granulocyttfunksjons undersøkelser
DESCRIPTION
Granulocyttfunksjons undersøkelser. Haakon Sjursen Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus 2013. Celler i blod. Den nøytrofile granulocytt. Immunforsvarets raskeste Produksjon > 1 x 10 11 /døgn ca . 1500 kg per 80 åring Rask turnover: ~ 10 t i blod Evt . 1–2 døgn i vev - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Granulocyttfunksjons undersøkelser
Haakon SjursenUniversitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus
2013
H.Sjursen 1
Celler i blodCelle type Celler/mm3 FunksjonErythrocytter 4.8 – 5.4 x 106 Transport av O2 og CO2
Granulocytter 5000 - 9000 (ca 1 per 1000 røde)
Nøytrofile 70% Fagocytose
Basofile 1% Histaminproduksjon
Eosinofile 4% Toksiner mot parasitterNoe Fagocytose
Monocytter/Makrofager
5% Fagocytose
Lymfocytter 20% B celler: Antistoff produksjonT celler: Cellemediært immunitet
Plater 300 000 Blod koagulasjon
H.Sjursen 2
Den nøytrofile granulocytt
• Immunforsvarets raskeste
• Produksjon > 1 x 1011 /døgn
• ca. 1500 kg per 80 åring
• Rask turnover: ~ 10 t i blod
• Evt. 1–2 døgn i vev
• Endestadiecelle: effektorcelle
• Cytokinprodusent
H.Sjursen 3
3 linjer i forsvaret mot infeksjon
H.Sjursen 4
(Innate immune defence)
Andre linje forsvar - Fagocytose
Fagocytose Gresk: fago = spise og cyto = celle
– Fagocytose utføres av nøytrofile og monocytter/makrofager
– Nøytrofile dominerer tidlig i infeksjonen
– Makrofager er monocytter som forlater blodbanen og utvikles
til makrofager som vandrer i vev
– Histiocytter er makrofager lokalt i lever, nervesystem, lunger,
lymfeknuter, beinmarg o.a. vev H.Sjursen 5
• Marginasjon – «Rolling» langs endotelveggen
• Adhesjon• Migrasjon• Diapedese (emigrasjon)• Kjemotakse• Fagocytose• Intracellulært drap
• NB: kan ha nedsatt funksjon tross normale granulocytter:• Ved antistoffmangel eller komplementmangel
Den nøytrofile granulocytt
H.Sjursen 6
Marginasjon - Adhesjon - Migrasjon - Diapedese
H.Sjursen 7
H.Sjursen 8
A neutrophil adheres to the endothelium in a venule (1). It extends its pseudopodium between the endothelial cells and migrates towards the basement membrane (2). After the neutrophil has crossed into the tissue, the endothelium reseals behind (3). The entire process is referred to as diapedesis. (Courtesy of Dr I Jovis)
Kjemotakse: Fagocyttene trekkes til Infeksjonsfokus
H.Sjursen 9
Klassisk og alternativ komplement pathways trigger spalting av C3
H.Sjursen 10
Membran Attack Complex (MAC) forårsaker cytolyse
H.Sjursen 11
H.Sjursen 12
H.Sjursen 13
H.Sjursen 14
Reseptorer og signal interaksjoner ved fagocytose av mikrober
(Underhill DM, Ozinsky A, Annu Rev Immunol 2002, 20, 825
H.Sjursen 15
Mange reseptorer er involvert. Svikt i én reseptorgruppe kan delvis kompenseres om andre reseptorer er normale
Stadier i fagocytose -11. Adheranse: Fagocyttens plasmamembran
fester seg til bakterieno Hemmes av kapsel (pneumokokker) og M
protein (GAS)o Opsonisering: Coating prosess med
opsoniner som letter festeo Opsoniner: Antistoff og komplement
2. Internalisering: Plasmamembranen på fagocytten danner pseudopoder som omgir mikroben
3. Mikroben omsluttes av en sekk kalt fagosom
4. Intraacellulært drap: Fagosomet fusjonerer med lysosomet og danner fagolysosomet
H.Sjursen 16
Phagocytose
H.Sjursen 17
Stadier i fagocytose -25. Lysosomale enzymer dreper bakterien innen 10 sec – 20 min.
– O2 uavhengig
• Lysozym: Ødelegger peptidoglykan i bakteriens cellevegg
• Lipaser
• Lactoferrin
• Proteaser
• RNAser og DNAser
6. Etter nedbryting dannes residual legemet med ufordøyelig materialer som blir utskilt fra cellen
H.Sjursen 18
Oxidativ burstO2 - avhengig
a) Myeloperoxidase (MPO)b) MPO- uavhengig1. H2O2
2. Superoxid anion O2¯3. Hydroxyl radikal OH ¯ 4. Singlet oxygen O2* 5. Ascorbat-peroxid-metall ion 6. Aminosyre oksidasjon
2O2 + NADPH 2O2¯ + H+ + NADP +
2O2¯ + 2H+ H2O2 + O2
H.Sjursen 19
H.Sjursen 20
H.Sjursen 21
Elektronmikroskopi av en granulocytt som har internalisert Staphylococcus aureus (S)
Intracellulær lokalisering av bakterier
Fagosom
Lysosom
ChlamydiaeLegionellaMycoplasma
ListeriaIngen fusjon med lysosomet
Fagolysosom
S.aureausBrucellaSalmonellaCoxiella burneti
pH=5.0
3
4
2
1
Fusjon
pH=7.4
B
B
B
B
BB
Cytoplasma
Intracellulær lokalisering av antibiotika
Fagolysosomvolum 1 to 5% av cellevolumetpH=5.0
Macrolider (x10-50)Aminoglycosider (x2-4)TetracyklinerFluoroquinoloner
CytoplasmaFagosompH=7.2
Fluoroquinoloner (x2-8)beta-lactamer (x0.2-0.6)Rifampicin (x2)Aminoglycosides (slow)
Intracellulær antibiotika aktivitet
Fagolysosom pH 5.0
Macrolider AminoglycosiderLav eller 0
Cytoplasma PH 7.2Fagosom pH 7.2
Fluoroquinolonerbeta-lactamer*Rifampicin AminoglycosiderMacrolider
God Fluoroquinoloner, Doxycyclin God
* Husk:Mycoplasma, Chlamydia, Legionella har ikke cellevegg: β-lactamer virker ikke!
Chlamydia Legionella Mycoplasma
Listeria
S aureusBrucellaSalmonellaCoxiella
Fagocyttfunksjons undersøkelser• Måles ved Fagocytose laboratoriet ved Institutt for Indremedisin,
Universitetet i Bergen• Nasjonal referanse laboratorium• Hva måles:
– Kjemotakse– Fagocytose– Intracellulært drap– Reseptor ekspressjon: Fc- , komplement reseptorer o.a.
• Hvorfor: Fordi det finnes medfødte og erværvede defekter i alle disse funksjonene
H.Sjursen 25
Kjemotakse defekter
• Komplement mangel/defekter
• Inhibitorer (SLE o.a. autoimmune sykdomer
• Cellulær svikt: Chédiak-Higashi syndrom
• Immunglobulinmangel (IgA, IgG 1-4)
• Hyperimmunoglobulinemi E (Job’s syndrom)
• Hypofosfatemi
• Opsonindefekter
• Mannan bindende protein (Lectin) mangel
H.Sjursen 26
• Normalt: →1.8 mm/t
• Nedsatt ved:
Noen infeksjoner
Brannskader
Malignitet
Underernæring
Revmatoid arthritt
Diabetes mellitus
Nøytrofile defekterDefekt i nøytrofil- avhengig immunforsvar
Kvantitativ Nøytropeni – den vanligste
– Ervervet • Medikament indusert• Autoimmun• Cancer• Leukemi
– Hereditær• Familiær benign
(etnisk) nøytropeni• Infantil genetisk
agranulocytose (Severe congenital neutropenia)• Cyklisk nøytropeni
H.Sjursen 27
Kvantitative Granulocyttfunksjons defekter
• Leukemi, aplastisk anemi, nøytropeni, brannskader, sepsis, diabetes, underernæring, AIDS, nyfødte
• Hyppigere og alvorligere infeksjoner
• Ofte med spesielle mikrober
• Rammer ofte mononukleære fagocytter tilsvarende
• Funksjonsdefekten fører til lite kliniske funn tross fulminant infeksjon
• Sjelden sepsis og meningitt
H.Sjursen 28
Kvalitative nøytrofile defekter
H.Sjursen 29
• Adhesjonsdefekter
– Leukocytt adhesions mangel (LAD)
• Type 1 Integrin mangel
• Type 2 E-selectin ligand mangel
Defekter i intracellulært srap• Abnormalt respiratory burst
• Kronisk granulomatøs sykdom
(CGD)
• Glukose-6-fosfat mangel
• Granula abnormaliteter
– Myeloperoxidase mangel
– Spesifikke granula mangler
– Chédiak-Higashi syndromH.Sjursen 30
H.Sjursen 31
Nøytrofil og lymfocytt fra en pasient med Chediak-Higashi syndrom. Store dysmorfe granula (se pil)
Kronisk granulomatøs sykdom (CGD)
• 1: 250 – 500 000 (?)
• 70% x-bundet recessiv
• Mutasjoner i gener for 4 plasmamembran proteiner
• Svært nedsatt H2O
2produksjon
• Excessiv inflammasjon med granulomer
• DHR-test (Dihydro-rhodamin for intracellulært drap)
H.Sjursen 32
Kronisk granulomatøs sykdom (CGD)
• Alvorlige infeksjoner i hud, øre, lunger, lever, bein– Gingivitt, aphter
– Infeksjoner med katalase-produserende mikrober:• Staphylococcus aureus• Bacillus cepacia• Aspergillus
Behandling: antibiotika og IFN-γ profylakse
H.Sjursen 33
Behandling av granulocytt defekter
• Antibiotika profylakse
• Granulocytt transfusjon (CGD)
• Beinmargs transplantasjon
• Gen terapi (CGD)
• Stamcelle transplantasjon
– CD34
H.Sjursen 34
Granulocyttfunksjonsundersøkelser
• Kjemotakse• Fagocytose (og drap)• Oxidative burst (DHR-test)• Reseptorundersøkelser• Fc-reseptorer (CD16, 32, 64)• C-reseptorer (CD11/CD18, CD35)• IFNγR1• Toll-like reseptorer (2 og 4)
H.Sjursen 35
Kjemotakse
H.Sjursen 36
H.Sjursen 37
Transwell kjemotaksi plate Granulocytter: porestr. 3 µmMonocytter: porestr. 5 µm
ELISA plate Incubator/ Shaker (Labsystems i EMS) til kjemotaksi, fagocytose, ic. drap
H.Sjursen 38
96 brønners celle cultur plate i polypropylen m rund bunn til flowcytometer
Flowcytometer (Cytomics FC 500 MPL (Multi-plate loader)
H.Sjursen 39
• Væskestrømscytometri• Fagocytose og oxidativ burst• S. aureus og opsonisert zymosan
• Fc- og Komplement reseptormåling
H.Sjursen 40
H.Sjursen 41
Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)
H.Sjursen 42
Med to lasere
H.Sjursen 43
Med 3 lasere5 Color FACSort optical layout
Med 3 lasereMed 3 lasere
Med 3 lasere Gir 5 farger
H.Sjursen 44
FCM sorting av 3 ulike alger
H.Sjursen 45
Flow cytometer output of BacLight® stained marine bacteria. BacLight® is a dual nucleic acid stain that causes live bacteria to fluoresce green and dead bacteria to fluoresce red when excited with the 488 nm argon laser of the flow cytometer
H.Sjursen 46
Ly
Mo
Granulocytter
Celle-debris RBC
H.Sjursen 47
granMo
Ly
Flowcytogram for Oxidativ burst
Samme prinsipp for fagocytose og receptormåling med flere fluoriserende fargerH.Sjursen 48
OX.BURST S.aureus S.aureus S.aureus ZYM ZYM ZYM ZYM ZYM ZYM
SERUM: UTEN PHS PHS PHS PHS KTR KTR PAS PAS
Granulocytter % Med Fl1 Med Fl1 Med Fl1
Med Fl1 Med Fl1 Med Fl1
Med Fl1 Med Fl1
Med Fl1
% av KTR
% av KTR
% av KTR
% av KTR
KTR 100,0 0,4 62,6 100,0 117,5 100,0 112,0 100,0 116,5 100,0
PAS 1 100,0 0,4 1,8 2,9 7,6 6,5 5,7 5,1 8,7 7,5
OXIDATIVT BURST – INTRACELLULÆRT DRAP
H.Sjursen 49
Fagocytose av Staph.aureus-RGX
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
PHS KTR PAS
Opsoniserende serum
Fago
cyto
se (f
luor
esce
nce)
KTR-GRANPAS-GRAN
Oksidativ burst av Staph.aureus
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
PHS KTR
Opsoniserende serum
Oks
idat
iv b
urst
(flu
ores
cenc
e)
KTR-GRANPAS-GRAN
H.Sjursen 50
Reseptor undersøkelser
Merkes med: – isoktr-FITC – isoktr-PE: Phycoerythrin– isoktr-PC5: Phycoeryhrin – Cyanin 5
CD11b-PE: C-receptor IIICD18-FITC:CD35-FITC: C-receptor ICD16-PC5: Fc-receptor III
CD32-PE: Fc-receptor IICD64-FITC: Fc-receptor I
H.Sjursen 51
Leukocytt adhesjonsdefekt (LAD)• LAD1: CD18-defekt, CR3 (komplement reseptor III mangel)
• LAD2: CD15 selectin-mangel
• Nøytrofili
• Defekt adheranse, aggregering, kjemotakse og fagocytose
• Redusert inflammasjon tross fulminant infeksjon (rtg. thorax neg.)
• Infeksjoner i hud/mucosa, gingivitt/periodontitt
• S. aureus og gramnegative stavbakterier
• Prognose relatert til reseptor nivå
H.Sjursen 52
LAD hos pasient, arvet fra mor
Naess A, Sjursen H, Leegaard J: Leukocyte adhesion deficiency in a Norwegian boy. Scand J Infect Dis; 1999;31(6):600-2 H.Sjursen 53
*CD64, FcR I kompensatorisk økning
*
H.Sjursen 54
Rekvirering av analyser
• Undersøkelsene gjøres ved:Infeksjonsmedisinsk forskningslaboratorium, Klinisk Institutt 2,Det medisinsk-odontologiske fakultet, Universitetet i Bergen
• Forhåndsavtale nødvendig: • Kontakt Overingeniør Steinar Sørnes Tlf. 55973067• eller Haakon Sjursen Tlf. 55972924
Takk for oppmerksomheten!
H.Sjursen 55