UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE DURANGO

CAMPUS LOS MOCHIS

LIC. EN NUTRICIÓN

GUÍA DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

Ing. Oscar Cota Álvarez

INDICE

UNIDAD I

1.1ANTECEDENTES DE LA MICROBIOLOGÍA

Microbiología, ciencia que estudia los organismos de tamaño microscópico, entre

los que se incluyen las bacterias, los protozoos y los virus, así como ciertos

hongos (levaduras) y algas unicelulares de pequeño tamaño.

Microbiología, el estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras

griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente

significan el estudio de la vida microscópica.

La microbiología comprende un conjunto de disciplinas relacionadas, entre las que

destacan la bacteriología, la virología y la parasitología. Estudia, no sólo la

morfología de los microorganismos, sino también su modo de vida, su

metabolismo, su estructura molecular, sus propiedades patogénicas y sus

características antigénicas (aquellas que pueden provocar una respuesta del

sistema inmunológico).

La microbiología surgió como ciencia tras el descubrimiento, gracias al

perfeccionamiento del microscopio, de los microorganismos. El naturalista

holandés Antoni van Leeuwenhoek fue el primero en describir, en 1683, estos

organismos (a los que bautizó como “animálculos”), que observó con la ayuda de

un microscopio construido por él mismo.

Fue a partir de la segunda mitad del siglo XIX cuando los conocimientos de la

microbiología avanzaron de forma notable, gracias, por una parte a Louis Pasteur

(considerado el padre de la microbiología moderna) y, por otra, a Robert Koch

(descubridor del agente responsable de la tuberculosis o bacilo de Koch). Este

desarrollo se vio particularmente estimulado por las implicaciones de la

microbiología en el estudio de muchas enfermedades. De este modo, los trabajos

de estos dos investigadores y de sus discípulos permitieron descubrir numerosos

microorganismos patógenos, proporcionando las bases para el control diversas

enfermedades.

Además, Pasteur, durante una conferencia pronunciada en la Sorbona en 1864,

estableció un principio fundamental para el avance de las investigaciones: los

microorganismos, como los restantes seres vivos, no aparecen de manera

espontánea, sino a partir de “gérmenes” existentes en el medio (fue el final de la

teoría de la generación espontánea que, durante 200 años, había generado una

gran controversia). Pasteur describió también el origen bacteriano de los procesos

de fermentación y de muchas enfermedades infecciosas.

Cuando se descubrieron los organismos microscópicos, los científicos intentaron

incluirlos en los dos reinos establecidos por Aristóteles (reino Animal y reino

Vegetal): en efecto, aunque Leeuwenhoek los consideró a todos “animales

pequeños”, pronto se confirmó que algunos poseían características vegetales (por

ejemplo, actividad fotosintética). Sin embargo, la clasificación en uno los dos

reinos se hacían imposibles para cierto número de microorganismos que poseían

a la vez características animales y vegetales. Fue a finales del siglo XIX cuando el

biólogo alemán Ernst Haeckel agrupó a las bacterias en un reino aparte, el reino

Móneras.

Por otro lado, diversas experiencias permitieron ampliar considerablemente los

conocimientos sobre la estructura de las bacterias. Así, Hans Christian Joachim

Gram (1853-1938) puso a punto el método de coloración que lleva su nombre y

que permitió descubrir la existencia de dos grandes tipos de bacterias: bacterias

Gram positivas (con una pared gruesa de peptidoglicanos) y bacterias Gram

negativas (con una pared fina). Cuando se les aplica la tinción de Gram, las

primeras aparecen de color púrpura mientras que las bacterias Gram negativas

son incoloras o rojizas.

A finales del siglo XIX y comienzos del XX, diversos microbiólogos como el ruso

Serguei Winogradsky, considerado el fundador de la ecología microbiana

moderna, emprendieron las investigaciones sobre el metabolismo de las bacterias

(estudios iniciados por Pasteur). Winogradsky estableció que las bacterias

funcionan según dos modelos: la aerobiosis, que se basa en el consumo de

oxígeno; y la anaerobiosis, que permite a las bacterias vivir en un ambiente

desprovisto por completo de oxígeno. Winogradsky descubrió las bacterias

quimiosintéticas, puso de manifiesto la participación de los microorganismos en el

ciclo de la urea y fue uno de los primeros en estudiar las bacterias simbióticas.

El estudio de los virus se desarrolló especialmente en el primer tercio del siglo XX.

En efecto, a pesar de que en el año 1905 varios microbiólogos habían demostrado

que las enfermedades víricas conocidas se debían a agentes patógenos

minúsculos y no a las toxinas, los virus siguieron siendo invisibles; y su naturaleza,

desconocida, hasta la década de 1930. En 1935 el bioquímico estadounidense

Wendell Stanley logró aislar y cristalizar un virus: el del mosaico del tabaco.

En 1938 se observaron por primera vez los virus gracias a la invención del

microscopio electrónico. Después, en las décadas de 1960 y 1970 se descubrieron

numerosos virus y se determinaron sus características físicas y químicas.

Posteriormente, las investigaciones microbiológicas se sirvieron de diversas

técnicas innovadoras, como el microscopio electrónico de barrido o las técnicas de

secuenciación del ácido desoxirribonucleico (ADN). Gracias a todos estos

avances, los microorganismos se clasificaron en función de su estructura

molecular, incluyéndolos en tres reinos. De este modo, las bacterias forman el

conjunto de los procariotas, es decir, organismos en los que el material genético,

en forma de ADN, se encuentra libre en el citoplasma y no incluido en un núcleo:

pertenecen al reino Móneras. Los restantes organismos unicelulares se clasifican

como eucariotas (en los que el genoma está incluido en el núcleo celular). Entre

estos eucariotas unicelulares se distinguen los que pertenecen al reino Protistas

(grupo que engloba a los protozoos y algas unicelulares) y los que pertenecen al

reino Hongos (las levaduras). Los virus constituyen un mundo aparte, ya que no

pueden reproducirse por sí mismos, sino que necesitan parasitar una célula viva

para completar su ciclo vital.

Por último, el descubrimiento de los priones por Stanley Prusiner y su equipo en

1982 ha abierto una vía de estudio dentro de la microbiología. Los priones,

simples proteínas desprovistas de material genético, suscitan numerosos

interrogantes sobre su funcionamiento y modo de transmisión.

1.2 RAMAS DE LA MICROBIOLOGÍA

Las ramas más importantes de la microbiología son: la virología, parasitología,

micología, y bacteriología. Cada una de esas ciencias se encarga del estudio la

diversidad del microorganismo, metabolismo, reproducción, taxonomía y la

fisiología.

1.3 CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SEGÚN SUS

PARÁMETROS FÍSICOS

Por su requerimiento de oxigeno

Otro aspecto a tener en cuenta en la clasificación de bacterias es la necesidad de

oxígeno para poder vivir. Dependen en buena medida de la disponibilidad de las

enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos.

Aerobias estrictas: Dependen de O2 para su crecimiento.

Anaerobias estrictas: se desarrollan en ausencia total de O2, utilizan aceptores

finales distintos del oxígeno: CO2, H2 y N2, o poseen metabolismo estrictamente

fermentativo.

Anaerobias Facultativas: pueden desarrollarse en presencia o ausencia de O2,

aunque predominan en medios anaeróbicos

.

Microaerófilas: sólo se pueden desarrollar en presencia de bajas tensiones de O2

(menor del 12% en lugar del 20% que es la atmosférica) y altas tensiones de CO2.

Por su óptimo de temperatura

Según la temperatura óptima de crecimiento las bacterias se clasifican en:

Termófilas: se desarrollan entre 25 y 80°C, óptima 50 y60°C

Mesófilas: se desarrollan entre 10 y 45°C, óptima 20 y 40°C

Psicrófilas: se desarrollan entre -5y 30°C, óptima 10 y 20°C.

Según el pH en que se desarrollan

Las bacterias se clasifican en:

Acidófilas: Se desarrollan a pH entre 1.0 y 5.0

Neutrófilas: Se desarrollan a pH entre 5.5 y 8.5

Basófilas: Se desarrollan pH entre 9.0 y 10.0

Por su forma de nutrición

Según su metabolismo interno, las bacterias presentan requerimientos

nutricionales diversos y se clasifican en:

Autótrofas quimiosintéticas o fotosintéticas, Las autótrofas fotosintéticas

utilizan la luz del sol y el bióxido de carbono para fabricar su alimento. Las

autótrofas quimiosintéticas utilizan compuestos inorgánicos, por ejemplo, el azufre

para fabricar su alimento y su fuente de energía es el CO2

Heterótrofas (por absorción) pueden utilizar fuente de carbono orgánico para su

alimentación

Las bacterias pueden vivir como parásitos afectando los organismos donde

habitan, como simbiontes formando parte de la flora bacteriana normal de la piel,

cavidades y tracto digestivo del hombre y de los animales y saprofitas la gran

mayoría, ayudando a la descomposición de la materia orgánica muerta.

1.4FASES DE CRECIMIENTO MICROBIANO

El crecimiento bacteriano es la división de una bacteria en dos células hijas en

un proceso llamado fisión binaria. Previniendo que no se produzca ningún caso de

mutación las células hijas resultantes serán genéticamente idénticas a la célula

original. De este modo tiene lugar la "duplicación local" de la población bacteriana.

Las dos células hijas creadas tras la división no sobreviven necesariamente. Sin

embargo, si el número de supervivientes supera la unidad, en promedio, la

población bacteriana experimenta un crecimiento exponencial. La medición de una

curva del crecimiento exponencial de las bacterias en un cultivo ha sido

tradicionalmente una parte de la formación de todos los microbiólogos. Los

procesos fundamentales empleados para ello son la enumeración bacteriana

(conteo bacteriano) por métodos directos e individuales

(microscopía, citometría de flujo[1] ), por métodos directos y masivos (biomasa), por

métodos indirectos e individuales (conteo de colonias), o por métodos indirectos y

en bloque (número más probable, turbidez, absorción de nutrientes). Los modelos

permiten conciliar la teoría con las mediciones.

Fases de crecimiento microbioano

En estudios autoecológicos, el crecimiento bacteriano en un cultivo de lotes se

pueden modelar suponiendo cuatro fases diferentes: fase de adaptación (A), fase

exponencial (B), fase estacionaria (C), y fase de declive (D).

A. Durante la fase de adaptación, las bacterias se adaptan a las condiciones de

crecimiento. Es el período en el que las bacterias individuales están madurando y

no tienen aún la posibilidad de dividirse. Durante la fase de adaptación del ciclo de

crecimiento de las bacterias, se produce la síntesis de ARN, enzimas y otras

moléculas. Así que en esta fase los microorganismos no están latentes.

B. La fase exponencial (a veces llamada fase logarítmica) es un período

caracterizado por la duplicación celular. El número de nuevas bacterias que

aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la población actual. Si el

crecimiento no se limita, la duplicación continuará a un ritmo constante, por lo

tanto el número de células y la tasa de crecimiento de la población se duplica con

cada período de tiempo consecutivo. Para este tipo de crecimiento exponencial,

representando el logaritmo natural del número de células frente al tiempo se

obtiene una línea recta. La pendiente de esta línea es la tasa de crecimiento

específica del organismo, que es una medida del número de divisiones por célula

y por unidad de tiempo. La tasa real de este crecimiento (es decir, la pendiente de

la recta en la figura) depende de las condiciones de crecimiento, que afecta a la

frecuencia de los eventos de división celular y a la probabilidad de que ambas

células hijas sobrevivan. Bajo condiciones controladas, las cianobacterias pueden

duplicar su población cuatro veces al día. El crecimiento exponencial no puede

continuar indefinidamente, sin embargo, porque el medio llega pronto al

agotamiento de nutrientes mientras se acumulan los desechos.

C. Durante la fase estacionaria, la tasa de crecimiento disminuye como

consecuencia del agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos

tóxicos. Esta fase se alcanza cuando las bacterias empiezan a agotar los recursos

que están disponibles para ellas. Esta fase se caracteriza por un valor constante

del número de bacterias a medida que la tasa de crecimiento de las bacterias se

iguala con la tasa de muerte bacteriana.

D. En la fase de declive o muerte, las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren.

Esta modelo de crecimiento del cultivo básico en lotes se mantiene y pone su

énfasis en los aspectos de la proliferación de bacterias que pueden diferir de las

del crecimiento de la macrofauna. Se hace hincapié en clonalidad, división asexual

binaria, el breve tiempo de desarrollo en relación con la replicación en sí, la tasa

de mortalidad aparentemente baja, la necesidad de pasar de un estado inactivo a

un estado reproductivo y, por último, la tendencia de cepas adaptadas de

laboratorio para agotar sus nutrientes.

En realidad, incluso en los cultivos por lotes, las cuatro fases no están bien

definidas. Las células no se reproducen en sincronía sin una explícita y continua

instigación (como en los experimentos con bacterias forzadasa y su fase de

crecimiento exponencial a menudo no sigue siempre un ritmo constante, sino que

en su lugar poseen una tasa de lenta decadencia, una respuesta estocástica

constante ante las presiones simultáneas de reproducirse y de permanecer

latentes ante la disminución de las concentraciones de nutrientes y el aumento de

las concentraciones de residuos.

El cultivo en lotes es el medio de cultivo de laboratorio más común en el que se ha

estudiado el crecimiento de bacterias, pero es sólo uno de los muchos posibles.

En condiciones ideales, está espacialmente estructurado y no estructurado

temporalmente. El cultivo de bacterias se incuba en un recipiente cerrado con un

único lote de medio de cultivo. En algunos sistemas experimentales, algunos de

los cultivos bacterianos se retiran periódicamente y un medio fresco estéril se

añade. En el caso extremo, esto se lleva a la continua renovación de los

nutrientes. Se trata de un quimiostatO también conocido como cultivo continuo.

Está espacialmente estructurado y no estructurado temporalmente, en un estado

de equilibrio definido por la tasa de suministro de nutrientes y la reacción de las

bacterias. En comparación con el cultivo en lotes, las bacterias se mantienen en

fase de crecimiento exponencial y la tasa de crecimiento de la bacteria es

conocida. Los dispositivos de este tipo son por ejemplo los turbidoestatos y

auxoestatos.

El crecimiento bacteriano se puede suprimir con bacteriostáticos, sin necesidad de

matar las bacterias. En un sinecológico, una situación similar a la naturaleza,

cuando más de una especie bacteriana está presente, el crecimiento de los

microbios es más dinámico y continuo.

El líquido no es el único sistema de laboratorio para el crecimiento bacteriano. Otros

entornos espaciales estructurados como los biofilms o superficies de agar presentan

modelos de crecimiento adicionalmente complejos.

UNIDAD II

2.1 MICROSCOPÍA.

Microscopio, del griego: "mikro" = pequeño y "scopeõ" = mirar (para mirar cosas

pequeñas).

Un microscopio es un instrumento óptico compuesto de varias lentes que sirve

para observar objetos muy pequeños. En el microscopio electrónico, los rayos

luminosos del microscopio convencional son reemplazados por un haz de

electrones (el aumento puede alcanzar en este caso hasta 100 veces el del

microscopio convencional).

Aunque la existencia de criaturas demasiado pequeñas para ser vistas con el ojo

había sido sospechada desde tiempo atrás, su descubrimiento real está ligado a la

invención del microscopio.

La primera persona que vio los microorganismos con algún detalle fue el

constructor de microscopios aficionado Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723);

este holandés usó microscopios simples construidos por él mismo (se dedicaba a

pulir lentes para fabricar sus microscopios que, como mucho, alcanzarían unos

300 aumentos). En 1677 escribe una carta a la Philosophical Transactions of the

Royal Society of London en la que comunicaba sus recientes observaciones con

los microscopios de su fabricación.

Desde ese momento, el microscopio óptico se ha transformado en uno de los

medios más importantes para el diagnóstico de las infecciones. Aun hoy, a pesar

del énfasis en los métodos rápidos de diagnóstico, muchos de los cuales requieren

instrumentos complicados o reactivos inmunológicos, la simple observación visual

de la muestra clínica obtenida de un paciente es la forma más rápida y específica

de apoyar el diagnóstico clínico realizado por el médico.

Microscopio electrónico:

Para estudiar la estructura interna de los procariotas es esencial el uso del

microscopio electrónico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de

rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Cuando los electrones

pasan a través de la preparación algunos son difractados creando entonces una

imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La longitud

de onda de la radiación de los electrones es mucho más pequeña que la de la luz

visible y, como el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional

a la longitud de onda utilizada, la resolución obtenida con el microscopio

electrónico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio óptico.

Mientras que con el microscopio óptico ordinario o el de contraste de fases las

estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0,2 µm, con el

microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de 0,001 µm. Con el

microscopio electrónico es posible ver muchas sustancias incluso de tamaño

molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden

examinarse objetos muy delgados: si se está interesado en ver estructuras

internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada

directamente.

Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrónico se

necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las células

primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizándose habitualmente esto último

transfiriendo las células a un disolvente orgánico. Después de la deshidratación, la

muestra es incluida en plástico y en este plástico se cortan secciones finas

utilizando un ultramicrótomo, por lo general equipado con una cuchilla de

diamante. Una sola célula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis

secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con el

microscopio electrónico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se

tratan con colorantes especiales de la microscopia electrónica, tales como ácido

ósmico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales están

compuestos por átomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los

electrones. Las estructuras celulares teñidas con uno de esos materiales

presentan un contraste muy aumentado y; por tanto, se ven mejor.

Microscopio de contraste de fases:

Hace posible visualizar fácilmente pequeñas células incluso sin teñir. Las células

tienen un índice de refracción distinto del medio que las rodea, y esta diferencia

puede utilizarse para crear una imagen de mucho mayor contraste que el que

puede obtenerse con el microscopio óptico normal. La microscopia de contraste de

fases hace posible observar células en estado vivo más fácilmente, ayudándonos

así a evitar la creación de condiciones artificiales tales como las introducidas por la

tinción (aparición de artefactos que interfieren con la correcta visión y alteración de

las estructuras naturales de las célula). En muchos laboratorios de bacteriología,

el microscopio de contraste de fases ha reemplazado prácticamente el

microscopio óptico común como instrumento de investigación.

Esta técnica se basa en el hecho de que las diferentes estructuras celulares

introducen pequeñas variaciones de fase en las radiaciones, retrasándolas

ligeramente, siendo estos retrasos diferentes según el tipo de estructura. Con este

microscopio, el bajo contraste existente se refuerza por medio de un sistema

óptico especial, que transforma las diferencias de fase, que no son captadas por el

ojo humano, en diferencias de amplitud (intensidad luminosa), que sí son

detectables.

Microscopio de campo oscuro:

Se le llama también ultramicroscopio y es un microscopio óptico ordinario cuyo

sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparación desde

los lados, de tal modo que sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y

se hace visible. A causa de esta disposición, la muestra aparece iluminada sobre

un fondo oscuro.

La microscopía de campo oscuro hace posible la observación en estado vivo de

partículas y células que de otra manera estarían por debajo de los límites de

resolución del microscopio óptico, aunque resulten visibles pocos detalles

estructurales. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el

estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema pallidum, la

espiroqueta causante de la sífilis, que es invisible con la microscopía óptica

ordinaria.

 

El microscopio de fluorescencia:

Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser

excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta

(luz de longitud de onda corta). A medida que las moléculas excitadas regresan a

su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor

longitud de onda que la radiación excitante. Esta propiedad se denomina

fluorescencia. Se han desarrollado métodos microscópicos modernos que

aprovechan la mayor detección que posibilita este sistema.

Este tipo de microscopios lleva una fuente luminosa que emite radiaciones ultra-

violeta, en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la

preparación de de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común.

Las lentes suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.

A continuación del objetivo lleva unos filtros que retienen la radiación ultra-violeta,

que es peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible,

que no es peligrosa.

Hoy día se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es

emitida desde arriba del preparado (epifluorescencia). Un filtro deja pasar luz de la

longitud de onda deseada para excitar al fluorocromo y un filtro barrera en el

objetivo protege al ojo del observador de la radiación fluorescente. Los objetos

fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según

el color del colorante usad

Microscopio invertido:

En el laboratorio de virología se utiliza muchísimo el microscopio invertido que no

es más que una variante del microscopio convencional que, tal y como indica su

nombre, tiene invertida la posición normal de los objetivos, que están, en el

revólver, por debajo de la platina, mientras que la luz de la fuente de iluminación, a

través del condensador y del diafragma, llega desde encima de la platina, lo que

facilita cierto tipo de trabajos como el control del estado de las monocapas

celulares cuando se trabaja con botellas o tubos de cultivo.

2.2 MEDIOS DE CULTIVOS

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de

patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne

líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio

sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las

colonias microbianas. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a

utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri,

para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se

usaban hasta entonces. Actualmente se han preparado más de 10.000 medios de

cultivo diferentes. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales

preparadas en el laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de

Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las

bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una

serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de

oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio

de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y

debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de

muchos medios de cultivo es una infusión de estractos de carne y Peptona a la

que se añadirán otros ingredientes

Condiciones general:

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,

son ajenos por completo al propio medio.

Disponibilidad de nutrientes adecuados:

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,

como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos

casos serán necesarias Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas

para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas

que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en

forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin

embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de

cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Actualmente, la

forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona

que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya

que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las

proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros

compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias

tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios

sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser

necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,

manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,

generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de

cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades

metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de

ciertos microorganismos.

Consistencia del medio:

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en

estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran

inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente

a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros

tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso

universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de

medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

Esterilidad del medio:

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la

aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el

crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos

medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave

(que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

Clasificación de los medios de cultivo

Se pueden realizar distintas clasificaciones atendiendo a su estado físico,

composición, el uso al que se destinan:

Por su estado físico se dividen:

Sólidos, presentan en su composición una agente solidificante (AGAR) en

proporción de 12 a 15 gramos por litro.

Semisólidos, presentan AGAR en su composición, pero a una concentración

mucho menor, entre 2,5 a 4 gramos del agente solidificante.

Líquidos, no presenta ningún agente solidificante.

Por su composición:

Se dividen en empíricos, sintéticos y semisintéticos;

Empíricos, en su composición aparecen sustancias orgánicas sintéticas, en su

composición aparecen sustancias químicas definidas semisintéticos, en su

composición aparecen moléculas de naturales hidrolizadas.

Según al uso que se destinen:

Se dividen en: enriquecidos, diferenciales o aislamiento, selectivos e inhibidores,

transporte y mantenimiento, uso general, para filtros de membrana.

Enriquecidos, suelen ser medios con un nutriente simple que presentan

enriquecedores, tales como sangre de caballo, etc.

Diferenciales o de aislamiento, contienen colorantes, azucares e indicadores

para provocar la respuesta bioquímica conocida selectiva e inhibidora, además de

los componentes de los medios diferenciales, contienen en su composición una

serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a

estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca.

Transporte y mantenimiento, se utilizan en la recogida, transporte y

conservación de muestras biológicas. son medios muy reductores que inhiben las

reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células evitando los efectos

destructivos de la oxidación.

Uso general, son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de

microorganismos fastidiosos.

Filtros de membrana, son medios que permiten el examen de grandes

volúmenes con un baja concentración de microorganismos, la separación de los

microorganismos del medio de cultivo e incluso su cambio de un medio de cultivo

a otro, permite el crecimiento sin interrupción del microorganismo.

Composición del medio

Los constituyentes más utilizados en la composición de los medios de cultivo son:

agar, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, sangre, plasma, suero,

bilis, sales biliares, gelatina, carbohidratos, indicadores, Agar, comercialmente se

presenta en gránulos y polvos, la concentración en la que se encuentra en los

medios de cultivo, dependerá del uso que quiera darse al medio.

Peptona, es un producto de composición variable, obtenido generalmente de la

hidrólisis ácida o enzimática de las proteínas vegetales o animales.

Extracto de carne, contiene bases orgánicas solubles, productos de degradación

de las proteínas, vitaminas y minerales.

Extracto de levadura, se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es

una fuente de aminoácidos y vitaminas del complejo B.

Sangre, las más utilizada es la de sangre o carnero, tiene que estar libre de

agentes antimicrobianos para evitar la inhibición el crecimiento de los

microorganismos. Se debe de comprobar siempre la esterilidad, así como la

ausencia de citratos ya que inhiben el crecimiento de estafilococos.

Plasma, se utiliza para emplear la actividad coagulasa de las bacterias, se emplea

plasma humano o de conejo.

Suero, se prepara a partir de sangre recolectada sin adición de anticoagulante,

eliminando el líquido que se separa cuando se contrae el coágulo.

Bilis, contiene varios ácidos biliares, como compuestos conjugados con

aminoácidos, bilirrubina y biliverdina.

Sales biliares, inhiben el crecimiento de bacterias grampositivas y bacilos en forma

de esporas, sin afectar el desarrollo de los bacilos entéricos gramnegativos.

Gelatina, proteína obtenida mediante extracción de material colágeno a partir de

tejidos animales... Es un agente solidificante pero se emplea poco ya que

bastantes bacterias provocan su licuación.

2.3 ESTERILIZACIÓN

La esterilización es un proceso a través del que se logra la destrucción total de los

microorganismos viables presentes en un determinado material.

Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo farmacéutico, ya que

existen muchos procesos que requieren la utilización de materiales estériles. Entre

éstos podemos destacar:

• La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico

con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes.

• El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas,

etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiología.

• La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes

propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o

personal, análisis microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos,

etc.)

• La descontaminación de material utilizado.

Clasificación de los métodos de esterilización:

Existen diversos métodos de esterilización. La selección del método a aplicar en

cada caso está determinada por el tipo de producto a esterilizar.

.

Agentes físicos

El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor

húmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización de las

proteínas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidación de sus

componentes celulares.

El calor es considerado como el método de esterilización por excelencia siempre y

cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningún tipo de

daño. La radiación, o emisión y propagación de la energía a través de un medio,

puede ser utilizada como agente para la eliminación de microorganismos. Así

tenemos que las radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilización de

materiales termolábiles, como por ejemplo materiales plásticos, y las radiaciones

no ionizantes, como la luz ultravioleta, puede ser empleada en el control de áreas

cerradas.

Agentes mecánicos

La filtración permite la remoción de todos los microorganismos presentes en un

líquido o un gas reteniéndolos sobre la superficie de un material.

Agentes químicos

Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes

porque tienen la capacidad de promover una o más reacciones químicas capaces

de dañar los componentes celulares de los microorganismos (proteínas,

membranas, etc.)

Existen diversas marcas comerciales de medios de cultivo que se utilizan en el

laboratorio de microbiología para diferentes fines.

3.4 TECNICAS DE SIEMBRA EN MICROBIOLOGIA

En Microbiología, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo

que se impida cualquier tipo de contaminación en el área de trabajo.

Se aconseja que la siembra de todas las muestras a los medios de cultivos se

realice bajo una cabina de flujo de aire laminar o en un gabinete de seguridad

biológica, con los protectores de plástico o vidrio para el cuello y la cara, las

muestras procesadas se las debe considerar como potencialmente infecciosas y

manipularlos adecuadamente.

También se deben utilizar guantes de goma o latex biológicos

La mesada de trabajo debe estar equipada con todos los materiales necesarios

para efectuar las siembras, también se debe contar con todos los medios de

cultivos necesarios para realizar las siembras.

Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el

material de vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de

microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor.

Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar en todo su perímetro las

bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez

destapadas, antes y después de la inoculación.

Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetándolos por la

parte que no entra en contacto con tubos y matraces.

Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada hacia el frente para

que el riesgo de contaminación sea mínimo.

Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo

boca arriba trabajando con bacterias.

Los pasos de un proceso de aislamiento de una especie microbiana se

pueden resumir en los siguientes:

Siembra en placa de la muestra de partida.

Tomar una colonia de la placa una vez incubada y sembrar una segunda placa, en

la que todas las colonias que crezcan deben ser idénticas.

A partir de la segunda placa se puede resuspender una de las colonias en medio

líquido, consiguiéndose ya un cultivo puro.

Para la conservación de los cultivos puros de un microorganismo existen diversos

métodos, el más simple es la resiembra en tubos inclinados que se mantienen,

normalmente refrigerados, durante 3-6 meses.

El equipo necesario para la inoculación es muy simple. Consta de un alambre, con

una punta en ojal, recta o en gancho, y el otro extremo insertado en un mango

cilíndrico (el conjunto es llamado asa u ansa).

La inoculación primaria puede hacerse con un asa, hisopo u otro material sobre la

superficie del medio agarizado en la placa de petri o sobre caldos de cultivos.

SIEMBRA

Objetivos

- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de

aislamiento en placa de Petri.

- Obtener colonias separadas, utilizando uno o más métodos.

- Estudiar la morfología de cada colonia.

Material

Asa de siembra, Tubo con cultivo, placas de Petri con medio de cultivo sólido y

cultivo de microorganismo.

Toma de muestras:

Técnica de siembra para aislamiento:

Estría múltiple:

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo

de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la

placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión

para no dañar el agar.

Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente,

se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este

proceso se repite sucesivamente, flameando

y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la

placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida.

Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que

contenga un elevado número de gérmenes.

Ejemplo de resultado con estría múltiple

Siembra por superficie

Se realiza una descarga y se realiza estría por toda la placa.

Siembra por vaciado

Técnica de Barry

En una placa de Petri vacía se deposita

un pequeño volumen conocido de

muestra y a continuación se añade el

medio de cultivo (agar nutritivo) fundido

y atemperado aproximadamente a 45ºC.

Se mezclan ambos por rotación suave

de la placa. De esta forma los

microorganismos se distribuirán de

forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias

separadas por todo el agar.

Inoculo a dilución conocida y con asa de Dygraski (Barry modificada):

Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una

determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del

cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté completamente

seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 ó 72

horas) según el tipo de microorganismo. La posición invertida evitará que el agua de

condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de

colonias aisladas.

Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el

recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente la

dilución.

Lectura de placas:

UNIDAD IV

1.1 BACTERIOLOGÍA

En las últimas décadas se han hecho importantes avances en el estudio de la

ultraestructura bacteriana, lográndose una identificación bioquímica de muchas

fracciones subcelulares; estos avances han permitido ubicar a las bacterias en el

reino Procaryotae.

El conocimiento de las diferentes estructuras y composición ha permitido

comprender como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea como

integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismo.

El conocimiento de la composición bioquímica de las diferentes estructuras

bacterianas, junto al conocimiento del metabolismo bacteriano, permite hoy la

comprensión del mecanismo de acción de los diferentes antibióticos.

Recientemente, los avances de la genética bacteriana hicieron posible el

desarrollo de técnicas de biología molecular con aplicaciones a nivel de la

investigación científica y el diagnóstico.

La observación al microscopio óptico con distintas coloraciones y de los cultivos

bacterianos, tienen un rol importante en la identificación de las bacterias y su

ubicación taxonómica.

Célula procariota

Son células sin núcleo, la zona de la célula, donde está el ADN y ARN no está

limitado por membrana. Ej. Bacteria.

Actualmente están divididas en dos grupos:

• Eubacterias, que poseen paredes celulares formadas por peptidoglicano o por

mureína. Incluye a la mayoría de las bacterias y también a las cianobacterias.

• Arqueobacterias, que utilizan otras sustancias para constituir sus paredes

celulares. Son todas aquellas características que habitan en condiciones extremas

como manantiales sulfurosos calientes o aguas de salinidad muy elevada.

Célula procariota

Procariota (Pros = Antes, Karion = Núcleo) es una célula sin núcleo celular

diferenciado, es decir, su ADN no está confinado en el interior de un núcleo, sino

libremente en el citoplasma. Las células con núcleo diferenciado se llaman

eucariotas. Procarionte es un organismo formado por células procariotas.

La celula procariota, también procarionte, organismo vivo cuyo núcleo celular no

está envuelto por una membrana, en contraposición con los organismos

eucariotas, que presentan un núcleo verdadero o rodeado de membrana nuclear.

Además, el término procariota hace referencia a los organismos conocidos como

móneras que se incluyen en el reino Móneras o Procariotas.

Están metidos en los dominios Bacteria y Archaea.

Entre las características de las células procariotas que las diferencian de las

eucariotas, podemos señalar: ADN desnudo y circular; división celular por fisión

binaria; carencia de mitocondrias (la membrana citoplasmática ejerce la función

que desempeñarían éstas), nucleolos y retículo endoplasmático.

Poseen pared celular, agregados moleculares como el metano, azufre, carbono y

sal. Pueden estar sometidas a temperatura y ambiente extremos (salinidad,

acidificación o alcalinidad, frío, calor). Miden entre 1/10 Mm, posee ADN y ARN,

no tienen orgánulos definidos.

Evolución

Está aceptado que las células procariotas del dominio Archaea fueron las primeras

células vivas, y se conocen fósiles de hace 3.500 millones de años. Después de

su aparición, han sufrido una gran diversificación durante las épocas. Su

metabolismo es lo que más diverge, y causa que algunas procariotas sean muy

diferentes a otras.

Algunos científicos, que encuentran que los parecidos entre todos los seres vivos

son muy grandes, creen que todos los organismos que existen actualmente

derivan de esta primitiva célula. A los largo de un lento proceso evolutivo, hace

unos 1500 millones de años, las procariotas derivaron en células más complejas,

las eucariotas.

Las procarióticas, que comprenden bacterias y cianobacterias (antes llamadas

algas verdeazuladas), son células pequeñas, entre 1 y 5 µm de diámetro, y de

estructura sencilla; el material genético (ADN) está concentrado en una región,

pero no hay ninguna membrana que separe esta región del resto de la célula.

Componentes estructurales de los procariontes:

Cápsula o Vaina: es laxa y mulacilaginosa compuesto por polisacárido o

polipéctidos. No siempre está presente. Es común en bacterias patógenas

(esporas).

Pared celular: en todos los procariotas, estructura de sostén mecánico, presenta

poros. Ver más adelante información detallada.

Flagelo: No siempre presente. Su constitución es de naturaleza proteica. Su

función para el desplazamiento de algunos de estos organismos en medios

húmedos o acuosos.

Membrana Plamática: Semipermeable y selectiva, compuesta por una capa

bilipidica y proteínas. Nunca se presenta el colesterol.

Citoplasma: Se trata de un gel, que deja que las estructuras inmersas en él

se muevan fácilmente. Su constitución es de agua , proteínas, iones, lípidos e

hidratos de carbono.

Mesosoma: Prolongaciones de la membrana plasmática hacia el interior del

citoplasma en forma de rulo (abierto: no forma compartimentos) y donde se

acumula gran cantidad de corpúsculos respiratorios adheridos a ella. Su función

es muy parecida a lo que se realiza en la mitocondria de los eucariotas: zona

relacionada con la respiración.

Laminillas o lamelas: Se trata de pliegues membranosos que se extienden

desde la membrana plástica hacia el interior (abiertos: no forma compartimentos).

Su función puede ser muy diversa dependiendo del organismo que se trate, como

por ejemplo: presentar pigmentos relacionados con la fotosíntesis

(bacteriorodopsina o bacterioclorofíla) o partículas captadores de nitrógeno

molecular, etc.).

Ribosomas y Poliribosomas: Los ribosomas en los procariontes son de 70 S

(Cada ribosoma está constituido por dos subunidades, llamadas mayor y menor.

El tamaño de las subunidades suele indicarse en función de la velocidad con lo

cual sedimenta en un campo centrífugo. La unidad que expresa dicha velocidad se

denomina Svedberg (S), y depende no sólo del tamaño de la partícula, sino

también de su forma y densidad. Los poliribosomas son un conjunto de ribosomas

unidos por una hebra de ARN mensajero. La función es de intervenir en la síntesis

de proteínas.

Plásmidos: Son moléculas de ADN en la que la doble hélice se encuentra

formando un círculo cerrado. Es más pequeño que el ADN comosómico

bacteriano, y el hecho de su presencia le transmite a ese individuo caracteres que

no se presentan en aquello que no lo portan.

ADN: También conocido como ADN cormosómico, es circular, cerrado,

desnudo (no presenta histonas) y presenta toda la información génica del

individuo. Siempre hay una sola hebra o a lo sumo dos (cuando se duplica). Por lo

general el ADN se ubica en un sector del citoplasma que se le llama "zona

nuclear". Esta zona es muy cercano a los mesosomas, pues se trata de un lugar

donde se desprende mucha energía.

Las diferentes estructuras bacterianas que observamos las podemos dividir,

según sean constantes en las células o no, en estructuras permanentes o

variables. Dentro de las primeras se destaca: la pared celular, la membrana

celular, los ribosomas y el material genético.

Las estructuras variables son: los flagelos, las fimbrias o pilis, la cápsula y los

esporos.

Estructuras variables, son aquellos que existen en algunas bacterias pero no en

todas; un mismo grupo bacteriano o una misma cepa bacteriana las puede

presentar o no, dependiendo de las condiciones en donde se desarrolle. Las

estructuras variables no resultan esenciales para la vida de la bacteria.

Pared celular

Ubicada por fuera de la membrana plasmática, es una estructura vital para las

bacterias que la poseen. Los fármacos que bloquean su formación producen la

lisis y muerte de las bacterias susceptibles. Excepto los mycoplasmas todas las

bacterias tienen una pared celular que les da forma y las protege de la lisis

osmótica. La pared celular de muchos microorganismos patógenos tiene

componentes que contribuyen a su patogenicidad. La pared puede proteger a la

célula de las sustancias tóxicas y es el sitio de acción de algunos antibióticos.

Estructura de la pared celular de las bacterias grampositivas

La gruesa pared celular de las bacterias grampositivas está constituida

principalmente por peptidoglicano. Se cree que ésta gruesa capa de

peptidoglicano es la determinante de que estas bacterias retengan el cristal violeta

de la coloración de Gram.

Sin embargo, estas células contienen también una gran cantidad de ácido teicoico:

polisacáridos que se unen al ácido N-acetilmurámico o a los lípidos de la

membrana plasmática.

En este último caso se denomina ácido lipoteicoico. Tanto los ácidos teicoicos

como los

lipoteicoicos, tienen la función de estabilizar la pared celular. Además los ácidos

teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos microorganismos, porque actúan

como antígenos de superficie que se unen a receptores específicos en las células

del huésped.

La superficie externa del peptidoglicano de las bacterias grampositivas está

generalmente cubierta de proteínas. Los diferentes grupos de bacterias

grampositivas y las diferentes especies difieren en la composición de sus

proteínas y de ácidos teicoicos; ésto es útil para la clasificación serológica y la

identificación bacteriana.

Estructura de la pared celular de las bacterias gramnegativas

Si observamos la pared de las bacterias gramnegativas al microscopio electrónico

podemos observar tres zonas: la membrana plasmática, el espacio periplásmico

que incluye una fina capa de peptigolicano y la membrana externa. Esta última,

exclusiva de las bacterias gramnegativas, es una bicapa lipídica que difiere de

otras membranas por su capa externa, que está constituida por una molécula

anfipática: el lipopolisacárido o endotoxina. Además de la membrana externa

contiene fosfolípidos y proteínas que la unen al peptidoglicano.

Fundamento de la coloración de Gram

Es probable que la diferencia entre las bacterias grampositivas y gramnegativas se

deba a la naturaleza física de sus paredes celulares. El peptidoglicano no se tiñe

por sí mismo, más bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar

la pérdida de cristal violeta. Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen

primero con cristal violeta y luego se tratan con yoduro para favorecer la retención

del colorante. En la decoloración con etanol, se cree que el alcohol contrae los

poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el complejo colorante

yoduro; así las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la capa de

peptidoglicano de las bacterias gramnegativas es muy fina, con menos enlaces y

con poros de mayor tamaño. Además, es posible que le tratamiento con alcohol

extraiga suficientes lípidos de la membrana externa como para aumentar su

porosidad. Por estos motivos el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal

violeta yoduro en las bacterias gramnegativas.

Funciones de la pared celular

Otorga rigidez y da forma a las bacterias y las protege de la lisis osmótica. Su

importancia clínica deriva de su susceptibilidad a la acción de los antibióticos,

dado que éstos actúan sobre un blanco que no es propio del hombre y que es vital

para la vida bacteriana (poseen toxicidad selectiva). También actúa como filtro,

impidiendo el ingreso de algunas moléculas y permitiendo la entrada de

metabolitos imprescindibles y agua

Morfología de las bacterias

La microscopía óptica permite reconocer bacterias de distintas formas.

 Las bacterias esféricas o ligeramente ovoides se denominan cocos.

Las bacterias con forma de bastón se denominan bacilos.

Los bacilos de corto tamaño que pueden confundirse con un coco se denominan

cocobacilos. Algunos bacilos tienen extremos afinados y reciben el nombre de

bacilos fusiformes, mientras que otros poseen forma de clava o garrote.

Los bacilos cortos curvos, con forma de coma reciben el nombre de vibrios.

Las bacterias espiraladas se llaman comúnmente espirilos cuando son rígidas y

espiroquetas si son más flexibles y ondulantes.

Agrupación bacteriana

Algunos géneros bacterianos se agrupan de una manera característica. Esta

agrupación se debe a la tendencia de las células hijas a permanecer parcialmente

adheridas después de la división celular.

Los cocos pueden disponerse:

- de a pares y se los llama diplococos

- si se disponen en cadena se llaman estreptococos

- cuatro células esféricas conforman una tétrada

- en forma de racimo o irrregular se llaman estafilococos

- en paquetes cúbicos se denominan sarcinas

UNIDAD V

5.1 MICOLOGIA

Introducción

La contaminación fúngica de un alimento tiene mucha importancia, no tan sólo por

su acción deteriorante, que pudre y malogra materias primas y productos

manufacturados, sino también por la capacidad de algunos hongos para sintetizar

gran variedad de micotoxinas, para provocar infecciones y, incluso, para provocar

reacciones alérgicas en personas hipersensibles a los antígenos fúngicos. Por

estos motivos, para conocer la calidad microbiológica de un producto, es

pertinente realizar un recuento de hongos y levaduras.

En general, los hongos son microorganismos eucariotas pluricelulares

filamentosos, no presentan pigmentos fotosintéticos y son quimioheterótrofos

aerobios estrictos. A diferencia de las plantas, presentan un bajo grado de

diferenciación en los tejidos.

Poseen pared celular contiene quitina un polisacárido que le da rigidez y es

responsable de su morfología y en ocasiones celulosa. Algunos hongos presentan

cápsula, formada por polisacáridos, con propiedades inmunógenas y

antifagocitarias.

La estructura o cuerpo vegetativo de un hongo se denomina talo. El talo está

formado por filamentos, o hifas, de unas 5 m de diámetro, que generalmente

están ramificadas.

Las hifas son tubos largos que están formadas por la pared celular de quitina

(componentemayoritario) y el citoplasma con sus inclusiones y núcleos con la

información genética. En el citoplasma se realiza la actividad bioquímica del

hongo.

Las hifas pueden estar separadas en células por paredes transversales (septos)

en los hongos superiores (Eumicetos), o carecer de paredes en los hongos

inferiores (Ficomicetos).

El conjunto de hifas se llama micelio. En el micelio se distinguen dos partes: una

que penetra en el medio de cultivo y se extiende por su superficie (micelio

vegetativo), y otra que se proyecta y contiene las esporas (micelio reproductor

o aéreo). Los hongos crecen por el extremo de las hifas (crecimiento apical). Una

pequeña cantidad de micelio es suficiente para la formación de un nuevo talo.

Absorción de nutrientes: Debido a que su pared celular es rígida no pueden

englobar los alimentos (pinocitosis, fagocitosis). Los extremos en crecimiento de

las hifas expulsan enzimas sobre la materia orgánica en que crecen. Las cadenas

de carbohidratos se rompen en compuestos más sencillos como glucosa o

aminoácidos, lo suficientemente pequeños como para absorberlos por las paredes

de las hifas, hasta el citoplasma del hongo.

Según el tipo de sustrato nutritivo que empleen se clasifican en:

1. Hongos saprófitos (utilizan materia orgánica muerta)

2. Hongos parásitos (organismos vivos, plantas o animales)

TIPOS DE REPRODUCCIÓN.

Las formas y mecanismos de reproducción sexual y asexual son muy variados y

constituyen la base de la clasificación de los hongos.

1. Reproducción sexual: (Hongos perfectos) Por unión de gametos estado

teleomorfo. Zigósporas, Ascósporas, Basidiósporas.

Zigomicetos. Hongos que se reproducen sexualmente por zigosporas.

Constituyen el grupo de Ficomicetos más evolucionado y mejor adaptado a la

vida terrestre.

Eumicetos (hongos superiores) abarcan a los ascomicetos y a los

basidiomicetos. Es característico de los mismos la posesión de un micelio

septado y la formación de conidiosporas. No presentan células flageladas.

Setas (hongos erectos): En el momento propicio, y en lugares cercanos a la

superficie, las hifas del micelio vegetativo de un hongo basidiomiceto, forman

una masa de crecimiento (cuerpo fructifero) de aspecto tisular denominado

plecténquimas (setas). Es la parte reproductiva de un conjunto más amplio. Una

vez desarrollado emite esporas de forma variable según las especies (p.ej.

100.000 esporas/h durante 4-5 días).

2. Reproducción asexual (hongos imperfectos) Los hongos que tienen

reproducción asexual o desconocida (estado anamorfo) se denominan

Deuteromycetos.

a. Gemación en levaduras (unicelulares).

b. Fragmentación de las hifas (utilizado para resiembras en laboratorio).

c. Esporulación por germinación de esporas.

UNIDAD V

5.1 VIROLOGÍA

Están entre los organismos replicativos más pequeños. Son “agentes filtrables”:

atraviesan filtros. No se ven a microscopía óptica. Tamaño: 20 a 300 nm de

diámetro (tienden a la forma esférica): < 25 nm (S), 180-200 nm (M), > 250 nm (L).

Su genoma está constituido por un solo tipo de ácido nucleico (independiente de que puedan sintetizar ARN o ADN). Tiene un obligado requerimiento de crecimiento intracelular y dependencia estructural de la célula hospedadora. Son parásitos estrictos (no se replican si no es en la célula hospedadora).

En su estructura encontramos de adentro afuera:

Núcleo de ARN o ADN. En algunos casos este material genético está asociado a proteínas, como en los retrovirus (transcriptasa reversa).

Cápside: rodeando al núcleo, estructura generalmente proteica. Son unidades repetitivas de proteínas llamadas capsómeros. Cada capsómero es igual a otro. Esta es la estructura básica.

En algunos casos hay una envoltura lipídica o de hidratos de carbono que rodea a la cápside. La zona entre la cápside y la envoltura lipídica se denomina tegumento y normalmente está ocupada por hidratos de carbono.

En algunos virus se proyectan al exterior unas estructuras llamadas espículas, importantes en la replicación. También se les denomina peplómeros.

Clasificación de los virus Lugar donde producen la enfermedad:

Neurotrópicos: se multiplican en el sistema nervioso. Enterotrópicos: se multiplican en el sistema digestivo.

Tipo de hospedador: animales, vegetales, humanos, bacteriófagos. Características estructurales o de replicación: tamaño, forma, con o sin

envoltura y peplómeros, sitio de replicación (citoplasma o núcleo), tipo de ácido nucleico, efecto citopático que produce.

Clasificación taxonómica: Familia sufijo viridae Ej: herpes viridae. Subfamilia virinae Ej: herpes virinae. Género virus Ej: simplex virus. Subgénero algunas familias Especie no formalmente definidas Ej: virus herpes simple tipo 2.

Hoy en día se clasifican de acuerdo a la secuencia de su material genético.

Criterios epidemiológicos

Entéricos: se replican en tracto intestinal (transmisión fecal – oral). Como el de la polio, que además, después pasa a la sangre.

Respiratorios: se adquieren por inhalación. Se replican en el tracto respiratorio. Algunos pasan a la sangre, como el sarampión, también se transmiten por mano, nariz, boca y ojos.

Arbovirus: transportados por artrópodos; se replican en los artrópodos hematófagos y son transmitidos por mordeduras a los hospedadores vertebrados. Producen viremia.

Oncogénicos: gatillan la transformación celular, pudiendo producir cáncer. Adquiridos por contacto directo (incluye contacto sexual). Usualmente infectan tejidos blancos específicos. Ej: papiloma.

Efectos citopáticos

Alteración o daño que produce el virus en la célula hospedadora (blanco), el daño depende del tipo de virus, lugar de multiplicación, carga infectante (número de virus que infectan una célula), Nº de células infectadas.

Ej: Virus polio – intestino – diarrea o fiebre

sistema nervioso central – daño neuronal – parálisis

Efectos:

Lítico: el virus rompe la célula por la gran masa de virus que se produce. Ejemplo: polio, herpes.

Hiperplasia: la célula se transforma y multiplica aceleradamente. Ej: verruga.

Mixto (lítico e hiperplasia): Ej: viruela. Induce una transformación y luego se rompe.

Formación de sincicios (herpes): son células multinucleadas porque las membranas celulares se funden.

Oncogénicos: transformación en células malignas. Formación de cuerpos de inclusión: acumulación de restos de material

sobrante, es intranuclear o intracitoplasmático (dependiendo de donde se multiplique).

Infección y replicación

Adherencia del virus: los virus reconocen receptores celulares, lo que no significa que las células tengan receptores para virus. Esta etapa es reversible.

Ej: rabia: acetilcolina; Epstein Barr virus: receptor C3D en celulas B; VIH: molécula CD4 en células T.

Ingreso a la célula: comienza una etapa irreversible con algunos medicamentos. Existen diferentes formas de entrar a la célula: Translocación directa a través de la membrana celular; pasan virus que no

tiene envoltura. Los con envoltura lipídica se fusionan con los lípidos de la membrana

celular, liberándose la partícula viral al citoplasma. Esto se conoce como viropexia.

Captación de fagosomas: como el virus tiene envoltura, esta se fusiona con la membrana del fagosoma y se libera el virus.

Pérdida de la cubierta o denudación o decapsidación: se libera el ácido nucleico. Dependiendo del tipo de ácido nucleico hay distintas etapas: ADN: se transcribe a ARN mensajero y se produce síntesis proteica, o

puede quedar en el núcleo en estado latente. ARN: depende si es de 1 o 2 hebras y si es de sentido positivo o negativo.

Si es de sentido positivo, pasa directamente a ribosomas. Los retroviros en el citoplasma se transforman en ADN, el que va al núcleo.

Replicación: síntesis de ARN mensajero viral, síntesis de proteínas, cápsides, ácidos nucleico viral.

Ensamblaje: las cápsides se forman alrededor del ácido nucleico. Liberación: por yemación en los virus con envoltura lipídica. Esto hace que el

efecto citopático sea más leve, aunque la célula finalmente muere.

Cuando ingresa ADN de virus bacteriófago tiene 2 vías

Vía lítica: el ADN ingresa, se apodera de la maquinaria enzimática, luego viene el ensamblaje, empaquetamiento y lisis.

Vía latente: el virus queda a estado de profago; la bacteria reconoce el ADN viral como propio. También se conoce como fase lisogénica. Hay varias patologías que se dan solo en el estado lisogénico.

Patogénesis viral

Infección aguda: en el inicio aparecen los sintomas, los que luego desaparecen junto con los virus. Si hay inmunidad permanente, no habrá nueva infección, si no deja inmunidad, puede haber reinfección con virus exógeno. No quedan individuos portadores ej. V.polio V. Influenza V. Rinovirus.

Infección persistente: en el inicio aparecen los síntomas los que decaen, y pueden haber reapariciónes periódicas. El virus queda en estado de latencia y puede sufrir reactivaciónes, una o varias ej. V. Herpes.

Infección persistente crónica o latente: Parecida a la anterior, pero el daño final que se produce, aunque sea lento, será la muerte. No hay sintomatologías por largo tiempo ej. V. Sida, otros virus presentan sintomatología, la que disminuye pero se mantiene, hasta causar la muerte, ej. V.hepatitis B, donde los hapatocitos siempre se están multiplicando y ,por tanto, hay muerte celular. En otros casos de IPC hay aparición y desaparición de sintomatología (repetidas veces) hasta que reaparecen y causan la muerte.

El desarrollo o no de inmunidad depende (siempre hay respuesta inmune) que haya un serotipo; que el virus tenga mutabilidad, de esto depende que hayan o no vacunas.

Formas de diseminación

Local: ocurre cuando el virus ingresa y se multiplican solo en el sitio donde ingresó. Ej: infecciones respiratorias, infecciones digestivas (rotavirus). No se diseminan a todo el organismo.

Sistémico: virus ingresan, se multiplican en ese sitio y hacen viremia, distribuyéndose a todo el organismo. Ej. paperas.

Nueral: tiene parte de sistémica, ingresa, hace fase virémica, pero su tropismo lo lleva al cerebro. Ej. polio: se multiplica en el sistema digestivo y viaja al sistema nervioso central.

Vertical: infección de madre a hijo por la placenta en el embarazo.