guia_tp1_introducao_plasmideos_2011-2012 (4)
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GUIA DE TRABALHOS LABORATORIAIS
de
ENGENHARIA GENÉTICA
Mestrado em Engenharia Biológica Mestrado em Engenharia Biomédica
(2011/2012)
Leonilde M. Moreira
Cristina A. Viegas
Arsénio Fialho
Jorge H. Leitão
Isabel Sá-Correia
(Área de Ciências Biológicas, IST)
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ENGENHARIA GENÉTICA
(Mestrados em Engª Biológica e Engª Biomédica)
(2011/2012)
Aulas laboratoriais
AULA TRABALHO
A1 TP1- Introdução de plasmídeos em bactérias por conjugação triparental e
electrotransformação.
A2 TP2- Amplificação do gene pgmG (que codifica a proteína bifuncional com
actividades de fosfoglucomutase/fosfomanomutase) a partir do DNA cromossómico de
Sphingomonas elodea, por recurso à técnica de PCR.
Utilização de ferramentas bioinformáticas para análise de sequências de nucleótidos e
aminoácidos.
A3 TP3- Hibridação de Southern utilizando sondas não radioactivas (1ª parte).
A4 TP4- Hibridação de Southern utilizando sondas não radioactivas (2ª parte).
A5 TP5- Métodos moleculares de tipagem: aplicação a isolados clínicos de Burkholderia
cepacia. Estudos de interacção proteína-proteína usando um sistema de dois híbridos
para bactérias.
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BIOSSÍNTESE DO EXOPOLISSACÁRIDO GELANO POR Sphingomonas elodea
O gelano é um heteropolissacárido constituído por uma unidade tetrassacarídica
repetitiva, apresentando, na sua forma nativa, substituintes acilo laterais (Fig. 1).
Figura 1- Estrutura nativa do gelano. Abreviaturas: D-Glc: D-glucose; D-GlcA, ácido D-glucurónico; L-Rha, L-
ramnose; Oac: grupo acetilo; OGl: grupo glicerilo.
O gelano quando desacilado, é capaz de formar géis rígidos e quebradiços. Devido às suas
propriedades gelificantes, tem uma vasta gama de aplicações biotecnológicas, nomeadamente
nas indústrias alimentar e farmacêutica. É produzido, com elevado rendimento, pela espécie
bacteriana Sphingomonas elodea (Fialho et al., 2008).
Entre as várias actividades enzimáticas envolvidas na síntese dos precursores
activados, a enzima fosfoglucomutase (PGM) desempenha um papel central, catalizando a
interconversão de glucose 6-fosfato, um importante intermediário glicolítico, a glucose 1-
fosfato, um intermediário importante para a síntese de compostos de reserva e de
polissacáridos. O gene que codifica a actividade de fosfoglucomutase em S. elodea (pgmG)
foi já clonado e sequenciado (Fig. 2), sabendo-se que codifica uma proteína bifuncional de
cerca de 50 kDa, com actividades de fosfoglucomutase e fosfomanomutase (catalisa a
interconversão da manose 6-fosfato a manose 1-fosfato). A proteína PgmG de S. elodea
pertence à família das fosfohexomutases, que contêm três domínios funcionais característicos
[o centro activo, o local de ligação a iões metálicos (ex. Mg 2+) e o local de ligação ao
substrato] altamente conservados quer em bactérias, quer em organismos superiores (Videira
et al., 2000).
Um outro gene essencial na biossíntese de gelano denomina-se gelE. Este gene
codifica para uma proteína homóloga a proteínas com actividade de tirosina cinase e encontra-
→→→→ 3)-ββββ-D-Glcp-(1→→→→4)-ββββ-D-GlcpA-(1→→→→4)-ββββ-D-Glcp-(1→→→→4)-αααα-L-Rhap-(1→→→→
(OAc)
(OGl)
6
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4
se envolvido nos passos finais de polimerização e excreção de gelano . Foi construído um
mutante de eliminação para este gene, tendo-se confirmado a ausência da produção de gelano
nesse mesmo mutante (Moreira et al. 2004).
Um dos objectivos do presente trabalho laboratorial é a introdução por
electrotransformação de um plasmídeo recombinado contendo o gene gelE (pHA010-3) no
mutante de Sphingomonas elodea ∆GelE (SpLM21-4) por forma a avaliar a reposição do
fenótipo mucoso desse mutante. A este processo denomina-se complementação homóloga.
Com o objectivo de demonstrar a complementação heteróloga, vai-se introduzir por
conjugação triparental um plasmídeo recombinado contendo o gene pgmG numa estirpe
mutante para a actividade de PGM de Pseudomonas aeruginosa e observar a reposição do
fenótipo mucoso devido à produção de alginato.
Em trabalhos posteriores ír-se-à obter um fragmento de DNA contendo o gene pgmG
de S. elodea usando a técnica de PCR. Esse fragmento de DNA será posteriormente usado
como sonda em experiências de hibridação de Southern. Finalmente proceder-se-à a estudos
de interacção proteína-proteína usando diversas proteínas envolvidas na biossíntese de gelano.
Fialho AM, Moreira LM, Granja AT, Popescu AO, Hoffman K, Sá-Correia I. (2008). Occurrence, production and applications of gellan: current state and perspectives. Applied
Microbiology and Biotechnology.79:889-900. Moreira LM, Hoffmann K, Albano H, Becker A, Niehaus K, and Sá-Correia I. (2004). The gellan gum biosynthetic genes gelC and gelE encode two separate polypeptides homologous to the activator and the kinase domains of tyrosine autokinases. Journal of Molecular Microbiology and
Biotechnology 8:43-57. Videira, P. A., L. L. Cortes, A. M. Fialho, e I. Sá-Correia. 2000. Identification of the pgmG gene, encoding a bifunctional protein with phosphoglucomutase and phosphomannomutase activities, in the gellan gum-producing strain Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461. Applied and Environmental
Microbiology. 66:2252-2258.
1 gacacgttgctgcgcggttgaggaccgtcctccgcacgtaacattttgccggcaactatg -35
61 ctgcagtgcaaaaattattaatctttccgtgcacggcgcgtcttgaaacttccattcgag
-10
121 tcgcggaaga ggcacgcatc tttaccttcg ggagggcatg a
RBS
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5
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K S G I V R G E Q A A H *
aggggca Figura 2- Sequência de nucleótidos do gene pgmG de S. elodea e sequência deduzida de aminoácidos (código de 1 letra). Encontram-se ainda indicadas as potenciais regiões –35 e –10 do promotor e o local de ligação ao ribossoma (RBS).
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TP1- INTRODUÇÃO DE PLASMÍDEOS RECOMBINADOS EM BACTÉRIAS
Pretende-se com este trabalho ilustrar e comparar dois métodos de introdução de DNA
recombinado em duas espécies Gram-negativas, S. elodea e P. aeruginosa e que são a
electrotransformação e a conjugação triparental (Fialho et al., 1991; Monteiro et al., 1992).
Por recurso à técnica de electrotransformação serão introduzidos no mutante SpLM21-4 de S.
elodea um plasmídeo contendo o gene gelE (pHA010-3) ou o vector onde este gene foi
clonado (plasmídeo pBBR1MCS) de forma o observar (ou não) a reposição do fenótipo
mucoso. Na conjugação triparental, será utilizada a estirpe P. aeruginosa 8858, com o
objectivo de observar a complementação, homóloga ou heteróloga, da mutação que as células
desta estirpe possuem no gene que codifica a actividade de
fosfoglucomutase/fosfomanomutase. Essa complementação será efectuada por introdução dos
plasmídeos recombinados pNZ49 ou pLC100 (contêm os genes algC ou pgmG de P.
aeruginosa ou S. elodea, respectivamente) e clonados no vector de expressão pMMB66(HE).
A complementação será visualizada através da reposição do fenótipo mucoso [capacidade
para produzir o exopolissacárido alginato (May e Chakrabarty, 1994)] no referido mutante de
P. aeruginosa 8858 (algC-).
Monteiro, G. A., A. M. Fialho, S. J. Ripley, e I. Sá-Correia. 1992. Electrotransformation of gellan-gum producing and non-producing Pseudomonas elodea strains. Journal of Applied Bacteriology 72:423-428.
Fialho, A. M., G. A. Monteiro, e I. Sá-Correia. 1991. Conjugal transfer of recombinant plasmids into gellan-gum producing and non-producing variants of Pseudomonas elodea ATCC 31461. Letters of
Applied Microbiology 12:85-87.
May, T. B., e A. M. Chakrabarty. 1994. Pseudomonas aeruginosa: genes and enzymes of alginate synthesis. Trends in Microbiology. 2:151-157.
A. Electrotransformação de Sphingomonas elodea
A electrotransformação tornou-se uma valiosíssima técnica de introdução de DNA quer
em células eucarióticas quer em bactérias, tendo vindo a possibilitar a transformação eficiente
de espécies refractárias à transformação pelo método clássico (incubação com CaCl2 ou
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outros catiões tais como o Rb+, o K+, seguida de choque térmico). Nesta técnica, as células a
transformar são sujeitas, durante um curto espaço de tempo, a um campo eléctrico de elevada
voltagem. Pensa-se que esta exposição tornará a membrana celular reversivelmente permeável
a macromoléculas permitindo assim a entrada, com elevada eficiência, de DNA plasmídico,
mesmo o de elevado peso molecular. Enquanto que o campo eléctrico usado na
electrotransformação de células de mamíferos e de protoplastos de plantas é de normalmente
0,5 - 1 kV cm-1, o campo eléctrico necessário para a transformação de bactérias (dadas as
suas dimensões diminutas) é muito superior (em média entre 6 - 12,5 kV cm-1). Tal facto
exigiu a introdução de algumas modificações no equipamento usado para a
electrotransformação de bactérias, de modo a permitir o uso dessas grandes voltagens sem
riscos quer para o equipamento quer para o operador.
A electrotransformação é uma técnica de introdução de DNA muito eficiente, rápida,
reprodutível e de fácil execução. Permite o uso, com idêntica eficiência de transformação,
quer de células frescas (usadas logo após centrifugação e suspensas no tampão de
electrotransformação, por exemplo 10 % (v/v) glicerol) quer após congelação (em tampão de
electrotransformação) e armazenamento a - 70 °C, durante vários mêses. A eficiência de
electrotransformação (nº de transformantes / µg DNA) e a frequência de electrotransformação
(nº de transformantes / nº de células viáveis após electrotransformação) dependem de várias
condições experimentais (fase da curva de crescimento em que as células são recolhidas,
concentração das células e composição do tampão usados para a electrotransformação, bem
como variáveis associadas ao aparelho de electroporação, tais como - intensidade do campo
eléctrico e duração do pulso, o qual, por sua vez, depende do valor da resistência introduzida
em paralelo com a resistência da amostra, etc). Depende ainda da dimensão do DNA a
introduzir e da estirpe hospedeira a transformar (nomeadamente do seu sistema de
modificação - restrição).
Neste trabalho, proceder-se-á à introdução em células de S. elodea ∆gelE do vector de
clonagem pBBR1MCS (4,7 kb) e do plasmídeo recombinado pHA010-3 (contendo o gene
gelE de S. elodea e de dimensão 5,4 kb) (Anexo III).
8
TÉCNICA:
I- Preparação de células competentes para electrotransformação
1. Inocular, uma colónia da estirpe SpLM21-4 (∆gelE), em 20 ml de LB. Crescer durante
a noite a 30 °C com agitação constante.
2. Adicionar o pré-inóculo a 750 mL de LB (DO inicial 0,05), e crescer até uma
densidade óptica, determinada a 640 nm, de 1,2 ± 0,1 (12 horas), a qual corresponde a
uma fase avançada do crescimento exponencial.
3. Transferir a cultura para tubos de centrifuga; arrefecer em gelo durante 15 minutos.
4. Centrifugar a cultura durante 15 minutos a 5.000 rpm, a 4°C (Beckman J2 - 21 ; rotor
JA 10).
5. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 mL de H2O
desionizada fria.
6. Repetir 4.
7. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 300 mL de H2O
desionizada fria.
8. Repetir 4.
9. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 mL de uma
solução fria (em gelo) de 10 % de glicerol (v/v).
10. Centrifugar a cultura durante 10 minutos a 5.000 rpm, a 4°C (Beckman J2 - 21 ; rotor
JA 10).
11. Ressuspender o sedimento em 20 ml glicerol 10 % (v/v) frio.
12. Repetir 10.
13. Ressuspender o sedimento em 10 ml de glicerol 10%(v/v) frio.
10. Dividir a suspensão celular em aliquotas (500 µL) e conservar a -70 °C. Nota: Este procedimento não será efectuado na aula. As células serão fornecidas já preparadas.
9
II- Electrotransformação
1. As células a electrotransformar, após descongelamento lento, deverão ser mantidas em
gelo. As cuvettes para electrotransformação (0,2 cm) deverão também ser previamente
arrefecidas (colocadas a -20 °C durante a noite).
2. Ligar o aparelho de electroporação ("Gene Pulser" da "BioRad" equipado com um
"Pulser controler"). Acertar a voltagem para 2,5 kV, o condensador para 25 µF e a
resistência para 400 Ω.
3. Adicionar às células electrocompetentes 2-5 µl de uma solução de DNA plasmídico em
H2O (cerca de 350 ng). Usar soluções dos plasmídeos pBBR1MCS, e pHA010-3.
Agitar a suspensão, com a ponta da pipeta, tendo o cuidado de não deixar formar bolhas
de ar.
4. Transferir a mistura para a cuvette evitando a formação de bolhas de ar, e colocá-la na
câmara de electrotransformação.
5. Desferir a corrente eléctrica.
6. Retirar a cuvette e adicionar, imediatamente, 2 ml de meio LB à suspensão.
7. Incubar, com agitação, a 30°C durante 2 horas [crescimento das células em meio não
selectivo, durante o tempo correspondente a cerca de uma geração, de modo a permitir a
síntese de proteínas codificadas pelos genes relacionados com as marcas selectivas
associadas ao plasmídeo (por exemplo de resistência a antibióticos)].
8. Plaquear (após diluição apropriada em solução salina) a suspensão celular em placas de
meio S contendo 25 mg/l de cloranfenicol (LB+Cm) para a selecção de transformantes.
9. Plaquear a mesma suspensão, diluída de 10-4 a 10-7, em meio S, para a determinação
do nº de células viáveis totais.
10
10. Incubar, durante 3 dias, a 30 °C, para crescimento dos electrotransformantes.
11. Calcular a eficiência (nº de transformantes / µg de DNA) e a frequência da
electrotransformação (nº de transformantes/nº de células viáveis após
electrotransformação) para cada um dos plasmídeos, nas condições ensaiadas. Observar
ainda se houve ou não reposição do fenótipo mucoso.
B- Transferência de DNA recombinado de Escherichia coli para Pseudomonas
aeruginosa por conjugação triparental
A transferência de DNA plasmídico por conjugação pressupõe contacto físico entre as
células, dadora e receptora. Há plasmídeos que, embora não sendo autotransmissíveis, são
mobilizáveis (como é o caso dos plasmídeos pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49, usados neste
trabalho). Isto quer dizer que não apresentam genes (tra), envolvidos no processo de
transferência (responsáveis por exemplo pela síntese do pilus sexual e de outras estruturas de
superfície que permitem o contacto físico entre as duas células envolvidas) mas que
apresentam os genes (mob) que codificam para funções envolvidas na sua mobilização entre
células. Neste caso, é necessário recorrer a um plasmídeo "ajudante" que, por ser conjugativo,
vem mediar a transferência de plasmídeos mobilizáveis por conjugação. Neste trabalho, usar-
se-á o plasmídeo pRK2013 (plasmídeo conjugativo) em E. coli HB101, que será uma terceira
estirpe (a estirpe ajudante) a qual participará num processo de acasalamento que envolverá
assim as 3 estirpes (dadora, receptora e ajudante). Estas serão para tal colocadas em contacto
sobre um filtro que retém bactérias (porosidade = 0, 45 µm).
O sistema descrito é geralmente utilizado para introduzir plasmídeos mobilizáveis em
espécies que não são transformáveis com uma eficiência razoável, ou que são mesmo
refractárias à transformação clássica, não sendo possível proceder à sua electrotransformação.
Os plasmídeos usados neste trabalho (pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49) têm uma vasta
gama de hospedeiros entre as bactérias Gram-negativas podendo assim replicar quer em E.
11
coli , a célula dadora, quer em P. aeruginosa, que neste trabalho funciona como célula
receptora.
TÉCNICA :
1. Inocular e incubar, durante a noite, a 37 °C e com agitação vigorosa, em meio LB
contendo o antibiótico indicado pela marca selectiva do plasmídeo (Anexo I, Tabelas I e
II), as seguintes bactérias:
a ) Escherichia coli HB101/ pRK2013
b) Pseudomonas aeruginosa 8858
c) Escherichia coli HB101/pMMB66(HE)
d) Escherichia coli HB101/pLC100
e) Escherichia coli HB101/pNZ49
- O plasmídeo conjugativo pRK2013 contém a marca de resistência a canamicina (Km)
pelo que se deverá adicionar 50 mg/l deste antibiótico ao meio de cultura. Os plasmídeos
pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49 (anexo III) conferem resistência à ampicilina, pelo que este
antibiótico deverá ser adicionado ao meio de cultura (Anexo II. B.).
1. Lavar as células com solução salina (NaCl 0,9%(v/v)) para eliminar restos dos
antibióticos.
2 Para mobilizar os plasmídeos pMMB66(HE), pLC100 ou pNZ49 para dentro de células
de P. aeruginosa 8858, proceder às seguintes misturas (A a C), de 3 culturas num tubo
eppendorf:
P. aeruginosa 8858 (0,5 ml)
A E. coli HB101/pRK2013 (0,1 ml)
E. coli DH1 / pMMB66(HE) (0,2 ml)
12
P. aeruginosa 8858 (0,5 ml) P. aeruginosa 8858 (0,5 ml)
B E. coli HB101 / pRK2013 (0,1 ml) C E. coli HB101/pRK2013 (0,1 ml)
E. coli DH1 / pLC100 (0,2 ml) E. coli DH1 / pNZ49 (0,2 ml)
4. Centrifugar 1 min, ressuspender as células no líquido que fica no eppendorf e aplicar
sobre um filtro estéril colocado num placa de LB sólido. Incubar a 30°C entre 6 a 18 h.
5. Ressuspender as células que cresceram sobre a membrana em 1 ml de uma solução estéril
de cloreto de sódio (0,9% p/v) (solução salina) contida em tubo de ensaio, mediante forte
agitação (vórtex).
6. No caso de P. aeruginosa 8858 (misturas A, B e C) plaquear em placas de meio PIA
(anexo II) suplementado com 500 mg/l de carbenicilina, a suspensão celular obtida em 5.
após diluição dessa mesma suspensão de 10-1 a 10-3 em solução salina estéril. Plaquear
ainda (após diluição entre 10-4 e 10-7 em solução salina) a mesma suspensão celular em
placas de meio PIA para determinação do número de células viáveis.
Nota: Dado que E. coli não cresce em meio PIA e que P. aeruginosa é naturalmente resistente
a ampicilina, as placas de PIA contendo carbenicilina visam seleccionar os transconjugantes
de P. aeruginosa 8858 que contêm os plasmídeos pMMB66(HE), pLC100 ou pNZ49.
7. Incubar, durante 2 a 3 dias, a 30 °C, para crescimento dos transconjugantes.
8. Calcular a frequência de conjugação (nº de transconjugantes/nº de células viáveis após
conjugação) para cada plasmídeo, nas condições ensaiadas.
9. Registar, no caso dos tranconjugantes de P. aeruginosa 8858, a reposição do fenótipo
mucoso produtor do exopolissacárido alginato, resultante da ocorrência de complementação
homóloga (pNZ49) ou heteróloga (pLC100).
13
Anexo I
TABELA I - ESTIRPES BACTERIANAS
Estirpe Fenótipo / Genótipo
S. elodea SpLM21-4 Gelano-; gelE-
P. aeruginosa 8858 Alginato-, algC-
E. coli HB101 F-, hsdR , hsdM , recA
TABELA II - PLASMÍDEOS
Plasmídeo Hospedeiro Descrição
pHA010-3 - gene gelE, Cmr
pBBR1MCS - vector, Cmr
pMMB66HE E. coli HB101 vector, Apr
pLC100 E. coli HB10 gene pgmG, Apr
pNZ49 E. coli HB101 gene algC, Apr
pRK2013 E. coli HB101 Kmr, tra+ Anexo II
A- Meios de cultura Os meios de cultura são esterilizados em autoclave (15 minutos,120 °C).
Meios líquidos Meio LB (pH 7,5) líquido (g/l) NaCl 5 g Peptona (Difco) 10 g Extracto de levedura (Difco) 5 g
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Meios sólidos
Os meios sólidos usados são idênticos aos meios líquidos aos quais se adicionou 20 g de agar por litro. O meio PIA é uma formulação comercial, sendo apenas necessário juntar 45 g de PIA, 20 ml de glicerol, perfazer o volume a 1 litro e esterilizar. Meio S (pH 7,4) ( g / l)
Na2HPO4 10 g
KH2PO4 3 g
K2SO4 1 g
NaCl 1 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
Hidrolisado de caseina (Difco) 1 g
Extracto de levedura (Difco) 1 g
Glucose * 20 g
CaCl2.2H2O * * 0,01 g
FeSO4.7H2O * * 0,001 g
* A glucose (tal como os outros açúcares) é esterilizada sempre em separado ** Soluções concentradas (10x) de CaCl2 e FeSO4 são esterilizadas,
individualmente, e em separado dos outros componentes do meio.
B. Antibióticos
Meio sólido (mg/l) Meio líquido (mg/l)
Ampicilina 150 75
Canamicina 100 50
Carbenicilina 500 -
Cloranfenicol 25 -
Os meios selectivos são preparados por adição de soluções concentradas dos
antibióticos (esterilizados por filtração) de modo a se obterem as concentrações acima indicadas. A concentração de antibiótico a usar para a preparação dos meios líquidos será metade da concentração usada em meio sólido.
15
Anexo III – Mapas de restrição dos plasmídeos pMMB66(HE), pLC100, pNZ49 e pHA010-3.
702 pbgelE
pBBR1MCS
4,7 kb
Plac
CmR
β-gal
KpnI HindIII
pHA010-3 (gelE)
B
702 pbgelE
pBBR1MCS
4,7 kb
Plac
CmR
β-gal
KpnI HindIII
pHA010-3 (gelE)
B
702 pbgelE
pBBR1MCS
4,7 kb
Plac
CmR
β-gal
KpnI HindIII
pHA010-3 (gelE)
702 pbgelE
pBBR1MCS
4,7 kb
Plac
CmR
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KpnI HindIII
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