groene diesel uit blauwwieren bacteriële dieselolie · 2014. 5. 22. · figuur 1. hoofddoel van...

Resultaten en bevindingen van project

Groene diesel uit blauwwieren Bacteriële Dieselolie

Dit rapport is onderdeel van de projectencatalogus energie-innovatie. Tussen 2005 en 2011 kregen ruim 1000 innovatieve onderzoeks- en praktijkprojecten subsidie. Ze delen hun resultaten en bevindingen, ter inspiratie voor nieuwe onderzoeks- en productideeën. De subsidies werden verleend door de energie-innovatieprogramma's Energie Onderzoek Subsidie (EOS) en Innovatie Agenda Energie (IAE).

Datum Mei 2012 Status Definitief Genetwister Technologies, e.a. in opdracht van Agentschap NL

Resultaten en bevindingen van project

Groene diesel uit blauwwieren Bacteriële Dieselolie

Dit rapport is onderdeel van de projectencatalogus energie-innovatie. Tussen 2005 en 2011 kregen ruim 1000 innovatieve onderzoeks- en praktijkprojecten subsidie. Ze delen hun resultaten en bevindingen, ter inspiratie voor nieuwe onderzoeks- en productideeën. De subsidies werden verleend door de energie-innovatieprogramma's Energie Onderzoek Subsidie (EOS) en Innovatie Agenda Energie (IAE).

Datum Mei 2012 Status Definitief Genetwister Technologies, e.a. in opdracht van Agentschap NL

Colofon

Projectnaam Groene Diesel uit blauwwieren, Bacteriële Dieselolie Programma Energie Onderzoek Subsidie Regeling Lange Termijn Projectnummer EOSLT07039 Contactpersoon Genetwister Technologies B.V. Hoewel dit rapport met de grootst mogelijke zorg is samengesteld kan Agentschap NL geen enkele aansprakelijkheid aanvaarden voor eventuele fouten.

OOOpppeeennnbbbaaaaaarrr rrraaappppppooorrrttt EEEOOOSSSLLLTTT 000777000333999

GGGrrroooeeennneee dddiiieeessseeelll uuuiiittt bbblllaaauuuwwwwwwiiieeerrreeennn BBBaaacccttteeerrriiiëëëllleee DDDiiieeessseeelllooollliiieee

EEEnnneeerrrgggiiieee OOOnnndddeeerrrzzzoooeeekkk SSSuuubbbsssiiidddiiieee::: LLLaaannngggeee TTTeeerrrmmmiiijjjnnn

EOSLT 07039 Bacteriële Dieselolie Openbaar rapport

2

Inhoudsopgave 1. Projectgegevens............................................................................................................. 3

2. Samenvatting ................................................................................................................. 4

3. Inleiding en Doelstelling .................................................................................................. 5

Cyanobacteriën en algen als producenten van inhoudsstoffen .................................. 5

Biobrandstoffen in cyanobacteriën en algen .............................................................. 5

Doelstellingen en strategieën van het project ............................................................. 5

Gamma-component ................................................................................................... 8

4. Resultaten en Discussie ................................................................................................. 9

Cultivatie van de cyanobacterie PCC 7942 in een fotobioreactor .............................. 9

Metabole profielen van cyanobacteriën door GC-MS ...............................................10

Genetische codes van twee cyanobacterie soorten ..................................................11

Lipide productie in modelsysteem E. coli na transformatie met ACCase genen uit PCC 7942 .................................................................................................................13

Introductie van nieuwe genen in PCC 7942: Opzetten van transformatie ..................14

Metabolic engineering van PCC 7942 .......................................................................15

Sociaal economisch onderzoek ................................................................................19

5. Conclusie en aanbevelingen .........................................................................................21

6. Knelpunten ....................................................................................................................22

7. Bijdrage aan de EOS: Lange Termijn doelstellingen ......................................................23

Bijdrage aan een duurzame energiehuishouding ......................................................23

De versterking van de kennispositie in Nederland .....................................................23

8. Referenties ....................................................................................................................24


3

1. Projectgegevens Projectnummer: EOSLT 07039 Projecttitel: Groene diesel uit blauwwieren. Korte titel: Bacteriële Dieselolie Penvoerder: Genetwister Technologies B.V., Wageningen Medeaanvragers: Moleculaire Microbiologie, Rijksuniversiteit Leiden;

Plant Metabolomics, Rijksuniversiteit Leiden Adviseur: LGem, Den Haag Gamma-component: Critical Technology Construction, Wageningen UR Projectperiode: 1 oktober 2008 t/m 29 februari 2012 Verslagdatum: 31 mei 2012 Contactpersoon: Dr. Simon Langeveld Telefoon: 0317 466 424 / 0317 466 420 E-mail: [email protected]


4

2. Samenvatting Biodiesel wordt tot nu toe uit dierlijk vet, plantaardige olie en recenter ook uit groene algen gehaald. De voordelen van biodiesel ten opzichte van fossiele brandstof zijn duidelijk: de productie is duurzamer want hernieuwbaar, het vermindert de CO2 uitstoot en het is biologisch afbreekbaar. Het project Groene Diesel uit Blauwwieren richtte zich op een andere kandidaat voor de productie van biodiesel: cyanobacteriën. Net als planten en groenalgen zijn deze bacteriën in staat om zonne-energie te gebruiken om koolstofdioxide vast te leggen in organische verbindingen, waaronder vetzuren en vetten (lipides). Cyanobacteriën zijn de efficiëntste gebruikers van zonne-energie die in de natuur voorkomen: ze groeien sneller dan groenalgen en hebben relatief weinig nodig om te groeien. Ze bevatten echter relatief weinig lipides, de basis voor biodiesel, en hun lipides hebben ook een andere samenstelling dan die van planten en groenalgen. Daarom is in dit project onderzoek uitgevoerd om het gehalte aan vetzuren en lipides in cyanobacteriën te verhogen en de samenstelling aan te passen voor het gebruik als dieselolie. Het onderzoek voltrok zich op verschillende niveaus. Analyses van de stofwisseling van cyanobacteriën en genetische gegevens werden gecombineerd om een cyanobacterie aan te passen om meer en andere lipides te produceren (metabolic engineering). De verschillende inhoudstoffen, en met name lipides, in verschillende cyanobacterie soorten zijn geïnventariseerd. De totale genetische codes van twee cyanobacterie soorten zijn opgehelderd, waarbij unieke genen voor deze soorten zijn geïdentificeerd. Naast de cyanobacteriën is ook een studie begonnen van de productie van biodieselverbindingen in twee soorten groenalgen. Het was de bedoeling om de productie routes voor biodiesel uit deze algen over te brengen naar een cyanobacterie, maar door diverse technische problemen is dit niet geslaagd. Als alternatief zijn biodieselgenen uit andere organismen, planten en bacteriën, ingebracht. We hebben ook gericht genen van de cyanobacterie zelf geselecteerd en aangepast om de gewenste verhoging van de lipides te bewerkstelligen. Hiervoor moesten technieken voor het inbrengen en aanpassen van genen ontwikkeld worden. Tenslotte is tevens een meer willekeurige benadering gekozen, waarbij allerlei mutaties zijn aangebracht in de cyanobacterie. De mutanten zijn gescreend op verhoogde lipide gehaltes en andere veranderingen, die interessant kunnen zijn voor biobrandstof-productie of opwerking. Het is nog niet gelukt om biodiesel in de cyanobacterie te maken, maar de aanpassingen die nu gemaakt zijn, kunnen een basis zijn voor verdere veranderingen die leiden tot een bruikbare cyanobacterie stam voor de productie van biobrandstof. Er zijn interessante mutanten gevonden met een potentiële verhoging van het lipide gehalte en versnelde sedimentatie in het kweekmedium. De laatste eigenschap is interessant, omdat het de mogelijkheid biedt om met minder inspanningen de cellen te oogsten. De mutanten moeten nog verder gekarakteriseerd worden, voordat ze toegepast kunnen worden bij de productie van biobrandstof. Naast biobrandstof kunnen cyanobacteriën in potentie ook toegepast worden voor de synthese van andere bulkchemicaliën. De aangepaste cyanobacteriën en de ontwikkelde technieken in dit project vormen een modelsysteem voor de verdere ontwikkeling van biobrandstoffen en ‘groene’ chemicaliën.


5

3. Inleiding en Doelstelling

Cyanobacteriën en algen als producenten van inhoudsstoffen Algen en cyanobacteriën staan volop in de belangstelling vanwege hun brede toepassingsmogelijkheden. Net als planten zijn deze organismen via fotosynthese in staat het broeikasgas kooldioxide vast te leggen voor de productie van glucose dat als uitgangspunt dient voor allerlei potentieel interessante verbindingen in de cel. Omdat alleen zonlicht, CO2, water en anorganische stoffen nodig zijn voor de vorming van biomassa en inhoudsstoffen zijn algen en cyanobacteriën in principe uitermate geschikt voor het duurzaam produceren van onder meer biobrandstoffen, bulkchemicaliën, visvoer, voedingssupplementen en pharmaceuticals (Quintana et al., 2011; Ducat et al., 2011; Wijffels & Barbosa, 2010). Er is een aantal voordelen van het inzetten van deze micro-organismen ten opzichte van landplanten: hun productiviteit per hectare is groter, waardoor kleinere arealen nodig zijn; er hoeft geen landbouwgrond gebruikt te worden; er is geen concurrentie met de productie van voedselgewassen; het watergebruik is minder en afvalwaterstromen kunnen worden gebruikt. Na de extractie van de waardevolle inhoudsstoffen, kan de restmassa verder gebruikt worden voor bijvoorbeeld productie van biogas door anaerobe fermentatie.

Biobrandstoffen in cyanobacteriën en algen Het project Groene Diesel uit Blauwwieren is erop gericht om vervangers van fossiele dieselolie te produceren in cyanobacteriën. Met cyanobacteriën kunnen verscheidene types biobrandstoffen gegenereerd worden zoals ethanol, waterstof, electriciteit, biogas, alkanen en vetzuren (Quintana et al., 2011). Hoewel er in principe vele alternatieve energiebronnen zijn die de gestaag afnemende voorraden van fossiele brandstof kunnen vervangen, is voor transportbrandstof een vervanger nodig met een hoge energie-inhoud om de tankgrootte te beperken en die compatibel is met de bestaande infrastructuur. Lipides zijn voor de hand liggende transportbrandstofmoleculen, omdat ze een hoge energie-inhoud hebben en ook de basis zijn van de huidige fossiele brandstoffen, die oorspronkelijk gevormd zijn door algen. Cyanobacteriën bevatten andere soorten lipides dan algen. Groenalgen kunnen oliedruppels maken, die na industriële verwerking (transesterificatie) bruikbaar zijn als biodiesel. Een nadeel is, dat groenalgen alleen deze olie vormen als ze een tekort aan voedingsstoffen hebben (vooral stikstof), waardoor ze dan ook niet meer groeien en de productiecapaciteit dus verlaagd wordt. Cyanobacteriën hebben lipides in hun membranen die ook door transesterificatie vrijgemaakt kunnen worden, maar het gehalte is relatief laag (~10% van het drooggewicht). Cyanobacteriën zijn evolutionair gezien eenvoudiger micro-organismen dan groenalgen. Voor een aantal cyanobacteriële soorten is genetische modificatie (GM) eenvoudig uitvoerbaar. Van veel cyanobacteriële soorten is de complete genetische code bekend. Cyanobacteriën hebben minder nutriënten nodig om te groeien en hebben een kortere delingstijd, waardoor sneller biomassa kan worden gekweekt. Deze voordelen van cyanobacteriën boven groenalgen hebben geleid tot het project, waarin onderzocht is hoe de productie van lipides door cyanobacteriën met behulp van metabolic engineering en willekeurige mutaties kan worden verhoogd en of de lipidesamenstelling kan worden aangepast zodat deze beter bruikbaar is als biobrandstof.

Doelstellingen en strategieën van het project Binnen dit project is gekozen voor drie strategieën om de lipideproductie van cyanobacteriën te verhogen dan wel de lipidesamenstelling te veranderen, zodat deze geschikter is voor gebruik als biobrandstof (Figuur 1). De eerste strategie richtte zich op verhoging van de productie van vetzuren door enzymen in de routes van de cyanobacterie zelf aan te passen (ACCase en AAS). Vrije vetzuren kunnen gebruikt worden voor de productie van


6

biobrandstof, bijvoorbeeld industriële transesterificatie met ethanol tot biodiesel. In het project is de cyanobacterie stam Synechococcus elongatus stam PCC 7942 geselecteerd als de gastheer om de aanpassingen mee uit te voeren. De vetzuursamenstelling verschilt namelijk per organisme en heeft invloed op de bruikbaarheid als biobrandstof. Binnen het project is een analyse uitgevoerd van een aantal cyanobacterie stammen om deze vetzuursamenstelling te typeren. Synechococcus elongatus PCC 7942 bleek een geschikte vetzuursamenstelling te hebben en bovendien is deze stam toegankelijk voor genetische aanpassingen en is de hele genetische code bekend, waardoor het een geschikt productie organisme is. De tweede strategie was gericht op de introductie van de productie routes voor olie in cyanobacteriën, omdat olie tot dusver alleen in groenalgen wordt gevormd met bovengenoemde nadelen. Olieproductie kan een voordeel bieden boven vetzuren, omdat de olie inert is en in druppeltjes ophoopt in de cel. Vetzuren daarentegen kunnen de stofwisseling van de cel verstoren. Om olie te produceren in cyanobacteriën is het nodig een aantal nieuwe conversies in te brengen, die van nature niet in cyanobacteriën voorkomen, maar wel in groenalgen, planten en bepaalde bacteriën. Aanvankelijk was het plan om de olieroutes te identificeren en isoleren uit groenalgen, omdat deze evolutionair gezien relatief dicht bij cyanobacteriën staan. Hierbij werd gekozen voor Botryosphaerella sudetica stam UTEX 2629, die grote hoeveelheden olie kan produceren bij een tekort aan stikstof. De identificatie van de oliegenen in de groenalg stuitte op onverwachte technische problemen, waardoor besloten is planten en (cyano)bacteriën als donoren van deze genen te gebruiken.

Figuur 1. Hoofddoel van het project is de lipide productie in de cyanobacterie te verhogen. Dit is ten eerste onderzocht met metabolic engineering door genen in de cyanobacterie zelf aan te passen en zodoende de vetzuurproductie te verhogen. In dit project is hiervoor de cyanobacterie stam Synechococcus elongatus PCC 7942 gebruikt. Het tweede doel is metabolic engineering met olie biosynthese genen uit olie-ophopende organismen zoals de groenalg Botryosphaerella en oliezaadplanten. Ten derde zijn willekeurige mutanten gemaakt van de cyanobacterie met transposon mutagenese om een verhoging van de productie van vetzuren of lipides in het algemeen te bewerkstelligen.

Verhogen lipide

productie in cyano-

bacterie

Metabolic engineering

Vetzuren

ACCase PCC 7942

AAS PCC 7942

Olie Olie

biosynthese genen

Botryo-sphaerella

planten Willekeurige

mutanten Lipides


7

De derde strategie behelsde verhoging van de lipideproductie door het maken en screenen van willekeurige mutanten van een cyanobacterie met behulp van transposon mutagenese. Transposons zijn springende stukjes DNA, die genen kunnen uitschakelen. Dit zou kunnen leiden tot identificatie van geheel nieuwe genen, die betrokken zijn bij de lipide-biosynthese in cyanobacteriën. Daarnaast kan ook gescreend worden voor andere interessante fenotypes, bijvoorbeeld mutaties die zouttolerantie verhogen zodat kweek op brak water mogelijk is of mutaties die de oogst van de cellen vergemakkelijken. De kennis over de lipide stofwisseling in cyanobacteriën is uitgebreid beschreven in Quintana et al., 2011. Hier wordt ter verduidelijking in Figuur 2 nog een schematisch overzicht gegeven van de routes en stappen die van belang zijn voor dit project. In kleur zijn de modificaties aangegeven die in het project zijn aangebracht. Aanpassingen van ACCase (groen) en AAS (rood) kan tot verhoogde productie van vetzuren of daaruit afgeleide lipides leiden. Introductie van een thioesterase (groen) kan hiervoor ook noodzakelijk zijn. Vrije vetzuren kunnen industrieel worden omgezet in biobrandstof of weer het uitgangspunt zijn voor de productie in de cel van neutrale lipides (olie) met behulp van olie productie genen (geel).

Figuur 2. Vereenvoudigd schema van de vetzuur en lipide synthese in cyanobacteriën. In kleur zijn de modificaties aangegeven die in het project zijn aangebracht.


8

Het is theoretisch mogelijk om in de cel de transesterificatie stap met ethanol uit te voeren, zodat direct biodiesel (FAEE) gevormd wordt. Deze biologische conversie zou industriële transesterificatie overbodig kunnen maken, waardoor het proces energetisch gunstiger uitgevoerd kan worden. Hiervoor moet ook ethanol gemaakt worden door de cyanobacterie maar door anderen is al aangetoond dat dit mogelijk is. Naast het verhogen van de lipideproductie in cyanobacteriën was een andere doelstelling van het project de inventarisatie van waardevolle nevenproducten in cyanobacteriën en het ophelderen van de hele genetische code van twee cyanobacterie stammen. Het doel hiervan was om te onderzoeken of cyanobacteriën ook gebruikt kunnen worden voor de productie van ‘groene chemicaliën’. Genetische informatie van cyanobacteriën die interessante inhoudstoffen bevatten, kan in principe gebruikt worden om het gehalte van dergelijke stoffen te verhogen of om te leiden naar andere producten. Door de vorming van waardevolle stoffen voor nichemarkten naast biobrandstof te verhogen, kan het productieproces economisch rendabel gemaakt worden. Biobrandstof uit algen en cyanobacteriën wordt nu nog vooral op kleine schaal toegepast en kan nog niet concurreren met fossiele brandstof omdat de productiekosten nog te hoog zijn voor dit bulkproduct. Dit wordt geïllustreerd door recente cijfers van algenproductie. In 2010 werd ~5000 ton droge algen biomassa geproduceerd en gebruikt voor de extractie van hoogwaardige producten zoals omega-3 vetzuren en carotenoïden met een gemiddelde marktprijs van €250/kg droge biomassa. Ter vergelijking is de productie van palmolie ~40 Mton met een marktwaarde van ~0.50 €/kg (Wijffels & Barbosa, 2010).

Gamma-component Het project beoogde een nieuwe technologie te ontwikkelen voor de productie van transportbrandstof die bij brede toepassing een sterke maatschappelijke invloed kan hebben. Dit geldt ook voor het feit dat voor de productie genetisch gemodificeerde bacteriën gebruikt worden. In een sociaal economisch onderzoek is geanalyseerd wat de relatie is tussen technologie en maatschappij, welke technologische aanpak is gevolgd in het project en of er ruimte is voor een alternatieve technologische route. Hiervoor zijn interviews afgenomen met specialisten en besluitvormers, de huidige positie van biobrandstofproductie in algen en cyanobacteriën is onderzocht en een case-study voor een gedecentraliseerde productiefaciliteit voor biobrandstof uit algen in kassen is uitgewerkt, waarover rapporten zijn opgesteld.


9

4. Resultaten en Discussie

Cultivatie van de cyanobacterie PCC 7942 in een fotobioreactor De cyanobacteriestam PCC 7942 werd batchgewijs gekweekt in een fotobioreactor (Labfors, Figuur 3). We hebben optimalisaties uitgevoerd van de samenstelling van het medium en de kweekcondities. Voor snelle productie van hoge hoeveelheden biomassa bleek een modificatie van het bestaande BG-11 medium, dat normaalgesproken gebruikt wordt, tot een grote verbetering te leiden. Met dit medium is een serie kweken ingezet in de Labfors, waarbij verschillende instellingen van de parameters licht, temperatuur en roersnelheid zijn getest. De hoogste opbrengst was 4.62 g drooggewicht, geproduceerd in 3 liter in 6 dagen bij 27.5°C, continu 75% licht (240 μmol.m-2.s-1) en 600 rpm (GT-AC_003 in Figuur 4). Het lipidegehalte en de vetzuursamenstelling varieerde met de kweekcondities, maar er werd geen eenduidige correlatie gevonden met bepaalde condities. Niet alle combinaties van mogelijke instellingen en mediumcomposities zijn getest, maar in de experimenten is wel een sterk verbeterde groei in de fotobioreactor gerealiseerd.

Figuur 4. Biomassa en percentage lipides van PCC 7942 onder verschillende groeicondities.

0

2

4

6

8

10

12

14

Biomass (g)

Oil (%)

Figuur 3. De Labfors fotobioreactor met een kweek van PCC 7942 en geopende lichtmantel.


10

Metabole profielen van cyanobacteriën door GC-MS Van vijf cyanobacterie stammen is het vetzuurpatroon onderzocht met GC-MS: drie Synechococcus stammen, PCC 6301, PCC 7942 en PCC 7942 R2-SPc, Synechocystis stam PCC 6803 en Geminocystis (voorheen Synechocystis) PCC 6308. Er zijn duidelijke verschillen tussen de cyanobacterie stammen (Figuur 5). De lage hoeveelheid meervoudig onverzadigde vetzuren en middellange-keten vetzuren en de hoge hoeveelheid van palmitinezuur en palmitoleaat maakten PCC 7942 tot de beste kandidaat voor metabolic engineering van biodiesel.

Figuur 5. Vetzuurprofielen van vijf cyanobacterie stammen. Boven, Overlappende GC profielen van de vijf stammen. Midden, Relatieve percentages van de verschillende vetzuren. Onder, PCA biplot van vetzuur profielen gegroepeerd per stam.


11

Naast vetzuurprofielen werd ook de samenstelling van de membraanlipides in de cyanobacteriën onderzocht en het centrale koolstofmetabolisme. Deze studie is nog niet helemaal afgerond. Ook werd een analyse van carotenoïden en allelopathische componenten in cyanobacteriën uitgevoerd. Carotenoïden zijn natuurlijke pigmenten met commerciële toepassingen in onder andere voedsel. Er werden met een HPLC methode nieuwe carotenoïden gevonden in de cyanobacteriële stammen. Deze moeten nog geïdentificeerd worden om te evalueren of ze interessante activiteiten hebben. Allelopathische stoffen hebben invloed op de groei van planten en kunnen gebruikt worden als bio-herbicides of als bio-meststoffen. Extracten van twee stammen bleken de groei van plantenzaailingen te bevorderen, respectievelijk te remmen. Het is nog niet duidelijk welke stoffen in de extracten hiervoor verantwoordelijk zijn. Er is nog verder onderzoek nodig om met name in PCC 7942 te kijken naar de metaboliet fluxen onder verschillende groeicondities en na metabolic engineering.

Genetische codes van twee cyanobacterie soorten De totale genetische codes van twee cyanobacterie soorten zijn opgehelderd, Cyanobium sp. PCC 6307 en Geminocystis sp. PCC 6308. De korte DNA sequenties, die gegenereerd werden bij de sequentiebepaling, werden geassembleerd tot langere sequenties met verschillende programma’s, IDBA, CLC en Abyss (Figuur 6).

Figuur 6. Resultaten van de assemblies van PCC 6307 en PCC 6308. Abyss gaf het kleinste aantal geassembleerde doorlopende sequenties (165 en 256 zogenaamde contigs) met de grootste gemiddelde lengte (26.137 en 13.497 bp) voor PCC 6308, respectievelijk PCC 6307. Wanneer de assemblages van de genetische code perfect verlopen waren, zou in feite maar één contig verwacht worden van het hele chromosoom of enkele contigs indien ook plasmides aanwezig zijn in deze cyanobacteriën. Dat dit hier niet is gevonden is te verklaren door de gebruikte sequentie techniek. Complementaire sequentie technologieën zijn waarschijnlijk nodig om gebieden die moeilijk te assembleren zijn te


12

overbruggen. Desalniettemin is de totale lengte van de contig sequenties die verkregen zijn (3 Mb voor PCC 6307 en 4.5 Mb voor PCC 6308), waarschijnlijk voldoende om de hele genetische code van beide stammen te beslaan. Met het programma GeneMarkS zijn de genen voorspeld die op de contigs liggen. Deze gensequenties zijn gebruikt voor vergelijkingen met bekende genen uit andere organismen (BLAST search) en gevonden overeenkomsten zijn geannoteerd (GO annotatie). Bij de annotatie worden moleculaire functies, positie in de cel en betrokkenheid bij biologische processen toegeschreven aan de genen op basis van hun gelijkenis op sequentieniveau met bekende genen uit andere organismen.

Figuur 7. Annotatie van alle voorspelde genen van PCC 6307 en PCC 6308. In Figuur 7 is te zien, dat een groot percentage voorspelde genen van beide cyanobacteriën gelijkenis vertoonde met bekende genen, waardoor het mogelijk was hun functie te voorspellen. Hiervan hadden 1792 respectievelijk 1511 genen van PCC 6307 en PCC 6308 een EC annotatie (codeerden voor enzymen). In totaal werden rond de 600 verschillende enzymen gevonden in deze stammen. In cyanobacteriën PCC 7942 en PCC 6803 (waarvan de hele chromosoomsequentie al bekend is) hebben 772 en 860 van de genen een enzymannotatie. Het lijkt er dus op dat het merendeel van de enzym coderende sequenties van PCC 6307 en 6308 is teruggevonden. Van veel genen in cyanobacteriën is de functie nog onbekend (40% voor PCC 7942). De annotaties van de vier stammen (PCC 6307, 6308, 6803 en 7942) zijn met elkaar vergeleken om genen te vinden die uniek zijn voor PCC 6307 en 6308. Deze genen zouden een rol kunnen spelen bij stofwisselingsprocessen die leiden tot interessante inhoudstoffen die uniek zijn voor deze stammen. In de metabolomics experimenten zijn duidelijk verschillen aangetoond in de lipide samenstelling van de vier stammen. In principe zou het mogelijk moeten zijn een correlatie te leggen tussen de aanwezigheid van bepaalde genen en de specifieke veranderingen in de lipide productie routes. Er zijn ~50-100 unieke genen gevonden voor PCC 6307 en PCC 6308. De metaboliet experimenten lieten zien dat PCC 6308 grote hoeveelheden zogenaamde medium-chain vetzuren bevatte, die interessant zouden kunnen zijn als vervangers van bijvoorbeeld kokosolie in de voedselindustrie. PCC 6307 bevatte relatief hoge hoeveelheden heptadecaan, een alkaan dat interessant kan zijn als biobrandstof. Meer onderzoek is nodig om genen betrokken bij de productie van deze stoffen aan te wijzen in de chromosoom sequenties.

4241 4250

37043908

27042448

17921511

650 595

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

genes B L AS T hits G O annotated E C annotated no of E cs

Annotation of all predicted genes

P C C 6307

P C C 6308


13

Lipide productie in modelsysteem E. coli na transformatie met ACCase genen uit PCC 7942 ACCase is het sleutelenzym van de vetzuursynthese, omdat het de eerste stap in de biochemische route katalyseert. ACCase bestaat uit vier subeenheden, en alle vier coderende sequenties zijn uit PCC 7942 geïsoleerd. Om de functie van ACCase te onderzoeken, is het via transformatie ingebracht in het modelsysteem E.coli. De ACCase subeenheden konden worden aangeschakeld in de cel door de stof IPTG toe te voegen aan het kweekmedium. E. coli met de volledige sequenties van de vier subeenheden (pGV2.6) bleek langzamer te groeien dan E. coli zonder ACCase van PCC 7942 (pGV in Figuur 8). Ook zonder IPTG was de groei al minder. Het lijkt erop dat de schakeling met IPTG niet helemaal waterdicht is en dat ook zonder IPTG de ACCase sequenties al actief zijn. Dit is een bekend fenomeen met de schakelaar die gebruikt is. Het ACCase van PCC 7942 heeft blijkbaar een negatieve invloed op de groei van E. coli. Er is ook een ACCase ingebracht waarvan een gedeelte miste, maar deze groeide niet veel langzamer dan de E. coli zonder PCC 7942 ACCase (pGV2.2).

Figuur 8. Groeisnelheid van E. coli met ACCase uit PCC 7942 (pGV2.6). pGV, geen PCC 7942 ACCase aanwezig. pGV2.2, gemuteerd ACCase met een deletie. I, IPTG toegevoegd aan het medium. Een kleuring met de lipide kleurstof Nile Red gaf na 16 uur groei in aanwezigheid van IPTG een toename van 8% in signaal bij pGV2.6 (pGV2.6 I) (Figuur 9). Bij de controles (wild-type DH5alpha of bij de stam die een lege vector [pGV] bevat) werd er geen toename gemeten, niet na toevoegen van IPTG en ook niet ten opzichte van elkaar. Bij pGV2.2 werd er een kleine afname in signaal gevonden in aanwezigheid van IPTG.


14

Figuur 9. Lipide detectie met behulp van Nile Red in E. coli met de verschillende ACCase constructen, 16 uur na toevoegen van IPTG (I) of zonder IPTG. De kleine toename van het Nile Red signaal bij pGV2.6 I wijst erop dat er mogelijk wel een kleine toename van lipides is door introductie van ACCase in E. coli. De toename is echter gering en dat kan komen doordat ACCase geremd wordt door het eindproduct van de vetzuursynthese (feedback inhibitie). Deze stammen worden momenteel nog verder onderzocht met behulp van GC-MS om het lipidegehalte en de lipidesamenstelling nauwkeurig te kwantificeren. Andere aanpassingen van de vetzuur- en lipideproductie zijn direct in de cyanobacterie PCC 7942 uitgevoerd in plaats van in E. coli.

Introductie van nieuwe genen in PCC 7942: Opzetten van transformatie Voor het introduceren van nieuwe genen en het veranderen of uitschakelen van bestaande genen in PCC 7942 is de mogelijkheid om deze stam te transformeren essentieel. Hoewel PCC 7942 eenvoudig te transformeren zou moeten zijn, is in eerste instantie veel vertraging opgelopen, omdat de gebruikte stam van de Pasteur Culture Collection niet meer transformeerbaar bleek te zijn. Veel verschillende optimalisaties van het standaardprotocol uit de literatuur zijn hierop uitgevoerd, maar zonder succes (zie Tabel 1). Uiteindelijk is een nieuwe stam verkregen van Prof. Dr. Susan Golden (Universiteit van San Diego, California), die eenvoudig te transformeren bleek te zijn.

Groeifase Begin van de exponentiële fase

Midden van de exponentiële fase

Eind van de exponentiële fase

DNA concentraties 50 ng 500 ng

Plasmide replicatief integratief

Fe3+ aanwezig afwezig

Wassen met 10 mM NaCl ja nee

Tabel 1. Verschillende combinaties van factoren die getest zijn voor de transformatie van PCC 7942. Van Prof. Dr. Pamela Silver (Harvard Medical School in Boston) zijn vectoren gekregen die door middel van homologe recombinatie integreren in het chromosoom van PCC 7942, waardoor de geïntroduceerde sequenties stabiel aanwezig blijven in de aangepaste cyanobacterie. Deze vectoren zijn nog door ons aangepast om sequenties die kunnen interfereren met de werking van de ingebrachte genen te verwijderen. Ook is een reportergen ingebracht, dat codeert voor een groen fluorescerend eiwit (eGFP), zodat we de werking van de vectoren in PCC 7942 konden volgen door fluorescentiemetingen.


15

Metabolic engineering van PCC 7942

a. Overexpressie van ACCase Voor zogenaamde ACCase overexpressie (verhoging van de ACCase activiteit) is een vector met de sequenties van de vier ACCase subeenheden van PCC 7942 in de cyanobacterie gebracht door transformatie, evenals de vector met eGFP. In Figuur 10 is te zien, dat na toevoegen van IPTG om de genen aan te schakelen, de groeisnelheid van de verschillende cyanobacterie transformanten nagenoeg hetzelfde bleef. Het fluorescentie signaal van eGFP nam toe in de tijd, naarmate de celdichtheid toennam in de cultuur. Ook is te zien, dat er zonder IPTG evenveel fluorescentie was en dat pas na 72 uur het signaal sterker toenam in de cultuur met IPTG dan zonder IPTG. Zoals boven vermeld, was de schakeling met IPTG niet helemaal waterdicht, waardoor het eGFP gen ook zonder IPTG al actief was. Van deze monsters wordt nog een GC-MS analyse uitgevoerd om te bepalen of het lipidegehalte verhoogd is door de ACCase overexpressie.

Figuur 10. Introductie van ACCase en eGFP in PCC 7942: Groeisnelheid en eGFP fluorescentie gemeten op verschillende tijdstippen na toevoegen van IPTG (0, 24, 48 en 72 uur). pNS3 is de controle vector zonder extra genen (lege vector).

b. Knockout van AAS Acetyl-ACP synthase (AAS) is een eiwit dat in het celmembraan van cyanobacteriën zit en er voor zorgt dat deze vrije vetzuren kan opnemen en kan gebruiken voor lipide synthese. Aangezien wij vrije vetzuren voor andere doeleinden willen gebruiken, hebben wij dit gen uitgeschakeld (knockout). Deze mutant (AAS-KO) is opgekweekt en de uitscheiding van vrije vetzuren in het medium is bepaald na 16 dagen. Vergeleken met wild-type PCC 7942, werd echter geen verhoogde concentratie van vrije vetzuren gedetecteerd.


16

Om toch een verhoging van vrije vetzuren te bereiken is begonnen met het introduceren van de coderende sequentie van een thioesterase in deze mutant en in de ACCase overexpressie mutant. Naar verwachting kan deze combinatie wel voor verhoogde productie van vrije vetzuren leiden, omdat hierdoor de feedback inhibitie van ACCase opgeheven wordt.

c. Introductie van olie productie genen Voor productie van olie (triacylglycerol, kortweg TAG) in PCC 7942 is allereerst het DGAT gen van de oliezaadplant Jatropha curcas in PCC 7942 geïntroduceerd (JcDGAT). DGAT voert in oliehoudende plantenzaden de laatste stap uit in de productie van TAG. De transformant is samen met een lege vector controle opgekweekt met en zonder toevoeging van IPTG. Daarna is een vetzuur analyse uitgevoerd met behulp van GC-MS (Figuur 11), waarbij alle vetzuren die vrij aanwezig waren in de cel of die veresterd waren in lipidemoleculen, vrijgemaakt werden en getransesterificeerd met methanol. Daarna vond relatieve kwantificatie plaats. Het vetzuurgehalte en de -compositie van deze JcDGAT transformant verschilde niet significant van de lege vector controle. Naast vetzuren werden ook alkanen gevonden (pentadecaan etc.), maar ook hierin was geen verandering door introductie van het JcDGAT gen. Met een voorlopige analyse door dunnelaag chromatografie (TLC) werd geen TAG gevonden. Gevoeligere metingen met GC-MS worden nog uitgevoerd.

Figuur 11. GC-MS vetzuur analyse van wild-type PCC7942 en PCC 7942 getransformeerd met lege vector pNS3 (controle) of met pNS3-JcDGAT. GT-S1: PCC 7942; GT-S2: pNS3, 24 h, geen inductie; GT-S3: pNS3, 24 h na inductie met IPTG; GT-S4: pNS3-JcDGAT1, 24 h, geen inductie; GT-S5: pNS3- JcDGAT1, 24 h na inductie met IPTG. Relatieve kwantificatie is uitgevoerd ten opzichte van de toegevoegde standaard C17:0. BHT is tijdens de extractie toegevoegd als antioxidant. Omdat we verwachten dat een combinatie van genen nodig is voor TAG productie in PCC 7942 zijn ook andere genen ingebracht, namelijk thioesterase, acyl-CoA synthetase, WS/DGAT en PAP (Figuur 2 voor schematisch overzicht). De invloed van een aantal van deze genen is al getest met TLC, maar hierbij werd geen TAG gevonden. Tests met GC-MS worden nog uitgevoerd.


17

Het feit dat er nog geen hoge TAG productie is gevonden kan op een aantal manieren verklaard worden. Er zijn genen gebruikt uit andere organismen (planten en bacteriën) die mogelijk niet goed werken in PCC 7942. De enzymen die gecodeerd worden door deze genen, kunnen op de verkeerde plaats in de cel terecht zijn gekomen of een verkeerde vouwing hebben in de cyanobacterie. Ook kan er sprake zijn van competitie met andere metabole routes, feedbackmechanismen, of afbraak van het product.

d. Transposon mutagenese Transposon mutagenese is een goede manier om genen te vinden waarvan onbekend is dat ze bij een proces betrokken zijn. Wij hebben getracht mutanten te vinden die een verhoogd lipide gehalte hebben of andere voor het project interessante fenotypen. Zo zouden verlengde cellen kunnen helpen met het oogsten van de cyanobacterien, pigmentatie mutanten zouden bijvoorbeeld gebruikt kunnen worden om culturen met hogere dichtheid te bereiken (geen concurrentie voor hetzelfde licht), etc. Na het verkrijgen van de mutanten is allereerst naar het fenotype gekeken met behulp van een fase constrast microscoop. Figuur 12 laat de verschillende fenotypen zien van 5 van de verkregen mutanten. In vergelijking met wild-type (WT) PCC7942 laten mutanten 2A01, 2B10, 2F01 en 2F10 een groot aantal cellen zien die langer zijn dan WT. Mutant 2F07 heeft wel een vergelijkbare lengte als WT, maar de cellen bevinden zich in aggregaten.

Figuur 12. Fase contrast microscopie van mutanten verkregen door transposon mutagenese. Van alle mutanten is ook het Nile Red signaal gemeten, dat een maat is voor het lipidegehalte (Figuur 13). Het WT PCC7942 signaal is vergelijkbaar met het signaal verkregen bij 2F01 en 2F10 en geeft de indicatie dat al deze cellen een vergelijkbare hoeveelheid lipiden (hydrofobische stoffen) maken. Bij mutanten 2B10 en 2F07 kan het hoge Nile Red signaal verklaard worden door de grotere cellen en de aggregaten van cellen. Bij mutant 2A01 is de toename van Nile Red signaal echter groter dan verwacht op basis van de celgrootte. Deze mutant lijkt dus een hoger lipidegehalte te bezitten. Verdere analyses met GC-MS zijn nog nodig om deze resultaten te bevestigen. Aangezien mutant 2A01 (vanwege de toename in Nile Red signaal) en 2F07 (vanwege de vorming van cel aggregaten) het meest interessante fenotype lieten zien, is begonnen met een verdere karakterisatie van hun mutatie. De locatie van het transposon in de mutanten is bepaald en 2A01 bleek gemuteerd te zijn in een GTP-bindend eiwit en 2F07 in een ATPase.


18

Figuur 13. Toename in fluorescentie intensiteit van mutanten na Nile Red kleuring. Mutant 2F07 liet naast de vorming van cel aggregaten ook een versnelde sedimentatie zien ten opzichte van WT PCC7942, waarschijnlijk doordat de aggregaten sneller naar de bodem zinken dan losse cellen. Dit kan een voordeel opleveren bij het oogsten van de cellen, doordat minder energie-input nodig is. Verder is er van mutant 2F07 een kleuring uitgevoerd met fluoresceine gelabelde concanavaline A (Figuur 14). Concanavaline A is een lectine dat aan bepaalde suiker groepen kan binden, zoals die aanwezig zijn in de buitenmembraan. Bij WT PCC7942 komt

Figuur 14. Fluorescentie van WT PCC 7942 (A en B) en mutant 2F07 (C en D). A en C: autofluorescentie van de cellen. B en D, Fluorescentie na kleuring van de cellen met fluoresceine gelabelde concanavaline A.


19

de autofluorescentie afkomstig van het fotosynthetisch apparaat van de cellen (A) overeen met het signaal van concanavaline A (B). Bij de mutant is echter te zien dat de autofluorescentie (C) niet overeenkomt met het signaal van concanavaline A (D). De concanavaline A lijkt bij de mutant de ruimte tussen de cellen te kleuren en niet de membraan van de cellen. Het experiment met concanavaline A suggereert dat 2F07 nauwelijks of geen suikers in zijn buitenmembraan heeft, maar deze uitscheidt in het medium. De andere interessante mutant is 2A01 welke een transposon heeft in een GTP-bindend eiwit (SynPCC7942_0160) en een hoger Nile Red signaal laat zien. In Figuur 15 is te zien dat deze mutant afwijkende kolonies vertoont op vaste voedingsbodems. De mutatie moet nog geverifieerd worden door complementatie en knockout van het GTP-bindend eiwit gen. Het GTP-bindend eiwit is in E. coli betrokken bij eiwitsynthese. Mogelijk is het lipidegehalte in deze mutant verhoogd, doordat minder eiwitten gevormd worden ten gunste van lipides. Zowel de versnelde sedimentatie van de 2F07 mutant als het potentieel verhoogde lipidegehalte van 2A01 zijn interessant voor commerciële toepassingen. Echter, verder onderzoek naar de effecten van deze mutaties is noodzakelijk.

Figuur 15. Filamenteuze groei van een kolonie van mutant 2A01 op vaste voedingsbodem, in vergelijking met wild-type PCC 7942.

Sociaal economisch onderzoek Het sociaal economisch onderzoek is gefocust op de relatie tussen technologie en samenleving. Er is onderzocht welke technologische aanpak is gevolgd in dit project en of er ruimte is voor een alternatieve technologische route. In het kader hiervan heeft een interdisciplinaire groep MSc studenten een rapport geschreven over de huidige positie en productie van biobrandstoffen in algen. Zij hebben een case-study gepresenteerd van een gedecentraliseerde productieketen voor biobrandstof uit algen geproduceerd in plantenkassen. Dit zou een locale productketen op dorpsschaal kunnen vormen, mits geïntegreerd in een bestaand systeem, in dit geval een plantenkas. De hoge productiekosten van algen biobrandstof zouden dan verlaagd kunnen worden door de bestaande toevoer van kooldioxide en water in de kas te benutten. De opbrengst van hoogwaardige nevenproducten kan het systeem commercieel haalbaar maken. Echter, het gebruik van genetisch gemodificeerde algen beperkt de toepasbaarheid van de nevenproducten. Indien gekozen zou worden voor een non-GM benadering, kunnen de bijproducten ook gebruikt worden voor bijvoorbeeld voedingssupplementen en veevoeder. In een bioraffinaderij kunnen de biobrandstof en nevenproducten uit de algen geëxtraheerd worden en het afval verbrand worden om extra energie op te leveren. De CO2 die hierbij vrijkomt zou weer gebruikt kunnen worden in de kas en ook water kan in de kas gerecyceld worden. Verder zijn de belanghebbenden in de productketen zijn geanalyseerd en een SWOT analyse is geïmplementeerd. Er zijn interviews afgenomen met specialisten, belanghebbenden en besluitvormers over hun ideeën en meningen over biobrandstof. Het eindrapport van CTC reflecteert op de verschillende benaderingen van de relatie technologie-maatschappij en de code van een technologie. Dit levert een inhoudelijke schematische weergave van de technologie-


20

samenleving interacties op, die als leidraad gebruikt kan worden voor reflecties op innovatieve transitieprocessen. In verband met deze reflecties werd het cyanodiesel project opnieuw geanalyseerd. Het project had als speerpunt vorming van biomassa ten behoeve van de winning van transportbrandstof en vormde daarmee een onderdeel van het wetenschappelijk en maatschappelijk debat omtrent de overgang naar een bio-based economy. Een belangrijk punt voor reflectie betreft de vraag in hoeverre de exclusieve gerichtheid op biodiesel niet een beperkende factor is om het productieproces te verwaarden en een overgang naar een bio-based economy te realiseren. Bio-economie baseert zich niet meer primair op globale productieketens met haar specifieke ruimtelijke infrastructurele organisatie maar eerder op een lokaal-specifieke uitwerking van het begrip bio-raffinage. De studie over de transitie naar een bio-based economy en de gevoerde interviews maakten duidelijk dat er sprake is van een sociaal-technische code in de ruimtelijke organisatie van productieketens die de transitie naar een bio-economie bemoeilijkt en daarmee de verwaarding van nieuwe biomassa producten beperkt. Ondanks de vele beleidsinitiatieven en discussies over duurzaamheid blijkt in de praktijk dat allerlei innovatieve ideeën over kleinschalige en lokaal specifieke productieprocessen het toch vaak moeten afleggen tegen de politiek-economische belangen van bijvoorbeeld de Rotterdamse haven, gericht op de handel van producten uit globale productieketens. In het Bacteriële Dieselolie project kan het piramideconcept worden ingebouwd om zich te baseren op een andere ruimtelijke organisatie van de productie. In het piramideconcept wordt de vervaardiging van een product geplaatst binnen het functioneren van regionaal-specifieke en gesloten productiecircuits die een veelheid van producten vervaardigen. In de top van de piramide worden componenten uit de biomassa gewonnen die bruikbaar zijn om hoogwaardige producten te maken. De resterende biomassa kan worden ingezet voor de vervaardiging van meer laagwaardige toepassingen. Door de reststromen als grondstof te gebruiken kan het hele productieproces een toegevoegde waarde krijgen. Conversieketens kunnen op allerlei locaties op relatief kleine schaal en tegen relatief lage kosten basis-grondstoffen omzetten in producten met verschillende waarden die – zoveel mogelijk zonder tussentijdse opslag en met zo weinig mogelijk transport – op verschillende locaties kunnen worden gebruikt. Uit literatuur en interviews blijkt dat het beste perspectief voor het gebruik van algen en cyanobacteriën als biomassa vooral ligt in de ruimtelijk-sociale integratie van afgestemde conversieprocessen van verschillende biomassa waardeketens.


21

5. Conclusie en aanbevelingen Het project Groene Diesel uit Blauwwieren heeft een bijdrage geleverd aan de kennis en praktijk van cyanobacteriën op het gebied van kweekprocedures, metaboliet analyses, lipide samenstelling, genetische codes en metabolic engineering. Cyanobacteriële stammen bevatten interessante vetzuurprofielen en de diversiteit tussen de stammen is groot gebleken. De nieuwe genetische codes van twee cyanobacteriële stammen kunnen verder bestudeerd worden om genen in routes voor interessante inhoudstoffen te identificeren. De metabolic engineering strategieën hebben een aantal aanknopingspunten opgeleverd voor verder onderzoek naar verhoogde lipide productie in cyanobacteriën. Voor toekomstig onderzoek is het noodzakelijk om de multidisciplinaire benadering, waar in dit project een begin mee is gemaakt, verder uit te werken. De doelstellingen van het project waren ambitieus en op dit moment is directe toepassing van de gemodificeerde stammen uit dit project nog niet mogelijk. De verhoogde productie van vrije vetzuren door het gebruik van genen van de cyanobacterie zelf, is nog niet gerealiseerd. Wel zijn al een aantal stappen in de vetzuursynthese gemodificeerd, maar de mutanten zijn nog niet uitgebreid geanalyseerd met GC-MS technieken, waardoor nog niet met zekerheid te zeggen is of deze aanpak geslaagd is. Inmiddels zijn ook nieuwe constructen gemaakt, omdat meerdere genen samen moeten werken om tot een positief resultaat te komen. Nieuwe transformanten met combinaties van de gewenste genen, worden nog gemaakt. In analogie met de vrije vetzuurproductie zijn ook veel modificaties nodig in een cyanobacterie, om tot productie van neutrale lipides, TAG, te komen. De modificaties zijn uitgevoerd, en de productie van TAG is in een aantal van de transformanten geanalyseerd met een weinig gevoelige methode. Hierbij werd geen TAG waargenomen, maar analyses met de gevoelige GC-MS methode moeten nog gedaan worden. In vivo verestering van TAG waardoor de cyanobacterie kant en klare biodiesel kan produceren, is nog niet gerealiseerd. Vaak leidt metabolic engineering in de praktijk tot slechts lage hoeveelheden van het beoogde product en aanzienlijke verbeteringen in de gebruikte genconstructen en het ‘chassis’ van de gastheer zijn meestal nodig om tot hogere productie te komen. De mutanten die verkregen zijn door transposon mutagenese zijn zeer interessant voor verder onderzoek. Met name een mutant die versnelde sedimentatie liet zien en een mutant met mogelijk verhoogde lipideproductie. De karakterisatie van deze mutanten moet echter nog verder uitgewerkt worden, voordat gedacht kan worden over eventuele toepassingen. Voor het gebruik van cyanobacteriën als producenten van biobrandstoffen is meer kennis nodig van de metabole routes en de interacties ertussen. Met behulp van metabolic modeling kunnen de netwerken verder ontrafeld worden en kunnen modificaties voorspeld worden die meer kans geven op verhoogde opbrengst van een bepaald product. Dit type onderzoek kan de hiaten die nu nog aanwezig zijn in de kennis van cyanobacteriële biologie en biochemie verder invullen. Ook de opschaling van de productie van de gemodificeerde cyanobacteriën naar grotere kweekreactoren is een onderzoek op zich. De acceptatie van genetisch gemodificeerde cyanobacteriën in Europa is een punt van zorg. Desalniettemin blijven cyanobacteriën veelbelovende organismen voor de productie van velerlei interessante stoffen. De integratie van de kennis en het onderzoek op de verschillende niveaus van chromosoom, stofwisseling en biologische processen in cyanobacteriën is een taak waarbij de bijdrage en samenwerking van diverse onderzoeksgroepen nodig zullen zijn. Een van de aspecten die naar voren kwam in het sociaal economisch onderzoek was het meenemen van sociale relaties en sociale doelstellingen ín het ontwerpen van een technologie. Van tevoren zou bedacht kunnen worden of de technologie zich richt op de productie van biodiesel of op hoogwaardige inhoudstoffen; op globale of locale productieketens etc. Aangezien de productie van biobrandstof en groene chemicaliën in cyanobacteriën nog in de kinderschoenen staat, is voor het uitvoerende deel van het project uitgegaan van een meer technologisch dan sociaal standpunt om eerst de primaire mogelijkheden van lipide productie in PCC 7942 te onderzoeken.


22

6. Knelpunten

Tijdens het project hebben zich meerdere technische problemen voorgedaan, waardoor vertraging is opgelopen. Omdat al het werk met groenalgen en cyanobacteriën opgezet moest worden, is veel tijd besteed aan optimalisatie van media, gebruik van de fotobioreactoren, kweekparameters en moleculair biologische technieken. Ook voor het metabolomics werk is veel tijd geïnvesteerd in het vergelijken van extractiemethoden, bepalen van de juiste analyse methodes en identificatie en kwantificatie van de metabolieten. Hiervoor is ook een verblijf aan de Universiteit van Manchester nodig geweest. Metaboloom analyses zijn technisch gezien lastig, omdat metabolieten chemisch divers zijn, zodat meerdere analytische technieken nodig zijn om zoveel mogelijk metabolieten te kunnen detecteren en kwantificeren. Er is 1H NMR, GC-MS, GC-TOF/MS en DIMS toegepast om de diverse metabolieten te kunnen onderscheiden. De analyse van vetzuurpatronen was een moeilijke taak vanwege de complexiteit van de chromatogrammen. Uiteindelijk zijn de methodes goed opgezet, maar door de vertragingen zijn niet alle doelen van het project gehaald. Technische problemen bij de sequentiebepalingen van de groenalgen en een bottleneck in de bioinformatica capaciteit heeft ertoe geleid, dat de identificatie van de olieroutes in de groenalgen niet mogelijk was, waardoor lipide genen uit planten en (cyano)bacteriën gebruikt zijn voor de metabolic engineering van PCC 7942. Door de vertraging is het bestuderen van de modificaties in het modelsysteem E. coli, alleen uitgevoerd voor het enzym ACCase. De transformatie van PCC 7942 heeft in het begin veel tijd gekost, omdat de stam van de Pasteur Culture Collection niet meer transformeerbaar bleek te zijn. Een bezoek aan de groep van Susan Golden in de VS was nodig om de juiste transformeerbare PCC 7942 stam te krijgen evenals ervaring met de transformatieprocedure en geschikte vectoren zijn verkregen van Pamela Silver. Er moesten nog aanpassingen gemaakt worden in deze vectoren om maximale efficiëntie te krijgen. De analyse van de vrije vetzuren en de neutrale lipides die door metabolic engineering in PCC 7942 zouden moeten worden geproduceerd, kon door tijdsgebrek niet meer met GC-MS uitgevoerd worden. Hier wordt nog wel aan gewerkt evenals aan nieuwe modificaties met andere sequenties.


23

7. Bijdrage aan de EOS: Lange Termijn doelstellingen

Bijdrage aan een duurzame energiehuishouding Het project viel binnen het aandachtsgebied 'Biomassa' met als speerpunt: vorming van biomassa ten behoeve van de winning van transportbrandstof. De kern van dit onderzoeksproject was de efficiënte omzetting van de energie uit zonlicht en vastleggen van CO2 in inhoudstoffen die voor de transportsector en chemische industrie bruikbaar zijn. Daarvoor was een onconventionele route gekozen waarin gebruik werd gemaakt van het eenvoudigste maar tegelijkertijd efficiëntste fotosynthetiserende micro-organisme dat in de natuur voorkomt, de cyanobacterie. Het onderzoek had tot doel speciaal deze micro-organismen geschikt te maken voor de economisch verantwoorde productie van biodiesel. Het project beoogde de huidige kwaliteit van cyanobacteriële biomassa voor dit doel te verbeteren. Enerzijds door de componenten die geschikt zijn voor toepassing als biobrandstof te verhogen en anderzijds door de samenstelling van deze componenten te verbeteren. De focus lag op de productie van vetzuren en lipides in cyanobacteriën. In het projectvoorstel was voorgerekend, dat het lipidegehalte van cyanobacteriën verhoogd moest worden van 10 naar 40% om rendabel te zijn, wat een ambitieus doel was. In het project is een geringe verhoging gehaald in het modelsysteem E. coli met een gen uit de vetzuursynthese van PCC 7942, maar het effect van dit gen in PCC 7942 zelf is nog niet bekend. Een mutant die met transposon mutagenese is verkregen vertoonde een verhoogd lipidegehalte, maar dit is nog niet exact gekwantificeerd. De productie van neutrale lipides die direct toepasbaar zijn is niet verwezenlijkt. Al met al is meer onderzoek nodig om tot een commerciële toepassing te komen. Productiekosten zoals investerings- en exploitatiekosten van fotobioreactoren en opwerkingskosten zijn binnen dit project nog niet onderzocht, maar verwacht wordt dat deze zullen dalen, naarmate nieuwere types en methodes beschikbaar komen. Aan het begin van het project was het gebruik van cyanobacteriën voor de productie van lipide biobrandstoffen nog nieuw. Het onderzoek van anderen was vooral gericht op productie van ethanol en waterstof in cyanobacteriën. Tijdens de uitvoering van het project bleek echter, dat ook andere onderzoeksgroepen en bedrijven zich gingen richten op productie van vetzuren, lipiden, TAG en koolwaterstoffen in deze organismen (bijvoorbeeld Joule Unlimited en Targeted Growth). De modificatie van lipidesynthese door transposon mutagenese in een cyanobacterie is nog niet door anderen toegepast. Het gebruik van een geïntegreerde benadering via analyses op verschillende niveaus in cyanobacteriën was ook nieuw. Door de vele technische problemen tijdens het project zijn niet alle doelstellingen gehaald. Zoals boven beschreven leveren de projectresultaten een belangrijke bijdrage aan de kennis van lipides en lipide syntheseroutes in cyanobacteriën, maar zijn de gemodificeerde stammen nog niet direct bruikbaar. Er is een belangrijk begin gemaakt, maar het onderzoek is momenteel nog niet voldoende ver gevorderd om een strategie uit te kunnen zetten voor implementatie.

De versterking van de kennispositie in Nederland Het project Groene Diesel uit Blauwwieren heeft in meerdere opzichten bijgedragen aan de kennis en kunde van onderzoeksfaciliteiten in Nederland. Er is kennis opgedaan van vele aspecten van cyanobacteriële stammen en groenalgen, zoals vetzuur- en lipidesamenstelling, lipide biosynthese routes en chromosoom sequenties. Daarnaast is kunde opgedaan onder andere in de vorm van protocollen voor kweken, moleculair biologische analyses, metabole analyses, transformatie en transposon mutagenese. Bovendien is de kennis op sociaal-economisch gebied van de toepassing van algen biomassa toegenomen. Dit alles komt tot uiting in een publicatie, een aantal rapporten, verslagen van studenten die hebben bijgedragen aan het onderzoek en posterpresentaties tijdens internationale congressen (zie hieronder). Een aantal zijn op te vragen via [email protected].


24

Renewable energy from Cyanobacteria: energy production optimization by metabolic pathway engineering. Mini-Review. Quintana N., Van der Kooy F., Van de Rhee M.D., Voshol G.P. & Verpoorte R. (2011) Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 471-490. Bacteriële dieselolie. Eindrapportage CTC, WUR. Ruivenkamp G. (2012). Interviewronde Biobrandstoffen. Ruivenkamp G. (2012). Fatty acid methyl ester profiling of cyanobacteria. Poster presentatie ‘10th Cyanobacterial Molecular Biology Workshop’, Californië, USA. Quintana N. (2010). Metabolic engineering of cyanobacteria for biodiesel production. Poster presentatie ESF-conferentie ‘Micro-organisms for biofuel production from sunlight’, Bielefeld, Duitsland. Van de Rhee M., Quintana N., Voshol G., Verpoorte R., Van den Hondel C. & Passarinho P. (2011). Cyanobacteria and microalgae as a source of biofuel. Stageverslag. Espí-Soler J. (2011). Cyanobacterial biodiesel: from bacteria to biodiesel. MSc verslag. Hamers D. (2011). Engineering S.elongatus PCC 7942 for the production of triglycerides. Van den Berg A. (2011). Improving S.elongatus PCC 7942 for biodiesel production. Liolitsas I. (2011). From cyanobacteria to biodiesel. MSc verslag. Warmerdam S. (2012). Metabolic engineering of cyanobacteria for biofuel production. Stageverslag. Cariti F. (2012). A new perspective for algae biofuel production: the greenhouse case. Verslag Academic Consultancy Training. Zhao Y., Sigdel G., Van Waalwijk-Van Doorn L., Lu M., Hartog M. & Kouklas E. (2012).

8. Referenties Ducat D. et al. (2011) Trends in Biotechnol. 29: 95-103. Quintana N. et al. (2011) Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 471-490. Wijffels R. & Barbosa M. (2010) Science 329: 796-799.

Meer exemplaren van dit rapport zijn te bestellen via [email protected].

Het project is uitgevoerd met subsidie van het Ministerie van Economische Zaken, Landbouw en Innovatie, regeling EOS: Lange Termijn uitgevoerd door Agentschap NL.

EOSLT07039 kaft.pdfColofon

groene diesel uit blauwwieren bacteriële dieselolie · 2014. 5. 22. · figuur 1. hoofddoel van...

Documents