tertinggi untuk FcγRII ( 13 ). Jadi, FcγRs disajikan pada makrofag dalam RES tampaknya memainkan peran sentral dalam 2 aspek dari proses patogenik: penghancuran trombosit dan tanggapan autoimun berkelanjutan terhadap antigen platelet. Hal ini masih diperdebatkan yang FcγR mengaktifkan didominasi terlibat dalam patogenesis ITP ( 17 ), tetapi peningkatan ekspresi relatif FcγRIIB hambat ke FcγRs mengaktifkan akhirnya bisa mengakibatkan redaman dari loop terus menerus patogen. Oleh karena itu, pemulihan platelet dimediasi melalui ekspresi FcγRIIB upregulated pada monosit setelah pemberantasan H. pylori pada pasien ITP melibatkan 2 langkah akibat: peningkatan platelet cepat diamati pada 1 minggu adalah hasil dari blokade clearance trombosit oleh makrofag dalam RES, sedangkan peningkatan berkelanjutan platelet hasil dari penindasan presentasi antigen oleh makrofag dan inhibisi berikutnya T dan tanggapan sel B untuk antigen platelet. Untuk menilai peran H. pylori infeksi pada clearance platelet, sangat menarik untuk mengevaluasi apakah H. infeksi pylori meningkatkan penghancuran trombosit pada tikus diperlakukan dengan platelet-depleting MABs. Efek penekan yang sama terhadap ekspresi FcγRIIB pada makrofag dilaporkan untuk imunoglobulin intravena (IVIG). Samuelsson et al. menunjukkan bahwa IVIG memerlukan kehadiran FcγRIIB untuk mencegah trombositopenia dalam model murin dari ITP pasif ( 18 ). Dalam model ini, FcγRIIB ekspresi pada makrofag adalah upregulated atas perlakuan IVIG.

Patogenesis ITP dalam asosiasi dengan H. pylori infeksi yang paling mungkin multifaktorial. Mekanisme kami tidak mengesampingkan mekanisme lain yang diusulkan untuk pemulihan trombosit setelah pemberantasan H. pylori di ITP, seperti mimikri molekuler antara CagA dan antigen permukaan platelet ( 7 ). Selain itu, telah menunjukkan bahwa beberapa strain H. pylori menginduksi agregasi platelet yang tergantung pada faktor von Willebrand dan IgG Abs khusus untuk H. pylori berinteraksi dengan reseptor yang berhubungan GPIB dan FcγRIIA pada platelet ( 19 ). Dalam model ini, Abs khusus untuk H. pylori mampu opsonizing platelet melalui mengikat H. pylori, von Willebrand faktor, dan GPIB, sebagai anti-platelet autoantibodies. Jadi, penurunan H. Ab spesifik pylori tingkat setelah terapi eradikasi juga dapat menekan penyajian antigen trombosit oleh makrofag. Ini-dimediasi mekanisme Ab tampaknya berperan dalam fase pemulihan platelet kemudian setelah H. pemberantasan pylori, karena perubahan fenotipe monosit didahului perbaikan dalam tanggapan Ab untuk GPIIb / IIIA dan CagA.

Platelet pemulihan setelah pemberantasan H. pylori diteliti hanya dalam subkelompok H. ITP terinfeksi pylori pasien ( 3 , 4 ). Hasil penelitian kami di sini menunjukkan bahwa ITP pasien dengan fenotipe monosit diaktifkan, seperti kapasitas fagositik ditingkatkan dan mengurangi ekspresi FcγRIIB, cenderung menanggapi H. pylori pemberantasan, menunjukkan bahwa diaktifkan monosit / makrofag fenotipe berkontribusi mendorong loop patogen yang menjaga kondisi autoimun platelet-anti di responden tersebut. Temuan ini penting secara klinis, karena suatu fenotipe monosit diaktifkan dapat memprediksi pemulihan platelet setelah pemberantasan H. pylori pada pasien ITP. Status aktivasi monosit yang beredar juga heterogen di ITP-individu yang tidak terinfeksi H. pylori, dan mata pelajaran dengan fenotipe monosit diaktifkan yang responsif terhadap H. pemberantasan pylori, yang mengubah keseimbangan FcγR. Jadi, apakah H. pylori infeksi mengaktifkan host monosit

pada / makrofag berbeda antara individu terlepas dari ada tidaknya ITP. Ada keragaman besar dalam kemanjuran H. pemberantasan pylori terapi pada pasien ITP antara kelompok-kelompok etnis. Kohort dari Jepang dan laporan tingkat respons Italia sebesar 39% -100%, sedangkan yang berasal dari Spanyol dan Amerika Serikat dokumen sedikit atau tidak ada tanggapan platelet ( 20 ). Alasan untuk variabilitas tersebut antara negara-negara tidak jelas, tetapi hal ini dapat dijelaskan oleh perbedaan dalam epidemi H. pylori strain atau latar belakang genetik di antara populasi. Dalam hal ini, H. genotipe pylori berbeda antara strain Asia Timur dan tekanan Eropa ( 21 ). Selain itu, faktor genetik yang mengatur ekspresi FcγRs mungkin akan menyebabkan perbedaan ini. Beberapa polimorfisme ada dalam gen FcγR manusia yang menunjukkan mengubah afinitas untuk IgG, berpotensi menghasilkan tingkat clearance tertentu tergantung alel-kompleks kekebalan ( 22 ). Secara khusus, satu SNP dalam gen FcγRIIB reseptornya mengubah sinyal ( 23 , 24 ) dan memprediksi perkembangan penyakit kronis pada anak-anak dengan ITP akut ( 25 ). Polimorfisme lain di daerah promotor gen FcγRIIB downregulates kegiatan transkripsional nya ( 26 ).

Potensi bias seleksi pasien merupakan salah satu keterbatasan penelitian ini. Karena rumah sakit kami adalah pusat rujukan, banyak pasien penyakit telah durasi relatif lama dan telah diobati dengan prednisolone dan / atau splenektomi. Selain itu, pasien kami adalah subset yang relatif ringan, karena kita tidak termasuk pasien dengan perdarahan aktif untuk mengurangi putus sekolah selama masa studi. Kita harus mempertimbangkan potensi bias interpretasi atas hasil, tapi tidak ada perbedaan jelas dalam karakteristik pasien antara H. pylori terinfeksi responden dan nonresponders. Selain itu, frekuensi tinggi pasien splenectomized di H. -Kelompok pylori negatif dapat mempengaruhi dan fungsional sifat fenotipik beredar monosit, meskipun tidak ada perbedaan yang jelas di tingkat ekspresi FcγR dan kapasitas fagositosis dari monosit antara-negatif H. pylori ITP pasien tanpa sejarah mereka splenektomi (data tidak ditampilkan). Keterbatasan lain adalah penggunaan darah perifer monosit bukan makrofag dalam RES dalam analisis. Namun, pada tikus, H. infeksi pylori mengubah keseimbangan FcγR sama dalam monosit / makrofag berasal dari darah tepi, sumsum tulang, dan limpa, menyatakan bahwa monosit beredar berpotensi mewakili seluruh monosit / sistem makrofag.

Modulasi dari saldo FcγR monosit yang terkait dengan H. pylori infeksi terdeteksi di ITP dan non-ITP individu serta pada tikus, menunjukkan bahwa respons ini mungkin menjadi tuan rumah normal respon imun terhadap mikroorganisme yang membentuk infeksi kronis yang berlangsung beberapa dekade. Diketahui bahwa H. pylori colonizes lapisan mukosa lambung dan tidak menginvasi epitel lambung, tapi H. pylori menyebabkan infeksi sistemik dan respons lokal melalui stimulasi sistem kekebalan tubuh adaptif dan bawaan ( 27 ). Peristiwa molekul yang menginduksi perubahan sifat-sifat monosit / makrofag masih tetap tidak jelas. Kami gagal untuk menunjukkan peran yang terkait dengan respon Th1 H. pylori infeksi pada perubahan fenotipe monosit. Di sisi lain, dilaporkan bahwa komponen H. pylori dilepaskan dan bertanggung jawab untuk aktivasi sel dendritik dan makrofag melalui reseptor tol seperti signaling ( 28 , 29 ). Dalam hal ini, frekuensi tinggi dari beberapa H. spesifik genotipe pylori dilaporkan pada pasien ITP dibandingkan dengan subyek non-ITP ( 5 ), menunjukkan potensi peran bakteri's struktur dan profil virulensi pada patogenesis ITP.

Penelitian sebelumnya menunjukkan hubungan sebab akibat antara infeksi dan penyakit autoimun, seperti infeksi usus oleh Campylobacter dan Guillian-Barré syndrome jejuni. Dalam hal ini, Abs lintas bereaksi dengan lipooligosaccharides hadir dalam C. jejuni dan di ganglioside GM1 bertanggung jawab untuk pengembangan ini penyakit ( 30 ). Di sisi lain, pada pasien ITP, H. ditingkatkan

imunogenisitas pylori infeksi khusus autoantigens platelet sekunder untuk FcγR keseimbangan berubah-dimediasi infeksi makrofag. Mekanisme serupa ditunjukkan pada model binatang untuk Coxsackie virus B4-induced diabetes tipe I ( 31 ), di mana virus ini diperkirakan untuk bertindak dengan meningkatkan imunogenisitas dari autoantigens sekunder untuk peradangan lokal. Selain itu, infeksi juga dapat melindungi dari penyakit autoimun. Onset diabetes tipe I dihambat oleh infeksi parasit cacing pada model hewan ( 32 ). Sebuah terbaru acak, double-blind, terkontrol plasebo menunjukkan peningkatan kolitis ulserativa aktif oleh infeksi Trichuris suis ( 33 ). Pengaruh agen infeksi pada patogenesis autoimmunity tampak variabel antara penyakit, dan mekanisme yang mendasari adalah beberapa dan kompleks, mungkin berbeda sesuai dengan patogen.

Singkatnya, H. pylori infeksi memainkan peran penting dalam patogenesis ITP dengan mengubah keseimbangan FcγR dari monosit / makrofag mendukung mengaktifkan FcγRs, melalui downregulation dari FcγRIIB. Keberhasilan dan profil keamanan H. pylori pemberantasan membuat rejimen pilihan yang menarik, namun diindikasikan hanya untuk H. pylori terinfeksi pasien dalam kelompok-kelompok etnis tertentu. Mekanisme yang mendorong pemulihan setelah H. platelet pemberantasan pylori dilaporkan di sini menunjukkan bahwa saldo FcγR pada monosit / makrofag dapat menjadi sasaran terapi yang wajar untuk ITP. Dalam hal ini, molekul kecil yang menghambat sinyal hilir mengaktifkan FcγR dapat memiliki efek menguntungkan pada pasien ITP ( 34 ). penelitian lebih lanjut untuk mengevaluasi seberapa H. pylori infeksi memodulasi monosit / makrofag fungsi mungkin berguna untuk memahami patogenesis ITP dan untuk mengembangkan strategi terapeutik baru untuk ITP.

Metode

Pasien dan kontrol itu. Ini pusat-tunggal, open-label, studi prospektif yang melibatkan 34 pasien berturut-turut dengan ITP. Diagnosis ITP didasarkan pada trombositopenia bertahan lebih lama dari 6 mo, normal atau meningkat sumsum tulang megakaryocytes tanpa bukti morfologi dari displasia, dan tidak ada penyakit kekebalan atau non-imun sekunder yang dapat menjelaskan keadaan trombositopenik ( 35 ). Semua pasien yang dirujuk ke Rumah Sakit Universitas Keio, Tokyo, Jepang, dan telah diobati selama sedikitnya 6 mo. jumlah trombosit yang <100 × 10 9 / l selama mo 3 sebelumnya. Kriteria eksklusi meliputi usia (<18 th), perdarahan aktif, kehamilan atau menyusui, sejarah efek samping potensial terkait dengan penisilin, pengobatan saat ini atau sebelumnya dengan penghambat pompa proton, atau penyakit yang melemahkan lainnya (misalnya, kanker). Sembilan relawan sehat terinfeksi H. pylori menjabat sebagai subjek kontrol. Protokol studi sesuai dengan prinsip-prinsip etis dari Asosiasi Kedokteran Dunia Deklarasi Helsinki sebagaimana tercermin dalam persetujuan priori dari Universitas Keio Review Kelembagaan Dewan, dan informed consent tertulis diperoleh dari masing-masing peserta.

Penilaian infeksi H. pylori. Untuk mengevaluasi H. infeksi pylori, kami melakukan uji urea 13 C napas menggunakan tablet Ubit (Otsuka Assay), IgG serum dianalisis H. -Spesifik Abs pylori menggunakan tersedia kit komersial (Kyowa Medex Perusahaan), dan dianalisis H. pylori antigen dalam sampel feses menggunakan ImmunoCard STAT! HpSA (Meridian Bioscience Inc), pada semua pasien ( 36 ). Pasien positif untuk tes napas urea ditambah setidaknya satu tes tambahan dianggap sebagai H. pylori positif, sedangkan yang negatif untuk semua 3 tes dianggap H. pylori negatif. Untuk meminimalkan hasil negatif palsu, pasien tidak menerima antasida atau antibiotik selama minimal 2

minggu sebelum tes. Keberhasilan pemberantasan didefinisikan sebagai hasil negatif untuk tes napas urea 12 minggu setelah regimen eradikasi.

H. pylori dan rejimen pemberantasan tindak lanjut. Semua pasien dan kontrol diberikan amoksisilin (750 mg dua kali sehari), klaritromisin (400 mg dua kali sehari), dan lansoprazole (30 mg dua kali sehari) selama 7 d terlepas dari mereka H. pylori status infeksi dan kemudian diikuti untuk 24 minggu berikutnya. Para pasien itu diizinkan untuk melanjutkan terapi lain mereka selama masa studi, memberikan dosis obat yang dipertahankan pada tingkat yang konstan sampai studi selesai, kecuali untuk prednisolone, yang dapat diturunkan atau dihentikan. Sebuah respon terapi didefinisikan sebagai jumlah platelet lebih tinggi dari 50 × 10 / l 9 dan dua kali lipat dari baseline pada 24 minggu setelah memulai regimen eradikasi.

Cell persiapan sampel. Darah perifer Heparinized diperoleh dari semua mata pelajaran pada 0 (-perawatan pra), 12, dan 24 minggu, dan dari beberapa pasien pada 1 minggu, setelah memulai regimen eradikasi. Setelah plasma platelet-kaya terisolasi, komponen sel residu tersebut dikenakan Lymphoprep (Nycomed Pharma AS) kepadatan gradien sentrifugasi untuk mengisolasi PBMCs. PBMCs baru diisolasi di resuspended di RPMI 1640 mengandung dilemahkan FBS% panas-10, 2 mmol / l-glutamin, 50 U / ml penisilin, dan 50 ug / ml streptomisin dan segera digunakan dalam percobaan berikut. plasma trombosit-miskin diisolasi dari plasma platelet-kaya dengan sentrifugasi.

Evaluasi respon Ab anti-GPIIb/IIIa. Sel B memproduksi IgG Abs anti-GPIIb/IIIa terdeteksi menggunakan linked immunospot uji-enzim, sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya ( 37 ). Setiap percobaan dilakukan dalam 5 sumur independen, dan hasilnya merupakan mean dari 5 nilai. Frekuensi beredar anti-GPIIb/IIIa Ab-sel B memproduksi dihitung sebagai nomor per 10 5 PBMCs, dan nilai-off memotong 2,0 didefinisikan sebagai sel. Abs anti-GPIIb/IIIa IgG di eluat platelet (dari 5 × 10 7 platelet) diukur dengan ELISA menggunakan dimurnikan GPIIb manusia / IIIA sebagai antigen ( 38 ). Ab unit dihitung dari densitas optik di 450 nm (OD 450) hasil, berdasarkan kurva standar yang diperoleh dari konsentrasi plasma serial titer IgG dikumpulkan dengan anti-GPIIb/IIIa-Abs tinggi. Semua sampel diperiksa dalam rangkap dua, dan hasilnya dihitung sebagai mean dari 2 nilai. The cut off untuk Abs anti-GPIIb/IIIa platelet-terkait adalah 3,3 U.

Evaluasi respon sel T GPIIb / IIIA (. Antigenik Spesifisitas T sel ditentukan oleh sel T antigen-induced proliferasi sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya 39 ). Secara singkat, PBMCs dikultur dalam kehadiran atau tidak adanya antigen selama 7 d. Setelah inkubasi 16-jam akhir dengan 0,5 μCi / baik timidin H-3, sel dipanen, dan penggabungan timidin H-3 ditentukan dalam microplate sintilasi TopCount counter (Packard). Antigen yang digunakan adalah tripsin-dicerna GPIIb / IIIA, PBS mock-diperlakukan, dan toksoid tetanus (Daftar Laboratorium Biologi) yang digunakan pada konsentrasi 5 ug / ml. Semua budaya disusun rangkap tiga, dan semua nilai rata-rata merupakan penentuan rangkap tiga. T antigen-spesifik respons sel dinyatakan sebagai indeks stimulasi, yang dihitung sebagai cpm dimasukkan ke dalam budaya dengan dicerna tripsin-GPIIb / IIIA atau tetanus toksoid dibagi dengan cpm dimasukkan ke dalam budaya dengan perawatan pura-pura dengan PBS.

Evaluasi omset platelet. Reticulated platelet terdeteksi oleh pewarnaan terisolasi platelet segar dengan jeruk tiazol (Retic-COUNT; Becton Dickinson) diikuti oleh analisis aliran cytometric, seperti yang dijelaskan sebelumnya ( 40 ). The cut off untuk persentase platelet Reticulated adalah 2,0%. Tingkat TPO plasma diukur dengan menggunakan kit ELISA tersedia secara komersial (Quantikine; R & D Systems) menurut protokol produsen.

Evaluasi dan fungsional sifat fenotipik beredar monosit. Tidak tetap PBMCs diwarnai dengan-terkonjugasi anti-FcγRI/CD64 FITC (clone 10.1), anti-FcγRII/CD32 (clone FLI8.26), anti-FcγRIII/CD16 (clone 3G8) ( BD Biosciences), atau anti-CD86 MABs (BU63 clone; Ancell), dalam kombinasi dengan PC5-konjugasi anti-CD14 MAB (RMO52 klon; Beckman Coulter). Untuk FcγRIIB menodai, sel-sel yang tetap dan permeabilized menggunakan buffer yang mengandung paraformaldehyde dan saponin (BD Biosciences) dan kemudian diwarnai dengan MABs ke bagian C-terminal FcγRIIB (EP888Y clone; Epitomics), diikuti oleh inkubasi dengan FITC-label anti- kelinci IgG F (ab ') 2 (Beckman Coulter) dan PC5-konjugasi anti-CD14 MAB. Sel kontrol negatif diinkubasi dengan neon-label isotipe pencocokan MABs mouse melawan antigen tidak relevan. Sel dianalisis pada aliran cytometer FACSCalibur (BD Biosciences) dengan menggunakan perangkat lunak CellQuest. sel yang layak dipilih oleh pengecualian sel apoptosis diwarnai dengan iodida propidium (Sigma-Aldrich). tingkat ekspresi relatif FcγRI, FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB), FcγRIIB, FcγRIII, dan CD86 pada gated + CD14 monosit yang dinyatakan sebagai LKM, yang dihitung berdasarkan intensitas sel diinkubasi dengan pencocokan kontrol MAB isotipe sesuai sebagai referensi . Proporsi sel positif bagi FcγRIII di + CD14 monosit juga ditentukan. Setiap uji termasuk sampel kontrol kualitas PBMC berasal dari donor sehat tunggal, yang telah disimpan dalam aliquots pada -80 ° C. Kapasitas fagositik spesifik dari monosit diperiksa seperti yang dijelaskan sebelumnya ( 41 ). Dalam singkat, PBMCs dikultur dengan netral-dekstran FITC dengan berat molekul 2.000 kDa (Sigma-Aldrich) selama 30 menit pada 0 ° C atau 37 ° C dan dianalisis pada cytometer aliran. Penyerapan FITC-label dekstran dievaluasi oleh LKM pada gated + CD14 monosit. Kapasitas fagositik dinyatakan sebagai rasio LKM, yang dihitung sebagai LKM yang diperoleh pada suhu 37 ° C dibagi dengan LKM pada 0 ° C. pengaturan yang konsisten untuk sensitivitas detektor, kompensasi, dan gating menyebarkan digunakan dalam analisis dari semua sampel.

keseimbangan Th1/Th2. Proporsi-sel IFN γ + dan + IL-4 sel dalam darah perifer CD4 + sel T dievaluasi menggunakan aliran cytometry berbasis intraselular sitokin Staining Kit Manusia (BD Biosciences) menurut produsen protokol. Hasilnya dinyatakan sebagai rasio IFN-γ CD4 + T + sel untuk IL-4 + sel T CD4 +.

Anti-CagA Abs Abs. Anti-CagA dari isotipe IgG diukur dalam rangkap pada sampel plasma menggunakan ELISA kit yang tersedia secara komersial (ravo Diagnostika). Cut-off sebesar 7,5 U berdasarkan informasi dari produsen.

Ekspresi gen FcγRIIA dan FcγRIIB pada CD14 monosit. Beredar + monosit diisolasi dari PBMCs menggunakan anti-CD14 MAB digabungkan dengan manik-manik magnetik (Miltenyi Biotech) diikuti oleh MACS pemisahan kolom. cytometric analisis Arus mengungkapkan bahwa fraksi diurutkan mengandung> 95% CD14 + sel. Total RNA diekstraksi dari monosit menggunakan kit RNeasy (Qiagen), dan cDNA-untai pertama disintesis dari total RNA menjadi sasaran PCR menggunakan primer spesifik panel (FcγRIIA: akal primer, 5'-CTGACTGTGCTTTCCGAATG-3 ', dan antisense primer, 5'-TGGATGAGAACAGCGTGTAG-3 '; FcγRIIB: primer akal, 5'-ACAAGCCTCTGGTCAAGGTC-3', dan antisense primer, 5'-TTCCCTGCACTCAGGGTATC-3 '; dan GAPDH: primer akal, 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG -3', dan primer antisense, 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '). Produk PCR diselesaikan dengan elektroforesis pada gel agarosa 2% dan divisualisasikan dengan pewarnaan etidium bromida. Selain itu, tingkat ekspresi mRNA yang dinilai secara kuantitatif dengan menggunakan sistem real-time PCR TaqMan (Terapan Biosystems). Sebuah kombinasi dari primer dan probe khusus untuk FcγRIIA manusia dan FcγRIIB dibeli dari Terapan Biosystems. Tingkat

ekspresi relatif dihitung dari kurva standar yang dihasilkan dengan memetakan jumlah produk PCR terhadap jumlah input serial PBMC cDNA, dan FcγRIIA / IIB rasio dihitung dari tingkat ekspresi relatif pada sampel yang sama.

Infeksi dan pemberantasan H. pylori dalam tikus,. Enam-minggu-tua khusus bebas laki-laki tikus-patogen (C57BL / 6; Sankyo Layanan Lab) diberi makanan iradiasi dan diautoklaf iklan libitum air suling. Sydney strain H. pylori SS1, yang ditumbuhkan pada suhu 37 ° C dalam kondisi microaerobic, digunakan untuk inokulasi lisan, seperti yang dijelaskan sebelumnya ( 42 , 43 ). Suspensi H. pylori (2 × 10 7 CFU / ml, 15 ml / kg) yang diberikan pada mencit setelah semalam kelaparan, dua kali dengan interval-wk 2, sedangkan mencit kontrol diberi suspensi larutan buffer sendiri (infeksi pura-pura). Dua belas minggu kemudian, setengah dari tikus di H. Diinokulasi-kelompok pylori dan kelompok kontrol dikorbankan untuk diperiksa. Sisanya H. pylori-diinokulasi dan tikus kontrol diperlakukan dengan H. pengobatan pylori pemberantasan terdiri dari lansoprazole (10 mg / kg), amoksisilin (3 mg / kg), dan klaritromisin (30 mg / kg) dibekukan dalam 0,5 karboksimetil% larutan garam natrium selulosa, sekali sehari selama 2 hari ( 44 ). Enam minggu kemudian, semua mencit dikorbankan untuk diperiksa. H. infeksi pylori di lambung dipotong dievaluasi dengan kultur bakteri microaerobic, sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya ( 45 ). mononuklear sel diisolasi dari darah perifer, limpa, dan sumsum tulang dan disimpan pada -80 ° C, dan semua sampel dikenakan analisis aliran cytometric pada hari yang sama. Sel diinkubasi dengan MAB CD11b Cy5-label anti-mouse (M1/70 klon; Beckman-Coulter) dalam kombinasi dengan anti-mouse FcγRI biotin-label poliklonal Ab (R & D Systems) atau tikus MAB reaktif dengan kedua mouse FcγRII ( klon 2.4G2; BD Biosciences - Pharmingen) dan biotin-label anti-tikus IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc), diikuti dengan pengobatan dengan FITC-streptavidin (Beckman Coulter). Dalam beberapa kasus, kita menggunakan mouse untuk spesifik MAB FcγRII (Ly17.2 clone) (Sloan-Kettering Cancer Institute) dalam kombinasi dengan FITC-label anti-mouse IgG F (ab ') 2. Semua prosedur mouse telah disetujui oleh Universitas Keio Hewan Komite Penelitian.

Statistik. Semua nilai kontinu ditampilkan sebagai SD ± berarti. Perbandingan untuk menentukan signifikansi statistik antara 2 kelompok dilakukan dengan menggunakan uji Fisher's Exact atau Mann-Whitney U, yang sesuai. Perubahan nilai absolut pada titik-titik waktu yang berbeda dari nilai awal diambil di minggu ke 0 dibandingkan dengan uji t berpasangan.

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih Ulrich Hammerling (Sloan-Kettering Institute) untuk mengkoordinasikan akuisisi Ly17.2 klon MAB dan Masahiro Kizaki dan Mitsuru Murata untuk merekrut pasien untuk studi ini. Karya ini didukung oleh dana dari Departemen Pendidikan Jepang, Budaya, Olahraga, Sains dan Teknologi, hibah penelitian tentang penyakit keras dari Departemen Kesehatan Jepang, Perburuhan dan Kesejahteraan, dan Nagao Memorial Fund.

Catatan kaki

singkatan tidak standar yang digunakan: CagA, cytotoxin-terkait gen A; FcγRIIB, Fcγ reseptor IIB; GPIIb / IIIA, glikoprotein IIb / IIIA; ITP, purpura trombositopenia imun; RES, sistem retikuloendotelial; TPO, thromb