guião do aluno versão b
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VERSO B
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NDICE:
Introduo... 3
Parte I Enquadramento terico da actividade 4
Parte II Problematizao da actividade... 9
Parte III Procedimentos protocolares........................................... 12
Parte IV Anlise e discusso dos resultados.. 16
Parte V Actividades complementares... 17
Parte VI Glossrio. 26
Apndices. 28
Referncias Bibliogrficas.... 34
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Introduo
O kit BioExperimentando uma actividade prtica, de laboratrio, que se baseia numa
simulao de uma triagem gentica numa famlia que possui uma doena hereditria fictcia. Nesta
actividade pretende-se que se integre a compreenso de processos genticos, com as tcnicas associadas,
e as respectivas questes ticas.
Os alunos tero que determinar a probabilidade de um determinado casal ter um filho doente,
atravs da anlise das amostras de DNA, aps restrio e separao electrofortica.
O kitBioExperimentando vai permitir que o aluno:
estude a transmisso de determinada caracterstica hereditria, atravs de tcnicas de
Engenharia Gentica;
analise e interprete casos de mutao, sua gnese e consequncias;
explore procedimentos laboratoriais de manipulao do DNA;
compreenda a importncia e modo de funcionamento das enzimas de restrio;
manipule o material de laboratrio de forma autnoma e responsvel;
desperte a curiosidade relativa metodologia desta investigao;
compreenda a utilidade de algumas tcnicas utilizadas em Engenharia Gentica no
quotidiano dos cidados;
use o pensamento crtico para resolver problemas;
discuta algumas questes ticas inerentes manipulao do DNA.
Este kitfoi concebido para alunos do Ensino Secundrio do Curso de Cincias e Tecnologias do
12ano, no mbito da disciplina de Biologia.
KitBioExperimentando (verso B)
Etapas de implementao Vantagens da utilizao Ajuda a ensinar
Cultura de bactrias
Extraco do DNA
plasmdico
Introduo aos perfis de
DNA
Restrio das amostras
de DNA
Electroforese em gel de
agarose
Anlise e interpretao
de resultados
Preparao e manuteno de culturas
de bactrias.
Aquisio de tcnicas laboratoriais na
rea da microbiologia e da biologia
molecular.
Uso de enzimas de restrio reais e
realizao de electroforese com
fragmentos de DNA real.
A actividade pode ser realizada em trs
sesses de 90 minutos (no entanto o
professor poder reajustar o tempo).
Material suficiente para 23 alunos.
Preparar meios de cultura
Extrair DNA plasmdico
Estrutura do DNA
Hereditariedade clssica
Mendeliana (autossmica ou
ligada ao sexo)
Anlise de restrio do DNA
Preparar um gel de agarose para
electroforese
Determinar o tamanho molecular.
Simulao de perfis de DNA
Anlise de mapas de restrio
Questes ticas inerentes aos
testes genticos.
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Medidas de segurana
No permitido comer, beber ou fumar no laboratrio/rea de trabalho.
recomendado a utilizao de luvas e de uma bata de algodo.
Os alunos devem lavar as mos com gua e sabo antes e depois da actividade.
Se alguma soluo entrar em contacto com os olhos, estes devem ser imediatamente lavados
com gua.
Parte I Enquadramento terico da actividade
A anlise de DNA humano tem aplicaes em duas grandes reas:
1. Cuidados de sade inclui o diagnstico de doenas hereditrias, mutaes cromossmicas e cancro.
2. Sistema judicial identificao de suspeitos em casos criminais (homicdio, rapto, roubo) e anlise
de relaes familiares em casos de disputa da paternidade e de imigrao.
Na presente actividade simula-se o diagnstico de uma doena fictcia, que afecta vrios membros de uma
famlia. So vrios os conceitos e tcnicas inerentes implementao e compreenso da actividade:
Cultura de bactrias
As bactrias so conhecidas desde 1674, sendo a sua estrutura ainda objecto de estudo. So os
seres vivos mais simples do ponto de vista estrutural, e os de menor tamanho. As bactrias so
microorganismos unicelulares, procariontes.
A cultura de bactrias o crescimento de colnias de microorganismos induzida pelo Homem
para facilitar o seu estudo. Para a realizao de uma cultura bacteriana, precisamos de um inoculo e deum meio de cultura. Os meios de cultura podem ser de dois tipos: meios lquidos ou meios slidos. Os
meios lquidos so normalmente utilizados para enriquecimento das bactrias, enquanto que os meios
slidos so utilizados para o seu isolamento. O meio de cultura permite a nutrio, o crescimento e a
multiplicao dos microorganismos do inoculo. Os meios de cultura so seleccionados consoante o tipo
de bactria. As bactrias multiplicam-se em meios de cultura apropriados desde que sejam respeitadas
as condies de temperatura, pH, humidade e composio.
Um bom meio de cultura deve possuir as seguintes caractersticas:
- Um teor de humidade entre os 75% e os 95%.
- Os nutrientes necessrios- Possuir um pH adequado
- Ser estril
- Possuir as propriedades fsicas desejveis (lmpido, lquido, slido)
Os meios de cultura podem ser usados na seleco e crescimento de um determinado microrganismo
ou na identificao de uma espcie em particular. Desta forma, a funo de um dado meio depende da
sua composio. O isolamento de uma determinada estirpe bacteriana pode ser feito atravs do recurso
e/ou combinao dos seguintes tipos de meios:
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Meios selectivos suprimem o crescimento de determinados microrganismos em benefcio de
outros.
Meios diferenciais permitem a distino entre diferentes grupos de microrganismos com base
na capacidade de metabolizar componentes especficas do meio de cultura ou na morfologia
(aparncia) das colnias. Permitem, por vezes, a identificao de microrganismos com base nassuas caractersticas biolgicas.
No apndice I Guia prtico de microbiologia, ou no site www.bioexperimentando.blogspot.com
encontra-se informao necessria preparao de diferentes meios de cultura para estirpes
de E.coli.
Manuteno de estirpes de E. coli
H diferentes mtodos para manuteno de estirpes de E.coli, dependendo do tempo de
armazenamento que se deseje. Os stocks de glicerol e as culturas Stab permitem um longo tempo de
conservao das bactrias, enquanto que placas de agar podem ser usadas para um perodo de
manuteno mais curto.
O kitBioExperimentando fornece as bactrias em cultura Stab. Para que possa implementar o
trabalho experimental do kitvrias vezes, com menos custos, necessrio manter as culturas de bactrias
viveis. Para tal, aps a recepo das primeiras bactrias em cultura Stab, proceda como sugerido no
ponto 1 dos procedimentos protocolares. Aps a incubao das bactrias em meio lquido durante a noite,
poder manter novas culturas em placas de agar, ou em cultura Stab. Os procedimentos para a
realizao dos meios de cultura para placas de agar ou cultura Stab encontram -se no apndice I Guia
prtico de microbiologia, ou no site:www.bioexperimentando.blogspot.com
Extraco de DNA plasmdico
A lise enzimtica, tambm denominada Mtodo de fervura ou Boiling lysis um mtodo rpido
utilizado para extraco do DNA plasmdico, especialmente recomendado para um grande nmero de
culturas de E.coli de volume reduzido. A qualidade do DNA plasmdico isolado inferior do que a obtida
por lise alcalina, mas suficiente para anlise de restrio. As bactrias sofrem lise atravs do tratamento
com lisozima, Triton-X-100 e calor. A lisozima enfraquece a parede das clulas bacterianas e o calor
rompe-as. Tambm pela aco do calor desnaturado o DNA cromossmico e as protenas. As cadeias do
DNA plasmdico circular fechado no se separam uma da outra devido forma como esto entrelaadas.
O DNA cromossmico permanece ligado membrana bacteriana, e juntamente com as protenas, removido por centrifugao. O DNA plasmdico fica no supernadante, o qual precipitado com
isopropanol. Este procedimento eficaz com plasmdios pequenos (tamanho inferior a 15 kb), e com a
maioria das estirpes de Escherichia coli(excepo das estirpes de E.colique expressem a endonuclease A,
a qual no completamente inactivada pelo calor, e de que resulta a degradao do plasmdio durante a
incubao na presena de Mg2+).
http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/ -
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Enzimas de restrio
As endonucleases (endo = dentro, nuclease = enzima que corta cidos nucleicos) ou enzimas de
restrio so enzimas que reconhecem sequncias especficas de bases no DNA e so capazes de
hidrolisar as cadeias de DNA.
Uma enzima de restrio liga-se a uma molcula de DNA e desliza ao longo da hlice at reconhecer
sequncias especificas de pares de bases que indicam que esta deve parar de deslizar. A enzima corta
ento quimicamente o DNA naquele local, chamado local de restrio. Se um local de restrio especfico
ocorrer em mais do que um local numa molcula de DNA, a enzima de restrio ir cortar em cada um
desses locais, resultando mltiplos fragmentos. O tamanho de cada fragmento vai depender da localizao
dos locais de restrio na molcula de DNA.
Quando as enzimas de restrio so usadas para cortar cadeias de plasmdios circulares de DNA, tal
como acontece neste kit, fragmentos de diferentes tamanhos so produzidos. O DNA que se cortou pode
ser observado usando um processo conhecido como electroforese em gel de agarose.
O gel de agarose
O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspenso de agarose numa soluo tampo e
deixando arrefecer num recipiente apropriado. A agarose deve ser previamente pesada para a
concentrao pretendida do gel e deve ser dissolvida na soluo tampo com a ajuda de uma fonte de
calor (em banhomaria ou no microondas). Assim que a soluo levantar fervura deve ser retirada da
fonte de calor, pois se deixarmos ferver a malha do gel pode ficar laxa, o que poder trazer implicaes na
electroforese e nos resultados que deveremos obter.
A soluo deve ser vertida num molde apropriado (figura 1) quando atinge uma temperatura de
cerca de 50C (ou seja, quando pudermos pegar no recipiente directamente com a mo sem nos
queimarmos).
Antes de vertermos a soluo de agarose no molde, devemos colocar as borrachas adaptadoras e
um pente junto da extremidade orientada para o plo negativo da tina de electroforese (uma vez que o
DNA ir migrar para o plo positivo) para obtermos um gel com uma fileira de poos.
Aps solidificao do gel, vertemos tampo de electroforese sobre o gel, e cuidadosamente
retiramos o pente, tendo o cuidado de no danificar os poos (nunca retirar o pente sem o gel estar
submerso em tampo de electroforese!). Posteriormente vertemos um pouco mais de tampo de
electroforese sobre os poos para eliminar eventuais resduos de agarose que no tenha sido
polimerizada.
Figura 1 Gel de agarose
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Electroforese
A electroforese consiste em fazer migrar biomolculas por uma matriz, sob a influncia de um
campo elctrico, permitindo separ-las segundo os seus tamanhos. Esta tcnica permite analisar
fragmentos de DNA e determinar o seu tamanho.
O DNA antes de ser carregado nos poos tem que ser tratado com tampo de amostra que tem
vrias funes: d cor amostra (azul de bromofenol ou xilenocianol), confere densidade (tem sacarose
ou glicerol) e mantm o pH alcalino. Os fragmentos de DNA so ento descarregados em poos, no gel de
agarose, que colocado numa tina cheia de tampo de electroforese (TAE ou TBE). O tampo de
electroforese fornece condutibilidade elctrica e mantm o pH que necessrio para a manuteno da
carga e estabilidade das molculas. O carregamento dos poos um procedimento que deve ser feito com
muito cuidado para no danificar os poos do gel (figura 2). O contedo deve ser expelido da pipeta
devagar e continuamente, carregando no mbolo da pipeta at ao primeiro ponto de resistncia. Quando
sentida esta primeira resistncia, deve-se aguardar uns breves segundos antes de retirar, lentamente, a
ponta da pipeta do poo.
Aps o carregamento dos poos, ligam-se os elctrodos fonte de alimentao, determinando
previamente a voltagem e o tempo de electroforese (figura 3).
A corrente elctrica passada entre os elctrodos que esto nos terminais da tina de electroforese. Desde
que os fragmentos de DNA estejam carregados negativamente, eles vo avanar para o plo positivo
(ctodo) quando estiverem sujeitos a um campo elctrico. No decorrer da electroforese, verifica-se junto
extremidade que contm o elctrodo negativo a libertao de H 2. Na extremidade que contm o plo
positivo observa-se a libertao de O2. Se no estiver a ocorrer a electroforese no h formao deste
gases, pelo que a observao da libertao destes gases sob a forma de bolhinhas um bom indicador
da ocorrncia ou no deste processo.
A matriz do gel de agarose funciona como uma malha molecular atravs da qual cada fragmento
pequeno de DNA se move mais facilmente do que os fragmentos maiores. No entanto, a razo entre o que
cada fragmento de DNA migra atravs do gel inversamente proporcional ao seu tamanho em pares de
bases. Aps um determinado perodo de tempo, os fragmentos menores de DNA vo migrar at mais
longe do que os maiores. Fragmentos do mesmo tamanho ficam juntos, e migram numa nica banda de
DNA. Estas bandas iro ser vistas posteriormente no gel aps o DNA ser corado.
Figura 2 Carregamento dos poos Figura 3 A electroforese
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Visualizao do DNA
O DNA incolor, por isso os fragmentos no gel no podem ser vistos durante a electroforese.
Corando as bandas de DNA possvel a sua localizao no gel. Habitualmente nas escolas utiliza-se o
corante Azure A: 100% incuo, e com um grau de eficcia muito elevado, j que permite uma boa
visualizao do DNA, num espao de tempo reduzido (figura 4).
Testes genticos
Um teste gentico o mais recente e sofisticado procedimento utilizado para identificar
alteraes genticas, e envolve a anlise directa do DNA.
As finalidades dos testes genticos podem ser o diagnstico, o rastreio ou a monitorizao. Os testes
genticos podem ser utilizados para diagnosticar uma doena gentica, para determinar se um indivduo
portador de uma doena associada a uma mutao, para prever o desenvolvimento de uma doena
gentica, para determinar a susceptibilidade de um indivduo para uma determinada doena, ou ainda
para aplicaes na cincia forense.
Actualmente so realizados centenas de testes genticos e muitos outros esto em desenvolvimento.
Quando o gel imerso no corante Azure A, as molculas do
corante atacam o DNA que se encontram na malha do gel de
agarose. Quando as bandas ficam visveis, possvel comparar
os padres de restrio do DNA em diferentes amostras de
DNA.
Dada a relao qualidade/preo/segurana, o corante
seleccionado para esta actividade o Azure A. No caso daescola possuir transiluminador UV sugere-se a utilizao do
corante GelRed. No caso da escola possuir uma fonte de luz
azul, pode optar-se pela utilizao do GelGreen.Figura 4 Corante para o visualizao do
DNA - Azure A
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Parte IIProblematizao da actividade
O problema apresentado turma o seguinte:
D. Maria Sr Joaquim
Ana Andr
Paulo
Vera
Jos Rosa ManuelAgostinhoElisabete Helena Joana Antnio
MartaDianaSerafimJosefinaRuiTiagoRita
Carlos Pedro
Filho A Filho B
Figura 5 rvore genealgica da famlia Antunes
Transmisso da doena Raritose
A famlia Antunes afectada h quatro geraes sucessivas pela doena Raritose. A Ana, bisneta da D. Maria e do Sr Joaquim,casou com o Andr, e pretendem ter um filho. Tendo o Andr conhecimento de que a famlia de Ana tem problemas com essadoena, este sugere a Ana que faam um teste gentico para averiguar a probabilidade dos seus eventuais filhos serem doentesou portadores da doena. A rvore genealgica desta famlia encontra-se disponvel na figura 6.
Questo- problema: Ser possvel pela anlise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e Andr sero doentes?
Mulher
Homem
SexoIndefinido
Legenda
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Para simplificao de identificao, a cada membro da famlia ser atribudo um nmero, como mostra a
figura 6.
Parte III Procedimentos protocolares
Trabalho laboratorial:
- Material/Mtodos
- Notas para o professor
- Informao adicionalPipetagem
Electroforese
Parte IV Anlise e discusso dos resultados
Membros da famlia Antunes:
No sentido de dar resposta questo formulada anteriormente, foram recolhidas amostras de
cada um dos membros da famlia Antunes. De referir que cada amostra de DNA recolhida contm parte do
gene responsvel pela doena, amplificado previamente por PCR (Reaco de Polimerizao em Cadeia).
Existem apenas dois alelos diferentes para o locus que est ser investigado. Um indivduo que seja
homozigtico para o alelo dominante (gentipo RR) ter apenas DNA do tipo R. Um indivduo que seja
homozigtico para o alelo responsvel pela doena (gentipo rr) ter apenas DNA do tipo r. Por sua vez,
1 2
20 21
5
23
3 4 876 9 10 11
18171615141312
19 22
Filho A Filho B
Figura 6 rvore genealgica da famlia Antunes
1 D. Maria2 Sr. Joaquim3 Jos
4 Rosa5 Paulo6 Elisabete7 Agostinho8 Manuel
9 Helena10 Joana11 Antnio
12 Rita13 Tiago14 Rui15 Josefina16 - Serafim
17 Diana18 Marta19 Carlos
20 Ana21 Andr22 Pedro23 Vera
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um indivduo que seja heterozigtico (gentipo Rr), ter DNA dos dois tipos. A amplificao da regio de
interesse do DNA origina fragmentos de mesmo tamanho para ambos os alelos, neste caso, 6500 pb.
O objectivo detectar que formas de DNA esto presentes em cada amostra, e para isso
sujeitam-se as amostras a restrio com a enzima BamHI e analisar os fragmentos de DNA resultantes, no
gel de electroforese.
A diferena na sequncia de DNA dos alelos R e r tal que, no alelo r existe uma sequncia de
bases que pode ser reconhecida e cortada pela enzima de restrio BamHI. O alelo R no possui local de
restrio para a enzima BamHI e assim no vai ser cortada pela enzima.
Um marcador de DNA, que consiste num conjunto de fragmentos de tamanhos conhecidos,
sujeito a electroforese juntamente com as amostras, para se poder confirmar que os fragmentos mais
pequenos obtidos, quando combinados, formam o fragmento maior (4000 + 2500 = 6500 bp).
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Parte IIIProcedimentos protocolares
Segue-se o trabalho de laboratrio que implica o cumprimento de todas as regras de segurana
j mencionadas na introduo deste guio. De referir que quando se manuseia DNA, deve ter-se sempre
em ateno que todo o material que entre em contacto com o DNA deve ser esterilizado, com particular
ateno s pontas das micropipetas. Estas nunca devem ser tocadas com as mos ou entrar em contacto
com material no esterilizado, para que no haja contaminao do DNA.
1. Cultura de bactrias para extraco de DNA plasmdico
a) Seleccionar um conjunto de culturas em stock (em placa petri, cultura Stab, ou meio lquido LB
mais Ampicilina), dependendo de como so mantidas as bactrias no laboratrio, e proceder propagao
das bactrias atravs de cultura lquida, transferindo perto da chama, para um tubo estril que continha j
10 mL de meio de cultura (tabela 4):
- uma colnia de cada cultura de bactrias no caso de estarem em meio slido;
- uma picada de cada cultura de bactrias caso sejam retiradas da cultura Stab;
- 10 L de cada cultura de bactrias, no caso de estarem em meio lquido.
b) Agitar de modo a provocar a disperso das bactrias no meio.
c) Incubar a 37C durante a noite.
2. Extraco do DNA plasmdico
a) Perto da chama, transferir 1,5 mL de cada cultura bacteriana para os respectivos tubos de 1,5 mL
estreis.
b) Centrifugar velocidade mdia durante 3 minutos para recolher as bactrias no fundo do tubo, e
verter o sobrenadante.
c) Perto da chama transferir novamente 1,5 mL de cada cultura bacteriana para os respectivos tubos
de 1,5 mL.
d) Centrifugar velocidade mdia durante 3 minutos para recolher as bactrias no fundo do tubo, e
verter o sobrenadante.
e) Ressuspender os sedimentos em 300 de STET e adicionar 4 uL de lisozima (50mg/mL) a cada
tubo.
f) Incubar temperatura ambiente durante 5 minutos.
g) Ferver durante 45 segundos.
h) Centrifugar durante 5 minutos velocidade mxima, para que as estruturas celulares sedimentem
no fundo.
i) Remover o sedimento de cada tubo com um palito.j) Adicionar a cada tubo 300 L de isopropanol (insolubiliza o DNA) e agitar.
Culturas
(meio LB+Ampicilina)pCR2.1 pUC 18 pCard
Volume final da
cultura10mL 10mL 10mL
Tabela 4: Cultura de bactrias seleccionadas para extraco deDNA plasmdico
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k) Centrifugar os tubos velocidade mxima, durante 10 minutos, para sedimentar o DNA.
l) Eliminar o sobrenadante e deixar secar at desaparecer o odor de isopropanol, evitando que os
sedimentos sequem em demasia.
m) Adicionar 100 L de etanol, a 70% e deixar evaporar.
n)Ressuspender os sedimentos em 30-40 L de gua destilada estril, agitando a base dos tubos com
os dedos.
o) Utilizar o DNA dissolvido directamente, ou conservar a preparao de DNA a -20C para posterior
utilizao.
3. Preparao das amostras de DNA
Nesta actividade experimental, se o corante de DNA a utilizar for o Azure A, ser necessrio 0,3 g de
DNA para cada banda visvel num volume de 20 L a carregar nos poos.
As solues de plasmdios so normalmente fornecidas em concentraes de 1 g/L, que necessitam de
ser diludas para uma concentrao de 0,06 g/L (ver tabela 5). 5 L dessas solues contm 0,3 g de
DNA.
Para este trabalho, necessrio preparar 3 misturas diferentes de plasmdios, que vo posteriormente ser
utilizadas. A tabela 6 indica as quantidades de cada mistura que so necessrias para a realizao da
actividade experimental. As amostras de DNA vo conter 20 L de uma das misturas, pelo que a
quantidade de DNA em cada amostra vai ser 0,3 g, 0,9 g, ou 0,6 g, dependendo se contem a mistura
A (1 plasmdio), a mistura B (3 plasmdios) ou a mistura C (2 plasmdios).
Plasmdio
(1 g/L)gua
Volume Final
(0,06 g/L)
3 L 47 L 50 L6 L 94 L 100 L
9 L 141 L 150 L
15 L 235 L 250 L
Amostra de DNA AAmostra de DNA
BAmostra de DNA C
Volume necessrio
de plasmdio
(o,o6 g/L)
pUC 18 ------------------------ 60 L 20 L 80 L
pCR 2.1 ------------------------ 60 L 20 L 80 LpCArd 45 L 60 L ----------------------- 105 L
gua 135 L 60 L 40 L
Volume total 180 L 240 L 80 L
N de amostras
de 20 L
necessrias
8 tubos 11tubos 3 tubos
Tabela 6 - Preparao das misturas de plasmdios (amostra de DNA A, B e C)
Tabela 5 - Preparao das solues de plasmdios para aconcentrao final de 0,06 g/L
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4. Distribuio das amostras de DNA
a) No topo de cada um dos tubos que contm enzima liofilizada, proceder identificao dos mesmos
com os nmeros de 1 a 23 (utilizar caneta de tinta permanente).
b) Colocar 20 L de cada amostra de DNA (amostra A, B e C) no respectivo tubo (figura 8) que
continha j enzima de restrio liofilizada (9 tubos recebem a amostra de DNA A, 11 tubos recebem a
amostra de DNA B, e 3 tubos recebem a amostra de DNA C).
c) Proceder mistura da soluo de DNA com a enzima, fazendo leves batimentos com os dedos no
fundo do tubo.
5. Restrio enzimtica
a) Com os tubos dispostos num suporte adequado, incubar as amostras de DNA numa estufa a 37C,
durante cerca de 40 minutos.
6. Preparao do gel de agarose
a) Pesar 0,4 g de agarose num matraz, adicionar 50 mL de tampo TAE (1x) (ver nota para o
professor 2).
b) Tapar o matraz com pelcula aderente, e furar a pelcula antes de o levar ao microondas (no
utilizar parafilme).
c) Proceder sua dissoluo no microondas durante 2 minutos (ter ateno para a soluo no
levantar fervura, uma vez que se ferver a malha do gel vai ficar laxa, havendo implicaes na
electroforese).
d) Retirar o matraz do microondas com o auxlio de uma pega, e agitar suavemente, certificando de
que toda a agarose se encontrava totalmente dissolvida.
e) Deixar arrefecer at temperatura aproximada de 60C.
f) Colocar o pente junto ao elctrodo negativo da tina de electroforese.
g) Verter continuamente o volume de agarose derretida na tina de electroforese, (evitando assim a
criao de bolhas de ar) de modo a encher a cavidade central, e a circundar os dentes do pente.
h) Aguardar a polimerizao da agarose durante cerca de 20 minutos.
Tubos que recebem a amostra de DNA A: tubos 3, 9, 10, 12, 14, 17, 18, 19, 22
Tubos que recebem a amostra de DNA B: tubos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 13, 16, 20, 21, 23
Tubos que recebem a amostra de DNA C: tubos 7, 11, 15Figura 8 Distribuio dasdiferentes amostras de DNA
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7. Carregamento do gel
a) Aps a solidificao do gel de agarose, cobrir toda a
sua superfcie com TAE (0,25x).
b) Remover cuidadosamente o pente do gel bem como
as placas laterais.
c) Adicionar 2 L de tampo de amostra que contm azul de
bromofenol a cada um dos tubos que contem as amostras de DNA.
d) Agitar suavemente no sentido de misturar o tampo de
amostra com a soluo de DNA.
e) Pipetar 5 L do marcador molecular Lambda DNA/HindIII e adicionar
2L de tampo de amostra.
f) Carregar 5 L da soluo anterior no primeiro poo do gel.
g) Pipetar 20 L de cada amostra de DNA, pela ordem numrica dos tubos, e carregar nos poos do
gel (figura 9).
8. A electroforese
a) Verificar se os elctrodos esto bem colocados.
b) Regular a voltagem para os 120 volts.
c) Submeter o DNA a electroforese durante 20 a 30 minutos (figura 10).
d) Interromper a electroforese quando o azul do tampo alcanar o
fim do gel.
9. Colorao do DNA
a) Remover a soluo tampo TAE da tina, reservando-a para posteriores utilizaes (tem que se ter
o cuidado de segurar o gel, e assim evitar que este se parta).
b) Verter cerca de 10mL de corante do DNA, Azure A, na superfcie do gel .
c) Deixar actuar cerca de 4 minutos.
d) Retirar o corante da superfcie do gel e guarda-lo para posterior reutilizao, anotando no frasco o
n de vezes que este j tinha sido utilizado.
e) Retirar o corante da superfcie do gel, lavando-o com 5ml de etanol a 70%, durante uns segundos.
f) Eliminar o lcool e lavar o gel com gua corrente, durante 3 ou 4 minutos, no deixando gua no
gel, para que no seja removido do gel a totalidade do corante.
g) Aguardar at que as bandas se tornem visveis.
h) Observar os resultados.
i) Registar o nmero de bandas na respectiva rvore genealgica.
Figura 10 - Electroforese
Figura 9 Carregamento do gel deagarose
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Parte IVAnlise e discusso dos resultados
Parte VIActividade complementar
Parte V - Actividade complementarMapeamento de plasmdios (Plasmid Mapping)
Plasmdios e enzimas de restrio
O mapeamento de plasmdios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a indstria da
biotecnologia. Esta tcnica permite aos bilogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso deexperincias de clonagem assim como identificar facilmente plasmdios e tratamentos associados em
diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA
genmico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmdico para simular como os verdadeiros perfis de
DNA so analisados.
Aps o corte dos plasmdios pelas enzimas de restrio, estes podem ser ligados a um fragmento de DNA
proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrio. O
1. Elabore um desenho do gel resultante do trabalho laboratorial, com os poos devidamenteassinalados (apndice II).
2. Na rvore genealgica fornecida (apndice III), registe o nmero de bandas obtido em cadaindivduo (para cada amostra de DNA poder visualizar uma, duas ou trs bandas).
3. Indique, justificando, qual o modo de transmisso da doena.
4. Identifique os indivduos que so portadores da doena.
5. Refira os indivduos que podem ter falecido devido doena Raritose.
6. Indique o gentipo e o fentipo dos indivduos 1, 15 e 22.
7. Comente a seguinte afirmao: A probabilidade de o Andr e a Ana terem um filho doente igual probabilidade de terem um filho portador. (Sugesto: Faa um xadrez mendeliano).
8. A Ana e o Andr optaram na realidade pela realizao de um teste gentico, antes de terem filhos,para saberem se h a possibilidade de terem um filho doente. Alguns membros da famlia apoiam adeciso tomada pelo casal, mas h outros membros que se opem. Enumera dois argumentos quepossam ter sido referidos a favor da realizao do teste gentico e dois argumentos que possam tersido referidos contra.
9. Complete oV de Gowinrelativo actividade experimental desenvolvida (apndice IV).
10. Elabore uma resposta para a questo-problema formulada inicialmente Ser possvel pelaanlise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e Andr sero doentes?
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Parte VActividades complementares
Actividade complementar 1Mapeamento de plasmdios
Plasmdios e enzimas de restrio
O mapeamento de plasmdios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a
indstria da biotecnologia. Esta tcnica permite aos bilogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso
de experincias de clonagem assim como identificar facilmente plasmdios e tratamentos associados em
diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA
genmico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmdico para simular como os verdadeiros perfis de
DNA so analisados.
Aps o corte dos plasmdios pelas enzimas de restrio, estes podem ser ligados a um fragmento
de DNA proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrio. O
plasmdio resultante que possui DNA hbrido pode ser incorporado em clulas bacterianas (transformao).
O plasmdio hbrido replica-se na bactria da mesma forma que o plasmdio original, incluindo o fragmento
de DNA estranho que foi introduzido. Assim, cada plasmdio hbrido contm uma cpia do DNA estranho
incorporado. Diz-se que o fragmento de DNA foi clonado e o plasmdio de DNA que o transporta
designado vector.
Os plasmdios podem ser descritos em termos de localizao dos locais de restrio usando
simples procedimentos e lgica. O procedimento geral digerir um plasmdio com duas enzimas de
restrio separadamente e com as duas em simultneo (digesto dupla). Os tamanhos dos fragmentos de
DNA resultantes so determinados usando a lgica para determinar a localizao relativa dos locais de
restrio.
Uma vez que os plasmdios so circulares, o nmero de fragmentos representam o nmero de
cortes ou locais de restrio.
Ler um mapa de um plasmdio
Um mapa de um plasmdio contm informaes relativas ao tamanho do plasmdio, aos genes
presentes, origem do local de replicao, e aos locais de restrio para as enzimas de restrio. Os
plasmdios utilizados nesta actividade laboratorial foram o plasmdio pUC 18, o plasmdio pCR2.1.TOPO, e
o plasmdio pCard (resulta da adio de um insertde 1500bp no plasmdio pCR 2.1 TOPO). Foi utilizada a
enzima de restrio BamHI, embora outras enzimas pudessem ter sido utilizadas para cortar estes
plasmdios (exemplo da enzima HindIII). Os locais de restrio so marcados no mapa com um nmero
que indica o local de restrio. Uma vez que o plasmdio circular, existe um local zero arbitrrio. Todos
os locais de restrio so indicados com um nmero entre zero e o nmero total de pares de base do
plasmdio. O tamanho dos fragmentos pode ser calculado pela simples subtraco (e nalguns casos
adio) entre pontos do plasmdio.
Plasmdios utilizados neste kit
O mapa de um plasmdio mostra as posies (numeradas pelos pares de bases do DNA) dos
locais onde o plasmdio pode ser cortado por determinadas enzimas de restrio. O nome do plasmdio e o
seu tamanho em pares de base de DNA mostrado dentro do crculo, assim como a Origem de Replicao
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(Ori). Dois dos plasmdios utilizados neste kitso plasmdios comerciais: o pUC18 e o pCR2.1 (figura 10 e
11).
Figura 10 Plasmdio pUC 18Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html
Figura 11: Plasmdio pCR2.1Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml
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Questes:
1. A partir do mapa do plasmdio pCR2.1 enumere as enzimas de restrio que podem cortar o plasmdio.
2. Qual dos plasmdios, pUC 18 ou pCR2.1, o maior e qual o seu tamanho?
3. Utilizando o plasmdio pUC18 como exemplo, procure os locais de restrio para a enzima AvaII.
Quantos locais de restrio existem? Se a enzima AvaII for usada para restrio deste plasmdio, quantos
fragmentos iremos obter?
4. Determine o tamanho dos fragmentos obtidos da restrio do plasmdio pUC18 com a enzima AvaII.
Confirme que a soma dos fragmentos obtidos igual ao tamanho total do plasmdio.
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Actividade complementar 2 Restrio e anlise do gel, virtual, utilizando o software
pDrwa32
Para se realizar restries virtuais em plasmdios, e visualizar o padro de restrio obtido num gelvirtual, pode-se utilizar um software gratuito: opDRAW32 DNA analysis software,AcaClone software.
1. Proceda instalao do software pDRAW32 DNA analysis, acedendo ao sitehttp://www.acaclone.com/e seguindo todas as instrues.
Figura 1:Instalao do programa Pdraw32 DNA analysis software
2. Abra o programa j instalado pDRAW32 DNA analysis. De seguida, clique em File (ficheiro),New (novo) e Enter new sequence (introduzir nova sequncia).
Figura 2: Menus de abertura do programa pDRAW32
http://www.acaclone.com/http://www.acaclone.com/http://www.acaclone.com/ -
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3. Acedendo ao site https://www.lablife.org/ escolha a sequncia do plasmdio que pretendeanalisar (sugere-se que escolha a sequncia do plasmdio pCR2.1). De seguida cole a sequnciaseleccionada no local indicado no programa pDRAW.
Figura 3: Seleco da sequncia de nucleotdios do plasmdio pCR2.1
4. Clique em Edit (editar), e seleccione a opo Edit Sequence.
Figura 4: Sequncia do plasmdio pCR2.1 linearizada, mostrando tambm os locais de restrio de dezenas de enzimasde restrio. Est indicado tambm o comprimento da sequncia do DNA.
https://www.lablife.org/https://www.lablife.org/https://www.lablife.org/ -
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5. Clique em Edit, seleccione DNA name, properties and annotations, e registe os dados como seindica no exemplo abaixo:
Figura 5: Designao do nome correcto do plasmdio (pCR2.1), e indicao da forma que se pretende visualizar o DNA(forma circular)
6. Clique em Preview, e aparecer no ecr o plasmdio pretendido pCR2.1, com todos os locais derestrio enzimtica.
Figura 6: Mapa do plasmdio pCR2.1, circular, com locais de restrio das respectivas enzimas
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7. Clique em Settings (opes), e seleccione Enzime selection (seleco das enzimas).
Figura 7: Menu de opo para seleco das enzimas
8. Introduza a informao que deseja relativamente s enzimas que pretende utilizar para a
restrio do plasmdio.
Figura 8: Seleco das enzimas e das caractersticas pretendidas
Nota: no exemplo apresentado foram seleccionadas algumas caractersticas, podendo no entanto
serem seleccionadas outras.
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9. Aps ter clicado em Apply, vai aparecer no ecr o plasmdio pCR2.1 apenas com os locais derestrio para as enzimas que apresentam as caractersticas anteriormente definidas.
Figura 9: Mapa do plasmdio pCR2.1 com os locais de restrio das enzimas anteriormente definidas
10.Uma vez que aparecem ainda muitos locais de restrio para as enzimas anteriormenteseleccionadas, a melhor opo ser seleccionar as enzimas que s cortam duas vezes oplasmdio.
Figura 10:Mapa do plasmdio pCR2.1 com os locais de restrio das enzimas que cortam apenas duas vezes
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11. Obtido o mapa virtual do plasmdio pCR2.1. com os respectivos locais de restrio para enzimas ques cortam duas vezes, pode-se agora realizar a restrio virtual e respectiva electroforese em gel virtual.Clique em View agarose gel electrophoresis.
Figura 11:Mapa de restrio do plasmdio pCR2.1, em gel virtual
Discusso:
Que concluses se podem retirar, aps observao do padro de restrio do plasmdio pCR2.1, com
enzimas que apenas cortam duas vezes?
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Parte VI -Glossrio
Glossrio
cido desoxirribonucleico vulgarmente conhecido por DNA, um polmero orgnico complexo formado por duascadeias de nucletidos emparelhadas entre si, com uma disposio antiparalela. Cada nucletido que constitui o DNA composto por um acar, a desoxirribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases azotadas (timina, adenina,guanina e citosina).
cido ribonucleico vulgarmente conhecido por RNA, um polmero orgnico formado por uma cadeia simples denucletidos. Cada nucletido que constitui o RNA composto por um acar, a ribose, um grupo fosfato e uma dasquatro bases azotadas (adenina, guanina, citosina e uracilo).
Adenina base azotada prica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA.
Agarose polmero constitudo por unidades de galactose. Aps dissoluo em gua a ferver, seguido dearrefecimento, toma uma consistncia gelatinosa.
Alelos formas diferentes de um determinado gene.
Base Azotada molculas que entram na constituio dos cidos nucleicos. No DNA podemos encontrar quatro basesazotadas: a adenina, timina, citosina e guanina. A adenina e a timina so bases complementares, emparelhando entresi. De igual modo a citosina e a guanina emparelham por complementaridade.No RNA encontram-se tambm quatro bases azotadas: guanina, citosina, adenina e uracilo em vez da timina. As basesemparelham do mesmo modo que no DNA excepo da adenina que vai emparelhar com o uracilo.
Caritipo conjunto dos cromossomas presentes nas clulas de cada ser vivo.
Centrmero parte central dos cromossomas. O centrmero importante no processo de mitose e de meiose para aseparao dos cromossomas.
Citosina base azotada pirimdica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA.
Co-dominncia situao em que h expresso individual dos dois alelos de um locus, num heterozigtico.
Cromatdio componente de um cromossoma contendo uma molcula de DNA.
Cromatina denso material do ncleo constitudo principalmente por DNA e protenas.
Cromossoma estrutura filamentosa constituda por DNA associado a protenas estruturais (histnicas e nohistnicas). Os cromossomas encontram-se no ncleo das clulas eucariticas.
Cromossoma homlogo cada um dos cromossomas de um par de cromossomas idnticos, que apresenta osmesmos loci genticos. Cada cromossoma de um desses pares homlogo do outro e emparelha com ele durante ameiose.
DNA ver cido desoxirribonucleico.
DNA fingerprinting tcnica de separao de segmentos de DNA que permite a identificao gentica dos
indivduos.DNA polimerase enzima presente nas clulas procariticas e eucariticas, responsvel pela polimerizao das novascadeias de DNA.
Dominante refere-se a um carcter que se exprime quando h heterozigotia para o gene que o determina. Aexpresso ocorre na presena de uma cpia normal do alelo.
Enzimas de restrio - enzimas responsveis por cortar o DNA. Estas enzimas so produzidas por bactrias erecebem o nome da espcie da bactria de onde foram extradas. Enzimas de restrio diferentes reconhecem e cortamDNA em diferentes sequncias de bases.
Electroforese uma tcnica que permite a separao de molculas (DNA, protenas) de acordo com o tamanho,carga e forma que apresentam, quando sujeitas a uma corrente elctrica. As molculas vo movimentar-se no meio desuporte (gel de agarose ou de poliacrilamida, por exemplo) a velocidades diferentes consoante as caractersticas queapresentam (tamanho, carga e forma).
Engenharia gentica manipulao do material gentico.
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Feniltiocarbamida a feniltiocarbamida (PTC) uma protena, descoberta na dcada 30,
Fentipo caractersticas observveis num organismo. O fentipo resulta da combinao de factores genticos eambientais.
Gene a unidade bsica da hereditariedade. Corresponde a uma sequncia nucleotdica de DNA que codifica umadeterminada sequncia polipeptdica, responsvel por determinada caracterstica ou funo no organismo. Cada geneencontra-se num local especfico de um cromossoma (locus) e pode apresentar vrias variantes (alelos) quedeterminam uma forma particular dessa caracterstica (exemplo: a caracterstica cor dos olhos pode ter vrios alelos:alelo que determina a cor azul, alelo que determina a cor castanha, etc).
Gentica cincia que estuda os genes e a hereditariedade.
Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo.
Gentipoconstituio gnica de um indivduo no que diz respeito aos alelos de um locus.
Guanina - base azotada prica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA
Hereditariedade mecanismo atravs do qual as caractersticas genticas passam dos progenitores para osdescendentes.
Heterozigtico um indivduo diz-se heterozigtico quando possui dois alelos diferentes para o mesmo gene.
Histona protenas bsicas, associadas ao DNA nos cromossomas. Tm baixo peso molecular, e so ricas nosaminocidos lisina ou arginina.
Homozigtico um indivduo diz-se homozigtico quando possui alelos iguais para o mesmo gene.
Locuslocalizao de um gene num cromossoma.
Primer pequena sequncia especfica de oligonucletidos que se liga ao DNA alvo, para permitir o incio da sntese dacadeia complementar pela DNA polimerase.
Reaco de polimerizao em cadeia (PCR) - reaco que permite a amplificao de pores especficas de DNAque estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam conhecidas as suas extremidades.
Recessivo gene ou carcter que s se manifesta em homozigotia ou em hemizigotia (presena de um nico alelo no
genoma).RNA ver cido ribonucleico.
SNP (Single nucleotide polymorphism) variao numa sequncia de DNA que envolve uma alterao num niconucletido.
Southern blot mtodo descrito por E.Southern em que fragmentos de restrio so separados num gel deelectroforese e transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Esta membrana posteriormentetratada com uma sonda (fragmento de DNA ou RNA com uma sequncia de bases conhecida, e complementar ao DNAcontido na membrana) que vai hibridar com o fragmento de DNA que se pretende identificar. A sonda de DNA marcada radioactivamente para permitir a sua deteco.
Taq polimerase uma DNA polimerase termoestvel, utilizada na amplificao de fragmentos de DNA atravs datcnica de PCR. O seu nome devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactria Thermus aquaticus. A Taqpolimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimtica de 40 minutos (a 94C).
Teste gentico teste que permite detectar a presena, ausncia ou alterao, num gene particular, cromossoma ounum produto gentico.
Timina base azotada pirimdica presente nos nucletidos que constituem o DNA (ausente no RNA).
Uracilo base azotada pirimdica encontrada nos nucletidos do RNA.
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Meio Liquido
Culturas lquidas de E.coli, podem geralmente fazer-se crescer no meio LB (Luria-Bertani). H diferentes
meios LB, com diferentes composies. Frmulas diferentes contm diferentes concentraes de NaCl e
do origem a quantidades variadas de DNA plasmdico. Para obter grande quantidade de DNA plasmdico
a composio LB recomendada a seguinte:
Composio do meio LB por litro
Triptona 10 g
Extracto delevedura
5 g
NaCl 10 g
Preparao do meio LB
Para preparar um litro de meio LB, adicione 10g de NaCl, 10 g de triptona e 5 g de extracto de levedura a
950 mL de gua destilada e desionizada, e agite at se dissolver. Ajuste o volume da soluo para um litro
com gua destilada e desionizada. Decante para pequenos reservatrios e esterilize na autoclave.
Esterilizao do meio
Esterilize o meio lquido ou slido na autoclave, utilizando uma presso e um perodo de tempo adequado
ao tipo de meio, tamanho do frasco, e tipo de autoclave.
Apndices:
Apndice IGuia prtico de Microbiologia
Nota 1: aconselhvel autoclavar o meio lquido em vrios frascos pequenos, do que apenas num frascogrande, para evitar uma possvel contaminao de todo o meio. Depois de autoclavar, no utilizar o meio
durante 24 h para garantir que est devidamente esterilizado e livre de contaminao por microorganismos.
Nota 2: Encha apenas da capacidade dos frascos com meio, e solte as rolhas antes de autoclavar paraevitar que o meio a ferver verta para fora. Aperte as rolhas quando o meio estiver frio (por volta dos 40C)
para o manter completamente estril.
Nota 3: Os antibiticos e os nutrientes como os aminocidos so inactivados pelas altas temperaturas de
uma autoclave. Eles devem ser adicionados ao meio frio e autoclavado a partir de solues stock
adequadas.
Tabela 1: Composio do meio LB por litro
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Meio slido
Estirpes de E. colipodem geralmente ser riscadas e armazenadas em placas de petri com meio LB que
contenham 1,5% de agar e o antibitico apropriado.
Preparao: prepare o meio LB de acordo com a composio dada na tabela acima. Mesmo antes deautoclavar, adicione 15 gramas de agar por litro e misture. Depois de autoclavar, agite o meio suavemente
para distribuir o agar dissolvido por toda a soluo. Tenha o cuidado para que o lquido quente no verta
para fora enquanto o agita.
Seque as placas directamente quer aps a solidificao ou logo antes de usar removendo as tampas e
colocando as placas na cmara de fluxo laminar durante 1 hora. Em alternativa, se no houver cmara de
fluxo laminar, as placas podem ser secas com as tampas ligeiramente abertas numa estufa a 37C durante
30 minutos, ou deixe-as invertidas com as tampas temperatura ambiente durante 2-3 dias.
Antibiticos
Estirpes bacterianas que contm plasmdios ou genes com marcadores selectivos de antibiticos devem
sempre ser postas num meio de cultura liquido ou slido que contenha o agente selectivo. Os antibiticos
devem ser adicionados ao meio apenas quando este estiver a uma temperatura abaixo dos 50C.
Antibitico Solues stock Concentraes a utilizar (diluidas)Concentrao Armazenamento
Ampicilina50 mg/mL em gua -20C 100 ug/mL (1/500)
Clorofenical 34 mg/mL em etanol -20C 170 ug/mL (1/200)
Kanamycin 10 mg/mL em gua -20C 50 ug/mL (1/200)
Streptomycin 10 mg /mL em gua -20C 50 ug/mL (1/200)
Tetraciclina 5 mg/mL em etanol -20C 50 ug/mL (1/100)
Nota 4: Deixe arrefecer o meio de agar autoclavado at aos 50C, antes de adicionar antibiticos e nutrientes
sensveis ao calor. Misture muito bem.
Nota 5: Faa o plaqueamento das placas com o meio numa cmara de fluxo laminar, ou numa superfcie
limpa, prximo de uma chama. Use 30-35 mL de meio para placas de petri de 90mm de dimetro (1 litro de
meio d para cerca de 30 placas).
Nota 6: Aps o plaqueamento, quaisquer bolhas de ar podem ser removidas passando rapidamente uma
chama perto da superfcie da placa. No se deve demorar com a chama pois esta pode destruir os
antibiticos.
Nota 7: Guarde as placas invertidas a 4C, protegidas da luz, para preservar os antibiticos sensveis luz.
No guarde as placas por perodos superiores a 3 meses, j que os antibiticos podem degradar-se.
Tabela 2: concentra es de antibiticos fre uentemente utilizados
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Culturas Stab
As estirpes de E.coli podem ser mantidas durante um ano em cultura Stab. As culturas Stab so
utilizadas para transportar bactrias de uns laboratrios para outros.
Preparao das culturas Stab:
1. Preparar e autoclavar o meio LB como descrito anteriormente,
tendo em conta que se pretende um meio LB que contenha 0,7% de agar.
2. Arrefecer o meio LB at cerca dos 50C, e adicionar o
antibitico apropriado. Enquanto o agar ainda estiver lquido,
adicionar 1 mL de agar para um tubo de 2 mL, em condies estreis,
e deixar solidificar.
3. Com uma ansa esterilizada, retirar uma nica colnia
de bactrias de uma placa de petri e introduzir a ansa no fundo do frasco
com agar diversas vezes (figura 1).
4. Incubar o tubo a 37C durante 8 a 12 h deixando a tampa
do tubo ligeiramente aberta.
5. Aps incubao, retirar o tubo, apertar muito bem a tampa,
e guardar no escuro a uma temperatura de 4C.
Placas de agar
Placas com riscado de bactrias podem ser seladas com Parafilme, e guardadas invertidas a 4C
durante vrias semanas.
O riscado de bactrias deve ser sempre feito em placas que contenham o antibitico apropriado.
Para se obter colnias de bactrias bem isoladas, riscar uma placa de agar como se descreve de seguida:
1. Passar uma ansa de inoculao pela chama, e arrefece-la
numa placa esterilizada que contem agar, mas que no v ser utilizada.
2. Utilizando a ansa, proceder ao riscado de bactria
(a partir de uma cultura stock em glicerol, cultura Stab ou de uma
colnia isolada de outra placa) a partir de uma canto da placa de
agar fresco.
3. Passar a ansa pela chama mais uma vez e arrefece-la.
Passar a ansa sobre o primeiro riscado e riscar de novo a partir
de um canto fresco da placa.
4. Repetir o processo at formar o padro visvel na figura 2.
5. Incubar a placa invertida a 37C durante 12 a 24 h, at as colnias
se desenvolverem.
Figura 2: Riscado de bactrias emplacas de agarFonte da imagem: www.qiagen.com
Figura 1-Inoculao de uma cultura StabFonte da imagem: www.qiagen.com
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Apndice IIRegisto das bandas de DNA resultantes no gel de agarose
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Apndice III rvore genealgica
Mulher
Homem
SexoIndefinido
Legenda
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Apndice IVV de Gowin
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(2) Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricular
http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf
Para mais informaes consultar:
Bailey J (1995) A Gentica A Nova Enciclopdia das Cincias, Crculo de Leitores.
Regateiro F (2003) Manual de Gentica Mdica - Imprensa da Universidade de Coimbra.
Sambrook J., Fritsch E. F., e Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor: Cold Spring Harbor Laboratory.
Videira A (2001) Engenharia Gentica Princpios e Aplicaes, Lidel.
Corantes
Biotiumwww.biotium.com
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BioRadhttp://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/
Biotecnologia conceitos e tcnicas
The European Initiative for Biotechnology Educationhttp://www.eibe.info/
Learn.Genetics - Science Learning Centerhttp://learn.genetics.utah.edu/
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Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricularhttp://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf
Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da EducaoBsica, Orientaes Curriculares
http://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdfKitscomerciaisNature`s dice Teacher`s guidehttp://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/MATERIALS/DNA/PDF/DiceTG.pdf
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Testes genticosUnderstanding Gene Testinghttp://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene19.php
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Microbiologia
QIAGEN Newswww.qiagen.com
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Invitrogenwww.invitrogen.com
Source BioScience ImaGeneshttp://www.imagenesbio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml
LabLifehttps://www.lablife.org/
http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/