AISLAMIENTO DE Halobacterium Sp A PARTIR DE PESCADO DE MAR.Janier Ariza1, Jess Baena Negrete1, Yenis Olivera Pjaro1, Ibeth Padilla Lobo1(1)Estudiantes de IV semestre de Ingeniera de Alimentos de la universidad de Crdoba.

El gnero Halobacterium sp, es una arqueobacteria aerobia hetertrofa que se caracteriza por ser halfila estricta, consigue su equilibrio osmtico con concentraciones elevadas de cloruro potsico, carece de murena y por tal razn su pared celular requiere de iones de sodio para lograr la estabilidad; debido a su estilo de vida intenso Halobacterium sp, existe en extremas o altas concentraciones de sal y se puede encontrar en todo el mundo. Es una bacteria Gram-negativa, con forma de bastn en una disposicin nica que es importante en su capacidad para moverse y sobrevivir en las duras condiciones en que viven. [1] Para aislar Halobacterium Sp, se utiliz una muestra de pescado de mar, el cual se enriqueci en agua peptonada con una concentracin de 2.5M de cloruro de sodio e incubada propiciamente para luego propagarla en el medio Agar salado manitol (A.S.M), del cual se extrajeron las colonias para realizar tincin y pruebas bioqumicas, que nos darn indicios de la naturaleza de la bacteria aislada y de alguna manera confirmar su identidad, procedimientos que profundizaremos ms adelante.Palabras claves: agua peptonada, bacteria, colonias, agar salado manitol.

ABSTRACTThe genus Halobacterium sp, is an archaebacterium that aerobic heterotrophic halophilic is characterized by strict gets its osmotic balance with high concentrations of potassium chloride, no murein and for this reason their cell wall sodium ion required to achieve stability, because his intense lifestyle Halobacterium sp, exists in extreme or high salt concentrations and can be found worldwide. It is a Gram-negative, rod-shaped in a unique arrangement that is important in their ability to move and survive in the harsh conditions in which they live.[1] To isolate Halobacterium sp, we used a sample of sea fish, which was enriched in peptone water and incubated auspiciously and then spread it on Mannitol Salt Agar (ASM), which were removed for staining colonies and biochemical tests, which will give us clues to the nature of the bacteria isolated and somehow confirm their identity, deepen procedures below.Key words: peptone water, bacteria, colonies, mannitol salt agarINTRODUCCINLa percepcin humana se ha derrochado generosamente con el espritu de un verdadero cazador detrs de cada posibilidad de dar con los microorganismos que circundan en nuestro medio, y no obstante no se conforma solamente con conocerlos, observarlos, sino tambin aislarlos para as saber las condiciones a las cuales estos crecen y se desarrollan. Con tal objeto se han descubierto numerosos mtodos, muchos de los cuales no han persistido porque resultaban demasiado laboriosos o porque los resultados obtenidos no eran fciles de interpretar. Aun en la actualidad existe un mtodo mucho mas prctico, econmico y menos laborioso o tedioso, ste es el aislamiento de microorganismos a nivel de laboratorio conociendo el sustrato o alimento donde estos crecen y suministrndole los nutrientes necesarios y de igual forma, dotando al microorganismo de las condiciones necesarias para su crecimiento. En el estudio realizado por los autores [1], se aisl el microorganismo Halobacterium Sp, El gnero Halobacterium sp, es una arqueobacteria aerobia hetertrofa que se caracteriza por ser halfila estricta, consigue su equilibrio osmtico con concentraciones elevadas de cloruro potsico, carece de murena y por tal razn su pared celular requiere de iones de sodio para lograr la estabilidad; Halobacterium sp, existe en extremas o altas concentraciones de sal y se puede encontrar en todo el mundo. Estos incluyen las instalaciones de produccin de sal, de inclusiones de salmuera en los cristales de sal en las salinas, as como lagos y lagunas naturales y en los mares. Halobacterium Sp es una bacteria Gram negativa, Este microorganismo mesfilo es una bacteria con forma de bastn en una disposicin nica que es importante en su capacidad para moverse y sobrevivir en las duras condiciones en que viven, no tienen endosporas, por lo tanto, pueden ser daados por los rayos ultravioleta, gamma y la temperatura. [1].Sonaerobiosobligados que crecen sobreaminocidos. Tienen forma de coco o de bacilo, un color rojo o prpura y son mviles. La temperatura ptima deHalobacteriumSp es de 42 C y una alcalinidad (NaCl) ptima de 4,3. La experiencia fue realizada en el Laboratorio de Microbiologa de Alimentos de la Universidad de Crdoba, y tuvo como objetivo principal el aislamiento de la bacteria Halobacterium Sp de pescado de mar. MATERIALES, REACTIVOS Y METODOLOGAMATERIALES 1. Materia prima (pescado de mar)1. Esptula estril. 1. Balanza analtica.1. Bolsa plstica para el agua peptona.1. Agua peptonada (con cloruro de sodio a una concentracin de 2,5M).1. Mecheros.1. Agar ASM (con cloruro de sodio a una concentracin de 2,5M).1. Asa bacteriolgica redonda.1. Asa bacteriolgica en punta. 1. Incubadora. 1. Portaobjetos y cubreobjetos. 1. Microscopio. 1. Aceite de inmersin. 1. Batera para las pruebas bioqumicas respectivas: (Nitrato, Catalasa, Motilidad y H2S, Ureasa, KIA, Rojo de metilo y Citrato)

REACTIVOS Reactivos para Tincin de Gram: cristal violeta, agua destilada, lugol, alcohol acetona, safranina de Gram. Perxido de hidrgeno (Para prueba de Catalasa). METODOLOGA (ETAPAS DEL PROCESO) ETAPA N1: OBTENCIN DE LA MATERIA PRIMALa materia prima bajo la que se trabaj, fue pescado de mar el cual se obtuvo en el mercado pblico de Cinaga de Oro Crdoba.ETAPA N2: PRE-ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA. Para esta etapa se llev al laboratorio pescado de mar. Seguidamente, se pesaron 10g de pescado se introdujo en una bolsa plstica con 90 ml de agua peptonada. Se agito manualmente, luego se llevo a incubar a 37C por 24 horas. Fig. 1: Pre-enriquecimiento de la muestra (pescado de mar en agua peptonada)

ETAPA N3: SIEMBRA POR MTODO FRANCSAl segundo da luego del enriquecimiento de la muestra de pescado, se realiz la siembra por mtodo francs en el Agar ASM (Agar salado manitol). Se dej transcurrir 24 horas ms y se pudieron observar los resultados del crecimiento de la bacteria. ETAPA N4: TINCIN DE GRAM Se realiz la tincin de Gram despus de pasadas 24 horas para observar el crecimiento del microorganismo en el medio. Se tomaron muestras de colonias del cultivo de Halobacterium Sp con respecto al crecimiento de la bacteria en cuestin, en efecto, el medio ASM, presento caractersticas de crecimiento del Halobacterium Sp debido a que es un medio muy selectivo para este microorganismo. Posteriormente, siguiendo el procedimiento de este mtodo se realiz el montaje para la tincin diferencial de Gram.ETAPA N 5: PRUEBAS BIOQUMICASLuego de haber realizado las tinciones se procedi al desarrollo de las pruebas bioqumicas, basadas en los siguientes principios:KIA: Determina la capacidad de la bacteria de atacar un hidrato de carbono especifico, incorporado en un medio de crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto con la posible formacin de H2S.(1) NITRATO: esta prueba bioqumica evala la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito o gas nitrgeno libre. Esta reduccin se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales un organismo produce su oxigeno del nitrato(2). CATALASA: determina la presencia de la enzima catalasa la cual elimina de manera cataltica el anin superxido. Esta enzima es esencial en la defensa biolgica contra la toxicidad del oxigeno (3). UREASA: Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos molcula de amoniaco por accin de la enzima ureasa. Indicador, Rojo de fenol (4)MOTILIDAD Y SH2: esta prueba se basa en observar la motilidad de un microorganismo, gracias a la baja concentracin de agar, lo cual nos indica la presencia de flagelos. Por otro lado se puede determinar si se ha liberado H2S por la accin enzimtico de los aminocidos que contienen azufre, produciendo una reaccin visible de color negro, se usan como indicadores tiosulfato de sodio y sulfato ferroso. Adems tambin se observa en el medio la formacin de indol (4).ROJO DE METILO: Comprueba la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema.PruebaResultado +Resultado -

Kia / :Fermentacin de G y L / :No hay fermentacin

Nitrato

Catalasa BurbujeoSin burbujeo

Ureasa

Motilidad y SH2Mvil y SH2No mvil y no se produce SH2

Citrato Azul VerdeRojo de metiloAnillo rojo en la superficieAmarillo en la superficie

CITRATO: Determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono para el metabolismo provocando alcalinidad. La utilizacin de cidos orgnicos y sus sales como fuente de carbono produce carbonatos alcalinos en nueva degradacin. Indicador de pH: azul de bromotimol.

Tabla 1.1 de coloracin de las pruebas en los medios

RESULTADOS Y DISCUSIN:1. SIEMBRA EN MEDIO A.S.M

Fig.1 crecimiento de la cepa en el medio A.S.MLa siembra realizada en el medio selectivo para el crecimiento de Halobacterium Sp. Fue satisfactoria dado que el crecimiento se manifest en el medio (fig.2.)TINCIN DE GRAM De acuerdo a lo observado despus de haber realizado el procedimiento se puede decir que la cepa de estudio es un bacilo Gram negativo, debido la coloracin violeta que se observa en la figura 3. Aunque cabe resaltar que tambin se observaron bacilos Gram positivos.

Fig.3 Coloracin de Gram

2. PRUEBAS BIOQUMICAS: KIA

Fig. 4 prueba KIAPrueba KIA gas ac/ac coloracin amarilla en toda la lnea de siembra, con presencia de gas en el pico de flauta. (fig.4) NITRATO: Fig. 5 prueba nitratoPrueba nitrato positiva, con viraje de color rojo. (fig.5) CATALASA

Fig. 6 prueba catalasaPrueba de catalasa positiva, formacin de burbujas en la superficie del portaobjeto que contena la muestra (fig. 6) UREASA

Fig. 7 prueba ureasaPrueba de ureasa negativa, coloracin piel de ante (fig.7). MOTILIDAD Y SH2 Fig. 8 prueba Motilidad y SH2La prueba de Motilidad y SH2 dio un resultado positivo debido a que los microorganismos mviles migran de la lnea de siembra y se difunden en el medio, ennegrecimiento del medio para el H2S. ROJO DE METILO

Fig. 9 prueba rojo de metiloPrueba rojo de metilo positiva, anillo rojo en la superficie.

CITRATO

Fig. 10 prueba de citratoPrueba negativa debido a que no cambio de color el medio se mantuvo de color verde.

Prueba Resultado

KIA(+) Ac gas/Ac.

Nitrato(+) Viraje de color rojo en la superficie.

Catalasa (+)Formacin de burbujas.

Ureasa (-) no se produce cambio de color (piel de ante).

Motilidad y SH2(+) hubo crecimiento y hubo presencia de sulfuro.

Rojo de metilo(+) Medio licuado

Citrato (-) coloracin verde.

Tincin de Gram(-)coloracin fucsia de las clulas

Tabla 2. Resultado de pruebas experimentalesDe acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas bioqumicas, tincin de Gram, y teora consultada sobre la cepa de estudio (Halobacterium Sp), se podra decir que la cepa aislada podra ser la buscada debido que todas las caractersticas obtenidas por pruebas de laboratorio (realizados por nosotros) fueron las encontradas en la teora, cabe resaltar que no puede afirmar que la especie encontrada corresponde a la del anlisis dado que para esto se necesita una confirmacin con pruebas de antibitico las cuales no pudieron ser ejecutadas por falta de recursos. CONCLUSINEn este articulo podemos concluir que se pudo llevar a cabo de manera exitosa el objetivo del trabajo el cual consista primordialmente en aislar la bacteria Halobacterium Sp a partir de pescado de mar, se puede decir que para tener una certeza razonable de que el microorganismo aislado era el mencionado anteriormente se realizaron un conjunto de pruebas bioqumicas las cuales produjeron unos resultado exitoso concordando con la teora consultada al igual que la tincin efectuada; para finalizar podemos decir que a pesar que todas las pruebas bioqumicas dieron resultados satisfactorios no podemos afirmar en un 100% que las colonias obtenidas en el cultivo correspondan a Halobacterium Sp dado que para tener una seguridad absoluta de que la bacteria asilada corresponda a Halobacterium Sp se deban realizar pruebas ms rigurosas como lo serian exmenes genticos y pruebas antibiticas.RECOMENDACIONESComo recomendaciones tenemos las siguientes, las cuales son muy importantes a la hora de aislar dicho microorganismo: Antes de realizar el procedimiento del aislamiento se deben consultar todos los pasos con el estado del arte de dicho microorganismo que se vaya a aislar. Mantener el rea de trabajo desinfectada y en buenas condiciones, para evitar la contaminacin de diversos microorganismos. Se debe utilizar los medios de cultivos adecuados para as poder evidenciar si existe o no crecimiento de bacterias. Trabajar cuidadosamente para as evitar riegos de accidentes con dichas bacterias. Utilizar adecuadamente todos los implementos necesarios para la realizacin de la prctica y as evitar la contaminacin de los mismos. BIBLIOGRAFA 1. GRUPO NORIEGA. EDITORES/Escrito por Agustn Lpez, Mariano Garca Garibay, Rodolfo Quintero Ramrez, Agustn Lpez-Mungua Canales 2. BEUCHAT, Thomas J. DOYLE, Michael P. R. Larry. Microbiologa de los alimentos, fundamentos y fronteras editorial Acribia S.A. 3. KONEMAN, Elmer; STEPEN D. Allen. Diagnostico, Microbiolgico. Texto y atlas.5a edicin. Editorial medica. Panamericana. 4. MACFADDIN, Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. 3ra Edicion Argentina (2003), 526-527. 5. RAMON PARES. Bioqumica de los microorganismos. Reverte. Barcelona Espaa. Pg. 118.