guia de trabajos practicos de planta piloto v2012
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GUIA DE TRABAJOS
PRACTICOS
Materia de Especialización CEBI_E18
Planta Piloto
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El presente documento pretende orientar al estudiante en las distintas etapas de un
proceso biotecnológico. Las distintas etapas son desarrolladas como diferentes
trabajos prácticos en el orden en el cual deberían acontecer en un proceso real.
Por otro lado, se incluyen al final en forma de anexos, las diferentes técnicas
empleadas para los seguimientos de las diferentes etapas.
Información adicional y específica estará disponible y será entregada a lo largo de la
cursada.
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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS DE PLANTA PILOTO
Índice
Medidas de Seguridad en el Laboratorio Biotecnológico ............................................... 4
T.P. Nro 1. Preparación de medios de cultivo .............................................................. 5
T. P. No 2 Producción de una proteína verde fluorescente (GFP). Primera Parte.
Curva de crecimiento .................................................................................................... 7
Ecuaciones generales: sistema de batch alimentado y tratamiento de los datos ........ 10
TP Nro. 3 Concentración por microfiltración .............................................................. 12
TP Nro. 4. Disrupción de las células y concentración.................................................. 15
TP Nro. 5 Purificación ............................................................................................. 17
Anexo 1: Preparación de inóculo. ............................................................................... 24
Anexo 2: Determinación de masa celular .................................................................. 26
Anexo 3: Determinación de número de células. ........................................................ 27
Anexo 4. Recuento de células viables ....................................................................... 29
Anexo 5: Determinación de glucosa por el método enzimático ............................. 31
Anexo 6. Medición de proteínas con el método de Lowry y col. ................................ 33
Anexo 7: Electroforesis en gel de agarosa ............................................................... 34
Anexo 8: Electroforesis en gel (SDS-Page) ............................................................. 35
Referencias Bibliográficas .......................................................................................... 38
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Medidas de Seguridad en el Laboratorio Biotecnológi co
1- Antes de la clase leer la práctica hasta familiarizarse con los principios y métodos implicados. Al conocer la experiencia disminuye la posibilidad de que ocurra un accidente. Además esta programación permite emplear el tiempo en el laboratorio de una manera más eficaz.
2- No bloquear el acceso a la salida, salidas de emergencia, matafuegos, ducha, kit antiderrame, con sillas, bolsos u otro elemento que entorpezca.
3- Se debe conocer la ubicación de todos los elementos de seguridad en el laboratorio (matafuegos, salidas de emergencia, ducha, lavaojos, kit antiderrame).
4- En el laboratorio está prohibido comer, fumar o beber.
5- Respetar las señales de advertencia.
6- En el laboratorio se debe usar guardapolvo en todo momento. Esto garantiza que ningún material caiga accidentalmente sobre la ropa o piel.
7- Evitar el uso de accesorios colgantes (collares, corbata, aros, etc.). Usar zapatos cerrados. Usar el cabello recogido.
8- A la mesada de trabajo sólo se debe llevar aquellos materiales estrictamente necesarios para el trabajo, como cuaderno y bolígrafo. El resto de los objetos, como serían abrigos, libros, bolsos, deben dejarse fuera del área de trabajo.
9- Comenzar la práctica desinfectando el área de trabajo. Saturar la zona con desinfectante, extenderlo con una toalla de papel y dejar que se seque. Repetir este procedimiento al terminar la experiencia.
10- Utilizar guantes apropiados para cada manipulación de sustancias químicas o material biológico.
11- Mantener todos los cultivos y sustancias químicas identificados. Estos es crucial para evitar usos o colocaciones indebidas. No utilizar el contenido de un recipiente que no esté identificado.
12- No utilizar equipos o materiales sin antes haber recibido la capacitación del docente.
13- Ser muy cuidadoso con los mecheros. Apagarlos cuando no se los usa. Tener cuidado durante la desinfección de la mesada con alcohol.
14- No manipular sustancias inflamables cerca de llamas.
15- No pipetear con la boca.
16- Todo material contaminado debe ser desinfectado antes de ser eliminado o reutilizado. Colocar las pipetas, tips y portaobjetos ya usados en solución desinfectante
17- El derrame o caída de muestras contaminadas debe ser informado inmediatamente al docente
18- Cuando sea necesario, proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos. Si se usan sustancias químicas que emitan vapores o puedan provocar proyecciones se debe evitar el uso de lentes de contacto.
19- Se debe usar barbijo descartable cuando exista riesgo de producción de aerosoles o polvo durante la manipulación de sustancias tóxicas o biopatógenas.
20- Lavarse las manos tras la sesión de trabajo.
21- Está prohibido realizar experimentos no autorizados por el docente. No sustituir nunca un reactivo por otro durante una experiencia.
22- Los residuos generados deben ser desechados en los recipientes destinados para tal fin según las indicaciones del docente.
23- En caso de accidente o lesión avisar inmediatamente al docente para que pueda realizarse una acción rápida y apropiada.
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T.P. Nro 1. Preparación de medios de cultivo
Introducción y Objetivo.
Cualquier medio de cultivo de bacterias o levaduras debe incluir:
1. Una fuente de carbono
2. Agua
3. Una fuente de nitrógeno
4. Una fuente de fósforo
5. Una fuente de azufre
6. Otros nutrientes minerales y vitaminas.
Un medio de cultivo va a ser definido o sintético, cuando se conoce exactamente su
composición química. Sin embargo es habitual en el trabajo de laboratorio, el empleo
de medios complejos. Por ejemplo, el extracto de levaduras y las peptonas (proteína
hidrolizada) son los ingredientes básicos del medio Luria-Bertani (LB), utilizado muy
frecuentemente con E.coli. Estos materiales proporcionan una gran variedad de
fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos; y
una mezcla de cofactores, como por ejemplo vitaminas.
Los procesos de esterilización eliminan todos los microorganismos viables de los
medios de cultivo y equipamientos antes de ser utilizados con las cepas puras. Existen
varios métodos de esterilizar los líquidos, los recipientes y los instrumentos utilizados
en la manipulación de cultivos puros. En el trabajo práctico, utilizaremos la
esterilización por calor, empleando temperaturas de 121ºC (utilizando vapor a 15 psi)
durante un período de 20 minutos. Los recipientes de cultivo deben ser sellados o
cerrados para prevenir la contaminación.
El objetivo de este TP es aprender a preparar y a esterilizar un medio de cultivo
complejo y acondicionar el biorreactor para la esterilización en autoclave.
Materiales
Caldo de Cultivo LB:
Triptona 10g/litro
Extracto de Levadura 5g/litro
NaCl 10 g/litro
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Ajustar el pH hasta 7,5 con NaOH.
Autoclave Marca SCT
Biorreactor BIOSTAT® Bplus 5. Sartorius Stedim Biotech.
Métodos
Preparar 5 litros de caldo de cultivo LB.
Acondicionar el reactor, cubriendo todas las válvulas antes de ingresarlo al
esterilizador.
Verificar el nivel de agua del autoclave. Colocar la carga a esterilizar dentro del
autoclave. Cerrar la tapa superior del autoclave y ajustar las mancuernas con las
manos y de a pares enfrentados. Verificar que la espita esté abierta. En caso contrario
abrirla. Abrir la llave de paso de gas y encender el mechero. Cuando de la boca de la
espita se observe la salida de vapor en forma continua, proceder a cerrar la espita.
Una vez alcanzada la presión de trabajo (1,2 atm, 121ºC) regular la llave de gas de
manera tal que la presión se mantenga en dicho valor. Mantener a temperatura y
presión constantes durante 20 minutos. Verificar periódicamente que se mantengan
dichas condiciones. Transcurridos el tiempo indicado proceder a cerrar la llave de gas.
Una vez que la presión halla alcanzado el valor 0 atm. proceder a abrir la espita
permitiendo que se igualen las presiones interior y exterior. Colocarse los guantes de
amianto. Liberar las mancuernas y proceder a abrir la tapa del autoclave, cuidando
alejar el rostro de la boca del autoclave.
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T. P. No 2 Producción de una proteína verde flu orescente (GFP). Primera Parte. Curva de crecimiento
Introducción y Objetivos
En biotecnología, el conocimiento de las características de crecimiento de un
microorganismo es esencial para lograr una eficiencia de transformación reproducible,
y para obtener rendimientos repetibles de plásmidos y proteínas recombinantes. Las
células que están creciendo en un cultivo discontinuo, normalmente experimentan
cuatro diferentes estadíos de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de
crecimiento exponencial (log), una fase de crecimiento estacionario, y una fase de
muerte. Para conseguir un crecimiento uniforme y equilibrado, el cultivo se recoge en
la fase de crecimiento logarítmico o exponencial, donde la tasa de crecimiento y la
composición de cada célula en la población es relativamente la misma. El comienzo y
la duración de la fase logarítmica es variable, y debe establecerse para cada medio y
cada cepa microbiana empleados. La construcción de una curva de crecimiento que
incluya las fases de latencia, logarítmica, estacionaria y de muerte, nos permitirá
establecer estos parámetros. En esta primera parte del TP trabajaremos hasta la fase
logarítmica para luego cambiar la operación batch a un sistema fed-batch o de cultivo
en batch alimentado (ver 2da parte).
El objetivo del trabajo práctico es que el alumno realice una experiencia en un
bioreactor de escala de laboratorio, de manera de producir una proteína (GFP) a partir
de cepas productoras. Se busca además que el alumno se familiarice con el diseño de
un proceso de batch alimentado. En la primera parte del TP se seguirán los
parámetros de crecimiento (ver apartado de métodos), de manera de poder establecer
la duración de la fase lag y el comienzo de la fase logarítmica así como la constante
de la velocidad de crecimiento (µ). Esta última sirve para definir la velocidad de
crecimiento de un cultivo durante una etapa equilibrada: µ = (ln 2)/t (t es el tiempo
medio de duplicación o tiempo de generación). Además se procederá a realizar los
cálculos estequiométricos correspondientes.
Conforme se consumen los nutrientes en un sistema discontinuo y se van acumulando
productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a
detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En esta fase, las células no están
todas en el mismo estado fisiológico; algunas todavía se están dividiendo mientras que
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otras ya han comenzado a morirse. Pero la población se mantiene constante.
Conforme se agota la mayor parte de los nutrientes, el número de células que mueren
sobrepasa al número de células que se producen, y el cultivo entra en la fase de
muerte. El objetivo de la segunda parte del trabajo práctico, será la de evitar llegar a la
fase estacionaria, prolongando la fase logarítmica mediante el control y agregado de
nutrientes.
Primera Parte: CULTIVO EN BATCH
1. Para iniciar el cultivo en batch se utilizará un inóculo preparado 16-18 horas
antes en un erlenmeyer conteniendo 300 ml de caldo LB.
2. El cultivo en batch se lleva a cabo en medio líquido conteniendo caldo LB en un
biorreactor de 5 litros como se muestra en la figura 1.
3. Desde tiempo 0 hasta el final del ensayo con intervalos de 1 hora se tomará muestra para determinar: Peso Seco, DO, pH, Glucosa, Densidad óptica (en línea o Visible a 600 nm) Correcciones medir volumen de cada agregado, llevar registro de parámetros Agregar glucosa, NH3 y sales Llegar a DO 6-8 para inducir (vs DO 2 para un erle)
Determinación de DO
La DO se determinará a 600 nm, luego de realizar una dilución adecuada del cultivo de
tal manera que la DO medida entre en el rango: 0.2-1.2. El peso seco de cada muestra
se estimará a partir de los datos obtenidos en el gráfico de DO vs peso seco.
..
Figura 1: Esquema de un biorreactor de escala de laboratorio.
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3. Desde tiempo 0 se comienza el control y registro de variables: temperatura,
O2 disuelto, pH, Nivel (antiespumante), Densidad óptica (DO) en línea. El registro se
llevará a cabo hasta el final del ensayo con intervalos de 1 hora. Asimismo se tomará
muestra para determinar: Peso Seco, DO en espectofotómero a 600 nm y contenido
de glucosa. Se realizará, también, un recuento directo con una cámara Petroff-Hauser
para bacterias.
4. Confeccionar una tabla con los datos: (ver Anexo)
Hora Tiempo
(h)
DO
(Abs600nm)
Recuento
directo
Peso
Seco
Concentración
de glucosa
Operador
t1
t2
t… …
Primera Parte: CULTIVO EN BATCH. Tratamiento de los datos y expresión de
resultados.
1. Realizar una curva de calibración1 de DO vs Peso Seco, o bien, DO vs
número de células, graficando Peso seco (en ordenadas), o bien el número de células
en función de DO (en abscisas) y calculando la regresión lineal.
2. Se realiza la curva de crecimiento graficando la masa celular en función del
tiempo de incubación. Identificar la fase de latencia (lag) y la fase de crecimiento
exponencial (log).
3. De la fase de crecimiento exponencial determinar la constante de velocidad
de crecimiento (µ), µ = (ln 2) / t (t es el tiempo medio de duplicación o tiempo de
generación) y el rendimiento celular (YX/S) en gramos de masa celular por gramos de
glucosa consumidos.
1 A veces se hace plaqueo para correlacionar (Ver Anexo).
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Segunda Parte: FED-BATCH O DE CULTIVO EN BATCH ALIM ENTADO.
Cuando la DO se aproxime al valor de 2, se agregará NH3 y sales de manera que no
sean estos sustratos controlantes del crecimiento microbiano. Se continuará con el
registro de los valores, midiendo y anotando cada volumen agregado. Se alimentará
glucosa a un caudal de entrada constante F.
Ecuaciones generales: sistema de batch alimentado y tratamiento de los datos d XV
dtV X
( )= ⋅ ⋅µ
(1) d S V
dtF S
V X
YRX S
( )
/
⋅= ⋅ −
⋅ ⋅µ
(2) d P V
dtV X YP X
( )/
⋅= ⋅ ⋅ ⋅µ
(3) Sustituyendo (1) en (2) queda; d S V
dtF S
d X V
dt YRX S
( ) ( )
/
⋅= ⋅ −
⋅⋅
1
(4) En un sistema de cultivo en batch alimentado, generalmente, deseamos que la
velocidad de crecimiento este regulada por la alimentación por lo que S ~ 0 y por lo
tanto d(SV)/dt = 0 o sea que el sustrato es completamente consumido apenas ingresa
en el biorreactor. Entonces considerando un flujo constante y donde existe un sustrato
limitante del crecimiento tenemos:
d X V
dtF S YR X S
( )/
⋅= ⋅ ⋅
(5)
e integrando da: X V X V F S Y tR X S⋅ = ⋅ + ⋅ ⋅ ⋅0 0 / (6) La dependencia del volumen con el tiempo es igual a: V V F t= + ⋅0 (7) si combinamos las ecuaciones (5) y (1) resulta:
F SV X
YRX S
⋅ =⋅ ⋅µ
/ (8) En realidad se puede utilizar cualquier valor de flujo que sea menor a µµµµmax.
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F SV X
YRX S
⋅ ≤⋅ ⋅µ
/ (9) Alimentación constante Como varia µ con el tiempo
µ =⋅
⋅⋅1
X V
d X V
dt
( )
(10) Reemplazando en (10) las ecuaciones (5) y (6),
µ =⋅ ⋅
⋅ + ⋅ ⋅ ⋅F S Y
X V F S Y tR X S
R X S
/
/( )0 0 (11) Usando las ecuaciones (7) y (6) se llega a saber la concentración de biomasa en cada
momento,
XX V F S Y t
V F tR X S=
⋅ + ⋅ ⋅ ⋅+ ⋅
0 0
0
( )/
(12) Para este caso no se considerará la energía de mantenimiento. Las condiciones
iniciales serán. V0 ; YXS; µµµµ y X0; conocidas de la primera parte del TP. La concentración
de sustrato en la corriente de alimentación fresca, será SR. Calcule los valores
esperados a cada tiempo (t= 1 h).
tiempo F XV V X g glucosa /h
0.00
1.00
2.00… Continuar controlando hasta que el valor de DO haya ascedido hasta 6-8. En ese
momento se procederá a la inducción mediante el agregado de isopropiltiogalactósido
(IPTG). A partir de ese momento, el microorganismo comienza a producir la proteían
de interés. Consume sustrato para la producción de la proteína y cesa la fase de
crecimiento exponencial.
El registro de datos y la toma de muestras se contínua por dos o tres horas más.
Tomar muestras para geles de proteínas (preinducción y post inducción).
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TP Nro. 3 Concentración por microfiltración
Introducción y Objetivo.
Los productos sintetizados biológicamente pueden ser intracelulares o extracelulares.
Los productos intracelulares ocurren en forma soluble dentro del citoplasma o bien se
producen como cuerpos de inclusión (finas partículas que se depositan en el interior
de la célula). Con el objeto de obtener los productos intracelulares primero se tienen
que romper las células para que éstos sean liberados en un medio líquido antes de
que se puedan llevar a cabo las separaciones posteriores. En procesos a gran escala,
las células generalmente se separan del medio de cultivo. Esto se hace para reducir la
cantidad de impurezas: particularmente sustancias extracelulares segregadas,
componentes del medio inutilizados. En muchos casos las suspensiones de células se
espesan o concentran por microfiltración o centrifugación con el objeto de reducir el
volumen a procesar.
El objetivo del siguiente TP es el de familiarizarse con la instalación y operación del
sistema de filtración tangencial, ProFlux® M12,.Millipore.
Procedimientos.
Brevemente, se lleva a cabo un procedimiento de operación típico para el sistema
cassette de Pellicon. Siguiendo las indicaciones del fabricante del equipo. Se debe
tener en cuenta:
• El ensamblado del equipo y sistema de lavado (enjuague)
Se ensambla el soporte de acrílico y se instala la membrana en el soporte
correctamente. Para eliminar la solución de almacenaje del sistema antes de ser
utilizado y prevenir la contaminación de la muestra con dicha solución, se enjuaga
bombeando agua a través del sistema. Los filtros son conservados en una solución de
0,1% Lysol™. Esta solución no es tóxica, pero puede irritar piel y ojos. Utilice guantes
de goma para la manipulación de los filtros.
• Ensayo de integridad
Se debe realizar para confirmar la integridad de la membrana y del sistema antes de
filtrar la muestra.
• La determinación de la permeabilidad al agua inicial normalizada (NWP) de los
filtros nuevos (sin uso).
Esta determinación hay que realizarla antes de comenzar a filtrar nuestra muestra. La
NWP inicial es el punto de referencia que determina la efectividad del lavado y ayuda a
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establecer el estado de las membranas que son almacenadas y re-utilizadas. Para
estar seguro que nuestra medición de NWP es correcta, se medirá y registrará la NWP
a dos valores diferentes de presión de transmembrana (TMP).
• Estudio de ensuciamiento
Antes de optimizar las condiciones de aplicación del sistema, es importante determinar
si la solución ensucia la membrana, y si así fuese, cuánto se reduce el caudal debido
al ensuciamiento y cuánto le lleva al ensuciamiento estabilizar. Si el ensuciamiento no
se estabiliza, o si este es muy severo (el caudal cae más del 50% durante esta etapa),
se deberá seleccionar una membrana hecha de otro material.
• Determinación de la presión de transmembrana (TMP) óptima
Se determina midiendo y graficando el flujo de proceso en función de la TMP. El valor
óptimo de TMP es el punto para el cual cambia la pendiente.
• Concentración del soluto
Utilizando el caudal recomendado y el “óptimo” TMP determinado en el punto anterior,
se procederá a filtrar la solución eliminando el filtrado del sistema para concentrar el
retentado. Se prende el cronómetro cuando comienza el filtrado. No detenerlo hasta
haber alcanzado el volumen final de concentrado.
Anotar:
Volumen inicial de solución de alimentación:………litros
Volumen final deseado de concentrado:…………..litros
Por diferencia calcular la cantidad de filtrado que debe ser eliminada (litros). Anotar el
tiempo transcurrido a cada 500 ml de filtrado eliminado. Medir la temperatura. Calcular
el caudal de filtrado. Normalizar cada caudal o medida de flujo utilizando los factores
de corrección de temperatura. Al mismo tiempo, registre la cantidad total de filtrado
que ha sido eliminado en cada intervalo. Utilice este dato para calcular el factor de
concentración, X,
( )XV
V V
alimentación inicial
alimentación inicial filtrado eliminado
=−
( )
( ) ( )
La variación de X con el tiempo será mucho más rápida al final del filtrado que al
principio. Grafique el caudal en función del log (X).
Guarde los últimos 500-1000ml de filtrado para utilizarlos como solución de enjuague
más tarde, par ayudar a recuperar proteína del sistema.
• Recuperación y enjuague.
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Para optimizar el rendimiento del producto, hay dos técnicas de recuperación
utilizadas: el drenado gravitacional con una recirculación del enjuague y el flujo tapón.
se debe enjuagar el sistema con el filtrado o algún buffer salino antes de comenzar
con la etapa de lavado.
• Lavado.
De acuerdo al tipo de ensuciamiento que se cree haya quedado en la membrana se
selecciona la concentración y solución de lavado.
• Enjuague.
Se llena el recipiente contenedor con agua para bombear al sistema y así eliminar toda
la solución de lavado.
• La determinación de la permeabilidad al agua inicial normalizada (NWP) de los
filtros luego del lavado.
Se realiza del mismo modo indicado para los filtros nuevos pero esta vez, sirve como
medida de la efectividad del procedimiento de lavado.
• Desensamblado del sistema de filtros.
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TP Nro. 4. Disrupción de las células y concentració n
Introducción y objetivos.
Los métodos de disrupción se pueden clasificar en dos categorías: métodos físicos y
métodos químicos.
Métodos físicos.
• Disrupción en molino de bolas
• Disrupción utilizando un molino de rotor
• Disrupción utilizando prensa Francesa
• Disrupción utilizando vibración ultrasónica.
Métodos químicos y físicoquímicos
• Disrupción utilizando detergentes
• Disrupción utilizando enzimas
• Disrupción utilizando solventes
• Disrupción utilizando shock osmótico
Los métodos físicos están más focalizados a la ruptura de la pared celular mientras
que los métodos químicos y fisicoquímicos se utilizan principalmente para
desestabilizar la membrana celular.
El objetivo del TP será el procesado del producto obtenido del biorreactor, de manera
que el alumno pueda observar y aprender los factores que requieren especial atención
en esta operación unitaria.
Materiales y métodos.
Se utilizará un homogeinizador de alta presión tipo Prensa Francesa marca
Roholmsvej 8. APV Homogenisers.
La cosecha del biorreactor deberá ser enfriada a 10ºC antes de proceder al primer
paso por la prensa. Registrar la presión de trabajo utilizada (aproximadamente será de
1000 Bar) y el número de pasadas (de 3 a 4). Controlar la temperatura al final de cada
pasada para decidir, de ser necesario, una etapa de enfriamiento adicional antes de
iniciar el siguiente paso. Retirar muestras de 5 ml prerruptura y después de cada ciclo
para:
• controlar la ruptura por microscopía óptica,
• Guardar muestras para observar la ruptura de ADN mediante electroforesis en gel
de agarosa (optativo).
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• Guardar alícuotas para analizar pellet y sobrenadante.
Centrifugar a 10000 rpm durante 15 minutos. Almacenar el sobrenadante a 4ºC. Lavar
el pellet con agua destilada (igual volumen) y almacenar a -20ºC. Este último podría
contener cuerpos de inclusión de posible interés.
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TP Nro. 5 Purificación
Introducción y objetivos
Resumiendo los pasos que se han estado siguiendo se puede confeccionar el
siguiente esquema.
Para esta última parte en el esquema de obtención de la proteína se realizará una
purificación vía columnas de cromatografía. Existen distintos tipos de cromatografías
en tres ellos:
• La filtración o exclusión molecular
• La cromatografía de intercambio iónico
• La cromatografía interacción hidrofóbica
• La cromatografía de afinidad
Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular.
La fase estacionaria esta constituida por partículas de polímeros de diferente
porosidad. La separación se basa en el tamaño de las partículas. Las proteínas más
grandes que no pueden penetrar en los poros de las partículas de la matriz de
filtración son eluidas con más rapidez que las proteínas más pequeñas que penetran
Crecimiento de las células
Recogida
Disrupción celular
Centrifugación
Precipitado (Pellet)Sobrenadante
Filtración
Cromatografía
Microfiltración
Crecimiento de las células
Recogida
Disrupción celular
Centrifugación
Precipitado (Pellet)Sobrenadante
Filtración
Cromatografía
Microfiltración
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por los poros de las partículas y siguen un camino más tortuoso y más largo. El
tamaño de los poros internos depende de la naturaleza del polímero en cuestión, y
permite la entrada a proteínas por debajo de un determinado peso molecular.
Cromatografía de intercambio iónico.
En ella, la columna está rellena con un soporte al que van unidos grupos cargados
positivamente (intercambio aniónico) o negativamente (intercambio catiónico). Estos
grupos cargados normalmente están neutralizados por iones del tampón. Estos iones
son reversiblemente reemplazados por las proteínas con más tendencia a unirse al
soporte. Las proteínas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores
catiónicos o aniónicos dependiendo de su carga neta. Las proteínas más cargadas se
unirán más fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de
eluir. La afinidad con la que una proteína se une a un intercambiador iónico depende
de la fuerza iónica del medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la
proteína y los iones de la fase móvil. Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas
(retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza iónica de la fase móvil
(aumentando la concentración de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las
proteínas mas débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor saldrán las
proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas.
Cromatografía interacción hidrofóbica.
Se trata de un método similar al anterior con la única diferencia de que la fase
estacionaria es apolar (hidrofóbica), es decir, la proteína se pega al soporte por los
restos de aminoácidos apolares, cuanto más residuos de este tipo tenga en su
superficie, más apolar será, más se retendrá en la columna y se eluirá más tarde. En
este caso a elusión se realiza aumentando la apolaridad de fase móvil.
Cromatografía de afinidad.
Involucra interacciones específicas entre las biomoléculas, como por ejemplo, la unión
de una enzima con un cofactor o un inhibidor. En esta técnica la molécula que se une
específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando y éste a su vez se
une en forma covalente al soporte inerte de la columna. Cuando el extracto con la
mezcla de proteínas se aplica a la columna, la proteína buscada se unirá al ligando
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inmovilizado mientras que las demás saldrán de la columna con el tampón. En este
caso también se utiliza el incremento de fuerza iónica para eluir las proteínas.
Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas cromatográficos
tales como el FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography), en el que se hace uso de
bombas de alta presión (100-400 bares) y columnas con materiales que soportan altas
presiones. Este sistema reduce notablemente los tiempos de purificación y utilizan
fases estacionarias con mayor poder de retención, lo que se incrementa los
porcentajes y rendimiento de las purificaciones.
El objetivo del trabajo práctico es aprender a determinar un esquema de purificación,
seleccionando las columnas convenientes de acuerdo a la proteína en cuestión.
Preparar la muestra a sembrar, así como las soluciones buffer a emplear. Conocer las
recomendaciones más importantes para el armado de columnas. Equilibrar y
acondicionar la columna. Registrar, calcular y analizar los parámetros más relevantes
de esta operación.
Materiales y métodos
Se utilizarán columnas de 16 mm de diámetro y 20 cm de longitud. El equipo consta de
detectores de pH, conductividad y de tres longitudes de de onda en el rango del
ultravioleta.
1) Filtrar la muestra a través de poro 0,45 µm.
2) Equilibrar la columna.
3) Sembrar la muestra
4) Lavar con buffer de equilibrio
5) Eluir con buffer específico.
6) Limpiar y sanitizar
7) Acondicionar para guardar o para la próxima corrida
8) Tomar muestras de presiembra, pass trough (lo que no pega en la siembra),
picos que salen en el/los lavados, picos durante la elusión.
TEORÍA DE CROMATOGRAFIA.
La forma en que una molécula interactúa con la fase estacionaria se cuantifica en
términos de factor de capacidad k.
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kn
ns
M
= (1)
Donde
ns: moles de soluto unidos a la fase estacionaria (kmoles)
nM: moles de soluto presentes en la fase móvil (kmoles)
Entonces:
kV C
V CK
V
VS S
M M
S
M
=⋅⋅
= ⋅ (2)
Donde
VS: volumen de la fase estacionaria (m3)
VM: volumen de la fase móvil (m3)
CS: concentración del soluto en la fase estacionaria (kmoles/m3)
CM: concentración del soluto en la fase móvil (kmoles/m3)
K: coeficiente de distribución o de partición
De la ecuación (1) y (2):
k K= ⋅−
( )1 ε
ε (3)
Donde
ε: fracción de vaciado de la columna.
El tiempo de retención (tR) es el tiempo en el cual la concentración de un determinado
soluto alcanza su valor máximo en el efluente, es el tiempo que corresponde a los
picos de concentración. El tiempo de retención tiene dos componentes: el tiempo de
retención de la fase móvil (tM) dentro de una columna que se basa puramente en
consideraciones hidrodinámicas, y el tiempo de retención ajustado (tR’ ) que se debe a
las interacciones del soluto-fase estacionaria:
t t tR M R= + ' (4)
Ha sido demostrado que:
t k tR M'= ⋅ (5)
De las ecuaciones (3), (4) y (5):
t t KR M= ⋅ +−
⋅( )11 ε
ε (6)
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Por consiguiente, a mayores valores de K de un soluto, mayores son sus tiempos de
retención. El tiempo de retención de la fase móvil (tM) depende de su caudal, del
volumen de la columna y de la fracción de vaciado:
tV
QMC=
⋅ε
(7)
Donde
Q: caudal volumétrico de la fase móvil (m3/s)
VC: volumen de la columna (m3)
De las ecuaciones (6) y (7), se obtiene:
tV
QK KR
C= ⋅ + − ⋅( )ε ε (8)
La separación cromatográfica yace fundamentalmente en la diferencia de los tiempos
de retención de los solutos. La calidad de la separación depende de cuán bien los
picos se resuelven. La figura 1 muestra un cromatograma típico de la separación de
dos solutos. Aquí tR1 y tR2 son los tiempos de retención de dos solutos estando
separados mientras que w1 y w2 son los anchos característicos de sus picos. El ancho
del pico depende de las interacciones entre el soluto y la fase estacionaria, el caudal
de la fase móvil y la concentración del soluto en la muestra inyectada. La separación
espacial de dos picos se mide en términos de parámetros de resolución (R).
Rt t
w wR R=
−⋅ +
2 1
1 20 5, ( ) (9)
Mayores valores de R, mejor separación de los picos. R < 1 indica que los picos se van
a superponer, R = 1 indica que los picos están justo resueltos. R > 1 indica que hay un
gap entre los picos.
- 22 -
La separación cromatográfica también se puede definir en términos de selectividad (α).
Mayores valores de α mejor es la separación.
α = = =−−
K
K
k
k
t t
t tR M
R M
2
1
2
1
2
1 (10)
Se asume que una columna de cromatografía está formada por una cantidad de platos
teóricos los cuales son análogos a los de una columna de destilación. A mayor
cantidad de platos mejor es la separación. La altura equivalente de plato teórico (H)
está dada por:
HL
N=
(11)
Donde
N: número de platos teóricos
L: largo de la columna (m)
La cantidad de platos teóricos en una columna de cromatografía se puede determinar
de un cromatograma con un soluto. N depende del tiempo de retención del soluto y del
ancho del pico:
Nt
wR= ⋅
16
2
(12)
El perfil de concentraciones en un pico está dado por:
- 23 -
( )C C
t t= ⋅ −
−
0
0
2
22exp
σ (13)
Donde
C0: concentración máxima del soluto en el pico (kg/m3)
t0: tiempo para el cual se alcanza la concentración máxima, o sea tR (s)
σ2: varianza del pico (σ2). El ancho característico del pico w es igual a 4σ.
La cantidad total de soluto eluido (Mtotal) en un pico está dada por
M Q C dttotal = ⋅ ⋅∞
∫0 (14)
Donde
Mtotal: cantidad total de soluto eluido en un pico (kg)
Q: es el caudal de la fase móvil (m3/s)
El rendimiento del soluto en el efluente colectado en el período de t1 a t2 es:
% Re dimn ientoC dt
C dt
t
t
=⋅
⋅
⋅
∫
∫∞1
2
0
100
(15)
La pureza de un soluto A en la separación binaria de solutos A y B, en el efluente
colectado durante el período t1 a t2 es:
%PurezaC dt
C dt C dt
At
t
At
t
Bt
t=⋅
⋅ + ⋅
⋅
∫
∫ ∫1
2
1
2
1
2 100
(16)
- 24 -
Anexo 1: Preparación de inóculo.
Conservación de Microorganismos.
Existen varios métodos para conservar cepas:
• Liofilización
• Conservación a -70ºC o en nitrógeno líquido. Para evitar que las células se
destruyan durante la congelación, el medio de cultivo debe contener un agente
crioprotector como el dimetilsulfóxido (DMSO) al 7% (v/v), o el glicerol al 15%.
• A temperatura ambiente, en forma de cultivo en siembra profunda en tubos
herméticamente cerrados que contienen un medio sólido rico.
• Con refrigeración, en forma de cultivos en tubo inclinado (slant).
Inoculación y subcultivo
Como una gran cantidad de las células de un inóculo obtenido de un cultivo en un
tubo inclinado están muertas, la mayoría de los experimentos comienzan con el
inóculo de un pequeño volumen de un medio de crecimiento y después el crecimiento
de estas células durante la noche, a la mañana, el crecimiento se habrá detenido. Para
obtener células en crecimiento activo para un experimento en particular, se diluye el
cultivo de la noche unas 10-100 veces y se vuelve a incubar durante varias horas,
hasta que las células vuelven a encontrarse en crecimiento exponencial. Además, si
un cultivo en crecimiento exponencial se enfría rápidamente por debajo de los 8º
(introduciendo el matráz con el cultivo en un baño de agua fría), se conserva a 4ºC, y
después se atempera rápidamente a la temperatura original a la que el cultivo había
estado creciendo, el crecimiento se reanuda sin fase de latencia.
Técnica aséptica y transferencia de cultivos
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para
matener la esterilidad de los medios y soluciones como así también, proteger al
biotecnólogo de la contaminación con el cultivo. La técnica aséptica significa evitar
cualquier contacto entre el cultivo puro, el medio estéril, y las superficies estériles del
recipiente de cultivo, con microorganismos contaminantes. Para conseguir este
objetivo:
- 25 -
1. Se desinfecta el área de trabajo para reducir el número de contaminantes
potenciales.
2. los instrumentos con los que se realiza la transferencia están esterilizados.
3. El trabajo se realiza rápido y eficientemente para minimizar el tiempo de
exposición.
Los pasos típicos en la transferencia de un cultivo de un recipiente a otro son los
siguientes:
1. Flamear el ansa de siembra.
2. Abrir y flamear las bocas de los tubos de cultivo
3. Recoger un poco de cultivo crecido y transferirlo al medio fresco.
4. Flamear las bocas de los recipientes de cultivo antes de cerrarlos
5. Volver a flamear el ansa de siembra.
- 26 -
Anexo 2: Determinación de masa celular
El crecimiento de los cultivos puede seguirse por espectrofotometría. El número de
fotones dispersado es proporcional a la masa de células de la muestra (excepto en
cultivos muy concentrados), o, en condiciones específicas de crecimiento, a la
concentración de células. Sin embargo es la geometría de cada espectrofotómetro la
que determina cuánta luz entra en el fotodetector. Por lo tanto, debe construirse para
cada espectrofotómetro una curva de calibración que relacione la concentración
celular con a absorbancia. Esto se hace midiendo la absorbancia de suspensiones de
células de diferente concentración, y determinando la concentración de cada
suspensión por recuento microscópico directo, o por recuento en placa midiendo el
número de colonias que se forman.
Es importante señalar que la absorbancia es una medida de masa cellar más que un
número celular. El tamaño de la célula varía con la fase de crecimiento, de modo que
es mejor calibrar el espectrofotómetro con células en crecimiento exponencial porque
son tales células las que se emplean en la mayoría de los experimentos. El tamaño
celular también depende del medio de cultivo, disminuyendo conforme el medio se va
haciendo cada vez más pobre, de modo que ha de hacerse una curva de calibración
para cada medio de crecimiento, y a menudo para cada cepa.
Si la densidad celular es demasiado alta, un fotón puede ser reflejado lejos del
detector por una célula y después volver a rebotar en una segunda célula y alcanzar el
detector. Este efecto hace que la absorbancia sea menor que la que ocurriría si no se
diera esta dispersión múltiple; y se hace importante a valores de absorbancia por
encima de 0,7. Así cuando se va a determinar la concentración de un cultivo denso por
espectrofotometría, el cultivo debe diluirse antes de medirlo. Y después el valor
obtenido se corrige con ese factor de dilución.
Se pueden emplear longitudes de onda distintas a 600 nm para determinar la densidad
celular u óptica (DO) y, de hecho, la sensibilidad aumenta según desciende la longitud
de onda. Se pueden emplear longitudes de onda tan bajas como 400 nm, pero no con
todos los medios enriquecidos. Estos medios suelen absorber luz de longitudes de
onda corta de una manera significativa lo que complicaría las determinaciones.
- 27 -
Anexo 3: Determinación de número de células.
Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de elección es el
recuento microscópico directo. Para células de levadura, puede emplearse un
hemocitómetro. Es necesaria una ampliación de X100 a X400 para visualizar la
cámara de recuento y las células en suspensión. Para células bacterianas, se necesita
una cámara de Petroff-Hauser y una ampliación de X1000 a causa del pequeño
tamaño de las bacterias. El recuento microscópico directo tiene la ventaja de que
permite observar directamente la morfología de las células estudiadas. Las
morfologías aberrantes o atípicas podrían indicar unas condiciones subóptimas de
crecimiento o la presencia de un genotipo o fenotipo alterados.
Cargando la cámara
Agitar la suspensión celular con un vortex. Aspirar una pequeña cantidad de
suspensión con una pipeta Pasteur. Depositar una gota pequeña en la superficie
pulida de la cámara de recuento cerca del extremo del cubre. La suspensión entrará
en la cámara por capilaridad. Una cámara adecuadamente llenada contiene células
solo en el espacio contenido entre el cubre y la cámara de recuento. No debería sobrar
fluido que cayera en los surcos.
Realizando el contaje
Colocar el hemocitómetro o la cámara en la platina de un microscopio compuesto y
enfocar el enrejado con el objetivo de menos aumento. Para contra levaduras utiliza el
cuadrado central (Figura A1). Ajusta la intensidad de la luz de modo que se hagan
visibles tanto las líneas como las células. Dependiendo del número de células, cuenta
todas las células del cuadrado central o cuenta sólo cinco cuadrados (indicados con
una X en la Figura A1).
Cálculos
El cuadrado central tiene un volumen de 0,1 mm3. Por lo tanto si el número de células
del cuadrado central se multiplica por 10.000 tendremos el recuento de células por
mililitro de cultivo. Si se han contado sólo 5 cuadrados del interior del cuadrado central,
- 28 -
el recuento debe multiplicarse por 5 x 104 para obtener el recuento por ml. Es
necesario contar un mínimo de 100 células para que el recuento obtenido sea exacto.
Figura A1: Cámara del hemocitómetro. El área central rodeada por círculos se observa
a 100 aumentos
- 29 -
Anexo 4. Recuento de células viables
Una célula puede multiplicarse hasta formar una única colonia visible. Éste es el
fundamento del método de recuento en placa, ya que el número de colonias
producidas a partir de un determinado volumen de cultivo indicará el número de
células viables en ese volumen de cultivo.
Para obtener recuentos de colonias en placa confiables, es esencial que cada una de
las colonias provenga de una sola célula y no de dos o más. Para conseguir que las
células crezcan separadas, el número de células colocadas sobre el agar no ha de
superar el de unos pocos cientos por placa1, y además las células deben distribuirse
en la placa de una manera uniforme. Como la concentración celular utilizada en las
experiencias de la planta piloto suele ser superior a las 106 células/ml, el cultivo debe
diluirse antes de plaquearse. El protocolo estándar es hacer diluciones 10x ó 100x
seriadas hasta que la concentración de células alcance unos pocos miles por mililitro.
Después , se extiende una muestra de 0,1 ml sobre la superficie de una placa de agar;
esta operación (dilución y extensión) se denomina plaqueo. Para evitar el error que
surgiría al transferir volúmenes excesivamente pequeños de muestra, se suelen
transferir volúmenes de entre 0,1-1 ml. Utilizaremos diluciones 10x y 100x añadiendo,
respectivamente, 1 ml de células sobre 9,0 ml de diluyente estéril (solución fisiológica
o agua peptona) y 0,1 ml de células sobre 9,9 ml de diluyente estéril.
Después de colocar la alícuota final de 0,1 ml de células diluidas sobre la placa de
agar , la gota se extiende sobre la superficie con un asa de Drigalski . Este asa se
esteriliza sumergiéndola en etanol, sacudiendo después el exceso de líquido, y
quemando el alcohol remanente en la llama de un mechero Bunsen. El asa se enfría
después tocando con ella la superficie del agar y después se emplea para extender la
gota con las células uniformemente por toda la superficie de la placa. Si todavía queda
líquido sobre el agar, las células pueden moverse a través del líquido y pueden surgir
dos o más colonias de una única célula original. Las placas se preparan con un día de
antelación para que absorban el líquido rápidamente; la absorción se acelera si las
gotas se extienden formando una película tan delgada como sea posible. Una vez que
la superficie de la placa esté seca, se coloca ésta en la estufa de incubación.
Conforme la placa de Petri se calienta, el líquido exudaría desde la porción más
superficial del agar. Por ello es recomendable invertir las placas en la estufa para
evitar la formación de exudados sobre la superficie del agar que permitirían el
- 30 -
movimiento de las células dentro del líquido. Así también se evita la formación de
gotas que podrían formarse por condensación sobre la tapa de la placa, que podrían
caer sobre el agar.
1 Se comete menos error haciendo recuento de placas cuyo crecimiento se encuentre
entre 30 UFC y 300 UFC.
- 31 -
Anexo 5: Determinación de glucosa por el méto do enzimático Se utiliza el kit de glicemia enzimática Boehringer o Wiener Lab.
Protocolo utilizado
Utilizo tubos de ensayo comunes
Blanco Standard Muestra1
H2O bidestilada (µl) 30 - -
Standard del kit (µl) - 30 -
Muestra (µl) - - 30
Reactivo de trabajo (µl) 3000 3000 3000 1Centrifugar 3 minutos a 14000 rpm tomar el sobrenadante.
Agitar en vórtex cada tubo
Incubar en baño de agua a 37ºC durante 10 minutos
Leer en espectrofotómetro a λ = 505 nm
El color final es rosa y es estable durante 1 hora
Reactivo de trabajo
Según el prospecto interno del kit.
Calcular el volumen total necesario según el número total de muestras (más el blanco
y el estándar) a medir.
Se usa una probeta graduada y con tapa a la cual se agrega:
1) 500 partes de agua bidestilada.
2) 50 partes del reactivo 4-AF
3) 50 partes del reactivo fenol
4) Se lleva a 1000 partes con agua bidestilada
5) Se agregan 3 partes de las enzimas GOD/POD (que fueron previamente
homogenizadas en su frasquito original con mucho cuidado de no producir
espuma)
6) Se mezcla delicadamente por inversión tratando de no producir espuma (lo
cual es muy difícil)
Conservar en heladera al abrigo de la luz (hasta 1 mes)
- 32 -
Cálculo del resultado
D = Absorbancia
S = Absorbancia del estándar de glucosa
Glucosa (g/l) = D . f
f = 1,00 g / l (glucosa) S
- 33 -
Anexo 6. Medición de proteínas con el método de L owry y col.
Procedimiento
La curva de calibración se hace con suero albúmina bovina (BSA), Sigma Protein
Standard. Se disuelve en agua bidestilada utilizando jeringa estéril y, si se diluye
según etiqueta (1.99 mg + 4.97 ml) queda una solución de 400 µg BSA / ml.
Muestras1: 100 µl de solución protéica + 100 µl de agua + 1000 µl de Reactivo A
Blanco: 200 µl de agua + 1000 µl de Reactivo A
Agitar en vórtex
Mantener a 37ºC durante 20 minutos
Agregar 100 µl de Reactivo B al tubo de reacción
Agitar en vórtex
Mantener a 37ºC durante 20 minutos
Leer contra blanco a λ = 660 nm (tonos azulados ). Usar cubetas de poco volumen.
Reactivos
-Reactivo A
1. Carbonato sódico (Na2CO3) 2% en NaOH 0,1N
2. Sulfato cúprico (CuSO4 .5 H2O) 1% en agua
3. Tartrato sódico potásico (KNaC4H4O6 . 4 H2O) 1% en agua
Mezclar 1, 2 y 3 en relación 10 (de 1) : 0,1 (de 2) : 0,1 (de 3)
-Reactivo B
1. Solución Folin Ciocalteau en agua 1 : 1 (se prepara antes de usar)
Una descripción detallada de la técnica puede ser consultada en:
Lowry, Rosebrough, Lewis Farr, Randall Peterson (1977). “A simplification of the
protein assay method of Lowry et al more applicable”. Anal. Biochem. 83, 346 – 356
1 Proteína soluble: directo
Pellet 100 ml suspensión → lavar el pellet y resuspender → tomar alícuota
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Anexo 7: Electroforesis en gel de agarosa Solución de agarosa:
1. Para preparar un gel al 1%, pesar 0,5g de agarosa (grado biología molecular) y
pasar a un erlenmeyer.
2. Medir en probeta 50 ml de buffer TBE (Tris- acido bórico- EDTA) y mezclar con la
agarosa.
3. Llevar a fundir en microondas o en baño térmico. Observar que toda la agarosa
se haya fundido. Homogeneizar agitando suavemente.
4. Verter la agarosa fundida en el soporte. Colocar los peines y dejar gelificar.
Buffer TBE 10X:
Componente Stock 10X Concentración final 1X
Tris Base 890 mM 89 mM
Ácido Boórico 890 mM 89 mM
EDTA (pH 8,0) 20 mM 2 mM
Muestras:
Considerar que por cada calle se siembran 20ng de DNA como mínimo. Diluir en
loading buffer llevando a la concentración requerida de éste último. Agregar también el
colorante Sybr green. El volumen de muestra que entra en cada calle depende del
peine utilizado y varía de 10ul a 20ul
Loading buffer: Glicerol y azul de bromofenol (6x):
3ml de glicerol (30%)
25mg de azul de bromophenol (0.25%)
Llevar a 10mL con dH2O
Corrida:
1. Retirar el peine una vez que haya gelificado completamente la agarosa.
2. Llenar la cuba con buffer TBE hasta sobrepasar al gel en 2-5mm
3. Cargar las muestras en las calles. Anotar el orden de siembra. Si es posible no
sembrar las calles de los extremos. Sembrar los marcadores de peso molecular.
4. Conectar las salidas a la fuente. Correr a voltaje constante. Detener la corrida
cuando el azul de bromofenol haya alcanzado los ¾ de la longitud total del gel.
5. Retirar el gel y llevar al transiluminador para revelar las bandas obtenidas.
- 35 -
Anexo 8: Electroforesis en gel (SDS-Page) Armado del cassette de gel
1. Realizar un pequeño corte en el extremo superior derecho del gel para indicar que
corresponde a la última calle.
2. Colocar la placa corta encima de la placa espaciadora
3. Deslizar las dos placas dentro del armazón del marco. La placa corta debe mirar
hacia el frente.
4. Trabar las palancas de la presión para asegurar las placas de vidrio.
5. Utilizar la traba para mantener el cassette de gel apoyado firmemente sobre la
superficie correspondiente.
Componentes Gel al 6%
Volumen final 5 mL 10 mL Acrilamida 30% 1,0 mL 2,0 mL Agua destilada 2,65 mL 5,3 mL Tris-HCl 0,5M pH8,0 1,25 mL 2,5 mL SDS 10% 50 µL 100 µL APS 10% 50 µL 100 µL TEMED 3,5 µL 7,0 µL
Gel al 8% Volumen final 5 mL 10 mL Acrilamida 30% 1,3 mL 2,6 mL Agua destilada 2,35 mL 4,7 mL Tris-HCl 0,5M pH8,0 1,25 mL 2,5 mL SDS 10% 50 µL 100 µL APS 10% 50 µL 100 µL TEMED 3,5 µL 7,0 µL
Gel al 10 % Volumen final 5 mL 10 mL Acrilamida 30% 1,7 mL 3,4 mL Agua destilada 1,95 mL 3,9 mL Tris-HCl 0,5M pH8,0 1,25 mL 2,5 mL SDS 10% 50 µL 100 µL APS 10% 50 µL 100 µL TEMED 3,5 µL 7,0 µL
- 36 -
Preparación del gel de poliacrilamida
1. Preparar en tubos falcon, por separado, el gel separador y el gel concentrador.
2. En primer lugar agregar el APS y el TEMED al gel separador, homogeneizar bien y
cargar en el cassette con pipeta. Dejar solidificar.
3. Agregar el APS y el TEMED al gel concentrador, homogeinizar y cargar con pipeta.
4. Colocar el peine correspondiente. Dejar polimerizar (chequear observando la
polimerización en el tubo)
5. Retirar el peine.
Montaje del módulo
1. Remover el cassette del gel del montaje para armado
2. Posicionar el cassette del gel dentro del montaje del electrodo dentro de la traba
del marco.
3. Presionar hacia abajo el montaje del electrodo mientras se cierran las dos trabas
del armazón del marco.
4. Bajar el compartimiento interno dentro del tanque
Componentes Gel al 12%
Volumen final 5 mL 10 mL Acrilamida 30% 2,0 mL 4,0 mL Agua destilada 1,65 mL 3,3 mL Tris-HCl 0,5M pH8,0 1,25 mL 2,5 mL SDS 10% 50 µL 100 µL APS 10% 50 µL 100 µL TEMED 3,5 µL 7,0 µL
Gel al 16% Volumen final 5 mL 10 mL Acrilamida 30% 2,7 mL 5,4 mL Agua destilada 0,95 mL 1,9 mL Tris-HCl 0,5M pH8,0 1,25 mL 2,5 mL SDS 10% 50 µL 100 µL APS 10% 50 µL 100 µL TEMED 3,5 µL 7,0 µL
Gel al 18 % Volumen final 5 mL 10 mL Acrilamida 30% 3 mL 6 mL Agua destilada 0,65 mL 1,3 mL Tris-HCl 0,5M pH8,0 1,25 mL 2,5 mL SDS 10% 50 µL 100 µL APS 10% 50 µL 100 µL TEMED 3,5 µL 7,0 µL
- 37 -
5. Llenar la cámara interna con aproximadamente 125mL del buffer de corrida (que
alcance un nivel entre los bordes de ambos vidrios). Evitar que el buffer ingrese a
la cámara menor.
6. agregar aproximadamente 200mL del buffer de corrida en el tanque.
Siembra de muestras, electroforesis y remoción del gel
1. Colocar la guía entre ambos geles
2. Sembrar las muestras con pipeta
3. Tapar el tanque. Asegurarse de conectar correctamente los electrodos a la fuente
considerando el color de los cables.
4. Conectar a la fuente de energía, setear voltaje de corrida (máximo 200 V) e iniciar
la corrida.
5. Una vez finalizada la corrida, apagar la fuente de poder y desconectar los
electrodos
6. Remover la tapa del tanque y retirar cuidadosamente la cámara
7. Descartar el buffer de corrida antes de abrir las trabas para evitar el derrame de
buffer
8. Abrir las trabas del marco, retirar el montaje del electrodo y sacar los cassettes.
9. Remover el gel separando gentilmente las dos placas del cassette, usando los
liberadores de gel plásticos de color verde.
10. Pasar el gel al buffer que corresponda (de transferencia, por ejemplo)
11. Enjuagar todo con agua destilada después de su uso.
- 38 -
Referencias Bibliográficas
- Becker JM, Caldwell GA, Zachgo EA. (1999). Biotecnología. Curso de Practicas de
Laboratorio. Ed Acribia, Zaragoza, España.
- Guía de Trabajos Práctico, Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología.
(2006). Disponible desde: http://www.ffyb.uba.ar/micro_ind/biot1/tps/gtp2007.doc
- Manual de operación del sistema Millipore. (2009). Pellicon Laboratory.
- Najafpour, Ghasem D. (2007). Biochemical engineering and biotechnology. 1st. ed.
Elsevier, Ámsterdam.
- Raja Ghosh. (2006). Principles of Bioseparations Engineering. World Scientific, New
Jersey .