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GLUT e Neoplasias (Tumores): Os tumores, ao crescerem provocam um aumento da captação de glicose e da

taxa de glicólise. Para que esta (glicólise) ocorra é necessário haver oxigénio e, há medida que a quantidade deste diminui os tumores começam a ficar hipóxidos (pouco

oxigénio). Ao ficarem hipóxidos libertam o factor HIF (Hipoxy Induced Factor), muito importante na sobrevivência do tumor, que provoca uma adaptação metabólica, esta vai aumentar a expressão das proteínas envolvidas no metabolismo da glicose e no número

de transportadores GLUT 1 e 3, sendo a glicose captada pela célula. Como não há oxigénio, ocorre fermentação láctea, processo que vai fornecer

energia (ATP) e permitir o crescimento das células. Para compensar a falta de oxigénio, as células tumorais ao libertarem o factor HIF produzem outro factor, o UEGF (factor de crescimento endotelial vascular) que provoca um aumento da irrigação. Se fosse possível manter o tumor em hipoxia, o seu crescimento seria impedido.

Alguns tipos de neoplasias apresentam nas suas membranas transportadores de

glicose que não são expressos no tecido saudável, estando relacionada a expressão de

alguns tipos de transportadores ao grau de malignidade dos tumores. As células malignas possuem maior expressão de GLUT1 e 3. Quanto maior a

expressão destes transportadores, mais sombrio é o prognóstico. A expressão de GLUT1 está relacionada com o potencial maligno de neoplasias

mamárias, tumores hepáticos, pancreáticos, esofagianos, cerebrais, renais, ovarianos e

cutâneos. Já a presença elevada de GLUT3 encontra-se associada a neoplasias gástricas, ovarianas e pulmonares. Contudo estes transportadores não são comuns quando os

órgãos estão sadios. Os transportadores GLUT5 presentes em tumores mamários, também não são

encontrados neste tecido, quando normal. Recentemente descoberto o GLUT12 está expresso em células prostáticas e

mamárias neoplásicas, sendo que nos adultos também se encontra expresso na

musculatura cardíaca, esquelética e no tecido adiposo normal. Tumores do ovário, com maior produção de estradiol, podem estimular a

expressão de GLUT no tecido neoplásico e piorar o diagnostico. Ionóforos:

Os iões são substâncias muito pequenas, contudo essenciais para o correcto

funcionamento celular. Devido há existência de uma bicamada lipídica com regiões hidrofóbicas, os iões (por possuírem carga) tem dificuldades em atravessar para o meio

intracelular. Deste modo, podem atravessar a membrana através de canais proteicos, ou serem carregados por ionóforos.

Os ionóforos são moléculas sintéticas (não existem fisiologicamente) de

pequenas dimensões, que ao “mascararem” a carga dos iões vão permitir que estes se difundam através da bicamada lipídica.

Têm poder antibiótico.

Os ionóforos dividem-se em:

- Transportadores móveis O transporte depende da fluidez membranar,

sendo que os ionóforos realizam um movimento de flip-flop através desta. É muito específico relativamente ao tipo de iões que transporta;

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- Formadores de canais O canal transportador encontra-se fixo à

membrana, formando um poro hidrofílico que permite a passagem de iões, é um

transporte menos específico. Efectuou-se uma experiência para distinguir os

dois tipos de ionóforos, para isso estudou-se a condutância dos vários transportadores de acordo com

variações na temperatura. Verificou-se que num transportador móvel (Ex. Valinomicina) quanto maior for a fluidez membranar, maior o transporte efectuado.

Quando a fluidez da membrana é nula, também o transporte se aproxima de zero. No caso de transportadores formadores de canais (Ex. Gramicidina A), são

geralmente mais rápidos, não se verificando grandes variações com a alteração da temperatura.

Transportadores móveis

Dependem das propriedades físicas da membrana, mais precisamente da fluidez

da membrana, que também afecta, embora em menor escala, o transporte de outros ionóforos. À medida que se vai enriquecendo a membrana em colesterol, ela vai ficando

menos fluida, sendo menor o transporte efectuado por estes transportadores.

Ex. Valinomicina: Como exemplo de um ionóforo móvel podemos considerar a valinomicina, uma

molécula de pequena dimensão (circular com 4 resíduos peptídicos) que transporta iões

na seguinte escala decrescente de preferência:

Rb+ > K+ > Cs+ > NH4+ > Na+

Preferência por iões K+ relativamente a Na+. (Raio Iónico do K+ > Na+: 1,33 Ǻ e 0,95 Ǻ respectivamente)

É um valente antibiótico, pois ajuda a destruir o gradiente iónico membranar dos

microorganismos. Na valinomicina, o ião é englobado na molécula e a sua carga passa a ser

irrelevante. É um transportador móvel característico, tem uma zona interna que complexa o ião, escondendo a sua carga. É um ionóforo específico para K+ que se forma espontaneamente se houver muitos iões no meio. A valinomicina transporta potássio, ligando uma outra molécula. Esta é

transportada para um lado e o potássio para o outro. Quando se fala em especificidade do ionóforo, devemos ter em conta dois

factores:

- O raio do ião; - A energia de dessolvatação (energia de ligação do ião às moléculas de água que lhe permitem circular na água) ΔG associada a hidratação.

Os ionóforos do tipo móvel são mais selectivos devido a estes factores, enquanto os outros formam apenas poros. No poro, não é necessário ter a energia de dessolvatação

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em linha de conta. Quando se utiliza um ionóforo, aumenta-se a permeabilidade da membrana, mas o transporte dá-se sempre no sentido do gradiente. Este ionóforo tem a particularidade de envolver completamente o potássio,

mantendo a electronegatividade. Os oxigénios no centro do anel da valinomicina formam um local de ajuste

perfeito para o catião, daí que o raio do catião seja crítico. Iões muito grandes requerem

grande distorção do peptídeo, de forma a ajustá-los. Outro aspecto que confere especificidade quanto ao ião a transportar é a ΔG

associada a hidratação do mesmo. Quanto mais negativa é a ΔG associada, mais estável é o sistema, logo maior quantidade de energia é necessária para desidratar o ião. O Na+ tem uma ΔG de - 72 Kcal/mol enquanto K+ possui ΔG = - 55 Kcal/mol, logo é

energeticamente mais dispendioso desidratar Na+. Ex. Monensina:

É um ionóforo para Na+.

É um transportador móvel com sistema antiporte Na+/H+. A monensina tem

vários grupos carboxilo e, para transportar o ião, tem de perder os protões, fechando. Quando não se encontra complexada ao ião é uma molécula linear aberta e

neutra. Para poder ligar os iões, a monensina tem de alterar a sua estrutura, para isso

é desprotonada nos grupos carboxilo, fechando sobre si mesma. Deste modo assume a conformação cíclica que liga Na+, ficando novamente neutra, o que lhe permite

atravessar a membrana. Quando o sódio é libertado no interior celular, a monesina volta a ligar H+ (protonação dos grupos carboxilo) ficando novamente neutra, podendo assim atravessar a membrana sem problemas.

Como este sistema transporta H+ para um lado e Na+ para outro há uma

compensação de cargas, sendo o transporte electroneutro.

Ex. X-537A: Foi dos primeiros antibióticos a ser descoberto e um dos mais usados, embora

na actualidade não o seja. Transporta catiões monovalentes e bivalentes, por troca com protões. A molécula X-537A não é muito específica. Os seus grupos carboxilo são

desprotonados quando o ião se liga. No caso de um ião bivalente, são necessárias duas moléculas de X-537A e duas desprotonações, formando-se um dímero.

Ex. A23187: Trata-se de uma molécula aberta que se fecha quando complexa o ião, sendo

que as suas extremidades se unem através de uma ligação de hidrogénio. É um ionóforo carboxílico móvel para catiões bivalentes, nomeadamente cálcio

(Ca2+). Funciona da mesma maneira que o ionóforo anterior. Como o ião cálcio tem

duas cargas positivas, são necessárias duas moléculas do ionóforo, que realizam a transferência electricamente neutra dos iões, ou seja, juntamente com o cálcio são

transportados dois aniões ou um catião bivalente, para o lado oposto. O objectivo final é, sempre, manter a electroneutralidade.

A utilização de ionóforos de cálcio contribuiu decisivamente para a compreensão

do papel do Ca2+ nos processos celulares. Não é possível injectar cálcio nas células, mas

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recorrendo a este ionóforo o transporte deste ião torna-se é possível. Muitas respostas fisiológicas normalmente accionadas pela ligação de hormonas a receptores membranares de superfície podem ser deduzidas pela utilização de ionóforos de cálcio

que fazem elevar os níveis de Ca2+ intracelular.

Ex. Nigericina: Ionóforo carboxílico, mas com elevada especificidade para K+ e H+.

Possui função complementar à da valinomicina, dissipando o gradiente de K+,

mas mantendo o potencial de membrana devido ao antiporte com H+. Funciona como

protonóforo, sendo um transporte electroneutro. Conclusões:

Os ionóforos móveis são geralmente cíclicos (Ex. valinomicina), mas também

podem ser ácidos carboxílicos, que formam um anel através da junção das extremidades por ligações de H (Ex. A-23187).

O ião aprisionado no interior do anel estabelece interacções com os átomos

electronegativos do ionóforo de forma a compensar as ligações que anteriormente estabelecera com o solvente.

O elevado número de resíduos apolares na periferia do anel permitem que o

transportador se difunda no interior hidrofóbico da membrana.

Formadores de canais: Estes ionóforos são muito menos selectivos para os iões a transportar, contudo

o seu transporte é bem mais rápido. Existe um poro pelo qual ocorre transporte inespecífico.

Ex. Gramidicina: É um ionóforo para catiões monovalentes que estabelece poros hidrofílicos na

membrana formados por duas moléculas helicoidais. Este peptídeo forma espontaneamente dímeros na membrana, estes estão

ligados pelo terminal formil e formam o canal transmembranar. A formação destes dímeros é um processo reversível.

Num sistema fisiológico em que existe gramidicina, ela vai desfazer os

gradientes, mas não sendo específica para os iões, os transportes dão-se de acordo com os gradientes, até se estabelecer equilíbrio.

Protonóforos (Ionóforos de protões): São moléculas de baixa densidade de carga, em que esta está “localizada” no

anel, ou seja, está deslocalizada. São ácidos fracos, lipossolúveis, que penetram nas membranas biológicas quer

na forma protonada quer na desprotonada, transportando protões segundo um gradiente

de concentração. Ex. Dinitrofenol:

De nome químico 2,4-dinitrofenol, é um ácido fraco. Seria de esperar que a sua

base conjugada, 4-dinitrofenolato, não atravessa-se a membrana, mas na verdade a sua

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carga negativa encontra-se repartida por toda a estrutura, tendo por isso de um modo geral baixa densidade de carga, o que lhe confere vantagem para se difundir pela membrana.

Encontra-se na forma protonada quando o pH é

menor e na desprotonada quando é maior. O protonóforo liga o protão na face externa da

membrana e, no interior da célula, após passar pela

membrana, desliga-o. Funciona como desacoplador da fosforilação

oxidativa, pois dissipa o gradiente electroquímico transportando H+ para o interior da matriz.

Ex. FCCP: É um ácido fraco, lipossolúvel na forma protonada e desprotonada.

Tem um comportamento semelhante ao do DNP dissipando de igual forma o

gradiente electroquímico da membrana. Liga H+ no exterior, formando-se FCCPH que passa pela membrana e, no

interior o H+ é libertado, regressando o FCCP ao exterior. Na presença deste desacoplador a ATP sintetase deixa de funcionar como

sintetase de ATP e passa a ter função de ATPase, hidrolizando ATP de forma a repor o

gradiente de H+. Protonóforos – Cadeia Respiratória e Fosforilação Oxidativa:

Nas mitocôndrias, há síntese de ATP e gasto de

oxigénio. Estes organelos têm uma dupla membrana, em que

a primeira é permeável a quase tudo e serve apenas para isolar, e a mais interior é praticamente impermeável. O espaço intermembranar é muito importante.

O número de protões ejectados pela cadeia

respiratória é grande, e estas partículas associam-se á

fosforilação. Na fosforilação oxidativa mitocondrial (ocorre na membrana interna) existem

quatro complexos enzimáticos, onde ocorre transporte de electrões, cuja consequência é a redução do oxigénio a água. Os complexos I, III e IV ejectam protões para o espaço intermembranar, gerando-se um gradiente de protões, que contribui para um potencial

eléctrico de membrana particular. O complexo V, ATP-sintetase, sintetiza ATP por fosforilação de ADP (que só

ocorre se houver fosfato), quando se dá a passagem de protões pelo complexo. Os ionóforos provocam a ruptura do gradiente protónico. Quando ocorre fosforilação oxidativa, o processo é desacoplado na presença de

dinitrofenol, pois este protonóforo transporta protões para o interior da mitocôndria. Na presença de FCCP, também ocorre um aumento de protões no interior da

mitocôndria, sendo a velocidade de ejecção maior (processo mais rápido). A baixa densidade e a deslocalização da sua carga permitem que o FCCP atravesse a bicamada

com a mesma facilidade tanto no estado protonado como no desprotonado. A cadeia continua a funcionar, consome-se muito oxigénio e não há produção de ATP, mesmo que haja ADP, uma vez que a ATP sintetase não funciona sem o gradiente. Os protonóforos

podem ser designados, portanto, de dissociadores energéticos. O dinitrofenol e o FCCP podem levar à morte celular.

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Aplicação dos Ionóforos: 1. Estudos bioenergéticos, por exemplo sobre a capacidade da membrana interna

para sintetizar ATP com base num gradiente electroquímico; 2. Impedir a respiração para que não haja síntese de ATP natural, e assim estudar o

efeito de diversos compostos; 3. Estudos bioquímicos, especialmente de permeabilidade membranar.

Transporte activo: Refere-se ao transporte de solutos contra um gradiente de concentração, é um

processo endergónico estando por isso muitas vezes associado a reacções exergónicas, como hidrólise de ATP, absorção de luz, transporte de electrões e fluxo de outras

substâncias a favor do gradiente. Por exemplo o transporte de K+:

O transporte de potássio de fora

para dentro, onde está mais concentrado, é um processo endergónico (não ocorre espontaneamente) que requer gasto de

energia, pois a ΔG = +5 Kcal/mol. Na célula este processo requer transportadores, as ATPases.

Transporte activo primário – O transporte dos iões está associado ao gasto

directo de ATP, utilizando a energia proveniente da hidrólise deste. Um exemplo é a Na+/K+ ATPase, entre outras ATPases.

Transporte activo secundário – Utiliza a energia conservada num gradiente

iónico para transportar solutos contra o gradiente de concentração, por um sistema antiporta. Este movimento não está associado à hidrólise de ATP. Um exemplo é o Co-transporte Glicose/Na+ nas células epiteliais do intestino.

Nota: O co-transporte é o transporte de duas substâncias ao mesmo tempo. Ele pode traduzir o movimento das duas substâncias no mesmo sentido – Simporta, ou em

sentidos opostos, em que uma entra e outra sai – Antiporta.

ATPases (Classificação, Funções e Patologias):

São proteínas associadas ao transporte activo primário, encontram-se em

membranas biológicas e utilizam a energia libertada na hidrólise de ATP para transportarem iões contra o gradiente electroquímico. A manutenção das várias concentrações de iões no meio intracelular é fulcral

para a viabilidade das células. No meio citoplasmático é estritamente necessário manter elevadas concentrações de K+ e baixas concentrações de Na+ e Ca2+, geralmente o pH é

mantido neutro. Deste modo, uma porção significativa da energia disponível na célula é utilizada para manter o gradiente de concentração destes iões (K+, N+, Ca2+, H+) através das membranas.

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Classes de ATPases responsáveis pela manutenção do gradiente iónico:

1. Classe P 2. Classe F 3. Classe V

4. Superfamília ABC Classe P:

Foram as primeiras a ser descritas, são as mais conhecidas, as mais abundantes

e as que apresentam a estrutura mais simples. São constituídas por 4 subunidades

transmembranares, 2α e 2β, as subunidades α contêm o local

de ligação do ATP, enquanto que as subunidades β têm função reguladora. Durante o transporte, pelo menos uma das

subunidades α é fosforilada e pensa-se que o transporte se dá

através dessa subunidade.

O transporte de iões por estas ATPases está sempre associado a um ciclo de

fosforilação/desfosforilação. O fosfato resultante da hidrólise de ATP é transferido para um resíduo de

aminoácido da ATPase, o que conduz a uma alteração conformacional. Pensa-se que é

esta alteração que determina a afinidade do transportador pelo ião a ser transportado. A esta classe pertencem as ATPases:

- Na+/K+ ATPase (Membrana plasmática dos eucariotas);

- H+ ATPase (Membrana de plantas, fungos e bactérias); - H+/K+ ATPase (Membrana plasmática do estômago de mamíferos) - Ca2+ ATPase (Células eucarióticas, na membrana plasmática e na membrana

do retículo sarcoplasmático das células musculares); - Ca2+/K+ ATPase (Retículo endoplasmático e sarcoplasmático);

- K+ ATPase (E.coli).

Na+/K+ ATPase da membrana plasmática:

Funciona como antiporta, lançando 3 Na+ para fora e 2 K+ para dentro. É por isso

um sistema electrogénico, que cria um movimento “net” de 1+ para fora, gerando uma carga negativa dentro da célula. O mecanismo pelo qual esta bomba actua é simples: Os iões de Na+ e o ATP

ligam-se ao transportador quando este se encontra na conformação E1 (face citosólica da

membrana). O ATP é desfosforilado e o fosfato resultante vai fosforilar um resíduo de aspartato do transportador, induzindo uma alteração conformacional da forma E1 para a E2. Os iões de Na+ são libertados para o espaço extracelular, ligando-se de seguida dois

iões de K+ ao transportador (face exoplasmática). Esta ligação promove a remoção do grupo fosfato, levando a nova alteração conformacional. Finalmente os iões de K+ são libertados completando o transporte de iões.

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A ouabaína e a digoxigenina são duas drogas capazes de inibir a função desta

bomba. Ligam-se à face exoplasmática, competindo directamente com o K+ pelo local de ligação ao transportador e inibindo deste modo a desfosforilação do resíduo de aspartato e consequentemente a função da ATPase. Experiências realizadas em proteoliposomas com Na+/K+ ATPases na membrana

provaram que é possível sintetizar ATP. Ao induzirmos um interior celular com elevada

concentração de K+ e um exterior rico em Na+, verifica-se que o transporte se efectua no sentido oposto ao observado nas células, dissipando-se o gradiente gerado artificialmente. O resultado é a produção de ATP a partir de ADP + Pi. Isto vem provar

que as ATPases podem também funcionar como ATP sintetases. Nota: Bactérias, fungos e plantas não possuem esta bomba iónica. Nestes

organismos o Δψ de membrana é gerado por outras proteínas. Bactérias anaeróbias possuem H+ ATPases, que usam o ATP resultante da glicólise para gerar um gradiente de protões. A energia é então conservada num gradiente iónico

sendo utilizada para transportar solutos contra o gradiente de concentração (transporte activo secundário). Bactérias aeróbias e mitocôndrias funcionam de forma semelhante. Na cadeia

respiratória ocorre transporte de electrões, e associado a este a expulsão de H+. A energia libertada no processo de transferência de electrões é armazenada num gradiente de H+ sendo depois utilizada na síntese de ATP.

Ca2+ ATPase das células musculares:

Encontra-se presente na membrana plasmática e na membrana do retículo

sarcoplasmático. Esta bomba transporta Ca2+ activamente para

fora do citosol, quer para o espaço extracelular, quer para o interior do RS. As biomembranas são relativamente

impermeáveis a Ca2+, sendo fundamental para a funcionalidade da célula que a concentração

intracelular deste ião seja baixa. Em virtude de um estímulo hormonal (alteração

da voltagem) os canais de Ca2+ (de reservatórios intracelulares ou do exterior) abrem, levando a um aumento da sua concentração no citoplasma.

Este aumento desencadeia várias respostas, como a contracção muscular e a fosforilação de enzimas. A principal fonte de cálcio para a contracção muscular consiste naquele que é libertado pelo retículo sarcoplasmático.

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a) Ca2+ ATPase da membrana do Retículo Sarcoplasmático: Constitui mais de 80% do total de proteínas membranares do RS e realiza o

transporte de Ca2+ do citosol para o interior do retículo. O RS é um organelo com grade capacidade de armazenamento de Ca2+, a sua

libertação para o citosol provoca a contracção muscular e a sua remoção por estes transportadores (Ca2+ ATPase) induz o relaxamento. No interior do RS existem duas proteínas solúveis que ligam Ca2+:

- Calsequestrina É uma proteína extremamente ácida (37% dos seus

aminoácidos são resíduos de aspartato e glutamato). Cada molécula destas é capaz de

ligar 43 átomos de Ca2+. No entanto, e apesar da sua grande capacidade de ligar Ca2+, possui um Km elevado (Km = 1 mM) o que significa que só liga Ca2+ quando este está presente em grande quantidade – baixa afinidade. - Proteína ligadora de Ca2+ de alta afinidade É outra proteína

presente no interior do RS que auxilia na função de reservatório de Ca2+. Apesar de ter

menor capacidade para se ligar a este ião possui uma afinidade bastante mais elevada (Km = 3 - 4 μM)

A importância destas duas proteínas reside no facto de ambas funcionarem como

reservatório intracelular de Ca2+. Desta forma reduzem a concentração deste ião livre no interior do RS (o gradiente de concentração de determinada substância depende

essencialmente da sua quantidade livre no solvente). O gradiente iónico diminui e consequentemente é necessária menor quantidade de energia para promover o transporte activo de Ca2+ para o interior do RS pelas Ca2+ ATPases. O mecanismo de funcionamento destas ATPases é igualmente simples. O

transporte de Ca2+ está acoplado à hidrólise de ATP, desta forma, a fosforilação do

resíduo de aspartato (pelo fosfato libertado pelo ATP) promove uma alteração conformacional da enzima (Ca2+ ATPase) de E1 para E2, permitindo a libertação de Ca2+. Mais especificamente, os locais de grande afinidade para o catião (Ca2+) estão

voltados para o citosol (E1), após a ligação de dois iões de Ca2+, o ATP também se liga à proteína, sendo que esta ligação necessita de um co-factor (Mg2+), ou seja de uma Mg2+

ATPase. O ATP é então hidrolisado e o fosfato resultante liga-se a um resíduo de

aspartato, formando uma ligação aspartil-P altamente energética (E1-P). Induz-se uma alteração conformacional da ATPase para a forma E2, levando a uma perda de afinidade da enzima pelo Ca2+, que é libertado lúmen do RS. Depois desta libertação, a ligação

aspartil-P é hidrolisada, o que provoca uma nova alteração conformacional da enzima para a forma inicial (E1). Neste momento os locais de ligação de Ca2+ virados para o lúmen ficam inactivos e os do lado citosólico são activados.

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Experiência de Mitchell – Reversibilidade das ATPases: Num meio apropriado, foram colocadas vesículas do RS isoladas e purificadas,

juntamente com ATP e Ca2+. Devido à existência de um gradiente de concentração e energia (ATP), o Ca2+ é transportado para o interior das vesículas por acção da Ca2+

ATPase. De seguida transferiram-se as vesículas carregadas com Ca2+ para uma solução contendo ADP + Pi e nenhum Ca2+. O resultado é a dissipação do gradiente de Ca2+ e formação de ATP. Deste modo Mitchell provou que os gradientes iónicos contêm energia

suficiente, que pode ser utilizada na síntese de ATP, neste caso, no exterior da vesícula. Provou também a reversibilidade destas proteínas.

b) Ca2+ ATPase da membrana plasmática:

É importante para o correcto funcionamento celular manter os níveis de Ca2+

baixos no citosol, existindo, para tal efeito, na membrana plasmática de várias células, Ca2+ ATPases, que expelem o Ca2+ para o espaço extracelular. O aumento da concentração de Ca2+ no citosol é um sinal de activação de várias

respostas celulares, contudo após estas respostas é necessário que a concentração deste

ião retome níveis normais no citosol. Deste modo, a célula pode ser estimulada novamente, note-se que elevados níveis de Ca2+ no citosol podem conduzir à morte celular. O cálcio é excluído pela ATPase para o exterior celular e para o interior de alguns

organelos, como o retículo endoplasmático e as mitocôndrias. No entanto, o RE apesar de apresentar grande afinidade para este composto não apresenta grande capacidade de

armazenamento, e as mitocôndrias apesar de possuírem grande capacidade de armazenamento não possuem grande afinidade. Como a afinidade é reduzida, este

organelo funciona como reservatório apenas em situações de doença, em que a concentração de Ca2+ é muito elevada. Ou seja, funciona como tampão em situações de disfunção celular (doença).

Calmodulina (CaM):

Encontra-se grandemente distribuída no citosol e funciona de uma forma simples. É uma proteína com grande afinidade para

o Ca2+, que regula a actividade da Ca2+ ATPase

presente na membrana plasmática de eritrócitos e de outras células, ligando-se alostericamente à enzima, activando-a. Possui 4 locais de ligação para iões Ca2+

com motivos hélice-loop-hélice (zonas EF).

Normalmente possui uma conformação aberta, mas quando a concentração deste ião aumenta acima dos 5x10-7, ele liga-se à CaM e esta sofre uma

alteração conformacional, que a torna mais compacta, expondo o seu domínio hidrofóbico. Este serve de interface para a interacção com a Ca2+

ATPase. Um aumento na concentração intracelular de Ca2+ induz a ligação de iões Ca2+ à

calmodulina, conduzindo a uma activação alostérica (pela CaM) da Ca2+ ATPase. Esta altera o Km de 80 μM para 10 μM, aumentando a velocidade de transporte. Assim, a expulsão de Ca2+ para o exterior aumenta, diminuindo a concentração de Ca2+ no citosol.

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Inibidores da Calmodulina: A actividade da calmodulina pode ser

inibida pela utilização de Trifluoperazina (TFP) ou de outros agentes anti-psicóticos.

Estes ligam-se ao domínio hidrofóbico da calmodulina, ocupando assim, o local de interacção entre a calmodulina e a Ca2+

ATPase. Esta ocupação impede a activação alostérica do transportador e

consequentemente a saída de Ca2+. Note-se que a ligação de TFP à calmodulina está dependente da ligação de Ca2+ a

esta. Só quando o Ca2+ se liga à CaM é que o domínio hidrofóbico é exposto e o TFP

pode actuar.

H+ ATPases: A H+ ATPase das células vegetais é uma enzima fundamental, desempenhando o

papel de bomba de protões para o apoplasto. Desta forma controla o pH intra e extracelular, alcalinizando o citosol e desencadeando a síntese de ácido málico. Este vai afectar o ciclo de Krebs e consequentemente a razão NADH/NAD+. Outras funções são reguladas pela actividade desta ATPase, como a abertura e

fecho dos estomas e o desenvolvimento da polaridade nas plantas jovens. É totalmente inibida por DES e Vandato, este último é muito generalista, pois é

análogo do fosfato, inibindo todas as fosfatases ácidas, alcalinas e todas as ATPases do

tipo P.

Classe F: Podem encontrar-se nas membranas mitocondriais, nos

cloroplastos (nos tilacóides, no interior dos grana, onde se dá a

fotossíntese) e na membrana plasmática de bactérias. Todas as ATPases deste grupo são protónicas, ou seja,

promovem o movimento de protões (H+) e utilizam o seu gradiente para fosforilar ATP, sem a formação de um intermediário fosforilado (não ocorre ciclo de fosforilação/desfosforilação).

São constituídas por 8 a 13 peptídeos divididos em dois domínios diferentes:

- Domínio hidrofóbico F0 Encontra-se embebido na membrana e forma

o canal protónico; - Domínio hidrofílico F1 Local catalítico que promove a síntese de ATP.

Estas ATPases sintetizam ATP através do gradiente de protões e, no sentido

inverso, usam ATP para transportá-los. Funcionam de forma inversa ás restantes

ATPases, pois o gradiente de protões é utilizado para a formação de ATP a partir de ADP + Pi. Contudo, em situações de anoxia (sem respiração), ocorre uma reversão, na qual o ATP é usado para manter os gradientes (ΔH+), Têm actividade reversa, ou seja, funcionam como ATP sintetases, apenas se os

H+ fluírem a favor do gradiente de concentração.

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Classe V: Bastante semelhantes ás do tipo F, sendo também protónicas (transportam

exclusivamente H+), utilizam a energia da hidrólise de ATP sem no entanto formarem um intermediário fosforilado. Mas ao contrário das F, promovem um transporte unidireccional

de H+ gerando um potencial. Existem na membrana dos vacúolos de plantas, leveduras e outros fungos, nas

membranas dos endossomas e lisossomas (mantendo sempre um pH baixo necessário à funcionalidade destes organelos) das células animais e na membrana plasmática dos osteoclastos e das células tubulares dos rins. São formadas por muitas subunidades sendo que algumas estão associadas à

hidrólise de ATP e outras à translocação de H+.

Dividem-se em dois domínios:

- Domínio Vo Forma o canal protónico (o O em índice deriva de

“oligomicina”, um composto que inibe especificamente a passagem por este componente); - Domínio V1 Apresenta actividade catalítica.

A acidificação (pH baixo) provocada por estas bombas permite uma melhor acção

de clivagem de enzimas digestivas, pois causa desnaturação. São importantes no crescimento dos ossos.

ATPases tipo V (em vacúolos):

Regulam a concentração de iões e sacarose no interior de vacúolos de plantas.

Por exemplo, com a fotossíntese realizada durante o dia há um excesso na produção de sacarose, este excesso é armazenado nos vacúolos. Durante a noite, esta mesma sacarose sai para o citosol onde é metabolizada com consequente produção de ATP.

A membrana dos vacúolos possui dois tipos de

bombas, H+ ATPases (Tipo V) e Pirofosfatases (Bombas protónicas exclusivas de vacúolos de plantas). Estas bombas ao ejectarem H+ no interior do vacúolo,

conduzem a um decréscimo do pH, bem como a um potencial eléctrico positivo ao longo da face interna da membrana vacuolar.

Devido a este gradiente eléctrico ocorre entrada de aniões Cl- e NO3- através de canais proteicos (Transporte activo em resposta a um gradiente eléctrico

Transporte secundário). A entrada destes aniões vai compensar o excesso de cargas positivas presente no

interior do vacúolo, dissipando o gradiente eléctrico. Esta dissipação permite a contínua entrada de H+ reduzindo assim o valor de energia necessário ao seu transporte

activo. Na membrana de vacúolos é também possível encontrar transportadores

antiporta, activados pelo gradiente de H+, que vão acumular Na+, Ca2+, e sacarose no interior do vacúolo, ao mesmo tempo que expelem H+ para o citosol.

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Em suma existem três grandes tipos de transportadores nas membranas

vacuolares: Bombas protónicas, canais proteicos, e transportadores antiporta. Renovação óssea – Osteoclastos: Os osteoclastos ligam-se ao osso, e fecham

um pequeno espaço extracelular entre a membrana plasmática e a superfície deste. Apresentam H+ ATPases na membrana que

excluem H+ para o exterior de forma a baixar o pH

externo e dissolver o osso. A solução acídica gerada dissolve a matriz mineral óssea constituída essencialmente por CaCo3 e hidroxiapatite (fosfato

de cálcio). Após terminar o crescimento de um indivíduo, o organismo equilibra a formação

de novo tecido ósseo (pelos osteoblastos) com a dissolução da matriz óssea (pelos osteoclastos).

Na membrana plasmática dos túbulos renais, existe uma H+ ATPase muito

importante, pois contribui para a manutenção do equilíbrio ácido-base do organismo ao secretar protões para a urina em formação. A acidez contribui para a destruição de

bactérias e para a fluência.

ATPases da Superfamília ABC:

Recentemente descoberta, todos os membros

desta família possuem dois domínios transmembranares (T

– Formados por 6 α-hélices), que constituem um canal de

passagem de solutos, conferindo especificidade a cada membro desta família. Estas ATPases apresentam ainda

dois domínios citosólicos (A) de ligação ao ATP. Estes domínios apresentam cerca de 30 a 40% de homologia em todos os membros desta superfamília, evidenciando uma

origem evolutiva comum. Algumas proteínas desta superfamília apresentam ainda uma subunidade

reguladora, que liga ao substrato. Nesta superfamília não se tem conhecimento da formação de intermediários

fosforilados, ou seja, elas utilizam a energia libertada na hidrólise de ATP para efectuar o

transporte de solutos. Transportam fosfolípidos, drogas lipofílicas, colesterol e outras moléculas

pequenas, na membrana plasmática de mamíferos, e aminoácidos, açúcares e peptídeos, na membrana plasmática de bactérias. Existe uma relação entre estes transportadores e a quimioterapia, uma vez que

transportam a adimicina para o exterior da célula assim que ela entra, impedindo a sua acção anti-tumoral. A ideia de que estas ATPases só existem em situações patológicas é falsa, pois

estas proteínas encontram-se normalmente nas células. Os aspectos terapêuticos só

foram descobertos posteriormente.

50

Permeases da Membrana Plasmática de Bactérias: As bactérias possuem numerosas permeases da superfamília ABC, que as ajudam

a captar aminoácidos, açúcares, vitaminas, péptidos, etc. Dado que a maioria destas bactérias vive em solos e charcos com baixas

concentrações de solutos, estas proteínas permitem-lhes concentrar nutrientes dentro da célula contra um gradiente de concentração. As bactérias gram (-), como a E.coli, importam solutos através de permeases

ABC, que utilizam uma proteína solúvel ligadora de substrato presente no espaço

periplasmático. A quantidade de proteína solúvel transportadora presente na membrana é

regulada pela concentração de nutrientes no meio, e pelas necessidades metabólicas da bactéria. A Histidina permease é uma

permease ABC típica, possui dois domínios transmembranares e dois citosólicos de

ligação ao ATP. As bactérias gram negativas possuem a membrana externa separada por um espaço periplasmático da membrana

interna. Isto complica a importação de histidina pois obriga-a a atravessar duas membranas. A histidina entra, através de

uma porina da membrana externa, para o espaço periplasmático, onde se liga a uma proteína solúvel e específica.

Esta vai transportar a histidina directamente para as subunidades T da permease ABC, que por sua vez a transportam para o citosol, à custa da energia libertada pela hidrólise de ATP.

MDR1 (Multidrug Resistance Transporte Protein): Algumas células cancerígenas tornam-se frequentemente resistentes a várias

drogas quimioterapêuticas. Biólogos celulares observaram que, culturas de células resistentes a uma toxina

em particular, muitas vezes se tornavam também resistentes a outras drogas. Estudos subsequentes revelaram que esta resistência se devia à expressão de um

transportador proteico conhecido como MDR1. Uma glicoproteína transmembranar pertencente à superfamília ABC que possui as 4 subunidades fundidas numa única

unidade, e exporta drogas do citosol para o meio extracelular. As drogas transportadas por esta proteína são pequenas moléculas hidrofóbicas

que se difundem através da membrana plasmática para o citosol, a MDR1 ao expelir estas substâncias de volta ao espaço extracelular faz com que maiores concentrações de toxina sejam necessárias para um tratamento quimioterapêutico. A MDR1 existe principalmente em órgãos como o fígado, intestinos e rins, locais

onde se executa a remoção de produtos naturais tóxicos ao organismo. E nestes casos, a

função de MDR1 é o transporte de vários produtos para a bílis, lúmen intersticial ou urina. Pensa-se que durante a evolução, esta proteína tenha adquirido a capacidade de transportar drogas semelhantes a estas toxinas naturais. Nas células cancerígenas do fígado, os hepatomas, as células tendem a sobre

expressar esta proteína tornando-se resistentes a muitos agentes terapêuticos.

51

Possível modelo de acção da MDR1 – Modelo Flipase:

Este modelo propõe que a substância lipossolúvel se difunda passivamente

através do folheto citoplasmático da membrana, até alcançar o local de ligação do transportador MDR1, localizado no interior da bicamada lipídica. O composto a transportar tem sempre uma parte polar e uma parte apolar e, alinhando-se com as

zonas hidrofílicas e hidrofóbicas das membranas, é depois integrado entre as subunidades T. De seguida, e à custa da energia da hidrólise de ATP, estas subunidades

sofrem um movimento de flip-flop, sendo a droga transportada para o folheto externo da membrana plasmática e depois excretada no meio extracelular. De acordo com este modelo, cada transportador tem um único local de ligação para a droga.

Como o transporte se dá de uma zona menos concentrada para uma zona mais

concentrada, o transporte é activo e dá-se com gasto de ATP.

Este modelo de flipase fundamenta-se no mecanismo de acção de uma proteína

homóloga, a MDR2, existente na membrana plasmática dos hepatócitos. Esta promove o

“flip” de fosfolípidos do folheto citosólico da membrana para o folheto extracelular. Estes fosfolípidos vão fazer parte essencial da bílis. Existe ainda um outro modelo, o do transportador tipo bomba. Neste modelo a

droga é transportada segundo um mecanismo semelhante às restantes ATPases, com gasto de ATP.

Fibrose Cística (Mucoviscidose):

É uma doença genética, comum entre

caucasianos, que está associada a mutações autossómica

recessivas em ABC ATPases. Caracteriza-se por uma obstrução dos sistemas

respiratório e gastrointestinal, que leva a infecções bacterianas. Os indivíduos que sofrem desta doença exprimem uma proteína membranar

mutante, a CFTR, constituída por 12 α-hélices transmembranares e estruturalmente

semelhante à MDR1. A proteína CFTR normal (presente nas membranas dos pulmões e

do pâncreas), funciona como um canal específico para cloro, que aumenta a sua

actividade quando fosforilado.

Mutações no gene codificante para esta proteína podem ter os seguintes efeitos:

- A proteína não se insere adequadamente na membrana; - A proteína é inserida correctamente na membrana mas não é fosforilada.

52

Qualquer um dos casos resulta num canal de Cl- não funcional. Normalmente, as células epiteliais que revestem a superfície interna dos pulmões

secretam uma substância mucosa, que aprisiona e mata as bactérias invasoras, sendo estas expelidas para o exterior com a ajuda do movimento dos cílios das células do trato

respiratório. Em indivíduos saudáveis, o muco é uma solução com baixa concentração de

NaCl, infelizmente em pacientes com fibrose cística a concentração de NaCl é elevada, o muco é mais espesso e as trocas gasosas são mais difíceis (eficiência grandemente reduzida). Existe um trocador Cl-/CO3

-. Sendo a CFTR um canal de Cl-, se esta proteína não

estiver a funcionar correctamente (mutada), não há exportação deste anião. Não ocorre

saída de cloreto, logo os gradientes de Cl- e Na+ ficam alterados (no muco). A capacidade bactericida do muco é diminuída.

Sistemas Simporta e Antiporta e Regulação do pH citosólico: Para que as células possam crescer e dividir-se correctamente, o pH citosólico é

um factor importante, devendo ser muito bem regulado e mantido sempre dentro dos estreitos limites.

No interior celular, são muitas as reacções metabólicas de que resultam ácidos

fracos, estes dissociam-se e aumentam a concentração de H+ livre no citosol. São por isso necessários sistemas membranares para transportar os H+ para o espaço

extracelular, só assim se consegue prevenir a acidificação do citoplasma.

Co-transportador Na+ HCO3

-/Cl-: Este transportador importa 1 Na+ segundo o seu gradiente

de concentração, juntamente com 1 HCO3- contra o seu gradiente.

Uma vez dentro da célula o HCO3- combina-se com um H+,

proveniente do metabolismo celular, originando H2O e CO2, que se

difunde para fora da célula. Desta forma, o correcto funcionamento deste transportador contribui para a

manutenção do pH citosólico, uma vez que reduz o número de H+ livres no citoplasma.

Antiporta H+/Na+: Conjuga a entrada de Na+ segundo o seu gradiente de concentração com a saída

de H+ contra o gradiente de concentração deste.

Antiporta Cl-/HCO3

-: É um transportador presente na membrana plasmática das

células animais (semelhante à banda 3 de eritrócitos) que contribui

para a manutenção do pH extracelular. Este transportador combina a saída de 1 HCO3

- citosólico em troca com a entrada

de 1 Cl- a favor do seu gradiente de concentração, é um transporte electroneutro. Baixa o pH citosólico ao exportar o excesso de OH-.

53

A actividade destes três transportadores

(Co-transportador Na+ HCO3-/Cl-, Antiporta H+/Na+

e Antiporta Cl-/ HCO3-) depende do pH do meio. As

células encontram-se assim equipadas com

mecanismos bastante eficientes para regular o seu pH.

Quando o pH desce, o antiporta Na+/H+ e o co-transporte Na+ HCO3

-/Cl- são

activados. A sua função é baixar a concentração de H+ livres no citosol, elevando o pH.

Quando o pH está acima de 7 é o antiporta Cl-/HCO3- que fica activo, expelindo HCO3

- até o pH baixar para valores fisiológicos.

Banda 3 – Antiporta Cl-/HCO3-:

O seu nome deriva do facto de ser a terceira banda a aparecer num gel de um

eritrócito. Existe nos eritrócitos, mas também nas células parietais do estômago.

É um transportador essencial ao nosso organismo, pois permite o eficiente

transporte de CO2 pelos eritrócitos. Este transportador promove um antiporta electroneutro, com saída e entrada de

1 anião monovalente, mas é também capaz de efectuar a reacção inversa, dependendo a

direcção do transporte apenas do gradiente de concentração.

a) Capilares Sistémicos:

O CO2 resultante do metabolismo é

libertado nos capilares, difundindo-se para os eritrócitos. Ao combinar-se com a H2O (pela acção da anidrase carbónica) origina H2CO3 (ácido

carbónico), que rapidamente se dissocia em HCO3- e

H+. Este processo é simultâneo à libertação de O2 pela hemoglobina, induzindo uma

alteração conformacional desta, o que possibilita a ligação de H+ ao resíduo de histidina. A remoção de H+ pela histidina provoca uma deslocação da reacção H2O + CO2 HCO3

-

+ H+ para a direita, no sentido de produzir mais H+. Assim a concentração de HCO3- no

interior do eritrócito aumenta muito. É neste momento que o transportador (Banda 3) promove a troca entre Cl-/HCO3

-, exportando HCO3- e importando Cl-.

Este sistema é de grande importância para o organismo pois permite o transporte

de CO2 dos tecidos para os pulmões, sendo que cerca de 80% do CO2 produzido pelo metabolismo celular é exportado desta forma. É também importante uma vez que sem a troca de aniões, o pH do citosol dos eritrócitos ficaria muito mais básico. A troca de HCO3

-

por Cl- permite manter do pH citosólico perto da neutralidade.

b) Capilares Pulmonares: Nos capilares pulmonares, a direcção de troca é inversa. O CO2 transportado

pelos eritrócitos difunde-se pela membrana e é expelido na respiração. Há um decréscimo na concentração de CO2, deslocando a reacção acima descrita no sentido

inverso, produzindo-se mais CO2 e H2O (esta reacção também é catalizada pela anidrase carbónica).

54

Como a concentração de O2 no exterior

(pulmões) é elevada, este tem tendência a entrar para o

interior do eritrócito (difusão) e a ligar-se à hemoglobina, que, por sua vez, sofre uma alteração conformacional e liberta o H+ ligado ao resíduo de histidina.

Devido a todos estes factores a concentração de HCO3

- no interior do eritrócito

diminui, e por isso, a Banda 3 promove a sua entrada em troca com Cl-. Assim, a influência do H+ no citosol diminui, ficando o pH menos ácido.

c) Células Parietais do Estômago:

O estômago dos mamíferos contém uma solução 0,1 M de ácido clorídrico (HCl).

Este ácido elimina muitas bactérias ingeridas e desnatura proteínas, que depois vão ser degradadas por enzimas proteolíticas actuantes a pH ácido (Ex. Pepsina).

As células parietais têm como função secretar HCl para o lúmen do estômago,

tornando-o ácido, pois as enzimas que aqui actuam, só funcionam neste pH. No entanto,

o pH destas células dever ser mantido em valores fisiológicos. A membrane apical das células

parietais possui H+/K+ ATPases, bem como canais proteicos de Cl- e K+. A membrana

basolateral contém antiportas Cl-/HCO3-.

Nas células parietais, H2O dissocia-

se em H+ e OH-, e este último reage com CO2 formando HCO3

-, que, por acção da antiporta Cl-/ HCO3

- é trocado por cloreto. O

H+ é transportado para o lúmen por troca com K+ (acção da H+/K+ ATPase).

O transporte de K+ é cíclico, uma vez que ele é transportado para o citosol, pela

ATPase, saindo de novo para o lúmen, pelos canais proteicos. Assim, o K+ entra para o

citosol por troca com H+ (ATPase), que sai para o lúmen. No entanto o Cl- que entra no citosol (por troca com HCO3

-) volta a sair, saindo também um K+ (pelo canal proteico) para compensar as cargas, mantendo-se a electroneutralidade.

O pH do interior mantém-se constante, porque saem iões H+, mas também grupos OH- (CO2 + OH- HCO3

- , por acção da anidrase carbónica). Se estes últimos

não saíssem, o pH tornar-se-ia básico. Daí a importância do antiporta Cl-/HCO3-.

Assim, a combinação dos diferentes transportes, com a acção da anidrase

carbónica, permite acidificar o lúmen do estômago, mantendo o pH das células parietais electroneutro.

Co-transporte Glicose/Na+ (Células Epiteliais do Intestino):

Nas células epiteliais do intestino, a concentração celular de Na+ é mantida muito

baixa devido à acção de uma Na+/K+ ATPase (Transporte primário), localizada na

membrana basolateral, que expele Na+ para o exterior contra um gradiente de concentração. Em resposta a este mesmo gradiente de concentração, o Na+ tem tendência a entrar na célula, e esta utiliza a energia conservada no gradiente iónico para

transportar glicose, juntamente com Na+, contra o gradiente de concentração (Co-transporte – Transporte secundário).

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Este co-transportador Glucose/Na+

encontra-se na membrana apical e liga 2

Na+ e uma molécula de glicose na face externa da membrana. Quando os iões de Na+ são libertados no meio intracelular, o

transportador sofre uma alteração conformacional, perdendo afinidade pela molécula de glicose que é então libertada

no interior da célula. Dentro da célula, a molécula de glicose atravessa a membrana

basolateral através de outro transportador, o GLUT2, que permite a difusão facilitada da glicose, passando esta para a corrente

sanguínea. Antiporta de Na+/Ca2+ (Células Musculares e Nervosas):

É bastante importante regular os níveis de Ca2+ no interior das células. Ligeiras

variações na concentração deste ião são responsáveis por muitos processos biológicos, como a contracção muscular, secreção em glândulas e transmissão do impulso nervoso. No entanto, depois da resposta ser efectuada, convém que os níveis de Ca2+ retomem

valores normais, para isso existem dois transportadores importantes a Ca2+ ATPase (referida anteriormente, que utiliza a hidrólise de ATP para excluir Ca2+) e o transportador Na+/Ca2+, que é o principal responsável pela exclusão de Ca2+ em células

nervosas e musculares. O transportador Na+/Ca2+ efectua um movimento

antiporte e electrogénico. Não há compensação de cargas, uma vez que entram três cargas positivas (3 Na+) e saem

duas (1 Ca2+). Este transporte é electroforético, pois acontece à

custa de um estímulo (campo eléctrico). Trata-se de um transportador activo secundário, pois o Ca2+ é excluído devido a

um gradiente de concentração de Na+, este é, no entanto, criado pela Na+/Ca2+ ATPase.

Inibidores Cardiotónicos: Estes compostos levam à diminuição do ritmo cardíaco, inibindo as bombas de K+

e Ca2+. Aumentam a força de contracção do músculo cardíaco. A oubaína é um inibidor cardiotónico, é uma droga terapêutica usada em casos

de insuficiência cardíaca. Drogas como esta são frequentemente referidas como glicosídeos cardíacos, pois possuem resíduos de açúcares, embora estes não contribuam para a sua função, mas sim para a sua solubilidade no fluido intersticial. Os glicosídeos

ligam-se exclusivamente à face citosólica da Na+/K+ ATPase, formando um complexo muito estável, impedindo que o K+ se ligue e seja importado pela célula. A inibição da Na+/K+ ATPase provoca um aumento da concentração de sódio no

interior da célula, que conduz à activação da Na+/Ca2+ ATPase. No entanto, este trocador não funciona normalmente se a concentração de sódio dentro da célula aumentar, uma

vez que o gradiente de concentração de Na+ regula a actividade do antiporte Na+/Ca2+. Logo, a bomba Na+/Ca2+ fica inactiva, levando a um aumento da concentração de cálcio no interior celular (citosol).

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Concentrações elevadas deste ião (no citosol) promovem um aumento da força

de contracção muscular. Devido à acumulação de cargas positivas no interior celular, o potencial eléctrico

ao longo da membrana diminui e o Cl- extracelular entra (em condições normais o

potencial eléctrico sobrepõem-se à sua entrada, mas neste caso essa barreira é desfeita). Com a entrada destes iões, a concentração iónica intracelular é elevada e a água tende a entrar para contra-balançar a osmolaridade. Por esta razão as células que revestem os

vasos sanguíneos aumentam de volume e consequentemente dá-se um aumento da pressão arterial. Os glicosídeos são, por este motivo, utilizados com agentes terapêuticos em casos de insuficiência cardíaca. No entanto podem funcionar como um veneno em

casos de hipertensão (elevados níveis de glicosídeos). Existem várias plantas (Ex. Dedaleiro) e

animais (Ex. Borboleta Monarca) que produzem glicosídeos ou esteróides cardiotónicos, de forma

a poderem defender-se dos predadores.

Sistemas Transportadores em Procariotas:

Em procariotas o transporte de nutrientes é mais difícil e não é efectuado da

mesma forma que em eucariotas devido a dois factores: - O meio em que habitam difere muito em termos de composição nutricional;

- Têm de concentrar nutrientes contra um gradiente de concentração muito elevado.

Durante o processo evolutivo as bactérias desenvolveram e sistemas de

transporte poderosos, capazes de funcionar mesmo quando o gradiente de concentração

é de 100 vezes, entre interior e exterior celular. Normalmente, as permeases presentes nas bactérias são indutíveis, ou seja, a

quantidade de transportadores na membrana depende da concentração de nutrientes no meio extracelular e das necessidades metabólicas da célula.

De uma forma geral existem três tipos de transportadores em procariotas:

1. Sistema simporta Lactose/H+;

2. Sistema de Fosfotransferase (Translocação de um grupo fosfato); 3. Bacteriorodopsina (Bomba protónica).

1. Sistema Simporta Lactose/H+ em E. coli: Muitas bactérias obtêm a energia de que necessitam a partir da oxidação de

glucose em CO2. Durante este processo os electrões são transferidos para intermediários

metabólicos, como o piruvato e o NADH, ou para o O2 no final da respiração. Os transportadores de electrões nas bactérias são proteínas integrais

membranares, semelhante ao que acontece nas mitocôndrias. Ao longo da cadeia respiratória os electrões vão sendo bombeados para o espaço

extracelular, por um transporte activo primário do qual resulta um potencial eléctrico de membrana (cerca de 100 mV no interior) e um gradiente de H+. A energia conservada neste gradiente electroquímico de H+ é utilizada para sintetizar ATP e para importar

nutrientes para o interior do procariota.

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Em E. coli a lactose é acumulada no interior através de uma permease Lactose/

H+ simporta, constituída por 12 α-hélices transmembranares, que formam um canal

central, permitindo a passagem de H+ e lactose. Ocorre um influxo (entrada) de H+ segundo um gradiente de concentração acoplado ao transporte de lactose na mesma

direcção. Trata-se de um transporte activo secundário.

Demonstração do Co-transporte de Lactose/H+:

Utilizando um inibidor como o cianeto,

podemos observar como este movimento é

dependente da fosforilação oxidativa E.coli envenenadas com cianeto são

incapazes de acidificar o meio extracelular, através

de uma bombagem activa de H+ (bomba protónica

inibida), e, consequentemente, acumular lactose.

O pH interno e externo igualam-se. Se adicionar-mos HCl ao meio (acidificação) estamos a fornecer H+, não havendo

assim, qualquer limitação ao simporta Lactose/H+. Neste caso as bactérias adquirem capacidade para acumular lactose, utilizando a energia contida neste gradiente de H+

artificial, o simporta dá-se mais rapidamente. A acumulação de lactose requer um potencial de H+ (força protomotriz).

A eficiência das mitocôndrias deve-se à acumulação de H+ no espaço

intermembranar, o mesmo acontece nas bactérias que possuem duas membranas. Uma outra experiência que demonstra este co-transporte consiste em adicionar

valinomicina a uma cultura de E.coli mutante, que não expressa a permease Lactose/H+.

A valinomicina é um ionóforo de K+, que ao transportá-lo para o exterior cria um potencial eléctrico capaz de sustentar o transporte de lactose. Devido ao gradiente de concentração, o K+ tende a entrar na célula e ao fazê-lo promove também a entrada da

lactose.

2. Sistema de Fosfotransferase (Translocação de um grupo fosforil):

Quando células eucarióticas executam a importação de substâncias, como a

glicose ou aminoácidos, quer por difusão facilitada ou simporta, as moléculas são

transportadas de forma intacta, e, uma vez dentro da célula são modificadas (por exemplo fosforiladas) de forma a impedir a sua saída e a manter o gradiente de concentração da substancia em questão.

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Contrariamente, em bactérias alguns nutrientes são modificados enquanto se

processa o transporte para o interior (da bactéria) por um processo denominado

translocação de grupo. Outra diferença que se verifica neste tipo de transporte é a utilização de PEP

(Fosfo-enol-piruvato) em vez de ATP como molécula dadora de grupo fosforil. Isto justifica-se porque a ΔG resultante da hidrólise desta molécula é maior, favorecendo a ocorrência de reacções mais endotérmicas em simultâneo, e, porque o PEP é um

intermediário do catabolismo da glicose a piruvato, podendo tornar-se um ponto de regulação.

Sistema de Fosfotransferase em E.coli: A importação de açúcares para E.coli é um movimento muito específico, cada

açúcar é importado por uma enzima II (E2) específica, trata-se de uma enzima integral da membrana plasmática que forma um canal e ao mesmo tempo transfere um grupo fosfato para o açúcar, enquanto este se desloca pela membrana.

O mecanismo de acção é bastante simples, embora um pouco confuso. Este pode

ser dividido em duas fases, na primeira estão envolvidas duas proteínas citoplasmáticas

solúveis, E1 e HPr (pequeno peptídeo). O primeiro passo é a passagem do fosfato do PEP para a proteína E1, o segundo é a transferiência deste mesmo fosfato de E1 para HPr. A segunda fase envolve outras duas enzimas, E2 e E3. O HPr tranfere o seu grupo fosfato

para a enzima E3 e esta por sua vez vai passa-lo para E2. Esta ao funcionar como um canal transmembranar, permite a passagem de açúcares, sendo o fosfato proveniente do PEP transferido para o açúcar em questão.

Nota: No transporte de açúcares, as enzimas E1 e HPr são generalistas, ou seja,

actuam em todos os casos, no entanto as enzimas E2 e E3 são específicas para cada tipo de açúcar. Se uma mutação afectar a enzima E1 ou o HPr, todos os transportes de açúcares são afectados, enquanto que, se a mutação ocorrer na enzima E2 ou na E3, só

o transporte de um determinado tipo de açúcar é que é afectado. Se a E2 for específica para a glicose, também o é a E3, pois funcionam acopladas.

Este sistema para além das funções de transporte tem também funções

reguladoras. De facto a abundância de açúcares acumulados por este sistema (PTS –

Phosphotransferase System) vai inibir outros sistemas de transporte activo de açúcares.

3. Bacteriorodopsina (Bomba protónica):

Encontra-se presente em Halobacterium halobium, uma bactéria que vive em

ambientes muito salinos e pouco oxigenados (Ex. Mar Morto, Salinas da Figueira da Foz).

Na presença de O2 esta bactéria oxida substratos para obter energia química (ATP), contudo, a elevadas concentrações de sal, a solubilidade deste gás é baixíssima, pelo que

o metabolismo é baixo. A luz é então utilizada como fonte de energia alternativa, ou seja, em condições anaeróbias estas bactérias utilizam a energia luminosa para criar um

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gradiente electroquímico de H+, sendo este utilizado para sintetizar ATP ou para transportar substâncias para o interior celular.

É composta por 7 α-hélices transmembranares. Possui um grupo retinal

(cromóforo fotossensível envolvido no processo de absorção de luz) localizado na zona mediana interior da proteína, rodeado pelas 7 hélices. Este grupo está ligado a uma lisina da cadeia polipeptídica, através de uma Base de Shiff protonada. Quando o grupo retinal

absorve luz, sofre uma isomerização, passando de retinal all-trans (protonado) para retinal 13-cis (desprotonado), libertando-se um H+ para o meio extracelular. Esta forma (retinal 13-cis) volta a receber um protão do citoplasma, regressando ao isómero inicial

(por cada ciclo de isomerização é libertado um H+). O interior da bacteriorodopsina forma

um canal iónico constituído por duas subunidades que nunca estão directamente em

contacto, sendo que a ligação entre estas é estabelecida pelo grupo retinal. Os resíduos de Asp85 (localizado na subunidade virada para o

meio externo) e Asp96 (localizado na subunidade virada para o citosol) formam o cabo condutor de H+, que é uma cadeia de

ligação de H+ formada pelo alinhamento das cadeias laterais destes dois resíduos de aminoácidos no interior do canal iónico.

Resumindo:

1. Na ausência de luz a Base de Shiff está protonada e o grupo retinal encontra-se na forma all-trans;

2. Ao absorver luz, o grupo retinal sofre uma isomerização para a forma 13-cis e

liberta um protão (H+) para o resíduo Asp85; 3. Uma rede de ligação de H é formada pelo alinhamento dos resíduos laterais de

aminoácidos, e funciona como um cabo condutor de transferência de H+;

4. O H+ é transferido através desta rede para o meio extracelular; 5. A re-protonação da Base de Shiff é feita por cedência de um H+ pelo resíduo

Asp96 que por sua vez o retirou do citosol;

6. O grupo retinal retoma a sua conformação all-trans.

Interiorização celular de macromoléculas:

A endocitose é o processo pelo qual uma pequena região da membrana

plasmática invagina, formando uma vesícula membranar intracelular. Existem dois tipos de endocitose:

- Pinocitose: Não específica;

- Endocitose mediada por receptores: Um receptor específico na superfície da membrana plasmática liga-se à proteína extracelular que reconhece

(ligando). A região da membrana que contém o complexo receptor-ligando invagina, tansformando-se numa vesícula de transporte. A taxa de endocitose de um ligando por este processo depende da quantidade de receptor específico disponível. Através deste

processo os complexos receptor-ligando são selectivamente incorporados em vesículas de

60

transporte, sendo todas as outras proteínas membranares excluídas da vesícula endocitada.

A endocitose mediada por receptores ocorre via poços e vesículas de clatrina

(actua como um esqueleto flexível). Os poços revestidos por clatrina formam quase 2% da superfície membranar dos hepatócitos e dos fibroblastos. Alguns receptores

aglomeram-se nos poços de clatrina mesmo sem ligando, outros difundem-se livremente pela membrana, mas quando se ligam à proteína, os complexos (receptor-ligando) ao

passarem por um poço de clatrina ficam lá retidos, formando-se uma vesícula. Receptores como LDL e transferina são frequentemente encontrados associados

a estas vesículas de clatrina. Pensa-se que a polimerização espontânea da clatrina provoca a expansão dos

poços e consequentemente, a formação de vesículas. Após serem endocitadas, as vesículas perdem o revestimento de clatrina,

formando vesículas de superfície lisa. Os receptores endocitados são geralmente

reciclados intactos, regressando ao ponto de origem.

Endocitose mediada por receptores de LDL: A LDL (Low Density Lipoprotein) é uma proteína transportadora de triglicerídeos

e colesterol endógenos, do fígado para os tecidos. Está presente na corrente sanguínea. As células obtêm colesterol principalmente por meio de endocitose mediada por

receptores de LDL, sendo que a maioria das células produz receptores específicos para

esta proteína. Ocorre como descrito em cima. Na maior parte dos casos o receptor e o ligando

dissociam-se após a endocitose, o receptor regressa à superfície celular enquanto o ligando é transportado para lisossomas, onde é degradado.

O colesterol não é hidrosolúvel, logo necessita de um

transportador que o seja. A LDL é uma esfera com cerca de

20 nm de diâmetro, cuja superfície exterior é uma monocamada membranar de fosfolípidos e colesterol, onde uma molécula proteica muito grande (apoproteína-B) se

encontra. No interior existe um núcleo extremamente apolar, composto por ésteres de colesterol.

O receptor de LDL é uma glicoproteína de cadeia sinples de 839 aminoácidos.

Cerca de 50 aminoácidos do terminal C estão virados para o citosol e alguns destes estão

envolvidos na ligação do receptor ao poço de clatrina. No terminal N há 320 aminoácidos, extremamente ricos em pontes dissulfito de resíduos de cisteína, é neste terminal que se encontra o local de ligação para LDL.

Só quando o receptor é danificado é que é transportado para um lisossoma, onde

é degradado. Enquanto funcionar correctamente é sempre reciclado e retorna à

membrana plasmática para transportar mais LDL. A LDL liga-se a um receptor específico na membrana e inicia o processo de

endocitose, forma-se um endossoma (vesícula) que a transporta, juntamente com o seu receptor associado, para o interior da célula. Nos endossomas (vesículas) ocorre a

separação ligando-receptor, as vesículas possuem uma parte esférica que contém os ligandos e prolongamentos cilíndricos que contêm os receptores.

61

As partes esféricas fundem-se com

lisossomas, onde a apoproteína-B é degradada

em aminoácidos, e os ésteres de colesterol hidrolisados a colesterol e ácidos gordos. Os

receptores de LDL retornam à superfície celular. O colesterol é incorporado na membrana plasmática ou re-esterificado e

armazenado como lípido dentro da célula, para uso posterior. Os ácidos gordos são utilizados para fabricar fosfolípidos e triglicerídeos.

As apoproteínas-B são constituídas por muita gordura e pouca proteína, sendo

por isso consideradas como mau colesterol. Transportam o colesterol do fígado para os tecidos, no plasma. A diferença entre mau e bom colesterol deve-se às diferentes

apoproteinas. Na parede dos vasos existem receptores para as apoproteinas-B, fazendo com que estas sejam absorvidas para a região subendotelial, formando os ateromas por acumulação (Aterosclerose). O facto de não haver receptores paras as apoproteínas-A faz

com que estas prossigam o seu percurso, não sendo absorvidas.

Hipercolesterolémia Familiar: O nível celular de colesterol é auto-regulado. Quando existe um excesso de colesterol na célula a hidroximetil glutaril CoA

reductase (HMG CoA reductase) impede a síntese de colesterol, impedindo a síntese de um dos seus intermediários, o ácido meavónico. No entanto activa a ACAT (colesterol acil

transferase), que promove a esterificação e o armazenamento do colesterol captado da corrente sanguínea.

Numa situação de excesso é igualmente interrompida a síntese de receptores de

LDL, diminuindo a captação do sangue. É uma doença hereditária que provoca, nas pessoas afectadas, a produção de

receptores de LDL defeituosos. Caracteriza-se por:

- Elevados níveis de colesterol; - Receptores de LDL mutantes; - Morte dos homozigóticos ainda muito jovens

(antes dos 20 anos) por ataque cardíaco (aterosclerose). É comum, afecta 1 em 106 indivíduos.

Nos homozigóticos pode acontecer um dos três casos:

- O receptor não é produzido, não liga ou liga fracamente as LDL; - O segmento transmembranar não é produzido, embora o mutante ligue as

LDL normalmente, não consegue ancorar à membrana plasmática e é secretado da célula;

62

- O receptor está distribuído uniformemente na membrana plasmática, não estando presente em grande quantidade nos poços.

Nos heterozigóticos:

- Apenas 50% dos receptores são normais; - O nível de colesterol no sangue é mais elevado que o normal, mas mais

baixo do que em indivíduos homozigóticos;

- As pessoas afectadas estão sujeitas a ataques cardíacos, sobretudo depois dos 40 anos.

Mecanismos de acção de fármacos reguladores do conteúdo celular de

colesterol:

Com o objectivo de diminuir o conteúdo em colesterol do sangue existem

diversos fármacos com diferentes estratégias. O colesterol produzido no fígado, e que incorpora os ácidos biliares, pode, em

situação normal, ser reciclado a partir do intestino e reposto na circulação sanguínea.

Existem medicamentos capazes de se ligarem aos ácidos biliares no intestino, impedindo a reciclagem e obrigando o colesterol a ser excretado nas fezes. Desta forma as células hepáticas têm menos uma fonte de colesterol, sendo obrigadas a produzir mais

receptores LDL e a captar mais colesterol do sangue, baixando os seus níveis neste fluído.

Outros medicamentos inibem a síntese intracelular de colesterol a partir de Acetil-

CoA, obrigando a célula a recorrer à captação aumentada de LDL sanguíneo para manter os níveis celulares de colesterol, situação que é conseguida através da produção

aumentada de receptores LDL.

Sinalização Celular:

Em organismos multicelulares, nenhuma célula é capaz de viver isolada. A

sobrevivência depende de uma complexa rede de comunicações intercelular que coordena o crescimento, diferenciação e metabolismo das células dos diversos tecidos e órgãos. É frequente que, em pequenos grupos de células, estas comuniquem por

contacto directo célula-a-célula. Algumas recorrem a junções especializadas da membrana plasmática que lhes permite a passagem de pequenas moléculas e a coordenação de

respostas metabólicas. Outras junções entre células adjacentes determinam a forma e a rigidez de determinado tecido. Entre diferentes tipos de células, a comunicação dá-se quando uma certa

proteína de uma célula se liga a uma proteína receptora, na superfície de outra célula, desencadeando a sua diferenciação. Este processo é essencial para a organização de novos

tecidos.

Como é que as células comunicam através de moléculas sinalizadoras

extracelulares? As moléculas sinalizadoras extracelulares podem ser pequenas moléculas derivadas

de aminoácidos, peptídeos ou proteínas. Têm a capacidade de se difundirem para o exterior, podendo também ser transportadas pela corrente sanguínea, possibilitando uma comunicação a longa distância.

63

O processo de sinalização envolve normalmente 6 passos: 1. Síntese da molécula sinalizadora;

2. Libertação da molécula sinalizadora; 3. Transporte do sinal para célula alvo;

4. Detecção do sinal por receptores específicos na célula alvo; 5. Alterações do metabolismo celular, afectando a função ou o desenvolvimento (accionadas pelo complexo sinal/receptor);

6. Remoção do sinal, terminando a resposta celular. As células alvo promovem a transdução de sinal, ou seja, convertem o sinal

extracelular em respostas celulares, actuando sobre enzimas metabólicas (alteração do metabolismo), genes que regulam proteínas (alteração da sua expressão) e proteínas do

citosqueleto (alteração da forma e movimento das células alvo). Existem compostos químicos libertados por certos organismos eucariotas, como

as leveduras, bolores, protozoários, algumas algas e animais, que vão alterar o comportamento ou a expressão genética de outros organismos da mesma espécie, são um

tipo de sinalização próxima. Estes compostos denominam-se por feromonas. Em animais e plantas evidenciam-se as moléculas de sinalização extracelular que

actuam dentro do organismo, controlando todas as suas actividades.

Tipos de sinalização intercelular em animais:

A sinalização intercelular existente ao nível dos animais (e das plantas) inclui:

(a) Endócrina; (b) Parácrina; (c) Autócrina;

(d) Sinalização directa por proteínas ligadas à membrana plasmática. A sinalização intercelular ocorre através da libertação de uma molécula secretora

extracelular, que percorre alguns µm antes de ligar à célula alvo (b e c), ou metros (a).

(a) Sinalização Endócrina: Caracteriza-se pela existência de

hormonas, nos animais, estas são libertadas para a corrente sanguínea, actuando em células alvo distantes do

local de síntese (células das glândulas endócrinas).

(b) Sinalização Parácrina: Os neurotransmissores são exemplos de

moléculas sinalizadoras libertadas pelas células, que apenas afectam células alvo próximas. São

libertados por exemplo, na condução de um impulso nervoso de uma célula nervosa para outra, ou de uma célula nervosa para uma célula muscular

(induzindo ou inibindo a contracção muscular).

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(c) Sinalização Autócrina: Ocorre quando a célula responde a

substâncias que ela própria liberta. Muitos factores de crescimento actuam por este

processo, por exemplo, as células em cultura secretam factores de crescimento que estimulam o seu próprio crescimento e

proliferação. Este tipo de sinalização, numa situação anormal, pode originar células tumorais, provocando cancro.

(d) Sinalização directa por proteínas ligadas à membrana plasmática:

Proteínas ligadas à membrana plasmática de uma célula interagem directamente com receptores de uma célula adjacente.

Existem compostos que actuam em 2 ou mais tipos de sinalização: EGF (Epidermal Grow Factor – Hormona): Esta proteína é sintetizada como

parte exoplasmática de uma proteína membranar que pode ligar e comunicar com uma célula adjacente por contacto directo (Sinalização de proteínas ligadas à membrana

plasmática). No entanto pode ser clivada por uma protease e libertada na corrente sanguínea actuando assim como um agente endócrino em células alvo distantes (Sinalização endócrina); Epinefrina (derivada de aminoácidos): Actua como neurotransmissor

(Sinalização parácrina) ou como hormona sistémica (Sinalização endócrina).

As hormonas:

1. Modulam actividades enzimáticas em células-alvo; 2. Alteram propriedades ou taxas de síntese de proteínas existentes; 3. Induzem a síntese de novas proteínas.

Efeitos Pleiotrópicos: Diferentes tipos de células-alvo respondem ao mesmo

conjunto de sinais mas de um modo diferente. Especificidade do receptor:

Receptores são glicoproteínas que ligam reversivelmente compostos químicos

específicos que, ao contrário das enzimas, não os alteram quimicamente. Receptores específicos são responsáveis por mediar as respostas celulares.

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O receptor tem alta afinidade pelo ligando (1º mensageiro) e a ligação entre eles desencadeia uma resposta celular, determinada pelo tipo de receptor (especificidade efectora) e pelas reacções desencadeadas pela ligação do complexo ligando-receptor.

A ligação do ligando ao seu receptor específico causa uma alteração conformacional no receptor que é activado, sendo responsável por iniciar um programa molecular que leva

à resposta celular específica. Assim, a resposta celular a uma hormona específica é determinada por:

1. Tipo de receptor; 2. Reacções intracelulares iniciadas pelo complexo L – R.

Diferentes respostas podem ocorrer com: - O mesmo ligando a ligar a receptores diferentes em células diferentes;

- O mesmo receptor para o mesmo ligando, em células diferentes; - Numa mesma célula, receptores diferentes específicos para ligandos diferentes. No entanto, não é necessária uma afinidade de sinais para regular todos os

processos. A mesma molécula sinalizadora pode ligar-se a diferentes receptores

(geralmente localizados em células diferentes), desencadeando respostas igualmente distintas.

Exemplo: Acetilcolina Existem receptores para esta molécula em células musculares esqueléticas (A),

cardíacas (B) e em células acinares pancreáticas (C), contudo, em cada tipo de células a resposta induzida é diferente. Em A promove a contracção muscular, em B desacelera o

ritmo e força da contracção cardíaca e em C induz a secreção de enzimas de digestão. A acetilcolina liga-se a:

1. Receptores diferentes, em A e C.: 2. Receptores idênticos, em B e C.

Por vezes, diferentes complexos receptor-ligando podem induzir a mesma

resposta celular em diferentes tipos de células.

Exemplo: Glucagina ou Epinefrina em células hepáticas

A glucagina e a epinefrina são ligandos diferentes que desencadeiam a mesma

resposta nas células hepáticas. Nestas existem receptores específicos tanto para a

epinefrina como para a glucagina, que promovem uma alteração no metabolismo dos açúcares (degradação do glicogénio e libertação de glucose para o sangue). No entanto, nas células do músculo esquelético, só a epinefrina afecta o metabolismo do glicogénio. A glucagina mantém o Status Quo enquanto que a epinefrina promove a

alteração do Status Quo, preparando o organismo para a resposta inesperada e imediata. Estes exemplos mostram que o receptor é caracterizado pela especificidade da

ligação (para um ligando particular), sendo que o complexo R – L resultante exibe

especificidade efectora (regula uma resposta celular específica).

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Explicação do caso: A activação quer dos receptores de epinefrina quer dos de glucagina nas células

hepáticas induz a síntese de cAMP (2º mensageiro), o qual regula uma dada resposta metabólica.

Conclusão: A especificidade da ligação aos receptores de glucagina e epinefrina é diferente, mas a especificidade efectora é idêntica.

No geral, o ligando parece só ter a função de ligação ao receptor:

- O ligando não é metabolizado para dar outro ligando útil, não é intermediário em nenhuma actividade celular, nem tem propriedades enzimáticas;

- A única função do ligando parece ser alterar as propriedades do receptor, que transmite um sinal à célula que vai desencadear uma resposta. No entanto, muitas vezes as células alvo modificam ou degradam o ligando,

resultando modificação ou finalização da resposta na célula e nas células vizinhas.

Classificação das hormonas (com base na sua composição química):

Hormonas derivadas de aminoácidos: Epinefrina, Norepinefrina, Histamina,

Dopa, Dopamina, Tiroxina e Trioiodotironina (hormonas da tiróide) – Originadas a partir de aminoácidos; Hormonas Peptídicas: Insulina, ACTH, Factores de crescimento, Glucagina –

Polipeptídeos ou Proteínas; Hormonas Esteróides: Cortisol, Progesterona, Estradiol, Testosterona –

derivadas do colesterol – Derivadas do Colesterol; Hormonas Eicosanoides: Prostaglandinas, Tromboxanos – Derivadas do ácido

araquidónico (fosfolípidos).

Classificação das hormonas (com base na sua solubilidade em água e lípidos e localização do receptor):

A maioria das hormonas insere-se em 3 grandes grupos:

1. Pequenas moléculas lipofílicas que se difundem através da membrana plasmática e interagem com receptores intracelulares;

2. Moléculas hidrofílicas que ligam a receptores da superfície celular; 3. Moléculas lipofílicas que ligam a receptores da superfície celular. Recentemente descobriu-se que um gás, o óxido nítrico (NO), desempenha um

papel regulador central no controlo de muitas respostas celulares, no entanto não se inclui

em nenhuma das categorias acima referidas. O CO tem também uma acção reguladora no cérebro.

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1. Hormonas lipofílicas com receptores intracelulares: Geralmente são hormonas esteróides, estas

são transportadas na corrente sanguínea por proteínas que as tornam solúveis (lipofílicas). Após se

dissociarem das proteínas, perto da célula alvo, as hormonas conseguem difundir-se através da membrana plasmática. Ligam-se a receptores

citosólicos (o complexo formado pode posteriormente difundir-se para o núcleo) ou nucleares (através dos

poros nucleares) e depois de formado o complexo hormona-receptor, este interage com o DNA nuclear e altera a transcrição de genes específicos, podendo

também afectar a estabilidade de RNAm específicos (maior ou menor síntese). Desta forma a síntese de proteínas conduz à resposta celular.

Exemplos de hormonas lipofílicas:

- Hormonas esteróides (Cortisol, progesterona, estradiol, testosterona, são todas sintetizadas a partir do colesterol); - Vitamina D3 (antiraquítismo), relaciona-se com as hormonas esteróides pois

deriva do 7-desidrocolesterol; - Tiroxina, ácido retinóico. As hormonas esteróides podem actuar durante horas ou dias e influenciar o

crescimento e a diferenciação de diversos tecidos:

- Em galináceos, o estrogénio e progesterona (hormonas sexuais femininas) estimulam a produção das hormonas da clara do ovo e a proliferação celular no oviducto

da galinha; - Nos mamíferos, os estrogénios estimulam o crescimento da parede uterina na preparação para a implantação do embrião;

- Nos insectos e crustáceos, a ecdisona (quimicamente relacionada com os esteróides) desencadeia a diferenciação e maturação das larvas até ao adulto, tal como os

estrogénios, também induz a expressão de produtos de genes específicos. Em plantas também se descobriu uma família de esteróides que regula aspectos

do desenvolvimento, actuando também em receptores da superfície celular. São os brassinoesteróides, dos quais o primeiro identificado foi o brassinolídeo, sendo que

actualmente se conhecem mais de 60 tipos diferentes, todos derivados do 5-α-colestano.

Na tiróide, são produzidos por proteólese intracelular da proteína tiroglobulina, os

principais compostos iodados do corpo, a trioxina e triiodotironina, que são imediatamente libertadas no sangue. Estes compostos estimulam a expressão de enzimas citosólicas (Ex: hexocinase do fígado), que catalizam o catabolismo de vários compostos (glucose, lípidos,

proteínas) e de enzimas mitocondriais, que catalizam a fosforilação oxidativa. Os retinóides, derivados do retinol (vitamina A), regulam a proliferação,

diferenciação e morte celulares. Durante o desenvolvimento, os retinóides actuam como mediadores locais da interacção célula-a-célula. Os animais necessitam de betacarotenos

na sua dieta para ter vitamina A.

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Exemplo: Na formação dos neurónios motores na galinha, uma classe de neurónios motores gera um sinal de retinóide que regula o número e o tipo de neurónios motores diferenciados na vizinhança.

2. Hormonas hidrossolúveis com receptores superficiais:

As hormonas hidrossolúveis podem ser:

- Hormonas peptídicas: Insulina, Factores de crescimento, Glucagina; - Moléculas de carga reduzida: Epinefrina e Histamina (derivadas de

aminoácidos, funcionam como hormonas e neurotransmissores). Produzem efeitos de duração muito variável:

- Induzem modificação na actividade de uma ou mais enzimas já existentes Os efeitos são quase imediatos mas persistem pouco tempo; - Podem produzir alterações na expressão de genes Os efeitos podem

manter-se horas ou dias; - Podem provocar alterações irreversíveis Caso da diferenciação natural.

3. Hormonas lipofílicas com receptores superficiais (normalmente actuam

em sinalizações de proximidade): Neste grupo incluem-se algumas hormonas eicosanoides, como as

prostaglandinas (9 classes), prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos. (Imagem 28) As prostaglandinas (PG) (as mais conhecidas) são uma série de ácidos

ciclopentanoicos. Os tromboxanos (TX) diferem das prostaglandinas na estrutura do anel

que nestas é um ciclopentano e nos tromboxanos é um éter cíclico (anel oxano). A hormonas eicosanoides derivadam

maioritariamente do ácido gordo poliinsaturado (com 20 carbonos), o ácido araquidónico. Este por

sua vez deriva de fosfolípidos (Ex. Fosfatidilcolina, por acção de fosfolipase A2) e de diacilgliceróis. A fosfolipase A2 pode quebrar a ligação éster de um

fosfolípido, libertando o ácido araquidónico, este produz leucotrienos (acção de lipoxigenases ou prostaglandinas sintetases) e endoperóxidos

cíclicos (acção de prostaglandina H2), estes, sua vez originam outras prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos.

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As prostaglandinas só são conhecidas em animais, tendo as primeiras sido

descobertas por Ulf von Euler (Suécia) em 1930. Muitas hormonas desta família estão

envolvidas na sinalização Parácrina e Autócrina, degradando-se perto do local de síntese. A prostaglandina endoperoxidase sintetase (PES) é uma enzima existente no retículo endoplasmático, que vai actuar sobre o ácido araquidónico, convertendo-o em

prostaglandinas através uma dupla actividade enzimática, ciclooxigenase e peroxidase. As plaquetas desempenham um papel crucial na coagulação do sangue e na

regeneração da parede dos vasos sanguíneos (cicatrização). Os tramboxanos (TX2), derivados de prostaglandinas, promovem a agregação de plaquetas sanguíneas, estas

aderem às paredes dos vasos sanguíneos (vasoconstrição). As prostaglandinas e

prostaciclinas pelo contrário funcionam comos vasodilatadores. O vencedor de vários prémios Nobel, John Vane, descobriu que a aspirina ao

produzir acetilação de uma serina ao nível da actividade de cicooxigenases PES, bloqueia a produção de prostaglandinas. Deste modo não se formam tramboxanos por acetilação da

prostaglandina H2 sintetase, impedindo-se a agregação de plaquetas e consequentemente a formação de trombos (acumulação de tromboxanos em zonas em que o vaso sanguíneo tenha sofrido uma ruptura).

As hormonas PGI2 e TXA2 estão envolvidas no processo inflamatório e na

coagulação do sangue, podendo interferir em ataques cardíacos e AVC, com origem na formação de coágulos sanguíneos. A TXA2 promove a agregação de plaquetas sanguíneas, favorecendo a formação de coágulos sanguíneos, enquanto PGI2 relaxa as artérias

coronárias e inibe a agregação de plaquetas. A aterosclerose relaciona-se com a redução da síntese de PGI2, por interferência do metabolismo do colesterol, este ao reduzir o número de células endoteliais, que produzem PGI2, leva a uma baixa dos níveis desta

hormona. Existem prostaglandinas que se acumulam aquando do nascimento de um bebé,

iniciando a contracção das células do músculo liso (facilitam a contracção uterina).

Receptores Superficiais: Existe uma grande variedade de receptores superficiais (só ligam ligandos

hidro/lipossolúveis) nas células animais, mas todos eles podem ser incluídos em quatro grandes classes:

1. Receptores associados a proteínas G (GPCR); 2. Receptores que são canais iónicos;

3. Receptores associados a tirosina cinase (RTK); 4. Receptores com actividade catalítica intrínseca.

1. Receptores associados a proteínas G (GPCR):

A ligação do ligando (epinefrina, glucagina, serotonina) ao receptor provoca uma

alteração conformacional na face citosólica deste, activando a proteína G, que por sua vez, activa ou inibi uma enzima (Adenilciclase, fosfolipase, etc.). Esta ligação muitas vezes

traduz-se na formação de um segundo mensageiro (cAMP, IP3, DAG, etc.) ou na modulação de um canal iónico.

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2. Receptores que são canais iónicos: A ligação ao ligando leva a uma

alteração conformacional do receptor, que forma

um canal de entrada de iões. Isto acontece, por exemplo, com o receptor de acetilcolina, no contacto entre os neurónios e os músculos.

3. Receptores associados a Tirosina cinase (RTK):

Estes receptores geralmente ligam

citocinas, interferões e factores de crescimento humanos. Não possuam actividade enzimática intrínseca, mas a ligação do ligando promove a

dimerização (associação das duas unidades) do receptor (homodímero ou heterodímero), este reage com uma ou mais proteínas cinases

tirosínicas do citosol que, activadas, fosforilam tirosinas do receptor.

Os resíduos de fosfotirosina resultantes podem fosforilar os substratos proteicos que a eles se ligam, ficando o receptor com actividade de cinase. Estes receptores são referidos como “Superfamília dos Receptores das Citocinas”.

4. Receptores com actividade enzimática intrínseca: Possuem actividade enzimática no lado citosólico. Uns catalizam a conversão de

GTP em GMPc outros actuam como fosfatases, removendo grupos fosfato de resíduos de tirosina de proteínas substrato. Mas na maioria dos casos a ligação do ligando promove a

formação de um homodímero activo, que fosforila (actividade cinase) resíduos do seu próprio domínio citosólico (autofosforilação) e também de várias proteínas substrato. São exemplos os receptores para factores de crescimento e insulina.

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Segundos Mensageiros: Os efeitos de muitas hormonas são mediados por segundos mensageiros, que

actuam após a interacção entre ligando e receptor e promovem a transdução de sinal. Os segundos mensageiros mais conhecidos (normalmente de baixo peso molecular)

são o AMPc, GMPc, diacilglicerol (DAG), Ca2+ e o IP3 (inositol-1,4,5-trifosfato).

A sinalização pode dar-se pelo aumento ou diminuição da concentração destes

segundos mensageiros no interior da célula, que ocasiona uma rápida alteração na actividade de uma ou mais enzimas ou proteínas não enzimáticas. As funções metabólicas controladas por estes mensageiros incluem a acumulação e

utilização de glicose, armazenamento e mobilização de lípidos, reacções de produtos e até regulação de genes específicos.

Proteínas sinalizadoras intracelulares: Para além dos receptores e dos mensageiros secundários, existem outras

proteínas que funcionam nas vias de transdução de sinais, sendo estimuladas por sinais extracelulares. Estas incluem-se em 3 classes:

1. Proteínas Activadoras (“Switch”) de GTPases; 2. Proteínas cinases;

3. Proteínas adaptadoras. 1. Proteínas Activadores (“Switch”) de GTPases:

Actuam como “interruptores” moleculares nas vias de transdução de sinais.

Existem duas classes de GTPases, ambas com regiões que promovem a actividade de proteínas efectoras específicas.

- Proteínas G triméricas Directamente associadas a receptores activados; - Proteínas G monoméricas Associam-se indirectamente a receptores através de

outras proteínas. Exemplos: Ras e outras semelhantes.

Na ausência de sinal, estas proteínas

encontram-se inactivas e ligam GDP. Quando surge um

sinal, este promove a libertação de GDP, ligando-se GTP, que vai activar a proteína. A actividade intrínseca da GTPase hidrolisa GTP a GDP e fosfato, convertendo

a forma activa da proteína na forma inactiva. Assim, as proteínas activadoras de GTPases encontram-se activas quando ligadas a GTP e inactivas

quando ligadas a GDP.

72

2. Proteínas cinases:

A activação de receptores superficiais

leva a alterações na fosforilação de proteínas, através da activação de proteínas cinases.

Nalguns casos as cinases são parte integrante do próprio receptor, noutros encontram-se livres no citosol ou ligadas à

membrana plasmática, indo para junto do receptor quando solicitadas.

Em animais, existem proteínas cinases (que fosforilam resíduos) de tirosina e de

serina ou treonina.

As actividades catalíticas das cinases são moduladas por fosforilação, ligação a outras proteínas e por alterações nos níveis de segundos mensageiros.

A actividade destas enzimas é contrariada pela acção de fosfatases, que removem grupos fosfato de proteínas substrato específicas.

3. Proteínas adaptadoras: Não apresentam qualquer actividade

catalítica (nem activam directamente proteínas efectoras), mas possuem vários domínios que

funcionam como locais de ancoragem para outras proteínas. Esta combinação de proteínas confere um enorme potencial para complexas acções e

interferências entre vias sinalizadoras distintas. Muitas vias de transdução de sinal dependem de complexos sinalizadores multiproteicos que são mantidos por proteínas adaptadoras.

Vias de sinalização: As vias de sinalização comuns (altamente conservadas) são iniciadas por

receptores pertencentes a classes diferentes.

Existem duas vias de sinalização: - Uma comum aos receptores

associados a proteínas G (GPCRs); - Outra associada a receptores tirosina cinase (RTKs).

Uma proteína activadora de GTPase, é comum às duas vias, mas a

sua posição relativamente ao receptor é diferente. Os segundos mensageiros são

componentes decisivos na maioria das

vias de sinalização GPCR e de algumas RTK. Já as proteínas adaptadoras estão em todas as vias de sinalização RTK,

mas não nas principais vias GPCR.

73

As proteínas cinases, têm um papel fundamental em todas as vias de sinalização,

visto que na fase final fosforilam uma ou mais proteínas substrato. Estas podem ser

enzimas, microtúbulos, histonas e factores de transcrição, e desempenham um papel importante na determinação da resposta celular específica. A figura em cima mostra uma situação em que ocorre estimulação de um GPCR e

de um RTK, o efeito é o mesmo, no entanto a posição e tipo de GTPases varia em relação

ao receptor. Regulação hormonal:

Devido aos seus potentes efeitos as hormonas e os neurotransmissores devem

ser regulados com precisão. A libertação e a degradação destas moléculas estão reguladas para produzir efeitos imediatos e de curta duração (péptidos e catecolaminas), ou efeitos não imediatos mas de longa duração hormonas esteróides, retinóicos, etc.).

1. Hormonas Peptídicas e Catecolaminas: São hormonas hidrossolúveis com receptores superficiais. Os organismos

(animais) têm de responder instantaneamente a alterações do meio interno ou externo,

sendo esta resposta primariamente mediada por hormonas peptídicas (Ex. insulina) e catecolaminas (Ex. epinefrina, norepinefrina e dopamina).

2. Hormonas Esteróides, Tiroxina e Ácido Retinóico: São hormonas com receptores intracelulares.

a) As hormonas esteróides (originadas a partir do colesterol), por exemplo as

células do córtex adrenal, armazenam um precursor de hormona esteroide que se converte na hormona activa quando as células são estimuladas, difundindo-se depois através da membrana plasmática para ao sangue;

b) Um precursor iodado da tiroxina, a tiroglobulina, é armazenado em folículos da tiróide. Quando as células que revestem estes folículos são expostas à acção da hormona estimuladora da tiróide (TSH), elas captam tiroglobulina e as enzimas lisossómicas

produzem proteólise originando tiroxina que se liberta no sangue; c) O retinol é uma hormona armazenada no fígado e que se encontra em elevadas

concentrações no sangue. Devido à sua natureza lipofílica passa através da membrana plasmática e forma um complexo com uma proteína citossólica de ligação (CRBP). Uma desidrogenase do retinol converte-o em retinal e este, por sua vez, é convertido em ácido

retinóico pela desidrogenase do retinal. O ácido retinóico tem função de crescimento. Controlo do “feedback” dos níveis hormonais:

A síntese e libertação de muitas hormonas são reguladas por “feedback” positivo

ou negativo e este tipo de regulação é muito importante na coordenação da acção de múltiplas hormonas em vários tipos celulares durante o crescimento e diferenciação. Muitas vezes os níveis de várias hormonas estão interligados por circuitos de retrocontrolo, nos

quais alterações numa hormona afectam os níveis de expressão de outra. Um exemplo é a regulação do estrogénio e da progesterona ao nível do útero. O estrogénio estimula o crescimento das células do endométrio (que forra o útero), onde se vai desenvolver o

embrião.

74

Identificação e Purificação de Receptores de Superfície: A ligação de uma hormona ao seu receptor é específica e de alta afinidade. Esta

ligação envolve o mesmo tipo de interacções fracas (iónicas, Van der Waals e interacções hidrofóbicas) que caracterizam as ligações enzima/substrato. Deste modo a ligação

hormona/receptor pode ser vista como uma simples reacção:

Que pode ser descrita pela equação:

Onde, KD que é a constante de dissociação que mede a afinidade do receptor pelo ligando. Esta equação pode ser reescrita:

Onde, Rt é o somatório de todos os receptores (livres e ligados). Esta equação é

semelhante à de Michaelis-Menten para analisar reacções enzimáticas. Quanto mais baixo o valor de KD, maior a afinidade do receptor para o seu ligando. O KD é igual à concentração de substrato para a qual existem 50% de receptores ligados (KD ≈ Km).

Os receptores de hormonas são difíceis de identificar e purificar, principalmente,

porque apesar de existirem 10000 a 20000 receptores na superfície celular, isso perfaz 10-6 ou 10-4 do número total de proteínas de uma célula, ou da superfície respectivamente. A purificação é igualmente difícil porque estas proteínas integrais devem primeiro ser

solubilizadas com um detergente não iónico. Normalmente os receptores detectam-

se através de ensaios de ligação, medindo a sua habilidade de ligar hormonas radioactivas. Quando se aumenta a quantidade de hormona

radioactiva no meio, há numa primeira fase um aumento do número de receptores ligados, mas depois atinge-se um patamar que corresponde

ao nível de saturação dos receptores. No entanto algumas destas hormonas encontram-se ligadas

inespecificamente a outros componentes da membrana celular. Faz-se por isso outro ensaio, onde se coloca hormona não radioactiva no meio e só

depois as membranas. A hormona não radioactiva vai ligar-se aos receptores e saturá-los, é então adicionada mais hormona, esta radioactiva, que se vai ligar inespecificamente. Depois é só medir o nível de hormonas radioactivas que se ligou inespecificamente e

subtrair ao valor total do primeiro ensaio.

De uma forma geral o KD para os receptores superficiais de hormonas aproxima-

se das concentrações de hormonas circundantes. Normalmente a concentração de ligando necessária para induzir uma resposta celular máxima é menor que o necessário para

saturar todos os receptores celulares.

75

Receptores associados a proteínas G e seus efectores: A ligação do ligando ao receptor activa a proteína G que, por sua vez, activa ou

inibe uma enzima que produz um segundo mensageiro específico (nem sempre isso acontece) ou modula um canal iónico.

Esquema da estrutura geral dos receptores associados a proteínas G:

Possuem sete α-hélices no interior da membrana

associadas umas às outras, sendo o loop C3 importante na

interacção com a proteína G (é hidrofílico). Estes receptores formam uma grande família que inclui:

- Receptores activados pela luz no olho (Rodopsinas, nos bastonetes); - Receptores odoríferos do nariz dos mamíferos;

- Receptores de hormonas e neurotransmissores.

Estrutura e função dos receptores de Catecolaminas (ligam epinefrina e

norepinefrina) e proteínas G associadas: Estes receptores afectam a Adenilato ciclase, esta sintetisa c-AMP (segundo

mensageiro), cujo aumento de concentração na célula desencadeia a resposta celular. Tanto a epinefreina (adrenalina) como a norepinefrina (noradrenalina) são

produzidas na glândula adrenal (medula). Possuem cargas associadas ao grupo catecol e, por isso, pertencem às catecolaminas. A ligação da epinefrina aos receptores adrenérgicos induz respostas específicas

nos tecidos. Esta hormona liga-se a dois tipos de GPCRs, sendo muito importante na

mediação das respostas do corpo ao stress (medo e exercício violento), quando há maior necessidade de glicose e ácidos gordos nos tecidos. Estes nutrientes podem ser fornecidos ao sangue, em segundos, pelo catabolismo do gliconénio no fígado (glicogenólise) e dos

triacilgliceróis nos adipócitos (lipólise). Nos Mamíferos a libertação de glicose e ácidos gordos pode ser accionada pela ligação da epinefrina (ou noradrenalina) a receptores β-adrenérgicos, na superfície das

células hepáticas (fígado) e adiposas. A epinefrina provoca também outras reacções, que ajudam o organismo a responder a situações de stress:

- Ligada a receptores β-adrenérgicos, das células cardíacas, aumenta a velocidade e a força de contracção, o que favorece o fornecimento de sangue aos tecidos;

- Ligada a receptores β-adrenérgicos, das células do músculo liso do intestino, causa o seu relaxamento.

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- Ligada a receptores α-adrenérgicos, das células do músculo liso que revestem os

vasos sanguíneos no aparelho intestinal, na pele e nos rins, provoca vasoconstrição das artérias, cortando a circulação para órgãos periféricos.

Conclusão: Os efeitos da epinefrina concorrem todos para o mesmo fim, que é fornecer energia para o rápido movimento dos músculos em resposta ao stress do

organismo.

Os receptores adrenérgicos β e α estão associados a diferentes proteínas G:

- β1 e β2-receptores – Proteínas Gs (activam adenilato ciclase);

- α1 e α2-receptores – Proteínas Gq e proteínas Gi, respectivamente. α1 Gq

estimula a fosfolipase C (IP3 e DAG) e α2 Gi inibe a adenilato ciclase.

Demonstração experimental: A estimulação de receptores β-adrenérgicos medeia a indução da síntese de c-AMP:

Quanto maior a capacidade da hormona em se

ligar ao receptor, maior vai ser a resposta da Adenil-

ciclase. A elevação dos níveis de c-AMP, mediante estimulação dos receptores β-adrenérgicos, é comprovável experimentalmente:

Células-alvo sem receptores para epinefrina, mas expressando adenilato ciclase e as proteínas G

adequadas (não têm resposta a epinefrina, os níveis de c-AMP não se alteram), são incubadas com lipossomas contendo receptores β-adrenérgicos purificados, que se

fundem com a membrana plasmáticca das células. Adicionando epinefrina, que se liga aos receptores β-adrenérgicos, podemos observar uma subida nos níveis

celulares de c-AMP. Logo podemos concluir que a subida nos níveis celulares de c-AMP faz parte da resposta das

células (com receptores β-adrenérgicos) à epinefrina. Agonistas e Antagonistas:

É possível estudar a característica da hormona que é reconhecida pelo receptor

estudando os agonistas e antagonistas dessa mesma hormona.

- Agonistas: Móleculas que mimetizam a função de uma hormona, ligam ao seu

receptor e causam uma resposta normal; - Antagonistas: Moléculas que ligam ao receptor, mas não induzem os efeitos da hormona. Actuam como inibidores da hormona natural ao competir por locais de ligação no

receptor e, assim, bloqueando a actividade fisiológica da hormona.

A cadeia lateral contendo o grupo NH determina a afinidade do ligando pelo

receptor, que é tanto maior quanto maior for o grupo associado ao terminal NH. O anel de catecol é necessário para o aumento do nível de c-AMP induzido pelo ligando.

77

Curiosamente, a constante de dissociação (KD) do agonista de epinefrina, o

isoproterenol, para os receptores β-adrenérgicos é 10 mais baixa do que o KD para a

epinefrina, com consequente indução da síntese de AMPc. Tenhamos em conta:

- O valor de KD é equivalente à concentração do ligando para a qual 50% dos

contêm ligando ligado;

- Quanto maior for o valor de KD maior a afinidade de um receptor pelo seu ligando; - Epinefrina e agonistas têm um KD para o receptor que corresponde à concentração

necessária para a elevação meia-máxima (50%) da concentração de AMPc.

A estimulação dos receptores β-adrenérgicos causa a elevação de c-AMP. No

gráfico podemos comparar a capacidade que 3 catecolaminas diferentes têm para activar a adenilato ciclase (que catalisa a síntese de c-AMP) e ligarem receptores. As curvas mostram que cada ligando induz actividade de adenil ciclase proporcionalmente à sua

capacidade para ligar ao receptor. A resposta da adenilato ciclase e ligação do ligando ao receptor dão-se a concentrações mais baixas de isoproterenol do que de epinefrina e norepinefrina.

Existem 2 tipos de receptores β-adrenérgicos localizados em diferentes tipos de

células:

- β1 Receptores: Localizados nas células do músculo cardíaco (promovem o aumento do ritmo cardíaco e da força contractiva).

Ordem de afinidade: Isoproterenol > Norepinefrina > Epinefrina. O Practolol é um antagonista β1 usado para diminuir a velocidade da contracção

cardíaca no tratamento da arritmia cardíaca e angina. É um bloqueador β. - β2 Receptores: Localizados nas células do músculo liso que revestem os brônquios

(promovem o seu relaxamento). Ordem de afinidade: Isoproterenol > Epinefrina > Norepinefrina.

A Terbutalina é um agonista β2 usado no tratamento da asma porque medeia a abertura dos bronquíolos.

Os receptores adrenérgicos β1 e β2, embora fisiologicamente muito relacionadas,

têm apenas, ao nível da sequência de aminoácidos, 50% de analogia. A analogia entre os

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receptores β e α é ainda menor. Conclui-se que será a sequência de aminoácidos que

determina a especificidade da ligação ao ligando e que tipo de proteína G interage.

Como funcionam as Proteínas G na Transducção de Sinais: No caso da ligação da epinefrina aos receptores β-adrenérgicos, a ligação da

hormona a um domínio exterior do receptor promove a activação da adenilato ciclase através da proteína Gs (estimulatória). Esta proteína é o elo de ligação entre o domínio

exterior do receptor e a adenilato-ciclase, funcionando como um transductor de sinais.

A adenilato-ciclase dos mamíferos é composta

por 4 domínios, 2 catalíticos (podem ligar ATP) na fase citosólica da membrana e 2 membranares integrados, cada

um com 6 α-hélices transmembranares.

Consideram-se domínios catalíticos, pois a actividade desta molécula (hormona) resulta na produção de AMP cíclico e ADP. Existem 6 isoformas que são activadas ou inibidas por proteínas G após ligação da hormona ao receptor.

As proteínas Gs triméricas (Subunidades α, β e γ) associam receptores β-

adrenérgicos à adenilato ciclase, através de um conjunto de acções que envolvem

dissociação das subunidades da proteína G. As Proteínas G são GTPases “switch” (“off” quando ligadas a GDP e “on” quando ligadas a GTP). No estado de repouso o receptor está vazio e pronto a receber hormona ou o seu

agonista, a proteína G está no seu estado desligado (ligando GDP) e conta com as 3

subunidades unidas.

1. A ligação da hormona induz uma transformação conformacional no receptor activando-o;

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2. O receptor activado liga-se à subunidade Gα;

3. A ligação induz uma transformação conformacional em Gα. o GDP desliga-se e é

substituído por GTP. Gα dissocia-se de Gβγ;

4. A hormona dissocia-se do receptor. Gα liga-se ao efector (Adenilato ciclase)

activando-o, este vai produzir AMPc a partir de ATP;

5. A activação é breve porque o GTP é hidrolisado a GDP em segundos, levando à re-associação das 3 subunidades e à inactivação do efector.

O ciclo completa-se com o retorno do sistema ao estado de repouso. A evidência experimental para este modelo resultou da utilização de um análogo

do GTP denominado GMPPNP. Neste, a ligação fosfodiéster terminal é substituída pela

porção terminal P – NH – P. Este análogo não pode ser hidrolizado, mas liga-se a Gsα

como o GTP, ficando permanentemente ligado à enzima. A ligação do GMPPNP resulta numa activação da adenilato ciclase muito mais potente e mais longa, já que a enzima fica num estado activo permanente.

80

Amplificação do Sinal Hormonal:

A resposta celular activada pelo c-

AMP requer dezenas de milhar ou mesmo milhões destas moléculas por célula. Como

apenas alguns milhares de receptores β-adrenérgicos estão presentes na célula, o sinal hormonal tem de ser amplificado de

modo a poder produzir quantidade suficiente de segundo mensageiro.

A amplificação é possível porque:

- Um único complexo hormona-receptor converte cerca de 100 moléculas de Gs

inactivas na forma activa. Quer os receptores quer as proteínas Gs podem difundir-se rapidamente na membrana plasmática;

- No tempo de ligação Gsα-GTP, apenas

uma molécula de adenilato ciclase é activada, promovendo-se a síntese de muitas moléculas de AMPc.

- Pode ainda haver amplificação na síntese de enzima e do produto da enzima.

Finalização da Resposta Celular: O sucesso da comunicação intercelular exige que a resposta à hormona termine

rapidamente logo que a concentração da hormona decresça. Este efeito é obtido mediante vários processos:

1. O término da resposta é facilitado pela diminuição da afinidade do receptor que ocorre quando Gs é convertido da forma inactiva para a forma activa. Quando o GDP

ligado a Gsα é substituído por GTP após a ligação da hormona, o KD do complexo H – R

aumenta (a afinidade diminui);

2. O GTP ligado a Gsα é rapidamente hidrolisado, finalizando a activação da

adenilato ciclase, terminando a resposta celular (síntese de AMPc) a não ser que a

concentração da hormona permaneça suficientemente elevada para formar novos complexos H – R.

Algumas Toxinas Bacterianas Modificam Irreversivelmente as Proteínas G: Existem dois tipos de proteínas G (no processo de transdução de sinal que se

considerou), uma activa (Gs) e a outra inibi (Gi) a ligação. No caso particular da epinefrina, ocorre estimulação, mas noutros casos as proteínas Gi levam à inibição da resposta. A toxina da cólera (bactéria Vibrio cholerae) é uma proteína hexamérica, com

cinco subunidades β (semelhantes) e uma subunidade α. Esta é uma enzima que penetra a

membrana plasmática e entra no citosol, onde catalisa a adição covalente de ADP-ribose

(retirada de NAD+) a Gα. Esta torna-se activa (sempre ligada a GTP), pois quando há

ribozilação do complexo o GTP não pode desligar-se de Gα (não é hidrolisado), isto induz

uma resposta permanente da adenilato ciclase.

81

Os níveis de c-AMP aumentam cerca de 100x. Este aumento, ao nível das células

epiteliáis do intestino, leva a que certas proteínas permitam o fluxo massivo de água do sangue para o lúmen do intestino, dando-se uma elevada perda de água (desidratação) por diarreia. A toxina Pertussis é secretada pela bactéria Bordetella pertussis e afecta o tracto

respiratório, provocando tosse convulsa. Esta toxina tem uma subunidade S1, que cataliza

a adição de ADP-ribose à subunidade Giα (de inibição), no estado GDP-ligado. Assim Giα

deixa de inibir a adenilato ciclase, podendo esta produzir uma grande quantidade de AMPc. O aumento continuado da produção deste segundo mensageiro leva à perda de fluidos e electrólitos no muco nasal.

Conclusão: A consequência, nos dois casos, é o aumento do AMP cíclico.

Activação e Inibição da Adenilato-ciclase: A adenilato ciclase é estimulada e inibida por complexos receptor-ligando

diferentes. No fígado, tanto a glucagina como a epinefrina ligam GPCRs diferentes, mas

ambas activam a adenilato ciclase, accionando a mesma resposta celular (enviar glicose para o sangue). Nos adipócitos, os níveis de c-AMP podem ser regulados positiva ou

negativamente por hormonas. A glucagina, epinefrina e ACTH activam a adenilato ciclase

(estimulam proteínas G), no entanto, prostaglandinas (PGE1) e adenosinas ligam a um receptor que activa uma proteína G inibitória (Gi), inibindo a adenilato ciclase e consequentemente a produção de c-AMP.

82

Estrutura química e funcionamento das proteínas G triméricas:

A interacção Gα-Gβ dá-se na região N-terminal e nas regiões “Switch” I e II. Há

interacção Gβ-Gγ, mas não há interacção entre Gγ e Gα.

Os domínios N- e C- terminais de Gα interagem com o receptor.

Relativamente a Gα:

- Há indicações de que Gi e Gs interagem com a adenilato ciclase ao nível de locais

opostos logo, diferentes: A ligação de Gi parece induzir alteração conformacional no local activo que

inibe a actividade catalítica; Também Gi tem actividade de GTPase normal, hidrolizando o GTP

associado, o que leva à finalização do sinal inibidor.

Pode ainda acontecer que, em vez de Gα, seja Gβγ a regular a actividade em

algumas isoformas de adenilato ciclase. Neste caso, admite-se que o local de ligação com a

adenilato ciclase seja diferente dos locais utilizados pela Gi e a Gs.

Regulação da quantidade de AMPc: A síntese e a degradação do c-AMP estão sujeitas

a uma regulação complexa por múltiplas hormonas.

A síntese de c-AMP a partir de ATP é mediada,

nomeadamente, pela adenilato ciclase e a sua degradação

implica a presença de fosfodiesterase, que é muitas vezes estimulada pelo aumento da concentração citosólica de Ca2+. Existem células que regulam a quantidade de AMP

cíclico, transportando-o para fora da célula (segregando-o no meio extracelular).

Receptores de Tirosina cinase (RTK) e Ras: São receptores superficiais, sendo que os seus ligandos são hormonas

peptídeos/proteínas solúveis ou membranares, e incluem factores de crescimento como: NGF (dos nervos), PDGF (provocado pelas plaquetas), FGF, EGF (epidérmico) e a insulina. A ligação do ligando a estes receptores estimula a actividade intrínseca de

proteína cinase tirosínica do receptor, que estimula uma cascata transdutora de sinal, esta

produz alterações na fisiologia celular ou na expressão genética. As vias de sinalização RTKs têm um largo espectro de funções:

1.Regulação da proliferação e diferenciação celulares; 2. Promoção da sobrevivência celular; 3. Modulação do metabolismo celular.

Alguns RTKs foram identificados em estudos de cancro humano associado a

formas mutantes de receptores de factores de crescimento, os quais enviam um sinal para

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as células mesmo na ausência do factor de crescimento, originando proliferação descontrolada de certos cancros da mama. A ligação do ligando, a nível

extracelular, causa a dimerização da

maior parte dos RTKs. A proteína cinase de cada monómero fosforila, então, um conjunto distinto de resíduos de tirosina

no domínio citosólico do monómero associado (autofosforilação). A autofosforilação conta com 2

estádios:

- Primeiro os resíduos de tirosina perto do local catalítico são fosforilados, levando a uma alteração conformacional que facilita a ligação de ATP nalguns receptores (receptor de

insulina) e a ligação de outras proteínas (substratos) noutros receptores (receptor de FGF); - Segundo, a cinase intrínseca do receptor do receptor fosforila então outros locais no domínio citosólico, resultando fosfotirosinas que servem para acomodar outras proteínas

envolvidas na transducção do sinal.

As Ras e a subunidade Gα pertencem à

superfamília das proteínas activadoras de GTPases intracelulares.

Ras (RTK) e Gα (GPCR) são proteínas

activadoras de GTPase e alternam entre um estado

“on” (GTP ligado) e um estado “off” (GDP ligado).

Gα está directamente associada à actividade

dos GPCRs e faz a transdução de sinais para vários

efectores, por sua vez as Rãs não se encontram directamente associadas aos RTKs.

A activação de ambas as proteínas (Ras e Gα) é accionada pela ligação da

hormona ao respectivo receptor, sendo que Gα funciona sem proteínas auxiliares.

A activação das Ras é acelerada por uma

proteína, o factor GEF, este ao ligar-se à Ras induz a sua separação do GDP e a ligação ao GTP (normalmente existente em maior concentração

na célula), este ao ligar-se provoca a libertação do GEF. A Ras requer a assistência de outra proteína

no processo, a GAP (GTPase Activating Protein), esta estimula a actividade intrínseca de GTPase em 100x. Dá-se a hidrólise do GTP (ADP + Pi) e a

GAP desliga-se, conduzindo à desactivação das Ras.

84

As proteínas Ras mutadas estão associadas a vários tipos de cancro humano.

Ligam GTP, mas não o conseguem hidrolisar, ficando permanentemente no estado activo

(“on”) e causando a transformação neoplásica. As estruturas moleculares de Ras e Gs reflectem as diferenças nos mecanismos

de acção:

- A Ras é mais pequena (170 aminoácidos) do que Gα (300 aminoácidos), o que

justifica a necessidade de proteínas adicionais para o seu funcionamento; - A estrutura tridimensional da Ras é semelhante ao domínio da actividade de

GTPase da Gα; - Existe um domínio helicoidal em Gs que parece ser capaz de aumentar a taxa de hidrólise do GTP, tendo funções equivalentes à GAP (que activa a GTPase da Ras).

Como é que a ligação de um factor de crescimento (Ex. EGF) a RTK causa a activação da Ras?

Existem 2 proteínas citosólicas, GRB2 e Sos, que intrevêm no processo.

Activação de Ras no seguimento da ligação da hormona:

1. Ocorre a ligação de EGF ao receptor, dando-se a dimerização e a autofosforilação dos resíduos de tirosina.

2. A proteína adaptadora GRB2 liga-se a uma fosfotirosina específica do receptor,

pelo domínio SH2. Os dois domínios SH3 da GRB2 ligam-se à Sos, interagindo esta com a Ras. 3. A actividade de Sos promove a activação da Ras, induzindo a dissociação do GDP

e a consequente ligação de GTP, depois desta dissocia-se da Ras. A GRB2 funciona como uma proteína adaptadora para o receptor de EGF (factor

de crescimento). A Sos funciona como uma GEF, que ajuda a converter Ras-GDP (inactiva) para a

forma Ras-GTP (activa).

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A análise de mutantes (relativamente aos olhos) de Drosophila melanogaster, bloqueados num determinado estádio de diferenciação, forneceu informação importante

acerca das vias de sinalização por RTKs. O olho destes insectos tem 800 omatídios (olhos individuais), e cada um deles possui 22 células, das quais 8 são neurónios fotossensíveis (retínulas ou células R). Um

RTK destas células é o Sev (sevenless), que regula especificamente o desenvolvimento da célula R7. A observação de omatídios através de uma técnica especial permite-nos distinguir os fotorreceptores. Cada omatídio do tipo selvagem apresenta 7 fotorreceptores,

já os mutantes possuem apenas 6, não têm o R7 (responsável pela observação da luz ultravioleta).

Na superfície da célula R8 expressa-se a proteína Boss, que, ligada à membrana, sinaliza o RTK Sev da célula vizinha percursora de R7, induzindo produção de um neurónio fotossensível. Mutantes sem Sev RTK funcional (mutante sev- forma recessiva) não

induzem a formação destes neurónios, pois a proteína Boss não estabelece o contacto com a célula precursora de R7. Se tivermos um duplo mutante (sev- e RasD), a proteína Ras mantém-se continuamente activa e produz-se o neurónio.

Conclusão: O receptor Sev RTK é essencial á activação de Ras. Esta activada conduz à resposta, independentemente da existência do receptor específico.

Para identificar proteínas transductoras de sinais intracelulares na via Sev RTK, os

investigadores produziram moscas mutantes cuja expressão da proteína Sev (receptor) é sensível a temperatura. Por esta via codificaram-se genes de 3 proteínas importantes da via de sinalização do receptor Sev.

1. A proteína Ras revelou 80% de identidade com a proteína correspondente nos Mamíferos;

2. A proteína Sos tem 45% de identidade com a proteína correspondente nos ratos; 3. Uma proteína adaptadora contendo parte SH2 tem 64% de identidade com a proteína humana GRB2.

Além da via Sev RTK, estas três proteínas também aparecem em outras vias de transdução de RTK, utilizadas em tempos e locais diferentes do desenvolvimento das

moscas. A sequência fosfotirosina – ácido glutâmico – ácido glutâmico – isoleucina de RTK

liga-se ao domínio SH2 da GRB2. As sequências ricas em prolina de Sos promovem a ligação desta ao domínio SH3 da GRB2. As sequências ricas em prolina desempenham duas funções:

- Assumem uma conformação expandidam que facilita as interacções; - Um sub-conjunto destas prolinas forma bolsas de ligação com a superfície de SH3.

Existem outros resíduos sem prolina que também têm um papel importante na especificidade da ligação. Ligação RasGDP-Sos:

1. Antes da ligação da Sos à RasGDP, o grupo C-terminal da Sos inibe a possibilidade de troca de GDP por GTP. A ligação a GRB2 liberta esta inibição por alteração conformacional envolvendo “Switch” I e I;

2. Depois a Ras liga GTP e torna-se activa (existe 10x mais GTP nas células);

86

3. A RasGTP ao produzir uma conformação específica dos “Switchs” (I e II) activa moléculas efectoras.

Via das MAP cinases: Todas os RTKs parecem usar uma via geral em que o sinal induzido por ligação

ao ligando é comunicado através de GRB2 e Sos, sendo activada a via de transducção de sinal. A Ras induz uma cascata de cinases que finaliza na activação de uma MAP cinase.

MAP cinase: É uma cinase de serina/treonina, capaz de entrar no núcleo para

fosforilar proteínas que incluem factores de transcrição que regulam a expressão de proteínas específicas. Estudos em leveduras, Drosophila e mamíferos revelaram cascata de proteínas-

cinases altamente conservada.

- A Ras activada (RasGTP) liga ao domínio N-terminal da Raf; - A Raf activada (desligada da RasGTP) liga e fosforila a MEK;

- A MEK activa a MAP cinase por fosforilação de uma tirosina e de uma treonina; - A MAP cinase fosforila diversas proteínas, incluindo factores de transcrição que medeiam respostas celulares.

Realizou-se uma experiência utilizando o “Sistema de 2 híbridos de levedura”

para mostrar a capacidade de ligação da Ras a outra proteína, a Raf. A conclusão a que se chegou foi que se o gene Ras se ligar a um produto do cDNA, permitirá o crescimento da colónia sem histidina, se esse produto for Raf. Se nõ for, a colónia não cresce.

Existem duas proteínas que não foram referidas que podem ainda participar na

cascata MAP cinase a partir da Ras, a 14-3-3 e a Ksr: - Antes da estimulação, a Raf está no citossol numa configuração inactiva

estabilizada pelo dímero da 14-3-3. Esta proteína liga à fosfoserina da Raf, em Ser-259 e Ser-621. A interacção da Ras-GTP com a Raf induz uma alteração conformacional, rompendo ligação com a 14-3-3. A Ser-259 é desfosforilada, activando a Raf cinase.

87

- A Ksr contêm locais de ligação para a Raf, 14-3-3, MEK e MAP cinase. Portanto, mesmo depois da dissociação da ligação Raf – RasGDP, a Ksr fornece uma base de ligção para manter funcional o grande complexo de sinalização.

Como é que a fosforilação activa a MAP cinase?

A MAP cinase tem um local catalítico Lip (lábio de fosforilação), que altera a sua

conformação. Quando a MEK liga à MAP cinase:

- Uma determinada tirosina é exposta por destabilização da estrutura do lábio de

fosforilação da MAP cinase; - A MEK fosforila uma tirosina e também um treonina próxima da MAP cinase; - Estes aminoácidos da MAP cinase fosforilados vão então interagir com outros

aminoácidos e dar uma nova conformação à região do lábio; - Facilita-se assim a ligação do ATP ao local catalítico promovendo a actividade catalítica da MAP cinase.

- A fosfotirosina também é importante na formação de locais de ligação, de proteínas substrato específicas, à superfície da MAP cinase; - A fosforilação promove ainda a dimerização da MAP cinase necessária à entrada no

núcleo. É a forma dimérica que consegue entrar no núcleo onde vai activar factores de transcrição. Existem diversas MAP cinases associadas a sinalizações em Mamíferos: EKR; Jun

N-terminal e p38.

Vias da MAP cinase independentes de RTKs: Nas leveduras, esta via é independente de RTKs, uma vez que estes não existem

nestes organismos, a via MAP cinase está associada a receptores GPCRs.

Em Saccharomyces cerevisiae (no processo de conjugação) já foram identificadas

6 vias MAP cinases. O esquema em baixo representa 5 (das 6) vias de MAP cinase desencadeadas por sinais extracelulares já identificados.

Por acção das diferentes vias MAP cinase obtêm-se diferentes respostas celulares:

1. As ferormonas, pela via da Fus3, induzem a cunjugação das leveduras; 2. A carência de nutrientes, através da Kss1, induz a proliferação de hifas;

3. A elevada osmolaridae, pela via da Hog1, leva à síntese de osmólitos; 4. O choque hipotónico, através da Mpk1, conduz à remodelação da parede celular;

5. A falta de carbono e azoto, pela SMk1, induz a esporulação.

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Especificidade das vias MAP cinase: As cascatas das MAP cinases podem possuir proteínas em comum. Por exemplo,

Ste11, esta proteína é comum à sinalização que conduz a respostas celulares de conjugação, proliferação de hifas e osmorregulação. Todo o complexo enzimático confere

especificidade a cada uma das vias de sinalização. Exemplo: Processo de conjugação:

Após a sinalização, ocorre a ligação da proteína Gs ao receptor, Gα dissocia-se de

GDP e liga GTP e aquando desta ligação, dissocia-se de Gβ/γ. Este complexo vai continuar

o processo e Gα vai activar a adenilato ciclase. Este é um dos casos em que o complexo

Gβ/γ contém o sinal. 1. O complexo Gβ/γ activa a Ste20 que é uma serina/treonina cinase;

2. Existe uma proteína que serve de ancoradouro (Ste5, equivalente à proteína ligadora Ksr) onde se encontra a Ste11, esta vai ser fosforilada pela Ste20; 3. A Ste11 (serina/treonina cinase, equivalente à Raf) activada fosforila a Ste7,

uma cinase específica equivalente à MEK; 4. A Ste7 activada fosforila a Fus3, uma serina/treonina cinase (equivalente à MAP cinase)

5. Finalmente a Fus3 activa a Ste12 (não está acoplada a Ste5) e, sendo esta um factor de transcrição, dá origem à resposta celular (conjugação).

Exemplo: Osmorregulação

- Neste processo intervém também a Ste11, mas ligada a um receptor Pbs2 (apresenta função correspondente à MEK). Este liga-se a Hog1 (actividade de MAP cinase)

e Sho1, uma proteína intimamente ligada à membrana, que apresenta actividade na transdução de sinal. Uma MAP cinase pode substituir outra que esteja ausente. Por exemplo, um

mutante “Sem Fus3” tem a capacidade de induzir conjugação apesar da sua ausência, a

cascata ocorre normalmente, sendo Fus3 substituído por Kss1 (actua na formação de hifas). Esta é mobilizada para o local onde iria actuar o Fus3, sendo capaz de promover factores de conjugação, pelos quais não teria afinidade. Para o mutante “Fus3 morta”, há

produção de Fus3 mas inactivo, este liga-se na mesma a Ste5 (impedindo a substituição por Kss1), levando ao bloqueamento da via de sinalização e consequentemente à não ocorrência de conjugação.