gtc84 validación de análisis microbiológicos

GUÍA TÉCNICA GTC COLOMBIANA 84

2003-02-26

CALIDAD DEL AGUA. GUÍA PARA LA ORIENTACIÓN ACERCA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS E: WATER QUALITY. GUIDANCE ON VALIDATION OF

MICROBIOLOGICAL METHODS

CORRESPONDENCIA: esta guía es una adopción idéntica

(IDT) por traducción de la ISO/TR 13843:2000 Water Quality. Guidance on Validation of Microbiological Methods.

DESCRIPTORES: microbiología de agua; análisis

microbiológico; calidad del agua. I.C.S.: 07.100.20 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproducción Editada 2003-03-17

PRÓLOGO El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La GTC 84 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2003-02-26. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología. ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. ALPINA S.A. AQUALAB ASINAL LTDA ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA AVESCO BAVARIA S.A. BIOCONTROL BIOMERIUX BIOQUILAB LTDA BIOTRENDS CARULLA VIVERO S.A. CENICAÑA COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CONGELAGRO CONSULTOR BLANCA USECHE COOPERATIVA DE GANADEROS DE CARTAGENA LTDA. CREPES & WAFLES EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTA E.S.P. ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA

FÁBRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY FRIGORÍFICO GUADALUPE. FRIGORÍFICO SUIZO S.A. FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. COLFRIGOS S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A. INGENIO PICHICHI S.A. INGENIO PROVIDENCIA S. A. INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO - ICA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. LABORATORIO BIOCONTROL LABORATORIO DE SALUD PUBLICA BOGOTA LESNIAK E.U LEVAPAN S.A. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. NULAB LTDA. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS LTDA.

QUALA S.A. QUIOS LTDA. REPRESENTACIONES BIOTECNOLÓGICAS TRES M. COLOMBIA S.A.

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE MANIZALES INGECAL UNIVERSIDAD DE LOS ANDES LEMA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ALGARRA S.A. ASESORIAS MICROBIOLÓGICAS AVESCO CONSULTORA BEATRIZ DEL PILAR MACÍAS CASA LUKER S.A. CERVECERÍA LEONA COLOMBINA S.A. CONSULTORÍAS MICROBIOLÓGICAS DISA S.A. FRESENIUS MEDICAL CARE CONSULTOR NARDA PABÓN CONSULTOR MARIA CLEMENCIA MORA CONSULTOR ANA MARÍA MORALES INGENIO PROVIDENCIA

LABORATORIO PROCALIDAD LABORATORIOS GRAM LLOREDA GRASAS S.A. MINISTERIO DE SALUD NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL PASSIFLORA COLOMBIANA S.A. PRODUCTORA DE JUGOS S.A. RICA RONDO TECNIMICRO LABORATORIO DE ANÁLISIS UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD PÚBLICA UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO VIKINGOS S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN

GUÍA TÉCNICA COLOMBIANA GTC 84

ÍNDICE Página 1. OBJETO 1 2. TÉRMINOS Y DEFINICIONES 1 3. ORGANIZACIÓN DEL DOCUMENTO 9 4. CONCEPTOS BÁSICOS 10 5. LIMITACIONES Y CARACTERÍSTICAS PROPIAS DE LOS MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS 14 6. MODELOS MATEMÁTICOS DE VARIACIÓN 17 7. ESPECIFICACIONES - PRÁCTICA ACTUAL 25 8. ESPECIFICACIONES - ENFOQUE RECOMENDADO 26 9. DETERMINACIÓN Y EXPRESIÓN DE CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO 28 10. PROCEDIMIENTOS Y PASOS DE VALIDACIÓN 32 11. DISEÑOS PARA DETERMINAR LAS ESPECIFICACIONES 34 ANEXOS ANEXO A PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS Y PROGRAMAS DE COMPUTADOR 36 ANEXO B EJEMPLOS NUMÉRICOS 40 ANEXO C EJEMPLO DE EXPERIMENTO DE VALIDACIÓN 50 BIBLIOGRAFÍA 51


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CALIDAD DEL AGUA. GUÍA PARA LA ORIENTACIÓN ACERCA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS 1. OBJETO Esta guía trata acerca de la validación de métodos microbiológicos, con especial énfasis en métodos cuantitativos selectivos en los cuales el cálculo cuantitativo se basa en el recuento de partículas, ya sea directamente, con la ayuda de un microscopio, o indirectamente, sobre la base del crecimiento (multiplicación) en colonias o turbidez. Los principios y procedimientos dentro de este objeto se conocen comúnmente como el recuento de presencia/ausencia (P/A), el número más probable (NMP), recuento de colonias y recuento directo (microscópico). Esta guía no aplica a la validación de los así llamados rápidos y modernos métodos que dependen en su mayor parte de la medición de productos o cambios debidos a la actividad microbiana pero no tratan la detección de partículas individuales. 2. TÉRMINOS Y DEFINICIONES Para los propósitos de esta guía se aplican los siguientes términos y definiciones: 2.1 exactitud de la medición grado de correspondencia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado NOTA El término "exactitud", cuando se aplica a un conjunto de resultados de ensayo, involucra una combinación de componentes aleatorios y un error sistemático o componente de desviación común . [ISO 3534-1:1993, 3.11] 2.2 elemento mensurado analito cantidad particular sometida a medición NOTA 1 Véase la referencia [5]


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NOTA 2 En microbiología, el analito se define idealmente como una lista de especies definidas taxonómicamente. En muchos casos, en la práctica el analito solo puede definirse por designaciones de grupo menos exactas que las definiciones taxonómicas. 2.3 porción de ensayo porción analítica volumen de suspensión de partículas inoculado en una unidad detectora NOTA Son ejemplos de una unidad detectora: la placa de agar, el filtro de membrana, el tubo de ensayo, la cuadrícula microscópica. 2.4 intervalo de aplicación intervalo de concentraciones de partícula que rutinariamente se someten a medición mediante un método. 2.5 característica categórica característica de desempeño de un método expresada numéricamente como una frecuencia relativa con base en la clasificación P/A (presencia /ausencia) ó +/- (positivo/negativo). 2.6 UFC, depreciada unidad formadora de colonia, depreciada CFP, depreciado partícula formante de colonia, depreciada NOTA El término se introdujo originalmente para transmitir la idea de que una colonia puede originarse no sólo a partir de una célula única, sino de una cadena sólida o agregado de células, un grupo de esporas, un segmento de micelio, etc. Equivocadamente se iguala el número de colonias observadas con el número de entidades vivas sembradas en el medio. Unidad de crecimiento, partícula viable, propágula (véase el numeral 2.27) y germen (véase el numeral 2.13) son términos con significados similares pero transmiten mejor la idea original y no se aplican sólo a métodos de recuento de colonias, sino también a NMP y P/A. 2.7 coeficiente de variación CV desviación estándar relativa para una característica no-negativa, es la proporción de la desviación estándar al promedio NOTA 1 La proporción puede expresarse como un porcentaje. NOTA 2 El término "desviación estándar relativa" se emplea algunas veces como una alternativa al "coeficiente de variación", pero no se recomienda este uso. [ISO 3534-1:1993, 2.35] NOTA 3 En esta guía el término coeficiente de variación (CV) se emplea cuando la desviación estándar relativa se expresa en porcentaje (CV % = 100 RSD). 2.8 ensayo conjunto ensayo de desempeño de un método o laboratorio en el que se unen varios laboratorios en un experimento planeado y coordinado por un laboratorio líder. NOTA Los ensayos conjuntos son principalmente de dos tipos. Se realizan los ejercicios de intercalibración para permitir que los laboratorios comparen sus resultados analíticos con aquellos de otros laboratorios participantes.


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Los ensayos de desempeño de métodos producen cálculos de precisión (repetibilidad, reproducibilidad) de los datos acumulados cuando varios laboratorios participantes estudian muestras idénticas con un método estrictamente normalizado. 2.9 recuento de colonia confirmado [verificado] x probable recuento de colonia corregido para falsos positivos

cnk

pcx ==

en donde c es el recuento probable;

p es la tasa positiva verdadera;

n es el número de probables positivos aislados de contaminación;

k es el número confirmado. 2.10 gráfico de control diagrama de dispersión bi-dimensional para monitorear el desempeño del método con valores de control obtenidos mediante un estudio Tipo A. NOTA En los cuadros de control, el eje horizontal generalmente está en la escala del tiempo o la escala de las ordenadas y la variable de control es la media o alguna medida de precisión (s, CV. RSD). 2.11 detector detector de partículas placa de matriz sólida o tubo de líquido que contiene un medio nutriente para el recuento o detección de partículas microbianas vivas. 2.12 conjunto de detección conjunto detector combinación de placas o tubos sobre los cuales se basa el cálculo cuantitativo de concentración microbiana en una muestra. NOTA El conjunto de detección es el conjunto de placas o tubos utilizados para el cálculo numérico de un único valor. EJEMPLOS Las placas paralelas de una suspensión, las placas de diluciones consecutivas, sistema de NMP de 3 x 5 tubos, placa de microtítulo. 2.13 germen entidad viva capaz de producir crecimiento en un medio con nutrientes cf. propágula (véase el numeral 2.27)


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2.14 gráfico de orientación diagrama de dispersión bi-dimensional que sirve para presentar los datos de desempeño del método (cantidad o precisión) con valores de guía arbitrarios o valores de guía obtenidos por razonamiento Tipo B. NOTA En los gráficos de orientación, por lo general el eje horizontal es el recuento de la colonia por detector. 2.15 distribución homogénea de Poisson distribución que se origina cuando la media de una distribución de Poisson varía aleatoriamente de vez en cuando. NOTA 1 Véase la referencia [11]. NOTA 2 También véase la distribución binomial negativa (véase el numeral 2.19). 2.16 límite de detección número de partículas x(por porción analítica) donde la probabilidad p0 de un resultado negativo es igual al 5 %. NOTA 1 Probabilidad de un resultado positivo p(+) = 1 -p0

NOTA 2 a) Cálculo de x vía distribución Poisson:

0032005011

,)ln(,

lnpo

lnx ==

=

=

b) Cálculo de x vía distribución binomial negativa:

2221201501 22

2

uu

,

u

po(x

uuu

−=

−=

−

=−−

−

2.17 límite de determinación concentración de partículas mínima promedio x por porción analítica, donde la incertidumbre estándar relativa esperada es igual a un valor especificado (RSD) NOTA a) Cálculo de x por la vía de distribución Poisson:

21

)RSD(x =


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b) Cálculo de x por la vía de distribución binomial negativa:

221

u)RSD(x

−=

2.18 linealidad dependencia lineal de la señal en la concentración del analito cf. proporcionalidad (véase el numeral 2.28) 2.19 distribución binomial negativa distribución estadística particular "sobre dispersa" de recuentos NOTA 1 Su varianza se puede expresar como

222 µ+µ=σ u en donde

µ es la media

NOTA 2 En la presente guía el cuadrado del factor de sobredispersión (u) se remplaza por el inverso del exponente (1/k) de la fórmula de la norma para la distribución binomial negativa. 2.20 sobredispersión exceso de variación de la aleatoriedad de Poisson NOTA Se detecta cualitativamente mediante el índice de dispersión de Poisson y se mide cuantitativamente calculando el parámetro u (factor de sobre dispersión) de la distribución binomial negativa. 2.21 factor de sobredispersión u incertidumbre aleatoria adicional de la determinación excesiva de la distribución de Poisson, medida en términos de desviación estándar relativa. 2.22 error de sobreposición (traslapo) error de apiñamiento depresión sistemática de recuentos de colonia debido a la confluencia de colonias NOTA Cuantitativamente, el error de traslapo o apiñamiento depende principalmente de la fracción de espacio de crecimiento disponible ocupado por el crecimiento colonial. 2.23 recuentos paralelos cantidades de partículas o colonias en porciones analíticas iguales tomadas de la misma suspensión.


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2.24 distribución de Poisson distribución completamente aleatoria de cantidades de partículas cuando se muestrea una suspensión perfectamente mezclada. NOTA La probabilidad P (k) de observar exactamente unidades k en una porción de ensayo cuando la media es igual a µ se calcula con la siguiente fórmula:

µ−µ= e

!k)k(P

k

2.25 precisión grado de concordancia entre resultados de ensayo independientes obtenidos bajo condiciones estipuladas. NOTA La precisión no se relaciona con el valor verdadero o el valor especificado. Por lo general, se expresa en términos de imprecisión y se calcula como una desviación estándar de los resultados de ensayo. 2.26 validación primaria validación completa establecimiento de las especificaciones para el desempeño de un nuevo método y/o verificación experimental de que un método cumple criterios de calidad derivados teóricamente. 2.27 propágula entidad viable, célula vegetal, grupo de células, espora, grupo de esporas o una parte de micelio fungal capaz de crecer en un medio nutriente cf. germen (véase el numeral 2.13) 2.28 proporcionalidad acuerdo de recuentos de partículas observados con el volumen (o dilución) de una serie de porciones analíticas de una suspensión de origen común. NOTA La proporcionalidad se calcula para evaluación estadística como la G2 estadística de la relación de probabilidad logarítmica con n-1 grados de libertad. 2.29 método cualitativo método de análisis cuya respuesta es la presencia o ausencia del analito en una cierta cantidad de muestra NOTA Véase la referencia [10]. 2.30 recuperación término general empleado para la cantidad de partículas calculada en una porción de ensayo o muestra, entendiendo que existe un número verdadero (aunque desconocido) de partículas de las cuales el 100 % o menos son "recuperadas" por el detector.


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2.31 exactitud relativa grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el método de referencia y la respuesta obtenida por el método alternativo en muestras idénticas. NOTA Véase la referencia [10] 2.32 diferencia relativa d diferencia entre dos valores medidos divididos por su media

BA

BABA

xxxx

xxx

d+−

=−

=(2

d % =100 d NOTA Para todos los propósitos prácticos, el mismo valor resulta del cálculo d = In(xA) - In(xB). 2.33 recuperación relativa razón (A/B) de recuentos de colonias obtenidos por dos métodos ensayados sobre la porción de ensayo de la misma suspensión, donde B es la referencia (cuando es aplicable) 2.34 recuperación relativa RSD cálculo de la desviación estándar de una población de una muestra de n resultados dividido por la media de dicha muestra

xs

RSD =

cf. coeficiente de variación (véase el numeral 2.7) 2.35 repetibilidad grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo elemento mensurado realizadas bajo las mismas condiciones de medición. NOTA 1 Véase la guía: Guide to the expression of uncertainty in measurement [6] NOTA 2 La repetibilidad se calcula como r= 2,8 sr, donde sr es la desviación estándar de la repetibilidad. 2.36 reproducibilidad grado de concordancia entre los resultados de las mediciones en el mismo elemento mensurado realizadas bajo condiciones de medición alteradas. NOTA 1 Véase la guía: Guide to the expression of uncertainty in measurement [6] NOTA 2 La reproducibilidad se calcula como R= 2,8 sR,


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en donde

sR es la desviación estándar de la reproducibilidad generalmente compuesta por la desviación estándar entre laboratorios sL y la desviación estándar de repetibilidad sr:

22rL sssR +=

2.37 robustez insensibilidad de un método analítico frente a pequeños cambios en procedimiento. NOTA 1 Véase la referencia [23] NOTA 2 A fin de examinar la robustez, es aconsejable "abusar" del método en forma controlada. 2.38 validación secundaria demostración, mediante experimentos, de que un método establecido funciona de acuerdo con sus especificaciones, cuando lo emplea el usuario. 2.39 selectividad aparente F Proporción del número de colonias objeto de la cantidad total de colonias en el mismo volumen de muestra

F = lg (t/n) en donde

t es la concentración aparente de presuntos tipos objeto calculados por colonias de recuento;

n es la concentración del total de colonias 2.40 sensibilidad fracción de la cantidad total de culturas positivas o colonias correctamente asignadas en la presunta inspección. 2.41 especificidad fracción del número total de culturas o colonias negativas asignadas correctamente en la presunta inspección. 2.42 incertidumbre estándar incertidumbre del resultado de una medición expresada como desviación estándar NOTA Véase la referencia [5]


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2.43 EVALUACIÓN TIPO A (de incertidumbre) Método de evaluación de incertidumbre mediante el análisis estadístico de una serie de observaciones. EJEMPLO Las observaciones pueden ser, por ejemplo, la desviación estándar, la desviación estándar relativa. NOTA 1 Véanse las referencias [5] y [6]. NOTA 2 Con frecuencia se calculan la repetibilidad y la reproducibilidad realizando ensayos de desempeño del método conjunto cuando varios laboratorios estudian muestras "idénticas" provistas por un organizador central [15]. 2.44 evaluación Tipo B (de incertidumbre) Método de evaluación de incertidumbre por medios diferentes al análisis estadístico de series de observaciones, por ejemplo, a partir de supuestas distribuciones de probabilidad con base en la experiencia u otra información. NOTA Véanse las referencias [5] y [6] 2.45 incertidumbre (de medición) parámetro, asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podía atribuirse razonablemente al elemento mesurando. NOTA Véase la referencia [6] 2.46 incertidumbre (de recuento) desviación estándar relativa de resultados de recuento repetido de las colonias o partículas de la(s) misma(s) placa(s) o campo(s) bajo condiciones estipuladas. EJEMPLO Las condiciones estipuladas pueden ser por ejemplo, la misma persona o diferentes personas en un laboratorio, o diferentes laboratorios. 2.47 intervalo de validación intervalo del número promedio de partículas por porción analítica para el cual se ha demostrado en forma aceptable la obediencia de especificaciones de validación (en especial la linealidad). NOTA Por lo general se expresa como el intervalo de recuentos "confiables" de colonias. 3. ORGANIZACIÓN DEL DOCUMENTO La primera parte (véanse los numerales 4 a 8) de esta guía contiene material informativo sobre principios básicos, características y limitaciones de métodos microbiológicos, lo mismo que sobre aspectos generales de validación. La segunda mitad (véanse los Capítulos 9 a 11) es el documento de validación real, que contiene especificaciones y procedimientos recomendados para su determinación. En el cuerpo de esta guía no se definen por completo los viejos y nuevos conceptos y principios. Se adjuntan tres anexos. El Anexo A ofrece los detalles de las fórmulas estadísticas más pertinentes a este documento, el Anexo B contiene ejemplos numéricos y el Anexo C ofrece planes detallados para los dos experimentos de validación.


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Los ensayos estadísticos en el sentido ordinario no son centrales para las ideas. Los cálculos matemáticos de emplean principalmente con el propósito de ofrecer resúmenes convenientes de datos y las distribuciones estadísticas ofrecen valores de orientación. La guía que con mayor frecuencia se consulta es la tabla de distribución X2. Los dos programas de BASIC presentados en el Anexo A se copian con facilidad en los computadores de escritorio o calculadoras de bolsillo programables para ayudar a la realización de los cálculos básicos más frecuentemente requeridos. 4. CONCEPTOS BÁSICOS 4.1 GENERALIDADES En lo que se refiere a estadísticas de partículas, los recuentos microscópicos obedecen las mismas leyes que los recuentos viables pero están, con la excepción de los métodos de micro colonia, libres de problemas biológicos asociados con el crecimiento. Los colorantes diferenciales, complejos rotulados específicamente u otros agentes empleados para hallar el objetivo no alteran los principios metrológicos. Se pueden aplicar los mismos principios de validación como métodos de colonia selectivos. Los recuentos de placa de bacteriógrafos son en la mayoría de aspectos similares a los recuentos de colonias bacteriales. 4.2 VALIDACIÓN 4.2.1 Generalidades La validación significa un proceso que ofrece evidencia de que un método es capaz de servir para su propósito planeado, es decir, para detectar o cuantificar un grupo microbiano o microbio especificado con adecuada precisión y exactitud. Los métodos de recuento total no tienen un grupo objeto definible y sólo pueden validarse en relación con otros métodos o contra expectativas teóricas de precisión. La validación se clasifica como primaria o secundaria de acuerdo con su propósito. 4.2.2 Validación primaria La validación primaria es un proceso exploratorio con la meta de establecer los límites operacionales y características de desempeño de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debería originar especificaciones numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y precisa del objeto de interés (colonia positiva, tubo o placa) Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de esquemas de ensayo especialmente diseñados. Los laboratorios que desarrollan un método "en casa" o una variante de una norma existente debería realizar los pasos de validación primaria. Resulta imperativo que los técnicos que participan en la validación primaria cuenten con considerable experiencia en los otros métodos microbiológicos.


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4.2.3 Validación secundaria La validación secundaria (también llamada verificación) tiene lugar cuando un laboratorio procede a implementar un método desarrollado en otra parte. La validación secundaria se centra en la reunión de evidencia acerca de que el laboratorio está en capacidad de cumplir las especificaciones establecidas en la validación primaria. En el presente, no se encuentran especificaciones para la mayoría de métodos. Es posible que se tengan que emplear los resultados de aseguramiento de la calidad externo (véase el numeral 4.2.8) como el primer paso hacia la validación secundaria completa. Normalmente, la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo óptimo y el trabajo sólo requiere tratar el procedimiento dentro de los límites operacionales establecidos por la validación primaria. 4.2.4 Control de calidad analítico (CCA) La aplicación de métodos válidos en sus límites confiables especificados no asegura automáticamente resultados válidos. Es necesario el control de calidad analítico (AQC) empleado en conexión con análisis de rutinas diarias. Por medio de éste se controla la capacidad de emplear un método exitosamente. El AQC es un proceso continuo. Las principales herramientas son los gráficos de orientación, con límites derivados de especificaciones de métodos (a partir de la validación primaria) o de consideraciones teóricas. Los métodos de AQC son extensiones del proceso analítico de rutina, por ejemplo, réplicas a diferentes niveles, o simplemente cálculos que no se realizan ordinariamente en datos de rutina. Adicionalmente, se emplean materiales de referencia, intercalibraciones y muestras con adición conocida. El control de calidad analítico es necesario en conexión con la validación primaria y secundaria. Se deberían emplear sólo resultados confiables en el sentido de AQC par ala derivación de criterios de validación y características de desempeño. Los grupos de trabajo internacionales y nacionales han producido numerosos documentos sobre control analítico de la calidad de métodos microbiológicos (por ejemplo, las referencias [1,2,3,4,7,8,20,21,24,26]. Los manuales de normas también contienen secciones que tratan el tema. Aunque son vitales para la validación, en esta guía no se detallan los métodos de control analítico de la calidad. En todo lo que sigue, se supone que los laboratorios cuentan con los controles analíticos apropiados y sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos en operación. 4.2.5 Métodos equivalentes Es necesario aplicar dos métodos en forma paralela sobre las mismas muestras al desarrollar un método en casa y también al reunir información para justificar el uso de un método alternativo. El desempeño del método consta de muchos aspectos. No existe un único ensayo de equivalencia de método, ni criterios numéricos para él. Un método puede ser superior en especificidad, pero inferior en recuperación. Para comparaciones de métodos (ejemplos B.2, B.3, B.4 en el Anexo B) se puede emplear toda la información colectiva acerca de la estabilidad, precisión y especificidad ganada durante los ensayos de validación.


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Obviamente, el mejor es el método que ofrece la más alta recuperación de organismos objeto confirmados, a menos que siempre se requiera confirmación para el uso rutinario. Puede resultar preferible un método que ofrezca una recuperación un poco baja pero no requiera confirmación, Si no se pueden corregir altas tasas negativas falsas o tasas positivas falsas observadas en la validación primaria, mediante definiciones de colonia objeto más refinadas, el método debería considerarse no válido. Es una creencia popular que la validación debería simular la rutina tanto como sea posible. Las muestras naturales con concentraciones naturales de microbios , por lo tanto, deberían ser los principales materiales de ensayo. Existen excepciones bajo algunas circunstancias. Se emplean materiales artificiales (materiales de referencia certificados y muestras con adición conocida) en sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos a fin de garantizar la competencia básica de los laboratorios que participan en los ejercicios de validación del método. La adición de una sustancia conocida puede ser útil e incluso necesaria en la validación secundaria siempre que resulte difícil encontrar muestras naturales con organismos objeto. El personal del laboratorio podrá familiarizarse con el objeto. Las muestras negativas (blancos) deberían limitase al aseguramiento interno de la calidad. Su inclusión en las muestras estudiadas para equivalencia del método puede conducir a una falsa impresión de una buena correlación entre los métodos. Si fuera posible conocer por anticipado cuáles muestras naturales no contienen ningún organismo objeto, éstas representarían una selección conveniente para ensayar falsos positivos en ejercicios de validación real. El intervalo de concentración óptima para la validación de métodos microbiológicos es más angosto que el intervalo de aplicación proyectado. No son necesarias altas concentraciones. Dichas muestras se asemejan a culturas puras y no ponen a prueba el desempeño del método o el laboratorio. LAS muestras con muy bajo contenido bacterial deben estudiarse por razones de salud pública, pero no son adecuadas para comparaciones de método y otros ejercicios de validación por razones estadísticas. La mayoría de veces, el problema es evitable puesto que los métodos microbiológicos generalmente no son sensibles a la concentración en el último extremo de la escala. Cada germen individual reacciona con el medio nutriente casi independientemente de otras partículas de la muestra. Si un método tiene una baja recuperación en comparación con otro, el hecho se descubre con mayor prontitud con veinte o treinta partículas formadoras de colonia por placa que con una o un poco. Los métodos encontrados válidos a concentraciones suficientes para validación son confiables para trabajar también a concentraciones bajas de analito. 4.2.7 Muestras - representatividad y suficiencia La teoría estadística provee soluciones para el cálculo del número de muestras requeridas para diferentes situaciones de ensayo o cálculo [3, 13]. Para poder hacer uso de la teoría, se debería definir la dimensión de los efectos de importancia real y el poder para detectarlos. Debería contarse con un cálculo de la incertidumbre (precisión) de la determinación y debería practicarse muestreo aleatorio. Muchos o todos los anteriores requisitos son difíciles de cumplir en la planeación y ejecución anticipada de ensayos de desempeño de método microbiológico. Las técnicas estadísticas, si se emplean, se convierten en directrices aproximadas.


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La cantidad y variedad de muestras examinadas debe ser suficiente para ser convincente. Sin la ayudad de la estadística, no existen formas exactas de decidir. En algunos casos, la primera muestra estudiada podría dar la respuesta de que el método no es lo suficientemente bueno. No obstante, por lo general, se requieren más muestras. Se pueden requerir miles de muestras para "probar" que dos métodos P/A no son equivalentes. La selección de muy pocos ejemplos puede representar una perdida de tiempo. 4.2.8 Aseguramiento externo de la calidad y otros ensayos de colaboración Con la participación de varios laboratorios en estudios de material "homogéneo" se considera que se realizan ensayos esenciales de tanto el método como el desempeño del laboratorio. (Después de haber reconocido y eliminado anómalos, se considera que los datos restantes ofrecen la información necesaria sobre el desempeño y eficiencia del método). Los ensayos de colaboración se han convertido en una herramienta ampliamente aplicada para las características de precisión de ensayo de métodos químicos [34]. Parece un poco prematuro recomendar plenamente lo mismo en microbología. Se supone que todos los laboratorios participantes cuentan con muchos años de experiencia en los métodos ensayados y una comprobada capacidad de emplearlos. Por la experiencia presente sabemos que los experimentos de colaboración destinados a ensayos de desempeño de métodos tienden a convertirse en ensayos de competencia del laboratorio y ejercicios de formación. Numerosos métodos microbiológicos han estado en uso durante décadas (por ejemplo, agar Endo para colíformes totales, mFC para colíformes termotolerantes, agar m-Enterococcuspara enterococos intestinales) por cientos de laboratorios. Por ende, estos métodos teóricamente serían objetos adecuados para ensayos de desempeño de método de colaboración. Al realizar ensayos de competencia de colaboración para organismos objeto específicos con medios selectivos, de forma casi imprescindible las muestras deberían tener una adición conocida con cultivos puros o mezclas de organismos. Otra solución consiste en emplear materiales de referencia certificados. Esta es una situación simplificada y artificial. Se pueden omitir las principales dificultades experimentadas por diferentes laboratorios en el uso rutinario de métodos en muestras naturales. Ya que las características de desempeño detalladas de un método microbiológico no se han expresado cuantitativamente, estos tipos de esquemas de aseguramiento externo de la calidad (EQA) pueden, a pesar de todo, ser el medio más satisfactorio hacia la validación secundaria (verificación) de un método. 4.3 DETECTORES 4.3.1 Generalidades Con frecuencia resulta conveniente denominar detector (véase el numeral 2.11) al medio nutriente en su contenedor. Se emplean dos tipos de detectores, sólidos y líquidos, en diferentes variantes de métodos microbiológicos. Además, en la mayoría de los casos, se asocian con diferentes principios de enumeración o detección: líquido con P/A y NMP, y sólido con recuentos de colonia. Todas las formas de validación en microbiología se centran en el desempeño de los detectores. El conjunto de tubos (NMP) o la serie de placas (contables) empleadas para análisis se denomina conjunto de detección o conjunto detector (véase el numeral 2.12). Cada NMP de tubo individual es un detector P/A. EJEMPLO Un pozo individual de una placa de microtítulo es un detector de P/A. La placa completa cuando se emplea como un sistema NMP es el conjunto de detección.


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4.3.2 Comparaciones de detectores Para la mayoría de métodos de recuento de colonia se puede producir una contraparte líquida con la misma composición química pero con la matriz sólida (agar, filtro de membrana). El efecto del ambiente sólido puede evaluarse comparando recuentos de colonia con el cálculo NMP equivalente siempre que la reacción para reconocimiento de objeto sea la misma en ambos tipos de detectores y el número de tubos paralelos sea lo suficientemente grande para la precisión adecuada. Además se puede evaluar la sensibilidad de los detectores de P/A mediante comparaciones de líquidos-sólidos similares. 4.4 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO Las características de desempeño deberían ser cuantificables y susceptibles de ensayo para usarse en validación. La terminología sobre características de desempeño en esta guía, en su mayor parte, sigue el uso quimiométrico. Puesto que las definiciones originales de los términos no siempre encajan con los métodos microbiológicos a la perfección, éstas han sido modificadas y adaptadas, de acuerdo con las necesidades. Las características de desempeño tratadas en esta guía se relacionan con el objeto (lista de situaciones y tipos de muestras donde el método es aplicable), la precisión, linealidad, recuperación, límites de trabajo en términos del más bajo y más alto número de colonias recomendable por placa, selectividad, especificidad y estabilidad (rugosidad). En el Capítulo 2 se pueden encontrar definiciones de estos y otros términos. 4.5 ESPECIFICACIONES Las especificaciones son expresiones numéricas o cualitativas de características de desempeño o de límites de trabajo derivados de ellas. La validación primaria debería ofrecer los siguiente:

a) identificación morfológica del (presunto) objeto;

b) declaraciones con respecto a las condiciones de incubación (temperatura, tiempo, gas, atmósfera, humedad) y características de los medios (pH, estabilidad);

c) una declaración en cuanto a los límites de trabajo confiables en términos de

colonia o números de placa por detector (placa, numero más probable , filtro de membrana) si es posible;

d) expresiones de incertidumbre dentro de límites confiables especificados;

e) objeto y limitaciones

5. LIMITACIONES Y CARACTERÍSTICAS PROPIAS DE LOS MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS 5.1 RECUPERACIÓN DEL ANALITO El analito microbiológico consta de partículas vivas discretas, llamadas de diversas maneras como: unidades formadoras de colonias (UFC), partículas formadoras de colonia (PCF), gérmenes, propágulas, etc. (véase el Capítulo 2). El número de colonias observadas es una aproximación del número de partículas vivas.


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El arsenal útil de los ensayos de desempeño se limita por la casi imposibilidad de conocer la verdadera cantidad del analito en una muestra o en una porción analítica. No se pueden verificar los detectores con una cantidad exactamente conocida de microorganismos. La viabilidad se define por crecimiento, es decir, por el método mismo. La recuperación absoluta es indefinible y la trazabilidad es imposible. Puesto que la viabilidad puede ser diferente con diferentes detectores y/o con diferente historia de la muestra, la recuperación relativa (que involucra el nuevo método y una referencia) es una característica de desempeño posible aun cuando no se conozca el resultado verdadero. 5.2 VARIANZA DE LA MUESTRA En el medio ambiente e incluso en las muestras de laboratorio, la distribución de las partículas es desigual. La varianza del muestreo del medio ambiente no es una característica del método, si bien la varianza del submuestreo de una muestra de laboratorio si se puede considerar así. Probablemente no sea posible emplear prácticas de mezclado suficientes para garantizar la mezcla perfecta del contenido de una muestra sin cierta pérdida de células viables. Dentro de la muestra, con frecuencia la varianza es considerable y causa problemas en la validación. El desempeño, especialmente la precisión y los límites de trabajo superiores, no deben determinarse por separado para diferentes matrices. 5.3 DISTRIBUCIÓN DE LAS PARTÍCULAS Y SOBRE DISPERSIÓN La variación aleatoria debida a la distribución desigual de las partículas entre muestras paralelas, incluso en suspensiones perfectamente mezcladas, es una característica propia de los métodos microbiológicos [31]. La variación aleatoria básica es inevitable y no tiene nada que ver con las destrezas técnicas o el equipo. Ésta sigue una conocida ley matemática, la de la distribución de Poisson [28], y, por tanto, es confiable. Las imperfecciones técnicas y muchas otras causas son responsables de la variación adicional. Las determinaciones paralelas varían incluso más que lo que se explica mediante la distribución de Poisson. La situación se denomina sobredispersión (véase el numeral 2.20). Muchos argumentos apoyan la distribución binomial negativa (véase el numeral 2.19) como un modelo de sobredispersión en microbiología [11, 14, 15]. 5.4 INTERACCIONES EN EL DETECTOR Surgen considerables dificultades de las interacciones de los factores abióticos y bióticos dentro de los detectores. Los detectores líquidos sufren de posible cohabitación de una variada microflora en el mismo tubo. Los detectores sólidos sufren de apiñamiento y enmascaramiento de colonias objeto por crecimiento de desechos y de otras colonias no deseadas. La lectura se hace difícil, no confiable o imposible. 5.5 ROBUSTEZ Los métodos microbiológicos no son robustos. Tanto el analito como la mayoría de impurezas son vivas, lo cual puede causar fenómenos inesperados en los detectores. Los microbiólogos deberían poder reconocerlos y entenderlos. Los efectos de la matriz, el estrés de incubación, la calidad y el origen de los ingredientes del substrato, la composición de la flora microbiana de la muestra y la capacitación de los técnicos son todos factores que pueden afectar el resultado.


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La falta de robustez se origina en cinco áreas principales: la muestra (sus propiedades fisicoquímicas y la población microbiana), el personal competente, la preparación de la muestra, las condiciones de incubación y el medio de detección. De éstos, los tres últimos deberían normalizarse. La validación primaria debería establecer los límites generales dentro de los cuales se espera que los métodos se desempeñen bien. El diseño estadístico eficiente para ensayos de robustez desarrollado por AOAC [34] puede aplicarse también en microbiología. Considerando la naturaleza viva del analito, la libertad de opción en cuanto a tiempos de reacción (tiempo de incubación) y temperatura de incubación con frecuencia es sorprendente. Los recuentos de colonia son más sensibles al tiempo que lo que se supone normalmente. Por ejemplo, las normas internacionales, en su esfuerzo por incluir prácticas actuales en diferentes países, frecuentemente involucran la robustez con límites improbables. EJEMPLO La descripción del método para detección y enumeración de organismos coliformes permite la incubación durante 18 h a 24 h a36 °C ± 1 °C. Esto implica estabilidad considerable de resultados hacia las variaciones en el tiempo y temperatura de incubación; probablemente más que la realmente verdadera. Cuando la temperatura es uno de los factores selectivos (por ejemplo, 44 °C con coliformes termotolerantes) incluso la posición de la placa en el incubador o en la pila de placas pueden tener marcados efectos en el resultado. Esto se ha reconocido en algunas normas mediante la especificación del más alto tamaño de pila permisible (por ejemplo, seis). La eliminación total del efecto de apilamiento requeriría incubación en una capa solamente, lo cual se considera impracticable. Otra característica importante de la robustez que rara vez se considera es el almacenamiento de las muestras antes del análisis. Se considera generalmente válido que las muestras puedan tolerar almacenamiento refrigerado durante, por ejemplo, 24 h [9]. El estrés en frío impuesto durante el almacenamiento refrigerado puede no ser importante para los recuentos totales pero resulta perjudicial para los métodos que dependen de métodos altamente selectivos. Los choques térmicos y otros cambios adicionales no son generales sino específicos del método. 5.6 ERRORES ESPORÁDICOS Una característica típica de la mayoría de métodos de recuento de colonia microbiológicos es su predisposición a problemas inesperados, con frecuencia en una sola placa. Las diferentes técnicas (estriado, dispersión superficial, FM) son bastante diferentes en este aspecto. Los problemas pueden deberse a la presencia de una sola colonia perturbadora, humedad, diferencias de temperatura, sólidos y otras impurezas en la parte de ensayo, contaminación, etc. Tales "accidentes" no reflejan el desempeño del método en general y no son ni cuantificables en validación ni predecibles con modelos matemáticos, cuando, con mucha frecuencia, emplean un método incierto. Los métodos de cultivo líquido son menos susceptibles. Los partidarios de la "última tecnología" son de la opinión de que los errores esporádicos pertenecen a métodos microbiológicos y deberían incluirse en el cálculo de incertidumbre del desempeño. Esto se relaciona con la idea de que los métodos deben validarse como aparecen en uso. La opinión de este Reporte Técnico es que los errores esporádicos son asunto por tratar en el AQC diario. Aunque su detección depende de la competencia de los técnicos, debería hacerse todos los esfuerzos por reconocer los valores erróneos y eliminarlos. Si se descubre que los errores esporádicos causan fallas de análisis frecuentes, el método es obviamente inadecuado par el propósito destinado.


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5.7 GRÁFICOS DE CONTROL Y ORIENTACIÓN Un procedimiento analítico es un tipo de proceso, y se puede considerar como su producto la medición o determinación resultante. Puede parecer que la idea del gráfico de control básico, surgida en la industria de procesos, funciona también en el control del proceso analítico. Este ayudaría a detectar si han ocurrido cambios repentinos o más insidiosos en la calidad del proceso. Cuando una situación fuera de control es más o menos cierta, el proceso puede detenerse y repararse. Las posibilidades de control de proceso en el análisis son limitadas. Los tipos más comunes son el empleo de muestras de referencia para ensayar la constancia de la recuperación (ausencia de desviación sistemática) y determinaciones duplicadas para verificar la precisión (repetibilidad y/o reproducibilidad). Este planteamiento encaja bien con los análisis químicos automatizados, pero no es adecuado para análisis microbiológicos. Con éste, se supone que el proceso (es decir el procedimiento analítico) se encuentra en su mejor desempeño en el inicio y puede dañarse repentina o gradualmente, después de lo cual todos los resultados son erróneos. En microbiología, no es fácil indicar cuando un método esta bajo o fuera de control. Es posible que un resultado analítico de deficiente calidad no esté relacionado con ningún otro resultado del mismo día. Las representaciones gráficas son elementos útiles y prácticos no sólo en el AQC sino también en algunos contextos de validación. Por las razones indicadas arriba, su uso en microbiología debería estar limitado a ofrecer orientación en la práctica analítica, No deberían emplearse para desaprobar el trabajo analítico de un día entero o de una serie de resultados. Se ha sugerido que el término "gráfico de control" debería restringirse a situaciones de control obvio, tales como monitoreo de temperaturas del incubador. Se prefiere el término "gráficos de orientación" al ilustrar gráficamente el desempeño de métodos microbiológicos. No obstante pueden escogerse algunos valores de guía para ayudar a la toma de decisiones. 6. MODELOS MATEMÁTICOS DE VARIACIÓN 6.1 VARIACIÓN BÁSICA INEVITABLE - DISTRIBUCIÓN DE POISSON 6.1.1 Generalidades La variación por azar de las cantidades de partículas entre porciones de ensayo paralelas en la escala de trabajo óptimo de los detectores microbiológicos es considerable incluso si la suspensión se mezcla perfectamente (aleatoriedad completa) y no se involucran incertidumbres técnicas de medición. Con esto se crea un dilema microbiológico típico. Los métodos de recuento de colonia se encuentran en su mejor desempeño, en la mayoría de aspectos biológicos y técnicos, cuando los números son tan pequeños que la precisión estadística es inadecuada. 6.1.2 Precisión de los detectores de recuento de colonia Por lo general, la precisión se expresa en términos de la desviación estándar. La variación estadística básica de recuentos puede modelarse matemáticamente por la distribución de Poisson. La varianza (s2) de la distribución de Poisson es numéricamente igual a la media (m). (La igualdad de la media y la varianza no prueban que los datos sigan una distribución de Poisson).


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La desviación estándar relativa (RSD) es una relación inversa al recuento de la media o en forma más general al recuento total (c) del conjunto de detección:

ccc

cs

RSD1

=== (1)

EJEMPLO Un solo recuento de placa de una muestra de una suspensión perfectamente mezclada, digamos 48 colonias, tiene la precisión relativa teórica (RSD) de 1/√48 = ± 0,14 (CV = 14 %). Si el mismo recuento total, 48 colonias, ha resultado de tres placas paralelas 12 + 16 +20 = 48, la desviación estándar relativa de la media 48/3 = 16 debería ser la misma. En la Figura 1 se muestra la dependencia de la precisión relativa (CV, coeficiente de variación) en el recuento de partículas.

Particula

CV

1009080706050403020100

0

150

125

100

75

50

25

Figura 1. Coeficiente de variación de número de colonias c en una suspensión mezclada perfectamente siguiendo la ley de distribución de Poisson

El gráfico muestra por qué los números de colonias tales como 20, 25 ó 30 se han considerado tradicionalmente como los recuentos confiables estadísticamente más bajos. El modelo de Poisson puede emplearse para calcular la incertidumbre estadística teórica en cualquier recuento de colonia y a la inversa para tomar decisiones sobre los límites de trabajo inferiores con base en la precisión estadística estipulada. La incertidumbre aleatoria se incrementa rápidamente a medida que el recuento de colonia decrece (véase la Figura 1). En la escala de recuento por debajo de aproximadamente diez, lo que resulta ser de considerable interés para la salud pública, las mediciones únicas son tan imprecisas que difícilmente se pueden caracterizar como mejores que semi-cuantitativas. La escala de recuento de 1 a 10 corresponde aproximadamente a la escala que determina la precisión característica del cálculo común de NMP de 3 x 5-tubos. La clasificación de los recuentos de colonia por debajo diez como semi-cuantitativos se encuentra en armonía con la opinión de muchos estadísticos de que los métodos de NMP de acuerdo con los diseños 3 x 3 ó 3 x 5 se consideran más apropiadamente como ensayos del orden de magnitud en vez de los


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cálculos cuantitativos. (El cálculo de NMP de 3 x 5- tubos presenta el intervalo de confianza del 95 % de cerca de ± 0,5 unidades logarítmicas [12]). 6.1.3 Precisión de los detectores de NMP La precisión de los cálculos de NMP depende del recuento mismo, pero de una manera un poco más complicada que la del recuento de colonia. La desviación estándar del registro de NMP es una curva ondulatoria. Tiene tantos elementos mínimos locales como niveles de dilución existentes en el conjunto de detección. Como ejemplo, la desviación estándar logarítmica se calculó para el detector de NMP de 3 x 10 tubos con la ayuda de un programa de computador [19] (véase la Figura 2).

0

0

0,4

0,3

log

SD

105

Número de positivos

0,2

0,1

15 20 25 30

COCHSE

Figura 2. Desviación estándar logarítmica de NMP de 3 x 10 tubos

El número de tubos positivos en el conjunto completo se encuentra sobre la abscisa. La curva ondulante muestra la verdadera desviación estándar. La horizontal recta es la aproximación de Cochran [12]. Cochran [12] propuso una desviación estándar constante aproximada para la escala entera de NMP. Esta aproximación se indica mediante la línea horizontal en la Figura 2. Parece que el resultado exacto se desvía el máximo de la aproximación cuando la mayoría de los tubos en el conjunto de detección son negativos. De acuerdo con la fórmula de Cochran [12], la precisión del cálculo de NMP en la escala logarítmica depende de manera sencilla del número de tubos (n) y del factor de dilución (f) entre diluciones consecutivas. Se escogió la constante 0,58 "al ojo" para diluciones décuplas a fin de proporcionar el ajuste ilustrado en la Figura 2. Si el factor de dilución entre las diluciones es menor a diez, entonces se puede emplear la constante 0,55 [12].

Desviación estándar (SD) de lg NMP = n

flg,580 (2)

Los límites de confianza del 95 % en muchas tablas de NMP se basa en la aproximación de Cochran en la ecuación (2), pero se están remplazando por límites "verdaderos" más exactos en tablas recientemente publicadas.


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En la actualidad, la desviación estándar de cualquier valor e NMP individual se obtiene fácilmente mediante un apropiado programa de computador, por ejemplo, el [19]. A pesar de su naturaleza aproximativa, la fórmula de Cochran es útil en la planeación experimental y las comparaciones de métodos (véase el ejemplo a continuación). EJEMPLO Suponga una determinación basada en el sistema de detección de NMP de 3 x 32 pozos en una placa de microtítulo de 96 pozos. Suponga, además, un factor de dilución f = 2 entre diluciones consecutivas. La desviación estándar de lg NMP, de acuerdo con la fórmula aproximada de Cochran es:

Desviación estándar (SD) de lg NMP = 206709014055032

3550 ,,,

lg, == (3)

Con números elevados de tubos paralelos y factores de dilución inferiores a 10, los sistemas de NMP se vuelven iguales o mejores que los métodos de colonia debido a las condiciones superiores de crecimiento, la facilidad de interpretación y la ausencia de errores de traslapo. 6.1.4 Límite de detección - modelo Poisson En concentraciones de partículas muy bajas, todos los métodos microbiológicos, NMP y recuento de colonia incluido, se convierten esencialmente en métodos de P/A (presencia/ausencia). Existe poco daño, en lo que respecta a salud pública o evaluación de la calidad del producto, al considerar cualquier recuento por debajo de tres o cuatro como simples detecciones positivas de presencia. Si el limite de detección se define en términos de la probabilidad de registrar un resultado positivo, éste no se puede leer en la Figura 1. La probabilidad de un resultado positivo p (+) cuando la distribución de Poisson prevalece puede calcularse a partir de

me)(p −−=+ 1 en donde

e es la base de logaritmos naturales; m es el número promedio de partículas por porción analítica. EJEMPLO Una de las definiciones populares del límite de detección es la concentración a la cual la probabilidad de detectar la presencia del analito es igual al 95 % [p(+) = 0,95]. Si se toma p(+) como 0,95, entonces e-m = 1 - 0,95 = 0,05. Al solucionar la ecuación para m se produce m = - ln (0,05) = 3,0. Por lo tanto, en el recuento promedio de 3, las oportunidades de detectar una partícula en una porción de ensayo es igual a 0,95 (siempre que prevalezca la distribución de Poisson). 6.2 SOBREDISPERSIÓN - EL MODELO BINOMIAL NEGATIVO 6.2.1 Generalidades La preparación de la suspensión básica, la dilución, inoculación y recuento de las colonias no están totalmente libres de incertidumbre. Cada paso técnico se agrega a la variabilidad total de la medición. No se puede esperar que las determinaciones paralelas que involucran el procedimiento analítico completo sigan la distribución de Poisson. Se observará la


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sobredispersión, es decir la variación mayor que la aleatoriedad completa (en el sentido de Poisson), entre determinaciones paralelas. La sobredispersión es el estado normal de las determinaciones microbiológicas y la distribución de Poisson es una excepción. Las causas comunes de la sobredispersión, aparte de los errores esporádicos, tienen efectos aproximadamente proporcionales a la media o en realidad al número total de colonias (c) contadas en el conjunto de detección. Más adelante [11,14] se presentan otros argumentos de por qué la sobredispersión de recuentos microbiológicos debería seguir este patrón. Puesto que la incertidumbre básica debida a la dispersión aleatoria de las partículas en suspensión sigue la distribución de Poisson, la varianza total s2 puede expresarse como

s2 = c +u2 c2

en donde

u es el factor de sobredispersión, desviación estándar relativa de incertidumbrre adicional

c es el recuento de colonia en el conjunto entero de detección. La primera parte de la varianza (c) se debe al proceso de Poisson, el resto (u2 c2) se debe al efecto combinado de todos los factores de sobredispersión aleatorios. Una distribución estadística con este modelo de varianza se denomina una distribución binomial negativa (también distribución de Poisson compuesta o heterogénea). Consecuentemente, la desviación estándar relativa puede expresarse como

21u

cRSD +=

La Figura 3 muestra el efecto de diferentes grados de sobredispersión en la precisión relativa total (coeficiente de variación)


22

CV

, %

CV15CV

00

125

150

10

Número de particulas, C.

CV30

100

75

50

25

20 4030 6050 8070 10090

NOTA Dependencia del coeficiente de variación (CV) del número (c) de partículas contadas y variación adicional moderada. Curva inferior: el modelo de Poisson sin sobredispersión. Curvas superiores: binomiales negativos con dispersión del 15 % y 30 % (u= 0,15 y 0,30).

Figura 3. Efecto de sobredispersión en CV

El número de colonias requerido para alcanzar una precisión total relativa es considerablemente superior en una situación de sobredispersión que en el caso aleatorio totalmente (Poisson). Se puede calcular resolviendo la ecuación (6) para el número de colonia c:

221

uRSDc

−= (7)

EJEMPLO Para lograr la desviación estándar relativa RSD= 0,2 cuando la sobredispersión es u= 0,15 se requiere, de acuerdo con la ecuación (7), el número de colonia c = 1/(0,22 - 0,152) = 1/(0,04 - 0,022 5) = 57. La misma precisión se alcanza en una situación completamente aleatoria (Poisson) con el número de colonia c = 1/0,22 = 1/0,04 =25. NOTA Resulta obvio que no se pueda alcanzar la precisión total inferior a la sobredispersión dentro de una sola determinación. El procedimiento completo debe repetirse si se requiere mejor precisión. Con n determinaciones paralelas, la desviación estándar relativa total puede calcularse aproximadamente a partir de

nu

cRSD

21+=

∑ (8)

en donde

∑c es el número total de colonias registradas;

u es la constante de sobredispersión;

n es el número de determinaciones paralelas.


23

6.2.2 Límite de detección - modelo binomial negativo El límite de detección, si se define en términos de la probabilidad de un resultadopositivo puede calcularse a partir de la probabilidad de negativos. Citando a Anscombe [11] pero cambiando los símbolos por los empleados en esta guía, la probabilidad de un resultado negativo (probabilidad de cero) se da por la fórmula:

( ) 2121 u/cupo −+= (9)

Al resolver c se obtiene el límite de detección cuando se ha dado la probabilidad de negativos y el factor de sobredispersión.

210

2

u

pc

u −=

−

Como es evidente en la Figura 2, el límite de detección se ve más bien poco afectado por la sobredispersión moderada (véase el ejemplo a continuación). EJEMPLO El recuento de colonia promedio requerido a fin de alcanzar un 95 % de probabilidad de un resultado positivo en una situación de sobredispersión depende del factor de sobredispersión. Se supone un factor de sobredisersión u= 0,30. La substitución directa de la probabilidad de un resultado negativo p0 = 1 - p(+) = 1 - 0,95 = 0,05 en la ecuación (10) produce c= (0,05 -u2 - 1)/u2 = 0,05-0,09 - 1)/0,09 = 3,44. El cálculo correspondiente con la distribución de Posison (sin sobredispersión) sería c= In(1/0,05) = 3,00 (véase ejemplo en el numeral 6.2.4). 6.2.3 Cuantificación de la sobredispersión Existen tres principales formas de calcular el parámetro u [20]. En el intervalo de valores promedio y factores de sobredispersión que son de interés en la validación de los métodos de recuento de colonia, el Método de Anscombe I [11] es eficiente. Consiste en resolver la ecuación (5) para u. Para poder usar el Método de Anscombe I, debe contarse con una serie substancial (preferiblemente más de 30) de observaciones independientes en una única muestra en la que se base el cálculo confiable de la varianza (s2) y la media (m). La ecuación (5) produce, al remplazar c por m:

2

22

m

msu

−=

Para que sean eficientes, las observaciones deberían limitarse a recuentos de colonia en el intervalo de trabajo óptimo. La media nunca debería ser menor que 30. Esto se aplica especialmente si el propósito es calcular u en un único experimento. EJEMPLO Para demostrar la factibilidad de cálculos de sobredispersión, se realizó un experimento para introducir deliberadamente sobredispersión en una serie de recuentos paralelos. Se hicieron 24 filtraciones de membrana con una suspensión mezclada cuidadosamente de un cultivo puro de Enterococcus faecium de forma tal que se inocularon ocho placas con 8 ml, 10 ml y 12 ml de la suspensión. Con esto se introdujo una imprecisión de volumen destinado a causar una cantidad aproximadamente predecible de sobredispersión a los 24 otros recuentos paralelos.


24

El volumen calculado de 8 x 8 ml , 8 x 10 ml y 8 x12 ml tiene una media µ = 10 y una desviación estándar σ = 1,633. Por lo tanto, la incertidumbre de la desviación estándar debida a la sobredispersión debería ser u =s/m = 0,163 3(CV = 16,33%), si los volúmenes fueran exactamente como los establecidos. Los 24 recuentos de colonia observados tuvieron una media m = 379,29 y la varianza s2 = 4 586,54. De acuerdo con la ecuación (11), u2 = (4 586,54 - 379,29)/379,292 = 0,029 2. Por lo tanto, el coeficiente de sobredispersión u = √0,029 = 0,171 0 el cual se acerca lo suficiente al valor esperado, considerando que también incluye las posibles incertidumbres de recuento y volumen ignoradas en el esperado u = 0,163 3. (Todas las mediciones de 8 ml, 10 ml y 12 ml se consideraron exactas). El estimativo de incertidumbre calculado de la forma antes mencionada por lo general no es válido, puesto que se basa en una muestra únicamente. La segunda solución también se basa en la ecuación (5) pero considera varias muestras. Al dividir la ecuación por c se obtiene

cucs

Y 22

1+==

Siempre que se cuente con determinaciones paralelas, se pueden realizar los cálculos de varianza y media. Al calcular la proporción Y = s2/c de cada conjunto se obtiene un gran número de pares (Y,c). La pendiente de la línea de regresión en correspondencia con los puntos ofrece un cálculo de u2. La dispersión aleatoria es inevitablemente considerable si los cálculos de media y varianza se basan en pequeñas muestras (pequeños números de determinaciones paralelas) (véase el ejemplo B.7). La ventaja de este método es que el cálculo de sobredispersión se basa en una gran selección de diferentes muestras y por lo tanto tiene considerable utilidad general. NOTA El anterior razonamiento se aplica mejor cuando la media (m) es el número de colonias (o partículas) sin transformar por conjunto de detección y los conjuntos de detección son en otros aspectos idénticos en todas las determinaciones paralelas. 6.2.4 Sobredispersión en el nivel del detector Los recuentos paralelos de una suspensión única también pueden variar más de lo permitido por la distribución de Poisson. Esta es una observación clásica [16]. En este nivel las únicas causas de sobredispersión son errores de pipeteo, la incertidumbre del recuento y errores esporádicos ("accidentes"). La sobredispersión es una medida útil de confiabilidad total. Se puede detectar mediante los índices de dispersión (X2, G2) (véase el ejemplo B.6 en el Anexo B). 6.3 LÍMITES ESTADÍSTICOS Y PRÁCTICOS 6.3.1 Generalidades Los límites de trabajo inferiores de métodos microbiológicos son en gran medida asuntos de definición. Los límites superiores se definen mediante los requisitos de espacio y las interacciones resultantes de las colonias microbianas. Una partícula microbiana se debe multiplicar un millón de veces para hacerse detectable a simple vista. 6.3.2 Límite inferior Cuando se examina sólo una porción analítica (una placa), el límite estadístico inferior puede expresarse convenientemente como el recuento "confiable" más bajo por placa; definiendo la confiabilidad por la mejor precisión.


25

Habiendo considerado todas las cosas, el límite inferior debería escogerse en alguna parte cercana a las 20 colonias por conjunto de detección. En dicho número de colonia, el coeficiente de variación en una situación completamente aleatoria (Poisson) es ca. ±25 % (véase el numeral 6.1.4). Si se conoce numéricamente la sobredispersión, el cálculo de límite inferior de la determinación puede basarse en el modelo binomial negativo (véase el numeral 6.2.2). 6.3.3 Límites superiores Los análisis de P/A no tienen un límite superior. A medida que el número de gérmenes en la porción analítica se incrementa, la probabilidad de detectar su presencia se acerca a la certidumbre. Con los métodos de NMP, el límite superior práctico se ha excedido cuando todos los tubos de todas las diluciones se encuentran positivos. Estos percances no reflejan el límite superior del método mismo, sólo la dilución equivocada. Tampoco puede establecerse ningún límite superior por razones estadísticas, puesto que la precisión no depende en forma directa simple del número de partículas introducido en el conjunto de detección. Es característico de los procedimientos de NMP que su precisión pueda mejorarse a voluntad cambiando la configuración del conjunto de detección (véase el numeral 6.1). Con los métodos de recuento de colonia, la precisión teóricamente mejora de manera constante con el número de colonias objeto observadas en el conjunto de detección. En la práctica, los métodos de recuento de colonia tienen un límite superior por detector que varía con la situación de ensayo. El detector de recuento de colonias (plato de agar, filtro de membrana) se "atasca" o satura por varias razones, de las cuales el número de colonias objeto es sólo una. Existen muchas causas y concordantemente muchas formas de determinar el límite superior. Una posibilidad es determinar el recuento de colonias por placa cuando la incertidumbre total (incluyendo los errores sistemáticos) se eleva nuevamente al mismo nivel que en el límite inferior [30]. Otra consideración es el apiñamiento o enmascaramiento de colonias objeto debido a crecimiento no-objeto. Dicho fenómeno puede vincularse cuantitativamente a la selectividad del método, o de manera más científica a la "cobertura", es decir, la fracción de espacio disponible que ocupan las colonias. Incluso los cultivos puros tienen un límite superior que depende del cubrimiento [25]. Un tercer aspecto es la pérdida de proporcionalidad (pérdida de linealidad) que ocurre con la alta congestión de la placa. 6.4 ENSAYOS GENERALES DE ALEATORIEDAD - DETECCIÓN DE SOBREDISPERSIÓN La desviación de aleatoriedad (presencia de sobre o sub-dispersión) puede detectarse efectivamente por uno de los dos ensayos clásicos de bondad de ajuste, a saber, el índice de dispersión de Poisson (X2, D2) o la estadística de relación de probabilidad logarítmica (G2). En el Anexo A se presenta el cálculo de los índices. En los pocos casos (por ejemplo, placas paralelas) donde la sobredispersión general no tiene razones técnicas aceptables se puede emplear la concordancia con la distribución de Poisson como un ensayo de método o desempeño del analista [16,33]. Debido a su sencillez, esta característica es especialmente útil como una herramienta de AQC. 7. ESPECIFICACIONES - PRÁCTICA ACTUAL Un ejemplo de cómo el mejor de los protocolos normativos expresa características de desempeño del método puede encontrarse en la forma como los métodos normativos para el


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análisis de agua y desechos de agua, Standard Methods for the Analysis of Water and Wastewater [8] ofrece instrucciones a los usuarios de sus métodos. En diferentes partes del procedimiento de filtro e membrana colíforme total, el usuario encontrará las siguientes declaraciones relacionadas con las especificaciones:

a) Objeto

El objeto del método puede inferirse de una tabla que presenta volúmenes de muestra recomendados para diferentes tipos de aguas. Esta tabla incluye todos los tipos de aguas potables y recreacionales lo mismo que de desechos de agua.

b) Robustez de la incubación y sensibilidad al tiempo

La regla principal se presenta así: "Se incuba durante 20 h a 22 h a (35 ± 0,5) °C". En otra parte del documento se presentan las excepciones a la principal regla: "Las muestras de aguas desinfectadas pueden incluir organismos estresados que crecen a ritmo relativamente lento y producen máximo resplandor en 22 h a 24 h. Los organismos de fuentes no perturbadas pueden producir resplandor a 16 h a 18 h, y el resplandor puede desvanecerse posteriormente después de 24 h a 30 h.

c) Límites de trabajo confiables

Los límites de trabajo confiables se pueden inferir de: "Se calcula el recuento, empleando filtros de membrana con 20 a 80 colonias...". A esto le siguen posteriores salvedades que vinculan el límite de trabajo con la selectividad:".. y no más de 200 colonias de todos los tipos por membrana". Algunas razones para lo último se encuentran en otra parte del documento: "El tamaño de la muestra se regirá por la densidad bacterial esperada, que en las muestras de agua potable se limitará sólo por el grado de turbidez o por el crecimiento no colíforme en el medio".

d) Definición de objeto e identificación

"Todas las bacterias que producen una colonia roja con un resplandor metálico dentro de 24 h de incubación a 35 °C en un medio tipo Endo- se consideran miembros del grupo colíforme. Este resplandor puede cubrir la colonia entera o puede aparecer sólo en un área central ó en la periferia".

Existen consideraciones adicionales : "Los medios de tipo Endo ocasionalmente pueden producir colonias rojas oscuras atípicas sin un resplandor metálico. La verificación de varios tipos de colonias típicas (con resplandor) y atípicas (sin resplandor) detectará resultados negativos falsos y proporcionará experiencia en el reconocimiento de colonias".

e) Otras limitaciones y especificaciones

El documento normativo también ofrece consejo y hace exigencias sobre control de la calidad de los medios y equipos.

8. ESPECIFICACIONES - ENFOQUE RECOMENDADO Generalmente hablando, en la actualidad las normas brindan poca ayuda para los laboratorios que buscan asegurarse de aplicar bien los métodos y obtener resultados válidos.


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Lo que parece hacer falta es una presentación concisa de lo que los laboratorios deberían hacer para verificar que el método también funciona al usarlo ellos mismos y cómo diferenciar el buen desempeño del mal desempeño. Se debería agregar una sección de especificaciones a todas las normas escritas. El formato para métodos de recuento de colonia podría incluir lo siguiente:

a) Sensibilidad: con pocas excepciones (casos mencionados) se confirman más del 90 % de los presuntos positivos.

b) Selectividad: por lo general mejor que - 1 (véase la definición de selectividad). Los

resultados no son válidos si la selectividad es inferior a -2.

c) Incertidumbre de recuento: la desviación estándar relativa del recuento duplicado (réplica) dentro de un laboratorio es generalmente inferior a uZ = 0,05. La incertidumbre del recuento individual (una persona) permanece normalmente por debajo de uZ= ± 0,03.

d) Estriado paralelo: la variación se encuentra dentro de la distribución de Poisson.

(Si no, se debería presentar el grado de sobredispersión). e) La variación dentro de la muestra tiene un coeficiente de incertidumbre procedimental

adicionada de menos de uX = 0,10 en muestras de agua. En muestras sólidas, la incertidumbre adicionada debería permanecer por debajo de 0,15.

f) La proporcionalidad (linealidad) del detector depende de la selectividad. Ésta es

adecuada hasta los números de colonia limitantes dados a continuación:

Selectividad Límite superior de linealidad (colonias objeto por placa)

0 500 (cultivos puros) -0,5 a -1 200 a 100 -1 a -2 100 a 25 por debajo de 2 detección P/A solamente

Con el crecimiento excesivo de colonia, el límite funcional superior puede alcanzarse más pronto. Sin importar el valor de la selectividad, los recuentos no son válidos si más de 1/3 del espacio disponible se ocupa por crecimiento (objeto y no- objeto). Lo anterior es sólo un ejemplo de cómo se podrían presentar las especificaciones concretas del desempeño del método. Dichas especificaciones se pueden ensayar con diseños apropiados. Los valores numéricos se presentan como ilustración y no se deben entender como valores estándar en el presente. Si se cuenta con información acerca de la recuperación relativa comparada con una referencia normativa, ésta debería presentarse. Si se cuenta con datos de reproducibilidad de ensayos de desempeño de método, éstos deberían adicionarse como información adicional. Además, deberían especificarse las condiciones de ensayo, la descripción objeto y el almacenamiento de muestras.


28

9. DETERMINACIÓN Y EXPRESIÓN DE CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO 9.1 GENERALIDADES Las características de desempeño basadas en frecuencias de elementos en categorías cualitativas se denominan categóricas en lo sucesivo. En conexión con los métodos selectivos, éstos se determinan mediante verificación de presuntos cultivos positivos y negativos. 9.2 CARACTERÍSTICAS CATEGÓRICAS RELACIONADAS CON LA ESPECIFICIDAD Y

LA SELECTIVIDAD 9.2.1 Generalidades La visión cualitativa más global del desempeño del método se gana estudiando las muestras naturales. Las muestras deberían cumplir el alcance completo del método, incluyendo diferentes muestras y situaciones de contaminación lo mismo que las diferentes estaciones. Una colonia o una placa es el equivalente de un ensayo P/A o un tubo en una serie de NMP. En la validación primaria, deberían verificarse tanto los presuntos cultivos positivos como los presuntos negativos. La forma más atractiva biológicamente y costo-efectiva de ensayar los métodos de cultivo liquido (tanto P/A como NMP) consiste en emplear un diseño de NMP. Se seleccionan para verificación los tubos en las diluciones donde ocurren tanto positivos como negativos. Estas son las diluciones donde surgen tubos positivos de una o muy pocas celdas. Las características de desempeño asociadas con la selectividad y especificidad pueden definirse numéricamente [17]. Estas se relacionan con las proporciones relativas de colonias o tubos que se supone son positivos o negativos sobre la base de la primera impresión (presunta) comparada con la "verdad" después de la verificación. Después de haber realizado n ensayos de verificación, sus resultados se dividen en cuatro categorías:

a) número de presuntos positivos encontrados como positivos (verdaderos positivos); b) número de presuntos negativos encontrados como positivos (falsos negativos); c) número de presuntos positivos encontrados como negativos (falsos positivos); d) número de presuntos negativos encontrados como negativos (verdaderos negativos).

Estas frecuencias pueden expresarse convenientemente en una tabla de 2 x 2:

Recuento presuntivo + -

+ a b a+ b Recuento confirmado - c d c +d

a+c b+d n Las características de desempeño calculadas de estas observaciones se definen de la siguiente manera:


29

1) sensibilidad = a/(a + b), la fracción de los positivos totales correctamente asignada en la presunta cuenta;

2) especificidad = d/(c + d), la fracción de los negativos totales correctamente

asignados en la presunta cuenta;

3) tasa de falsos positivos = c/(a + c), la fracción de los positivos observados asignados erróneamente;

4) tasa de falsos negativos = b/(b + d), la fracción de los negativos observados

asignados erróneamente;

El número total de ensayos es a + b + c + d = n.

5) la eficiencia E es un parámetro único general, que presenta la fracción de colonias o tubos asignados correctamente:

E = (a + d)/n Las colonias deberían tomarse aleatoriamente de todas las colonias (objeto y no objeto) consideradas como un todo. Con cultivos líquidos, es probable que todos los positivos y negativos se ensayen en sus proporciones reales. Debido a las fueres influencias del operador y la población microbiana, ninguna de las características de desempeño detalladas anteriormente puede tener un valor constante de método específico. La validación secundaria sólo debe ocuparse de los falsos positivos, a menos que parezca recurrente una tasa inferior que la especificada. 9.2.2 Selectividad La selectividad de un método microbiológico se define en esta guía como el logaritmo de la fracción de presuntas colonias objeto (presuntos positivos) entre el total:

F = lg [(a + c)/n] La selectividad puede ser tan baja en algunos tipos de muestra o durante ciertas estaciones que no permiten obtener un recuento objeto confiable. La escala de trabajo superior se ve grandemente influenciada por la selectividad. La "presunta" selectividad definida anteriormente es una herramienta seleccionada por conveniencia. Si se cuenta con recursos, la selectividad real basada en recuentos verificados de positivos verdaderos es científicamente mejor. Las restricciones económicas pueden limitar su uso a comparaciones finales entre métodos. La selectividad aparente varía considerablemente debido a los efectos de estaciones y otras causas que cambian la abundancia relativa de las poblaciones objeto y de fondo. Esta no es una constante específica del método. No obstante, la selectividad proporciona información acerca del desempeño del método y puede ayudar a escoger entre las alternativas. Se debería estudiar una amplia variedad de casos. Puesto que no se cuenta con criterios de decisión, no existen fundamentos para decidir qué cantidad específica es suficiente. Se deberían recolectar suficientes datos para ser convincentes de una u otra forma.


30

9.3 LÍMITES DE TRABAJO 9.3.1 Límites inferiores de detección y determinación El límite de trabajo inferior es cuestión de definición en todos los métodos (véase el Capítulo 6). Numéricamente, el límite debería expresarse como el número inferior suficiente de colonias o partículas por conjunto de detección o placas paralelas. 9.3.2 Límites superiores Cada método, de hecho cada determinación individual, tiene un límite superior confiable. No es un número fijado claramente, sino una región un poco vaga de números de colonia donde los recuentos por placa se vuelven demasiado inciertos para servir de base a una determinación valida. El límite de trabajo superior de un detector de colonia se indica por las siguientes señales:

a) La sobredispersión de recuentos de colonia paralelos puede hacerse más pronunciada y frecuente. La situación puede reconocerse mediante la ayuda del índice de dispersión de Poisson (Véase el Ejemplo B.3).

b) Los recuentos de colonia de diferentes diluciones (volúmenes) no concuerdan. Se

pierde la proporcionalidad (linealidad). La proporcionalidad puede ensayarse mediante métodos basados en el índice G2 (Anexo A y Ejemplo B.4).

El ensayo de proporcionalidad (linealidad) es el más efectivo de los dos. Ambas características pueden explorarse mediante el uso de un ensayo de proporcionalidad especialmente diseñado (Anexo C) [27,33] o mediante recolección de datos sobre los elementos anteriores a partir de ensayos separados. 9.4 INTERVALO DE TRABAJO DE PROCEDIMIENTOS DE NMP Los límites prácticos inferiores y superiores de procedimientos de NMP son los casos extremos cuando sólo un tubo del conjunto de detección es positivo o negativo. El intervalo de aplicación aparente de un conjunto de detección de 3 x 5 es concordante con 0,2 a 160 partículas por volumen unitario (porción analítica) o la primera serie (la menos diluida), sin importar el medio nutriente o población objeto. 9.5 PRECISIÓN 9.5.1 Generalidades Cada medición analítica debería estar acompañada con un cálculo de precisión, incluso cuando no sea factible determinar experimentalmente la precisión de cada determinación individual. Por tanto, existe considerable interés en obtener declaraciones de precisión generalmente válidas para diferentes métodos. De manera ideal, la validación primaria debería ofrecer un cálculo general sobre el cual puede basarse la precisión de cualquier medición. Esto sólo es posible en microbiología de dos maneras. Se puede o asumir aleatoriedad total, y consecuentemente la validez de la distribución de Poisson, o determinar una constante general de sobredispersión por experimento.


31

Se pueden obtener cálculos de precisión principalmente en dos diferentes formas que se han denominado Tipo A y Tipo B (véase el numeral 2) [5,6]. 9.5.2 Cálculos de precisión Tipo A Los cálculos Tipo A se obtienen a partir de cálculos estadísticos con base en determinaciones paralelas. Se expresan como desviación estándar (incertidumbre estándar) o desviación estándar relativa. Los cálculos más generales de Tipo A se obtienen mediante ensayos de desempeño de método conjunto de acuerdo con los principios desarrollados principalmente por AOAC [18]. Los cálculos Tipo A de mediciones microbiológicas hasta el presente se han calculado y expresado como desviación estándar en la escala logarítmica. Tales cálculos no han hecho su aparición aún en las normas microbiológicas. Como resulta evidente de la discusión del numeral 6, la precisión de las determinaciones microbiológicas no es constante incluso en la escala logarítmica, sino que depende del número de colonias. Esta es una razón por la que los cálculos Tipo A siempre son aproximativos y tienden a ser grandes. 9.5.3 CÁLCULOS DE PRECISIÓN TIPO B Los cálculos Tipo B se basan en supuestas distribuciones de probabilidad u otra información. La distribución de Poisson se ha considerado como un modelo estadístico apropiado en suspensiones perfectamente aleatorias en microbiología. Las declaraciones de precisión basadas en la distribución de Poisson son bastante comunes en las normas microbiológicas. EJEMPLO Las normas estadounidenses (American Standard Methods) incluyen la siguiente declaración de incertidumbre sobre el Tipo B: "Para resultados con recuentos, c, mayores a 20 organismos, se calcula los límites de confianza aproximados del 95 % empleando las siguientes ecuaciones de distribución normal:

- Límite superior = cc 2+

- Límite inferior = cc 2−

La desviación estándar en estos casos se basa obviamente en el supuesto de igualdad de varianza y media (Poisson) Por razones discutidas en el numeral 6, el modelo Poisson es bastante ideal y arroja cálculos de incertidumbre mínimos. Tiene la ventaja distintiva de que se puede adjuntar un cálculo individual a cada determinación. 9.5.4 Un modelo mixto Un modelo de sobredispersión basado en la distribución binomial negativa combina el elemento teórico de Poisson con una constante de sobredispersión empírica (véase el numeral 6.2.3). La determinación del factor de sobredispersión es una meta realista para validación primaria. Los métodos para determinarlo se tratan en (véase el numeral 6.2.3).


32

Debería darse el valor de incertidumbre para diferentes aplicaciones de un método si varía de situación a situación. Puede depender de la matriz en estudio. Se expresa convenientemente como la desviación estándar relativa. 9.5.5 Precisión de NMP Los cálculos de precisión de NMP dependen del supuesto de aleatoriedad completa de la distribución de partículas en el conjunto de detección. Al involucrar los números de partículas bajos, esta creencia no se valida fácilmente por ensayo experimental. La precisión de los cálculos de NMP se determina por el número de tubos paralelos por dilución y por el coeficiente de dilución. En [12] se presenta una fórmula aproximativa, asumiendo una incertidumbre constante sobre la escala. Los límites de confianza del 95 % para las combinaciones estándar de tubos aparecen en las tablas de NMP (véase también el numeral 6.1). 10. PROCEDIMIENTOS Y PASOS DE VALIDACIÓN 10.1 GENERALIDADES La validación casi necesariamente ocurre en pasos. Las investigaciones de desempeño real de método deberían estar precedidas por una búsqueda del intervalo de trabajo confiable en la que el desempeño del método es pertinente. Cualquier comparación de recuperación entre dos métodos debería limitarse a casos para los cuales son confiables ambos métodos. 10.2 VALIDACIÓN PRIMARIA 10.2.1 Identificación de objeto Los estudios de cultivos puros durante el desarrollo inicial del método proporcionan la descripción básica de las colonias objeto o tubos P/A. Obviamente, se debe ensayar más de una cepa de cultivo puro del objeto. Se debe probar la validez de la descripción básica empleando el método candidato en una selección representativa (véase el numeral 4.2.6) de muestras naturales. Se ensayan las presuntas colonias objeto, placas o cultivos aislando los cultivos y realizando ensayos de confirmación apropiados. Las presuntas colonias no-objeto o tubos negativos se ensayan de la misma manera. Se calculan los valores numéricos de sensibilidad, selectividad, tasas de falsos positivos y falsos negativos y eficiencia. Se corrige la descripción del objeto, si es necesario. 10.2.2 Incertidumbre del recuento y sensibilidad al tiempo Después de que se ha definido adecuadamente la morfología del objeto, el método se emplea tentativamente sobre una colección de muestras naturales. Se estudia la confiabilidad de línea de base de los recuentos mediante recuento repetido de las colonias de las placas de muestras dentro de un corto tiempo. Si va a trabajar más de una persona en el laboratorio con el método, todos deberían participar.


33

El ejercicio debería producir cálculos numéricos individuales o colectivos de incertidumbre de recuento, expresada como desviación estándar relativa (véanse los Ejemplos B.1 y B.2). La desviación estándar calculada a partir de los resultados de diferentes personas es más informativa que la calculada a partir de recuentos duplicados realizados por una persona. (Por lo general, una persona puede duplicar el recuento, aunque erróneamente, con considerable precisión). También deberían detectarse y evaluarse las diferencias sistemáticas entre personas. Las observaciones sobre incertidumbre en el recuento y sensibilidad al tiempo proporcionarán la primera indicación de problemas potenciales con el amplio uso del método. 10.2.3 Otras características de robustez Si existen dudas acerca de los efectos de la temperatura de incubación, la humedad o la atmósfera de gas, éstas deberían estudiarse mediante ensayos especiales que involucren la incubación de sub-muestras paralelas bajo las condiciones alternativas. Se recomienda que la decisión en estos casos se base en ensayos estadísticos más que en simples impresiones superficiales. Los diseños experimentales basados en planes factoriales del análisis de varianza son generalmente los más apropiados. Los factores que no se ensayan específicamente se consideran ineficaces o bajo control. 10.2.4 Límite de trabajo superior Habiendo establecido las condiciones "ambientales" y las características del objeto, el siguiente paso es explorar las limitaciones cuantitativas del detector en cuestión. Esto puede realizarse con un único tipo de experimento: una serie finamente graduada de diluciones o volúmenes, con paralelos [21, 25]. El ejercicio ofrece los datos para evaluar el límite superior sobre la base de proporcionalidad y repetibilidad (véase el Anexo C). 10.2.5 Precisión El laboratorio responsable de introducir un nuevo método debería también ser el responsable de ofrecer los valores iniciales de sus cálculos de precisión. Estos deberían incluir cálculos de incertidumbre de recuento y repetibilidad básica y cálculos de reproducibilidad de diferentes repeticiones (placas paralelas, series de dilución paralela, matrices). Otros laboratorios requieren esta información para su validación secundaria del método y subsecuentemente para establecer los sistemas de control de calidad analítico. Si no se encuentran suficientes fundamentos para realizar un cálculo Tipo B de distribuciones estadísticas supuestas o conocidas y otra información, deben realizarse experimentos de muestra dividida o muestra paralela para obtener cálculos de precisión Tipo A. Los estudios de desempeño de método conjunto [18] que involucran varios laboratorios resultan inapropiados para la validación de nuevos métodos puesto que presumen que cada participante cuenta con experiencia sólida en el método y esto será posible sólo después de un tiempo. 10.2.6 Veracidad y recuperación relativa La recuperación absoluta (veracidad) del analito microbiológico es inmensurable, lo cual representa un problema en la validación primaria de un nuevo método.


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Se puede aproximar a la verdadera recuperación con ensayos en cultivos puros o muestras esterilizadas fijas (spiked/alambre de púas) empleando un método no selectivo como referencia. También se encuentran algunos materiales de referencia certificados, para dicho propósito. A fin de observar la recuperación relativa, se estudian las muestras naturales con el método candidato y un método de referencia paralelamente. La baja recuperación comparada con la recuperación en un método estándar es una razón obvia para dudar del método. Para que la comparación sea válida, debe basarse en recuentos de colonia confirmados. 10.2.7 Especificaciones Se deben anotar las características de desempeño numérico observadas en una sección de especificaciones en el protocolo del método de acuerdo con el numeral 7 c). 10.3 VALIDACIÓN SECUNDARIA Se deben obtener numerosas muestras naturales. Las muestras divididas o series de dilución duplicadas se estudian con estriado paralelo. Se practica el recuento duplicado con el fin de verificar el desempeño de recuento esperado. Se debe aislar y verificar numerosos presuntos positivos (por lo menos 100). Las características de desempeño categóricas se calculan y comparan con los valores especificados, si se encuentran disponibles. 11. DISEÑOS PARA DETERMINAR LAS ESPECIFICACIONES 11.1 MODELO GENERAL PARA ESPECIFICACIONES CUANTITATIVAS BÁSICAS Un diseño experimental basado en una serie finamente graduada de diluciones o volúmenes duplicados de estriado y recuento ofrece los datos para determinar el límite de trabajo superior y algunas otras especificaciones cuantitativas (Ejemplo B.1, Anexo C). El diseño apropiado es una versión reducida [27] de un plan empleado como un ensayo de desempeño del analista [33]. Se diluye previamente una muestra líquida mezclada cuidadosamente o una suspensión de un material sólido hasta alcanzar una densidad que dé un número esperado de colonia por placa que exceda un poco el límite superior supuesto del desempeño del detector. Se continua una serie de seis o siete diluciones adicionales con pasos de dilución 1:2 desde la suspensión de partida. Se siembran tres placas paralelas de cada dilución. Las placas de diluciones que promedian más de 20 colonias por placa se leen en un orden codificado aleatoriamente por una persona. Si todas las placas o un subconjunto seleccionado aleatoriamente se leen por una segunda persona, los resultados también ofrecerían datos sobre incertidumbre del recuento. Con muchos métodos, la apariencia típica de las colonias objeto podría cambiar durante el tiempo requerido para realizar recuento duplicado de una extensa serie de placas. Entonces debería ensayarse por separado el acuerdo/desacuerdo. NOTA La serie geométrica basada en los pasos de dilución 1:2 es más bien tosca. Los números de colonia al comienzo disminuyen en grandes pasos. Los métodos con límite de trabajo superior no se pueden evaluar eficientemente. En tales casos se recomienda una proporción de dilución inferior a 1:2.


35

Los métodos de filtración de membrana permiten la fácil variación del volumen de la muestra, permitiendo una gradación más apropiada. En tales casos es practicable una serie aritmética con proporciones de volumen 1:2:3:4:5:6:7. Esto tiene la ventaja adicional de que todas las porciones de ensayo se derivan de una única suspensión. Se analiza la proporcionalidad de los datos, la sobredispersión de paralelos y la incertidumbre del recuento, asumiendo una aleatoriedad perfecta en cada paso como base de evaluación. El diseño unitario (véase el Ejemplo B.1, Anexo C) involucra sólo una muestra. Se debería repetir un plan similar con muchas muestras (mínimo diez) para poder generalizar los resultados. Los cálculos estadísticos se basan en procedimientos detallados en el Anexo A, con ejemplos prácticos B.3 y B.4 en el Anexo B. 11.2 PRECISIÓN DEL PROCEDIMIENTO ANALÍTICO COMPLETO El plan descrito en el numeral 11.1 no trata la precisión del procedimiento analítico completo. A fin de determinar la precisión de la determinación, se requieren ensayos con muestras divididas o duplicadas de serie de dilución (véase el Ejemplo B.2, Anexo C). Se deberían obtener muestras naturales con números medios o altos del analito. Después de un procedimiento de mezcla estándar, se realizan determinaciones duplicadas. Se recomienda el estriado paralelo, aunque no es absolutamente necesario. Por lo menos se requieren treinta muestras que abarquen el objeto por completo para tener adecuado cubrimiento. El número de determinaciones paralelas (series de dilución) por muestra debe ser mínimo dos. Cinco o seis paralelos ofrecen resultados más confiables. Aunque es lo recomendado, no es obligatorio que el número de paralelos sea el mismo para cada muestra. Los resultados se emplean para calcular la constante de sobredispersión (véase el numeral 6.2.3) de la manera ilustrada para placas paralelas en el ejemplo B.7. 11.3 CARACTERÍSTICAS CATEGÓRICAS Las características relacionadas con selectividad, sensibilidad, especificidad, etc. (véase el numeral 9.2) pueden estudiarse en conexión con los ensayos descritos en el numeral 11.2 a menos que el tiempo de trabajo se vuelva un factor limitante. Se seleccionan placas con números de colonias bajos, es decir técnica y biológicamente confiables. Se cuentan todas las colonias de tipo objeto y no-objeto. En la validación primaria las colonias de ambos tipos se aíslan aleatoriamente para verificación. El número "no debería ser pequeño", lo que quiere decir mínimo 20 ó 30 de ambos tipos por muestra, si se encuentran disponibles. No es necesario que los dos tipos de colonia sean de las mismas diluciones si la selectividad no lo permite. Cuando la selectividad es alta (colonias objeto más del 90 %) puede ser innecesario aislar presuntas colonias negativas. En validación secundaria, sólo deben aislarse y verificarse presuntas colonias positivas. 11.4 DATOS NO PLANEADOS Se pueden emplear resultados de varias observaciones paralelas reunidos con el tiempo sin diseño especial como información adicional para apoyar o enmendar especificaciones de límite de trabajo superior o de sobredispersión.


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ANEXO A

PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS Y PROGRAMAS DE COMPUTADOR

A.1 INCERTIDUMBRE DEL RECUENTO La incertidumbre del recuento se calcula mediante la lectura de las mismas placas más de una vez. A partir de estos resultados, se puede calcular la desviación estándar o desviación estándar relativa. NOTA Puesto que los acrónimos de tres letras tales como RSD pueden ser confusos en las fórmulas matemáticas, en su lugar se emplea consistentemente la letra u como el símbolo para la desviación estándar relativa. Se supone una placa con el número (desconocido) x de colonias características, y se denota con x1, x2, ..., xn los números observados en el recuento de la placa por la misma persona repetidamente o por diferentes personas. La incertidumbre del recuento uZ se expresa como la desviación estándar relativa:

−=x

)x(suz

en donde

1

2

−

−

=∑

−

n

xxi

)x(s

En caso de recuento duplicado, la misma puede calcularse a partir de

21

212

xx

xxuZ

+

−=

Con el tiempo se debería tomar aleatoriamente un gran número de casos (placas) con mínimo 20 colonias, sin seleccionar los inusuales. La media cuadrática se toma como la incertidumbre de recuento relativo promedio calculada.

n

uuuuZ Zn...ZZ

222

21 ++=

Para un cálculo confiable, n debería ser mínimo 30.


37

Dependiendo de las personas que participan, se aplica la siguiente terminología; repetibilidad individual (o personal) resumen de los resultados de una persona que lea las mismas placas dos veces (o más): repetibilidad dentro del laboratorio valor promedio (cuadrático) ponderado de las repetibilidades individuales del personal de laboratorio; resumen de los resultados de recuento duplicado o réplica obtenidos por todas las personas; reproducibilidad dentro del laboratorio media (cuadrática) de resultados de varias personas del mismo laboratorio que leen las mismas placas; reproducibilidad entre laboratorios media (cuadrática) de resultados de personas de diferentes laboratorios que leen las mismas placas. Véanse los Ejemplos B.1, B.2 y B.3. A.2 ENSAYO GENERAL DE PROPORCIONALIDAD (LINEALIDAD) Se permite obtener n recuentos de colonia c1, c2,..., cn del estudio de la misma suspensión de ensayo en volúmenes o diluciones que se relacionan como los números R1, R2, ..., Rn

El cálculo de la relación de probabilidad logarítmica de la proporcionalidad (linealidad) de los recuentos puede calcularse a partir de

( )

−+−+=

∑∑∑−

R

clnxc

n

cnlncn...

Rc

lncRc

lncGn 22

221

11

21

Se adjunta un programa de BASIC para calcular G2. Se puede obtener un valor guía refiriéndose a las tablas de X2 con n -1 grados de libertad. Los valores que exceden un valor tabulado indican salida de la proporcionalidad en el nivel de probabilidad seleccionado. NOTA Esta fórmula puede emplearse también para ensayar la concordancia de placas paralelas dando el mismo número (por ejemplo R1= R2 = ...= Rn = 1) para cada volumen relativo. Por lo general, el resultado es casi el mismo que el índice Poisson de dispersión dado en A.3. _____________________________________________________________________________ Programa de BASIC para calcular el índice de relación de probabilidad logarítmica general G2 de acuerdo con A.2. Véase el Ejemplo B.5 10 PRINT "LIKELIHOOD RATIO INDEX G∧ 2"

20 INPUT "NUMBER OF TERMS, n =;N

30 C=0: R =0: S=0: T=0: D= O

40 FOR I=1 TO N


38

50 PRINT "I=";I

60 INPUT "COLONY COUNT= ";C

70 INPUT "RELATIVE VOLUME=";R

80 IF C=0 THEN W=0; GO TO 100

90 W=C*LOG(C/R)

100 S=S+W

110 T=T+R

120 D=D+C

130 NEXT I

140 Y=2*(S+D*LOG(D/T))

150 Y=(INT(1000*Y+0.5))/1000

160 PRINT

170 PRINT "INDEX G∧ 2=";Y

180 PRINT

190 PRINT

200 INPUT "ANOTHER SET? (Y/N)"; A$

210 IF A$="Y" OR A$="y" GOTO 20 ELSE 220

220 END

NOTA En la versión BASIC, LOG significa el logaritmo natural. En otras versiones se requiere el símbolo LN en las filas numeradas con 90 y 140. A.3 ÍNDICE DE DISPERSIÓN DE POISSON Se puede ensayar la aleatoriedad de los recuentos de colonia paralelos c1, c2, ...,cn de porciones iguales de una suspensión completamente mezclada mediante el cálculo del Índice de Dispersión de Poisson:

( )∑∑

∑∑

∑ ∑ −=−

=− ii

iiin c

c

cn

ci

ccnX

22

22

1

NOTA 1 Con frecuencia también se emplean para X2 los símbolos: D2, ?2 y T1 NOTA 2 En su lugar se puede aplicar la fórmula G2 general. La dispersión excesiva (sobredispersión) puede detectarse refiriéndose a una tabla de distribución ?2 con n - 1 grados de libertad.


39

Un valor X2 aislado tiene poca importancia, especialmente si el número de placas paralelas (n) es pequeño. Se recomienda estudiar un número grande (por lo menos 100) de conjuntos de placas paralelas sobre un período largo. Las muestras deberían representar diferentes fuentes y estaciones. Los valores X2 y sus grados de libertad son aditivos. Se puede ensayar la concordancia general de varios conjuntos de paralelos mediante la comparación de la suma de valores X2 con el valor teórico X2 con grados de libertad correspondiente a la suma de los grados de libertad. El ensayo es extremadamente poderoso. Cuando se cuenta con cerca de 100 valores X2, éstos también se pueden agrupar en clases de frecuencia, con límites de clase leídos de la Tabla ?2 apropiada. Las frecuencias observadas se pueden comparar con las frecuencias esperadas de acuerdo con la distribución teórica. La comparación de las distribuciones de frecuencia de dos métodos en esta forma es más comparativa que las simples sumas. (Véase el Ejemplo B.6). _____________________________________________________________________________ Programa de BASIC para calcular el índice de Dispersión de Poisson X2 de acuerdo con el literal A.3. Véase el Ejemplo B.6 10 PRINT "DISPERSION INDEX X∧ 2" 20 INPUT "NUMBER OF PARALLELS, n =;N 30 S1=0: S2 =0 40 FOR I=1 TO N 50 PRINT "I=";I 60 INPUT "COLONY COUNT= ";C 70 S1= S1+C 80 S2 = S2+C∧ 2 90 NEXT I 100 X= (N*S2-S1∧ 2)/S1 110 X2= (INT (1000*X+0.5))/1000 120 PRINT 130 PRINT "INDEX X∧ 2=";X2 140 PRINT 150 INPUT "ANOTHER SET? (Y/N)";A$ 160 IF A$="Y" OR A$= GOTO 20 ELSE 170 170 END


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ANEXO B

EJEMPLOS NUMÉRICOS

B.1 GENERALIDADES Los ejemplos B.1, B.2 y B.3 tienen que ver con la repetibilidad y reproducibilidad del recuento, es decir, los resultados de la lectura de las mismas placas realizada por una ó más personas. El ejemplo B.4 está conectado con la robustez de los resultados con respecto al tiempo de incubación. El Ejemplo B.5 ilustra un análisis de linealidad, el Ejemplo B.6 muestra formas de emplear la información contenida en placas paralelas y el Ejemplo B.7 ilustra el cálculo de la constante de sobredispersión de los datos de ensayo paralelo. Los ejemplos presentados en B.1 a B.3 ilustran los cálculos recomendados siempre que se cuente con resultados de recuento duplicado o de réplica. Tales resultados se basan en la lectura de las mismas placas repetidamente bajo condiciones uniformes, es decir, dentro de un intervalo de tiempo claramente más corto que la supuesta tolerancia permitida para el método. En la práctica, esto significa un intervalo máximo de 1 h. Dependiendo de las personas que participen, los mismos cálculos formales (véase el literal A.1) producen cálculos de diferente cobertura. Se deberían seleccionar aleatoriamente las placas para recuento repetido, ignorando las placas con menos de 20 colonias. De otro modo, las placas recogidas deberían representar el intervalo de aplicación completo del método. Para un cálculo general razonablemente confiable, se debería contar con mínimo 30 casos. La repetibilidad entre laboratorios se estudia mejor transportando personas a sesiones comunes que poniendo a circular placas. NOTA En la tarea de recuento microbiológico más sencilla, la del recuento de colonias de un cultivo puro con colonias de tamaño medio regular en filtros de membrana, se puede esperar que el recuento sea repetible con una desviación estándar mejor que el 2 % (RSD < 0,02). Esto se aplica casi por igual cuando una persona o diferentes personas de diferentes laboratorios repiten el recuento, hasta varios cientos de colonias por placa. Cuando se deben identificar las colonias objetos en una población mixta sobre la base de color, tamaño, forma, textura o reacciones con el medio de crecimiento, la tarea es más difícil. Con frecuencia, un apersona puede repetir el recuento con bastante precisión pero las desviaciones entre diferentes personas se hacen mayores. No se ha decidido que tan grande una incertidumbre es tolerable. La desviación estándar relativa mayor que 0,1 (cinco a diez veces el RSD del recuento de cultivo puro) es una señal cierta de problemas o dificultades. B.2 EJEMPLO B.1 - REPETIBILIDAD PERSONAL DE RECUENTO B.2.1 Generalidades En el siguiente ejemplo de datos reales en recuentos de colonia totales sobre medios no selectivos, la desviación estándar de repetibilidad fue la mayoría de las veces mayor que la "ideal" (RSD < 0,02) a la que se hizo referencia anteriormente. Las personas A y B, trabajando en el mismo laboratorio de manera independiente, leen diferentes placas dos veces dentro de un intervalo corto de tiempo. Los recuentos duplicados se denotan por ?1 y ?2.


41

B.2.2 Cálculos Primero se calcula la media (m) y desviación estándar (s) de cada par. A partir de estos se obtienen los valores de RSD = s/m (penúltima columna).

Placa ?1 ?2 m s RSD Persona 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

129 417 73 49 86 37 112 204 66 306

122 377 80 52 81 39 115 214 71 299

125,5 397,0 76,5 50,5 87,5 38,0

113,5 209,0 68,5

302,5

4,95 28,28 4,95 2,12 3,54 1,41 2,12 7,07 3,54 4,95

0,039 4 0,071 2 0,064 7 0,042 0 0,042 3 0,037 2 0,018 7 0,033 8 0,051 6 0,016 4

A A A A B B B B B B

Los cálculos personales de media de repetibilidad se obtienen de la siguiente manera: Persona A:

05604

00420706400712040390 2222,

,,´,,RSDA =

+++=

Persona B:

03606

4016030420 22,

,...,RSDB =

++=

A fin de obtener la desviación estándar relativa agrupada ponderada en el laboratorio donde A y B son los técnicos, la media cuadrática de todos los diez valores puede calcularse de la misma manera:

046010

401602071040390 222,

,...,,RSDC =

+++=

Un cálculo agrupado no ponderado podría ser más apropiado. Se puede obtener tomando la media cuadrática de las medias personales:

04702

036005602

2222,

,,RSDRSDRSD bA

C =+

=+

=

B.3 EJEMPLO B.2 - CÁLCULO DE REPETIBILIDAD AGRUPADO: ANÁLISIS DE VARIANZA Los valores promedio para una persona o el laboratorio como un todo también se pueden obtener mediante análisis de varianza de una vía. Los recuentos de colonia ?1 y ?2. en el Ejemplo B.1 se convierten primero a sus valores-ln y se calculan las varianzas entre placas y dentro de cada una de ellas.


42

A continuación se muestra el análisis de varianza de todos los resultados de repetibilidad:

DF SS MS Entre placas Dentro de las placas

9 10

10,4817 0,019,0

1,164,6 0,0019

de donde DF grados de libertad; SS suma de cuadrados; MS media cuadrática (varianza)

La MS dentro de las placas representa la repetibilidad ponderada agrupada. La desviación estándar para la repetibilidad es la raíz cuadrada de la media cuadrática dentro de placas (puesto que la desviación estándar en escala ln corresponde aproximadamente a la desviación estándar relativa en la escala aritmética).

044090010 ,,RSDC ==

Si el valor es alto (mayor a 0,1) puede ser útil regresar a la tabla para examinar los valores RSD individuales en búsqueda de las razones. Un valor grande accidental puede ser el responsable, o puede estar presente una tendencia en el recuento de colonia promedio. Estos se ilustran mejor gráficamente mediante la representación de los valores RSD contra el recuento de colonia. Se requiere la repetibilidad del recuento personal o dentro del laboratorio como valor base al calcular otras características de robustez tales como la sensibilidad al tiempo o la reproducibilidad del recuento. El valor ideal de 0,02 frecuentemente es demasiado optimista. B.4 EJEMPLO B.3 - REPRODUCIBILIDAD DE RECUENTO ENTRE LABORATORIOS Se reunieron dos personas (A1, A2) del laboratorio A y tres (B1, B2, B3) del laboratorio B en una sesión de recuento de colonias organizada por el laboratorio B. Se tomaron placas de agar estándar de determinaciones de rutina y fueron leídas por cada participante. Se omitieron las placas con menos de 30 colonias. En la lista a continuación se muestran los resultados de seis placas.

Placa A1 A2 B1 B2 B3 Media RSD 1 2 3 4 5 6

33 160 142 78 89 38

26 156 128 97 94 44

33 166 142 81 81 38

34 176 146 81 94 42

33 174 139 83 92 40

31,8 166,4 139,4 84,0 90,0 40,4

0,102 9 0,052 0 0,049 1 0,089 1 0,060 3 0,064 5

Seis placas son demasiado pocas para un cálculo general confiable, pero ilustran los cálculos. La media cuadrática de las desviaciones estándar relativas es

407206

506403060010890049100052091020 222222,

,,,,,,RSDC =

+++++=

En comparación con la reproducibilidad del recuento dentro de un laboratorio (Ejemplos B.1 Y B.2) el valor obtenido en este experimento conjunto fue casi dos veces dicho valor. El análisis de la varianza puede emplearse en la búsqueda de diferencias sistemáticas entre personas o entre laboratorios.


43

B.5 EJEMPLO B.4 - ROBUSTEZ: SENSIBILIDAD AL TIEMPO DE LOS RECUENTOS DE COLONIAS

La dependencia del recuento de colonias del tiempo de incubación se puede ensayar fácilmente contando las mismas placas dos veces: en los dos tiempos de incubación extremos permitidos por el método. En el análisis coliforme total mediante el método de filtración de membrana (FM) de acuerdo con ISO, las membranas deberían incubarse durante 18 h a 24 h a una temperatura especificada. A fin de ensayar la validez de los límites dados, se ensayaron cinco muestras de agua mediante el método de FM. Se contaron las placas con números "confiables" de colonias después de 18 h y 24 h. A continuación se enuncian los resultados:

Muestra Recuento después de 18 h Recuento después de 24 h Cambio % 1 2 3 4 5

90 44 70 8

29

93 88 69 49 69

+3 +100

-2 +613 +238

En sólo dos muestras (1 y 3), la diferencia entre recuentos después de 18 h y después de 24 h encaja dentro de la repetibilidad normal del recuento (CV= 3 % a 4 %) ilustrada por los Ejemplos B.2 Y B.3. Por lo general no es necesario probar los resultados de tales experimentos estadísticamente. En principio, es suficiente una clara excepción para rechazar la hipótesis de robustez. En este ejemplo, cada una de las muestras 2, 4 y 5 indicaron que el recuento cambia demasiado dentro del supuesto intervalo aceptable. El resultad de este ejemplo debería interpretarse de modo que se reconsideren las especificaciones para tolerancia del tiempo de incubación o el objeto del método. B.6 EJEMPLO B.5 - ANÁLISIS DE UN ENSAYO DE PROPORCIONALIDAD: LÍMITE

SUPERIOR DEL DESEMPEÑO DEL DETECTOR B.6.1 Generalidades Se diluyó previamente una muestra natural hasta el nivel adecuado después de lo cual se preparó una serie de dilución de seis pasos sucesivos de 1:2 de acuerdo con el plan presentado en el Anexo C. Se elaboraron tres placas paralelas de cada dilución empleando la técnica de siembra superficial. Se contaron las colonias después de dos días de incubación.

Dilución Recuentos paralelos Suma

Si

Volumen relativo VR, i

Proporción

Si/ VR, i 2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6

121 109 111 56 36 11

204 128 114 60 29 13

163 148 97 68 24 17

487 385 322 184 89 41

32 16 8 4 2 1

15,22 24,06 40,25 46,00 44,50 41,00

Total: 1 508 63


44

B.6.2 ENSAYO DE PROPORCIONALIDAD GENERAL A fin de ensayar la proporcionalidad general ("linealidad") de los recuentos de colonias y el volumen de muestra, basta con calcular el índice de relación de probabilidad logarítmica (G2) para la concordancia de las sumas de números de colonias paralelas con los respectivos volúmenes relativos. Los recuentos deberían concordar con las series geométricas 32/16/8/4/2/1. La estadística de ensayo tiene 6-1=5 grados de libertad. De acuerdo con la fórmula (véase el Anexo A, ítem A.2):

[ ]526,292

)63/5081(ln508)1/41(ln41)2/89(ln89)4/184(ln184)8/322(ln322)16/385(ln385)32/487ln(48725

=−+++++=G

Se compara el valor del índice con la distribución ?2 con cinco grados de libertad. El valor calculado excede el valor teórico para 0,1 % (20,515), lo cual significa que la linealidad general de los resultados es extremadamente deficiente. (La conclusión es obvia en este caso incluso sin cálculo, y se puede alcanzar por simple observación de las sumas en la tabla). Obviamente la proporción 2:1 entre diluciones sucesivas no se realiza en los recuentos de colonia. Por lo tanto, la conclusión es que el sistema detector no fue lineal en esta muestra en el intervalo de recuento de colonia desde 41/3=14 hasta 483/3=161 colonias por placa. A partir de la inspección de las sumas, o incluso más claramente de los recuentos por volumen relativo (Si /Vi), se puede concluir que los números elevados de colonia se desvían la mayoría de lo esperado. El detector se ha vuelto no funcional incluso por debajo de 160 colonias por placa. Se puede obtener un número de valores por pareja con ensayos de proporcionalidad similar realizados en diferentes muestras: el recuento promedio más alto (161 en este caso) y el valor de índice de dispersión observado (G2 = 292,526 en este caso).La representación de los valores índice en gráficos de guía ayuda a determinar el más alto recuento de colonia cuando la proporcionalidad del método es suficiente. En la Figura B.1 se examina de esta manera un ejemplo de 14 muestras. Se seleccionó un valor de guía arbitrario de 15,09 (1% de probabilidad) y se mostró mediante una línea horizontal. Los puntos por encima de la línea pertenecen a la serie con proporcionalidad deficiente. El eje horizontal (cmáx) presenta el recuento promedio por placa de la dilución más baja incluida en el ensayo de proporcionalidad. Las líneas horizontal y diagonal se intersectan en el número de colonia promedio donde la probabilidad de proporcionalidad "adecuada" se hace menor del 1 %. La linealidad se mide en términos de G2 .cmáx = recuento promedio de colonia por placa de la dilución con más altos números de colonia. La conclusión no siempre es tan obvia como en este ejemplo. Se puede requerir un análisis más detallado a fin de explicar la falta de proporcionalidad. NOTA 1 El empleo de los presupuestos razonables mencionados anteriormente respecto a que todas las series incluidas en el estudio de proporcionalidad tienen el mismo número de diluciones contables (grados de libertad). Si ocurriera que todas las series no tuvieran el mismo número de diluciones contables, se debería emplear otra medida de proporcionalidad I = G2/(n-1). El valor de guía se hace un poco más vago en esta instancia puesto que I = ?2/(v) no es una constante pero depende de los grados de libertad (v). NOTA 2 I = ?2/(v) generalmente denominada la proporción Lexis, en honor del economista alemán Lexis. Frecuentemente se denotó por el símbolo L.


45

2000

0

150

50

100

400 600 800

G²

índi

ce

REF X21

C G5máx. máx.C

Figura B.1. Linealidad de serie de recuentos a partir de seis diluciones binarias sucesivas de 14 muestras

Para ensayar con mayor detalle donde ocurre la pérdida de linealidad, se puede subdividir el índice total G5

2=292,526 en comparaciones ortogonales avanzando o descendiendo poco a poco en la tabla y formando sucesivamente los contrastes para cada suma individual, con todas las sumas por debajo de dicho índice tomadas en conjunto. B.7 EJEMPLO B.6 -DATOS DE PLACAS PARALELAS B.7.1 Generalidades Los datos en recuentos de placa paralelos se corrigen con facilidad. Estos resultan útiles para la validación del método puesto que la diferencia técnica entre placas paralelas consiste en casi nada más que errores de volumen al pipetear. A menos que algo esté radicalmente erróneo en la técnica de pipeteo, la incertidumbre del volumen prácticamente desaparece entre la dispersión aleatoria de partículas (véase el numeral 6.1). La concordancia estadísticas (aleatoriedad) de un conjunto de placas paralelas puede medirse calculando el índice de dispersión de Poisson de acuerdo con el literal A.3 o el índice de relación de probabilidad logarítmica de acuerdo con el literal A.2. Si se observa desacuerdo substancial con la aleatoriedad de Poisson, casi con seguridad la causa será algo diferente a la inexactitud del pipeteo. De esta manera, el análisis de datos de placas paralelas puede servir par los propósitos de validación del método. Se puede emplear un valor de índice individual para evaluar la confiabilidad estadística del conjunto de placas paralelas en particular. Un valor de índice excesivamente alto, en comparación con la distribución ?2, puede indicar que la media de dicho conjunto no es confiable. De esta forma, el índice de dispersión de Poisson es una herramienta de AQC importante.


46

De mayor importancia es que los valores índice reunidos de un gran número de muestras diferentes pueden emplearse para orientación acerca de los aspectos de desempeño del método. Los datos de dos métodos brindan una oportunidad de comparar su confiabilidad relativa, y la validación secundaria se beneficiará de una comparación con especificaciones desarrolladas durante la validación primaria. B.7.2 DISTRIBUCIONES DE FRECUENCIA DE ÍNDICES DE POISSON La siguiente tabla muestra las primeras pocas filas de datos de recuentos paralelos (B1, B2) de sesenta muestras. Éstas representaban una amplia serie de concentraciones de partícula. El índice de dispersión de Poisson (?2) se calculó para cada conjunto paralelo de acuerdo con el literal A.3.

Suspensión B1 B2 ?2

1 2 3 4 5

etc.

256 228 89 27

143

302 146 108 29

129

3,792 17,979 1,832 0,071 0,721

Por ejemplo, el primer par de resultados del valor ?2 se obtuvo del cálculo:

( )

79233022563022563022562

222

,)(X =+−++

=

El índice tiene una distribución estadística teórica. La distribución de índices observada puede compararse con la expectativa teórica mediante la anotación de la frecuencia de los valores índice de diferente tamaño. Estos límites de clase se obtienen de los puntos de porcentaje de la distribución ?2. Para hacer esto, se deben consultar los puntos de porcentaje de la distribución ?2

con los grados apropiados de libertad (uno menos que el número de paralelos). Este caso, es necesaria la tabla para un grado de libertad. Puntos de porcentaje P de la distribución ?2 para un grado de libertad:

P 0,95 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,05 X2 0,004 0,016 0,064 0,148 0,256 0,455 0,722 1,07 1,62 2,71 3,84

La forma más simple de emplear la tabla consiste en construir límites de clase para una distribución uniforme de frecuencias esperadas. Por ejemplo, de todos los valores índice, se espera que el 20 % encaje por casualidad en cada una de las cinco clases con los siguientes límites:

Clase 1 0 a 0,064 Clase 2 0,064 a 0,256 Clase 3 0,256 a 0,722 Clase 4 0,722 a 1,62 Clase 5 > 1,62

La frecuencia esperada en cada clase depende del número de casos estudiados. Con 60 casos (ejemplo a continuación), la expectativa sería que 12 observaciones encajaran en cada clase. De manera similar se pueden construir distribuciones que no sean uniformes. En el ejemplo a continuación se muestra una construcción diferente. Los datos se dividieron en seis clases, con el 5 %, 15 %, 30 %, 30 %, 15 % y 5 % de casos esperados en las clases respectivas.


47

Los datos mostrados en el caso de ejemplo son para un método particular (Método A). Otro método (Método B) se ensayó simultáneamente en las mismas suspensiones exactamente en la misma forma, También se calcularon y se reunieron en las clases de frecuencia los índices de dispersión de las placas paralelas con dicho método. En la Tabla B.1 se presentan los resultados

Tabla B.1. Comparación de las frecuencias observadas de los índices de dispersión de dos métodos con expectativa teórica

Frecuencia observada Clase de frecuencia Límite de clase

superior Frecuencia esperada

Método A Método B 1 0,004 3 1 2 2 0,064 9 3 7 3 0,455 18 10 10 4 1,64 18 15 22 5 3,84 9 10 10 6 >3,84 3 21 9 Total 60 60 60

Obviamente, las determinaciones paralelas del Método B son más cercanas a las expectativas teóricas. El ajuste podría probarse mediante el ensayo clásico de bondad del ajuste de Pearson en caso de que en las especificaciones se haya indicado acuerdo con la distribución de Poisson. Si, de otro modo, los Métodos A y B son equivalentes, la observación claramente favorece la opción del Método B. Una inspección más detallada de los valores índice podría revelar las razones para la excesiva cantidad de valores elevados con el método A. Si se encuentra correlacionada con los recuentos de colonia, se podría emplear como información adicional acerca del límite de trabajo superior del método. B. 8 EJEMPLO B.7 - CÁLCULO DEL COMPONENTE DE SOBREDISPERSIÓN U A PARTIR

DE DATOS DE RECUENTO PARALELO Siempre que se cuente con observaciones paralelas en forma de datos de recuento sin transformar, se puede emplear el principio descrito en el numeral 6.2.3 [ecuación (12)] para calcular el componente adicional (sobredispersión) del procedimiento analítico. El siguiente ejemplo se basa en un ensayo de desempeño de método multicentral. Más de 50 laboratorios participaron. Se tomaron los resultados de doce laboratorios para ilustrar los cálculos. Cada laboratorio estudió una muestra por su cuenta. De antemano, sólo se acordó que la muestra debía representar el mismo tipo de material (agua de desecho municipal). Todos emplearon el mismo procedimiento analítico, excepto que cada laboratorio tenía completa libertad en cuanto a la forma cómo mezclar y diluir la muestra que habían tomado. Como consecuencia, los resultados de diferentes laboratorios tuvieron recuentos de colonia promedio bastante diferentes en las diluciones que tenían para recuento. El diseño experimental constó de cuatro series de dilución elaboradas de la suspensión de muestra homogenizada. Se preparó una placa por dilución. Se dio instrucciones a los laboratorios para que escogieran la misma dilución en todas las cuatro series para recuento.


48

Tabla B.2. Resultados de diferentes laboratorios

Resultados paralelos Laboratorio C1 C2 C3 C4

c Varianza VTM

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12

198 155 58 37 124 28 167 10 66 8

204 162

233 145 53 42 106 17 238 12 84 13 186 141

218 150 64 38 92 11 213 13 94 7

225 166

254 131 66 31

117 20

206 8 71 5

216 199

225,8 145,3 60,3 37,0

109,8 19,0

206,0 10,8 78,8 8,3

207,8 167,0

506,2 106,9 34,9 20,7 194,9 50,0 864,7 4,9

160,9 11,6 284,2 575,3

2,48 0,75 0,58 0,56 1,78 2,63 4,20 0,46 2,04 1,40 1,37 3,45

c= recuento promedio por placa VTM= proporción varianza-a-media ("proporción Lexis")

De acuerdo con el principio dado en el numeral 6.2.3, se espera que la línea de regresión de VTM (=Y) en c tenga la forma:

Y = 1 + u2 c Así la pendiente de la línea ofrece un cálculo de la constante de sobredispersión al cuadrado. Las medias y varianzas se basaron en un pequeño número (4) de paralelos. Se espera considerable dispersión aleatoria en sus cálculos de proporción. Este hecho es claramente evidente cuando se representan los resultados de este experimento (véase la Figura B.2).

0

0,3

1,1

80

Y

4,3

1,9

160

Número de recuentos

240

2,7

3,5

Figura B.2. Dependencia de la proporción varianza-a -media en el recuento de colonia promedio en un experimento con muestras de agua de desecho

Cada punto representa una muestra estudiada por un laboratorio diferente. Las medias y varianzas se basaron en recuentos de colonia sin transformar en cuatro determinaciones paralelas de una suspensión de ensayo.


49

Debido a la gran dispersión, existe considerable duda de si la línea de regresión representa exactamente la verdadera relación. Se necesitarían más datos para calcular la pendiente con un alto grado de confiabilidad. No obstante, se puede continuar el cálculo, a fin de ilustrar el método. La línea de regresión de los cuadrados mínimos ajustada a los puntos de los datos tiene la ecuación:

Y = 0,09 + 0,007 66c La constante (0,09) está muy cerca del valor esperado de 1,0. La pendiente presenta el valor de sobredispersión al cuadrado u2= 0,007 66. Por consiguiente, la variación excesiva como desviación estándar relativa es u= 0,088. La pendiente no es significativa estadísticamente. No se ha demostrado de manera convincente que existan fuentes de variación además de la distribución de Poisson. no es aconsejable proceder más allá en la interpretación. no obstante, el resultado es lo suficientemente interesante para poder concluir que vale la pena el esfuerzo de reunir más datos similares para poder calcular la pendiente con mayor confiabilidad. NOTA Los componentes de incertidumbre que contiene la constante de sobredispersión dependen del plan experimental. Los principales factores que pudieron haber causado variación adicional en este plan experimental particular fueron:

- posible falta de mezcla perfecta de muestras;

- errores aleatorios volumétricos en las diluciones;

- incertidumbre de recuento personal. El valor de la constante 0,088 significa que el componente adicionado es sólo aproximadamente ±9 %. La heterogeneidad de la muestra, las incertidumbres volumétricas acumuladas y la repetibilidad del recuento personal combinados pueden interpretarse como aún dentro de los límites aceptables. En este plan, donde cada laboratorio empleó una muestra propia, no se puede aprender nada acerca de la competencia de los diferentes laboratorios. Han desaparecido todas las diferencias en la recuperación relativa, la interpretación de la apariencia de la colonia y el funcionamiento de los medios nutrientes. A fin de incluir estos factores, todos los laboratorios deberían haber estudiado una muestra idéntica y haber seguid procedimientos idénticos. Si los resultados paralelos habían sido recuentos paralelos del mismo recipiente de dilución final, entonces el factor de sobredispersión no habría incluido heterogeneidad del material e incertidumbre de la dilución. Las únicas fuentes adicionales restantes habrían sido el pipeteo y el recuento.


50

ANEXO C

EJEMPLO DE EXPERIMENTO DE VALIDACIÓN

C.1 RECUENTO DE PLACA Y SIEMBRA SUPERFICIAL (repetidos para diferentes muestras)

Suspensión básica

Dilución

1:2

C C C C

1:2

C C

1:2

C C

1:2...

Diluciones dobles(ej: 7 pasos de

dilución repetido)

Siembra por triplicado

Conteo por diferentes personas

Repetido para diferentesmétodos

C.2 FILTRACIÓN DE MEMBRANA (repetida para diferentes muestras)

Suspensión básica

Filtración de un volúmen graduado finamente

(ej: diferentes volúmenes)

C C

1 x a ml

C C C C

C CC C C C

2 x a ml

C CC C C C

3 x a ml

n x a ml

C CC C C C

...

Repetido para diferentes métodos





NOTA Cualquier dato disponible de recuento en réplica o placas paralelas se puede emplear para estudiar los detalles específicos de la validación. Se deberían probar la sensibilidad y selectividad antes de emplear este diseño.


51

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