葡萄糖激酶与糖尿病的研究进展

前言 GK 的结构、分布及特点 GK 的生物学作用 GK 与糖尿病 GK 活性的调节机制 GKRP 参与调解 GK 的活性 现有改善 GK 活性的化合物及 GK 激动剂的发现 总结

背景介绍 糖尿病 (DM) 是由不同病因导致胰岛 β 细胞分泌胰岛素不足和

（或）周围组织胰岛素抵抗而引起的以血糖水平增高为特征的代谢性疾病，表现为糖代谢、脂代谢异常及多种并发症的发生。高血糖是 DM 的主要生化特征，其产生与肝脏及外周组织对葡萄糖的利用减少，肝糖生成增多有关。

目前，对 DM 的发病机制尚未十分明确，虽然现有一些不同作用靶点的药物用于治疗糖尿病，但有时并不能达到预期。研究发现治疗 DM 新药的核心问题是确定有效的药物作用靶点〔 1 〕 。

葡萄糖激酶（ GK ）是近年来逐渐被人们重视，以它作为靶点来开发新药是未来研究的方向之一，基于该靶点的小分子活化剂研究也非常活跃。

GK 的结构、分布及特点 哺乳动物组织含有 4 种不同的已糖激酶 (HK) , 按负电荷由小到

大顺序命名为Ⅰ～ Ⅳ型 , 其中 HKⅣ 被称作 GK 。 GK 是一个单节显性变位酶，其底物为葡萄糖，与其他同工酶在分子结构和功能特性上均不同 。人类 GK 的晶体结构〔 2 〕如 Fig 1 所示，由 488 个氨基酸残基构成，折叠成大小不等的两个结构域，中间凹槽为连接域，葡萄糖分子磷酸化的活性位点和小分子活化剂的变构位点都位于该连接域内。

GK 具有高度典型的组织分布特异性，含量最为丰富的是成熟肝实质细胞和胰岛 β 细胞，在神经内分泌细胞核肠道细胞内也有少量分布。

GK 具有区别于其它 HK 的酶学特性：⑴对葡萄糖亲和力低（ Km=8mmol.L ）；⑵在葡萄糖生理浓度范围内，不受产物6- 磷酸葡萄糖的反馈性抑制；⑶动力学曲线为 S 状，与葡萄糖在动力学上有协同性；⑷ GK 的 分子量 52KU, 明显小于其它己糖激酶 100KU.

Fig1. Overall Structures of Glucokinase Ribbon drawing of the GK(1-11) structure complexed with glucose (red, ball-and-stick model) and compound A (yellow, ball-and-stickmodel). The spatial relationship of the large domain (blue) and the small domain (cyan) exhibited a closed form. The two domains are connectedby connecting regions I–III (green). The 13 helix (magenta) is included in the small domain of the closed form.

GK 的生物学作用 糖是有机体重要的能源和碳源。糖分解产生能量，可以供给有机

体生命活动的需要，糖代谢的中间产物又可以转变成其它的含碳化合物，如氨基酸、脂肪酸、核苷等。糖代谢可分为糖的分解与糖的合成两方面。糖的分解包括糖酵解—糖的共同分解途径；三羧酸循环—糖的最后氧化途径。酵解是酶将葡萄糖降解成丙酮酸并伴随着生成 ATP 的过程。它是动植物、细胞中葡萄糖分解产生能量的共同代谢途径。在耗氧有机体中，酵解生成的丙酮酸进入线粒体，经三羧酸循环被彻底氧化成 CO2 和水；酵解生成的NADH 经呼吸链氧化而产生 ATP 和水（ Fig2 ） .

所以酵解是氧化磷酸化和三羧酸循环的前奏。 GK 是糖酵解途径中的第一关键酶，它可以在 ATP存在的条件下，将葡萄糖磷酸化而成为 6- 磷酸葡萄糖，进入下游的代谢过程。因此，此步是整个代谢过程的第一个限速步骤， GK 为糖代谢过程中的一个限速酶，起到重要的生物学作用。（ Fig3 ）

Fig2 糖代谢概况

Fig3 糖酵解

GK 与糖尿病 DM 的发病与胰岛素抵抗及胰岛素分泌缺陷两方面有关，现已明确 DM

为多基因遗传因子所决定，包括：葡萄糖转运蛋白 -1 ， 4 基因，胰淀粉样多肽基因，葡萄糖激酶基因等。对青年型早发糖尿病 MODY 的深入研究证实了 GK 活性改变与糖尿病的发生有关。 (MODY 是一种单基因突变的遗传性疾病，在已发现的 6 种突变基因中， GK 基因突变者被命名为 MODY-2.) 而一般的 DM 个体中也普遍存在 GK 活性下降。

肝脏是糖代谢的重要器官，胰岛素是体内主要的降解激素，而在肝脏糖代谢和胰岛 β 细胞分裂胰岛素的过程中， GK催化葡萄糖转变为 6- 磷酸葡萄糖都是极为关键的一步，所以 GK 活性异常在糖代谢紊乱的发生发展中起着重要作用。在正常生理条件下， GK 主要作用是监控血中的葡萄糖水平。当血中的葡萄糖水平升高时， GK可以通过两条途径降低血糖水平〔 3 ， 4 〕 ：一方面胰岛细胞中的 GK促进胰岛细胞分泌胰岛素，分泌到血液中的胰岛素通过肌肉细胞、脂肪细胞和肝脏细胞的胰岛素受体介导进行糖原合成；另一方面，肝细胞中的 GK可以直接促进糖原合成。在这两条途径共同作用下，迅速降低过高的血糖水平。但是在一些特定的条件下，由于 GK过度激活或者失活，导致血中葡萄糖水平过低或过高，继而引发Ⅱ型糖尿病和高血糖症的一系列病变反应。

GK 活性的调节机制

晶体结构分析表明 Fig4 ， GK存在 3 种不同的构象，即关闭型，开启型，和超开启型。其中前两种为活性构象，第 3三种为非活性构象。。由于能量消耗不同 ,关闭型构象与超开启型构象之间的转化较慢 ,而关闭型和开启型构象之间的转变较快。当血糖浓度较低时 , GK 主要以稳定的超开启构象存在 , 当葡萄糖分子与之结合后 ,其构象缓慢转变为开启型构象 ,然后转变为关闭型构象 ,在 ATP存在下同时发生酶催化反应———葡萄糖磷酸化。反应结束后 GK回复到开启型构象 ,同时释放出 6- 磷酸葡萄糖 (G6P) 和ADP 。若有新的葡萄糖分子结合则继续发生磷酸化 ,进入快循环 ; 若没有新的葡萄糖分子结合 , GK则转变为超开启型构象 ,进入慢循环。

当小分子活化剂结合到 GK 活性构象变构位点后 , GK就不能回复到非活性构象 , 只能以两种活性构象存在 , GK 的活性得以增强。

Figure 4. Kinetic Model of GlucokinaseGlucokinase appears to exist in three conformations and to havetwo catalytic cycles. The ratio of two catalytic cycles is responsiblefor the sigmoidal response to glucose. Although ordered processin the slow cycle of glucokinase was indicated by isotope-exchange experiment, the addition of substrates in the fast cycle may be random.

GKRP 参与调解 GK 的活性 有研究者 Clark 〔 5 〕 ， Van 〔 6 〕等研究发现 GKRP可与葡萄糖竞争，抑制葡萄糖与 GK 的结合， 6- 磷酸果糖（ F-6-P ）或 1-磷酸果糖 (F-1-P) 能通过影响 GKRP 与 GK 的结合，而加强或拮抗这种抑制作用，从而影响葡萄糖的磷酸化。当葡萄糖浓度很低时 ( 禁食 )， GK 与 GKRP 结合形成复合物，此时 GK没有活性，该复合物存在于细胞核，当葡萄糖浓度增高或有 F-1-P存在时， F-1-P可替代 GKRP 上结合的 F-6-P ，将 F-6-P 从 GKRP 上置换出来，结合了 F-1-P 的 GKRP从而与 GK 解离，最终细胞核中活性状态的 GK 被释放到胞质内，而催化葡萄糖的磷酸化。因此 GK 活化剂可直接对 GK 起激动作用，也促进 GKRP 与 GK 的解离，增强活性。

其他如葡萄糖的类似物 N-乙酰葡萄糖胺、甘露庚酮糖等也可抑制 GK 的活性，分别结合在 GK 开启型和关闭型构象的催化位点。

现有改善 GK 活性的化合物及 GK 激动剂的发现 在研究 GK 与糖尿病的关系中，人们发现了许多化合物，如有机

钒〔 7 〕 、硒酸盐〔 8 〕在 STZ-DM 大鼠治疗中， β肾上腺素能兴奋剂〔 9 〕在四氧嘧啶 DM 大鼠治疗中出现血糖尿糖明显改善、肝脏GK 活性及 mRNA 水平明显提高等改善糖尿病症状； 胰高血糖素样肽 -1 （ GLP-1 ）〔 10 〕和生物素〔 11 〕可以通过提高 GK 的活性降低血糖。

迄今报道的 GK 小分子活化剂有 8 种结构类型 200余个活性化合物，其中 PSN-010 已进入临床一期的研究，处于临床前研究阶段的有（ Ro-28-1675 、 Ro-27-4375 、 GKA1 、 GKA2 、 ,thiophene22 、 LY2121260 、 psn-105 等）。研究较多的主要有三（环）取代酰胺类化合物、（ e ） -2 ， 3-二取代 -n-芳杂丙烯酰胺类化合物、四唑基苯乙酰胺类化合物、芳基环烷基丙酰胺类化合物、 α-酰基和 α-杂原子取代苯乙酰胺类化合物、含乙内酰脲结构化合物等。此外，对位氨基取代的苯胺类化合物、 n-芳杂苯乙酰胺类化合物等作为GK 活化剂也有报道，但关于构效关系分析的文献报道较少。

RO-28-1675 （ e.g. ）Refer:Grimsby J ， Sarabu R ， Corhett W L ， et a1 ． Allosteric

activators of glucokinase ： potential role in diabetes therapy[J] ． Science ， 2003 ， 301(5631) ： 370—3．

1 、 RO-28-0450 的 R(RO-28-1675) 和 S(RO-28-1674) 构型对 GK活性的影响（ Fig1 ）。

2 、在能够分泌胰岛素的胰岛细胞上测定激活剂的作用，该 GK 激活剂可以在血糖不高的情况下，诱导胰岛 β 细胞分泌胰岛素。当化合物作用于肝脏细胞时，细胞释放葡萄糖减少，从而解决了糖尿病的肝糖代谢问题。有科学家 Alant Cherringlon评价：同时作用于胰腺和肝脏的化合物是很有潜力的。

3 、 RO-28-1675 激活剂在各种动物模型治疗后血糖的变化〔 12 〕 Fig5.

Science 301, 370 (2003);

Fig5 Ro-28-1675

Animal Model Basal blood glucose

C57BL/6J

Dio C57BL/6J

KK

Ob/ob

GK Rat

Db/db _

GKA50 （ Cellular level e.g. ） Glucose-Dependent Modulation of Insulin Secretion and

Intracellular Calcium Ions by GKA50, a Glucokinase activatorDiabetes ， 2007 ， VOL56

GKA50 modulates insulin secretion from human and rodent insulin-secreting cells(Fig6).

DIABETES, VOL. 56, JUNE 2007

Glucokinase assay

Activation and Translocation of Glucokinase in Rat Primary Hepatocytes Monitored by High Content Image Analysis(Journal of

Biomolecular Screening, Vol. 13, No. 9, 837-846 (2008)) 25 mM HEPES (pH,7.1), 25 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1

mM DTT, 1 mM NAD, 0.1% BSA, 5%DMSO, 5 U/ml glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides, 5 mM glucose (unless indicated otherwise), and 0.7 ug/ml human liver GST-GK fusion protein in a volume of 0.12 ml (Fig7).

Fig7 GK ASSAY

Discovery of GK activators

LGH00230 EC50 = 3.15±0.491 ug/ml

Secondary functional assay

Molecular level Effect on Km and kcat value of glucokinase toward glucose Selectivity assay toward other Hexokinase (HKI, II, and III) Activation on the glucokinase presence of glucokinase

regulatory protein (GKRP) Cellular level

Isolated rat islets for glucose induced insulin secretion Min6 islet cell line for GIIS

Animal level C57BL6J ob/ob obesity mice

总结 药物研究的一种新思路：药物能够准确有效的识别靶

点，其中，一些关键酶可成为药物的高效、高选择性靶点。基于 GK 在血糖平衡控制中起到促进胰岛素分泌和减少肝脏葡萄糖生成的双重作用， GK 已被作为2 型糖尿病药物治疗中的一个强有力的潜在靶点。而GK 激活剂具有影响胰岛素释放和肝脏葡萄糖代谢的功能，在葡萄糖动态平衡中 GK 的复杂功能研究中可以发挥重要作用，也可能成为糖尿病治疗的安全有效的新型药物。

但是此类激活剂有局限性： 1 、可能对 1 型和严重 2型糖尿病无效，因为此两类病人的胰岛素分泌极少或分泌不足。 2 、可能会造成低血糖或糖原蓄积。如果严格控制服用剂量是可以避免的。

FIG6. GKA50 modulates insulin secretion from human and rodent insulin-secreting cells. GKA50 (inset) enhances GSIS from mouse (A and B),human (C), and rat (D) islets in a glucose-dependent manner. Control islets ( or E); 1 mol/l GKA50-treated islets (p or F). Mouse islet data are typical of n 7 separate experiments, human islet data were obtained from a single donor with each dataset representing n 6 replications(similar results were also obtained from a second preparation of human islets), and rat islet data were obtained from n 5 separate experiments.Where appropriate, values are expressed as means SE, and * symbolizes a significant GKA50-dependent increase in insulin release over the respective control values.