Gizakia eta arratoiaren garuneko peptidasak: opiazeoekiko menpekotasunaren eragina neuropeptidoen anderakuntzan

Jakintza-arloa: Medikuntza

Egilea: GORKA LARRINAGA ENBEITA

Urtea: 2002

Zuzendariak: JON IRAZUSTA ASTIAZARAN, JAVIER GIL GOIKURIA

Unibertsitatea: UPV-EHU

ISBN: 978-84-8438-354-3

Hitzaurrea

Nire ikerketaren ibilbidea EHUko Medikuntza Fakultateko Fisiologia Sailean hasi zen, Fisiologia Zelularreko Laborategian hain zuzen. Talde honek zelula komunikazioan eragina duten sistema peptidikoen ikerketan 25 urte dirau. Peptido bioaktiboak eta hauek eraldatzen dituzten entzimak (peptidasak) eragin zuzena dute hainbat prozesu fisiologikotan eta, ondorioz, sistema hauen desorekek hainbat patologiatan eragiten dute. Euren artean droga psikoaktiboek sortutako menpekotasun prozesuetan.

Opiazeoekiko menpekotasuna, droga-menpekotasunen artean gizartean galera handienak sortu dituena izan da. Morfina eta heroinak menpekotasun psikikoa (droga hartzeko premia kontrolagaitza) eta menpekotasun fisikoa edo abstinentzia eragiteko duten gaitasuna ezaguna da, baina gertaera hauen oinarri neurokimiko eta molekularrei dagokionez oraindik hutsune ugari daude. Interes honek bultzatuta, “Gizakia eta arratoiaren garuneko peptidasak. Opiazeoekiko menpekotasunaren eragina neuropeptidoen anderakuntzan” izenburua duen Tesia egin nuen. Lan honetan opiazeoak hartzeak menpekotasunarekin zerikusia duten garun ataletan peptidasa ezberdinei nola eragiten dion aztertu nuen. Tesia 2003ko uztailaren 16an defendatu nuen. Lanak bere hedapena izan zuen, nazioarteko aldizkarietan 5 artikulu argitaratu zirelarik. Hau dela eta, Tesi honek EHU-k banatzen duen Aparteko Saria jaso zuen 2005ean, Osasun Zientzien atalean.

Honen ostean, taldeak izan duen ikerketa azpilerroetariko batekin erlazionatuta (sistema peptidikoak eta zelula garapen prozesuak), gai berriarekin hasi nintzen: sistema peptidikoen erregulazioa gaixotasun neoplasikoetan. Hau da gaur egun nire ikerketa lerroa, eta honekin batera EHUko Medikuntza Fakultatean fisiologia ikasgaiko irakasle lana betetzen dut.

Gorka Larrrinaga2011

Gizakia eta arratoiaren garuneko peptidasak. Opiazeoekiko

menpekotasunaren eragina neuropeptidoen anderakuntzan.

Doktore-tesia:

Gorka Larrinaga Enbeita

Fisiologia Saila

Medikuntza eta Odontologia Fakultatea

Aurkibidea

Aurkibidea

Doktore-tesia

I. Sarrera

1. Opiazeoak eta barne sistema opioidea 1

1.1. Sarrera historikoa 1

1.2. Opioaren konposaketa 2

1.3. Hartzaile opioideak 3

1.3.1. Deskribapen historikoa eta klasifikazioa 3

1.3.2. Ezaugarri molekularrak 4

1.3.3. Hartzaile opioideen kokapena nerbio sisteman 6

1.3.4. Hartzaile opioideen aktibazioa. Ezaugarri

molekularrak eta efektu fisiologikoak 7

1.4. Barneko peptido opioideak 11

1.4.1. Neuropeptidoak. Orokortasunak 11

1.4.2. Deskribapen historikoa 13

1.4.3. Klasifikazioa, ezaugarri molekularrak, eta kokapena 14

2. Neuropeptidoen anderakuntza 18

2.1. Entzima proteolitikoak 18

2.2. Peptidasak. Deskribapen orokorra 19

2.2.1. Entzefalinen anderakuntza. Aminopeptidasak

eta endopeptidasa neutroa 24.11 22

2.2.2. Beste neuropeptido ezberdinen

anderakuntzan eragiten duten peptidasak 26

3. Opiazeoekiko menpekotasuna 32

3.1. Kontzeptuak 32

3.2. Menpekotasun psikikoa 33

Aurkibidea

Doktore-tesia

3.3. Menpekotasun fisikoa 36

3.4. Menpekotasuna eta barne sistema opioidea 43

3.5. Menpekotasuna eta BPO-en anderakuntza 49

3.6. Menpekotasuna, beste neuropeptidoak

eta hauen anderakuntza 52

II. Helburuak 55

III. Materiala eta metodoak

1. Materiala 59

1.1. Esperimentazio animaliak eta talde esperimentalak 59

1.2. Gizaki garun laginak, postmortem 60

1.3. Ekipamendua 61

1.4. Produktu kimikoak 62

1.5. Soluzioak 63

1.5.1. Soluzio indargetzaileak 63

1.5.2. Entseiu entzimatikoentzako substratu soluzioak 64

1.5.3. Beste soluzio batzuk 67

2. Metodoak 69

2.1. Tratamenduak 69

2.1.1. Morfinarekin egindako tratamendua 69

2.1.2. Abstinentzia sindromearen gogortasunaren

neurria arratoietan. Esperimentu konduktualak 70

2.2. Teknika kirurgikoak 70

2.3. Zatiki azpizelularren lorpena 71

Aurkibidea

Doktore-tesia

2.4. Zatiki azpizelularren purutasunaren froga 75

2.4.1. Entzima markatzaileak 75

2.4.2. Zatiki nuklearra 75

2.4.3. Zatiki sinaptosomala 76

2.5. Peptidasen aktibitatearen determinazio fluorimetrikoa 76

2.6. Proteinen neurketa 78

2.7. Metodo estatistikoa 78

IV. Emaitzak

1. Gizaki eta arratoiaren garun kortexeko

peptidasa ezberdinen banaketa azpizelularra 81

2. Gizaki eta arratoiaren NSZ-ko peptidasa

ezberdinen banaketa erregionala 111

3. Heroinaren efektua giza garunaren kortex

prefrontaleko eta nukleo kaudatuko peptidasa

ezberdinen gain 137

4. Morfinarekiko tolerantzia eta abstinentzi

sindromearen efektua arratoiaren NSZ-ko

gune ezberdinetako peptidasen gain 163

V. Eztabaida

1. Peptidasen banaketa azpizelularra

gizaki eta arratoiaren garun kortexean 213

Aurkibidea

Doktore-tesia

1.1. Peptidasa solugarriak 215

1.2. Mintzari lotutako peptidasak 217

2. Peptidasa aktibitateak gizakiaren

eta arratoiaren garuneko atal ezberdinetan 222

2.1. Prolil endopeptidasa 223

2.2. Puromizinarekiko sentikorra

den aminopeptidasa (PSA) 225

2.3. Arginil aminopeptidasa edo APB 225

2.4. Beste peptidasak 226

3. Garuneko peptidasa aktibitateak

opiazeoekiko menpekotasunean 228

3.1. Opiazeoekiko menpekotasuna

eta BPO-en katabolismoa 229

3.2. Opiazeoekiko menpekotasuna eta

beste peptido batzuen anderakuntza 234

VI. Konklusioak 237

VII. Bibliografia 239

I. Sarrera

Sarrera

Doktore-tesia

1

1. Opiazeoak eta barne sistema

opioidea.

1.1. Sarrera historikoa:

Opioa, bere eragin psikoaktiboak direla eta, beste edozein narkotiko baino gehiago

erabili izan da historian zehar, alkohola alde batera utzita. Izan ere, opioak beti izan du toki

gailena medikuntzan, gutxienez azken 4000 urteotan terapeutikan ugari erabili da eta

(Snyder eta lank., 1993).

Baina bere erabilpena, baita helburu hedonistikoekin, XIX. Mendearen hasieran

asko zabaldu zen Europa osoan zehar, Britaniar Inperioaren zabalkuntzak Europa eta lo-

belarra ekoiztu eta erabiltzen zuten Ekialdeko herrialdeen arteko merkatal harremanak

hobetzea ekarri baitzuen.

Opiazeoen eragin kimikoak zientifikoki ulertzen, ordea, opioaren osagai aktiboak

isolatutakoan hasi ziren. 1805ean Friedrich Sertürner izeneko kimikari alemaniar batek lo-

belarretik morfina hutsa lortu zuen eta substantzia hau morphium izenaz bataiatu zuen,

Morfeo edo loaren jainko Grekoaren oroimenez. Morfinaren isolamenduak beste sendagai

askoren osagai puruak aurkitzera bultzatu zituen kimikari asko eta horrela joan ziren

agertzen kinina (paludismoaren tratamenduan aitzindaria), kokaina (lehenengo anestesiko

lokala), e.a. Normalean kimikoki puruak diren substantziak erabiltzeak abantaila izaten du

landare-estraktuen aldean, ur-disoluzioetan disolbatu eta zuzenean odol-zirkulaziora injekta

daitezke eta.

1853. urtetik aurrera, Alexander Woodek xiringa hipodermikoa asmatu eta gero,

morfina injektatzea posible bihurtu zen. Bide parenteralez morfinak duen ahalmen

analgesikoa azkarrago eta intentsitate handiagoz lortzen zen eta horregatik kontsumo-mota

hau asko zabaldu zen mende honetan zehar. Adibidez, ezaguna da Iparramerikako guda

Sarrera

Doktore-Tesia

2

zibilak eta guda Franko-Prusiarrak hainbat soldadu bidali zituela etxera morfinarekiko

izugarrizko menpekotasunarekin, “soldaduaren gaitza“ bezala ezagutua garai haietan.

XX. Mendean opiazeoekiko menpekotasuna izurrite bat izan dela esan genezake

baina arduradun nagusia heroina izan da eta ez morfina. Deribatu erdisintetiko hau 1875-an

sortu zen eta Bayer farmazi enpresak eztulkontrako botika bezala merkaturatu zuen

1898an. Ia 25 urtetan ez zen neurririk hartu heroina erabiltzearen aurka, beharbada ahotik

hartzen zen eztulkontrako botikak efektu psikoaktiborik sortzea espero ez zutelako.

60.hamarkadan Estatu Batuetan eta 70. hamarkadan Europan heroinaren erabilpena

asko hedatu zen. Garai haietan emandako drogekiko jarrera aldaketak eta hasiera bateko

heroinaren prezio baxuak heroinazale kopurua nabarmen handitzea ekarri zuen (%1000)

(Escohotado, 1999). Azkenengo hamarkadan heroinaren erabilpena asko jaitsi da. EAEan

adibidez, 1986an 15-24 urteko gazteen artean %2.8ak noizbait heroina probatu zuen,

1996an ordea, %0.6ak (Elzo eta lank., 2000).

Hala ere, hasi berria den XXI. mende honetan opiazeoekiko menpekotasunak

gizartearentzat arazo larri bat izaten jarraitzen du.

1.2. Opioaren konposaketa:

Opioa lo-belarraren (Papaver Somniferum) fruituetatik ateratako erretxina da eta bere

ondorioen arduradun nagusia, morfina (Lorenzo eta lank., 1999). Merkaturatze bide legalek

daramaten opio kantitatea munduko ekoizpenaren erdira baino ez da iristen. Asiaren

hegoekialdean dauden eta “Urrezko Triangelua“ izenaz ezagutzen ditugun lurraldeak

(Laos, Tailandiaren iparraldea eta Birmaniaren iparmendebaldea) dira legez kanpoko

opioaren ekoizle nagusiak.

Oro har lo-belar landare batek eman dezakeen opio gordineko kantitatea 5-10

gramokoa da. Opioaren % 75-80-a substantzi inaktiboak dira eta beste % 20-25a substantzi

aktiboek osatzen dute. Garrantzitsuenak morfina (% 10), narkotina (% 6), papaverina (%

1) eta kodeina (% 0.5) dira.

Sarrera

Doktore-tesia

3

Heroina, morfinari talde azetilo bi gehituz lorturiko eratorri erdisintetikoa da eta

talde horiei esker lipodisolbagarritasun handia du. Horren ondorioz garuneko ehunetara

errazago heltzen da eta sortutako efektuak morfinak sortutakoak baino biziagoak dira.

1.3. Hartzaile opioideak:

1.3.1. Deskribapen historikoa eta klasifikazioa:

Barne sistema opioideoa guztiz ezezaguna izan da 70. hamarkadaren hasiera arte.

Morfina, heroina eta bere antzekoek sortutako antinozizepzioa eta menpekotasuna beste

neurotransmisore sistemen arteko elkarrekintza kontestupean ikasi ohi ziren, adibidez

sistema monoaminergikoa eta kolinergikoa (Akil eta lank., 1998). 50. hamarkadan,

ikertzaile batzuk bazegoela opiazeoekiko espezifikoa den hartzaile bat hipotetizatu zuten

(Beckett eta Casy, 1954) baina ezin izan zuten frogatu barneko “opiazeo antzeko” sistema

honen existentzia. Honela, 1973. urtean aldi berean hiru laborategi ezberdinetan ugaztunen

nerbio sisteman erradiaktiboki markatuta zeuden opiazeoak hartzaile batzuei espezifikoki

lotzen zitzaizkiela aurkitu zuten (Pert eta Snyder, 1973; Simon eta lank., 1973; Terenius,

1973). Aurkikuntza honek barneko substantzia opioideak egon behar zutenaren susmopean

jarri zituen ikertzaileak. 5 urteko epean barneko ligando ugari aurkitu zirenez (entzefalinak,

endorfinak eta dinorfinak), ez zen harrigarria hartzaile berriak ere deskribatzea.

Txakurretan eginiko in vivo ikerketa farmakologikoetan oinarrituz 1976an hiru

hartzaile opioide mota daudela postulatu zuten (Martín eta lank., 1976): µ (morfinarekin

espezifikoki lotzen zena), κ (ketoziklazozinarekin) eta σ hartzailea (SKF-10,047arekin).

Gero, saguaren hodi deferentean eta burmuinean entzefalineei afinitate handiz lotzen zen

δ hartzailea isolatu zen (Lord eta lank., 1977; Chang eta Cuatrecasas, 1979).

Gaur egun σ hartzailea ez da hartzaile opioide bezela onartzen eta beste hirurentzat

proposaturiko barne ligandoak β-endorfina (µ), dinorfina (κ) eta entzefalinak (δ) dira.

Gainera, irizpide fisiologiko eta farmakologikoetan oinarrituz, hartzaile hauen azpimotak

ere deskribatu dira: µ1, µ2, κ1, κ2, κ3, δ1 eta δ2 (Dhawan eta lank., 1996). Lehenengo biei

Sarrera

Doktore-Tesia

4

dagokienez, µ1 hartzaileak morfina eta entzefalinak afinitate handiz ezagutzen ditu eta µ2-a

morfinarekiko selektiboa da (Nishimura eta lank., 1984; Pasternak, 1986).

90. hamarkadan saguan, arratoian eta gizakian δ, κ eta µ hartzaileak klonatzea lortu

da (Dhawan eta lank., 1996). Gainera ORL-1 izena daraman beste hartzaile opioide bat ere

klonatu da (Fukuda eta lank., 1994) eta baita bere barne ligandoak aurkitu ere; orfanina-FQ

(Meunier eta lank., 1995) edo nozizeptina (Reinscheid eta lank., 1995).

Farmakologiako nazioarteko batasunak (Unión internacional de farmacología) beste

terminologia bat proposatu du hartzaile opioideak bereizteko; OP1 (δ), OP2 (κ) eta OP3

(µ) izenak erabiliz hain zuzen (Dhawan eta lank., 1996).

1.3.2. Ezaugarri molekularrak:

Hartzaile (µ, δ eta κ) opioideak G proteinari akoplatutako eta mintz zelularran 7

alfa helize tartekatuta dituzten proteinen superfamilian kokatzen dira. Heuren artean

aminoazido sekuentzi homologia %61-ekoa da (Akil eta lank., 1998).

Agonista opioide batek sortutako hartzaile/G proteina sistemaren kitzikapena,

adenilil-ziklasarengain (AZ) eta Ca2+ eta K+ erreten mota batzuengain eraginez (efektore

sistema deituak), zelula barnera bidalitako seinale batean bihurtzen da (Harrison eta lank.,

1998).

Hartzaile opioideen eta G proteina hauen akoplamendua eta adenilil-ziklasarekiko

ekintza mekanismoak ulertzeko NG108-15 hazkuntza zelulak oso baliagarriak izan dira

ikertzaileentzako (Childers, 1991), zelula hauek hartzaile opioideetan oso aberatsak baitira,

δ hartzaileetan hain zuzen ere (Chang eta lank., 1978). Zelula hauetan opioideek AZ-aren

inhibizioa eta, honen ondorioz, AMP ziklikoaren mailak jaistea eragiten zuten (Sharma eta

lank., 1975). Hain zuzen ere sustantzia opioideak prostaglandina E1, adenosina eta toxina

kolerikoak sortutako AZ-ren estimulazioa inhibitzeko gai direla ikusi zen (Propst eta lank.,

1981). Lerro zelular hau pertusis toxinarekin inkubatuz gero, opioideek sortutako AZ-ren

Sarrera

Doktore-tesia

5

inhibizioa deuseztu egiten zen. Beraz, inhibizio hau hartzaile opioideen Gi edo G0

proteinekiko akoplamenduaren ondorioa da (Hsia eta lank., 1984). Urte batzuk beranduago

eragin berbera konprobatu zen arratoien burmuinean (Duman eta lank., 1988).

Beste alde batetik, µ, δ eta κ hartzaile opioideek Gi/G0 proteina hauekiko

elkarrekintzaren ondorioz Ca2+-ren zelula barnerako konduktantzia jaitsi eta K+-ren zelula

kanporako fluxua handitu dezakete (Grudt eta lank., 1993).

ORL-1 hartzailea ere Gi/G0 proteinekin lotzen da eta AZ eta Ca2+ edo K+

erretenengain eragiten du (Calo eta lank., 2000).

80. hamarkadan hartzaile opioideak G proteina inhibitzaileekin (Gi/G0) lotzen

direla argi gelditu bazen ere, hurrengo urteetan Gs proteina aktibatzaileekin lotu

daitezkeelaren susmoa handituz joan zen (Harrison eta lank., 1998). Adibidez, Crain eta

lankideek opiazeo kontzentrazio oso txikiak erabiliz (nM) atzeko adarreko gongoiletako

hazkuntza neuronetan eintza potentziala luzatu egiten zela ikusi zuten; ekintza kitzikatzaile

bat (1990). Talde berberak, F-11 zelula hibridoetan (hazkuntza neurona berberetan eta

neuroblastoma zelulekin sortuak), hartzaile opioideak bai Gi eta bai Gs proteinekin lotuta

zeudela ikusi zuen (Cruciani eta lank., 1993).

1.3.3. Hartzaile opioideen kokapena nerbio sisteman:

Hartzaile opioideen klonazioa aurrerapausu handia izan da hauen kokapena nerbio

sistema zentralean (NSZ) zehar hobeto ezagutzeko. Izan ere, biologia molekularrezko

teknikek, adibidez in situ hibridazioa eta inmunozitokimika, ordura arte hartzaileen

kokapena ezagutzeko gehien erabili den autorradiografiak baino bereizmen hobea

aurkezten dute. Gainera teknika hauen xehetasuna maila zelularreraino heltzen da, posible

bihurtuz hartzaileak neuronaren zein partetan kokatuta dauden jakitea (Harrison eta lank.,

1998).

µ-hartzaileen lotura-guneen eta mRNA-ren kokapenaren artean elkarrekikotasun

(korrespondentzia) handia dago (Mansour eta lank., 19941).

Sarrera

Doktore-Tesia

6

Arratoietan eginiko autorradiografi ikerketetan, hartzaile hauen dentsitate handiena

kaudatu-putamenean agertzen da. Halaber, kortexean, talamoan, accumbens nukleoan,

hipokanpoan, amigdalan, locus coeruleus-ean, orno-muineko atzeko adarrean, e.a ere ikus

daitezke. Kortexaren kasuan, µ-hartzaileen dentsitatea handia bada ere, mRNA-ren

espresioa txikia da eta gainera banaketa laminar ezberdina du (Delfs eta lank., 1994).

Ezberdintasun hau hipokanpoan, nukleo koklearrean, usaimen bulboan, e.a. ikusi izan da

eta baliteke hartzaile hauek amaiera presinaptikora garraiatzearen ondorioa izatea (Mansour

eta lank., 19942).

µ-hartzaileak nerbio sistema periferikoan ere deskribatu dira; adibidez, arratoiaren

heste-meheko neurona mienterikoetan (Hutchinson eta lank., 1975) eta hodi deferentean

(Lemaire eta lank., 1978).

Giza garunean, µ-hartzaileen dentsitate nagusienak talamoan, amigdalan, kortex

frontalean (lamina I eta IV) eta kaudatu-putamenean daude (Frost eta lank., 1985; Pilapil

eta lank., 1987). µ-hartzaileen mRNA estriatuan, talamoan, hipotalamoan, kortexean,

zerebeloan eta orno-muinean markatu da (Peckys eta Landwehrmeyer, 1999).

δ-hartzaileen eta µ-hartzaileen mRNA banaketa nahiko antzekoa den arren, badira

ezberdintasunak. Adibidez kortexean δ-mRNA mailak handiak diren bitartean, µ-mRNA

nahiko eskasa da (klase bietako hartzaileak ugariak izan arren). Talamoan eta hipotalamoan

berriz, δ-mRNA gutxi (baita δ-hartzaileak ere) eta µ-mRNA ugari agertzen da. Estriatuan

(kaudatu-putamen) eta accumbens nukleoan, mRNA eta hartzaile mota biak azaltzen diren

arren, δ-mRNA lausotuago banatzen da (Mansour eta lank., 19941-2).

Gizakiaren garunean, δ-hartzaileen dentsitate handia ikus daiteke kortexean (lamina

I-II) eta kaudatu-putamenean (Pilapil eta lank., 1987). δ-mRNA, kortexean, kaudatu-

putamenean, hipokanpoan eta amigdalan banatzen da (Simonin eta lank., 1994).

Sarrera

Doktore-tesia

7

Karraskarietan, κ-hartzaile opioidea eta bere mRNA hipotalamoan, talamoan,

amigdalan, klaustroan, atzeko hipofisian eta mesenzefaloko hainbat nukleotan agertzen dira

(Arvidsson eta lank., 1995).

Gizakian κ-hartzaile opioideak kortexean (V eta VI. laminetan), amigdalan eta

klaustroan ikus daitezke (Pilapil eta lank., 1987). κ-mRNAren banaketa µ-mRNA-ren

antzekoa da (Peckys eta Landwehrmeyer, 1999).

Elde eta lankideek hartzaile hauek neuronaren zein alderditan kokatuta dauden

ikertu ondoren zera ikusi zuten: Alderdi batetik, δ-hartzaileak batez ere axoietan kokatzen

zirela, beraz, seguraski gune presinaptikoan funtzionatzen dute gehienetan. Bestetik, µ eta

κ- hartzaileak dendritetan eta gorputz zelularrean kokatzen dira gehienbat, seguruenik

postsinaptikoki funtzionatuz (Elde eta lank., 1995).

1.3.4. Hartzaile opioideen aktibazioa. Ezaugarri molekularrak eta

efektu fisiologikoak.

Orokorrean, esan daiteke opiazeo bat bere hartzailearekin lotzen denean neuronan

sortutako eragin akutua hau dela: zelularen aktibitate bioelektrikoaren inhibizioa eta

neurotransmisorearen askatzearen inhibizioa edo gutxitzea.

Lehen aipatu bezela, hartzaile opioideak gehienbat G proteina inhibitzaileei (Gi/G0)

lotuta daude. Hartzaile/G proteina sistema honen kitzikapenak adenilil ziklasa eta ioi

erretenez osatuta dagoen efektore sistema bat martxan jartzen du, eta honek zelularengan

aipatutako efektua sortuko du.

Alde batetik, jakina da opiazeoen eraginez boltai menpekoak diren Ca2+ erretenen

inaktibazioa ematen dela (North, 1993), hazkuntza zelula lerro ezberdinetan ikusi den

bezala (Suprenant eta lank., 1990; Seward eta lank., 1991; Schroeder eta lank., 1991; Chieng

eta Bekkers, 1999). Gainera kaltzioak morfinaren efektu analgesikoa gutxitu edo agonista

opioideek burmuineko Ca2+ edukina murriztu dezaketela ere ikusi da. Horrez gain ioi

Sarrera

Doktore-Tesia

8

honen kelanteek (EGTA) edota Ca2+ erretenen antagonistak diren farmako batzuk

(nimodipino, e.a) morfinaren ekintza analgesikoa indartu dezaketela deskribatu da,

arratoietan (Bongianni eta lank., 1986) eta gizakian (Santillán eta lank., 1998). Erreten hauen

inaktibazioaren eta ioi honen zelula barnerako fluxua jaistearen ondorioz mintzaren

potentzialean aldaketak eta neurotransmisore askapenaren inhibizioa ematen da (Lorenzo

eta lank., 1999).

Beste aldetik, ezaguna da µ eta κ-hartzaileen aktibazioak NSZ-ko gune

ezberdinetan K+ konduktantzia handitzen duela (North eta lank., 1987; Wimpey eta

Chavkin, 1991; Grudt eta Williams, 1993). K+ erretenen zabalkuntzak eta ioiaren irteerak

mintzaren hiperpolarizazioa eta neuronaren inhibizio bioelektrikoa sortarazten du.

Azkenik, eta lehen azaldu bezela, opiazeoen akzio akutuaren ezaugarria den adenill

ziklasaren inhibizioa eta AMPz mailaren jaitsierak neurona barneko eta baita nukleoko

proteina askoren fosforilazio egoeran eragingo du. Ondorioz, transkripzio prozesu askoren

aldaketak gerta daitezke, epe batean opiazeoekiko tolerantzia edota abstinentzia sindrome

prozesuen errudun bihurtuz (Lorenzo eta lank., 1999).

Hartzaile opioideak aktibitate fisiologiko askoren modulazioarekin erlazionatu dira.

Orokorrean peptido opioideak edo morfina bezelako alkaloide opiazeoak NSZ edo NSP-an

ematean sortutako ekintza espektrua antzekoa da. Hala ere, eragin horien intentsitatea

ezberdina izango da eratorri opioide mota eta lotutako hartzailearen arabera.

Morfinak afinitate eta indar handiz aktibaturiko µ-hartzaileak oso ezaguna den

efektu analgesikoaren arduradunak dira. Antinozizepzio hau batez ere bai orno-muinean,

muingaineko eta SNP-an kokatutako µ-hartzaileen bitartez sortua da (Chaillet eta lank.,

1984; Stein, 1993). Arnas depresioa, opiazeoen sobredosiak sortutako heriotz-kausa

nagusia, µ eta δ-hartzaileen eraginez ematen da. Beheranzko aurkako akzio farmakologikoa

batez ere µ eta zertxobait δ-hartzaileen bitartez ematen da (Foz-Threlkel eta lank., 1994).

Menpekotasun eta tolerantzian hartzaile opioide mota guztiek dute erantzunkizuna (Civelli

eta lank., 1987). µ-hartzaileari dagokionez, µ1 azpimota opiazeoen akzio analgesikoaren

Sarrera

Doktore-tesia

9

arduraduna den bitartean, µ2-a opiazeoekiko menpekotasuna, abstinentzi sindromearen eta

arnas depresioaren arduraduna dela proposatu zuten Ling eta lankideek (1983; 1984; 1985).

Opioaren eratorriek (naturalek, sintetikoek eta barneko peptido opioideek) sor

ditzaketen efektuak eta parte hartzen duten hartzaileak 1. taulan deskribatzen dira. Gainera

tesiaren gaiarekin bat doalako morfina edo heroinak eragindako toxikapen akutuaren

sintomak 2.taulan aipatzen dira.

Opiazoen ekintzak eta hartzaileak Ekintza Hartzaileak

Minaren inhibizioa µ, δ, κ Arnas depresioa µ, δ Menpekotasun psikikoa µ > κ Menpekotasun fisikoa µ > κ; δ? Tolerantzia µ, δ, κ Euforia eta sedazioa µ Disforia κ Miosia µ, κ Gihar zurruntasuna µ Mugikortasun gastrointestinala µ, δ? Puxikaren mugikortasuna µ Diuresia Inhibizioa µ Aktibazioa κ Bradikardia µ > δ = κ Hipotentsioa δ = κ > µ Akzio endokrinologikoak Prolaktina askapena µ GH askapena δ > µ ACTH askapena µ, κ ADH inhibizioa κ LH inhibizioa µ, δ

1. Taula. Opiazeoen ekintzak eta hartzaileak. (Flórez, 1998).

Sarrera

Doktore-Tesia

10

Opiazeoek sortutako toxikapen akutua Sintoma neurologikoak

Logalea Konbultsioak Koma (dosi altuekin) Miosi simetrikoa Midriasia (anoxia egoeran)

Arnas sintomak Arnas depresioa eta hipoxia Birikietako edema akutua

Sintoma kardiobaskularrak Hipotentsioa Bradikardia Gutxiegitasun kardiakoa eta shock-a Heroinazaleetan substantzia aizuntzaileak eragindakoak Arritmiak (kinina) Gihar-uzkurdura larriak (estriknina)

2. Taula. Opiazeoek sortutako toxikapen akutua. (Lorenzo eta lank., 1999).

Bai terapeutikan eta jolas-kontsumoan erabilitako opiazeo gehienak hiru hartzaile

opioide motekin batu daitezkeen arren, batez ere µ-hartzaileen bitartez gauzatzen dira

eragin gehienak. Lehen aipatu den bezala, heroinak eta bere metabolito aktiboak (6-

monoazetil-morfina), gero morfinan hidrolizatzen dena, heuren egitura liposolugarriagoari

esker efektu analgesiko, euforia eta menpekotasun-sortzaile biziagoak eragiten dituzte. Bada

menpekotasuna sortzeko eragin bizi hau dela eta, heroina ez da terapeutikan erabiltzen eta

munduko farmakopea gehienetatik desagertu da. Bakarrik interes toxikologikoa aurkezten

du (Lorenzo eta lank., 1999).

Sarrera

Doktore-tesia

11

1.4. Barneko peptido opioideak:

1.4.1. Neuropeptidoak. Orokortasunak:

Orain 32 urte transmisio sinaptikoa neurotransmisore sistema klasiko bezela

ezagutzen diren molekula ez-peptidiko batzuen bitartez bakarrik ematen zela uste zen.

Adibidez azetil kolina, noradrenalina, serotonina, e.a.

70. hamarkadan zehar eginiko ikerketa askori esker peptidikoak ziren eta NSZ-ko

transmisore edo moduladore bezela jokatzen zuten sustantzien existentzia onartu zen.

Hauek neuropeptido izena hartu zuten eta hauek sintetizatu eta askatu zitzaketen neuronei

edo neurona taldeari neurona edo sistema peptidergikoa. Ornodunetan neurona peptidergikoak

hipotalamoan aurkitu ziren lehenengoz (Scharrer, 1978). Neurona talde honek bere

hormona peptidiko edukina neurohipofisian (basopresina, oxitozina) edo erdiko

eminentzian (TRH, LHRH eta somatostatina) askatzen zuen.

Orokorrean, neuropeptidoak, beste neurotransmisoreekin konparatuz, kokagune

espezifikoagoa dute, kontzentrazio askoz txikiagoekin aktuatzen dute, neuromodulatzaile

bezela joka dezakete eta sintesi-degradazio mekanismo ezberdinak dituzte.

Ezagutzen diren peptido guztiak (karnosina dipeptidoa eta glutation tripeptidoa

izan ezik) gorputz neuronaleko erribosometan (erretikulu endoplasmiko bikortsuan)

molekula aitzindari peptidiko handi edo pre-pro-proteina bezela sintetisatzen dira (Siegel eta

lank., 1993). Metalo-endopeptidasa batek hidrolizatu ondoren proproteina bezela garraiatzen

dira Golgi aparatura eta handik axoian zehar granulu batzuetan amaiera presinaptikoraino.

Bitartean, hidrolisi eta aldaketa berri batzuk jasaten dituzte metabolito peptidiko aktibo

bihurtu arte. Neurotransmisore klasikoekin deskribatu bezela (Douglas, 1973) neurona

peptidergikoa kitzikatzean, kaltzio-menpeko prozesua jartzen da martxan (Thorn eta lank.,

1978). Mintz presinaptikoaren despolarizazioak boltaiaren menpeko Ca2+-kanaleak zabaldu

eta ioi honen kontzentrazio zelularra igotzen da, neuropeptidoz beterik dauden bixikulak

exositozi bitartez gune sinaptikora askatuz.

Sarrera

Doktore-Tesia

12

Neuropeptidoen inaktibazioa batez ere degradazio metabolikoaren bitartez egiten

da, peptidasa izeneko entzimen bitartez hain zuzen, biologikoki aktiboak diren peptidoak

zatiki inaktibo bihurtuz (Iversen, 1987).

Peptido opioideak

Proopiomelanokortina (POMC)

β-Endorfina (1-31), (1-27)

N-azetil-β-endorfina (1-31, 1-

27)

Proentzefalina

Met-entzefalina

Leu-entzefalina

Metorfamida

Oktapeptidoa

Heptapeptidoa

Prodinorfina

α-Neoendorfina

β-Neoendorfina

Dinorfina A (1-8), (1-17)

Dinorfina B

Leumorfina (Dinorfina B, 1-29)

Hipofisiko peptidoak

ACTH (POMC-tik)

α-MSH (POMC-tik)

Hipotalamoko peptidoak

TRH

LHRH (Gn-RH)

Somatostatina

Kortikoliberina (CRH)

Basopresina (ADH)

Oxitozina

Neurofisina(k)

Peptido gastrointestinalak

P substantzia

Hesteko polipeptido basoaktiboa (VIP)

Kolezistokinina (CCK-8)

Gastrina

Neurotensina

Neuropeptido Y

Bombesina

Insulina

Glukagoia

Beste batzuk

Angiotensina II

Bradizinina

3. Taula. Nerbio sistema zentralean isolatutako neuropeptido nagusiak. (Florez, 1998)

Sarrera

Doktore-tesia

13

1.4.2. Barneko peptido opioideak (BPO). Deskribapen historikoa:

Lehen azaldu bezela, 1973an lehenengoz hartzaile opioideak aurkitu ondoren

barneko sustantzi opioideak egon behar zutenaren susmopean jarri zituen ikertzaileak. Izan

ere, urte bat lehenago, Akil eta lankideek (1972,1976) garuneko gune batzuetan elektrikoki

kitzikatuz lorturiko analgesia naloxonaren bitartez lehengoratu zitekeela ikusi zuten.

Terenius eta Whalström (1974) eta Kosterlitz eta Waterfield-ek (1975) ere garun-estraktuez

osatutako prestakin batzuk opiazeoen antzeko aktibitatea zutela egiaztatu zuten. 1975an

Hughes eta lankideek txerriaren burmuinean opiazeoek bezela jokatzen zuten neuropeptido

bi isolatu zituzten, entzefalina izenaz bataiatuak: Metionina entzefalina (met-entzefalina) eta

leuzina entzefalina (leu-entzefalina).

Hurrengo urteetan endorfinak (Li eta lank., 1976) eta dinorfinak (Goldstein eta

lank.,1979;1981) aurkitu ziren.

Barne peptido hauen arteko erlazio molekularra beren prekurtsore molekularrak

klonatu zirenean argitu zen. Lehenengoz karakterizatu zena, proopiomelanokortina (POMC), β-

endorfina eta ACTH aren prekurtsorea, izan zen (Nakanishi eta lank., 1979). Gero

entzefalinen prekurtsorea, proentzefalina, eta dinorfinena (prodinorfina) klonatu ziren (Comb

eta lank., 1982; Kakidani eta lank., 1982).

Beraz, hamar urte barruan opiazeo-antzeko barne sistema bat egon zitekeela

susmatzetik hartzaile opioideak, beren barneko ligandoak eta hauen prekurtsoreak direnen

hiru geneak identifikatzera pasatu zen.

1997an, endomorfina bezala ezagutzen diren peptido berri bi aurkitu ziren (Zadina eta

lank., 1997).

Sarrera

Doktore-Tesia

14

1.4.3. BPOen klasifikazioa, ezaugarri molekularrak, eta kokapena:

Gaur egun 20 peptido opioide ezagutzen dira. Guztien ezaugarria amino-muturretik

karboxi-muturrera errepikatutako aminoazido sekuentzia da:

Tyr-Gly-Gly-Phe-Met

edo

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (met/leu entzefalinen egitura)

Era honetara, BPO-en familia 5-tik 32 aminoazidorainoko (β-endorfina) luzera

izan dezaketen peptidoz osatzen da, guztiek dutelarik gutxienez met edo leu-entzefalina

sekuentzi bat heuren barnean.

Peptido hauek lehen aipatutako hiru prekurtsoreen apurketaren ondorioz

sintetisatzen dira, opioide aktibitatezko molekula bihurtuz.

Met-entzefalina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met

Leu-entzefalina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

β-endorfina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Gly-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-

Thr-Leu--Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu

Dinorfina A (1-17): Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-

-Asn-Gln

Dinorfina B(1-13): Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Gln-Phe-Lys-Val-Val-Thr

α-Neoendorfina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys

Nozizeptina: Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-

Asn-Gln

Endomorfinak: Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2

4. Taula. Ugaztunen neuropeptido naturalak. (Florez, 1998)

Sarrera

Doktore-tesia

15

Proentzefalina (PE) NSZ-ean eta muin adrenalean sintetisatzen da. Tripsina,

endopeptidasa eta N-karboxipeptidasa motatako entzimen eraginez 243 aminoazidotako

proteina honetatik 7 peptido opioide ezberdin sor daitezke. Garrantzitsuenak entzefalinak

(met edo leu entzefalina) dira. Burmuinean isolatutako entzefalina konbertasa izeneko

karboxipeptidasa bat da pentapeptido hauen sintesiaren arduraduna (Hughes, 1983). PE-ak

met-E-ren lau kopia ditu (Akil eta lank., 1998).

Entzefalinez gain heptadekapeptido (Met-E-Arg6-Phe7) bat eta oktapeptido bat

(Met-E-Arg6-Gly7-Leu8) azpimarratu behar dira.

PE eta honen eratorriak NSZ-ko gune askotako neuronek sintetisatzen dituzte.

Gehienak estriatuan, garun kortexean, usainmen tuberkuluan, hipokanpoan, septumean,

talamoan, sustantzia periakueduktal grisean (PAG) eta orno-muineko atzeko adarrean

kokatzen dira. Entzefalinak baita SNPko zuntzetan (neurona aferenteak gehienbat) ere ikus

daitezke (Roques, 1999).

Prodinorfinak (PD) dinorfina A (1-8) (1-17), B (1-13), β-neo-endorfina, e.a. peptido

gordetzen ditu. Proteina hau PE bezain hedatua dago NSZ-ean zehar (Roques, 1999).

Proopiomelanokortina (POMC) opioide aitzindarien artean barne opioideak ez diren

peptidoak gordetzen dituen bakarra da. Izan ere, β-endorfina peptido opioideaz gain,

hormona adenokortikotropoa (ACTH), α eta β-lipotropina (LPH), α eta β-melanotropina

(MSH), e.a. peptidoren prekurtsorea da. Kasu honetan ere molekula hauek sintetisatzen

dituen entzima ezagutzen da, POMC entzima bihurtzailea hain zuzen (Turner eta lank.,

1987). Batez ere neurona hipotalamikoek sintetisatzen duten arren, NSZ-eko hainbat

gunetara proiektatzen dituzte bere axoiak, adibidez nozizepzioarekin erlazionatutako gune

batzuetara (talamoa, formazio erretikularra eta PAG). Aurreko hipofisian ere (oinarrizko

guruin hormonala) POMC kantitate haundiak daudela azpimarratu behar da.

Entzefalinak, dinorfinak eta endorfinak nahiko espezifizitate baxuz lotzen zaizkie

hiru hartzaile opioideei. Entzefalinak δ-hartzailearen lotugai naturalak bezela ezagutzen

dira, baina µ-hartzaileei ere lotzen zaizkie. Dinorfinak κ-hartzaileari lotzen zaizkio eta β-

Sarrera

Doktore-Tesia

16

endorfinak µ-hartzailea eta baita δ-hartzailea ia afinitate berez ezagutu ditzake (Roques,

1999).

Gaur egun, bost aminoazidoko egitura amankomun gabeko eta opioide aktibitatea

duten peptido berriak ere ezagutzen dira.

Nozizeptina edo orfanina FQ (OFQ), ORL-1 hartzaile opioidearen lotugai naturala,

17 aminoazidoz osatutako peptidoa da. Bere amino muturreko lehen eta bostgarren

aminoazidoak tirosina eta leu/met izan beharrean, fenilalanina eta threonina dira (Phe-Gly-

Gly-Phe-Thr) (Meunier eta lank., 1995; Reinscheid eta lank., 1995). OFQ-aren prekurtsorea

pronozizeptina edo proorfanina FQ da. Gizakien eta karraskarien NSZ estraktuetan

(Reinscheid eta lank., 2000) eta baita gaizkatan ere klonatu izan da. Arrain espezie honetan

klonatu izanak opioide klase honen eta besteen arteko erlazio ebolutiboa ulertzeko

aurrerapausu bat izan liteke (Danielson eta lank., 2001).

Prekurtsore honen mRNA maila altuak sistema linbikoan deskribatu dira,

nozizeptinak duen estres-aurkako aktibitatea azpimarratuz; gero knock-out arratoietan ikusi

den bezela (Reinscheid eta lank., 2000).

Pronozizeptinak OFQ-z gain peptido biologikoki aktibo bi gorde ditzake. OFQ2-a

adibidez ahalmen analgesiko handia duela deskribatu da (Amodeo eta lank., 2000).

OFQ edo nozizeptina, azkenengo urteetan ikertzaile ezberdinek deskribatutako

opioideen aurkako familia barnean kokatzen dute (Harrison eta lank., 1998).

Endomorfina 1 eta 2 (EM 1 edo 2) µ-hartzaileari afinitate handiz lotzen zaizkion

arren, tetrapeptido hauen aminoazido sekuentziak Tyr-Pro-Trp-Phe edo Tyr-Pro-Phe-Phe

dira (Zadina eta lank., 1997). EM-1 NSZ gune askotan kokatzen da eta EM-2 orno-

muineko atzeko adarrean agertzen da gehienbat. Biak deskribatu izan dira µ-hartzaile

dentsitate handiko guneetan eta NSZ-ren funtzio askotan partaide direla ikusi da (Zadina

eta lank., 1999). Oraindik ez da bere aitzindaria klonatu.

Sarrera

Doktore-tesia

17

Lehen azaldu den bezela, bai barne peptido opioideak eta beste neuropeptido

motak peptidasa batzuen bitartez inaktibatzen dira. Hurrengo atalean, entzima hauen

deskribapen sakona egingo da tesiaren gaiarekin bat doalako.

Sarrera

Doktore-Tesia

18

2. Neuropeptidoen anderakuntza.

2.1. Entzima proteolitikoak:

Sistema biologikoetan ematen diren ia erreakzio guztiak entzimak deritzen

makromolekula espezifiko batzuen bitartez katalizatzen dira. Entzimen ezaugarririk

garrantzitsuenak bere ahalmen katalitikoa (gizakiak sorturiko katalizatzaileak baino askoz

boteretsuagoa) eta espezifizitatea dira.

Entzima proteolitikoak, lotura peptidikoen apurketa hidrolitikoaren katalizatzen

dutenak dira. Hauek sailkatzerakoan bi talde bereiz daitezke:

Proteinasak, bere ekintza proteinen gain egiten duten entzimak dira (ehun baino

aminoazido gehiagoz osatutako egituren gain). Hauek exoproteinasak edo endoproteinasak

(ugarienak) izango dira proteina katearen kanpokaldean edo erdian egiten badute bere

ekintza katalitikoa. Zelula kanpoan (tripsina, errenina, e.a.) edo barnean (katepsinak,

kalpaina,…) kokatuta egon daitezke.

Peptidasak, peptidoen (ehun unitate baino gutxiagoko katea) apurketa

hidrolitikoaren katalizatzaileak dira eta hauek ere exo eta endopeptidasetan sailkatzen dira.

Exopeptidasen barruan aminopeptidasak eta karboxipeptidasak aurkitzen dira. Lehenengoek

amino muturrean (karga positiboduna) eta besteek karboxilo muturrean (karga

negatiboduna) egiten dituzte bere ekintzak. Endopeptidasek peptido erdian ekiten dute,

adibidez; angiotensina eraldatzen duen entzima (AEE), kalpainak eta endopeptidasa

neutroa 24.11.

Entzima proteolitikoak neuropeptido ezberdinen sintesi eta anderakuntzarako

proposatuak izan dira. Sintesiari dagokionez, BPO-en deskribapena egiterakoan azaldu den

bezela, prekurtsore proteiko baten apurketaren ondorioz peptido aktiboak sortzen dira.

Sarrera

Doktore-tesia

19

Peptido aktibo hauen inaktibazioa berriz, peptidasen ekintzaren ondorioz ematen da, zati

inaktibo txikiagoak edo aminoazidoak askatuz (endo edo exopeptidasak diren arauera).

2.2. Peptidasak. Deskribapen orokorra.

70. hamarkadaren bukaeran, Ondetti eta lankideek AEE-ren inhibizioak

hipertentsio-kontrako efektua eragiten zuela ikusi zutenean (Ondetti eta lank., 1977)

peptidasekiko interesa asko suspertu zen. Hiru urte beranduago zink metalopeptidasa

konkretu baten inhibizioak analgesia sor zezakeela ikusi zuten. Entzima hori endopeptidasa

24.11 edo entzefalinasa izenaz bataiatu zuten (Roques eta lag., 1980).

Peptidoen anderatzaileak diren entzimei buruzko ikerketak aurrera joan ahala,

biomolekula hauek (baita beren sustratuak ere) gorputz osoan oso hedatuak daudela argi

gelditu zen. Gainera kontzeptu hau, “peptidasa bat, sustratu bat”, alde batera utzi zen

(Schwartz, 1983; Kenny, 1986). Gaur egun onartuta dago nerbio ehunetan zein besteetan

peptidoak sustratuarekiko espezifizitate nahiko zabala duten entzima kopuru mugatu batek

hidrolizatzen dituela.

Peptidasa hauen artean batzuk mintz zelularrean integratzen dira, bere gune aktiboa

alde extrazelularrean kokatuta dute (ektoentzimak), eta talde prostetikoan zinka daukaten

metaloproteinak dira (Turner eta lank., 1987; Maroux, 1987). Hala ere, badaude

zitosolikoak diren peptidasak (Wagner eta lank., 1981; Hersh, 1982) eta baita gune aktiboa

zelula barnera begira duten peptidasa integralak ere (Dyer eta lank., 1991).

Nerbio ehunetan ia ez da ezagutzen peptido neuroaktiboak birkaptatzeko

mekanismo espezifikorik. Amina biogenikoak edo neurotransmisore aminoazidoak bai

birkaptazioz eta bai anderakuntza azkar baten bitartez inaktibatzen diren bitartean,

neuropeptidoak batez ere peptidasen bitartez anderatzen direla esan daiteke (Iversen, 1987).

80. hamarkadan eginiko ikerketa askotan bai neuronen eta bai zelula glialen mintzetan

peptidasa ugari aurkitu dira, neuropeptidoen inaktibazioaren arduradun nagusiak direla

proposatuz (Turner eta lag., 1985; McKelvy eta Blumberg, 1986; Lynch eta Snyder, 1986;

Turner, 1986).

Sarrera

Doktore-Tesia

20

Aminopeptidasak peptido ezberdinen N-muturreko aminoazidoen lotura

peptidikoa hidrolisatzen dute. Egitura kimikoa argi egon ez arren gehienak talde prostetiko

bezala Zn2+-a daramaten metaloproteinak (Vallee eta Galdes, 1984) edo tiol proteinak

(O’Cuinn eta lank., 1990) direla dakigu. Peptidasa hauen tamaina oso aldakorra da, 25-300

kDa tartekoa (Taylor, 1993).

Orain arte eginiko ikerketa ezberdinek neuropeptido bakoitzarekiko espezifikoak

diren peptidasarik ez dagoela diote. Dirudienez, probableagoa da espektru zabaleko

peptidasa gutxi batzuk neuropeptido askoren anderakuntzaren arduradunak izatea. Hala

ere, oraindik beharrezkoak dira ikerketa gehiago ikuspuntu hau ziurtatzeko.

Sustratuekiko espezifizitate gutxi dutenez eta orokorrean ikertutako izaki bizidun

eta ehun mota gehienetan aminopeptidasa aktibitatea ikus daitekenez entzima hauen

sailkapen zehatza egitea ez da erraza (Taylor, 1993).

Gaur egun peptidasen sailkapena egiteko Enzyme Commission (EC) delakoaren

irizpideak dira onartuenak. Jarraian azaldutako taulan tesi honetarako aztertu diren

peptidasa ezberdinen EC sailkapena azaltzen da:

Sarrera

Doktore-tesia

21

5. Taula. (S) zatiki solugarria, (M) mintzari lotutakoa.

Peptidasak Izen murriztua EC sailkapena

Alanil Aminopeptidasa (S) PSA 3.4.11.14

Alanil aminopeptidasa (M) AP MII (baita PSA ere) 3.4.11.14

Alanil aminopeptidasa N APN edo APM 3.4.11.2

Arginil aminopeptidasa APB 3.4.11.6

Leuzil aminopeptidasa LAP 3.4.11.1

Aspartil aminopeptidasa (S) APA 3.4.11.21

Aspartil aminopeptidasa (M) APA 3.4.11.21

Prolil endopeptidasa (S) PEP 3.4.21.26

Prolil endopeptidasa (S) PEP 3.4.21.26

Piroglutamil peptidasa I (S) PG I 3.4.19.3

Piroglutamil peptidasa I (M) PG I 3.4.19.3

Sarrera

Doktore-Tesia

22

2.2.1 Entzefalinen anderakuntza. Aminopeptidasak eta

endopeptidasa neutroa 24.11:

Entzefalinen anderakuntzan parte hartzen duten entzimak aminopeptidasak,

endopeptidasa neutroa 24.11, karboxipeptidasak, katepsina C eta angiotentsina eraldatzen

duen entzima (AEE) dira, n. irudian ikus daitekeen bezala.

Katepsina C AEE Karboxipeptidasak

Tyr – Gly – Gly – Phe – met / Leu Aminopeptidasak Endopeptidasa neutroa 24.11 1. Irudia. Entzefalinen entzima anderatzaileak.

Hala ere azkeneko 30 urteetan egindako lan askok NSZ-ko entzefalinen

anderakuntzaren arduradun nagusiak aminopeptidasak eta endopeptidasa neutroa 24.11

(entzefalinasa) direla azpimarratzen dute.

70. hamarkadan eginiko lan batzuk entzefalinen erdibizitza nahiko laburra zela bai

“in vivo” zein “in vitro” egoeran adierazi zuten, animaliei pentapeptido hauen dosi

altuekin tratatu eta analgesia ahula eta laburra azaltzen zela ikusi ondoren (Belluzi eta lank.,

1976 ). Gainera tyr–gly edo gly–phe lotura peptidikoak hidrolisiarengandik babestuta zuten

entzefalina sintetikoak eman ondoren analogo hauen botere analgesikoa handiagoa zela

frogatu zen (Pert eta lank., 1976; Fournié-Zaluski eta lank., 1979). Beraz zelulen mintzan

peptidasa aktibitatea zuten ektoentzimak egon behar zirenaren susmoa egiaztatzen hasi zen.

Honela, arratoiaren NSZ-ko estriatuko mintzetan tyr–gly–gly tripeptidoa askatzen zuen

entzima aurkitu zen (Malfroy eta lank, 1978). Entzefalinasa izena hartutako entzima honen

ekintza fisiologikoa frogatuta gelditu zen bere lehenengo inhibitzaile sintetikoa (tiorfana)

Sarrera

Doktore-tesia

23

erabili zenan, honek naloxonarekin itzulgarria zen propietate nozizeptiboa baitzuen

(Roques eta lank., 1980). 1983-an Zn2+-metalopeptidasa hau endopeptidasa neutroa 24.11

bezala deskribatu zen (NEP edo EC 3.4.24.11) (Relton eta lank., 1983).

Bestalde, entzefalinen tyr–gly lotura peptidikoaren apurketa fisiologikoaren

arduraduna aminopeptidasa N zela frogatu zen bere inhibitzailea den kelatorfanak

sortutako analgesiaren ondorioz (Waksman eta lank., 1985). Era berean, Hui eta lankideek

(1983) puromizina antibiotikoarekiko sentikorra zen beste aminopeptidasa bat (puromycin-

sensitive aminopeptidase edo PSA) deskribatu zuten, zeinek entzefalinak hidrolisatu eta tirosina

aminoazidoa askatzen zuen.

Gaur egun aminopeptidasa N eta entzefalinasaren inhibitzaile sintetiko berriak (RB

101) eta kelatorfana bera, animalietan lortutako nozizepzioaren aurkako efektuak direla eta,

etorkizunean opiazeoen alternatiba edo laguntzaile moduan erabil zitezkeen analgesiko

berri bezala proposatu dira (Ortega-Alvaro eta lank., 1998; Noble eta lank., 1999). Izan ere,

inhibitzaile hauen eragin analgesikoa arnas-depresio arrisku gabeko efektua dela frogatu da,

opiazeoekin gertatzen ez den bezala (Boudinot eta lank., 2001).

Tesi honetan entzefalinak anderatzen dituzten aminopeptidasen deskribapen zabala

egin denez, hauen adierazpen berezia egingo dugu:

2.2.1.1. Puromizinarekiko sentikorra den alanina aminopeptidasa (PSA edo

EC 3.4.11.14):

Puromizina hazkuntza bakterianoetan isolaturiko antibiotikoa da (Porter eta lank.,

1952). Espektru antibakteriano zabaleko molekula hau entzefalinen anderakuntzaren

inhibitzailea zela ikusi zen orain dela 20 urte, nahiz eta lortutako eragina beste inhibitzaile

batzuena (bestatina adibidez) baino askoz eskasagoa izan (Chaillet, 1983). Urte gutxi

beranduago definituta gelditu ziren garun mintzetan entzefalinak anderatzen dituzten

aminopeptidasa mota bi. Bata, puromizinarekiko sentikorra zena (PSA) (Hui eta lank.,

1983; Hersh eta lank., 1985), eta bestea, ez zena antibiotiko honekin inhibitzen (alanina

minopeptidasa N edo M, APN) (Gros eta lank., 1985; Matsas eta lank., 1985). Hori dela eta

Sarrera

Doktore-Tesia

24

bestatinak, entzima bien inhibitzailea, puromizinak baino nozizepzio aurkako aktibitate

hobea aurkezten zuen.

Entzefalinak anderatzen dituen PSA-k isoforma bi ditu; hau da, egitura berbera

aurkezten duten entzima solugarri bat (alanil aminopeptidasa solugarria) eta mintzari

lotutako beste bat (alanil aminopeptidasa MII edo AP MII). Azken hau ez da mintzan

kokatutako proteina integral bat ez baitu aurkezten mintzari lotzeko domeinu berezirik,

proteina anfitropikoen taldean sartu dutelarik ikertzaile batzuk. Dirudienez, AP MII-ak

mintzean kokatzeko beste proteina integral batzuekin elkarrekiten du (Dyer eta lank., 1990).

PSA garunean azaltzen den aminopeptidasa ugariena da, APN-a baino 50-100 bider

ugariagoa (Hersh eta lank., 1987); aktibitatearen %80-a entzima solugarriari eta %20-a

mintzari lotutakoari dagozkielarik (McLellan eta lank., 1988). Orain dela 6 urte Tobler eta

lankideek (1997) giza PSA klonatu eta neuronetan (ezta glian, ezta garun basoetako

endotelioan) azaltzen zela agertu zuten. Izan ere, AP MII-a garunean espezifikoki agertzen

dela deskribatu den bitartean, forma solugarria oso hedatua dago ehun ezberdinetan,

(bihotza, gihar eskeletikoa, giltzurruna, gibela, e.a.) (McLellan eta lank., 1988).

PSA-k eta APN-ak oligopeptido eta proteina askoren N-muturreko alanina,

tirosina, fenilalanina eta metionina aminoazidoak hidrolisatzen dituzte. Fisiologikoki,

entzefalinez gain, beste oligopeptido batzuen anderakuntzan parte hartzen dutela

deskribatu da (Taylor A, 1993). Adibidez, barne peptido opioideen artean prodinorfinaren

eratorriak diren dinorfina antzeko peptidoak hidrolisatzen dituzte; beti, 13 aminoazido

baino gutxiago dituzten peptidoak direnean. Izan ere, 1989-an Gibson eta lankideak

(beranduago Safavi eta lankideak (1995)), dinorfina A (1-17) -k Leu-entzefalinaren hidrolisia

inhibitzen zuela ikustean, tamaina honetako peptidoak eta handiagoak zitosoleko alanina

aminopeptidasa aktibitatearen erregulatzaileak izan zitezkeela proposatu zuten. Beharbada

ordura arte animali ereduekin egindako garunbideko BPO tratamenduen efektuak zuzenak

eta ez-zuzenak izan litezke. Hau da, efektu ez-zuzena BPO-en anderatzaileak diren

aminopeptidasen inhibizioaren ondorioz gerta liteke.

Azkeneko emaitza hauek aminopeptidasa solugarrien papera nora arte heltzen

denaren eztabaidaren parte dira. Egia esan, gune sinaptikora askatutako BPO-en

Sarrera

Doktore-tesia

25

anderakuntzan gune aktiboa bertarantz zuzendurik duten mintzari lotutako peptidasek

parte hartzen dutela esaten da (Turner AJ, 1986; Tobler AR, 1997). Hala ere, posible

litzateke entzima solugarriek neuropeptidoen anderakuntzan parte hartzea hauek bere

hartzailearekin konplexu bat bezela zelulan barneratu ondoren edo baita entzima bera gune

sinaptikora askatu ondoren (Gibson eta lank., 1989).

PSA-ri dagokionez, Yamamoto eta lankideek (2002) orain duela gutxi entzima hau

nerbio bukaerara garraiatu eta bertan edo gune sinaptikoan bere aktibitatea ematen dela

ziurtatu dute. Baina oraindik ez dago batere argi hain aktiboa den AAP solugarriaren

funtzio fisiologikoa mintzari lotutakoaren berbera edo beste bat denentz.

2.2.1.2 Alanina aminopeptidasa N edo M (puromizinarekiko ez-sentikorra)

(APN edo EC 3.4.11.2):

Entzima hau 1985-an arratoi garun mintzetan isolatu eta entzefalinak anderatzen

dituen entzima dela frogatu zenetik (Gros eta lank., 1985; Waksman eta lank., 1985)

gorputzeko beste organo edo ehunetan ere deskribatu da (giltzurruna, gibela, hesteak, e.a)

(Hersh eta lank., 1987). Azkeneko urteetan, linfozitoen CD13 markatzailea dela ikusi

ondoren, inmunitatearekin erlazionaturiko ikerketa asko egiten ari dira entzima honi buruz

(Shimizu eta lank., 2002).

APN-aren inhibitzaile naturalei dagokionez, PSA eta dinorfina “luzeekin” gertatzen

den bezala, P substantziak eta bradikininak entzima hori inhibitzen duela deskribatu da (Xu

eta lank., 1995).

Giros-en taldeak (1985) APN-ak entzefalinen anderakuntzan PSA-k baino eragin

gehiago duela proposatu zuen eta, ideia honi jarraituz, gaur egun prestatzen ari diren

katabolismo honen inhibitzaile berriak APN-a eta entzefalinasaren inhibitzaileak dira

(Roques BP, 1999). Hala ere, NSZ-an APN-ak bere ekintza nola eta non egiten duen ez

dago argiegi. Egia esan, duela gutxi arte entzima honek bere ekintzaren zati handiena

garuneko endotelio baskularrean egiten duela uste izan da (Solhonne eta lank., 1987). Baina

entzima honen inhibitzaile markatuak erabiliz, APN-a NSZ-ko gune ezberdinetan azaltzen

dela ikusi da (Noble eta lank., 2001).

Sarrera

Doktore-Tesia

26

Beste peptido ezagunen artean APN-ak angiotensina III-a inaktibatu dezakeela ikusi

da (Reaux eta lank., 1999).

Beraz, tesi honen helburuetariko baterantz bideratuz, barne peptidoen

anderakuntzan benetako eragina duten aminopeptidasa bi ezagutzen dira:

Puromizinarekiko Sentikorra den Aminopeptidasa (PSA): Isoforma bi

ditu: Alanina aminopeptidasa solugarria eta AP MII (EC 3.4.11.14).

Alanina aminopeptidasa N: puromizinarekiko ez-sentikorra. (APN, APM

edo EC 3.4.11.2).

2.2.2 Beste neuropeptido ezberdinen anderakuntzan eragiten

duten peptidasak:

2.2.2.1. Prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26):

Prolina biologikoki aktiboak diren peptido askoren aminoazido sekuentzian

kokatzen da, hauen egitura molekularrean eta peptidasa ezberdinekiko erresistentzian

garrantzitsua delarik (Turner AJ, 1986). Lehenengoz 1971an deskribatutako prolil

endopeptidasak (PEP), askorentzako prolil oligopeptidasa, peptido hauek prolina

aminoazidoaren karboxil muturretik hidrolisatzen ditu (Walter eta lank., 1971).

Entzima hau gizaki edo arratoiaren garunaz gain (Kato eta lank., 1980; Wilk S,

1983; Kalwant eta lank., 1991) beste ehun eta organu ezberdinetan maila altuetan

deskribatu da (giltzurruna, testikuluak, gihar eskeletikoa, linfozitoak, fibroblastoak, e.a.)

(Kato eta lank., 1980; Goossens eta lank., 1996).

Hasiera baten bakarrik zitosolean aurkitzen den entzima dela pentsatu izan bada ere

(Dresdner eta lank., 1982) gaur egun mintzari lotutako isoforma bat dagoela dakigu,

Sarrera

Doktore-tesia

27

neuronen kasuan sinaptosoma mailan aurkitu daitekeena hain zuzen (O’Leary eta lank.,

1995 eta 1996).

Ekintza fisiologikoei dagokionez in vitro esperimentuetan P substantzia,

neurotensina, basopresina, angiotensina I eta II, TRH-a, bradikinina e.a peptido anderatu

ditzakeela ikusi da (Welches eta lank., 1993). Ekintza kataboliko honez gain, β-endorfinen

prekurtsorearen prozesamenduan eragiten duela aipatu izan da (Wilk, 1983).

Azkeneko hamarkadan prolil endopeptidasari buruzko ikerketa ugari argitaratu dira,

gaixotasun ezberdinen fisiopatologiarekin erlazionatuta baitago. NSZ-ren kasuan,

Alzheimer, Parkinsona, Huntington, e.a. endekapenezko gaixotasun neurologikoetan

entzima honen aktibitate aldaketak ikusi dira (Mantle eta lank., 1996). Izan ere, entzima

honek oroimenarekin zerikusia duela eta, gaur egun PEP-ren inhibitzaileekin azterketa

preklinikoak egiten hasi dira karraskari, tximino eta gizakian (Schneider eta lank., 2002;

Morain eta lank., 2002) emaitza onak agertu direlarik.

Maila periferikoan entzima hau espermatozoideen mugikortasunarekin (Kimura eta

lank., 2002), glomerulonefritisarekin (Naghetinni eta lank., 2001), sprue edo gaixotasun

zeliakoarekin (Shan eta lank., 2002), e.a erlazionatu da.

Ikus daitekeenez PEP-ren ikerketan hainbat lerro ezberdin zabaldu dira eta, NSZ-ri

dagokionez, entzima honen benetako funtzioa (maila zelular edo azpizelularrean) zein den

ezagutzeko esperimentu asko behar izango direla argi dago.

2.2.2.2. Piroglutamil peptidasa I (EC 3.4.19.3):

Badira neuropeptido asko bere amino muturrean piroglutamiko aminoazidoa

dutenak; adibidez hipotalamoko hormona jariaerazle (liberina) asko: TRH-a, LHRH-a,

Bombesina, Neurotensina, e.a. N-muturreko aminoazido ziklatu honi esker peptido hauen

erdibizitza tamaina berbereko beste peptidoena baino handiagoa da, peptidasa gehienak

mutur honen hidrolisia egiteko gai ez direlako (Gandarias eta lank., 2000). Hala ere, badira

lotura peptidiko hori anderatzen duten entzima bi:

Sarrera

Doktore-Tesia

28

Piroglutamil peptidasa I-ek, espektru zabaleko aminopeptidasa, piroglutamiko

hondarra duten peptido gehienak anderatu ditzake (Browne eta lank., 1983). Entzima hau,

gizakiaren eta arratoiaren garun kortexean eta beste organo batzuetan isolatu da; baita

ugaztunak ez diren beste animalietan eta bakterioetan ere (Cummins eta lank., 1998). Oso

hurbileko ikerlan batean gizakiaren PG I klonatu da (Dando eta lank., 2003).

Autore gehienak soilik zitosolean aurki daitekeela dioten bitartean (Cummins eta

lank., 1998) badira mintzean entzima hau neurtu izan dutenak eta, beraz, isoforma biko

entzima dela (Alba eta lank., 1995).

Bere paper fisiologikoa neuropeptidoen metabolismoan ez dago oso argi, entzima

solugarri gehienekin gertatzen den bezala. Posible da minduta edo zahartuta dauden

bixikuletatik zelula barnera askatutako edo gehiegi ekoiztutako neuropeptidoen

katabolismoan parte hartzea (O’Cuinn eta lank., 1990; Bauer K, 1987) edota beste entzima

batzuekin ikusi den bezala hauek gune extrazelularrera askatzea eta bertan egitea beren

funtzioa (Vincent eta lank., 1996; Cummins eta lank., 1998).

Gure tesian entzima honen deskribapena egitea aukeratu genuenez beste

piroglutamil peptidasaren aipamena baino ez dugu eginen.

Piroglutamil peptidasa II-a, mintzari lotutako entzima, TRH hormonarekiko edo

antzeko tripeptidoekiko espezifikoa dela onartu da (O’Connor eta lank., 1985). Arratoi

garunean aspalditik isolatua izan den bitartean, lehenengoz 1999an klonatu eta deskribatu

da gizakian (Schomburg eta lank., 1999). Dirudienez, sueroan isolatutako isoforma seriko

bat ere badu (serum tiroliberinasa) eta forma biek dute jatorri genetiko berbera (Cumming eta

lank., 1998; Schmitmeier eta lank., 2002).

2.2.2.3. Aspartil aminopeptidasa (EC 3.4.11.21):

Kelly eta lankideek orain 1983an saguaren garun homogenatuen zitosolean N-

muturrean aminoazido azidoak dituzten peptidoak hidrolisatzeko gai zen entzima purifikatu

zuten. 445 kD inguruko entzima honek glutamikoarekiko baino aspartikoarekiko afinitate

gehiago zuenez aspartil aminopeptidasa (APA) izena hartu zuen (Kelly eta lank., 1983). Duela

Sarrera

Doktore-tesia

29

5 urte metalopeptidasa honen DNA sekuentzia ezagutu eta berriro purifikatu zen untxiaren

garun zitosolean, entzima berbera zela ikusiz. Gaur egun bere gune aktiboak ere ezagutzen

dira (Wilk eta lank., 1998 eta 2002). Banaketari dagokionez, gorputzeko ehun ezberdinetan

hedatzen dela diote autore guztiek. Maila zelularrean berriz, entzima zitosoliko bezala

deskribatu izan bada ere mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa aktibitatea ere aurkitu da

(Ramírez-Exposito eta lank., 2000).

Badago aminoazido hondar berdinak anderatzen dituen beste peptidasa bat, glutamil

aminopeptidasa (EC 3.4.11.7) hain zuzen. Entzima hau beste metalopeptidasa bat da eta

organo edo ehun ezberdinetako (heste meharra, giltzurruna, garuna, endotelioa, timoa, e.a.)

zelulen mintzan kokatzen dela dakigu (Mentzel eta lank., 1996).

Gaur egun, autore batzuk aminopeptidasa A aktibitateari buruz hitzegitean; alegia,

aminoazido azidoak anderatzen dituen aktibitatea aipatzean, entzima bi hauei buruz

hitzegiten dute (Mayas eta lank., 2002). Izan ere, entzima biek dute aktibitate fisiologiko

antzekoa, anderatutako peptidoen artean angiotensina II-a delarik aipagarriena. Peptido

honen hidrolisiaren ondorioz angiotensina III sortzen da, dirudienez garun mailan tentsio

arterialaren igoerarekin zerikusi handia duena. Gainera, azkeneko urteetan aminopeptidasa

A aktibitatearen inhibitzaileekin egindako frogak emandako emaitza itxaropentsuei esker,

molekula hauek (EC33-a adibidez) hipertentsioaren aurkako agente bezala proposatu dira

(Reaux eta lank., 1999).

2.2.2.4. Arginil aminopeptidasa (EC 3.4.11.6):

Orain 30 urte gutxi gora behera arratoiaren hainbat ehunetan sustrato bezala

aminoazido basikoak (arginina eta lisina) zituen exopeptidasa aktibitatea identifikatu zen.

Propietate hau dela eta aminopeptidasa B (APB) izena eman zioten (Hopsu eta lank., 1964 eta

1966). Gaur egun zink2+ metalopeptidasa honen kokapen kromosomikoa eta egitura

gizakiaren zeluletan ezagutzen da (Piesse eta lank., 2002).

Bere kokapena zitosolikoa dela esan den arren orain 5 urte Balogh eta lankideak

(1998) arratoiaren feokromozitoma zelula mota berezi batean (PC12 zelulak) entzima hau

jariatu eta mintzaren kanpo alderdian kokatu daitekeela frogatu zuten. Aminopeptidasa

Sarrera

Doktore-Tesia

30

honen aktibitate egokia pH pixkat azidoan ematen da (pH 6.5-6.8) (O’Cuinn, 1997). Honek

konpartimentu azpizelularretara egokitzeko gaitasuna ematen dio, bertan gertaera

fisiologiko ezberdinetan parte har lezakeelarik (Foulon eta lank., 1999).

Lan ezberdinetan leukotrieno hidrolasarekin (LTA4-ren anderatzailea) egitura eta

funtzio erlazioa duela azaldu da, eta gainera Lys-bradikininatik (kalidina) bradikinina

eratzeko gai denez, aminopeptidasa B-ak hantura prozesuetan funtzioren bat joka lezakeela

proposatu da. Gainera beste propeptido edo prekurtsore ezberdinen prozesamenduan

(proentzefalina, prokolezistokinina, e.a) eragiten duela ere deskribatu da (Yasothornsrikul

eta lank., 1998; Foulon eta lank., 1999).

2.2.2.5. Leuzil aminopeptidasa (EC 3.4.11.1):

Espezifizitate zabaleko aminopeptidasa honek oligopeptido ezberdin asko hidrolisa

ditzake, N-muturrean ez direnean alanina, zisteina edo gly-gly sekuentzia azaltzen edota

azken aurreko aminoazidoa prolina ez denean (O’Cuinn, 1997).

1986an Kohno eta lankideak gizaki gibelaren zitosolean isolatu zuten, Mg2+ edo

Mn2+-arekin aktibatu eta, aminopeptidasa gehienak bezala, bestatinarekin inhibitu daitekeen

metaloentzima dela adieraziz. Kasu honetan LAP-ren pH egokia nahiko basikoa da, 9.5 -

10.5-ekoa hain zuzen. Autore batzuk prolil aminopeptidasa eta LAP entzima berbera dela

iradokitzen dute (Turzynski eta lank., 1990).

1991an Gibson eta lankideek giza garuneko LAP purifikatu eta neuropeptido

ezberdinen gain nola eragiten duen ikertu zuten. Guztien artean leu-entzefalina zen gehien

anderatzen zuena, baina hala ere peptido opioide honekiko espezifizitatea PSA-rena baino

8 bider txikiagoa da. Entzima solugarri honen benetako papera oraindik ez dago oso argi

baina, alanina aminopeptidasa solugarria bezala, ehun askotan hedatua dagoenez zelula

barneko proteinen bioeraldaketa edo turnoverrean erantzunkizun handia izan dezakela

proposatzen du talde honek.

Sarrera

Doktore-tesia

31

Sarrera

Doktore-Tesia

32

3. Opiazeoekiko menpekotasuna.

3.1. Kontzeptuak:

Opiazeoekiko menpekotasuna kausa eta ondorio psikologiko eta sozial

garrantzitsuko fenomeno konplexua da. Bertan substratu biologiko batek (garuna),

denboran zehar agente biologiko baten (opiazeoa) exposiziopean egotearen eraginez,

aldaketa fisiologiko edo biologikoak jasaten ditu. Beraz, menpekotasuna prozesu biologiko

bat dela onartu behar dugu (Nestler eta Aghajanian, 1997).

Droga, menpekotasuna sortzen duen edozein substantzia natural edo sintetikoari

deitzen zaio. Psikiatrek menpekotasun hau diagnostikatzeko Sistema bi onartzen dituzte.

Bata, Osasunerako Mundu–Erakundeak (OME) eratutako CIE-10; eta bestea, Psikiatria

Amerikarreko Batzordeak egindako DSM-IV-a (Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders). Azken honek, droga-menpekotasuna narriadura nabaria sortarazten duten

substantzia psikoaktiboekiko kontsumo-jokabide moldagabeari deritzo (American

Psychiatric Association, 2000).

Gainera bien artean menpekotasun diagnostikoaren irizpide nagusiak ezarri ziren.

ICD-10 (1992) eta DSM-IV-ean (1994) ikus daitezke 7 irizpide hauek:

1. Tolerantziaren sorrera.

2. Abstinentzia sindromearen agerpena.

3. Opiazeoaren erabilpena hasieran nahi izandakoa baino kopuru handiagoan

edo denboraldi luzeagoan.

4. Opiazeo kontsumoa kontrolatu ezina edo kontsumitzeko premia

kontrolagaitza.

5. Opiazeoa lortzeko edo bere efektuak lortzeko denbora asko erabili.

6. Opiazeoaren kontsumoaren ondorioz lan, gizarte edo solas aktibitateen

murrizketa.

Sarrera

Doktore-tesia

33

7. Opiazeo kontsumoaren jarraipena bere efektu kaltegarrien kontzientzia izan

arren.

Irizpide hauetatik hiru edo gehiago agertu badira 12 hilabete jarraian

menpekotasuna bezala katalogatu daiteke. Gainera, lehenengo eta/edo bigarren irizpideak

azaltzean, asaldura horri osagai fisikodun menpekotasun bezala dei diezaiokegu.

Beraz, drogazalea gaixo bezala eta menpekotasuna entitate nosologiko konkretu

bezala onartu eta aztertu behar dira (Leshner, 1997).

Sortzen duten menpekotasun mailari jarraituz OME-ak drogak klasifikatzen ditu

taldeka.

6. Taula. Menpekotasun graduaren arabera eginiko drogen sailkapena (OME).

Menpekotasunaren esanahia ulertzeko beharrezkoa da prozesu biologiko konplexu

hau osatzen duten gertaera bi bereiztea. Menpekotasun psikikoa eta menpekotasun fisikoa.

3.2. Menpekotasun psikikoa:

Drogazaletasuna ondoen definitzen duen ezaugarria menpekotasun psikikoa da.

Morfina eta heroina substantzia menpekotasun sortzaileen adibide klasikoak dira,

garrantzitsuenak OME-ren sailkapena ikusiz gero. Beren eragin akutu edo kronikoen

ondorioz periodikoki edo era jarraian substantzia hartzeko beharrizan konpultsiboa sortzen

dute. Bada jokabide edo premia kontrolagaitz honi (ingeleses craving bezala ezagutua)

1. Taldea Opioa eta eratorriak

2. Taldea Barbiturikoak eta alkohola

3. Taldea Psikoestimulagarriak (kokaina, anfetaminak), extasia, fenciclidina, e.a.

4. Taldea Kannabis-a eta eratorriak, meskalina, LSD, nikotina.

Sarrera

Doktore-Tesia

34

menpekotasun psikikoa deritzogu. Egoera patologiko hau ezarri ahala opiazeoaren

kontsumoa erregularra izatera pasatzen da, drogazalearen saiaketak droga kontsumoa

gutxitu edo gelditzeko ezerezean geratzen direlarik; eta nahiz eta efektu onuragarriak

bakoitzean gutxiago izan eta kontrako efektuak ugariagoak, opiazeoa hartzeko jokabide

konpultsibo horrek jarraitu egiten du.

Eskala ebolutiboan zehar garunak gizakiaren edo espeziearen biziraupenerako

beharrezkoak diren mekanismoak garatu ditu; garuneko sari-zirkuituak hain zuzen ere.

Zirkuitu hauek jokaera erabilgarriak sendotu eta mingarriak direnak ezabatzen dituzte;

honela, bide neuronal hauek plazerrak eta minak, asetze emozionala edo sexualak, goseak,

egarriak eta asetasunak aktibatzen dituzte. Aktibazio honek estimulazio edo asebetetze

egoera mantentzeko premia eragiten du.

Nahiz eta molekularki oso ezberdinak diren droga adiktibo asko egon eta

hauentzako espezifikoak diren hartzaile barietate handia izan arren, guztiek dute ezaugarri

fisiopatologiko amankomun bat, bide mesolinbiko dopaminergikoaren aktibazioa; hau da, sari-

zirkuituen aktibazioa (Nestler, 2001). Sexua, janaria eta edaria era naturalean sari-sistema

honen errefortzatzaileak diren bezala, drogak berdin jokatzen dute baina era patologikoan

(Fernández-Espejo, 2002).

Sari-sistema edo zirkuitu honen osagai nagusiak mesenzefaloko barneko gune

tegmentela (ventral tegmental area edo VTA) eta prosenzefaloko (forebrain) accumbens nukleoa

(estriatuko barnekaldea edo NAC), garun kortex frontala edo prefrontala (PF) eta amigdala

dira (Koob eta Nestler, 1997). VTA-an neurona dopaminergikoen somak aurkitzen dira eta

hemendik NAC-era doaz bere axoiak. Era berean, NAC-etik PF-ra eta amigdalara doaz

bere projekzio gehienak. Gainera, sari-sistema honek beste konexio neuronal asko ditu bai

hipokanpoa, estriatua eta mesenzefaloko edo kortexeko beste gune batzuekin (Fernández-

Espejo, 2000). Sistema konplexu eta integratu honetan neurotransmisore nagusia dopamina

izan arren, beste neurotransmisore erregulatzaile askok parte hartzen dutela deskribatu da

laborategiko ikerketa ezberdinetan (Koob eta lank., 1998; Wickelgren, 1998). Honela,

sistema mesolimbikoan neurona glutamatergikoak, GABAergikoak, serotoninergikoak,

noradrenergikoak eta opioidergikoak aurki daitezke. Azkeneko hauen artean zirkuitu

entzefalinergikoak dira ugarienak eta orokorrean laburrak izaten dira. Hala ere, badaude

Sarrera

Doktore-tesia

35

abstinentzia sindromearen egoera higuingarriarekin (NAC–VTA) edota minaren

erregulazioan zerikusia duten guneekin (hipotalamo laterala–periacueductal grey edo PGA)

loturak dituzten neurona dinorfinikoak eta endorfinikoak hurrenez hurren,

entzefalinergikoak baino zirkuitu luzeagoak osatzen dituztenak (Nestler, 2001).

Lehen esan bezala, menpekotasuna bide mesolinbikoan drogak sortutako asaldura

da eta bertan helburu bezala droga-kontsumoa duen aztura patologikoa ezartzen da. Bide

dopaminergiko honen aktibazioak, VTA-n hasi eta NAC-en bitartez PF-arekin lotzen dena,

garun kortexeko atal honetan hiperaktibitate dopaminergikoa eragiten du. Gertaera honen

esanahia ez dago oso argi baina droga-kontsumoaren ikaste eta garapenarekin erlazioa duela

uste da (Fernández-Espejo, 2002). Izan ere, orain 1980an Mogenson eta lankideek

accumbens nukleoa motibazioa eta ekintza motorearen integrazioarekin erlazionatzen dela

deskribatu zutenetik gaur egunera arte gauza bera frogatu eta osatzen duten ikerketa ugari

egin dira droga ezberdinak erabiliz. Hauen artean animaliekin egindako ikerketa

konduktualak (droga autohornikuntza, lekuarekiko lehentasun baldintzatuaren froga,

autokitzikapen intrakraneala, e.a.) oso erabilgarriak izan dira abusu drogekiko

menpekotasunaren oinarri neurobiologikoak ulertzeko (Wise, 1996).

Ikerketa tresna hauek erabiliz opiazeoek eta beste abusu-drogek sistema

mesolinbiko dopaminergikoa non eta zein eratan aktibatzen duten ezagutu da. Oraindik gai

honetan hainbat hutsune gelditu arren, nahiko ondo definitzen ari da morfina edo heroinak

nola eragiten dioten sari-sistema honi bai drogaren erabilpenaren hastapenetan (akutuki) eta

baita epe luzean (kronikoki).

Shippenberg eta lankideek (1992) opiazeoak VTA-ko neurona dopaminergikoak era

ez zuzenean aktibatzen zituztela proposatu zuten. Izan ere, gune horretan badira neurona

hauek modulatzen dituzten beste neurona gabaergiko inhibitzaileak eta hauen µ

hartzaileekin lotuz opiazeoek azkenengoen inhibizioa eragiten dute. Beraz, morfina edo

heroinak, neurona inhibitzaileen inhibizio honi esker, VTA-ko zelula dopaminergikoen

aktibitatea handitzen dute.

Beste atal batean aipatuko den bezala, drogaren erabilpen kronikoaren ondorioz

neuroegokitze bat gertatzen da. Sari-sistema mailan egokitze hau opiazeoen efektu

Sarrera

Doktore-Tesia

36

higuingarriaren eragilea bihurtzen da, drogazaleak substantzia hartzeko premia azaltzen

duelarik. NAC-etik VTA-ra doazen zuntz gabaergikoak, neuroegokitze hori dela eta,

dinorfinak expresatzen dituzte eta BPO hauen eraginez VTA-ko zelula dopaminergikoen

inhibizioa gertatzen da, abstinentzia sindromearen sentsazio higuingarriaren kausa bihurtuz,

behintzat bere sindromearen lehenengo egunetan (Nestler, 2001). Drogazaleak egoera

motibazional hau ekiditzeko beraz, droga hartzen jarraitu beharko du.

Heroina menpekotasun animali ereduak erabiliz Chang eta lankideek (1998) NAC-

aren erdian (core deritzon gunean) eta PF-an elektrodoak jarriz animaliak droga hartzeko

duen jokabide motorea eta gune hauen aktibitate neuronalaren arteko harreman hestua

dagoela frogatu zuten. Dirudienez droga hartzeko mugimendu sekuentzia NAC-ean eta PF-

an prozesatzen dira. Ez da ahaztu behar NAC-ak sistema extrapiramidalarekin duen

erlazioa eta PF-ak kortex premotorearekin konexioak dituela (Fernández-Espejo, 2000).

Beraz menpekotasun psikikoa, eta menpekotasun fisikoaren alderdi emozionalaren

substratu neuronalak sistema mesolinbiko dopaminergikoan kokatzen dira.

3.3. Menpekotasun fisikoa:

Opiazeoak etengabe edo kronikoki hartzeak bai gizaki edo animalia ereduetan

neuroegokitze fenomeno bat eragiten du, non beharrezkoa bihurtzen den organismoan

droga maila determinatuak mantentzea, organismo eta drogaren artean lokarri bat sortuz

(Lorenzo eta lank., 1999). Neuroegokitze egoera honen osagai nagusiak tolerantzia eta

menpekotasun fisikoa definitzen duen abstinentzia sindromea dira:

3.3.1. Tolerantzia opiazeo dosi berdinekin efektu txikiagoa sortzea edo, beste

era batera esanda, hasierako efektu berberak lortzeko dosiak igo beharrari deritzogu

(Harrison eta lank., 1998). Morfina edo heroinaren kasuan, hauek era jarraian erabiltzean

azaldutako tolerantzia ez da gradu berberean gertatzen opiazeoek sortutako efektu

guztietan. Adibidez analgesia, euforia, loa eta arnas depresioarekiko tolerantzia nahiko azkar

azaltzen da. Berriz, idorreria eta miosia bezalako efektuekiko tolerantzia agertzea askoz

zailagoa da.

Sarrera

Doktore-tesia

37

Substantzia opiazeo batekiko tolerantzia dagoenean, hartzaile berdinarekin lotzen

diren beste opiazeoekin gauza bera gertatzen da (tolerantzia gurutzatua), horregatik

fenomeno honen oinarria farmakodinamikoa dela esan daiteke; hau da, tolerantziak

hartzailea bera, efektore sistema edo azken erantzunarekin zerikusia izan beharko du

(Pineda-Ortiz, 2001). Zentzu honetan ikerketa ugari egin dira neuroegokitze honen

mekanismo molekularrak eta zelularrak azaltzeko eta proposaturiko fenomeno ezagunenak

hauek izan direlarik: hartzaile opioideen desentikortzea (hartzaile eta G proteinen arteko

banantzea), hartzaile opioideen beherantzako erregulazioa edo down-regulation delakoa

(hartzailearen barneratze edo bahiketarengatik edo kopuruaren txikitzearengatik) eta

hartzaile-osteko fenomenoak (adibidez sistema efektoreko entzima ezberdinen gorantzko-

erregulazioa) (Nestler, 1992; Nestler eta Aghajanian, 1997).

Hartzaileen desentikortzea eta bahiketa dira onartuenak azkar azaltzen den

tolerantzia fenomenoari dagokionez (ordu gutxitan hasitakoa) (Palczewski eta Benovic,

1991). Hartzaile opioideen kopuru txikitzeak edo dentsitate galtzearen argumentuak

(Dingledine eta lank., 1983; Tempel eta lank., 1988) gero eta indar gutxiago dauka ez baita

argi ikusten in vivo egoeran eta ez dituelako tolerantziaren ezaugarri klabeak azaltzen

(Harrison eta lank., 1998). Azken urteotan gizaki heroinazaleetan (postmortem) kortex

frontalean ikusitako µ eta δ-hartzaile opioideen dentsitate galtze ezak susmo hori berresten

du (Schmidt eta lank., 2000 eta 2001).

G proteina eta hartzaile opioidearen arteko banantzea azaltzen duten mekanismo

ezberdinak daude. Hartzaile hauen desentikortzea ikertzeko proteinkinasa ezberdinez

fosforilatzen diren hartzaile β-adrenergikoak erabili dira eredu bezala: AMPZ-ren menpeko

kinasak (PKA) eta β-hartzaileen kinasak (G proteinei lotutako hartzaileen kinasak edo GRK).

Bada GRK-k egoera aktiboan dagoen hartzailea fosforilatzean β-arrestina izeneko proteina

baten lotura eragiten da, eta ondorioz hartzaile eta G proteina arteko elkarrekintza

deusezten da, hurrengo fase batean hartzaile fosforilatuaren bahiketa eta barneratzea

eraginez (Freedman eta Lefkowitz, 1996). Kovoor eta lankideek µ-hartzaileen eta G

proteinen banantzea GRK ezberdinen bitartez gertatzen dela deskribatu zuten orain 5 urte

(1998). Hurrengo urtean Appleyard eta lankideak (1999) κ-hartzaile opioideen

Sarrera

Doktore-Tesia

38

desentikortzea kinasa berdinen bitartez gertatzen zela frogatu zuten. Era berean Terwilliger

eta lankideak (1994) opiazeoekin eginiko tratamendu kronikoen ondorioz, GRK eta β-

arrestina mailak NSZ-ko gune ezberdinetan igotzen direla deskribatu zuten. Gizaki

heroinazaleen kortex frontalean mintzari lotutako kinasa hauen maila altuagoak deskribatu

dira ere (Ozaita eta lank., 1998). Baita ere β-arrestina 2-arekiko knock out saguetan

morfinaren efektu analgesikoa luzatu egiten dela frogatu izan da (Bohn eta lank., 1999).

Duela oso gutxi, lehenengoz arratoietan morfinak β-arrestinen mRNA mailak erregulatzen

dituela ikusi da NSZ-ko atal batzuetan, proteina hauen 1 eta 2 isoformen erregulazio

ezberdina ikusi delarik, opiazeoekiko tolerantzia prozesuan funtzio ezberdina joka

lezaketela proposatuz (Fan eta lank., 2003).

µ-hartzaileen eta bere G proteinaren banantzea azaltzen duen beste mekanismo bat,

G proteina hauen azpiunitateen maila aldaketa litzateke. Honi lotuta opiazeoen tratamendu

kronikoak αi/0 azpiunitateen edota β azpiunitateen gutxitzea eragiten duela deskribatu da

(Terwilliger eta lank., 1991; Ventayol eta lank., 1997).

Era berean G proteinen funtzionamenduari eragiten dioten beste proteina batzuk,

fosducina (βγ azpiunitateak α-rekin lotzeko gaitasuna modulatzen duena) edo RGS proteinak

(α azpiunitatearen GTPasa aktibitateari eragiten diotenak) adibidez, tolerantzia mekanismo

honen atzean egon daitezke. 2001ean RGS-2 edo 3 proteinen (ia 20 isoforma ezagutzen

dira) sintesia blokeatuz morfinak edo β-endorfinek sortutako analgesia eskasagoa dela ikusi

zuten Garzón eta lankideek. Bishop eta lankideek (2002) berriz, abstinentzia

sindromearekin erlazio zuzena duen locus coeruleusean RGS-4 proteinen RNAm-ren

modulazio bifasikoa ikusi zuten. Alegia, morfina akutuki ematean RNAm-ren maila

gutxitzea, eta erabilpen kronikoan maila handitzea. Fosduzina edo antzekoei dagozkionez,

proteina hauek antigorputzekin blokeatuz opiazeoen nozizepzio aurkako boterea gutxitzen

dela ikusi da (Garzon eta lank., 2002).

Hartzaileen bahiketa prozesuari dagokionez agonista opiodeak akutuki erabiliz

hartzaile opioideen barneratzea (endozitosia) gertatzen dela deskribatu da (Sternini eta

lank., 1996). Autore batzuk bahitze honek agonistaren eraginkortasun farmakologikoarekin

zerikusia ez duela azpimarratzen dute (Alvarez eta lank., 2002).

Sarrera

Doktore-tesia

39

Kronikoki morfinarekin tratatutako animalien locus coeruleuseko neurona

noradrenergikoen aktibitate elektrikoa neurtuz, potasio korronteen errazte efektuarekiko

µ-hartzailearen desentikortzea gertatzen dela aspaldi frogatu zen (Christie eta lank., 1987).

Efektu honen ondorioz opiazeoak sortutako aktibitate biolektrikoaren inhibizioa eskasagoa

da (tolerantzia). In vitro entseiuetan agonista opioideak akutuki baina kontzentrazio altuetan

jarriz gero µ-hartzaile bitartezko potasio konduktantziaren gutxitzea ikusi zen (Harris eta

Williams, 1991). Opiazeo agonistek sortutako tolerantzia azkarra G proteinei lotutako

potasio erretenen asaldurekin ere erlaziona dagoela uste da (Kovoor eta lank., 1995).

Hartzaile osteko fenomenoei dagokionez, opiazeoak kronikoki ematean zirkuitu

neuronal ezberdinetan maila molekularrean azaldutako aldaketa konpensatzaile ezagunena

AMPz bidearen aktibazioa (up-regulation edo hipertrofia) da. Sharma eta lankideak

neuroblastoma eta glia lerro zelularretan morfina akutuki eta kronikoki erabiltzean AMPz-

ren maila aldaketak aurkitu zituztenetik (1975) hainbat ikerketa egin dira prozesu hau

baieztatuz. Opiazeoak akutuki ematean AMPz-ren bidea (efektore sistema nagusia)

inhibitzen da, baina droga emate hau kronifikatzean bide honen errebote bat gertatzen da

neuroegokitze prozesu berezi baten bitartez (Nestler eta Aghajanian, 1997). Mekanismo

hau menpekotasun fisikoa definitzen duen abstinentzia sindromearen lokarri

nagusienetarikoa da eta sakonki ikertu da sindrome honetan eragina duen NSZ-ko nukleo

noradrenergiko nagusian, locus coeruleusa.

Beraz tolerantzia fenomenoaren mekanismo molekular nagusiak hartzaileen

desentikortzea, bahiketa eta hartzaile-osteko fenomenoak dira.

3.3.2. Abstinentzia sindromea opiazeoa kronikoki hartzeari uztean edo

naloxona bezalako antagonista opioidea hartzean azaldutako seinu eta sintoma taldeari

deritzogu (Lorenzo eta lank., 1999). Hauek, opiazeoak akutuki sortutako efektuen

alderantzizkoak dira, eta heroina edo morfina nahiko azkar iraizten direnez, abstinentzia

sindromea agerpen azkarrekoa, intentsitate handikoa eta luzapen txikikoa izaten da. Hala

ere, efektuen epeei dagokionez, badira ezberdintasunak sindromea antagonista bat

ematearen ondorioz edo berezkoa denean. Lehenengo kasuan, abstinentzia sindromea

antagonista hartu eta zuzenean hasten da, efektuen gailurra ordu batetan azalduz. Berriz,

Sarrera

Doktore-Tesia

40

berezkoa denean, morfina eta heroinaren kasuan, efektuak 12. orduan azalduz doaz, 24-48

ordutan gailurra, eta ia 5 egun iraun ditzake.

Gizakian, seinu eta sintomei dagokionez, lehenengo fase bat dago rinorrea,

aharrausiak, antsietatea eta negar-jarioarekin. Fase gailurrean ile-tentetzea, midriasia, izerdia,

takikardia, urduritasuna, antsietatea, dardarak, insomnioa, min artikularra eta mialgiak

azaltzen dira. Azken fasean sukarra, tripalak, beherako eta gorakoak, berezko eiakulazioa

eta pisu galtzea dira ugarienak.

Animalietan suminkortasuna, urduritasuna, hiperalgesia, jauziak, gorputz-astintzea,

pisu-galtzea, beherakoak, berezko eiakulazioa, garrasiak, agresibitatea, e.a seinu ikus

daitezke (Pineda-Ortiz, 2001).

Sintomatologia zentral eta begetatibo honetan locus coreuleus (LC) izeneko gune

mesentzefalikoaren erantzunkizuna handia zela deskribatu zenetik (Aghajanian, 1978)

badira 25 urte. Abstinentzia sindromean gune noradrenergiko honetako hiperaktibitatea

gertatzen dela frogatzeko α2-hartzaile adrenergikoen agonista den klonidina erabili zuten,

errebotezko efektu hoiek baretu egiten zirela deskribatuz.

NSZ-ko neurona noradrenergikoen ia erdia dituen gune honetan µ-hartzaileen

dentsitatea nahiko altua da (Foote eta lank., 1983). Bertan, sarrera honen 1.3.4 atalean

azaldu bezala, opiazeoak neurona mailan akutuki neuronen aktibitate bioelektrikoa eta

neurotransmisore askapenaren inhibizioa eragiten dute. Efektu hau Gi/G0 proteinei

lotutako µ-hartzaileen bitartez sortzen da, G proteina hoiekin erlazionatutako potasio

erretenak zabaldu (North eta lank., 1987) eta AMPz menpeko sodio erretenak ixten baitira

(Alreja eta Aghajanian, 1993). Opiazeoak akutuki ematean adenilil ziklasaren (AC)

inhibizioa eragiten da (Beitner eta lank., 1987) proteina askoren AMPz-aren menpeko

fosforilazioa gutxitz (Guitart eta Nestler, 1989), eta ondorioz expresio genikoa bezalako

hainbat funtzio zelularri eraginez. Zentzu honetan, CREB (cAMP response element binding)

edo c-Fos bezalako transkripzio faktoreen fosforilazioa gutxitzen dela deskribatu da

(Guitart eta lank., 1992; Hayward eta lank., 1990). Opiazeoekiko menpekotasunean

azaldutako egokitze molekularrak gene espezifikoen transkripzio aldaketen ondorioz izan

litezke.

Sarrera

Doktore-tesia

41

Opiazeoaren tratamendu kronikoaren eraginez AMPz bidearen up-regulation delakoa

gertatzen da, opiazeoek zelulan sortutako inhibizio konstantearekiko mekanismo

konpentsatzaile bezala. Bide honen “hipertrofiak”, kanale kationiko ez-selektiboen

aktibazioa dela medio, neurona noradrenergikoen aktibitate intrinsekoa handitzea eragiten

du (Alreja eta Aghajanian, 1993). Barneko aktibitate hau opiazeoa hartzen jarraituz gero

“baretuta” agertzen da, baina bakoitzean dosi handiagoak behar dira hiperaktibitate hori

ekiditzeko (tolerantzia); eta opiazeoa uztean edo antagonista opioide bat hartzean

abstinentzia sindromea agerian jartzen da.

Goranzko erregulazio fenomeno honetan adenilil ziklasa, protein kinasa A, tirosina

hidroxilasa, Giα eta CREB transkripzio faktorearen expresioa handituta azaltzen dira

(Duman eta lank., 1988; Nestler eta Tallman, 1988; Guitart eta lank., 1992). Protein kinasa

A inhibitzen duten farmakoak zuzenean LC-an jartzean opiazeoekiko abstinentzia

sindromea leundu eta aktibatzaileekin okerragotu egiten dela ikusi da (Punch eta lank.,

1997). Hildo berberean, AC VIII azpimota eta tirosina hidroxilasaren kontzentrazio igotzea

– eta ez PKArena – CREB-aren igotzearekin zuzenean erlazionatuta dagoela frogatu zuten

Lane-Ladd eta lankideek (1997). Urte bat lehenago CREB-a kodifikatzen duen genea ez

zeukaten animalietan abstinentzia sindromearen gogortasuna asko murrizten zela

deskribatu zen (Maldonado eta lank., 1996). Emaitza hauek eta beste batzuk up-regulation

honetan CREB-aren papera funtzezkoa dela adierazten digute (Nestler, 2001). Dirudienez

opiazeoa akutuki hartzean emandako CREB-aren fosforilazio gutxitzeak autoerregulazio

geniko bitartez transkripzio proteina honen sintesia haunditzea dakar (Coven eta lank.,

1998). Hala ere, CREB-aren indukzio honek zein eratan eragiten duen hiperaktibitate

noradrenergikoan zerikusia duten beste entzima edo proteinen transkripzioan ez dago

batere argi. Baliteke fosforilatuta egon ez arren transkripzioa posible izatea edota mailaka

igotzen dagoen PKA-k fosforilatzea (Nestler, 2001).

Menpekotasun psikikoaren mekanismo molekularrak azaltzean esan den bezala,

CREB-aren indukzio hau NAC-eko neuronetan ere agertzen da (Nestler eta Aghajanian,

1997). Transkripzio faktore honen gehitzea NAC-eko neurona talde batean (eta estriatuko

beste atal batzutan) azaldutako dinorfina expresioarekin erlazionatzen da (Shippenberg eta

Rea, 1997). Neurona talde honek VTA-ko neurona dopaminergikoen inhibizioa eragiten du

Sarrera

Doktore-Tesia

42

(κ-hartzaile bitarteko ekintza) eta feed-back mekanismo honen ondorio nagusia

abstinentzia sindromearen sentsazio higuingarria da. Orain urte bi Kish eta lankideek

(2001) heroinazaleen estriatuan eginiko postmortem analisietan dopamina, bere metabolitoa

den azido homobalinikoa, eta tirosina hidroxilasa mailak neurtu zituzten. Kasu guztietan

maila hauek kontrol taldeenak baino heren bat txikiagoak ziren (27-33%). Datu hauek

heroina kronikoki hartzean animali ereduetan gertatutako prozesu berbera adieraztera

ematen digute, heroinazaleetan motibazio egoeraren eta droga beharrizanaren joerari eragin

diezaiokeela proposatuz.

Abstinentzia sindromean LC-a kontrolatzen duen kanpoko osagai garrantzitsu bat

ere badago. Gune honetara entzefalo-enborreko nukleo paragigantozelularretik (PGi) neurona

talde biren aferentziak heltzen dira. Hauek abstinentzia egoeran hiperaktibitatea azaltzen

dute eta molekula ezberdin biren bitartez LC-aren kanpoko eragileak dira egoera

patologiko honetan.

Alde batetik, neurona glutamatergikoak LC-an glutamatoa, aminoazido kitzikatzaile

nagusia, askatzen dute. Hau frogatzen duten lan asko daude: kronikoki morfinarekin

tratatutako animalietan naloxona eman ondoren glutamato mailaren igoerak (Aghajanian

eta lank., 1994), PGi-aren lesioak edo neurotransmisore honen antagonistak (azido

kinurenikoa) sortutako LC-aren hiperaktibitate leuntzea (Rasmussen eta Aghajanian, 1989),

e.a.

Bestetik, beste neurona taldeak oxido nitrikoa askatzen du LC-an gune hau

kitzikatuz. Hildo honetan eginiko ikerketak ere oso ugariak dira: Oxido nitriko sintetasaren

(NOS) inhibitzaile inespezifikoak erabiliz abstinentzia sindromearen intentsitatea leuntzen

dela ikusi da (Kimes eta lank., 1993) baina bere inespezifikotasuna dela eta sortutako

hipertentsioak abstinentziaren tratamendurako deusezten ditu molekula hauek. Vaupel eta

lankideak1-2 (1995) NSZ-ko espezifikoa den NOSnc-arekiko inhibitzaile selektiboak (7-

nitroindazola) abstinentzia era berberean gutxitzeko gai direla eta presio arterialean eraginik

ez dutela ikusi ondoren, terapeutikarako interesgarriak direla proposatu zuten.

Beraz menpekotasun fisikoan emandako aldaketa fisiopatologikoak kanpoko eta

barneko osagai birengatik gertatzen dira: Kanpokoari dagokionez, glutamatoa eta NO-a

Sarrera

Doktore-tesia

43

LC-an askatzen duten neuronen hiperaktibitatea litzateke. Barnekoa berriz AMPz bidean

gertatutako up-regulation delakoa eta CREB-aren indukzioa da. Gainera osagai hau bide

mesolinbikoan abstinentzian azaldutako emozio-egoera negatiboaren arduraduna da

(Nestler, 2001).

3.4. Menpekotasuna eta barne sistema opioidea:

70. hamarkadan gure NSZ-an hartzailez eta hauenganako afinitatea duten peptido

endogenoz osotzen zen barne sistema opioide bat geneukala aurkitu zenetik hona,

opiazeoekiko menpekotasunaren zergatiak ulertzeko egindako ikerketak oso ugariak izan

dira eta fenomeno hau ezagutzeko egindako aurrerapausuak etengabekoak. Gaur egun

menpekotasun psikikoan eta fisikoan eragin nagusia duten NSZ-ko atalak definituta daude

eta ikertzaile gehienen eritziz droga psikoaktibo guztiek era batera edo bestera gune

berdinetan eragiten dute.

Ikusi denez menpekotasun psikikoan sistema mesolinbikoaren aktibazioa da abusu

drogen ekintza nagusia. Sistema honen neurotransmisore garrantzitsuena dopamina den

arren, zirkuitu mesolinbiko hau bere modulazioan eragina duten zuntz opioidergiko anitzez

osatuta dago. Gehienak neurona laburrak dira, entzefalinak edo dinorfinak askatzen

dituztenak, eta zuntz luzeren bat ere badago (dinorfina eta endorfinak) (Nestler, 2001).

Droga kontsumoa kronikoa egin denean lehen azaldutako neuroegokitze prozesua

dela eta drogazaleak droga horren beharrizana azalduko du (craving), bakoitzean dosi

handiagoetan (tolerantzia) bere egoera higuingarri kronikoa gainditzeko. Egoera horren

neurotransmisore arduradun ez-zuzena barne peptido opioide bat dugu (dinorfina). Era

berean, beste NSZ-ko atal batzuetan eta hazkuntza zeluletan deskribatu den bezala,

menpekotasun fisikoa azaltzen duten hartzaile-osteko fenomeno ezberdinen ondorioz

proteina askoren (entzimak, transkripzio faktoreak, erretenak, e.a.) espresioa handitu egiten

dela nahiko argi dago.

Tesi honen helburuetariko bat morfina edo heroinak barne peptido opioideen

metabolismoan zein eratan eragiten duen ezagutzea da. Menpekotasunari buruz hitzegitean

ikusi bezala, opiazeoak hartzean hartzaileen dentsitatea aldatu daitekeen teoriak kontrako

Sarrera

Doktore-Tesia

44

eritzi asko ditu (Harrison eta lank., 1998) eta azken urteotan gizaki heroinazaleen garun

laginetan eginiko ikerketak hartzaileen dentsitate galtzerik ez dagoela frogatu dute (Schmidt

eta lank., 2000 eta 2001). Beraz menpekotasun fisikoaren mekanismo molekular nagusiak

hartzaile-osteko proteinen eraginez gertatzen direnaren bidea da gaur egun jarraituena.

Bide honetan murgilduta morfina edo heroinak barne peptido opioideen sintesian

zein eratan eragiten duten ezagutzeko lan mordoa aurkeztu dira. Edozein pertsona edo

animaliak opiazeoak era jarraian hartzean bere opioide endogenoen ekoizpenean (edo

askapenean) erregulazioren bat egon behar lukeela nahiko logikoa da (Bergstrom eta

Terenius, 1979). Are gehiago, zeluletan substantzia arrotz bat hartzearen ondorioz

sortutako oreka patologiko honetan (tolerantzia eta abstinentziaren lokarria) opioide

endogenoen askapena edo sintesia murriztuta egotea litzateke ulergarriena; gainera egoera

honek droga dosi altuagoak hartu behar hori ulertzen lagunduko liguke (barneko opioidea

jaitsiz gero, kanpotik gehiago hartu behar) (Trujillo eta Akil, 1991). Barne opioideen

erregulazio honetan hauen katabolismoan zerbait gertatzea ere ez litzateke harrigarria

izango.

Baina azkeneko 25 urteotan hari honi oratuz egindako ikerketek, ikusiko den bezala,

emaitz kontrajarri ugari azaldu dituzte:

Morfinarekiko menpekotasuna zuten animalietan entzefalina mailen neurketak

lehenengoz 1976. urtean deskribatu ziren. Lehenengo datu hauetan morfina-

menpekotasuna zuten arratoietan entzefalina maila altuak deskribatu ziren (Simantov eta

Snyder, 1976). Hala ere, ikerlari berdinek (Childers-ekin batera), radioinmunoentseiuz

eginiko esperimentuetan ez zuten entzefalina maila aldaketarik nabaritu morfina-

menpekotasuna zuten arratoietan (Childers eta lank., 1979). 1977an Fratta eta lankideek

NSZ-ko atal ezberdinetan met-entzefalina mailak egonkor mantentzen zirela adierazi zuten.

Shani eta lankideek (1979) Fratta eta bere taldearen lana zerbait zehazten zuten emaitzak

izan zituzten. Ikerlan honetan 72 ordutan zehar morfinazko pelletak ezarrita zeramatzaten

arratoietan leu eta met-entzefalina mailak nabarmenki jaisten zirela ikusi zuten,

menpekotasun fisikoaren hastapenetan entzefalina kontzentrazioaren erregulazioren bat

egon behar zuela eta epe erdi-luzean mailak baldintza normaletara bueltatzen zirela

proposatuz. Urte berberean, µ-hartzaileen deskribapena lehenengoz egin zuen taldeetariko

Sarrera

Doktore-tesia

45

batek arratoia espontaneoki abstinentzia egoeran sartzen denean estriatuko entzefalina

mailen gutxitzea ematen dela argitaratu zuen (Bergstrom eta Terenius, 1979). Datu hau

kontrajarriz, Wüster-en taldeak (1980) naloxonarekin eraginiko abstinentzian estriatuko

met-entzefalina mailak igo egiten direla argitaratu zuen.

β-Endorfinei dagokionez, BPO hauen mailak morfina tratamendu kronikoekin ez

direla aldatzen adierazi zuten Höllt eta lankideek (1978) hipotalamo, hipofisi eta plasman

egindako jarraipenetan. Hurrengo urtean Przewlockiren taldeak (1979) morfina tratamendu

luzeetan arratoi burmuinean eta hipofisian endorfina mailak murrizten direla argitaratu

zuten. Dinorfinei dagokionez, burmuinean eta hipofisian morfina-menpekotasunean

peptido hauen mailak egonkor mantentzen direla deskribatu zen (Ho eta lank., 1982).

Heroinarekin egindako ikerketak eskasagoak dira. 1987an azaldutako lan batean,

animalietan 72 ordutarako heroinazko pelletak ezarri ondoren menpekotasuna zuten

arratoien NSZ-ko atal ezberdinetan entzefalina eta dinorfinen maila igotze handiak ikusi

ziren (Weissman eta Zamir, 1987). Ikus daitekenez, lan honen emaitzak ez datoz bat Shani

eta lankideak (1979) morfina pelletekin lortutako emaitzekin. 1999an egindako ikerlan

batean, Cappendijk eta lankideek heroinaz tratatutako animalien (autohornikuntza

esperimentuak) estriatuan dinorfina eta entzefalina mailak altuak direla ikusi zuten. Ikerketa

berberean kokaina animalia taldeak ere bazituzten eta ez zituzten aldaketa berdinak ikusi,

BPO-en erregulazioa hartzaile opioideen bitartezko ekintza izan behar duela proposatuz

(Cappendijk eta lank., 1999).

Gai berdinean sakondu nahian baina planteamendua aldatuz, beharbada ikuspegi

terapeutiko batekin, barne peptido ezberdinez eginiko tratamenduak morfina edo heroinak

eragindako abstinentzia sindromea leundu zezakeen ala ez jakiteko frogak egin dira. 1976an

animalia ikerketetan β-endorfinak abstinentzia murriztu dezakela deskribatu zuten Tseng

eta lankideek; eta ez zen efektu berbera ikusi entzefalina eta dinorfinekin, beharbada

peptido hauen in vivo inaktibazio azkarrarengatik. Gizakiarekin egindako ikerketetan,

adibidez entzefalinen analogo sintetikoa den FK 33-824-rekin eginiko froga klinikotetan

konposatu honek heroinazaleen abstinentzia sintomak murriztu zitzakeela ikusi zen. Hala

ere, murrizketa hau morfinak sortutakoa baino txikiagoa zen (Holmstrand eta Gune, 1980).

Hiru urte beranduago abstinentziadun heroinazaleetan β-endorfina, entzefalina edo

Sarrera

Doktore-Tesia

46

dinorfina prestakinak benabidetik eman eta gero sindrome honetako sintomen murrizketa

gertatzen dela deskribatu zen (Wen eta lank., 1983). Clement-Jones-en taldeak (1979)

ikerlan interesgarri bat egin zuen gizaki heroinazaleekin, akupunturazko terapiak

abstinentzia sintomak murriztu zitzakeela frogatuz. Elektroakupunturak likido

zefalorrakideoko barne peptido hauen maila igotzeak eragiten zituela ikusi ondoren, efektu

terapeutiko honen azpian met-entzefalinaren askapena zegoela proposatu zuten.

Entzefalinen aurkikuntzaren (Hughes eta lankideak 1975an) hurrengo hamar

urteetan opiazeoekiko menpekotasuna eta barne peptido opioide mailak zuzenean

erlazionatzeko eginiko ikerketetan gauzak argiegi ez ziren gelditu. Gai honetan sakonduz

80. hamarkadaren bigarren erdian hasita, menpekotasun egoeran peptido opioideen

bioeraldaketan edo turn-overrean gertatutakoak ulertu nahian, peptido hauen proteina

aitzindarietan eta hauek kodifikatzen dituzten geneetan oinarritzen diren hainbat ikerlan

aurkeztu dira.

Lehenengo datuek, arratoietan morfina kronikoki ematean hipotalamoko

proopiomelanokortina (POMC: endorfinen aitzindaria) sistemaren gutxitzea edo down-

regulation delakoa eragiten dela diote, aitzindari hau kodifikatzen duen RNA mezulariaren

maila txikiagotzeak ikusi ondoren (Mocchetti eta Costa, 1986). Talde berberak hipotesi hau

ziurtatzeko hipotalamoko POMC-aren edukina eta baita aitzindari honen eratorriak diren

peptido batzuena ere jaitsi egiten dela deskribatu zuten; hala ere, β-endorfina mailetan ez

zuten aldaketarik adierazi (Mocchetti eta lank., 1989). Urte berberean Bronstein eta

lankideek (1989), arratoietan egindako 7 eguneko morfina tratamendu ostean, antzeko

emaitzak ikusi zituzten, baina aldaketa txiki batekin: tratamenduaren 3.egunean β-endorfina

immunoerreaktibotasuna kontrolena baino handiago zen, hurrengo egunetan maila hauek

berriro egoera normalera jaitsiz. Talde honen ustez, neurona endorfinergiko hauetan

morfinaren eraginez peptido honen askapenaren inhibizioa gertatzen denez lehenengo

egunetan β-endorfina maila intrazelularrak handiagoak dira. Baina hurrengo egunetako

BPO honen mailen egonkortzea POMC RNAm-ren sintesi erregulazioaren ondorioz

gertatzen da (Bronstein eta lank., 1989).

Entzefalinen aitzindari edo hauen RNAm-ari dagokionez, lehenengo emaitzak

hipotalamoan azaldu ziren. Lightman-en taldeak (1987) estresak zein eratan eragiten dion

Sarrera

Doktore-tesia

47

entzefalinen aitzindarien RNAm-ari deskribatu zuen. Estres estimuluetariko bat

opiazeoekiko abstinentzia sindromea izan zen eta egoera honetan proentzefalinaren RNA-

ren maila igotzeak ikusi ziren. Hurrengo urtean estriatuan egindako ikerketetan, tolerantzia

eta abstinentzia sindromean alderantzizko emaitzak azaldu ziren, estriatuan

preproentzefalina (PPE) RNAm maila jaisteak alegia (Uhl eta lank., 1988). 1992an Childers-

en taldeak agonista opioideak sortutako adenilil ziklasaren beheranzko erregulazioaren

ondorioetariko bat PPE RNAm mailen gutxitzea zela adierazi zuen. Urte bete beranduago

Basheer eta Tempel-ek (1993) morfina tratamendu kronikoaren ondorioz emaitza

ezberdinak jaso zituzten NSZ-ko atalen arabera. Estriatuan eta kortex frontalean PPE-ren

RNAm mailak jaitsi egin ziren. Ordea, hipokanpoan gorakada nabarmena jasan zuten.

1995an Trujillo eta lankideak estriatuko atal ezberdinetan egindako frogetan morfina

tratamenduak PPEren mailak ez dituela aldatzen azpimarratu zuten.

Dinorfinen sistemari dagokionez, morfinazko tratamendu kronikoak

prodinorfinen mailen igotzea eragiten duela estriatuan (Trujilo eta Akil, 1990), eta bere

RNAm-ak beherantzko erregulazioa jasaten duela estriatuan eta hipokanpoan (1Romualdi

eta lank., 1990) edota hipotalamoan (Basheer eta Tempel, 1993) deskribatu da.

Ikus daitekeenez, orain arte deskribatutakoarekin ez da erraza opiazeo

menpekotasuna eta BPO-en erregulazioaren arteko erlazioaren eskema orokor bat egitea.

Urteetan agertutako emaitzak eta proposaturiko hipotesiak ez datoz guztiak bat. Baina

behintzat zerbait argi gelditu bada zera da: hastapenetan uste zena zehaztuz, zuzenean

neuropeptido aktiboei baino bere metabolismoari eragiten diola opiazeoen tratamendu

kronikoak.

Egile askoren eritziz opiazeoak jarraian hartzean, droga hauen feed-back negatiboaren

ondorioz, peptido hauek kodifikatzen dituzten RNAm-aren sintesia murrizten da.

Biosintesiaren inhibizio hau aitzindari edo BPO aktiboen mailari ez eragiteak paradoxikoa

dirudien arren feed-back-aren hipotesiak nahiko errez azaltzen duela diote ikerlari hauek.

Izan ere, morfinak sorturiko inhibizioak BPO-ak dituzten neuronetan peptido hauen

askapena modulatzen du, eta horregatik nahiz eta biosintesia inhibitzen hasia egon, BPO

edo aitzindarien mailak altu edo egonkor diraute. Egoera hau nahiko ixila mantentzen da

morfinaren eraginpean, baina droga exogenoa hartzeari uztean (abstinentzia) neurona

Sarrera

Doktore-Tesia

48

opioidergikoen hiperaktibitate egoerak BPO-en biltegiak azkar agortu ditzake, biosintesia

inhibituta baitago. Biosintesia normalizatu ahala ordu edo egun batzutan egoera baldintza

fisiologikoetara bueltatuko litzateke (Trujillo eta Akil, 1991).

Atal honekin bukatzeko, komenigarria da tolerantzia edo abstinentzia

fenomenoarekin eta barne opioide sistemarekin erlazioa duen gai bati buruzko aipamen

berezia egitea: Peptido “antiopioideak” (AOP):

Opiazeoen eraginez sortutako neuroegokitze mekanismoen artean orain arte

azaldutako fenomeno nagusiak hartzaile mailan eta hartzaile-ostekoak izan dira; azken

hauen artean, BPO-en biosintesiaren beheranzko erregulazioaren hipotesia. Baina azpiatal

honetan kokatuta, ikerlari askoren ustez, ekintza antiopioidea duten peptido batzuk morfina

tolerantzia edo abstinentzia fenomenoan eragina izan dezakete.

Baldintza fisiologikoetan jakina da BPO-ek dituzten ekintza nagusien artean

nozizepzioaren kontrola dagoela. Urteetan zehar aurkeztutako lan ezberdinek gure NSZ-an

BPO “klasikoen” eta opiazeo exogenoen ekintzak modulatzen dituzten peptidoak

sintetisatzen direla frogatu dute. Hala ere peptido ezberdin hauen artean batzuk propietate

opioide eta antiopioideak dituztela frogatu denez, “antiopioide” hitza nahiko zalantzazkoa

da eta “opioiden modulatzaile” bezala deitzea komenigarriagoa litzateke (Cesselin F, 1995).

Propietate “antiopioideak” edo “opioide modulatzaileak” dituzten peptidoen

adibideak hauek dira (Rothman RB, 1992; Harrison eta lank., 1998): Neuropeptido FF,

Orfanina FQ edo nozizeptina, Tyr-MIF peptidoak, CCK-8, TRH-a, α-MSH eta baita BPO

batzuk ere (dinorfina 1-13, dinorfina 1-17, β-endorfina 1-27, e.a). Hauen artean batzuk

morfinaren antinozizepzioa leuntzen dute (Tyr-MIF, CCK-8 edo NPFF-ak), morfinarekiko

tolerantzia murriztu dezakete (α-MSH, TRH), abstinentzia prezipitatu dezakete (NPFF),

e.a.

Gai hau oraindik sakontzeko dagoen arren, morfinarekiko tolerantzia eta

abstinentzia prozesuetan peptido hauek eraginen bat izan dezaketela argitzen ari da. Izan

ere, animali ereduetan nabaria zen zenbat eta tolerantzia sakonagoa izan hainbat eta

naloxona dosi txikiagoa behar izana abstinentzia sindromea eragiteko. Orokorki azalduz,

Sarrera

Doktore-tesia

49

AOP batzuk morfina eman ahala gehiago sintetisatu edo askatzen dira, tolerantzia

fenomenoa azkartuz. Era berean, morfina emateari uztean, AOP-en askapen ez-arrunt hori

abstinentziaren efektuen arduradunetariko bat izan daiteke (Rothman, 1992). Hipotesi

honen adibide bezala, NPFF-ak abstinentzia prezipitatu dezakeela edota bere aurkako

antigorputzekin naloxonak eraginiko abstinentzia leundu dezakeela deskribatu da (Harrison

eta lank., 1998). Murphy eta lankideek (1996) arratoien sistema mesolinbikoko atal

konkretu batean orfanina FQ jartzeak NAC-ean dopamina askapen gutxitzea eragiten duela

deskribatu zuten. Hari berean, duela gutxiko ikerlan batek morfina tratamendu kronikoak

bide mesolinbikoan proorfanina FQ/nozizeptinaren gene aktibazioa eragiten duela

deskribatu zuen (Romualdi eta lank., 2002). Urte berean, Pommierren taldeak (2002) CCK-

2 hartzailearekiko knock-out saguen neuronetan BPO sistemaren goranzko erregulazioa

gertatzen dela adierazi zuten.

Ikus daitekenez, AOP-en sistemak nozizepzioa, menpekotasun psikikoa, tolerantzia

edo abstinentziaren mekanismo molekularrekin zerikusia duenaren teoriak gero eta indar

gehiago dauka eta fenomeno konplexu hauek ulertzeko bide berri bat izan daiteke, baita

terapeutikaren ikuspegitik ere.

3.5. Menpekotasuna eta BPO-en anderakuntza:

Lehengo atalean azaldu bezala, BPO-ak opiazeoekiko menpekotasunean duten

funtzioari buruzko ikerlan ugari zaldu dira azkeneko 25 urteetan. Emaitza nahiko

ezberdinak deskribatu diren arren, ideia amankomun bat dago opiazoen tratamendu

kronikoak BPO-en biosintesian beheranzko erregulazioa eragiten duela dioena; hau da,

peptido hauen sintesiaren hastapenetan feed-back negatiboa gertatzen dela (Trujillo eta

Akil, 1991; Trujillo eta lankideak 1995).

Baina morfina edo heroinarekiko menpekotasunean BPO-en katabolismoan

gertatzen denari buruz ezer gutxi idatzi da. Orain arte peptido hauek hidrolisatzeko gai

diren entzimei eta opiazeoen ekintzari buruzko ikerlan gehienak entzima hauen inhibitzaile

sintetikoen aurkikuntza eta nozizepzioarekin erlazionatutakoak izan dira. Zentzu honetan,

Sarrera

Doktore-Tesia

50

Roques-en taldeak lan mordoa aurkeztu ditu, endopeptidasa neutroa 24.11 (entzefalinasa)

edo aminopeptidasa N-an eta hauen inhibitzaileetan oinarritutako esperimentuak azalduz.

BPO-en anderakuntza azaltzen den atalean ikusi bezala, entzefalinasa eta

aminopeptidasa N, PSA-rekin batera, peptido hauen anderatzaile nagusiak dira. Tiorfana,

entzefalinasa eta APN-aren inhibitzailea, morfinarekiko abstinentzia sindromea leuntzeko

gai dela ikusi eta erabilpen honetarako medikamendu bezala proposatu da (Maldonado eta

lank., 1992; Roques eta Noble, 1995). Tiorfana, kelatorfana eta RB101 (entzefalinasa eta

APN inhibitzaileak ere) nozizepzio aurkako ahalmena dutela deskribatu da (Roques eta

lank., 1999). RB101-ak hain zuzen, morfinaren analgesia erabat potentziatzen du eta

zertxobait ere ibuprofenoa eta az.azetil salizilikoarena (hanturaurkako ez-esteroideoak)

(Nieto eta lank., 2001). Ahobidetik eman daitekeen RB120-ak ere min mota ezberdinak

murrizteko gaitasuna duela ere frogatu zen (Noble eta lank., 1997). Hau dela eta,

inhibitzaile hauek analgesiko berri bezala edota analgesian opiazeoen laguntzaile bezala

proposatu dira, morfinaren kontrako efektuak gutxituko lituzketelako (Roques eta lank.,

1999; Ortega-Alvaro eta lank., 1998; Noble F eta lank., 1999, Boudinot eta lank., 2001).

Egia esan inhibitzaile hauek tetrahidrokannabinolak sortutako antinozizepzioa

potentziatzen duela ere frogatu da, sistema opioidea eta kannabinoideak mina erregulatzeko

dituzten bideak erlazionatuta daudela adieraziz (Reche eta lank., 1998). Urte batzuk

lehenago Maldonado eta lankideek (1993) RB101-a CCK-B hartzailearen antagonista

batekin batera ematean nozizepzio aurkako efektu boteretsua lortzen dela deskribatu zuten.

Datu bezala, orain urte bi Noble eta lankideak (2001) beste inhibitzaile bat, RB129

(iodo erradioaktiboz markatua), APN-aren NSZ-ko banaketa hobeto ezagutzeko erabili

zuten.

Analgesiarekin erlazionatuz, endopeptidasa neutroaren genea ezabatuta duten

saguetan plaka beroaren frogan estimulu mingarri honekiko erresistentzia handiagoa

azaltzen zuten knock-out saguek (Saria eta lank., 1997). Talde berberak,

drogamenpekotasunen gaian sartuaz, sagu mutante hauetan kontroletan baino etanol

kontsumo handiagoa ikusi zituen (Siems eta lank., 2000). Emaitza hau 4 urte lehenagoko

beste ikerlan batekin ez dator bat. Izan ere, Szczepanska eta lankideek (1996)

Sarrera

Doktore-tesia

51

aminopeptidasa N-ren inhibitzailea den bestatinak, alkohol kontsumoa murrizten duela

deskribatu zuten.

Morfinak BPO-en katabolismoan duen eraginari buruzko lanak oso eskasak dira.

Malfroy eta lankideak morfina tratamenduak entzefalinen anderakuntza handitzen zuela

deskribatu zuten 1978an. Hiru urte beranduago Hui eta lankideak (1981) morfina kronikoki

ematean naloxonarekin itzulezina zen entzefalinen anderakuntzaren handitzea ikusi zuten.

Hala ere, esperimentu berbera in vitro egitean naloxonak anderakuntza hau inhibitzen duela

adierazi zuten. 1987an entzefalinasa eta APN aktibitatearen inhibitzaileak diren felorfana

eta tiorfanarekin animali ereduetan egindako ikerketa interesgarri bat argitaratu zen.

Farmako hauek naloxona bitartez eraginiko abstinentzia sindromearen sintoma batzuk

murrizten zituztela ikusirik, abstinentziaren tratamendurako proposatu zituzten (Hahhmans

eta lank., 1987). 1998an urte Fukunaga eta lankideek beste peptidasen inhibitzaile batzuk

substantzia gris periakueduktalean mikroinjektatuz naloxona bitarteko abstinentziaren

leuntzea deskribatu zuten. Gainera entzefalinen analogoa den [D-Ala2, Met5]-

entzefalinamida injektatzeak ere abstinentziaren sintoma batzuk gutxitu zituenez, autore

hauen ustez PAG-an entzefalinen maila igotzeak abstinentzia sindromea leundu litzakeela

proposatu zuten.

Endo-oligopeptidasa (EC 3.4.22.9), entzefalina edukina duten peptidoak anderatuz

entzefalinak ekoizteko gai den entzima, naloxona bitarteko abstinentziadun arratoien NSZ-

an maila altuetan agertzen dela ikusi da (Paik eta lank., 1994).

Lan berberean maila periferikoan, gongoil linfatiko eta timoan, entzima honen

mailak abstinentzian igo egiten direla adierazi zuten Paik eta lankideak (1994). Urte batzuk

lehenago Korányi eta lankideek (1989) T linfozitoetako dipeptidil-peptidasa IV entziman

morfinak naloxonarekin itzulgarria den dosi-menpeko aktibazioa eragiten duela deskribatu

zuten. Giza granulozitoetan ere morfinak endopeptidasa neutroaren aktibazioa,

naloxonarekin itzulgarria dena, eragiten duela deskribatu da (Stefano eta lank., 1994). Maila

periferikoan ere, aortako zelula endotelialetan hain zuzen, morfinak Leu-entzefalinaren

anderakuntza aktibatzen duela deskribatu zen. Ekintza hau APN-a edo entzefalinasa baino,

angiotentsinaren entzima bihurtzailearen (AEB) aktibazioak eragina dela adierazi zuten

Melzig eta lankideak (1998).

Sarrera

Doktore-Tesia

52

Ikus daitekeenez NSZ-an edo maila periferikoan opiazeoak zuzenean BPO-en

entzima anderatzaileengain duten eraginari buruzko ikerlanak nahiko eskasak dira.

Dirudienez, neurtutako entzimetan morfina tratamendu kronikoak hauen aktibazioa

eragiten du, kasu batzutan naloxonarekin itzultzen den efektua. Baina oraindik gai honetan

hutsune asko daude, eta are gehiago heroinarekin eginiko lanetan. Horregatik, tesi honen

helburuetariko bat BPO sistemaren katabolismoan opiazeoekiko tolerantzia edo

abstinentzia sindromean agertu litezkeen aldaketen deskribapen sakona egitea izan da; bai

gizaki zein animalietan.

3.6. Menpekotasuna, beste neuropeptidoak eta

hauen anderakuntza:

Tesi honetan aztertuko diren peptidasak BPO-ak ez diren beste peptido batzuen

inaktibazioaren arduradunak dira; hauen artean ezagunenak TRH-a, basopresina, hormona

sexualen askatzaileak, angiotentsina II eta III, bradikininak, P substantzia, e.a. direlarik.

TRH-a eta opiazeoak erlazionatzen dituzten lanak ez dira gutxi izan. TRH-ak

morfina abstinentzia sindromean agertutako hipotermia itzultzen duela frogatu da

(Bhargava HN, 1980). Morfina tratamenduak sortzen duen analgesiarekiko tolerantzia

TRH-ak murriztu egin dezakeela ere deskribatu da (Ramarao eta Bhargava, 1990). Morfina

abstinentzia sindromean PAG-an TRH-aren aitzindariak eta beren RNAm mailak

handitzen direla deskribatu da, sindromearen modulatzaile papera izan lezaketela

proposatuz (Ghan eta Sevarino, 1996; Legradi eta lank., 1996). 2002an, hipotalamo

lateralean TRH mailak abstinentzia sindromean handitu egiten direla ikusi da (Nillni eta

lank., 2002). Hormona honen anderakuntzan zerikusia duten entzima bi, prolil-

endopeptidasa eta dipeptidil-peptidasa IV, abstinentzia sindromean hipotalamoan aktibitate

handiagoa azaltzen dutela deskribatu da (Idänpään-Heikkilä eta lank., 1995).

Sarrera

Doktore-tesia

53

Opiazeoen beste ekintza batzuen artean ezaguna da drogazaleetan morfinak eta

heroinak sistema endokrinoan sortutako asaldurak. Adibidez, ACTH-a edo hipotalamoko

faktore askatzaileen (GnRH-ak) ekoizpen inhibizioa eta basopresina eta prolaktina sintesi

aktibazioa (Lorenzo eta lank., 1999).

Bradikinina eta P substantzia hantura eta minarekin erlazionaturiko bitartekari

zelularrak dira. Lehenengoak sortutako nozizepzioa morfinarekin itzul daiteke. Efektu hau

protein kinasa C-aren bitarteko ekintza bezala deskribatu zen duela gutxi (Inoue eta Ueda,

2000). P substantziari dagokionez, morfinarekiko abstinentzian NSZ-ko atal ezberdinetan

bere anderakuntza igo egiten dela deskribatu zuten Zhou eta lankideek (2001).

Angiotensina II peptido basopresoreari dagokionez, egile batzuk substantzia

antiopioideen artean kokatzen dute. Izan ere, morfinak arratoietan eraginiko analgesia

itzultzeko gai dela deskribatu da (Han eta lank., 2000). Melzig eta lankideek (1998) aortako

zelula endotelialetan morfinak AEE-aren aktibitatea handitzen duela ikusi zuten.

Nahiko argi ikus daitekeenez, opiazeoekiko tolerantzia edo abstinentzia prozesuetan

peptido askoren anderakuntzari buruzko ikerlanak oso eskasak dira. Tesi honen beste

helburuetariko bat opiazeoekiko menpekotasunak peptido ezberdinen entzima

anderatzaileen aktibitatean eraginik duen ala ez deskribatzea izan da, bai gizaki zein animalia

ereduetan.

II. Helburuak

Helburuak

Doktore-tesia

55

Peptidasak, peptido ezberdinen apurketa hidrolitikoaren katalisatzaileak dira.

Angiotensina eraldatzen duen entzima edo peptidasaren inhibitzaileak hipertentsio-

kontrako boterea dutela ikusi zenetik (Ondetti eta lank., 1977) entzima hauekiko interesa

asko suspertu zen. Aspalditik onartuta dago neuropeptidoen inaktibazioa batez ere

peptidasen bitartez egiten dela (Iversen, 1987), eta ildo honetan neuropeptidoen

anderatzaileak diren peptidasa ugari deskribatu dira hainbat espezieren NSZ-an eta beste

ehun ezberdinetan, bai zelulen mintzan eta bai zitosolean (Turner, 1987; Hersh, 1982;

Mantle, 1992; Taylor, 1993; O’Cuinn, 1997).

Lan honetan 7 peptidasa ezberdinen aktibitateak aztertu ditugu gizaki eta

arratoiaren garunean: Puromizinarekiko sentikorra den aminopeptidasa, APN, prolil-

endopeptidasa, arginil-AP, leuzil-AP, piroglutamil-peptidasa eta aspartil-AP. Sarreran

azaldu bezala, entzima hauek neuropeptido ugariren hidrolisian parte hartzen dute; euren

artean, barne peptido opioideak, TRH-a eta angiotentsina II eta III. Nurotransmisore edo

hormona funtzioa duten peptido hauen erregulazioaren ezagutzan zerbait laguntzeko

asmoz egindako azterketa deskriptibo hau baldintza fisiologikoetan eta egoera patologiko

konkretu batean egin da, helburu hauei jarraituz:

1. Gizakiaren eta arratoiaren garun kortexean peptidasen banaketa

azpizelularra ezagutu:

Garuneko neuropeptidoen metabolismoari dagokionez, nahiko ezarrita dago mintz

plasmatikoari lotutako peptidasen funtzioa neuropeptidoen – neurotransmisore edo

hormona ezberdinen – metabolismoan (Turner, 1986). Baina ezer gutxi dakigu peptidasa

askoren kokapen intrazelularrari buruz, eta are gutxiago zatiki solugarrian dauden

peptidasen funtzioari buruz (Mantle, 1992).

Peptidasen banaketa azpizelularraren ikerketak neuropeptidoen aktibitatearen

erregulazioa zelula mailan ulertzen lagun diezaguke. Hori dela eta, peptidasa solugarrien eta

mintzari lotutakoen aktibitateak nukleo, mitokondria, mikrosoma (lisosomak eta erretikulu

endoplasmikoa), zitosol eta sinaptosometan neurtu dira gizaki eta arratoiaren garun

kortexean.

Helburuak

Doktore-tesia

56

2. Peptidasa aktibitateak gizakiaren eta arratoiaren garuneko atal

ezberdinetan ezagutu, espezie arteko ezberdintasunak azpimarratuz.

Peptidasak mikroorganismo, landare eta animalia mota edo espezie ugaritan eta

ehun ezberdinetan isolatu dira (Taylor, 1993). Gainera, onartuta dago entzima hauek

neuropeptido edo beste peptidoen anderakuntzan ez dutela espezifikotasun osoz ekiten;

hau da, peptidasek sustratu bat baino gehiagoren gain eragin dezaketela (Kenny, 1986).

Tesi honetarako aukeratutako peptidasak zenbait neuropeptidoren anderakuntzan

parte hartzen dutela ikusirik, beren aktibitateak garuneko atal ezberdinetan nolakoak diren

ezagutzeak entzima hauen funtzio fisiologikoa ulertzen zerbait lagun diezaguke. Era berean,

gizakia eta arratoiaren garunean ikerketa egiteak, ebolutiboki NSZ-ren garapen maila

ezberdina duten espezien arteko peptidasa eta neuropeptidoen aktibitate ezberdintasunik

dagoenentz argituko liguke. Tesi honetarako aztergai izan diren garuneko atalak hurrengo

hauek izan dira: Garun kortexa, amigdala, hipokanpoa, hipotalamoa eta estriatua

(kaudatua).

3. Opiazeoekiko menpekotasunean gizaki eta arratoi garuneko peptidasen

aktibitateak aldaketarik jasaten duen ezagutu.

Morfina eta heroina menpekotasuna sortzen duten substantzien adibide

garrantzitsuenak dira, drogarekiko premia edo beharrizan bortitza (menpekotasun

psikikoa), tolerantzia azkarra eta abstinentzia sindrome bizia (menpekotasun fisikoa)

sortzeko gai baitira.

Menpekotasun psikikoaren substratu neuronala garuneko sari-zirkuitu bezala

ezagututako bide mesolinbiko dopaminergikoan kokatzen da. Opiazeoek bide honen

errefortzu edo aktibazio patologikoa eragiten dute, drogazaleetan craving delako premia hori

eraginez (Koob eta Nestler, 1997). Sari-sistema honen oinarrizko guneak barneko gune

tegmentala, accumbens nukleoa, kortex prefrontala eta amigdala dira eta beste atal

askorekin dituzte konexioak. Adibidez, kaudatu-putamena (estriatua), hipotalamoa,

hipokanpoa, substantzia gris periakueduktala, e.a. Gainera, sistema konplexu honetan

neurona dopaminergikoez gain beste askok ere parte hartzen dute; adibidez, neurona

Helburuak

Doktore-tesia

57

entzefalinergikoak edota dinorfina azaltzen dutenak (Koob eta Nestler, 1997; Nestler,

2001).

Tolerantzia eta abstinentzia, opiazeoen kontsumo errepikatuak eragindako

neuroegokitzearen ondorioz gertatzen dira. Maila zelularrean ezarritako oreka patologiko

honen lokarrietariko bat hartzaile osteko fenomenoak dira eta bertan proteina ezberdinen

metabolismoaren aldaketa ugari deskribatu dira (Nestler eta Aghajanian, 1997). Hauen

artean, barne peptido opioideen (BPO) erregulazioari dagozkion ikerlanak nahiko

kontrajarriak izan dira eta hutsune ugari daude. Hala ere, zerbait gertatzen dela argi dago,

behintzat biosintesi prozesuari dagokionez (Trujillo eta Akil, 1991; Trujillo eta lank., 1995).

Katabolismoari dagokionez, APN edo endopeptidasa neutroaren inhibitzaileekin egindako

ikerlanak izan dira ugarienak. Tiorfana, kelatorfana, RB-101, e.a. inhibitzaileren botere

analgesikoa eta abstinentzia sintoma aurkakoa frogatzen dituztenak, alegia (Maldonado eta

lank., 1992; Roques eta Noble, 1995; Roques eta lank., 1999).

Hutsune hauek betetzen joateko helburuarekin, gizaki heroinazaleen eta tolerantzia

edo abstinentzia duten animalia ereduen garuneko peptidasa ezberdinen modulaziorik

gertatzen denentz deskribatzea proposatu da. Gizakiaren kasuan garun kortex prefrontala

eta nukleo kaudatua izan dira aztergai. Arratoietan berriz, garun kortexa (prefrontala

adibidez), amigdala, hipotalamoa, hipokanpoa eta kaudatua.

Sistema opioidearen erregulazioak opiazeoekiko menpekotasunean duen eragina

hobeto ulertzeko, ikerlan honetan BPO-en anderakuntzan garrantzitsuenak diren

aminopeptidasa biak (PSA eta APN-a) aztertu dira.

Bestalde, opiazeoen kontsumo errepikatuak beste neuropeptido askoren

katabolismoan sortutako eraginari buruzko ikerlanak oraindik eskasagoak direnez; TRH-a,

angiotentsina, bradikinina, basopresina, e.a. neuropeptidoren aderatzaileak diren entzimen

aktibitateak neurtu dira.

III. Materiala eta

Metodoak

Materiala

Doktore-tesia

59

Doktoretza-tesi honen alderdi esperimental guztia Medikuntza eta Odontologia

Fakultateko Fisiologia Sailari esleitutako Neurokimika Laborategietan egin da (UPV/EHU),

Jon Irazusta Astiazaran Saileko Katedradunaren zuzendaritzapean.

1. Materiala

1.1. Esperimentazio animaliak eta talde esperimentalak:

Animaliak:

Erabilitako animaliak Sprague Dawley anduiko eta barietate albinoko arratoi harrak izan

ziren, 225-300 gramo eta 6 – 9 asteko adinekoak hain zuzen ere.

Talde guztiak plastiko polikarbonatuzko kaioletan eduki ziren Euskal Herriko

Unibertsitateko abeltegian argitasun / iluntasun (12h / 12h), hezetasun (50%) eta

tenperatura (24ºC) baldintza arruntetan. Animaliak ad libitum elikatu ziren ura eta UAR 104

motako dieta estandarrarekin (Panlab®). Edukina: gluzidoak (%58), proteinak (%17),

lipidoak (%3), zelulosa (%5), mineralak (%5) eta hezetasuna (%12).

Taldeak:

I. Lan honetan, helburuan azaldu bezala, lehenengo fase batean animalia tratatugabeetan

peptidasa ezberdinen deskribapen orokorra egin zen garuneko zati ezberdinetan eta garun

kortexeko zatiki azpizelularretan. Azken honen purutasuna zehazteko frogak ere egin ziren.

Hau guztirako ondoren adierazten diren animalia erabili ziren:

Nerbio sistema zentraleko atal ezberdinetan (n= 12).

Garuneko kortexaren zatiki azpizelularretan (n= 12).

Zatiki azpizelularren purotasun frogak (n = 8).

Materiala

Doktore-tesia

60

II. Bigarren fasean berriz, morfinarekiko menpekotasuna eta abstinentzi sindromea zuten

arratoiak erabili ziren:

Morfina taldea (n=20): tolerantzia aurkezten zuten arratoien taldea.

Morfina – kontrol taldea (n= 20): morfinaren ordez suero fisiologikoa zeramatenak.

Abstinentzia taldea (n=20): abstinentzi sindromea eragiten zitzaien arratoi taldea.

Abstinentzia – kontrol taldea (n= 20): suero fisiologikoa + naloxona zeramatenak.

1.2. Gizaki garun laginak, postmortem:

Gizaki laginak Bilboko Auzitegi Mediku Instituto Anatomikoan eginiko autopsia

judizialetan lortu ziren.

Lagin guztiak bat-bateko heriotza izan zuten pertsonetan dute jatorria auzitegi medikuek

istripu, erailketa eta opiazeo gaindosi bezala definituak.

Kasu honetan ere bereizi egin behar dira ikerketaren fase biak:

I. Peptidasen deskribapen orokorra gizaki arruntetan: Kasu honetan historia medikoan

gaixotasun nerbiosorik azaltzen ez zituztenen garun laginak erabili ziren. Bai gizon eta bai

emakumeek osatzen zuten taldea eta adina eta hil ondorengo atzerapenaren (postmortem delay

delakoa) bataz besteak 34 + 2.5 urte eta 30.6 + 2 ordukoak ziren hurrenez hurren.

Banaketa erregionala (n= 12)

Banaketa azpizelularra (n= 12)

Banaketa azpizelularraren purutasun frogak (n=12)

II. Peptidasak opiazeoekiko menpekotasuna azaltzen zuten gizaki eta hauen kontroletan:

Menpekotasun taldea (n= 8) heroina edo morfinarekiko menpekotasun historia

zuten gizabanakoek osatua. Beraiekin eginiko ikerketa mediko legalak beste

Materiala

Doktore-tesia

61

psikofarmakoren baten eraginpean ez zeudela frogatu zuen. Guztiak ziren

gizonezkoak eta adina eta PM delay-a XXX urte eta XX ordukoa izan zen.

Kontrol taldea (n= 8) gizaki osasuntsuek osatua. Lehenengo taldeko gizaki

bakoitzarekin adina, sexua eta hil ondorengo atzerapenarentzat parekatuak daude

(XXX urte eta XX ordu).

1.3. Ekipamendua:

Tefloizko enbolodun homogeneizagailua, Heidolph.

Abiadura handiko zentrifugagailu errefrigeragarria Sorvall RC 28S.

Angelu finkozko Sorvall-en SM-24 errotorea, polietilenozko hodiekin.

CPS-240A zelula-kokagailu termokontrolagarria.

FL500 espektrofluorofotometroa.

Shimadzu UV-2401 PC espektofotometroa.

Kontron-en CENTRIKON T2070 ultrazentrifugagailua.

Angelu finkoko KONTRON-en TFT 45.6 errotorea polietilenozko hodi

eta titaniozko tapoiekin.

Selecta-ren Hotcod S, 0–60ºC bitarteko inkubagailua.

JEOL 100SX mikroskopio elektronikoa.

Sartorius-en zehaztasunezko R180D pisua.

Mettler LV-2 dosifikadore elektrikoa.

Tefloizko enbolodun, Heidolph PZR 50 homogeneizagailua.

Selectaren Reax 2000 hodien eskuzko irabiagailua.

Termoegonkortutako irabiagailu magnetikoa, Agimatic.

Micro – pH 2001 eta 2002, Crison pH – metroak.

Bolumen aldakorreko mikropipeta kapilarrak.

Bolumen aldakorreko pipeta automatiokak, Nichiryo eta Brand.

1 – 5 ml-ko dispentsadoreak, Eppendorf Multipipette 4870.

Espektrofluorometriarako Fluoronunc plastikozko plakak.

Espektrofotometriarako plastikozko kubetak (3ml), IZASA.

Homogeneizatzeko beirazko ontziak.

3ml-ko plastikozko saiodiak, Eurotubo.

Materiala

Doktore-tesia

62

Bolumen ezberdinetako pipeta – puntak, Beortek.

Gradilak, Beortek.

Material kirurgikoa.

Beirazko materiala (ontziak, probetak, matrazak, e.a).

1.4. Produktu kimikoak:

Azetato sodikoa, Merck.

Azido Klorhidrikoa, Probus S.A.

Azido azetiko glaziala, Probus S. A.

Azido ortofosforikoa %85ean, Merck.

Behi – seroalbumina, Sigma Chemical Co.

Coomasie G-250 urdin distiratsua, Sigma Chemical Co.

Manganeso kloruroa, Merck.

Sodio kloruroa, Merck.

DAG (N-Dansyl-D-Ala-Gly), Sigma Chemical Co.

DAGNPG (N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitroPhe-Gly), Sigma Chemical Co.

Dimetil sulfoxidoa (DMSO), Sigma Chemical Co.

DL – Ditrioteitola (DTT), Sigma Chemical Co.

EDTA, Merck.

Etanol absolutua, Probus S.A.

Ficolla.

Fosfato sodiko monobasikoa, Merck.

Fosfato sodiko dibasikoa, Merck.

Kloral hidratoa, Merck.

Magnesio sulfatoa, Merck.

Manitola, Merck.

Sodio zitratoa, Merck.

β-Naftilamina, Sigma Chemical Co.

Alanil – β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.

Arginil– β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.

Materiala

Doktore-tesia

63

Aspartil– β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.

Leucil– β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.

Piroglutamil – β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.

Z-Glizil-Prolil-– β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.

Propilen – glikola, Panreac.

Puromizina, Sigma Chemical Co.

Rotenonea, Sigma chemical co.

NADPH, Sigma chemical co.

C zitokromoa, Sigma chemical co.

Hoeschst 33258 erreaktiboa, Sigma chemical co.

Zekorraren timoko DNA. Sigma chemical co.

DCIP. Sigma chemical co.

Azida sodikoa. Sigma chemical co.

Sukzinatoa. Sigma chemical co.

1.5. Soluzioak:

1.5.1. Soluzio indargetzaileak:

Tris HCl 0.2 M indargetzailea (pH = 7.4):

1000 ml egiteko, 24.22 gr Trizma base hartzen dira eta ur distilatua gehitzen zaio

bolumenera heldu arte. pH-a HCl-arekin egokitzen da.

Tris – Sakarosa HCl 0.25 M (pH= 7.4):

100 ml prestatzeko 8.435gr sacarosa eta 0.0606gr Trizma base ur destilatuan disolbatu, pH-

a doitu eta azken bolumena lortu arte ur destilatuarekin berdintzen da.

Materiala

Doktore-tesia

64

Fosfato 0.2 M indargetzailea (pH = 7.4):

A soluzioa: fosfato sodiko monobasikoaren (0.2 M) 27.6gr, 1l ur destilatuan

disolbatu.

B soluzioa: fosfato sodiko dibasikoaren (0.2 M) 28.6gr, 1l ur destilatuan disolbatu.

Fosfato 0.2 M indargetzailearen litro bat egin nahi bada A soluzioaren 190 ml, B

soluzioaren 810 ml-rekin nahastukoa dira.

Azetato indargetzailea 0.1 M, (pH = 4.2):

A soluzioa (azido azetikoa 0.2 M): 11.55 ml azido azetiko hartu eta ur destilatua

gehituz 1l-ra daramagu.

B soluzioa (azetato sodikoa 0.2 M): 27.6 gr azetato sodiko 1l ur destilatuan

disolbatzen da.

Litro bat azetato indargetzailea 0.1 M prestatzeko A soluzioaren 368 ml eta B soluzioaren

132 ml nahastuko dira, azken bolumenera ur destilatuarekin eramanez.

1.5.2. Entseiu entzimatikoentzako substratu soluzioak:

Alanina aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):

Alanina–β–naftilamida 0.125 mM.

DTT 0.65 mM.

Behi albumina 10mg/100ml.

Fosfato indargetzailea 50mM.

Materiala

Doktore-tesia

65

Puromizinarekiko sentikorra ez den alanil aminopeptidasa aktibitatea (APN)

neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):

Puromizina 20 µM.

Alanina–β–naftilamida 0.125 mM.

DTT 0.65 mM.

Behi albumina 10mg/100ml.

Fosfato indargetzailea 50mM.

Prolil endopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):

Z- Gly – Pro-β–naftilamida 0.125 mM.

DTT 2 mM.

Behi albumina 10mg/100 ml.

Fosfato indargetzailea 50 mM.

Piroglutamil peptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):

pGlu –β–naftilamida 0.125 mM.

DTT 5 mM.

EDTA 2 mM.

Behi albumina 10mg/100 ml.

Fosfato indargetzailea 50 mM.

Aspartil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):

Aspartil–β–naftilamida 0.125 mM.

MnCl2 1 mM.

Behi albumina 10mg/100 ml.

Fosfato indargetzailea 50 mM.

Materiala

Doktore-tesia

66

Arginil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 6.5):

Arginil–β–naftilamida 0.125 mM.

Puromizina 20 µM.

NaCl 0.15 M.

Behi albumina 10mg/100 ml.

Fosfato indargetzailea 50 mM.

Leuzil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 9.5):

Leuzil–β–naftilamida 2 mM.

Puromizina 20 µM.

MnCl2 0.5 mM.

Glizina 375 mg / 100ml

Behi albumina 10mg/100 ml.

Fosfato indargetzailea 50 mM.

Sukzinato deshidrogenasa aktibitatea:

Manitola 0.3 M

KCl 0.01 M

MgCl2 0.005 M

KH2PO4 0.002 M

Azida sodikoa 0.26 gr/100ml

DCIP 0.014 gr/100ml

Sukzinatoa 5.4 gr/100ml

Zitokromo C erreduktasa aktibitatea:

Fosfato potasiko indargetzailea 40 nM

NaCN 0.45 mM

C Zitokromoa 0.1 mM

Materiala

Doktore-tesia

67

Rotenone 13 µM

β-NADPH 0.13 mM

DNA-ren neurketa:

Hoeschst erreaktiboa 1.5 µM

Sodio (III) Zitratoa 0.441 gr/100ml

NaCl 0.9 gr/100ml

DNA (Calf thymus DNA) 1mg/ml

2’-3’- nuleotido zikliko fosfodiesterasa aktibitatea.

2’-3’- nuleotido zikliko fosfodiesterasa

Bromotimol urdina

Imidazol-HCL

Laktato deshidrogenasa aktibitatea:

NADH

Pirubatoa

1.5.3. Beste soluzio batzuk:

Bradford-en erreaktiboa:

Coomasie urdin disdiratsua 0.117 mM.

Etanola %5-ean.

Azido ortofosforikoa %15-ean.

Prestaketa: 1l Bradford erreaktiboa prestatzeko 100 mg Coomasie urdina 50 ml etanoletan

disolbatu eta 100 ml azido ortofosforiko gehitzen zaizkio, azken bolumenera ur

distilatuarekin eraman arte. Ordu 2-tan zehar irabiatu eta birritan iragazi beharko da.

Metodoak

Doktore-tesia

69

2. Metodoak

2.1. Tratamenduak:

2.1.1. Morfinarekin egindako tratamendua:

Heroinarekiko menpekotasuna duten gizakiekin eginiko ikerketa osatzeko

helburuarekin, animalia ereduetan morfinak peptidasen gain zein eragin izan zezakeen

ikustea proposatu genuen.

Morfinarekin egindako 5 eguneko tratamendu kronikoa Busquets eta lankideen (1995)

protokoloa jarraituz egin zen. Arratoiak opiazeo honekin egunean 3 bider ziztatuak

(peritoneo-barnetikoa) izan ziren dosiak honela handituz zihoazelarik:

1. eguna: 10, 10 eta 10 mg/kg.

2. eguna: 10, 10 eta 20 mg/kg.

3. eguna: 20, 20 eta 40 mg/kg.

4. eguna: 40, 40 eta 80 mg/kg.

5. eguna: 80, 80 eta 100 mg/kg.

Protokolo hau jarraituz morfinarekiko menpekotasuna zeukaten arratoiak lortu ziren.

Taldearen erdia, morfina taldea, morfina maila altuak odolean zeuzkatela, hurrengo eguneko

goizean sakrifikatu ziren. Besteari, abstinentzia taldeari, naloxona antagonista opioidea eman

zitzaion (5 mg/kg p.b) eta abstinentzia sindromea agertu zela baloratu ondoren

sakrifikatuak izan ziren.

Era berean talde bakoitzak bere kontrol taldea izan zuen. 5 egunetan zehar ordutegi

berbera jarraituz suero fisiologikoa ziztatu zitzaien (p.b) eta 6. egunean morfina taldearen

kontrolak zuzenean sakrifikatuak izan ziren einean abstinentzia taldearen kontrolak

naloxona hartu eta gero hil ziren.

Metodoak

Doktore-tesia

70

2.1.2. Abstinentzia sindromearen gogortasunaren neurria arratoietan.

Esperimentu konduktualak:

Abstinentzia taldeko arratoiei 5 mg/kg naloxonarekin (p.b) abstinentzi sindromea eragin

eta 5 minutu ondoren sindrome hori definitzen duten seinu ezberdinen behaketari ekin

genion Ulibarri eta lankideek (1987) deskribatutako eskala jarraituz. Tratamenduaren

banaketa ezagutzen ez zuen pertsona batek animalia bakoitza 10 minututan zehar

metakrilatozko kaiola garden batean behatu zuen, “itsu bikoitza” diseinua jarraituz. Era

berean, protokolo berdina jarraitu zen kontrol taldearekin.

Arratoi bakoitzean zera izan zen kontutan puntuaketa egiteko:

Zeinu zenbatuak edo gertakariak zenbat bider azaltzen ziren: Esplorazioa,

jauziak, astinaldiak, hortz-haginen karraska eta mastekapena.

Zeinu presenteak. Hau da, beste seinu konkretu batzuk bazeuden ala ez:

Rinorrea, negarra, begi injektatuak, irrintziak, maneiatzean areriotasuna,

erekzioa, eiakulazioa, beheranzkoa, ile–zutitzea, jarrera anormalak eta belarri

zurixkak. Seinu bakoitza agertuz gero puntu bat ematen zitzaion eta ez balego 0

puntu.

Azkenean zeinu zenbatu eta presenteen batuketa egin eta hori izan zen animali bakoitzaren

puntuaketa orokorra. Gero puntuaketa orokorrak batu eta abstinentzia taldea eta kontrol

taldearen arteko konparaketa egin zen (emaitzen atalean aipatuko dena).

2.2. Teknika kirurgikoak:

Aktibitate entzimatikoen deskribapena burutzeko animalien hilketa eta garunaren

erauzketa ezinbestekoa zen.

Animalien abeltegiko egonaldi, erabilketa eta hilketa prozesuetan Europear

Komunitatearen aginduak (1986ko Martxoaren 24-eko EEE-ko kontseiluaren; 609 agindua

Metodoak

Doktore-tesia

71

– 86/609/CEE agindua) eta Espainiako aginduak (1988-ko Martxoaren 14eko 223 erret

dekretua – R.D 223/88), animalien eskubideei dagokionez, bete izan dira.

Lan honen kasuan, talde mota guztiak, hau da, baldintza normaletako arratoiak,

menpekotasun eta abstinentzia ereduak eta hauen kontrolak dekapitazio teknikaren bitartez

sakrifikatuak izan ziren. Ondoren garezurra agerian utzi eta, garuna era egokian erauzteko,

kalota kontu handiz zabaltzen zen kako batzuen bitartez. Jarraian garuna izozgailura

eramaten zen (-70 ºC), ebaketarako prest geldituz.

Ebaketa egiteko entzefaloa milimetro bateko lodierako ebakidura koronaletan zatitzen

zen. Aukeratutako garun atalak Köening eta Klippel-en (1970) atlas estereoataxikoa

jarraituz lortu ziren.

I. Banaketa azpizelularrerako kortex laginak hartu ziren.

II. Banaketa erregionalerako aukeratutako atalak hauek izan ziren:

Garun kortexa: prefrontala, parietala eta okzipitala.

Amigdala.

Hipotalamoa.

Hipokampoa.

Kaudatua

III. Giza garunen kasuan ere banaketa azpizelularrerako garun kortex laginak erabili ziren

eta garun zati ezberdinen ikerketarako goian aipaturiko atal berberak aukeratu ziren,

Nieuwenhuys eta lankideak (1988) eta Haines-en teknikari (1995) jarraituz.

2.3. Zatiki azpizelularren lorpena:

Antolamendu zelularra maila molekularrean ulertzeko teknika erabilgarrienetariko bat

banaketa azpizelularra da. Teknika honen bidez ehun gehienetako zelulak ingurune

Metodoak

Doktore-tesia

72

isoosmotiko batean homogeneizazio batzuen bitartez banatu egiten dira eta zentrifugazio

diferentzialen bitartez nahiko ondo banatzen dira zelula barneko atalak (nukleoak,

mitokondriak, zitoplasma, erretikulu endoplasmikoa,…).

Garunaren kasuan, zatiki mitokondrialean mitokondriaz gain mielina eta nerbio

bukaerak azaltzen dira. Garun ehuna banatzean neuronen axoia nerbio bukaeratik hurbil

apurtu eta itxi egiten da, sinaptosoma izeneko egitura sortuz. Nerbio bukaera hauek

morfologia ezberdineko neuronenak dira. Era berean, beste zatiki zelularrek jatorri

neuronalaz gain gliala ere izan dezakete. Baina arazo hauek aintzat hartu arren, teknika

honek zatiki zelularretan aktibitate entzimatikoaren banaketa zein den nahiko ondo

ezagutarazten digu (Whitaker eta lank., 1969).

Tesi honen helburuetariko bat gizaki eta arratoien garun kortexeko aminopeptidasa

aktibitate ezberdinak zatiki azpizelularretan zeintzuk diren ikertzea izan da. Horretarako

Gray eta Whittakerren metodoa (1962), Krueger eta lankideen aldaketekin (1977), jarraitu

da:

Garun kortexaren 0.3gr 2ml sakarosa disoluzioan homogeneizatu (sakarosa 0.32M eta

Tris-HCl 4mM, pH 7.4 eta 4ºC-tan) 450 rpm-tan eta 30 seg-tan. Lortutako

homogenatutik 100µl geroko tratamendurako bereizi eta beste zatiari 1ml sakarosa

disoluzioa erantsi ondoren 1000 g-tan zentrifugatzen zen 10 minututan zehar.

Sobrenadantea beste hodi batzuetan bereizi eta pellet-a edo hauspeakina 1ml sakarosa

soluzioan homogeneizatuz gero beste 10 minutu zentrifugatzen zen 1000 g-tan. Lortutako

hauspeakina zatiki nuklearrari zegokion eta geroko tratamendurako uzten zen.

Lehengo sobrenadantea eta azkenengoa nahastu eta berriro zentrifugatzen ziren 1000 g-

tan 10 minututan zehar. Kasu honetan hauspeakina bota eta sobrenadantea 15 minutu

12.500 g-tan zentrifugatzen zen.

Oraingoan sobrenadantea bereizi eta pellet-a 2ml sakarosa soluzioan homogeneizatzen

zen, berriro beste 15 min 12.500 g-tan zentrifugatuz. Lortutako hauspeakinari zatiki

sinaptosomal gordina deritzogu eta bertan mitokondriak, mielina eta sinaptosomak daude.

Metodoak

Doktore-tesia

73

Sobrenadantea aurreko etapakoarekin nahasten zen eta ultrazentrifugako hodietan jarri

ondoren 120 minututan zehar 100.000 g-tan zentrifugatuz gero zatiki mikrosomala

(hauspeakina) eta zatiki zitosolikoa (sobrenadantea) lortzen zen. Orokorrean zatiki

mikrosomala erretikulu endoplasmiko mota biak eta Golgi aparatuaren zatikiz eraturiko

materiale hetereogeneoa dela esan dezakegu.

Zatiki sinaptosomal gordina 0.5 ml sakarosa soluzioan eseki eta 1.5ml ficoll %19

gehitzen zitzaion (sakarosa soluzioarekin nahastean %14-era gutxitzen zen). 2 ml hoietatik

0.5 ml bota eta beste 1.5ml-ak ultrazentrifugako hodira eramaten ziren, bertan dentsitatezko

gradiente ez jarrai bat sortzeko. Horretarako 1.5 ml hoien gainean 1ml ficoll (%7.5-ean) ezarri

eta honen gainean 0.5 ml sakarosa soluzio jartzen ziren, guztia 120 min-tan zehar eta

100.000 g-tan zentrifugatuz. Sakarosa – ficoll %7.5 tartean zegoen materiala zatiki

mielinikoari zegokion; ficoll %14 eta %7.5 interfasean agertutakoa zatiki

sinaptosomalari eta hauspeatutakoa zatiki mitokondrialari.

Purutasun handiagoa lortzeko zatiki sinaptosomala eta mielinikoak banandu ondoren,

bakoitza 2ml sakarosa disoluzioan berreseki 60min eta 100.000 g-ko zentrifugazioa egiten

zen, azkenean zatiki hauek haupeatzen zirelarik.

Azaldutako prozesua eskematikoki ikus daiteke 1. irudian.

Metodoak

Doktore-tesia

74

Garun kortexa

Homogenizatu

Sobrenadantea Hauspeakina (Pellet-a)

Sobrenadantea Hauspeakina Sobrenadantea Pellet-a

Pellet-a Sobrenadantea Berresekitu Bota Zatiki Nuklearra

Zatiki Mikrosomala Zitosola Ficoll gradientea

Pellet-a Banda Banda

Zatiki Mitokondriala Pellet-a Pellet-a

Zatiki Sinaptosomala Zatiki Mielinikoa

1. Irudia. Banaketa azpizelularraren teknikaren eskema.

Metodoak

Doktore-tesia

75

2.4. Zatiki azpizelularren purutasunaren froga:

Zatiki zelular ezberdinen purutasuna frogatzeko asmoz esperimentu ezberdinak egin

ziren bai gizaki zein arratoi garun kortexean. Sinaptosomen purutasunaren frogaren kasuan

izan ezik beste esperimentu guztietan zatikiak bata bestearekin konparatuz frogatu ziren

hauen purutasunak, emaitzen atalean ikusiko den bezala.

2.4.1. Entzima markatzaileak:

Zatiki zitosolikoaren purutasuna. Laktato deshidrogenasa aktibitatea (Berguemeyer

eta Brent, 1972) NADH-a eta pirubatoarekin laginak inkubatu ondoren

determinatu zen. Lagin bakoitzarentzako erreakzio denbora aldakor baten

ostean, NADH galpena espektrofotometroan neurtu zen 340nm-tan.

Zatiki mitokondrialaren purutasuna. Sukzinato deshidrogenasa aktibitatea neurtzeko

(Reddy eta Weber, 1986) sukzinatoa eta zianatoa zeraman disoluzio batekin

inkubatu ziren laginak. Entzima horren eraginez dikloroindofenolaren agerpenak

sortutako kolorazioa espektrofotometroaren neurtu zen 600 nm-tan.

Zatiki mikrosomalaren purutasuna. NADPH C zitokromo oxidasa aktibitatea

(Graham eta Ford, 1984) rotenonearen presentzian entzima horren erredukzioa

aztertuz egin zen neurketa, espektrofotometroaren bidez (550 nm).

Zatiki mielinikoaren purutasuna. 2’-3’ nukleotido zikliko fosfodiesterasa aktibitatea

(Nishizawa eta lank., 1980) lagina bromotimol urdina eta imidazol-HCL

indargetzailearekin inkubatu ondoren neurtu zen espektrofotometrikoki.

2.4.2. Zatiki nuklearra.

DNA edukina (Cesarone eta lank., 1979) lagina ilunpean 33258 Hoechst-arekin inkubatu

ondoren neurtu zen fluorimetrikoki.

Metodoak

Doktore-tesia

76

2.4.3. Zatiki sinaptosomala.

Hauspeakin sinaptosomalak lortu eta tratatu ondoren mikroskopio elektronikoa erabili zen

hauek konfirmatzeko.

2.5. Peptidasen aktibitatearen determinazio fluorimetrikoa.

Fluoreszentzia molekula askok duten ezaugarri fisikoa da. Zenbait molekulak behar

baino energia gehiago jasotzean (egitura elektronikoa kitzikatzean) ohiko egoera

energetikora berriz bilakatzeko argia igortzen dute. Ahalmen honi fluoreszentzia deritzogu

eta ezaugarri honek molekula hoiek oso erabilgarriak bihurtzen ditu ikerkuntzarako.

Peptidasen ikerketarako sustrato artifizialen artean erabilienak β–naftilaminaren eratorri

aminoazidikoak dira, non aminoazidoa amida lotura batez lotzen zaion sustrato artifizialari.

Aminoazil-β–naftilamida molekula honen gain aminopeptidasa jakin batek eragitean,

askatutako β–naftilamina ziklatu egiten da ahalmen fluoreszentea bereganatuz.

Gure esperimentuetan erreakzio entzimatikoa ikertzeko, agertzen zen β–naftilamina

(produktu fluoreszentea) 345 nm-ko uhin luzera duen argi igorpen batez kitzikatu eta,

412nm-ko uhin luzeran β–naftilamina honek, egonkortzeko, igortzen duen fluoreszentzia

neurtzen genuen. Lortutako fluoreszentziaren balio numerikoak, β–naftilamina

kontzentrazio jakinez egindako fluoreszentzia patroi-zuzen batean interpolatzen genituen,

erreakzioan zehar sortu den β–naftilamina kantitatea kalkulatzeko (Greenberg, 1962) (Alba

eta lank., 1989).

Neurtu beharreko laginari sustratoa gehitu eta 37º C-tan (giza tenperatura fisiologikoan)

30 minututan zehar inkubatzen uzten da. Laginean dauden aminopeptidasek sustratoa

(aminoazil-β–naftilamida) anderatuko dute eta askatutako fluoreszentzia plakazko

fluorimetroaren bitartez neurtuko zen.

Metodoak

Doktore-tesia

77

Plaketako ontzitxoetan jarri beharreko lagin eta sustratu kantitateak eta aminoazil-β–

naftilamida motak ezberdinak ziren neurtu nahi zen aminopeptidasaren arabera:

Alanil aminopeptidasa, APN (edo APM) eta AP MII aktibitateak neurtzeko: 10

µl lagin eta 290 µl sustrato (alanil-β–naftilamida).

Prolil endopeptidasa aktibitatea neurtzeko: 30 µl lagin eta 270 µl sustrato (prolil-

β–naftilamida).

Arginil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko: 10 µl lagin eta 290 µl sustrato

(arginil-β–naftilamida).

Leuzil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko: 30 µl lagin eta 270 µl sustrato

(leuzil-β–naftilamida).

Piroglutamil peptidasa aktibitatea neurtzeko: 60 µl lagin eta 240 µl sustrato

(piroglutamil-β–naftilamida).

Aspartatil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko: 60 µl lagin eta 240 µl sustrato

(aspartil-β–naftilamida).

Entzima batzuen aktibitateak izatez txikiagoak direnez, sortutako fluoreszentzia

neurgarria izan zedin, lagin kantitate handiagoak erabili behar izan genituen. Gainera aldez

aurretik kalkulatuta izan genuen kantitate eta denbora hauekin aktibitatea kurbaren zati

linealean zegoela.

Aminopeptidasen aktibitatearen balioak Peptidasa Aktibitate – Unitateetan (PAU)

ematen dira. Unitate hauek sustrato fluorogenikoaren pikomol bat minutuko hidrolisatzen

duen entzima kantitatea adierazten dute. Azkenengo emaitza aktibitate espezifiko bezala

ematen da; hau da, PAU mg proteina bakoitzeko (PAU/mg proteina).

Metodoak

Doktore-tesia

78

2.6. Proteinen neurketa:

Laginetan dagoen proteina kontzentrazioa kalkulatzeko metodoa Coomasie urdin

disdiratsu izeneko koloranteak polipeptidoekiko duen afinitatean oinarritzen da (Bradford,

1976). Teknika kolorimetrikoa da, hau da, zenbait konposatu kimikok argia zurgatzeko

duten gaitasunean oinarritzen da.

Kolorantea proteinekin lotu eta gai kimiko horren zurgapenaren uhin luzeran aldaketa

bat gertatzen da, 465 nm-tik 595 nm-tara pasaz. Zurgapen gehikuntza, kolorantea

saturantea izanik, proteina kontzentrazioarekiko zuzenki proportzionala da. Honela,

absortzioaren gehikuntza espektrofotometro edo kolorimetro batean neurtuz proteina

kantitate ezagunekin egindako zurgapen patroi-zuzen batean interpola daiteke.

Gure esperimentuetan 10 ml lagin 2 ml Bradford erreaktiborekin inkubatu (5 min) eta

sahodi bakoitzeren edukinaren absorbantzia fotometroan neurtzen genuen, absortzioaren

uhin-luzera kontrolatzen duen monomarkadorea 595 nm-tan finkatuz.

Patroi-zuzena egiteko, behi-seroalbuminaz prestatutako kontzentrazio jakineko

alikuotaren µl ezberdinak jarri eta bakoitza Bradford erreaktiboaren 2ml-rekin inkubatzen

genituen. Lortutako absorbantziaren emaitzak, kontzentrazioarekiko proportzionaltasun

zuzena azaltzen duen Y= aX + b funtzio zuzen batera doitzen direla ikusi eta zuzen

horretan gure laginekin lortutako absorbantzia balioak interpolatzen genituen.

2.7. Metodo estatistikoa

Tesi honetan, egindako neurketa eta planteatutako talde moten arabera metodo

estatistiko ezberdinak erabili dira konparaketen esangarritasuna jakiteko:

Metodoak

Doktore-tesia

79

Zatiki azpizelularren aktibitate peptidasikoek emandako datuak eta baita

purotasunaren frogaren datuak bide bateko bariantzaren analisiaren (ANOVA)

bitartez tratatu ziren.

NSZ-aren atal ezberdinetako peptidasa aktibitateak (gizaki eta arratoi garunean)

bide bateko bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez tratatu ziren. Espezie arteko

konparaketa berriz, parekatu gabeko T Student test-aren bitartez egin zen.

Gizaki heroinazaleen garunaren peptidasa aktibitateak beraien kontrolekin

konparatu ziren neurri errepikatutako bariantza analisiaren (ANOVA) bitartez.

Opiazeoekin tratatutako animalien aktibitate entzimatikoak (morfina eta

naloxona taldeak) beraien kontrolekin konparatu ziren parekatutako T Student test-

aren bidez.

Erabilitako programa estatistikoak SPSS 11.0, Instat eta Kyplot 2..0 izan dira.

IV. Emaitzak

Emaitzak

Doktore-tesia

81

1. Gizaki eta arratoiaren garun kortexeko peptidasa

ezberdinen banaketa azpizelularra:

Hurrengo 11 tauletan eta dagozkien 22 irudietan gizaki eta arratoi tratatugabeen garun

kortexeko zatiki azpizelularretako aktibitate peptidasikoak azaltzen dira. Aukeratutako

zatikiak sinaptosomak (Sp), mitokondriak (Mt), mikrosomak (Mr), nukleoa (N), zitosola

(Zit) eta zatiki mielinikoa (Miel) izan dira.

Aktibitateen baloreak mg proteinako peptidasa aktibitate unitateetan eman dira

(PAU/mg proteina), batazbestekoak eta estandart erroreak (S.E) azaltzen direlarik.

Datuen konparaketa bide bateko bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da.

Lortutako probabilitateak honela adierazi dira: P< 0.05, P< 0.01 edo P< 0.005 datu

esangarrientzako, eta (e.e.) batekin ez esangarriak zirenean.

Datuen irakurketa errazteko, lehenengo atal batean zatiki solugarriko peptidasen

aktibitateak azaltzen dira eta bigarren atalean mintzari lotutako entzimen aktibitateak.

Hirugarren zatian zatiki azpizelularren purotasuna frogatzeko egindako entseiuen

emaitzak aurkezten dira. Laugarrenean hil-osteko atzerapena edo postmortem delay-ak eta

laginen izozte denborak aktibitate entzimatikoaren gain eragiten duen jakiteko egindako

korrelazio ikerketaren datuak agertzen dira.

1.1. Peptidasa solugarriak:

1.1 Taulan eta 1.1 eta 2.2 irudietan PSA solugarriak (EC 3.4.11.14) zatiki azpizelular

ezberdinetan emandako baloreak azaltzen dira. Banaketa bai gizakian eta bai arratoian

nahiko homogeneoa eta antzekoa izan arren balore altuenak sinaptosoma eta zitosol mailan

ikusi dira. Aktibitate txikiena mikrosometan eman da (ANOVA: P< 0.05, gizakian;

P<0.005 arratoian).

1.2 Taulan eta 1.3-4. irudian prolil endopeptidasa solugarriaren (EC 3.4.21.26) aktibitateak

deskribatzen dira. Nahiko homogeneoki banatzen da entzima hau zatikietan eta espezie

Emaitzak

Doktore-tesia

82

arteko antzekotasuna dago banaketari dagokionez. Zitosolean azaldu dira aktibitate

nagusiak eta zatiki mikrosomalean txikienak (ANOVA: P< 0.05, gizakian; P< 0.05

arratoian).

1.3. Taulan eta 1.5-6. irudietan arginil aminopeptidasaren edo APB-aren (EC 3.4.11.6)

banaketa azpizelularrak aurkezten dira gizaki eta arratoi garun kortexean. Espezie bietan

banaketa patroi antzekoa ikusi dugu; aktibitate nagusiak sinaptosoma eta mitokondrietan

eta baxuenak mikrosometan neurtu dira (ANOVA: P< 0.01, gizakian; P<0.01 arratoian).

1.4. Taulan eta 1.7-8. irudietan leuzil aminopeptidasa aktibitatearen (EC 3.4.11.1) banaketa

azpizelularra azaltzen dira. Kasu honetan ere espezie bietan ia banaketa berbera ikus

daiteke, sinaptosometako aktibitatea beste zatiki azpizelular bakoitzean baino bi bider

handiagoa delarik (ANOVA: P< 0.005, gizakian; P<0.005 arratoian).

1.5. Taulan eta 1.9-10. irudietan piroglutamil peptidasa I solugarriaren (EC 3.4.19.3)

aktibitateak aurkezten ditugu gizaki zein arratoien garun kortexaren zatiki azpizelularretan.

Espezie bietan sinaptosometako aktibitatea zatiki guztien ia erdia dela ikusi da. Aktibitate

baxuenak nukleo eta zitosolean agertu dira (ANOVA: P< 0.005, gizakian; P<0.005

arratoian).

1.6. Taulan eta 1.11-12. irudietan aspartil aminopeptidasa solugarriaren (EC 3.4.11.7)

banaketa azpizelularra ikus daiteke. Kasu honetan ere sinaptosometako aktibitateak oso

altuak dira sinaptosometan eta baxuenak berriro azaltzen dira nukleo eta zitosolean

(ANOVA: P< 0.005, gizakian; P<0.005 arratoian).

Laburbilduz beraz, peptidasa solugarrien banaketari dagokionez espezie bietan

zatikietako banaketa – patroi antzekoa ikusi dugu, aktibitate altuenak sinaptosoma mailan

agertu direlarik, prolil endopeptidasaren kasuan izan ezik.

1.2. Mintzari lotutako peptidasak:

1.7. Taulan eta 1.13-14. irudietan mintzari lotutako PSA (AP MII edo EC 3.4.11.14)

aktibitateak azaltzen dira. Bai gizakian eta bai arratoian banaketa azpizelularra nahiko

homogeneoa da, baina kasu honetan espezie bien arteko antzekotasun txikiagoa dago.

Emaitzak

Doktore-tesia

83

Gizakiaren kasuan zatiki mikrosomalean ikusi dira balore altuenak eta mitokondriatan

txikienak (ANOVA: P<0.05). Arratoian berriz, nahiz eta sinaptosoma mailan agertu balore

altuenak eta mitokondrietan txikienak konparaketa ez da esangarria izan (ANOVA: P >

0.05).

1.8. Taulan eta 1.15-16. irudietan puromizinarekiko erresistentea den alanil

aminopeptidasa N-ren (EC 3.4.11.2) banaketa azpizelularra deskribatzen da. Oraingo honetan

banaketa nahiko homogeneoa eta antzekoa espezie artean gertatu da. Nukleoetan eman dira

aktibitate handienak eta mitokondrietan txikienak (ANOVA: P< 0.01, gizakian; P< 0.05

arratoian).

1.9. Taulan eta 1.17-18. irudietan mintzari lotutako prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26)

aktibitateak deskribatzen dira. Bai gizaki zein arratoian aktibitate handienak zatiki

sinaptosomala eta mielinikoan agertu dira, beste zatikietakoa baino %10-15 handiagoa

delarik (ANOVA: P<0.05, gizakian; P< 0.05 arratoian).

1.10. Taulan eta 1.19-20. irudietan mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I entzimaren

(EC 3.4.19.13) banaketa azpizelularra aurkezten da. Bai gizakian eta arratoian banaketa

antzekoa gertatu da, mielina eta sinaptosometako aktibitateak beste zatikietakoa baino %15

handiagoa delarik (ANOVA: P< 0.005, gizakian; P< 0.005 arratoian).

1.11. Taulan eta 1.21-22. irudietan mintzari lotutako aspartil aminoeptidasaren (EC 3.4.11.7)

banaketa azpizelularra agertzen da. Kasu honetan espezie arteko antzekotasun handia

azaldu da eta banaketa oso homogeneoa gertatu da. Konparaketak ez dira esangarriak izan

(ANOVA: P>0.05 gizakian eta arratoian).

Laburbilduz, mintzari lotutako peptidasen banaketa entzima motaren arabera

ezberdintsuagoa izan da eta konparaketa ez esangarri gehiago azaldu dira, nahiz eta hemen

ere espezie arteko antzekotasuna gutxi gora behera mantendu izan.

Emaitzak

Doktore-tesia

84

PSA solugarria (Banaketa azpizelularra)

1.1. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien PSA solugarriaren aktibitate balioak

aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki azpizelularretan.

Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak

batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa bariantzaren

analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan

daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Sinaptosomak 49287 9902 43034 6441

Mitokondriak 37233 4965 29820 2458

Mikrosomak 31943 2718 21782 1854

Nukleoa 34145 2289 30892 1679

Zitosola 45250 3008 40165 3806

ANOVA P<0.05 ANOVA P<0.001

Emaitzak

Doktore-tesia

85

PSA solugarria

(Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp25%

Mt19%

Mr16%

N 17%

Zit23%

1.1. Irudia

Arratoia

Sp26%

Mt18%

Mr13%

N 19%

Zit24%

1.2. Irudia

1.1–1.2 Irudiak. Zatiki solugarriko PSA aktibitateari dagozkion emaitzen irudiak.

Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:

Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta Zitosola (Zit).

Emaitzak

Doktore-tesia

86

Prolil endopeptidasa solugarria (Banaketa azpizelularra)

1.2. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien prolil endopeptidasa solugarriaren

aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki

azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa

bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria

(e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Sinaptosomak 21755 8340 8340 1217

Mitokondriak 23035 8870 8870 1221

Mikrosomak 16124 6019 6019 1307

Nukleoa 21500 6430 6430 292

Zitosola 27642 10002 10002 1382

ANOVA P<0.01 ANOVA P<0.01

Emaitzak

Doktore-tesia

87

Prolil endopeptidasa solugarria

(Banaketa azpizelularra)

GizakiaSp

20%

Mt21%

Mr15%

N 20%

Zit24%

1.3. Irudia

Arratoia

Sp21%

Mt22%

Mr15%

N 16%

Zit26%

1.4. Irudia 1.3–1.4 Irudiak. Zatiki solugarriko prolil endopeptidasa aktibitateari dagozkion emaitzen

irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:

Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta Zitosola (Zit).

Emaitzak

Doktore-tesia

88

Arginil aminopeptidasa (Banaketa azpizelularra)

1.3. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien arginil aminopeptidasaren aktibitate

balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki

azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa

bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria

(e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Sinaptosomak 23648 3199 43569 6052

Mitokondriak 21673 3677 36024 7506

Mikrosomak 3470 1001 6599 1830

Nukleoa 9432 1277 25433 2881

Zitosola 14370 2330 33004 5468

ANOVA P<0.01 ANOVA P<0.01

Emaitzak

Doktore-tesia

89

Arginil aminopeptidasa

(Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp32%

Mt30%

Mr5%

N 13%

Zit20%

1.5. Irudia

Arratoia

Sp29%

Mt25%

Mr5%

N 18%

Zit23%

1.6. Irudia 1.5–1.6 Irudiak. Zatiki solugarriko arginil aminopeptidasa aktibitateari dagozkion emaitzen

irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:

Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta Zitosola (Zit).

Emaitzak

Doktore-tesia

90

Leuzil aminopeptidasa (Banaketa azpizelularra)

1.4. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien leuzil aminopeptidasaren aktibitate

balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki

azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa

bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria

(e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Sinaptosomak 1139 260 1526 320

Mitokondriak 480 137 721 120

Mikrosomak 416 62 533 90

Nukleoa 378 72 406 94

Zitosola 405 50 504 93

ANOVA P<0.005 ANOVA P<0.005

Emaitzak

Doktore-tesia

91

Leuzil aminopeptidasa

(Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp41%

Mt17%

Mr15%

N 13%

Zit14%

1.7. Irudia

Arratoia

Sp41%

Mt20%

Mr14%

N 11%

Zit14%

1.8. Irudia 1.7–1.8 Irudiak. Zatiki solugarriko leuzil aminopeptidasa aktibitateari dagozkion emaitzen

irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:

Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta Zitosola (Zit).

Emaitzak

Doktore-tesia

92

Piroglutamil peptidasa I solugarria (Banaketa azpizelularra)

1.5. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien piroglutamil peptidasa I

solugarriaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun

kortxeko zatiki azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman

dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau

esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo

p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Sinaptosomak 2956 648 3203 868

Mitokondriak 1597 332 1170 274

Mikrosomak 1184 438 757 155

Nukleoa 602 109 533 113

Zitosola 653 138 720 123

ANOVA P<0.005 ANOVA P<0.005

Emaitzak

Doktore-tesia

93

Piroglutamil peptidasa I solugarria

(Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp42%

Mt23%

Mr17%

N 9%

Zit9%

1.9. Irudia

Arratoia

Sp51%

Mt18%

Mr12%

N 8%

Zit11%

1.10. Irudia 1.9–1.10 Irudiak. Zatiki solugarriko piroglutamil peptidasa I aktibitateari dagozkion

emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak

azaltzen dira: Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta

Zitosola (Zit).

Emaitzak

Doktore-tesia

94

Aspartil aminopeptidasa solugarria (Banaketa azpizelularra)

1.6. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien aspartil aminopeptidasa solugarriaren

aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki

azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa

bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria

(e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Sinaptosomak 1241 142 1425 286

Mitokondriak 490 87 505 80

Mikrosomak 297 44 337 39

Nukleoa 179 18 146 15

Zitosola 188 32 165 24

ANOVA P<0.005 ANOVA P<0.005

Emaitzak

Doktore-tesia

95

Aspartil aminopeptidasa solugarria

(Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp53%

Mt20%

Mr12%

N 7%

Zit8%

1.11. Irudia

Arratoia

Sp55%

Mt20%

Mr13%

N 6%

Zit6%

1.12. Irudia 1.11–1.12 Irudiak. Zatiki solugarriko aspartil aminopeptidasa aktibitateari dagozkion

emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak

azaltzen dira: Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta

Zitosola (Zit).

Emaitzak

Doktore-tesia

96

Mintzari lotutako PSA (AP MII) (Banaketa azpizelularra)

1.7. Taula. Taula honetan hurrengo irudiari dagozkion AP MII-aren aktibitate balioak

aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki azpizelularretan.

Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak

batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa bariantzaren

analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan

daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Mielina 14211 1855 12083 1467

Sinaptosomak 13568 2524 9182 1303

Mitokondriak 8471 1516 7436 1086

Mikrosomak 15789 2386 8500 970

Nukleoa 8769 1483 8061 1439

ANOVA P<0.05 ANOVA e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

97

Mintzari lotutako PSA (AP MII) (Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp22%

Mt14%

Mr27%

N14%

Miel23%

1.13. Irudia

Arratoia

Sp20%

Mt16%

Mr19%

N18%

Miel27%

1.14. Irudia 1.13–1.14 Irudiak. Mintzari lotutako PSA (AP MII) aktibitateari dagozkion emaitzen

irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:

Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr) eta Nukleoa (N).

Emaitzak

Doktore-tesia

98

Alanil aminopeptidasa N (APN) (Banaketa azpizelularra)

1.8. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien APN-aren aktibitate balioak

aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki azpizelularretan.

Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak

batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa bariantzaren

analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan

daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Mielina 2486 229 1979 224

Sinaptosomak 2662 340 2068 402

Mitokondriak 1958 282 1850 322

Mikrosomak 3146 398 1973 298

Nukleoa 4622 847 3617 751

ANOVA P<0.01 ANOVA P<0.05

Emaitzak

Doktore-tesia

99

Alanil aminopeptidasa N (APN) (Banaketa azpizelularra)

GizakiaSp

18%

Mt13%

Mr21%

N31%

Miel17%

1.15. Irudia

Arratoia

Sp18%

Mt16%

Mr17%

N32%

Miel17%

1.16. Irudia 1.15–1.16 Irudiak. Mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N (APN) aktibitateari

dagozkion emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki

azpizelularrak azaltzen dira: Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt),

Mikrosomak (Mr) eta Nukleoa (N).

Emaitzak

Doktore-tesia

100

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa aktibitatea (Banaketa azpizelularra)

1.9. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien mintzari lotutako prolil

endopeptidasaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun

kortxeko zatiki azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman

dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau

esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo

p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Mielina 4826 319 2483 249

Sinaptosomak 5181 631 2156 241

Mitokondriak 3059 436 1127 79

Mikrosomak 3902 562 1140 172

Nukleoa 2636 380 1185 261

ANOVA P<0.05 ANOVA P<0.05

Emaitzak

Doktore-tesia

101

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa aktibitatea (Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp26%

Mt16%

Mr20%

N13%

Miel25%

1.17. Irudia

Arratoia

Sp27%

Mt14%

Mr14%

N15%

Miel30%

1.18. Irudia 1.17–1.18 Irudiak. Mintzari lotutako prolil endopeptidasa aktibitateari dagozkion emaitzen

irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:

Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr) eta Nukleoa (N).

Emaitzak

Doktore-tesia

102

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I (Banaketa azpizelularra)

1.10. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien mintzari lotutako piroglutamil

peptidasa I -en aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun

kortxeko zatiki azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman

dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau

esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo

p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Mielina 527 83 399 65

Sinaptosomak 396 85 358 47

Mitokondriak 239 29 198 25

Mikrosomak 229 35 209 33

Nukleoa 245 39 224 30

ANOVA P<0.005 ANOVA P<0.005

Emaitzak

Doktore-tesia

103

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I (Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp24%

Mt15%

Mr14%

N15%

Miel32%

1.19. Irudia

Arratoia

Sp26%

Mt14%

Mt15%

N16%

Miel29%

1.20. Irudia 1.19–1.20 Irudiak. Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I aktibitateari dagozkion

emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak

azaltzen dira: Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr) eta

Nukleoa (N).

Emaitzak

Doktore-tesia

104

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa (Banaketa azpizelularra)

1.11. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien mintzari lotutako aspartil

aminopeptidasaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun

kortxeko zatiki azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman

dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau

esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo

p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

Zatiki

azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)

Mielina 342 70 334 87

Sinaptosomak 334 68 341 96

Mitokondriak 255 78 258 51

Mikrosomak 253 50 256 32

Nukleoa 232 46 269 43

ANOVA e.e ANOVA e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

105

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa (Banaketa azpizelularra)

Gizakia

Sp24%

Mt18%

Mr18%

N16%

Miel24%

1.21. Irudia

Arratoia

Sp23%

Mt18%

Mr18%

N18%

Miel23%

1.22. Irudia 1.20–1.22 Irudiak. Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa aktibitateari dagozkion

emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak

azaltzen dira: Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr) eta

Nukleoa (N).

Emaitzak

Doktore-tesia

106

1.3. Markatzaile azpizelularrak:

Aztertutako zatiki azpizelularren purotasuna ezagutzeko zatiki bakoitzarekiko

espezifikoak diren entzimen aktibitateak neurtu dira.

1.12. Taulan gizaki eta arratoian entzima hauen banaketa azpizelularra azaltzen da. Kasu

honetan garun kortexaren homogenatuak emandako balorea %100-tzat hartuz beste

zatikietako aktibitate baloreak homogenatu honekiko portzentaietan eman dira.

Konparaketak bide bateko bariantzaren analisiarekin (ANOVA) egin dira.

Zatiki sinaptosomalaren purotasuna azaltzeko mikroskopio elektronikoz eginiko

argazkia aurkezten da (1. Argazkia).

1.4. Aktibitate entzimatikoa, hil-osteko atzerapena eta izozte denbora:

Gizakiaren garunen kasuan, organu hau atera baino lehen pasatutako hil-osteko

atzerapenak eta izozkailuan pasatutako denborak aktibitate entzimatikoaren gain eragiten

duenentz ziurtatzeko korrelazio ikerketa estatistiko bat egin da. PSA solugarria eta APB-a

entzima aktibitateak lagintzat hartuz, baldintza fisiko hauek aktibitate entzimatikoan

eraginik ez dutela ikus daiteke 1.13-1.14 eta 1.15-1.16 tauletan. (PSA: R= 0.115, P= 0.505

pm delay-aren kasuan eta R= 0.034, P= 0.851 izozte denboraren kasuan. APB: R= 0.016, P=

0.934 eta R= 0.045, P= 0.823).

Em

aitz

ak

Dok

tore

-tes

ia

107

Sukz

inat

o de

shid

roge

nasa

DN

A

C Z

itokr

omo

erre

dukt

asa

Lak

tato

de

shid

roge

nasa

2’-3

’ Zik

liko

nukl

otid

asa

Giza

kia

Arra

toia

Giza

kia

Arra

toia

Giza

kia

Arra

toia

Giza

kia

Arra

toia

Giza

kia

Arra

toia

Hom

ogen

atu

a (S

/M

) %

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

S 74

68

25

18

58

80

26

1 24

4 -

- Si

napt

osom

akM

108

120

30

24

64

77

- -

140

134

S 71

76

45

45

29

28

11

9 10

8 -

- M

itoko

ndri

akM

174

200

14

32

39

44

- -

35

57

S 19

25

40

30

55

60

55

60

-

- M

ikro

som

ak

M28

34

19

32

22

3 24

8 -

- 11

0 10

7 S

32

28

19

24

32

35

32

35

- -

Nuk

leoa

M

84

84

260

176

26

33

- -

100

71

Zito

sola

60

44

11

12

45

43

25

0 16

7 -

- M

ielin

a 70

48

60

63

40

54

-

- 30

0 42

9

AN

OV

A: P

<

< 0

.005

<

0.0

05

< 0

.005

<

0.0

05

< 0

.005

<

0.0

05

< 0

.005

<

0.0

05

< 0

.005

< 0

.005

1.12

. Tau

la

Emaitzak

Doktore-tesia

108

1. Argazkia. Arratoiaren garuneko prestakin baten zatiki sinaptosomalen argazkia.

Mintzez inguraturiko egitura gehienak (%70) sinaptosomak dira (bixikula sinaptikoak edo

SV). Ikus daitezkeen beste egiturak lotura sinaptikoak dira (SJ). Eskala: 1mm. Handipena:

x10.000.

Emaitzak

Doktore-tesia

109

1.13-1.14 Taulak

PSA solugarria

0

25000

50000

75000

100000

0 10 20 30 40 50 60

Hil-osteko atzerapena (orduak)

PA

U/m

g pr

otei

na

PSA solugarria

0

25000

50000

75000

100000

0 5 10 15 20 25 30

Izozte denbora (hilabeteak)

PA

U/m

g pr

otei

na

Emaitzak

Doktore-tesia

110

1.15-1.16 Taulak

APB

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 10 20 30 40 50 60

Hil-osteko atzerapena (orduak)

PA

U/m

g pr

otei

na

APB

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 10 20 30 40 50 60

Izozte denbora (hilabeteak)

PA

U/m

g pr

otei

na

Emaitzak

Doktore-tesia

111

2. Gizaki eta arratoiaren NSZ-ko peptidasa ezberdinen

banaketa erregionala.

Hurrengo 11 tauletan eta dagozkien grafikatan gizaki eta arratoi tratatugabeen NSZ-ko

atal ezberdinetako aktibitate peptidasikoak azaltzen dira. Aukeratutako garun guneak 7 izan

ziren, amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K), kortex prefrontala

(PF), okzipitala (O) eta parietala (P) hain zuzen.

Aktibitateen baloreak mg proteinako peptidasa aktibitate unitateetan eman dira

(PAU/mg proteina), batazbestekoak eta estandart erroreak (S.E) azaltzen direlarik.

Taula eta grafiketan adierazten diren konparaketak gizakia eta arratoiaren arteko

aktibitate peptidasikoena da. Konparaketa horretarako parekatu gabeko T Student-a erabili

dugu tresna estatistiko bezala. Lortutako probabilitateak honela adierazi dira: P< 0.05 (*),

P< 0.01 (**) edo P< 0.005 (***) datu esangarrientzako, eta (e.e.) batekin ez esangarriak

zirenean.

Banaketa erregionalean aldakuntza esangarriak gertatu diren kasuetan (guneetako

aktibitateak ANOVA bitartez konparatuz), hauek tauletan adierazten dira. Banaketa

homogeneoa edo berezitasun esangarririk egon ez den kasuetan ez da ezer adierazi tauletan.

Datuen irakurketa errazteko, lehenengo atal batean zatiki solugarriko peptidasen

aktibitateak azaltzen dira eta bigarren atalean mintzari lotutako entzimen aktibitateak.

2.1. Peptidasa solugarriak:

2.1 Taulan eta 2.1 grafikan PSA solugarriak (EC 3.4.11.14) NSZ-ko atal ezberdinetan

emandako baloreak azaltzen dira. Aktibitatea bai gizakian eta bai arratoiaren garuneko atal

guztietan ikusi den arren, gizakiaren kasuan kortexean agertutako baloreak beste

guneetakoa baino txikiagoak izan dira (ANOVA: P < 0.05).

Alderantziz, aktibitate espezifikoa gizakiaren kasuan arratoiarena baino handiagoa dela

atal guztietan ikusi dugu; hipotalamoaren kasuan adibidez, ia %46 handiagoa.

Emaitzak

Doktore-tesia

112

2.2 Taulan eta 2.2 grafikan prolil endopeptidasa solugarriaren (EC 3.4.21.26) banaketa

erregionala deskribatzen da. Kasu honetan, giza garuneko kortexean PEP aktibitatea

aztertutako beste ataletan baino askoz handiagoa da (ANOVA: P< 0.005). Arratoi

garunean berriz, banaketa nahiko homogeneoa ikusi dugu.

Bestalde gizakiaren prolil endopeptidasa aktibitatea arratoiarenaren hirukoitza edo

laukoitza dela ikus daiteke (T student: P<0.005, atal guztietan).

2.3 Taulan eta bere grafikan arginil aminopeptidasa edo APB-aren (EC 3.4.11.6)

aktibitateak ikus daitezke. Entzima hau aztertutako garuneko atal guztietan banatzen da,

baina giza garun kortexeko mailak beste guneetakoa baino txikiagoak izan dira (ANOVA:

P< 0.05).

Kasu honetan, lehenengo bietan ez bezala, arratoi garunean azaldutako aktibitateak

gizakiarenak baino ia %50 handiagoak direla ikusi da (T student: P<0.005 atal guztietan

hipokanpoan izan ezik, non P< 0.05).

2.4 Taulan eta dagokion grafikan leuzil aminopeptidasaren (EC 3.4.11.1) banaketa

erregionala aurkezten da. Orokorrean, entzima atal guztietan banatzen da eta espezie arteko

konparaketan aipagarriena gizakiaren kortexeko aktibitate handiagoa izan da (T Student: P<

0.05 kortex parietalean).

2.5. eta 2.6 Tauletan eta grafiketan piroglutamil peptidasaren (EC 3.4.19.3) eta aspartil

aminopeptidasa (EC 3.4.11.17) solugarrien banaketa erregionala azaltzen da, hurrenez

hurren. Entzima hauetan ez zen ezberdintasun esangarririk ikusi ezta banaketan ezta

espezie arteko konparaketan.

Laburtuz eta espezie arteko konparaketari dagokionez, aipatu beharra dago gizakian

agertutako prolil endopeptidasa eta PSA aktibitate altuagoak eta arratoian ikusitako arginil

aminopeptidasa aktibitate handiagoa. Era berean aipagarria da, gizakiaren garunean emandako

PEP-ren banaketa, non kortexean beste ataletan baino aktibitate askoz handiagoak neurtu

ziren; eta alderantziz, gizaki atal berbereko PSA eta APB maila eskasagoak.

Emaitzak

Doktore-tesia

113

2.2. Mintzari lotutako peptidasak:

2.7 Taulan eta dagokion grafikan mintzari lotutako PSA (AP MII, PSA edo EC

3.4.11.14) aktibitateak aurkezten dira. Banaketari dagokionez kortexeko aktibitatea beste

atal batzuetan (amigdala, hipotalamoa eta hipokanpoa) baino pixkat txikiagoak izan dira

(ANOVA: P<0.005, gizakian). Espezie artean kasu honetan ere gizaki garunean aktibitatea

handiagoa izan da (T student: P< 0.01 hipotalamo eta hipokanpoan; P<0.05 kortex

frontalean).

2.8. Taula eta grafikan alanil aminopeptidasa N (APN edo EC 3.4.11.2) aktibitateak

azaltzen dira, non ez den ikusten berezitasun esangarririk ezta banaketa erregionalean ezta

espezie arteko konparaketan.

2.9. Taula eta grafikan mintzari lotutako prolil endopeptidasaren (EC 3.4.21.26) banaketa

erregionala azaltzen da. Hemen ere aktibitatea askoz handiagoa da gizakian (T student:

P<0.005 atal guztietan) eta gizakiaren NSZ-ko banaketari dagokionez, kortexean aktibitate

handiagoak aurkezten dira (ANOVA: P< 0.005).

2.10 eta 2.11 Tauletan eta dagozkien grafiketan mintzari lotutako piroglutamil peptidasa

(EC 3.4.19.13) eta aspartil aminopeptidasaren (EC 3.4.11.7) banaketa erregionala deskribatzen

dira. Kasu hauetan banaketak oso homogeneoak direla ikusi da eta ez da espezie arteko

konparaketa esangarririk azaldu.

Mintzari lotutako peptidasei dagokionez berriro errepikatzen dira giza garunean prolil

endopeptidasaren banaketa berezia, mintzari lotutako PSA-rena (esangarritasun

txikiagoarekin) eta baita entzima honen eta PEP-aren aktibitate handiagoak arratoiarekiko.

Emaitzak

Doktore-tesia

114

PSA solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.1. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion PSA solugarriaren aktibitate

balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune ezberdinetan.

Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak

batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student

test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo

kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 63676 4811 46798 3608 P<0.05

Hipotalamoa 69905 4431 38247 2630 P<0.005

Hipokanpoa 67187 2837 48148 2117 P<0.005

Kaudatua 69193 2117 47751 2839 P<0.005

Prefrontala 55079 2839 37603 2748 P<0.005

Okzipitala 57083 2748 39916 3287 P<0.01

Parietala 55399 3287 40831 3021 P<0.05

ANOVA (P< 0.05)

Emaitzak

Doktore-tesia

115

PSA solugarria

(NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

A Ht Hc K PF O P

APU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia

****

******

*** ***

2.1.Grafika. PSA solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa ardatzean

ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht),

hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta

parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

116

Prolil endopeptidasa solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.2 Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion prolil endopeptidasa solugarriaren

aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune

ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T

student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.

Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 8004 1200 3116 440 P< 0.005

Hipotalamoa 7118 856 2230 220 P< 0.005

Hipokanpoa 6650 660 3061 400 P< 0.005

Kaudatua 7999 880 3110 422 P< 0.005

Prefrontala 12888 1130 3111 419 P< 0.005

Okzipitala 14001 1133 2889 411 P< 0.005

Parietala 13536 1688 2996 200 P< 0.005

ANOVA (P< 0.005)

Emaitzak

Doktore-tesia

117

Prolil endopeptidasa solugarria

(NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

A Ht Hc E PF O P

APU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia***

*** ***

***

***

***

*** ***

2.2.Grafika. Prolil endopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa

ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),

hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),

okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),

P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

118

Arginil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.3. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion arginil aminopeptidasaren

aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune

ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T

student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.

Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 20951 2765 34671 2042 P<0.005

Hipotalamoa 18983 1911 28612 2053 P<0.005

Hipokanpoa 22596 2445 30861 2619 P<0.05

Kaudatua 20378 1520 32624 2728 P<0.005

Prefrontala 16291 1083 28062 1985 P<0.005

Okzipitala 16843 1308 30556 3068 P<0.005

Parietala 15139 1275 27875 2308 P<0.005

ANOVA (P<0.05)

Emaitzak

Doktore-tesia

119

Arginil aminopeptidasa solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia

***

****

***

*** ******

2.3.Grafika. Arginil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa ardatzean

ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht),

hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta

parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

120

Leuzil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2..4 Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion leuzil aminopeptidasaren aktibitate

balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune ezberdinetan.

Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak

batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student

test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo

kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 503 35 457 42 e.e

Hipotalamoa 477 87 386 39 e.e

Hipokanpoa 346 49 478 77 e.e

Kaudatua 447 90 450 65 e.e

Prefrontala 442 44 350 45 e.e

Okzipitala 523 71 349 34 e.e

Parietala 481 60 323 36 P<0.05

Emaitzak

Doktore-tesia

121

Leuzil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

100

200

300

400

500

600

700

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia

*

2.4.Grafika. Leuzil aminopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa

ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),

hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),

okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),

P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

122

Piroglutamil peptidasa I solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.5 Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion piroglutamil peptidasa I

solugarriaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko

gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 500 51 448 49 e.e

Hipotalamoa 496 56 504 77 e.e

Hipokanpoa 542 77 483 74 e.e

Kaudatua 411 80 482 65 e.e

Prefrontala 306 50 438 79 e.e

Okzipitala 464 67 415 49 e.e

Parietala 381 37 378 42 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

123

Piroglutamil peptidasa I solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

100

200

300

400

500

600

700

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia

2.5.Grafika. Piroglutamil peptidasa I solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa

ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),

hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),

okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),

P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

124

Aspartil aminopeptidasa solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.6. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion aspartil aminopeptidasa

solugarriaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko

gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 213 51 210 30 e.e

Hipotalamoa 200 30 185 25 e.e

Hipokanpoa 167 24 174 19 e.e

Kaudatua 205 25 197 23 e.e

Prefrontala 172 30 164 21 e.e

Okzipitala 185 26 164 22 e.e

Parietala 154 30 181 21 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

125

Aspartil aminopeptidasa solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

50

100

150

200

250

300

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia

2.6.Grafika. Aspartil aminopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa

ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),

hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),

okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),

P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

126

Mintzari lotutako PSA (AP MII) (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.7 Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion AP MII-aren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 17974 1088 13540 2722 e.e

Hipotalamoa 12158 1240 6731 832 P<0.01

Hipokanpoa 14337 1363 7568 1783 P<0.01

Kaudatua 11256 2131 9620 3091 e.e

Prefrontala 10445 1196 6130 1015 P<0.05

Okzipitala 9232 1137 8805 1731 e.e

Parietala 11302 933 8630 1047 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

127

Mintzari lotutako PSA (AP MII) (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

5000

10000

15000

20000

25000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia**

**

*

2.7 Grafika. Mintzari lotutako PSA-ri (AP MII) dagozkion emaitzen grafika. Abszisa

ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),

hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),

okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),

P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

128

Alanil aminopeptidasa N (APN) (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.8. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion APNaren aktibitate balioak

aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen

unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta

beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin

da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05,

p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 2878 615 3318 364 e.e

Hipotalamoa 2352 260 2706 368 e.e

Hipokanpoa 2476 356 3905 839 e.e

Kaudatua 2159 210 2776 424 e.e

Prefrontala 2931 707 2690 398 e.e

Okzipitala 2948 729 2776 478 e.e

Parietala 2468 480 2929 785 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

129

Alanina aminopeptidasa N (APN) (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

A Ht Hc K PF O P

APU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia

2.8 Grafika. Mintzari lotutako APN-ari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa ardatzean

ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht),

hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta

parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

130

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.9. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion mintzari lotutako prolil

endopeptidasaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko

gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 1155 182 800 164 P< 0.01

Hipotalamoa 955 102 400 67 P< 0.005

Hipokanpoa 800 124 488 94 P< 0.005

Kaudatua 1044 136 444 93 P< 0.005

Prefrontala 1600 156 467 80 P< 0.005

Okzipitala 1622 209 464 93 P< 0.005

Parietala 1533 173 412 44 P< 0.005

ANOVA (P<0.005)

Emaitzak

Doktore-tesia

131

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

A Ht Hc E PF O P

APU

/pro

tein

a m

g

GizakiaArratoia

**

******

***

******

***

2.9.Grafika. Mintzari lotutako prolil endopeptidasari dagozkion emaitzen grafika.

Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),

hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),

okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),

P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

132

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.10. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion mintzari lotutako piroglutamil

peptidasa I-ren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko

gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 345 41 436 88 e.e

Hipotalamoa 440 62 458 59 e.e

Hipokanpoa 482 101 517 81 e.e

Kaudatua 417 75 496 82 e.e

Prefrontala 465 84 414 47 e.e

Okzipitala 388 57 343 51 e.e

Parietala 388 39 417 43 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

133

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

100

200

300

400

500

600

700

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia

2.10 Grafika. Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I-ari dagozkion emaitzen grafika.

Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),

hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),

okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),

P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

134

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)

2.11. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion mintzari lotutako aspartil

aminopeptidasaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-

ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Gizakia Arratoiak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 256 58 327 61 e.e

Hipotalamoa 266 49 323 47 e.e

Hipokanpoa 210 40 296 42 e.e

Kaudatua 225 34 300 42 e.e

Prefrontala 228 28 267 36 e.e

Okzipitala 221 39 291 56 e.e

Parietala 226 27 276 35 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

135

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g GizakiaArratoia

2.11 Grafika. Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika.

Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),

hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),

okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),

P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

136

Emaitzak

Doktore-tesia

137

3. Heroinaren efektua giza garunaren kortex prefrontaleko

eta nukleo kaudatuko peptidasa ezberdinen gain.

Hurrengo 11 taula eta dagozkien grafiketan heroinazale eta beraien kontrolen garunen

aktibitate peptidasiko ezberdinak deskribatzen dira. Aztertutako atalak kortex prefrontala

eta nukleo kaudatua izan dira eta heroinak entzima hauen gain eraginik duenentz jakiteko

heroina taldea eta kontrolen arteko konparaketa egin da.

Kasuen kopurua nahiko txikia zenez (n= 8 kortexarentzako eta n= 5 kaudatuentzako),

BPO-ak anderatzen dituzten entzimen azterketarako, kasu bakoitzarekin esperimentu bat

baino gehiago egin da eta datu guztien tratamendurako Neurri Errepikatuko Bariantzaren

Analisia (ANOVA) erabili dugu. Kasu kopuruaren muga horri lagin kantitatearen eskasia

gehitu behar zitzaion; hori dela eta beste peptidasa talde hetereogenoaren artean guretzat

aipagarrienak direnekin ere (prolil endopeptidasa eta arginina aminopeptidasa) entseiuak

errepikatu ditugu eta tratamendu estatistiko berbera egin diegu. Besteekin berriz (Leu-AP,

ASP-AP eta Piroglutamil-P), n bakoitzeko esperimentu bakarra egin da eta heroina taldea

eta kontrolen arteko konparaketa egiteko parekatu gabeko T Student-a aplikatu dugu.

Aktibitateen baloreak mg proteinako peptidasa aktibitate unitateetan eman dira

(PAU/mg proteina), batazbestekoak eta estandart erroreak (S.E) azaltzen direlarik. Bai

ANOVA eta T Student-aren probabilitateak honela adierazi dira: P< 0.05 (* batekin

grafikan), P< 0.01 (**) edo P< 0.005 (***) datu esangarrientzako, eta (e.e.) batekin ez

esangarriak zirenean.

Datuen irakurketa errazteko, lehenengo atalean BPO-ak anderatzen dituzten

aminopeptidasa aktibitateak jarri ditugu eta bigarrenean beste peptidasa talde heterogeneoa

azaltzen dira.

3.1. BPO-ak anderatzen dituzten aminopeptidasak:

3.1. Taula eta 3.1. grafikan PSA (EC 3.4.11.2) solugarriaren aktibitatea azaltzen da. Bai

kortex prefrontalean bai kaudatuan heroina taldeko aktibitate entzimatikoa kontrolena

Emaitzak

Doktore-tesia

138

baino handiagoa dela ikusi dugu. Kortex prefrontalean %20 handiagoa da (ANOVA:

P<0.05).

3.2 - 3.3 Taula eta grafiketan mintzari lotutako PSA (AP MII edo EC 3.4.11.14) eta APN-

ak (EC 3.4.11.2) emandako baloreak aurkezten dira. Aktibitate hauek nahiko antzekoak

izan dira heroinazale eta kontrolen artean (ANOVA: e.e).

3.2 Beste peptidasak:

3.4.- 3.5 Tauletan eta dagozkien grafiketan prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26) solugarria

eta mintzari lotutakoaren aktibitateak deskribatzen dira. Kortex prefrontalean azaldutako

aktibitateak pixkat nahasiak izan dira, mintzari lotutako entzimaren mailak kontroletan

esangarriki altuagoak baitira (ANOVA: p<0.05) eta solugarriaren kasuan joera

alderantzizkoa baita (e.e). Kaudatuan berriz, kontroletan prolil endopeptidasa aktibitatea

handiagoa dela ikus daiteke (ANOVA: P<0.05 prolil endopeptidasa solugarrian).

3.6. Taulan eta bere grafikan arginil aminopeptidasa (EC 3.4.11.6) aktibitatea azaltzen da.

Entzima honen aktibitateak nahiko berdintsuak dira heroina taldean eta kontroletan

(ANOVA: P>0.05).

3.7. Taulan eta dagokion grafikan leuzil aminopeptidasa (EC 3.4.11.1) aktibitatea ikus

daiteke. Ez da balore esangarririk azaldu nahiz eta kortex prefrontalean heroina taldean

aktibitate handiagoak azaldu (T student: P>0.05).

3.8 – 3.9 Taula eta beraien grafiketan piroglutamil peptidasa I (EC 3.4.19.3) solugarriak eta

mintzari lotutakoak emandako baloreak azaltzen dira. Orokorrean ezin da ezberdintasun

handirik aipatu, entzima solugarriaren mailak heroinazaleen kortexean altuagoak izan arren

(T student: P>0.05).

3.10 – 3.11 Taula eta grafiketan aspartil aminopeptidasa (EC 3.4.11.7) solugarria eta

mintzari lotutakoa azaltzen dira. Kasu honetan ere ez da ezberdintasun esangarririk

agertzen (T student: P>0.05).

Guztiak laburtuz, datu esangarrienak PSA solugarrian eta prolil endopeptidasa entzimetan

azaldu dira. Lehenengoaren kasuan heroinazaleek aktibitate altuagoak azaldu dituzte

Emaitzak

Doktore-tesia

139

(P<0.05 kortex prefrontalean) eta bigarrenaren kasuan kontroletan agertu dira aktibitate

handiagoak (P<0.05: solugarria kaudatuan eta mintzari lotutakoa kortexean).

Emaitzak

Doktore-tesia

140

PSA solugarria

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.1. Taula. Taula honetan PSA solugarriaren aktibitateak heroinazaleen eta hauen

kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta estandar

erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU) minutuko

hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa neurri

errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**)

eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 51452 3892 42003 2597 P<0.05

Kaudatua 54279 4178 46635 3769 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

141

PSA solugarria

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

*

3.1. Grafika. Grafika honetan PSA solugarriaren aktibitateak heroinazaleen eta hauen

kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta estandar

erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza esangarrietan

P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

142

Mintzari lotutako PSA (Heroinazaleen NSZ-a)

3.2. Taula. Taula honetan mintzari lotutako PSA-aren aktibitateak heroinazaleen eta hauen

kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta estandar

erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU) minutuko

hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa neurri

errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**)

eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 9026 616 9140 677 e.e

Kaudatua 8267 710 9093 1015 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

143

Mintzari lotutako PSA

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

3.2. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako PSA (AP MII) aktibitateak heroinazaleen

eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta

estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza

esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

144

Mintzari lotutako alanina aminopeptidasa N (APN)

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.3. Taula. Taula honetan mintzari lotutako APN aktibitateak heroinazaleen eta hauen

kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta estandar

erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU) minutuko

hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa neurri

errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**)

eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 1333 103 1199 82 e.e

Kaudatua 1099 86 1114 106 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

145

Mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N (APN)

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

3.3. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N-ren (APN)

aktibitateak heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus

daitezke. Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira.

ANOVA klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***).

Emaitza ez esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

146

Prolil endopeptidasa solugarria

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.4. Taula. Taula honetan prolil endopeptidasa solugarriaren aktibitateak heroinazaleen eta

hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta

estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU)

minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa

neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01

(**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 17624 1073 16606 753 e.e

Kaudatua 8813 570 10405 631 P<0.05

Emaitzak

Doktore-tesia

147

Prolil endopeptidasa solugarria

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola*

3.4. Grafika. Grafika honetan prolil endopeptidasa solugarriaren aktibitateak heroinazaleen

eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta

estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza

esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

148

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.5. Taula. Taula honetan mintzari lotutako prolil endopeptidasaren aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira.

Batazbestekoak eta estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa

Unitatea (PAU) minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako

metodo estatistikoa neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan

P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 926 94 1250 148 P<0.05

Kaudatua 1694 118 2016 174 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

149

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

500

1000

1500

2000

2500

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

*

3.5. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako prolil endopeptidasa aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.

Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA

klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez

esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

150

Arginil aminopeptidasa

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.6. Taula. Taula honetan arginil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak heroinazaleen

eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta

estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU)

minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa

neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01

(**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 23045 1124 21993 873 e.e

Kaudatua 21066 1387 22885 1244 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

151

Arginil aminopeptidasa

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

3.6. Grafika. Grafika honetan arginil aminopeptidasa aktibitateak heroinazaleen eta hauen

kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta estandar

erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza esangarrietan

P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

152

Leuzil aminopeptidasa

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.7. Taula. Taula honetan leuzil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak heroinazaleen

eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta

estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU)

minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa

neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01

(**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 554 38 451 32 e.e

Kaudatua 392 88 390 91 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

153

Leuzil aminopeptidasa

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

100

200

300

400

500

600

700

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

3.7. Grafika. Grafika honetan leuzil aminopeptidasa aktibitateak heroinazaleen eta hauen

kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta estandar

erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza esangarrietan

P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

154

Piroglutamil peptidasa I solugarria

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.8. Taula. Taula honetan piroglutamil peptidasa I solugarriaren aktibitateak heroinazaleen

eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta

estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU)

minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa

neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01

(**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 132 20 112 9 e.e

Kaudatua 69 3 67 8 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

155

Piroglutamil peptidasa I solugarria

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

3.8. Grafika. Grafika honetan priroglutamil peptidasa I solugarriaren aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.

Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA

klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez

esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

156

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.9. Taula. Taula honetan mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I-ren aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira.

Batazbestekoak eta estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa

Unitatea (PAU) minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako

metodo estatistikoa neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan

P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 184 14 183 11 e.e

Kaudatua 131 11 137 7 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

157

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

50

100

150

200

250

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

3.9. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako priroglutamil peptidasa I-en aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.

Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA

klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez

esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

158

Aspartil aminopeptidasa solugarria (EC 3.4.11.7)

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.10. Taula. Taula honetan aspartil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira.

Batazbestekoak eta estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa

Unitatea (PAU) minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako

metodo estatistikoa neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan

P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 145 22 119 18 e.e

Kaudatua 95 17 90 10 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

159

Aspartil aminopeptidasa solugarria

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

3.10. Grafika. Grafika honetan aspartil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.

Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA

klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez

esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

160

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa

(Heroinazaleen NSZ-a)

3.11. Taula. Taula honetan mintzari lotutako aspartil aminopeptidasaren aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira.

Batazbestekoak eta estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa

Unitatea (PAU) minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako

metodo estatistikoa neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan

P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).

Heroina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batazbestekoa S.E

(+)Batazbestekoa S.E

(+)Probabilitatea

Kortexa 316 27 318 20 e.e

Kaudatua 188 13 232 24 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

161

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa

(Heroinazaleen NSZ-a)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Kortexa Kaudatua

PAU

/pro

tein

a m

g HeroinaKontrola

3.11. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako aspartil aminopeptidasaren aktibitateak

heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.

Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA

klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez

esangarriak (e.e).

Emaitzak

Doktore-tesia

162

Emaitzak

Doktore-tesia

163

4. Morfinarekiko tolerantzia eta abstinentzi sindromearen

efektua arratoiaren NSZ-ko gune ezberdinetako peptidasen

gain.

Atal honetan morfinarekin eta morfina eta naloxonarekin tratatutako arratoien eta

beraien kontrolen NSZ-ko 7 gune ezberdinetako peptidasa aktibitateak deskribatuko dira.

Aukeratutako garuneko atalak amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua

(K), kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P) izan dira.

Aktibitateen baloreak mg proteinako peptidasa aktibitate unitateetan eman dira

(PAU/mg proteina), batazbestekoak eta estandart erroreak (S.E) azaltzen direlarik.

Konparatutako datuak morfina edo abstinentzia taldearenak eta beraien kontrolenak

izan dira eta horretarako parekatutako T Student test-a erabili dugu, talde bikote bakoitzaren

tratamenduak eta neurketa entzimatikoak baldintza eta momentu bereberean egin baitziren.

T Student-aren probabilitateak honela adierazi dira: P< 0.05 (* batekin grafikan), P<

0.01 (**) edo P< 0.005 (***) datu esangarrientzako, eta (e.e.) batekin ez esangarriak

zirenean.

Datuen irakurketa errazteko, lehenengo puntuan BPO-ak anderatzen dituzten

aminopeptidasa aktibitateak deskribatuko ditugu eta bigarrenean beste peptidasa talde

heterogeneoa aurkeztuko da.

Azkenengo puntuan abstinentzia taldea eta beraien kontrolekin abstinentzia

sindromearen gogortasuna neurtzeko eginiko esperimentu konduktualetan, bakoitzak

izandako puntuaketa orokorraren konparaketa aurkeztuko da. T student test-a erabil dugu

horretarako.

4.1. BPO-ak anderatzen dituzten aminopeptidasak:

4.1 – 4.2 Tauletan eta dagozkien grafiketan morfina taldean eta abstinentzia taldean

neurtutako PSA (EC 3.4.11.14) solugarriaren aktibitateak deskribatzen dira hurrenez

hurren. Morfinarekin tratatutako arratoien garunean kontroletan baino aktibitate

Emaitzak

Doktore-tesia

164

handiagoak neurtu dira, esangarriak kortex prefrontalaren kasuan (T Student: P< 0.005).

Berriz, abstinentzia sindromea jasan duten arratoietan joera aldatu eta kontrolen garunean

baino aktibitate txikiagoa agertu dira (T Student: P< 0.05 estriatuan eta kortex guztietan).

4.3 – 4.4 Taula eta grafiketan mintzari lotutako PSA-ren (AP MII edo EC 3.4.11.14)

aktibitateak ikus daitezke. Kasu honetan entzima honen forma solugarriak duen joera argia

ez da ikusi (T student: P>0.05, atal guztietan).

4.5 – 4.6 Taula eta grafiketan APN-aren (EC 3.4.11.2) aktibitateak aurkezten dira.

Entzima honen neurketan berriro ikusi da morfina taldearen aktibitate handiagoa

kontrolekiko (T student: P<0.01 amigdala eta estriatuan; P<0.05 hipotalamoan) eta berriro

joera aldaketa berbera abstinentzia sindromea jasan duten animalietan (T Student: P< 0.01,

hipokanpoan).

Emaitzak

Doktore-tesia

165

Emaitzak

Doktore-tesia

166

PSA solugarria Morfina taldea.

4.1. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako PSA solugarriaren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko

gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 32270 2574 29802 1692 e.e

Hipotalamoa 30660 2117 28711 1575 e.e

Hipokanpoa 37042 2086 35974 1651 e.e

Estriatua 38975 1986 37793 1505 e.e

Prefrontala 34638 1423 30263 1580 P<0.005

Okzipitala 33881 1804 32727 1740 e.e

Parietala 35220 1883 33390 1732 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

167

PSA solugarria Morfina taldea

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g MorfinaKontrola

***

4.1. Grafika. PSA solugarriari dagozkion emaitzen grafika (morfina taldea eta

kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:

Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex

prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05

(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

168

PSA solugarria

Abstinentzia taldea

4.2. Taula. Taula honetan abstinentzi sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako PSA solugarriaren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko

gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 28047 1716 27873 2116 e.e

Hipotalamoa 25979 1767 26410 2108 e.e

Hipokanpoa 33419 2332 33843 2161 e.e

Kaudatua 35025 1850 38036 1997 P<0.05

Prefrontala 28211 1393 31745 1709 P<0.05

Okzipitala 29686 1648 31892 2077 P<0.05

Parietala 30027 1945 32983 2433 P<0.05

Emaitzak

Doktore-tesia

169

PSA solugarria Abstinentzia taldea

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

AbstinentziaKontrola

* * *

*

4.2. Grafika. PSA solugarriari dagozkion emaitzen grafika (abstinentzia taldea eta

kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:

Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex

prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05

(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

170

Mintzari lotutako PSA (AP MII) Morfina taldea.

4.3. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako AP MII-aren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune

ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T

student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.

Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 7118 1492 6812 1339 e.e

Hipotalamoa 5704 762 6890 1067 e.e

Hipokanpoa 7280 1082 7003 897 e.e

Kaudatua 7092 1049 6921 766 e.e

Prefrontala 7327 822 6883 679 e.e

Okzipitala 8026 986 7901 808 e.e

Parietala 7790 943 6932 720 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

171

Mintzari lotutako PSA (AP MII)

Morfina taldea

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g MorfinaKontrola

4.3. Grafika. Mintzari lotutako PSA-ri dagozkion emaitzen grafika (morfina taldea

eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:

Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex

prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05

(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

172

Mintzari lotutako PSA (AP MII) Abstinentzia taldea

4.4. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako AP MII-aren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune

ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T

student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.

Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 5589 1034 5854 1015 e.e

Hipotalamoa 5541 985 5937 906 e.e

Hipokanpoa 5483 818 5757 888 e.e

Kaudatua 6780 1025 6747 907 e.e

Prefrontala 5362 476 6474 911 e.e

Okzipitala 6916 750 5984 580 e.e

Parietala 6061 648 6087 996 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

173

Mintzari lotutako PSA (AP MII)

Abstinentzia taldea

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/mg

prot

eina

AbstinentziaKontrola

4.4. Grafika. Mintzari lotutako PSA-ri dagozkion emaitzen grafika (abstinentzia

taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak

azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun

kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea:

P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

174

Mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N (APN) Morfina taldea.

4.5. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako APN-aren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune

ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T

student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.

Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 1684 214 1286 247 P<0.01

Hipotalamoa 1670 281 1351 218 P<0.05

Hipokanpoa 1289 134 1190 156 e.e

Kaudatua 1555 156 1219 103 P<0.01

Prefrontala 1720 298 1544 172 e.e

Okzipitala 1649 232 1573 158 e.e

Parietala 1927 320 1702 334 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

175

APN Morfina taldea

0

500

1000

1500

2000

2500

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g MorfinaKontrola

****

*

4.5. Grafika. Mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N-ri dagozkion emaitzen

grafika (morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema

zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),

kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student

test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

176

APN Abstinentzia taldea

4.6. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako APN-aren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune

ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren

baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T

student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.

Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 1680 219 1927 230 e.e

Hipotalamoa 1439 164 1649 258 P<0.01

Hipokanpoa 1021 162 1760 288 e.e

Kaudatua 1503 189 1650 220 e.e

Prefrontala 1781 215 1777 308 e.e

Okzipitala 1852 251 1924 383 e.e

Parietala 1949 271 1793 218 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

177

APN

Abstinentzia taldea

0

500

1000

1500

2000

2500

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

AbstinentziaKontrola

**

4.6. Grafika. Mintzari lotutako alanina aminopeptidasa N-ri dagozkion emaitzen

grafika (abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema

zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),

kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student

test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

178

Emaitzak

Doktore-tesia

179

4.2. Beste peptidasak:

4.7 – 4.8. Tauletan eta dagozkien grafiketan prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26) solugarriak

emandako baloreak azaltzen dira. Orokorrean, bai morfina taldean eta bai abstinentzia

taldean, kontrolek aktibitate entzimatiko handiagoa azaldu dute (T Student: P<0.05,

naloxona taldearen kortex parietalean).

4.9 – 4.10. Taula eta beraien grafiketan mintzari lotutako prolil endopeptidasa (EC

3.4.21.26) azaltzen da. Entzima honek ez ditu aldaketa esangarririk jasan ezta morfina ezta

abstinentzia taldean (T student: P>0.05, atal guztietan).

4.11 – 4.12. Taula eta grafiketan arginil aminopeptidasa (EC 3.4.11.6) aktibitateak

deskribatzen dira. Hemen, aipagarriena garun kortexean gertatutako joera aldaketa izan

liteke, morfina taldean pixkat handiagoa den aktibitateak abstinentzia taldean buelta ematen

baitu (T student: P<0.05 naloxona taldearen kortex parietalean).

4.13 – 4.14 taulak eta grafikak leuzil aminopeptidasa (EC 3.4.11.1) aktibitatea aurkezten

dute. Entzima honek ez du bariazio esangarririk jasan (T student: P> 0.05, atal guztietan)

nahiz eta joera aldaketaren bat ikusi garun kortex mailan.

4.15 – 4.18 tauletan eta dagozkien grafiketan piroglutamil peptidasa (EC 3.4.19.3)

aktibitateak azaltzen dira (solugarriak eta mintzari lotutakoak). Ez dira morfina taldean ezta

abstinentzia taldean aldaketa esangarririk gertatu (T Student: P>0.05, talde eta atal

guztietan).

4.19 – 4.22 taula eta grafiketan aspartil aminopeptidasa (EC 3.4.11.7) aktibitateak aurkezten

dira (solugarria eta mintzari lotutakoak). Kasu honetan ere neurtutako aktibitateak ez dira

oso ezberdinak izan talde bakoitzean (beraien kontrolekiko) (T Student: P>0.05, talde eta

atal guztietan).

Emaitzak

Doktore-tesia

180

Prolil endopeptidasa solugarria Morfina taldea.

4.7. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako prolil endopeptidasa solugarriaren aktibitateak aurkezten dira

aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan

eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 2936 413 3180 378 e.e

Hipotalamoa 2230 326 2479 334 e.e

Hipokanpoa 3214 412 3564 470 e.e

Kaudatua 3210 450 3568 516 e.e

Prefrontala 3356 531 3456 611 e.e

Okzipitala 3798 605 3901 582 e.e

Parietala 3880 501 4184 619 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

181

Prolil endopeptidasa solugarria Morfina taldea

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

MorfinaKontrola

4.7. Grafika. Prolil endopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika (morfina

taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak

azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun

kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea:

P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

182

Prolil endopeptidasa solugarria Abstinentzia taldea

4.8. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako prolil endopeptidasa solugarriaren aktibitateak aurkezten dira

aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan

eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 3043 316 3241 290 e.e

Hipotalamoa 2232 210 2427 214 e.e

Hipokanpoa 3186 269 3452 340 e.e

Kaudatua 3208 245 3520 295 e.e

Prefrontala 3485 267 3843 338 e.e

Okzipitala 3684 299 4026 319 e.e

Parietala 3501 310 4085 416 P<0.05

Emaitzak

Doktore-tesia

183

Prolil endopeptidasa solugarria Abstinentzia taldea

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/mg

prot

eina

AbstinentziaKontrola

*

4.8.Grafika. Prolil endopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika

(abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko

guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta

garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren

probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

184

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa Morfina taldea.

4.9 Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako prolil endopeptidasaren aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten

dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-

tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)

dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 504 100 468 70 e.e

Hipotalamoa 407 78 384 45 e.e

Hipokanpoa 419 62 439 46 e.e

Kaudatua 420 42 395 35 e.e

Prefrontala 424 40 445 37 e.e

Okzipitala 456 50 456 38 e.e

Parietala 406 43 434 56 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

185

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa Morfina taldea

0

100

200

300

400

500

600

700

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

MorfinaKontrola

4.9. Grafika. Mintzari lotutako prolil endopeptidasari dagozkion emaitzen grafika

(morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko

guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta

garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren

probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

186

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa Abstinentzia taldea

4.10. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako prolil endopeptidasaren aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten

dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-

tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)

dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Naloxona Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 456 96 626 134 e.e

Hipotalamoa 409 55 470 59 e.e

Hipokanpoa 400 57 422 55 e.e

Kaudatua 366 46 437 57 e.e

Prefrontala 393 46 464 52 e.e

Okzipitala 461 55 472 60 e.e

Parietala 455 59 495 74 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

187

Mintzari lotutako prolil endopeptidasa Abstinentzia taldea

0

100

200

300

400

500

600

700

800

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

AbstinentziaKontrola

4.10. Grafika. Mintzari lotutako prolil endopeptidasari dagozkion emaitzen grafika

(abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko

guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (F) eta

garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren

probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

188

Arginil aminopeptidasa Morfina taldea.

4.11. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako arginil aminopeptidasa aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-

ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 35070 2894 32288 2438 e.e

Hipotalamoa 29865 2961 29193 2298 e.e

Hipokanpoa 33958 2589 33421 2659 e.e

Kaudatua 33933 2630 32649 2359 e.e

Prefrontala 33403 2495 31293 2638 e.e

Okzipitala 36988 3601 36494 3273 e.e

Parietala 34130 2097 33551 3343 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

189

Arginil aminopeptidasa Morfina taldea

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

MorfinaKontrola

4.11. Grafika. Arginil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika (morfina taldea

eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:

Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (F) eta garun kortex

prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05

(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

190

Arginil aminopeptidasa Abstinentzia taldea

4.12. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako arginil aminopeptidasaren aktibitateak aurkezten dira aztertutako

NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira.

Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 31100 2995 31342 3160 e.e

Hipotalamoa 27267 2746 25691 299 e.e

Hipokanpoa 31566 3182 31364 3523 e.e

Kaudatua 31583 2278 34010 3443 e.e

Prefrontala 28817 1965 32556 3218 e.e

Okzipitala 32833 2529 34648 3395 e.e

Parietala 28092 2097 31837 3343 P<0.05

Emaitzak

Doktore-tesia

191

Arginil aminopeptidasa Abstinentzia taldea

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

A Ht Hc K FP O P

PAU

/pro

tein

a m

g

AbstinentziaKontrola

*

4.12. Grafika. Arginil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika (abstinentzia

taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak

azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (F) eta garun

kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea:

P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

192

Leuzil aminopeptidasa Morfina taldea.

4.13. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako leuzil aminopeptidasa aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko

gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 415 43 357 46 e.e

Hipotalamoa 456 51 387 42 e.e

Hipokanpoa 411 48 411 45 e.e

Kaudatua 475 43 482 42 e.e

Prefrontala 371 48 384 52 e.e

Okzipitala 438 55 382 55 e.e

Parietala 423 45 411 50 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

193

Leuzil aminopeptidasa Morfina taldea

0

100

200

300

400

500

600

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g MorfinaKontrola

4.13. Grafika. Leuzina aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika (morfina taldea

eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:

Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex

prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05

(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

194

Leuzil aminopeptidasa Abstinentzia taldea

4.14. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako leuzil aminopeptidasaren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-

ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen

diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen

konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)

izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.

Naloxona Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 441 63 461 89 e.e

Hipotalamoa 341 54 414 83 e.e

Hipokanpoa 405 46 405 65 e.e

Kaudatua 443 42 487 72 e.e

Prefrontala 355 52 397 72 e.e

Okzipitala 365 62 358 76 e.e

Parietala 378 41 506 92 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

195

Leuzil aminopeptidasa Abstinentzia taldea

0

100

200

300

400

500

600

700

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

AbstinentziaKontrola

4.14. Grafika. Leuzil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika (abstinentzia

taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak

azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun

kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea:

P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

196

Piroglutamil peptidasa I solugarria Morfina taldea.

4.15. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako piroglutamil peptidasa I solugarriaren aktibitateak aurkezten dira

aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan

eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 85 21 76 23 e.e

Hipotalamoa 78 36 76 20 e.e

Hipokanpoa 59 11 61 9 e.e

Kaudatua 59 10 68 18 e.e

Prefrontala 65 16 60 14 e.e

Okzipitala 65 9 71 18 e.e

Parietala 95 18 85 16 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

197

Piroglutamil peptidasa I solugarria Morfina taldea

0

20

40

60

80

100

120

A Ht Hc E PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g MorfinaKontrola

4.15. Grafika. Piroglutamil peptidasa I solugarriari dagozkion emaitzen grafika

(morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko

guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta

garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren

probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

198

Piroglutamil peptidasa I solugarria

Abstinentzia taldea

4.16. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako piroglutamil peptidasa I solugarriaren aktibitateak aurkezten dira

aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan

eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 64 18 56 16 e.e

Hipotalamoa 54 5 60 11 e.e

Hipokanpoa 69 11 74 5 e.e

Kaudatua 68 23 54 14 e.e

Prefrontala 81 12 93 7 e.e

Okzipitala 68 3 72 4 e.e

Parietala 121 6 133 7 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

199

Piroglutamil peptidasa I solugarria Abstinentzia taldea

0

20

40

60

80

100

120

140

A Ht Hc E PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

NaloxonaKontrola

4.16. Grafika. Piroglutamil peptidasa I solugarriari dagozkion emaitzen grafika

(abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko

guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta

garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren

probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

200

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa Morfina taldea.

4.17. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako piroglutamil peptidasaren aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten

dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-

tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)

dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 89 29 86 21 e.e

Hipotalamoa 94 29 145 28 e.e

Hipokanpoa 127 30 117 31 e.e

Kaudatua 87 16 78 19 e.e

Prefrontala 85 19 83 18 e.e

Okzipitala 86 18 90 20 e.e

Parietala 127 36 147 26 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

201

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I Morfina taldea

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

MorfinaKontrola

4.17. Grafika. Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I-i dagozkion emaitzen

grafika (morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema

zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),

kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student

test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

202

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa Abstinentzia taldea

4.18. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako piroglutamil peptidasa I aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten

dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-

tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)

dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 175 43 205 46 e.e

Hipotalamoa 151 39 159 36 e.e

Hipokanpoa 221 46 223 36 e.e

Kaudatua 173 34 180 30 e.e

Prefrontala 200 60 205 21 e.e

Okzipitala 211 41 237 33 e.e

Parietala 277 34 361 26 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

203

Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I Abstinentzia taldea

0

50

100

150

200

250

300

350

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

AbstinentziaKontrola

4.18. Grafika. Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I-i dagozkion emaitzen

grafika (abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema

zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),

kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student

test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

204

Aspartil aminopeptidasa solugarria Morfina taldea.

4.19. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako aspartil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak aurkezten dira

aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan

eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 93 24 82 16 e.e

Hipotalamoa 69 11 94 16 e.e

Hipokanpoa 70 15 79 20 e.e

Kaudatua 100 16 100 16 e.e

Prefrontala 95 14 84 14 e.e

Okzipitala 80 17 83 15 e.e

Parietala 125 13 130 5 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

205

Aspartil aminopeptidasa solugarria Morfina taldea

0

20

40

60

80

100

120

140

160

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

MorfinaKontrola

4.19. Grafika. Aspartil aminopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika

(morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko

guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta

garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren

probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

206

Aspartil aminopeptidasa solugarria Abstinentzia taldea

4.20. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako aspartil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak aurkezten dira

aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan

eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.

Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 120 33 114 33 e.e

Hipotalamoa 74 22 97 14 e.e

Hipokanpoa 88 17 94 22 e.e

Kaudatua 107 19 104 11 e.e

Prefrontala 124 20 131 5 e.e

Okzipitala 92 20 110 4 e.e

Parietala 137 13 156 5 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

207

Aspartil aminopeptidasa solugarria Abstinentzia taldea

0

20

40

60

80

100

120

140

160

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

AbstinentziaKontrola

4.20. Grafika. Aspartil aminopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika

(abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko

guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta

garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren

probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

208

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa Morfina taldea.

4.21. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako aspartil aminopeptidasaren aktibitateak (mintzari lotutakoan)

aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU /

proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar

erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau

esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo

p<0.005 den azalduko da taulan.

Morfina Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 140 24 101 24 e.e

Hipotalamoa 131 10 135 53 e.e

Hipokanpoa 134 13 130 19 e.e

Kaudatua 145 20 125 14 e.e

Prefrontala 153 18 132 12 e.e

Okzipitala 132 14 155 21 e.e

Parietala 171 21 187 20 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

209

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa Morfina taldea

0

50

100

150

200

250

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

MorfinaKontrola

4.21. Grafika. Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasari dagozkion emaitzen

grafika (morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema

zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),

kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student

test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

210

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa Abstinentzia taldea

4.22. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren

kontrolek azaldutako aspartil aminopeptidasa aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten

dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-

tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)

dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez

esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko

da taulan.

Abstinentzia Kontrolak

NSZ-ko

gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea

Amigdala 184 34 190 53 e.e

Hipotalamoa 125 29 179 20 e.e

Hipokanpoa 188 30 189 28 e.e

Kaudatua 180 21 195 26 e.e

Prefrontala 202 19 188 19 e.e

Okzipitala 158 19 204 37 e.e

Parietala 239 28 271 32 e.e

Emaitzak

Doktore-tesia

211

Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa Abstinentzia taldea

0

50

100

150

200

250

300

350

A Ht Hc K PF O P

PAU

/pro

tein

a m

g

AbstinentziaKontrola

4.22. Grafika. Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasari dagozkion emaitzen

grafika (abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema

zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),

kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student

test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).

Emaitzak

Doktore-tesia

212

4.3. Abstinentzia sindromearen gogortasuna neurtzeko esperimentu

konduktualen puntuaketa orokorrak:

4.23 grafikan abstinentzia taldea eta kontrol taldeko arratoien puntuaketa orokorren

(zeinu zenbatu eta presenteak) arteko konparaketa ikus daiteke. Abstinentzia taldean, hau

da, morfina eta naloxona zeramaten arratoietan abstinentzia sindromea argia azaldu zen

bitartean sueroa eta naloxona zeramatenetan (kontrol taldea) ez zen sindrome honen zeinu

esangarririk agertu. Beraz jarraitutako tratamendu protokoloa egokia izan zela konfirmatu

genezake (T Student: P<0.005).

0

2

46

8

10

1214

1618

1

Abstinentzia sindromea

Punt

uake

ta o

roko

rra Abstinentzia

Kontrolak

***

4.23 Grafika. Abstinentzia sindromearen gogortasuna. “Y” ardatzean puntuaketa

orokorraren batazbestekoak eta erroreak azaltzen dira. “X” ardatzean naloxona taldea eta

kontrolen baloreak azaltzen dira. T student test-aren probabilitatea: (***) P< 0.005.

V. Eztabaida

Eztabaida

Doktore-tesia

213

Tesi honetan neuropeptido ezberdinak anderatzen dituzten peptidasen

deskribapena egin da gizaki eta arratoiaren garunetan lagin bezala hartuz. Deskribapena

ahalik eta zabalena izan zedin, lehenengoz maila azpizelularrean entzima hauen banaketa

aztertu da. Hurrengo pausuan, baldintza normaletan garuneko atal ezberdinetan entzima

hauen aktibitate banaketa zein den ikusi da, espezie arteko berezitasunak azpimarratuz.

Azkenengo etapan opiazeoekiko menpekotasun fenomenoan gizaki eta arratoien garuneko

atal konkretuetan aktibitate peptidasikoen modulaziorik gertatzen den analizatu da.

Ikerlanean jasotako emaitzak hurrengo hiru puntu hauetan eztabaidatuko dira:

1. Peptidasen banaketa azpizelularra gizaki

eta arratoiaren garun kortexean.

Ugaztun zeluletan peptidoen anderakuntza proteinen katabolismoaren azkenengo

faseetan kokatzen da. Proteina sintesia mintzei lotutako edo aske dauden erribosometan

egiten den bitartean, proteina edo peptidoen anderakuntza maila azpizelularreko gune

ezberdinetan ematen da, mekanismo ezberdinen bidez gertatuz. Edozein organismo

eukariotako zeluletan bezala, garuneko zelulak proteinen bioeraldaketa edo turn-over delakoa

eragiteko mekanismoak dituzte. Hauek proteina anormal edo minduak, egitura proteinak,

proteina erregulatzaileak edo entzimatikoak eraldatzeko beharrezkoak dira eta gune

azpizelular ezberdinetan deskribatu dira (O’Cuinn, 1997).

Neuropeptidoen inaktibazioa nagusiki peptidasen anderakuntzaren ondorioz

gertatzen dela ezarrita dago (Iversen, 1987). Peptidasen zelula kokapenari dagokionez,

mintzekoak edo zitosolikoak daudela dakigu. Lehenengoak ezagunagoak dira eta zentru

aktiboa gune extrazelularrerantz (gune sinaptikorantz) edo barnerantz dutenak bereiz

daitezke (Turner eta lank., 1987; Maroux, 1987; Dyer eta lank., 1991). Peptidasa solugarriak

gutxiago ezagutzen dira baina aktibitate altua azaltzen dutenez ekintza fisiologiko

ezberdinetan funtzio garrantzitsuak izan ditzaketela deskribatu da (Mantle, 1992; O’Cuinn,

1997).

Eztabaida

Doktore-tesia

214

Lan honetarako aukeratutako peptidasen zelula-barneko aktibitateak ezagutzeko

aspaldi deskribatutako banaketa zelularraren teknika erabili dugu. Teknika honen bitartez

lortutako zatiki azpizelularrak sinaptosomak, mielina, mitokondriak, mikrosomak, nukleoa

eta zitosola izan dira. Euren artean aipagarria da sinaptosoma bezala ezagututako egituren

lorpena. Hauek neuronen bukaera sinaptikoz sortutako egiturak dira. Bixikula hauen

edukinaren zati handi bat zitosolikoa da –zitosol edukin guztiarengandik bananduta

geratzen dena –, bertan aurkitutako LDH aktibitate altuak adierazten duten bezala (Gray

eta Whitaker, 1962).

Tesi honetan teknika horren bitartez lortutako zatiki azpizelularren purotasun

frogak egin ziren. Gure datuak Gray eta Whitakerrek sinaptosoma mailan

deskribatutakoarekin bat datoz. Bai gizakia zein arratoi kortex laginekin egindako banaketa

azpizelularraren ondorioz lortutako zatiki sinaptosomalean eta zitosolean LDH maila altuak

daude; beste zatikiekin konparatuz, bikoitza baino gehiago.

Bestalde, sinapsietatik eratorriko egitura hauek morfologikoki zein funtzionalki

nahiko egonkorrak direla dakigu. 70. hamarkadaren bukaeran egindako ikerlan batean,

gizaki eta arratoi garun kortex laginak hozkailuan biltegiratu ondoren, lagin freskoekin

konparatuz antzeko propietateak mantentzen dituztela ikusi zen. Propietate hauen artean,

kaltzio-bitarteko kinadak erabiliz sinaptosometatik neuropeptidoen askapena eragin

zitekeela aipatu zuten Dodd eta lankideek (1979).

Ildo honekin jarraituz, peptidasa aktibitateen gain hil ondorengo atzerapenak

(postmortem delay) edo laginen izozte denborak eraginik duenentz jakiteko korrelazio ikerketa

egin da tesi honetan. PSA solugarria eta arginil aminopeptidasa (APB-a) adibide bezala

hartuz, ez zen erlazio esanguratsurik ikusi baldintza fisiko hoiek eta aktibitate peptidasikoen

artean.

Era berean, beste zatikien isolamenduari dagokionez, hau egokia izan zela

adierazten diguten emaitzak jaso genituen (emaitzen atalean 12. taulan adierazitakoak).

Eztabaida

Doktore-tesia

215

Neuropeptidoen zelula berneko erregulazio mekanismoen ezagutzak oraindik

hutsune asko ditu. Peptidoen aktibitatearen kontrol fisiologikoa egiten duten peptidasak

mintz sinaptikoan lotutako ektopeptidasak izan behar dutela proposatu da (Schwartz eta

lank., 1981). Egia esan, mintzari lotutako aminopeptidasak neurotransmisore peptidikoen

kontrolean eragina dutela aspaldidanik deskribatu da (Turner, 1986). Hala ere, gizaki eta

animalien ehun ezberdinen zelulen zatiki solugarrian peptidasa aktibitatea oso ugaria dela

ikusi da, entzima hauen funtzioa zein den oraindik oso argi egon ez arren.

Tesi honetarako eginiko esperimentuetan aktibitate peptidasikoa zatiki azpizelular

guztietan aurkitu da eta banaketa patroia oso antzekoa izan da gizakia zein arratoiaren

garunen kortexean. Gainera, entzima solugarrien aktibitatea mintzari lotutakoena bezain

bestekoa edo handiagoa dela ikusi da.

1.1. Peptidasa solugarriei dagokionez, prolil endopeptidasa izan ezik

beste guztien aktibitate handiena zatiki sinaptosomalean aurkitu dugu bai gizaki zein

arratoiaren garun kortexean.

Aipatzekoa da piroglutamil peptidasa I (PG I) eta aspartil aminopeptidasa (APA)

aktibitate espezifikoen zati handi bat amaiera sinaptikoan azaldu izana.

Lehenengoari dagokionez, gure taldeak duela gutxi adin ezberdineko arratoien

zerebeloan nerbio sistema zentrala (NSZ) heldu ahala sinaptosometako PG I aktibitatea

bikoiztu egiten dela deskribatu zuen. Arratoi helduetan, zatiki azpizelularrak konparatuz

gero, aktibitate nagusia maila sinaptomalean agertu zen bai PG I solugarrian zein mintzari

lotutakoan. Gainera, zatiki zitosolikoaren PG I aktibitateak arratoiak heldu ahala

ikusgarrizko beherakada jasaten duela ikusi zen (Gandarias eta lank., 2000). Tesi honetan

banaketa azpizelularrerako gizaki eta arratoi helduen garun kortex laginak erabili ditugu eta

PG I entzimaren banaketa azpizelular berdina agertu da; hau da, maila sinaptosomal altuak

eta zitosoliko baxuak. Beraz, entzima honen forma solugarriaren ekintza azpizelular nagusia

maila sinaptikoan gertatzen dela esan genezake.

APA-ren kasuan ere aktibitate nagusia sinaptosometan azaltzen da gizaki eta

arratoiaren garun kortexean. Portzentai txikiagoan baina hala ere nagusiki, leuzil

Eztabaida

Doktore-tesia

216

aminopeptidasaren aktibitate handienak zatiki azpizelular honetan aurkitzen dira. Era

berean, PSA solugarriaren eta arginil aminopeptidasaren (APB) banaketa homogeneoagoa

izan arren, zatiki sinaptosomalean aktibitate altuak ikus daitezke gizaki eta arratoiaren garun

kortexean.

Kokapen nagusi honen zergatia ulertzea ez da errazegia gaur arte ditugun datuekin

behintzat. 1987an Hersh eta lankideak peptidasa batzuk bere funtzioa sinapsi inguruan izan

dezaketela deskribatu zuten; neuropeptidoen zelula barneko katabolismoak sinapsietatik

hurbil peptido hauen kontzentrazio gradientea mantentzen lagundu lezaketela proposatuz.

Autore batzuen eritziz, entzima hauen kokapena nahiz eta zelula-barnekoa izan

neuropeptidoen anderakuntzan era bitan parte hartu lezakete: neuropeptidoak bere

hartzailearekin konplexu bat sortu eta zelulan barneratu ondoren, edota peptidasak gune

sinaptikora askatuz gero (Gibson eta lank., 1989). Ideia honi lagunduz, duela gutxi PSA-ren

sinapsirainoko garraio axonala frogatzen duen lan bat aurkeztu da, entzima honen

neuropeptido anderatzaile funtzioa bukaera edo gune sinaptikoan gertatzen dela

proposatuz (Yamamoto eta lank., 2002). APB-aren kasuan ere, arratoiaren guruin

adrenaleko feokromozitoma zeluletan entzima honen jariaketa deskribatu da (Balogh eta

lank., 1998). Beraz, entzima solugarri hauen aktibitate nagusia zelula barnean gertatzen dela

argi egon arren, sinapsi inguruan proportzio handietan azaltzeak zergatia bat baino gehiago

izatea posible litzateke, ezin daitekelarik entzimen askapenaren hipotesia baztertu.

Bestalde, zelula arteko komunikazioan eragina duten peptidoak kontuan hartu gabe,

proteina ezberdinen apurketaren ondorioz eratutako peptidoen anderakuntza nagusiki

zelula barnean gertatzen dela onartuta dago; zitosolean batipat (O’Cuinn, 1997).

Tesi honetan deskribatutako entzima solugarri guztietan zatiki sinaptosomalean eta

zitosolikoan azaldutako aktibitateak batera aztertuko bagenitu – azken finean

sinaptosometako edukina zitosola baita – aktibitate espezifiko guztiaren erdia edo gehiago

zelularen zitosolean ematen dela adierazi genezake. Aktibitate hauen artean PSA solugarria,

APB-a eta prolil endopeptidasa solugarriarenak (gizakian) beste entzimenak baino askoz

handiagoak izan dira. PSA-ren kasuan adibidez, aminopeptidasa hau garunean aurkitzen

den ugariena dela eta bere aktibitatearen %80-a zatiki solugarrian ematen dela dakigu

(McLellan eta Lank., 1988). Beraz deskribatutako aktibitate zitosoliko handia kontuan

Eztabaida

Doktore-tesia

217

hartuz, zitosolean gertatutako peptido ezberdinen anderakuntzan entzima hauek funtzioren

bat izan behar dutela pentsatzera eramaten gaitu. Izan ere, puntu honen bukaeran azalduko

den bezala, peptidasa solugarri hauek aktibitate intrakrinoa duten neuropeptidoen

anderakuntzan eragin lezakete.

Peptidasa aktibitatea nahiko kantitate esanguratsuan aurkitu dugun beste zatiki bat,

mitokondriak izan dira. Batez ere PSA, APB eta PEP solugarria portzentai garrantzitsuetan

azaldu dira organulu azpizelular hauetan. Zatiki honetan entzima hauek izan lezaketen

funtzioa argiegi ez dagoen arren, badira beste ehun batzuetako zeluletan eginiko ikerlanak

non mitokondrietan peptidasa aktibitateak isolatu diren (Serizawa eta lank., 1995). Duela

gutxiko lan batetan mitokondriako proteina eta aitzindari polipeptidiko askoren

proteolisian eragiten duten hiru peptidasa isolatu dira. Hauek eboluzio maila ezberdineko

espezietan (gizakia barne) egitura eta funtzioa mantendu dutela diote ikerlariek (Gakh eta

lank., 2002). 1992an azaldutako artikulu batean, arratoiaren giltzurruneko zelula

tubularretako mikrosoma eta mitokondrietan PSA dagoela deskribatu zuten Kettmann eta

lankideek. Zentzu honetan, guk garun kortexean egindako esperimentuetan

mitokondrietako PSA aktibitatea nahiko altua dela ikusi dugu. Era berean, mikrosometakoa

ez da bestea baino askoz txikiagoa izan.

Beraz, peptidasa solugarrien banaketa azpizelularrean zerbait azpimarratzekotan,

entzima hauen zelula barneko aktibitatea handia dela eta zatiki sinaptosomaleko edo

zitosoleko (bere osotasunean) peptidasa mailak altuenak direla esan behar da.

1.2. Mintzari lotutako peptidasei dagokionez, hauek ere zatiki

azpizelular guztietan aurkitu daitezke, bai arratoi zein gizakiaren garun kortexean.

Mintzari lotutako entzimen analisian banaketa azpizelularraren teknikari esker zatiki

mielinikoa isolatu da. Bertan peptidasa aktibitateak altuak aurkitu ditugu. PG I eta PEP-

aren kasuan aktibitate mielinikoa guztiaren %30-ekoa da. Gainera, beste peptidasena ere

%17-27-koa dela ikusirik (nahiz eta beste zatikiekiko ezberdintasunak esanguratsuak ez

diren), maila honetan peptidasek funtzioren bat izan behar dutela susmagarria da.

Eztabaida

Doktore-tesia

218

Zentzu honetan ez dira ikerlan ugariegi agertu, baina badago baten bat. Adibidez,

1970an Frey eta lankideek akuriaren (guinea-pig) garunean mielinizazio garaian peptidasa

aktibitatea deskribatu zuten. 21 urte beranduago Kioussi eta Matsasek (1991) NSZ-eko

neuronen axoiak eztaltzen dituen mielina ekoizten duten Schwann zeluletan endopeptidasa

24.11 entzima (entzefalinasa) isolatu zuten. Kokapen honek nerbioen garapenean edo

birsorkuntzarekin zerikusiren bat izan behar duela proposatu zuten. Hildu honetan nerbio

sistema periferikoko neuronen endekapen mota berezi batean entzefalinasa, APN eta

angiotentsina eraldatzen duen entzima (AEE) bezalako peptidasa ezberdinen aktibitate

aldaketak deskribatu dira (Kenny eta Bourne, 1991).

Beraz, gaur egun arte deskribatutakoaren arabera, zatiki mielinikoan kokatutako

peptidasen zeregina nerbioen garapen edo endekapenarekin erlazionatuta egotea posible

litzateke. Egia esan, gure taldeak garunaren garapenean peptidasek izan lezaketen funtzioari

buruzko ikerketa lerro tinko bat zabaldu du eta horretan dirau (Gandarias eta lank., 1992;

1994; 1997; 1998; Irazusta eta lank., 1999; 2000; Agirregoitia eta lank., 2003).

Zatiki sinaptosomalean esangarriki handiagoak izan diren aktibitateen artean

mintzari lotutako PG I eta PEP aktibitatea ditugu:

PG I-ari dagokionez, bere aktibitatea nagusiki solugarria dela deskribatu den arren

(Cummings eta lank., 1998), mintzari lotutako aktibitatea ere azaltzen dela deskribatu da

(Alba eta lank., 1995); eta lan honetan aurkitutakoaren arabera, gune sinaptikoan funtzioren

bat izan behar duela esan genezake. Sarreran azaltzen den bezala, PG I-a espektru zabaleko

entzima da eta piroglutamiko hondarra duten peptido gehienak anderatu ditzake (Browne

eta lank., 1983); Euren artean TRH-a, LHRH-a, bonbesina, neurotensina, e.a.

Bai gizakia eta bai arratoiaren garun kortexeko sinaptosometan PEP-aren aktibitate

esangarriak aurkitu ditugu. Emaitza hauek O’Leary-ren taldeak (1995; 1996) behi-garunean

deskribatutakoarekin bat datoz. Ikerlari hauek mintzari lotutako PEP aktibitatea

sinaptosometan isolatu zuten. Maila honetan entzima honek izan lezaken funtzioa TRH-a,

ADH-a, P substantzia, e.a peptidoren hidrolisia egitea izan daiteke (Welches eta lank.,

1993).

Eztabaida

Doktore-tesia

219

Mintzari lotutako beste hiru entzimen (AP MII, APN eta APA) aktibitate

sinaptosomala ere kontuan hartzekoa izan da, nahiz eta beste zatikiekiko ezberdintasuna

esangarria ez izan. Lehengo biek barne peptido opioideen anderakuntzan duten funtzioa eta

APA-k angiotentsina II-aren eraldaketan duena zelularen maila honetan gertatu behar duela

pentsatzea da bidezkoena.

Beste datu aipagarrien artean zatiki nuklearrean azaldutako peptidasa aktibitateak

izan dira, esangarriki altuak APN-aren kasuan. Aminopeptidasa honen ekintza ezagunena

entzefalinen anderakuntza da (Giros eta lank., 1985) eta neuropeptido hauek

neurotransmisore/neuromodulatzaile funtzioa dutela jakinik, APN-aren kokapen

nuklearraren esanahia ulertzea ez da erraza.

Entzefalinak neurona eta beste zelulen hazkuntza eta bereizketan eragina dutela

aspaldidanik deskribatu da (Zagon eta lank., 1987). Egia esan, met-entzefalinari hazkuntza-

faktore opioide bezala ezagutzen zaio (opioid growth factor edo OGF) eta zelulen garapenean,

birsorkuntzan, zaurien orbaintzetan, angiogenesian eta minbizian peptido modulatzailea

dela deskribatu da. Ekintza hau hartzaile baten bitartez egiten duela deskribatu da, mintz

nuklearran kokatzen den OGFr hartzailearen bitartez alegia (Zagon eta lank., 2002). Gure

ikerlanean ikusitako APN-aren kokapenaren herena nukleoan agertu izanak (bai gizakia

zein arratoiaren garun kortexean) OGF-aren zelula-barneko ekintza posible horrekin

zerikusia izan lezake.

Era berean, baina maila txikiago batetan, entzefalinen anderakuntza egiten duten

PSA solugarria eta mintzari lotutakoak kokapen nuklearra dutela ikusi dugu tesi honetan

(aktibitate azpizelularraren %14 – 19). Constam eta lankideak (1995) ere PSA aktibitate

nuklearra dagoela ikusi zuten, zelula hazkuntza prozesuetan gertatutako proteolisi

fenomenoetan parte hartzen duela proposatuz.

Duela urte batzuk beste ikerlari talde batek PEP aktibitate nuklearra dagoela

deskribatu zuten, entzima honek ugaztunen DNA sintesian funtzioren bat izan dezakela

proposatuz (Ishino eta lank., 1998). Tesi honetan PEP solugarriaren aktibitate nuklearra ia

sinaptosometakoa bezain bestekoa dela ikusi dugu. Beraz, gure esperimentuetan ikusitakoa

Ishinoren taldeak deskribatutakoarekin bat datorrela esan genezake.

Eztabaida

Doktore-tesia

220

Orokorrean mintzari lotutako peptidasen banaketa azpizelularra gizakian eta

arratoian antzekoa izan den arren, aipagarria da giza garun kortexean AP MII aktibitate

handiena zatiki mikrosomalean aurkitu izana. Gizakian entzima honen isoforma

solugarriaren zelula-barneko kokapenari buruz lan batzuk badauden arren, ezer gutxi esan

daiteke mintzari lotutakoari buruz. Grdisa eta Vitalek (1991) gizakiaren odoleko zelula zuri

ezberdinen mikrosometan espezifizitate zabaleko aminopeptidasa aktibitateak isolatu

zituzten, zatiki honetan funtzio bereziren bat izan behar luketela adieraziz. Urte batzuk

lehenago ere gizakiaren karenako mikrosometan aminopeptidasa aktibitatea duen entzima

bat purifikatu zen (Kurauchi eta lank., 1986).

Zatiki mikrosomalean aurkitzen diren organulu nagusiak erretikulu endoplasmikoa

eta Golgi aparatua dira. Toki hauetan proteinen eta peptidoen ekoizpenean garrantzitsuak

diren prozesuak gertatzen direla aspaldidanik dakigu. Hauen artean, Golgi aparatuan

neuropeptidoen aitzindariak diren peptido handiagoen prozesamendua gertatzen da

(O’Cuinn, 1997). Beharbada, zatiki mikrosomalean proportzio ezberdinetan organulu

hauetan aurkitzen diren peptidasa hauek neuropeptidoen prozesamenduan funtzioren bat

izan lezakete.

Laburbilduz, mintzari lotutako peptidasa aktibitateen banaketa azpizelularrari

dagokionez, entzima hauek maila zelularrean organulu eta toki ezberdinetan azaltzen direla

esan behar da. Kokapenak oso ezberdinak izan diren arren, aipatzekoa da mielina eta

sinaptosometako aktibitate altua PG I eta PEP-aren kasuan, eta nukleoan azaldutako APN

aktibitate handia.

Mintzari lotutako garuneko peptidasen funtzioa jariatutako molekula

erregulatzaileen (hormona edo neurotransmisoreak adib.) metabolismoan nahiko ondo

ezarrita dagoen arren (Turner, 1987), peptidasa solugarrien zeregina zelula barnean ez dago

batere argi (Mantle, 1992). Arrazoi honegatik normalean mintzari lotutako eta zatiki

solugarriko entzimen funtzioa bata bestearengandik bananduta azaltzen dira. Baina ikerlan

askotan eta tesi honetan ikusitakoaren arabera, azpimarratzekoa da bai aktibitate solugarriak

zein mintzari lotutako aktibitate gehienak (sinaptosometakoa kontuan hartu gabe),

zelularen peptidasa aktibitate osoaren zati handiena direla eta maila azpizelularrean

Eztabaida

Doktore-tesia

221

gertatzen dela. Azken finean, aztertutako peptidasa ezberdinek neuropeptido edo beste

peptido askoren anderakuntzan parte hartzen dutela deskribatu da hainbat ikerlanetan;

baina peptidasa hauen zati handiena zelula barnean kokatzen dela jakinik, entzima hauen

ekintza mekanismoari buruzko hutsune zabal bat dagoela ikus dezakegu.

Peptidasa zitosolikoen eztabaidan entzima hauek Euren funtzio ezberdinak zelulatik

kanpora jariatu ondoren edo beren substratua diren peptidoak zelulan barneratu ondoren

egin litzaketela proposatu da (Gibson eta lank., 1989). Proposamen hau gune aktiboa zelula

barnera begira duten mintzari lotutako entzimentzako baliagarria da, AP MII-a adibidez

(Dyer eta lank., 1990).

Azkenengo urteotan hormona peptidiko edo hazkuntza faktore batzuk zelula

barnean ekintza intrakrino bat izan dezaketenaren hipotesia jarri da agerian. Peptido hauek

zelula kanpotik barneratu ondoren edo barnean atxikita gelditu ondoren zelularen aktibitate

ezberdinak modulatu ditzaketela proposatu da (geneen transkripzioa edo zelula bereizketa

adibidez) (Re, 2002; 2003). Hildu honetan hipofisiko hormona peptidiko batzuk edo

angiotentsina II-ak aktibitate intrakrinoa izan dezaketela deskribatu da (Houben eta Denef,

1994; De Mello eta Danser, 2000; Schuijt eta Danser, 2002).

Tesi honen helburuetariko bat NSZ-an peptido ezberdinen anderatzaileak diren

peptidasen aktibitate azpizelularra deskribatzea izan da. Ikus dezakegunez, entzima hauek

aztertutako zatiki azpizelular guztietan agertzen dira eta zelula barnean aktibitate handia

daukate. Emaitza hauek hipotesi intrakrino hau osotzen lagundu gaitzakete; azken finean,

ekintza intrakrinoa duten peptidoen erregulazioan peptidasek funtzioren bat izatea posible

baita.

Peptidasen banaketa azpizelularraz gain, entzima hauek NSZ-eko atal ezberdinetan

zein eratan banatzen diren ezagutzeak beraien funtzioari buruzko datu gehiago biltzen

lagun ziezagukeenez, tesiaren bigarren fasean gizaki eta arratoi arrunten (baldintza

normaletan daudenak) garuneko gune ezberdinetan 7 peptidasa hoien aktibitateak neurtu

genituen:

Eztabaida

Doktore-tesia

222

2. Peptidasa aktibitateak gizakiaren eta

arratoiaren garuneko atal ezberdinetan.

Peptidasak mikroorganismo, landare eta animalia mota edo espezie ugaritan eta

ehun ezberdinetan isolatu dira (Taylor, 1993). Organo periferikoen artean, gibela,

giltzurrunak, birikak, odol zelulak, gihar eskeletikoa, e.a. organo edo ehunetan peptidasa

aktibitatea azaltzen dela deskribatu da (Mantle, 1992; Goossens eta lank., 1996; Irazusta eta

lank., 2001; Fernández eta lank., 2002).

Lan honetarako aukeratutako entzima guztiak gizakia edo animalien NSZ-ko atalen

batean isolatu izan dira (Kato eta lank., 1980; Kelly eta lank., 1983; Hersh eta lank., 1985;

Gros eta lank., 1985; Matsas eta lank., 1985;…).

Ikerketa deskriptibo honetan lan hauek osatzeko asmoz garuneko 7 atal ezberdin

aukeratu dira beste hainbeste peptidasen aktibitateak gune guztietan hedatzen direnentz eta

nola egiten duten jakiteko. Aukeratutako guneak amigdala, hipotalamoa, hipokanpoa,

estriatuaren nukleo kaudatua eta garun kortexa (prefrontala, parietala eta okzipitala) izan

dira. Aukeraketa honek zergatia bat baino gehiago izan ditu:

I. Alde batetik, atal ezberdin bat baino gehiagotan neurtu nahi izan da, ikerketa

deskriptiboa izanik, peptidasen aktibitateak entzefaloaren hedaduran zehar analizatzea

zentzuzkoena baita. Gainera atal hauen artean, garapen ebolutiboari dagokionez garun

kortexaren kasuan garapen hau ez da berdina izan gizakiaren edo arratoiaren kasuan.

II. Bestetik, gune hauetan peptidasek hidrolisatutako neuropeptidoak azaltzen

direla, proportzio ezberdinetan, deskribatu da (begiratu sarreran).

III. Esperimentuetarako erabilitako teknikak eskatzen dituen lagin kantitateak

mugak jartzen dizkigunez (batez ere arratoi laginekin) aipatutako 7 garun gune hoiek

aukeratu ditugu.

Eztabaida

Doktore-tesia

223

IV. Gainera, gune hauek menpekotasunari dagokion punturako egokiak iruditu

zitzaizkigunez, egoera fisiologikoetan neurtutako garun atalak eta hurrengo fasean egoera

patologikoan aztertutakoak berdinak izatea pentsatu dugu.

Orokorrean, ikertutako peptidasa aktibitateen banaketa erregionala bai gizaki zein

arratoiaren garunean nahiko homogenoa izan da, PEP, PSA solugarria eta APB-an

agertutako ezberdintasun esangarriak kontuan hartu gabe. Zazpi entzimen aktibitateak

espezie bietan aztertutako garun gune guztietan ikusi dira.

Gainera, aztertutako 3 peptidasen aktibitateetan (PEP, PSA eta APB-a) espezie

arteko ezberdintasun esangarriak azaldu dira. Beste aktibitateetan joera adierazgarri batzuk

ikusi arren, ezberdintasunak ez dira esangarriak izan.

2.1. Prolil endopeptidasa peptido ezberdinen (adibidez TRH-a eta

ADH-a) anderakuntza eragin dezakeen entzima bezala deskribatu da (Welches eta lank.,

1993). Sinapsi mailan neuropeptido ezberdinen inaktibazioa hauen prolil aminoazidoak

hidrolisatuz eragiten duela dakigu (Walter eta lank., 1971; O’Leary eta lank., 1996). Bere

kokapena arratoi eta gizakiaren NSZ-ean ezaguna da (Kato eta lank., 1980; Wilk, 1983;

Kalwant eta lank., 1991) eta gure esperimentuetan horrela dela baieztatu dugu.

Baina PEP-aren aktibitatean, bai solugarrian zein mintzari lotutakoan, adierazgarriak

iruditu zaizkigun emaitza bi azpimarratu behar dira:

2.1.1. Arratoiaren garunean PEP-aren banaketa nahiko homogeneoa dela azaldu

den bitartean (amigdalan ikusitako joera salbu), giza garun kortexean beste guneetan baino

aktibitate esangarriki handiagoak azaltzen dira. Emaitza hauek Kato eta lankideak (1980)

giza garun homogenatuetan ikusitako PEP solugarriaren emaitzekin bat dator.

Griffiths eta lankideek (1985) TRH-aren anderakuntza mailak kortexean beste

ataletan baino nabariagoak direla deskribatu zuten. Gure lanean azaldutako kortexeko 3 atal

ezberdineko (PF, O eta P) PEP isoforma bien maila altuak lan horretan azaldutakoa

sostengatzen dute, PEP-a TRH-aren inaktibazioan zerikusia duela deskribatu baita

(Welches eta lank., 1993). Hipotalamoko hormona peptidiko honek, TSH-a edo hormona

Eztabaida

Doktore-tesia

224

tiroideen askapenean duen eraginaz gain, eragin trofiko zuzenak dituela deskribatu da

(Banda eta lank., 1985 eta 1987; Bauer, 1987). Beraz, PEP aktibitatea NSZ-an filogenetikoki

eboluzionatuago dauden guneetan azaltzeak oraindik hain ezezaguna den ehun honen

garapenean entzima honek funtzioren bat izan behar duen susmopean jartzen gaitu. Egia

esan, emaitza interesgarri hauek, espezie gehiagoren filogenesian PEP-aren funtzioa zein

izan daitekeen ulertzeko asmoz, ikerketa lerro berri bat zabaldu dute gure taldean

(Agirregoitia eta lank., 2003).

Hildu honetan, ikerlan anitzetan PEP-a oroimena, ezagutza eta ikaskuntza

funtzioarekin erlazionatu da (Shishido eta lank., 1998); garun kortexarekin erlazio zuzena

duten funtzioekin alegia (Coyle eta lank., 1983; Araujo eta lank., 1988). Are gehiago,

azkeneko hamarkadan Alzheimer, Parkinsona, Huntington, e.a. endekapenezko gaixotasun

neurologikoetan entzima honen aktibitate aldaketak ikusi dira. Alzheimerraren kasuan PEP

garun kortexean soilik agertzen dela eragindua deskribatu da (Ichai eta lank., 1994; Mantle

eta lank., 1996). Gainera, entzima honek oroimenarekin zerikusia duela eta, gaur egun PEP-

ren inhibitzaileekin azterketa preklinikoak egiten hasi dira karraskari, tximino eta gizakian

(Schneider eta lank., 2002; Morain eta lank., 2002) emaitza onak agertu direlarik.

Inhibitzaile hauek garun kortexean eragin gehiago dutela ere deskribatu da (Toide eta lank.,

1995).

Beraz datu hauek ikusita eta argitaratuko ikerlanak kontuan hartuz, gizakiaren garun

kortexaren fisiologian PEP-ak funtzioren bat izan dezakela proposatu daiteke.

2.1.2. Peptidasa honen analisian ikusitako beste berezitasun bat espezie arteko

aktibitate maila hain ezberdinak izan dira. Izan ere, giza garuneko PEP aktibitatea

arratoiarena baino handiagoa dela aurkitu dugu aztertutako garuneko atal guztietan eta

entzimaren isoforma bietan. Baina espezie bien kortexeko PEP mailak konparatuz, gizakian

entzima honen aktibitatea arratoian baino 3-4 bider handiagoa dela ikusi dugu.

Beharbada, emaitza hau goian eztabaidatutakoaren Hildu berberean kokatu

genezake. Garun kortexaren garapenarekin eta gune honekin zerikusia duten funtzio

bereziekin erlazionatu den entzima hau gizakiaren kortexean arratoian baino maila askoz

altuagoetan agertzeak badu bere logika.

Eztabaida

Doktore-tesia

225

2.2. Puromizinarekiko sentikorra den aminopeptidasa

(PSA) garunean azaltzen den aminopeptidasa ugariena dela deskribatu da (Hersh eta

lank., 1987). Entzima honek mintzari lotutako eta solugarria den isoforma bi dituela

deskribatu da, bigarrenaren aktibitatea askoz handiagoa delarik (McLellan eta lank., 1988).

Mintzari lotutako entzefalina anderatzaileen artean AP MII-a APN-a baino aktiboagoa dela

deskribatu da (Giros, 1985). Gainera mintzari lotutako PSA edo AP MII garunarekiko

espezifikoa den bitartean, isoforma solugarria eta APN-a beste ehun askotan isolatu dira

(Solhonne eta lank., 1987; Mantle, 1992; Yamamoto eta lank., 1998, Shimizu eta lank.,

2002). 1997an Tobler-en taldeak gizakiaren neuronetako PSA klonatu zuen.

Gure esperimentuetan, PSA espezie bietan azaldu da. Gainera, aminopeptidasa

honen aktibitatea ikertutako peptidasa guztien artean handiena dela ikusi dugu. Era berean,

mintzari lotutako peptidasa aktibitateen artean AP MII-arena izan da nagusia. Beraz

emaitza hauek beste argitarapenek diotenarekin bat datoz.

Banaketa erregionalari dagokionez, proentzefalina eta prodinorfina eta hauen

eratorriak NSZ eta periferikoko gune askotan isolatu dira, adibidez estriatua, hipokanpoa,

kortexa, hipotalamoa, e.a. (Roques, 1999). BPO batzuen hidrolisia sor dezakeen PSA garun

atal hoietan maila altuetan azaldu da. Hala ere, giza garun kortexean ikusitako PSA

solugarriaren aktibitatea beste ataletakoa baino eskasagoa izan da. Arratoi garunean ez da

berezitasun hau nabaritu.

Espezie arteko konparaketari dagokionez, giza garunean PSA-ren aktibitatea

arratoiarenean baino esangarriki handiagoa dela ikusi dugu. PSA solugarrian aztertutako atal

guztietan, eta AP MII-aren kasuan atal gehienetan azaldu dira emaitza hauek. Gainera,

hurrengo puntuan ikusiko dugun bezala APB aktibitatearen alderantzizko emaitzak izan

dira.

2.3. Arginil aminopeptidasa edo APB gizakia eta animalietan

isolatutako eta substratu bezala N-muturrean arginina edo lisina duten peptidoak

Eztabaida

Doktore-tesia

226

anderatzen dituen entzima da (Hopsu eta lank., 1966; Piesse eta lank., 2002). Entzima

solugarri bezala ezagutzen den peptidasa honek bere aktibitate egokia pH pixkat azidoan

daukanez (Mantle, 1992; O’Cuinn, 1997) barrunbe azpizelularretara hobeto egokitzen dela

eta bertan fenomeno fisiologiko ezberdinetan partaide dela deskribatu da (Foulon eta lank.,

1999).

Lan honetan garun atal ezberdinetako homogenatuen zatiki solugarrian aztertutako

APB-ak espezie bietan aktibitate handia duela ikusi dugu. PSA solugarriaren ostean

handiena. Gainera, arratoi garuneko APB aktibitatea era esangarrian gizakian baino

handiagoa dela ikusi dugu. Aktibitate garai hau zelula barnean gertatzeak APB-aren funtzioa

zein izan daitekeen jakitea zailagotu egiten digu. Bere ekintzen artean, hantura prozesuetan

sortutako bitartekari peptidikoen edota propeptido batzuen prozesamendua dagoela

proposatu da (Yasothornsikul eta lank., 1998; Foulon eta lank., 1999). Prozesu hauetan eta

beste batzuetan APB-ak nola eta non eragiten duen ezagutzan oraindik hutsune asko daude

eta ikerketa gehiago beharrezkoak izango dira.

Bestalde, APB eta baita PSA-ren balioak gizakiaren garun kortexean beste ataletan

baino txikiagoak izan dira. Emaitza hauek PEP-rekin ikusitakoaren alderantzizkoak izan

dira, atal arteko balore ezberdintasunak askoz txikiagoak diren arren. Zentzu honetan

azaldutako argitarapen eskasiak datu hauen esanahia zein izan daitekeen jakitea zailago

egiten duen arren, garunaren filogenesiarekin erlazioren bat izan dezakela susmatzera

eramaten gaitu.

Laburtuz, banaketa erregionalean azaldutako emaitza adierazgarrienak PEP, PSA

eta APB-ak jaurtitakoak izan dira.

2.4. Beste peptidasen banaketari dagokionez, nahiko homogeneoki

gertatzen da atal guztietan; eta espezie bietan ikusi ditugu peptidasa aktibitateak. Kasu

batzuetan joeraren bat ikusi den arren, ez da ezberdintasun esangarririk agertu garuneko

atalen artean.

APN-ak hurrengo puntuan zeresana duenez, bere banaketari buruzko azalpen txikia

egitea komeni da. Izan ere, entzima hau NSZ-an nagusiki bertako hodien endotelioan

Eztabaida

Doktore-tesia

227

kokatzen dela deskribatu da (Solhonne eta lank., 1987), baina duela gutxi Noble eta

lankideak (2001) egindako ikerlan batean aminopeptidasa hau NSZ-ko gune neuronal

askotan azaltzen dela deskribatu zuten. Entzima honen inhibitzailea den RB129 tritiatua

erabiliz, hipotalamoan, talamoan, hipokanpoan, estriatuan, kortexean, e.a. ataletan APN-a

neurrizko edo kantitate altuetan aurkitu du talde honek. Gure esperimentuetan ikusitakoa

datu hoiekin bat dator. Zerbait gehitzekotan, gure esperimentuetan amigdalan ere APN

aktibitatea agertzen dela esan behar.

Beste emaitza aipagarri bat, leuzil aminopeptidasaren aktibitate espezifikoa

kortexean arratoiarena baino handiagoa dela izan dugu (esangarria kortex parietalean).

Entzima solugarri honen funtzioa zein den oso ondo ez dakigun arren (BPO-ekiko ekintza

txiki bat omen du), ehun askotan hedatuta dagoenez proteinen bioeraldaketan

erantzunkizun nabaria izan lezakeela proposatu da (Gibson eta lank., 1991). Gure lan

honetan giza kortexean ikusitako berezitasun hori aipatzea adierazgarria iruditzen zaigu.

Laburbilduz, ikertutako peptidasa guztiak garunean zehar hedatzen direla esan

daiteke. Gainera, aktibitate altuena PSA solugarriak eta APB-ak daukate. Bestalde, PSA eta

PEP aktibitatea gizakian arratoietan baino handiagoa den bitartean, arratoi garunean APB-a

gizakiarena baino altuagoa da. Era berean, PEP, PSA solugarria eta APB-aren aktibitatea

giza garunean ez da homogeneoki banatzen (emaitza bereziki adierazgarria PEP-aren

kasuan).

Eztabaida

Doktore-tesia

228

3. Garuneko peptidasa aktibitateak

opiazeoekiko menpekotasunean.

Orain arte azaldutako guztia baldintza normaletan zeuden gizaki edo arratoien

garunetan eginiko ikerketak izan dira. Tesiaren azken puntuan neuropeptidoen

anderakuntzan opiazeoekiko menpekotasunak eraginik izan dezakeen aztertzen da.

Horretarako heroinarekiko tolerantzia zuten giza garunak eta morfinarekiko tolerantzia eta

abstinentziadun animali ereduen garunak izan ditugu aztergai.

Ikerketa fase honen helburu nagusia barne peptidoen anderakuntzan opiazeoen

erabilpen kronikoak aldaketarik sortzen duen jakitea izan da. Azken finean, morfina edo

heroinarekiko tolerantzia edo abstinentzia fenomenoak BPO sisteman izan lezakeen

eraginari buruzko ikerlan ugari azaldu dira, baina ezer gutxi dakigu peptido opioide hauen

katabolismoan zer gertatzen den egoera patologiko ezagun honetan. Zentzu honetan, BPO-

en anderakuntzan eragiten duten aminopeptidasa nagusiak (APN eta PSA) (Gros, 1985;

McLellan eta lank., 1988) ikertu ditugu.

Bestalde, beste peptidasen azterketak neuropeptido gehiagoren metabolismoan

opiazeoek duten eragina ezagutzen lagundu diezagukenez, PEP, APB, LAP, APA eta PGI

entzimak ere aztertu ditugu.

Gizaki heroinazaleen (eta hauen kontrolen) kasuan, lortu ahal izan den garun lagin

kantitatea eta barietatea mugatua izan da. Aztertutako atalak kortex prefrontala eta

estriatuko nukleo kaudatua izan dira. Morfinarekin tratatutako animalien kasuan berriz,

garun gune hoiez gain, amigdala, hipotalamoa, hipokanpoa, kortex parietala eta okzipitala

izan dira aukeratutakoak. Honen zergatia bigarren puntuan azaldutakoaz gain, opiazeoek

sortutako efektuak eta neuroegokitzeak aukeratutako garun gune gehienetan eragin berezia

duelako izan da. Adibidez, menpekotasun psikikoaren substratu neurala den sari-zirkuitu

edo sistema mesolinbikoak kortex prefrontalarekin, amigdala, hipokanpo, hipotalamo eta

estriatuarekin konexioak ditu (Koobs eta Nestler, 1997). Era berean, abstinentziaren

sintomen eragile garrantzitsuena mesentzefaloko locus coeruleus-a den arren, menpekotasun

Eztabaida

Doktore-tesia

229

fisikoan agertutako neuroegokitze fenomenoak aipatutako sari sistemako neuronetan eta

beste zelula askotan deskribatu dira (Nestler eta Aghajanian, 1997; Nestler, 2001).

3.1. Opiazeoekiko menpekotasuna eta BPO-en

katabolismoa:

Sarreran azaldu den bezala, gure nerbio sistema zentralean barne sistema opioidea

dagoela ezagutzean opiazeoen kontsumo kronikoak sistema honen alderdi ezberdinetan

nola eragiten duen ezagutzeko ikerketak gelditu gabeak izan dira. Morfina edo heroinaren

erabilpenak NSZ-ko gune ezberdinetan oreka patologiko berri bat ezartzen du.

Neuroegokitze prozesu honen lokarrietariko bat hartzaile-osteko fenomenoak direnaren

teoria tinko bat dago, non proteina ezberdinen metabolismoaren aldaketa ugari deskribatu

diren (Nestler eta Aghajanian; 1997).

Zentzu honetan aztertutako puntuetariko bat peptido opioideen erregulazioarena

izan da. Agertutako emaitzak eta proposamenak (batez ere peptido aktiboei dagokionez)

askotan kontrajarriak izan diren arren, neuropeptido hauen biosintesian beheranzko

erregulazio bat dagoela uste da (Trujillo eta Akil, 1991; Trujillo eta lank., 1995). Berriz,

BPO-en katabolismoaren erregulazioari buruz hutsune nabarmena daukagu.

Tesiaren puntu honetarako aztertutako aminopeptidasen artean APN-a izan da

entzefelina anderatzaile “in vivo” bezala onartutena (Gros, 1985). Hala ere, puromizinak

naloxona-bitartez itzulgarria den analgesia sor dezakela ikusi da (Herman eta lank., 1985)

eta esperimentu zuzenetan PSA-k entzefalinak anderaten dituela baieztatu da (McLellan eta

lank., 1988; Gibson eta lank., 1989; Mantle, 1992; e.a.). Gainera, aminopeptidasa biak beste

BPO edo hauen zati txikien hidrolisia (dinorfina antzeko peptido txikiak adibidez) egiten

duela deskribatu da (Taylor, 1993).

Gure ikerlanetan opiazeoek bai APN eta bai PSA aktibitatearen gain eragina dutela

ikusi dugu:

Eztabaida

Doktore-tesia

230

3.1.1. Alanina aminopeptidasa N-ari (APN) dagokionez, aurkitutako aldaketa

esangarriak opiazeoekiko menpekotasun animalia ereduetan azaldu dira, bai tolerantzia

taldean (morfina soilik) zein abstinentzia taldean (morfina + naloxona).

Lehenengo eta behin, aipatzekoa da tolerantzian dauden arratoien garuneko atal

guztietan APN aktibitatea arratoi-kontrolena baino handiagoa izan dela eta abstinentzia

agertu duten animalietan kontrako joera ikusi dela. Emaitza hauek atal batzuetan

esangarriak izan dira.

I. Morfinarekiko tolerantzia taldeko arratoien amigdalan, hipotalamoan eta

kaudatuan APN-aren aktibitatea kontroletakoa baino esangarriki altuagoa izan da. Datu

hauek Malfroy eta lankideak (1978) eta Hui eta lankideak (1981) deskribatutakoarekin bat

datoz, autore hauek morfinazko tratamendu kronikoak entzefalinen anderakuntza

handitzen duela adierazi baitzuten. Gure esperimentuetan APN aktibitate aldaketak izan

dituzten gune hoiek era batera edo bestera opiazeoekiko menpekotasunaren substratu

neuronalarekin erlazionatu dira (Koob eta Nestler, 1997).

Gune hauetan APN aktibitate altuak entzefalina mailetan eraginen bat izatea

esperogarria litzateke. Zentzu honetan 2Gudehithlu eta lankideak (1991) hipotalamoan,

hipofisian, amigdalan, e.a. gunetan endorfina eta entzefalina maila jaisteak deskribatu

zituzten tolerantziadun arratoietan. BPO-en beherapenak agertzen dituzten lan gehiago ere

azaldu dira (Shani eta lank., 1979; e.a) baina aldaketarik gertatzen ez dela edo mailak igo

egiten direla dioten beste lan asko ere badira (Simantov eta Snyder, 1976; Fratta eta lank.,

1977; Childers eta lank., 1979; e.a.). Beraz, gure esperimentuetan jasotako emaitzen

esanahia ulertzea nahiko zaila dela esan genezake.

Kaudatuan aurkitutako APN aktibitate igotzeak aipamen berezia merezi du. Izan

ere, estriatuan proentzefalina edo prodinorfinadun neuronen dentsitatea nahiko altua dela

deskribatu da eta BPO-ek ekintza motibazionaletan eragina dutela idatzi da (Trujillo eta

lank., 1995). Gainera, gune honek sistema dopaminergikoetatik (substantzia beltza edo sari-

zirkuituak adibidez) projekzio ugari jasotzen ditu (1Gudehithlu eta lank., 1991; Koob eta

Nestler, 1997; Nestler, 2001). Neurona hauek estriatuko met-entzefalinen metabolismoa

modulatzen dutela deskribatu da, dopamina-antagonista den haloperidolak edo dopamina

Eztabaida

Doktore-tesia

231

biltegien agortzea eragiten duen MPTP-ak met-entzefalina edo “antzeko” peptido txikien

mailak igoarazten dituztela ikusi baita (Houdi eta Van Loon, 1990; 1Gudehithlu eta lank.,

1991). Ideia honi helduz, Konkoy eta Waters-en taldeek (biek 1996an) haloperidolak

estriatuan eta garun kortexean APN-aren aktibitatea gutxitzen duela ikusi zuten, farmako

honek estriatuan sortutako met-entzefalinen maila igotzeak entzima hau inhibituz gertatu

litezkeela proposatuz. Argitaratu berria den ikerlan batean, gizakiaren plasman eginiko “in

vitro” esperimentuetan fenotiazina ezberdinek (dopamina antagonistak) leu-entzefalinen

anderakuntza inhibitu dezaketela ikusi dute (Mosnaim eta lank., 2003).

Opiazeoek eta beste droga menpekotasun sortzaileek ezaugarri fisiopatologiko

amankomun bat dute; bide mesolinbiko dopaminergikoaren (sari-zirkuituen) aktibazioa

(Nestler, 2001; Fernández-Espejo; 2002). Beharbada, gure esperimentuetan morfinarekin

kronikoki tratatutako arratoien estriatuan azaldutako APN aktibitate altua dopamina

hiperaktibitatearen efektu ez-zuzena izan liteke. Hala ere, hipotesi hau baieztatzeko beste

ikerketa espezifikoagoak egitea beharrezkoa dela iruditzen zaigu.

II. Naloxonarekin eragindako abstinentziadun arratoietan APN-aren aktibitateak

tolerantzian zeudenen kontrako joera agertu du. Kasu honetan esangarria izan da

hipokanpoan agertutako APN aktibitatearen gutxitzea.

APN-ak entzefalinen anderakuntzan duen funtzio kontutan hartuz, entzima honen

aktibitate gutxitzeak gune honetako peptido opioideen erabilgarritasuna handitzea eragin

beharko luke abstinentzia sindromean. Zentzu honetan, BPO-en katabolismoaren

inhibitzaileekin egindako ikerketetan konposatu hauek naloxonaz eragindako abstinentzia

sintomak leundu ditzaketela deskribatu da (Maldonado eta lank., 1992; Roques eta Noble,

1995). Bestalde, entzefalinen ekoizpenean eragina duen endo-oligopeptidasa aktibitatea

handituta azaldu zen naloxonaz eragindako abstinentziadun arratoien hipokanpoan (Paik

eta lank., 1994).

Datu hoiek kontuan hartuz, posible litzateke abstinentzian agertutako APN maila

gutxitzeak erregulazio mekanismo bat izatea abstinentzia sintomen murrizketa eragiteko.

Hala ere, emaitza honen irakurketa ez da batere erraza, opiazeoekiko abstinentzia

Eztabaida

Doktore-tesia

232

sindromea eta entzefalina mailak erlazionatzen dituzten ikerlanetan ez dagoelako

adostasunik (Wüster eta lank., 1980; Bergstrom eta Terenius, 1979; Uhl eta lank., 1988).

3.1.2. Puromizinarekiko sentikorra den aminopeptidasari (PSA) dagokionez,

aurkitutako aldaketa esangarriak heroinazaleetan eta opiazeoekiko menpekotasun animalia

ereduetan (tolerantzia eta abstinentzia taldeetan) azaldu dira; baina soilik PSA solugarrian.

Kasu honetan ere animalietan APN-arekin ikusitako joera azaldu da. Tolerantzian

zeuden arratoietan PSA-ren aktibitatea kontrolena baino handiagoa izan den bitartean,

abstinentziadunetan kontrako joera aurkitu dugu. Aktibitate mailen arteko ezberdintasunak

handiegiak ez diren arren, bai gizakia eta arratoiaren garuneko atal konkretu batzuetan

esangarriak izan dira.

I. Opiazeoekiko tolerantzia egoeran bai gizakia heroinazale eta bai arratoi

“morfinazaleen” garun kortex prefrontalean PSA solugarriaren aktibitatea altuagoa dela

ikusi da. Emaitza hau espezie bietan eta garun gune konkretu honetan gutxituta aurkitu

izanak bere garrantzia izan lezake; kortex prefrontala menpekotasunaren gune

garrantzitsuenetarikoa baita, bertara sistema mesolinbiko dopaminergikoko neurona ugari

heltzen direlako (Nestler eta Aghajanian, 1997; Nestler, 2001).

Heroina eta BPO-a erlazionatzen dituzten ikerlanak eskasagoak dira; are gutxiago

gizakietan egindakoak. Gure esperimentuetan heroinazaleetan aurkitutako aktibitate

handitzeak Weissman eta Zamir-ek (1987) eta Cappendijk eta lankideak (1999)

adierazitakoarekin kontrajartzen direla esan daiteke. Ikerlari hauek diotenez heroina

tratamendu kronikoak entzefalina eta dinorfina mailak igotzea eragiten du. Hala ere,

emaitza hauek animalia ereduetan eta NSZ-ko beste gune batzuetan aurkitu ziren.

II. Abstinentzia sindromeari dagokionez arratoien garunean PSA solugarriaren

aktibitatea kontrolena baino txikiagoa dela ikusten da; kortexean eta estriatuan datuak

esangarriak direlarik.

Eztabaida

Doktore-tesia

233

Zentzu honetan, entzefalina, dinorfina edo endorfinak zuzenki edo era ez-zuzenean

abstinentzian dauden heroinazaleei edo animaliei ematean sindrome horren sintomatologia

murriztu egiten dela deskribatu da (Tseng eta lank., 1976; Clement-Jones eta lank., 1979;

Wen eta lank., 1983). Beharbada PSA-ren murrizketak zentzuren bat izan lezake

abstinentzia prozesuan.

Dena den, PSA-k BPO-en anderakuntzan eta (ondorioz) menpekotasunaren

fisiopatologian zein eratan eta non eragin dezakeen asmatzea nahiko zaila da, gehienbat

entzima zitosolikoa baita. Puromizinak entzefalinen anderakuntza inhibitu dezakeela eta

PSA-k BPO ezberdinak anderatzen dituela ezarrita dago (Chailet, 1983; Taylor, 1993) baina

bere funtzio fisiologikoa oraindik oso eztabaidatua da.

Sarreran, emaitzetan eta eztabaida honetan ikusi den bezala opiazeoekiko

menpekotasunak BPO-en anderatzaileak diren aminopeptidasa nagusienetan eraginen bat

badu. Baina BPO-en katabolismoaren aldaketa hauei ez dizkiete zuzenean peptido hoien

maila gutxitze (tolerantzian) edo handitzeak (abstinentzian) jarraitzen; edo behintzat zentzu

honetan datuak kontrajarriak dira (Trujillo eta Akil, 1991; Trujillo eta lank., 1995). Baina

honek ez du esan nahi neurona opioidergikoetan erregulazioren bat gertatzen ez denik.

Azken finean, neurona hauen barneko peptido edukina prozesu ezberdinen menpe baitago.

Alegia, biosintesia, askapena eta anderakuntzaren menpe. Adibidez, Saria eta lankideak

(1997) neutral endopeptidasa 24.11-ren genea ezabatuta zeukaten saguetan leu eta met-

entzefalina mailak igo beharrean jaitsita daudela ikusi zuten. Emaitza hau paradoxikoa

dirudien arren, sagu hauetan entzefalinen biosintesiaren feed-back negatiboa gertatzearen

ondorioz peptido hauen mailak jaisten direla adierazi zuten.

Antzeko arrazonamenduarekin Trujillo eta Akilek (1991) morfinaren eraginpean

BPO-en biosintesiaren feed-back negatiboa gertatzen dela adierazi zuten. Biosintesiaren

beherakada hau nahiko ixila mantentzen da morfinaren efektupean (tolerantzia), opiazeoen

efektuetariko bat neuronengain neurotransmisoreen askapen inhibizioa baita (Lorenzo eta

lank., 1999). Abstinentzian neurona opioidergikoen hiperaktibitate egoerak BPO biltegiak

azkar agortu litzake, biosintesia inhibituta egon baita.

Eztabaida

Doktore-tesia

234

PSA solugarrian ikusitako aldaketek BPO-en biosintesiaren beheranzko

erregulazioaren hipotesian izan dezaketen kokapena asmatzea ez da erraza. Cummins eta

O’Connor-ek (1998) entzima solugarrien funtzioetariko bat zelula barnean neuropeptidoen

edukina gehiegizkoa denean hauek anderatzea izan daitekeela proposatu zuten. Beharbada

morfinak edo heroinak neurona opioidergikoetan eragindako neuropeptidoen askapenaren

inhibizioaren ondorioz zelula barnean pilatutako BPO edo “antzeko” peptido txikien gain

PSA solugarriak eraginen bat izan dezake.

Laburbilduz, tesi honen azken helburu nagusia opiazeoekiko tolerantzia eta

abstinentzia egoerak BPO-ak anderatzen dituzten aminopeptidasetan eraginik duenentz

jakitea izan da. Bai APN-a eta PSA solugarriaren kasuan aktibitate entzimatiko hauek

garuneko gune ezberdinetan aldaketak jasaten dituztela aurkitu dugu; beraz fenomeno

patologiko hauetan zerikusiren bat izan lezaketela proposatzen dugu. Hala ere, oraindik gai

honetan dauden hutsuneak oso nabariak dira eta hauek betetzeko beste ikerlan gehiago eta

sakonagoak beharrezkoak izango dira.

3.2. Opiazeoekiko menpekotasuna eta beste peptido

batzuen anderakuntza:

Tesiaren azkenengo etapan heroinak edo morfinak 1. eta 2. puntuetan azaldutako

beste peptidasengain (PEP, APB, LAP, APA eta PG I) efekturik izan dezakeen ikustea izan

da, opiazeoen kontsumoak hainbat neuropeptido ezberdinen biosintesia edo askapenaren

gain eragina duela deskribatu baita (Lorenzo eta lank., 1999).

Hildu honetan peptidasa hauek eta beste batzuei buruz azaldutako ikerlanak oso

eskasak izan dira. Morfinarekin egindako tratamenduei dagokionez, ehun ezberdinetan

PEP, dipeptidil-peptidasa IV, angiotensina eraldatzen duen entzima, e.a. peptidasen

aktibazioa deskribatu da (Idänpään-Heikkilä eta lank., 1995; Korányi eta lank., 1989; Melzig

eta lank; 1998). Beste droga psikoaktibo batzuen artean, etanolak garunean guk aztertutako

peptidasen gain aldaketak eragiten dituela adierazi dute Mayas eta lankideek (2001 eta

2002).

Eztabaida

Doktore-tesia

235

Gure esperimentuetan jasotako emaitza gehienetan ez dugu peptidasen aktibitatean

aldaketa esangarririk aurkitu ezta gizakia ezta arratoiaren garunean. Hala ere, gizakiaren

garunean PEP-aren aldaketak azaldu dira eta arratoiaren garun kortexean PEP eta APB-

aren aktibitate aldaketaren bat aurkitu dugu.

I. Lehenengoaren kasuan gizakian eta arratoiaren garunean azaldutako emaitzak

pixkat paradoxikoak iruditu zaizkigu. Gizakiek tolerantzia egoeran daudela PEP-aren

aktibitate txikiagoa azaltzen baitute eta emaitza berdina abstinentziadun arratoien garun

kortexean (parietala) agertu baita. Emaitza hauen kokapena opiazeoek eragindako

prozesuetan ez dirudi errezegia, egoera patologiko honetan entzima honi buruzko ikerlanik

ia ez baitago. PEP-ak TRH-aren eta beste peptido batzuen anderakuntza eragiten duela

ezarrita dago (Welches eta lank., 1993). TRH-ak opiazeoekiko abstinentzia sindromearen

modulazio funtzioren bat izan lezakeen ikerlan ugari agertu dira, egoera honetan bere

sintesia igo egiten dela deskribatu baita (Ghan eta Sevarino, 1996; Legradi eta lank., 1996;

Nillni eta lank., 2002). Gure esperimentuetan ikusitakoa PEP-aren aktibitate aldaketak

erregulazio bide honetan kokatuta egon litezke.

II. APB-ari dagokionez, tolerantzia egoeran ez da inolako aldaketarik azaldu, baina

abstinentziadun arratoietan garun kortexean aktibitate txikiagoak aurkitu ditugu. Zelula

barneko aktibitate altua duen entzima honek proentzefalina, prokolezistokinina e.a.

propeptido edo aitzindariren prozesamenduan eraginen bat izan lezakeela proposatu da

(Yasothornsrikul eta lank., 1998; Foulon eta lank., 1999). Zentzu honetan, posible litzateke

APB-ak erregulazioren bat jasatea abstinentzia egoeran gertatutako fenomenoen barnean.

III. Beste peptidasei dagokionez (LAP, APA eta PG I), morfinaren efektupean

hauen substratua diren neuropeptido batzuen erregulazioak gertatzen direla ezaguna den

arren (Lorenzo eta lank., 1999), gure esperimentuetan ez dugu emaitza azpimarragarririk

ikusi.

Eztabaida

Doktore-tesia

236

VI. Ondorioak

Ondorioak

Doktore-tesia

237

I. Ikertutako peptidasa aktibitateak (PSA, APN, PEP, APB, LAP, APA eta PG I)

gizakia eta arratoiaren garunean aztertutako atal eta zatiki azpizelular guztietan aurkitzen

dira. Gainera, peptidasa aktibitate solugarria mintzari lotutakoa baino handiagoa izan da, eta

handiena PSA solugarriak eta APB-ak izan dute..

II. Peptidasa solugarrien banaketa azpizelularra gehienbat zitosolikoa da, baina zati

handi bat bukaera sinaptikoan (sinaptosometan) ematen da. Aktibitate maila altua denez,

zatiki hauetan peptidoen erregulazioan funtzio garrantzitsuren bat daukatela esan behar da.

III. Mintzari lotutako peptidasa aktibitate nagusiak (APN-a izan ezik) zatiki

mielinikoan eta sinaptosomalean agertu dira. Kokapen mielinikoak nerbioen garapen edo

endekapen prozesuekin erlazioa izan lezake. Era berean, kokapen sinaptosomalak, gune

sinaptikoan neuropeptido aktiboen anderakuntzarekin erlazioa dauka.

IV. APN aktibitate azpizelular nagusia nukleoan azaldu da. Aktibitate hau met-

entzefalinak (opioid growth factor edo OGF bezala ezagutua) zelulen garapenean duen

funtzioarekin erlazionatuta egon daiteke.

V. Giza garuneko PEP eta PSA-ren aktibitateak arratoiarenak baino esangarriki

handiagoak dira; berriz, APB aktibitate gehiago dago arratoi garunean.

VI. PEP aktibitatea gizakiaren kortexean ebolutiboki atzeratuagoak dauden

guneetan baino askoz altuagoa da. Alderantziz, PSA solugarria eta APB-aren kortexeko

aktibitateak eskasagoak dira (maila txikiago batean). Peptidasa hauek, batez ere PEP-ak,

garun kortexaren garapenean eta fisiologian ekintza bereziren bat izan dezaketela

proposatzen dugu.

VII. Barne peptido opioideak (nagusiki entzefalinak) anderatzen dituzten

aminopeptidasen artean aktibitate altuenak PSA solugarriak eta txikienak APN-ak azaltzen

dituzte bai gizakia zein arratoiaren garunean.

Ondorioak

Doktore-tesia

238

VIII. APN aktibitatea tolerantziadun arratoien garunean igo egiten den bitartean

(esangarriki amigdala, hipotalamoa eta kaudatuan), abstinentzian jaitsi egiten da

(hipokanpoan esangarria).

IX. PSA solugarriaren aktibitatea tolerantziadun gizakia eta arratoietan igo egiten

den bitartean (esangarria bien garunaren kortex prefrontalean) abstinentziadun arratoietan

jaitsi egiten da (kortexean eta estriatuan esangarria). Opiazeoen efektupean bai APN eta

PSA-ren aktibitate aldaketa hauek menpekotasunean gertatuko fenomeno ezberdinetan

eraginen bat izan dezakete.

X. Opiazeoekiko tolerantzia edo abstinentzian PEP aktibitate aldaketak aurki

daitezke gizakiaren garun kortexean, eta PEP-a eta APB-arenak arratoiaren garun

kortexean. Beharbada, opiazeoek opioideak ez diren neuropeptidoen erregulazioan ere

eragina izan lezakete.

VII. Bibliografia

Bibliografia

Doktore-tesia

239

Alreja M, Aghajanian GK. Opiates supress a resting sodium-dependent inward current and

activate an outward potassium current in locus coeruleus neurons. J Neurosci. 13: 3525-3532.

1993.

Aghajanian GK. Tolerance of locus coeruleus neurones to morphine and supression of withdrawal

response by clonidine. Nature. 276: 186-188. 1978.

Aghajanian GK, Kogan JH, Moghaddam B. Opiate withdrawal increases glutamate and

aspartate efflux in the locus coeruleus: an in vivo microdialysis study. Brain Res. 636: 126-130.

1994.

Agirregoitia N, Irazusta A, Ruiz F, Irazusta J, Gil J. Ontogeny of soluble and particulate

prolyl endopeptidase activity in several areas of the rat brain in the pituitary gland. Dev. Neurosci.

(onartua).

Akil H, Mayer DJ, Liebeskind JC, Fessard MA. Comparison chez le rat entre l’analgesie

induite par stimulation de la substance gris peri-aqueductale et l’analgesie morphinique. Acad. Sci.

Paris Ser.D 274: 3603-3605. 1972.

Akil H, Mayer DJ, Liebeskind JC. Antagonism of stimulation-produced analgesia by

naloxone, a narcotic antagonist. Science. 191: 961-962. 1976.

Akil-H, Owens-K, Gutstein-H, Taylor-L, Curran-E, Watson-S. Endogenous opioids:

overview and current issues. Drug and alcohol dependence. 51: 127-140. 1998.

Alba F, Arenas JC, Lopez MA. A fluorimetric method for the determination of brain

aminopeptidases. Arch. Neurobiol., 52: 169-173. 1989.

Alba F, Arenas JC, Lopez MA. Comparison of soluble and membrane-bound pyroglutamyl

peptidase I activities in rat brain tissues in the presence of detergents. Neuropeptides. 29: 103-107.

1995.

Bibliografia

Doktore-tesia

240

Alvarez VA, Arttamangkul S, Dang V, Salem A, Whistler JL, Von Zastrow M,

Grandy DK, Williams JT. Mu-opioid receptors: Ligand-dependent activation of potassium

conductance, desensitization and internalization. J Neurosci. 22: 5769-5776. 2002.

American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders

(DSM-IV). Fourth edition. Washington, D.C.: American Psychiatric Press. 1994.

American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders

DSM-IV-TR (Text Revision). Fourth edition. 2000.

Amodeo P, Lopez Mendez B, Guerrini R, Salvadori S, Temussi PA, Tancredi T.

Pain peptides. Solution structure of orphanin FQ2. FEBS Lett. 473(2): 157-160. 2000.

Appleyard SM, Celver J, Pineda V, Kovoor A, Wayman GA, Chavkin C. Agonist

dependent desensitization of the kappa opioid receptor by G protein receptor kinase and beta-arrestin. J

Biol. Chem. 274: 23802-7. 1999.

Araujo DM, Lapchak PA, Robitale Y, Gautheir S, Quirion R. Differential alteration of

various cholinergic markers in cortical ans subcortical regions of human brain Alzheimer’s disease.

Neurochemis. Neurochem. 50: 1914-1923. 1988.

Arvidsson U, Riedl M, Chakrabarti S, Vulchanova L, Lee JH, Nakano AH, Lin X,

Loh HH, Law PY, Wessendorf MW. The kappa-opioid receptor is primarily postsynaptic:

combined inmunohistochemical localization of the receptor and endogenous opioids. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA. 92(11): 5062-5056. 1995.

Banda RW, Means M, Fitzgerald M, Scherch H. Trophic effect of thyrotropin releasing

hormone on neuronal process in culture. Neurology. 37: 285-295. 1987.

Banda RW, Means M, Samaha F. Trophic effect of thyrotropin releasing hormone on murine

ventral horn neurons in culture. Ann. Neurol. 35: 93-97. 1985.

Bibliografia

Doktore-tesia

241

Balogh A, Cadel S, Foulon T, Picart R, Der garabedian A, Rousselet A, Tougard C,

Cohen P. Aminopeptidase B: a processing enzyme secreted and associated with the plasma membrane

of rat pheochromocytoma (PC12) cells. J. Cell. Sci. 111: 161-169. 1998.

Basheer R, Tempel A. Morphine-induced reciprocal alterations in Gαs and opioid peptide

mRNA levels in discrete brain regions. J Neurosci Res. 36: 551-557. 1993.

Bauer K. Adenohypophyseal degradation of thyrotropin releasing hormone regulated by thyroid

hormones. Nature. 330: 375-377. 1987.

Bauer K. Integrative neuroendocrinology: Molecular, cellular and clinical aspects. McCann and

weiner (Eds.). pp 102-114. 1987.

Beckett AH, Casy AF. Stereochemestry of certain analgesics. Nature. 173: 1231-1232. 1954.

Beitner D, Duman RS, Nestler EJ. A novel action of morphine in the rat locus coeruleus:

persistent decrease in adenilate cyclase. Mol. Pharmacol. 35: 559-564. 1989.

Belluzi JD, Grant N, Garsky V, Sarantakis D, Wise CD, Stein D. Analgesia induced in

vivo by central administration of enkephalin in rat. Nature. 260: 625-626. 1976.

Bergström L, Terenius L. Enkephalin levels decrease in rat striatum during morphine

abstinence. Eur J Pharmacol. 60: 349-352. 1979.

Berguemeyer HU, Brent E. UV assay with piruvate and NADH. Methods in enzymatic

analysis. Academic press, London. 2: 574-577. 1972.

Bhargava HN. The effects of thyrotropin-releasing hormone on the central nervous system

responses to chronic morphine administration. Psychopharmacology (Berl). 68: 185-189. 1980.

Bishop GB, Cullinan WE, Curran E, Gutstein HB. Abused drugs modulate RSG4

mRNA levels between acute drug treatmen and drug chalenge after chronic treatment. Neurobiol

Dis. 10: 334-343. 2002.

Bibliografia

Doktore-tesia

242

Bohn LM, Lefkowitz RJ, Gainetdinov KP, Caron MG, Lin FT. Enhanced morphine

analgesia in mice laking –arrestin 2. Science. 286: 2405-2498. 2405-2498. 1999.

Bongianni F, Carla V, Moroni F, Pellegrini Giampietro DE. Calcium channel inhibitors

supress the morphin-withdrawal syndrome in rats. Br.J.Pharmacol. 88: 561-567. 1986.

Boudinot E, Morin-Surun M, Foutz AS, Fournié-Zaluski M, Roques BP, Denavit-

Saubié M. Effect of the potent analgesic enkephalin-catabolizing enzyme inhibitors RB101 and

kelatorphan on respiration. Pain. 90: 7-13. 2001.

Bradford HF. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram of protein

utilizing the principle of the protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254. 1976.

Bronstein DM, Przewlocki R, Akil H. Effects of morphine treatment on pro-opiomelanocortin

systems in rat brain. Brain Res. 519: 102-111. 1990.

Browne P, O’Cuinn G. An evaluation of the role of a pyroglutamyl peptidase, a post-proline

cleaving enzyme and a postproline dipetidyl aminopeptidase, each purified from the soluble fraction of

guinea-pig brain, in the degradationof thyroliberin in vitro. Eur. J. Biochem. 137: 75-87. 1983.

Busquets X, Escriba PV, Sastre M, Garcia-Sevilla JA. Loss of protein kinase C-alpha beta

in brain of heroin addicts and morphine – dependent rats. J Neurochem. 64: 247-252. 1995.

Calo G, Guerrini R, Salvadori S, Regoli D. Pharmacology of nociceptin and its

receptor: a novel terapeutic agent. Br. J. Pharmacol. 129(7): 1261-1283. 2000.

Cappendijk SLT, Hurd YL, Nylander I, van Ree JM, Terenius L. A heroin-, but not

cocaine-expecting, self administration state preferentially alters endogenous brain peptides. Eur. J

Pharmacol. 365: 175-182. 1999.

Cesarone CF, Bolognesi C, Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in

biological material using 33258 Hoechst. Anal.Biochem. 100: 188-197. 1979.

Bibliografia

Doktore-tesia

243

Cesselin F. Opioid and anti-opioid peptides. Fundam Clin. Pharmacol. 9: 409-433. 1995.

Chaillet P, Coulaud A, Zajac JM, Fournie-Zaluski MC, Costentin J, Roques BP. The

µ rather than de δ subtype of opioid receptors appears to be involved in the enkephalin induced

analgesia. Eur. J. Pharmacol. 101: 83-90. 1984.

Chaillet P, Marcais-Collado H, Costentin J, Yi CC, De la Baume S, Schwartz JC.

Inhibition of enkephalin metabolism and antinociceptive activity of bestatin, an aminopeptidase

inhibitor. Eur. J. Pharmacol., 86: 329-336. 1983.

Chang JY, Janak PH, Woodward DJ. Comparison of mesocorticolimbic neuronal responses

during cocaine and heroin self-administration in freely moving rats. J. Neurosci. 18: 3098-3115.

1998.

Chang KJ, Cuatrecasas P. Multiple opiate receptors: enkephalins and morphine bind to

receptors of diferent specificity. J. Biol. Chem. 254: 2610-2618. 1979.

Chang KJ, Miller RJ, Cuatrecasas M. Interaction of enkephalin with opiate receptors in intact

cultured cells. Mol. Pharmacol. 14: 961-970. 1978.

Chieng B, Bekkers JM. GABAB, opioid and α2 receptor inhibition of calcium channels in

acutely-dissociated locus coeruleus neurones. Br.J.Pharmacol. 127: 1533-1538. 1999.

Childers SR. Opioid receptor-coupled second messenger systems. Life Sciences. 48: 1991-2003.

1991.

Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D, Pacheco M, Sexton T, Ward S.

Opioid and cannabinoid receptor inhibition of adenylyl cyclase in brain. Ann Y Acad. Sci. 654: 33-

51. 1992.

Childers SR, Simantov R, Snyder SH. Enkephalin: radioinminoassay and radioreceptor

assay in morphine dependents rats. Eur J Pharmacol. 46: 289-293. (1979).

Bibliografia

Doktore-tesia

244

Christie MJ, Williams JT, North RA. Cellular mechanism of opioid tolerance: studies in single

brain neurons. Mol. Pharmacol. 32: 633-638. 1987.

Civelli O, Machida C, Bunzow J, Alber P, Hanneman E, Salon J, Bidlack J, Grandy

D. The next frontier molecular biology of the opioid system. The opioid receptors. Mol. Neurobiol.

1: 373-391. 1987.

Clement-Jones V, McLoughlin L, Lowry PJ, Besser GM, Rees LH, Wen HL.

Accupunture in heroin addicts; changes in met-enkephalin and beta-endorphin in blood and

cerebrospinal fluid. Lancet. 2: 380-383. 1979.

Comb M, Seeburg PH, Adelman J, Eiden L, Herbert E. Primary structure of the human

Met- and Leu-enkephalin precursor and its mRNA. Nature 295, 663-666. 1982.

Constam DB, Tobler AR, Resinghel A, Kemler Y, Hersh LB, Fontana A. Puromycin

sensitive aminopeptidase: sequence and analysis, expression and functional characterization. J Biol

Chem. 270: 26931-26939. 1995.

Coven E, Ni Y, Winell KL, Chen J, Walker WH, Habener JF, Nestler EJ. Cell type-

specific regulation of CREB gene expression: mutational analisis of CREB promoter activity. J

Neurochem. 71: 1865-1874. 1998.

Coyle JT, Donald LP, Delong MR. Alzheimer’s disease; a disorder of cortical cholinergic

innervation. Science. 219: 1184-1189. 1983.

Cruciani RA, Dvorkin B, Morris SA, Crain SM, Makman MH. Direct coupling of opioide

receptors to both stimulatory and inhibitory guanine nucleotide-binding proteins in F-11

neuroblastoma-sensory neuron hybrid cells. Proc. Natl. acad. Sci. USA. 90(7): 3019-3023. 1993.

Cummins PM, O’Connor B. Pyroglutamyl peptidase: an overview of the three known

enzymatic forms. Bichim. Biophys. Acta 1429: 1-17. 1998.

Bibliografia

Doktore-tesia

245

Dando PM, Fortunato M, Strand GB, Sith TS, Barrett AJ. Pyroglutamyl-peptidase I:

cloning, sequencing, and characterisation of the recombinant human enzyme. Prot. Expr. and Purif.

28: 111-119. 2003.

Danielson PB, Hoversten MT, Fitzpatrick M, Schreck C, Akil H, Dores RM. Sturgeon

orphanin: A molecular "Fossil" that bridges the gap between the opioids and orphanin FQ/N. J.

Biol. Chem. 276:25. 22114-22119. 2001.

De Mello WC, Danser AH. Angiotensin II and the heart: on the intracrine renin-angiotensin

system. Hypertension. 35: 1183-1188. 2000.

Dhawan, BN, Cesselin F, Raghubir R, Reisine T, Bradley PB, Portoghese PS and

Hamon M.. International Union of Pharmacology. XII. Classification of Opioid Receptors.

Pharmacol. Rev. 48, 567 - 592. 1996.

Dresdner K, Burker LA, Orlowski M, Wilk S. Subcellular distribution of prolyl

endopeptidase and cation-sensitive neutral endopeptidase in rabbit brain. J. Neurochem. 36: 1151-

1156. 1982.

Dodd PR, Hardy JA, Bradford HF, Benett GW, Edwardson JA, Harding BN.

Metabolic and secretory processes in nerve-endings isolated from post-mortem brain. Neuroscience

Letters. 11: 87-92. 1979.

Duman RS, Tallman JF, Nestler EJ. Acute and chronic opiate regulation of adenilate cyclase

in rat brain: specific effects in locus coeruleus. J. Pharmacol. Exp. Ther. 246: 1033-1039. 1988.

Delfs JM, Kong H, Mestek A, Chen Y, Yu L, Reisine T, Chesselet MF. Expression of

mu opioid receptor mRNA in rat brain: an in situ hybridisation study at the single cell level. J.

Comp. Neurol. 345: 46-68. 1994.

Bibliografia

Doktore-tesia

246

Dingledine R, Velentino RJ, Bostock E, King ME, Chang KJ. Downregulation of delta

but not mu opioid receptors in the hippocampal slice associated with loss of physiological response. Life

Sci. 33: 333-336. 1983.

Douglas WW. How do neurones secret peptides? Exocitosis and its consequences, including

synaptic vesicle formation, in the hypothalamo – neurohypophysial system. Prog. Brain Res. 39: 21-

39. 1973.

Duman RS, Tallman JF, Nestler EJ. Acute and chronic opiate-regulation of adenilate cyclase

in brain: specific effects in locus coeruleus. J Pharmacol. Exp. Ther. 246: 1033-1039. 1988.

Dyer SH, Slaughter CA, Orth K, Moomaw CR, Hersh LB. Comparison of the soluble

and membrane-bound forms of the puromycin-sensitive enkephalin aminopeptidases from rat. J

Neurochem. 54: 547-554. 1990.

Elde R, Arvidsson U, Riedl M, Vulchanova L, Lee JH, Dado R, Nakano A,

Chakrabarti S, Zhang X, Loh HH. Distribution of neuropeptide receptors. New views of

peptidergic neurotransmission made possible by antibodies to opioid receptors. Ann. N. Y. Acad. Sci.

757:390-404. 1995.

Elzo J, Comas D, Laespada MT, Salazar L, Vielva I. La cultura de las drogas en los

jóvenes: Ritos y fiestas. Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco. 2000.

Escohotado A. Historia general de las drogas. Editorial Espasa. 1999.

Fan XL, Zhang JS, Zhang XQ, Yue W, Ma L. Differential regulation of beta-arrestin 1 and

beta-arrestin 2 gene expression in rat by morphine. Neuroscience 117: 383-389. 2003.

Fernández D, Valdivia A, Irazusta J, Ochoa C, Casis L. Peptidase activities in human

semen. Peptides. 23: 461-468. 2002.

Fernández-Espejo E. ¿Cómo funciona el nucleus accumbens?. Rev Neurol. 30: 845-849.

2000.

Bibliografia

Doktore-tesia

247

Fernández-Espejo E. Bases neurobiológicas de la drogadicción. Rev. Neurol. 34: 659-654.

2002.

Florez J. Farmacología humana. Ed. Masson (3ª ed). Barcelona (1998).

Foote SL, Bloom FE, Aston-Jones G. Nucleus locus coeruleus: new evidece of anatomical

and physiological specificity. Physiol. Rev. 63: 844-914. 1983.

Foulon T, Cadel S, Cohen P. Aminopeptidase B (EC 3.4.11.6). Int. J. Biochem. And

Cell. Biol. 31: 747-750. 1998.

Fournié-Zaluski MC, Perdrisot R, Gacel G, Swerts JP, Roques BP, Schwartz JC.

Inhibitory potency of various peptides on enkephalinase activity from mouse estriatum. Biochem.

Biophys. Res. Comm. 91: 130-135. 1979.

Fox-Threlkeld J.A.E.T, Daniel EE, Christnick, F, Hruby VJ, Cipris S, Woskowska

Z. Identification of mechanisms and sites of action of mu and delta receptor activation in the canine

intestine. J.Pharmacol. Exp. Ther. 268:689-700. 1994.

Fratta W, Yang HY, Hong J, Costa E. Stability of Met-enkephalin content in brain

structures of morphine-dependent or foot shock-stressed rats. Nature. 268: 452-453. 1977.

Freedman NJ, Lefkowitz RJ. Desensitization of G-protein coupled receptors. Recent. Prog.

Horm . Res. 51: 319-353. 1996.

Frey HJ, Riekkinen PJ, Rinne Uk, Arstila AU. Peptidase activity of myelin during the

myelination period in guinea-pig brain. Brain Res. 22: 243-248. 1970.

Frost JJ, Wagner H.N.J., Dannals RF, Ravert HT, Links JM, Wilson AA, Burns HD,

Wong DF, McPherson RW, Rosenbaum AE, Kuhar MJ, Snyder SH. Imaging opiate

receptors in the human brain by positron tomography. J. Comput. Asist. Tomo. 9: 231-236.

1985.

Bibliografia

Doktore-tesia

248

Fukuda K, Kato S, Mori K, Nishi M, Takeshima H, Iwabe N, Myiata T, Houtani T,

Sugimoto T. cDNA cloning and regional distribution of a novel member of the opioid receptor

family. FEBS lett. 343: 42-46. 1994.

Fukunaga Y, Inoue N, Miyamoto M, Kishioka S, Yamamoto H. Effects of peptidase

inhibitors, [D-Ala2. Met5]-enkephalinamide and antiserum to methionine-enkephalin microinjected

into the caudal periacueductal gray on morphine withdrawal in rats. Jpn J Pharmacol. 78: 455-

461. 1998.

Gakh O, Cavadini P, Isaya O. Mitochondrial processing peptidases. Biochim

Biophys Acta. 1592: 63-77. 2002.

Gandarias JM, Casis O, Echevarria E, Irazusta J, Casis L. Pyroglutamyl peptidase I

activity in the cortex of the cat brain during development. Int J Dev Biol. 36: 355-337. 1992.

Gandarias JM, Gil J, Valdivia A, Larrinaga G, Artola D, Casis L. Subcellular distribution

of pyroglutamyl-peptidase activity in the developing rat cerebellum. Dev. Neurosci. 22: 264-27.

2000.

Gandarias JM, Irazusta J, Fernández D, Varona A, Casis L. Developmental changes of

pyroglutamyl-peptidase I activity in several regions of the female and male rat brain. Int J Neurosci.

77: 53-60. 1994.

Gandarias JM, Irazusta J, Gil J, Gallego M, Casis O, Casis L. Subcellular analysis of tyr-

aminopeptidase activities in the developing rat cerebellum. Dev Brain Res. 99: 66-71. 1997.

Gandarias JM, Irazusta J, Silio M, Saitua N, Gil J, Casis L. Soluble and membrane-bound

pyroglutamyl-peptidase I activity in developing cerebellum and brain cortex. Int J Dev Biol. 42: 103-

106. 1998.

García-Sevilla JA. Monografías de neurociencias: Raceptores para neurotransmisores.

Ediciones en Neurociencias. Barcelona. 1996.

Bibliografia

Doktore-tesia

249

Garzón J, Rodriguez-Diaz M, López-Fando A, Sánchez-Blázquez P. RSG9 proteins

facilitate acute tolerance to mu-opioid effects. Eur J Neurosci. 13: 801-811. 2001.

Garzón J, Rodriguez-Diaz M, López-Fando A, García-España A, Sánchez-Blázquez

P. Glucosilated phosducin-like protein long regulates opioid receptor function in mouse brain.

Neuropharmacology. 42:813-828. 2002.

Ghan LG, Sevarino KA. Prepothyrotropin-releasing hormone mRNA in the rat central grey is

strongly and presistenly induced during morphine withdrawal. Neuropeptides. 30: 207-212. 1996.

Gibson AM, McDermott JR, Lauffart B, Mantle D. Specificity of action of human brain

alanyl aminopeptidase on leu-enkephalin and dynorphin-related peptides. Neuropeptides. 13: 259-

262. 1989.

Gibson AM, Biggins JA, Lauffart B, Mantle D, McDermott JR. Human brain leucyl

aminopeptidase: Isolation, characterization and specificity against some neuropeptides.

Neuropeptides. 19: 163-168. 1991.

Giros B, Gros C, Solhonne B, Schwartz JC. Characterization of aminopeptidases

responsible for inactivating endogenous met-enkephalin in brain slices using peptidase inhibitors and

anti-aminopeptidase M antibodies. Mol. Pharmacol. 29: 281-287. 1985.

Goldstein A, Tachibana S, Lowney LI, Hunkapiller M, Hood L. Dynorphin (1-13), an

extraordinary potent opioid peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 6666-6670. 1979.

Goldstein A, Fischli W, Lowney LI, Hunkapiller M, Hood I. Porcine pituitary

dynorphin: Complete amino acid secuence of the biologically active heptadecapeptide. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. 78: 7219-7223. 1981.

Goossens F, De Meester I, vanhoof G, Scharpé S. Distribution of prolyl oligopeptidase in

human peripheral tissues and body fluids. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34: 17-22. 1996.

Bibliografia

Doktore-tesia

250

Graham J, Ford TC. Marker enzymes and chemical assays for the analysis of subcelular

fractions. In: Rickwood, D. Ed., Centrifugation: A practical aproach. 2nd Edition. IRL

Press, Washimgton DC, pp. 307- 333. 1984.

Gray EG, Whittaker VP. The isolation of nerve endings from rat brain. J. Anat., 96: 79-88.

1962.

Greenberg LJ. Fluorimetric measurement of alkaline phosphatase and aminopeptidase activities

in the order of 10-14 mole. Biochem Biophys. Res. Commun., 9: 430-435. 1962.

Griffiths EC, Baris C, Visser TJ, Klootwijk W. Tyrotroping-releasing hormone inactivation

by human postmortem in brain. Reg. Pept. 10: 145-155. 1985.

Gros C, Giros B, Schwartz JC. Identification of aminopeptidase M as an enkephalin-

degrading enzyme in rat cerebral membranes. Biochemestry. 24: 2179-2185. 1985.

1Gudehithlu KP, Duchemin AM, Tejwani GA, Neff NH, Hadjiconstantinou M.

Preproenkephalin and methionine-enkephalin increase in mouse striatum after 1-methyl-4-phenyl-

1,2,3,6-tetrahydropyridine treatment. J Neurochem. 56: 1043-1048. 1991.

2Gudehithlu KP, Tejwani GA, Bhargava HN. Beta-endorphin and methionine-enkephalin

levels in discrete brain regions, spinal cord, pituitary gland and plasma of morphine tolerant-dependent

and abstinent rats. Brain Res. 553: 284-290. 1991.

Grdisa M, Vitale L. Types and localization of aminopeptidases in different human blood cells.

Int J Biochem. 23: 339-345. 1991.

Grudt TJ, Williams JT. Kappa-opioid receptors also increase potassium conductance. Proc.

Natl. acad. Sci. USA. 90(23): 11429-32. 1993.

Guitart X, Nestler EJ. Identification of morphine and cyclic AMP-regulated phosphoproteins

(MARPPs) in the locus coeruleus and other regions of the rat brain: regulation by acute and chronic

morphine. J Neurosci. 9: 4371-4387. 1989.

Bibliografia

Doktore-tesia

251

Guitart X, Thompson MA, Mirante GK, Greenberg NE, Nestler EJ. Regulation of

cyclic AMP response element-binding protein (CREB) phosphorylation by acute and chronic morphine

in the rat locus coeruleus. J Neurochem. 58: 1168-1171. 1992.

Haffmans J, Walsum MV, van Amsterdam JC, Dzoljic MR. Phelorphan, an inhibitor of

enzymes involved in the biodegradation of enkephalins, affected the withdrawal symtoms in chronic

morphine-dependent rats. Neuroscience. 22: 233-266. 1987.

Haines DH. Neuroanatomy: an atlas of structures, sections and systems. Williams and

Wilkins, Baltimore. 1995.

Han NL, Bian ZP, Han JS. Synergistic effect of cholecystokinin octapeptide and angiotensin II

in reversal of morphine induced analgesia in rats. Pain. 85: 465-469. 2000.

Harris GC, Williams JT. Transient homologous mu-opioid receptor desensibilization in rat locus

coeruleus neurons. J Neurosci. 11: 2574-2581. 1991.

Harrison LM, Kastin AJ, Zadina JA. Opiate tolerance and dependence: Receptors, G-Proteins

and Antipopiates. Peptides. 19(9): 1603-1630. 1998.

Hayward MD, Duman RS, Nestler EJ. Induction of the c-fos protooncogene during opiate

withdrawal in the locus coeruleus and other regions of rat brain. Brain. Res. 525: 256-266. 1990.

Hersh LB. Characterization of membrane-bound aminopeptidases from rat brain: identificationof

the enkephalin-degrading aminopeptidase. J. Neurochem. 44: 1427-1435. 1985.

Hersh LB. Degradation of enkephalins. The search for a enkephalinase. Moll Cell. Biochem.

47: 35-43. 1982.

Hersh LB, Aboukhair N, Watson S. Inmunohistochemical localization of aminopeptidase M

in rat brain and perphery: relationship of enzyme localization and enkephalin metabolism. Peptides.

8: 523-532. 1987.

Bibliografia

Doktore-tesia

252

Ho WKK, Wan CC, Chan WY, Cheung WK, Kwok KY, Wen HL. Morphine addiction

does not alter brain or pituitary unmunoreactive dynorphin level. Pharmacol Res Comm.14: 861-

866. 1982.

Höllt V, Przewlocki R, Herz A. β-endorphin-like inmunoreactivity in plasma, pituitaries and

hypothalamus of rats following treatment with opiates. Life Sci. 23: 1057-1066. 1978.

Holmstrand J, Gunne LM. Application of a synthetic enkephalin analogue durin heroin

withdrawal. Pharmakopsychiatr. Neuropsychopharmakol. 13: 68-71. 1980.

Hopsu VK, Kantonen UM, Glenner GG. A peptidase from rat tissues selectively

hydrolysing N-terminal arginine and lysine residues. Life Sci 3: 1449-1453. 1964.

Hopsu VK, Mäkinen KK, Glenner GG. Characterization of aminopeptidase B: substrate

especificity and effector studies. Arch. Biochem. Biophys. 144: 567-575. 1966.

Houben H, Denef C. Bioactive peptides in anterior pituitary cells. Peptides. 15: 547-582.

1994.

Houdi AA, Van Loon GR. Haloperidol-induced increase in striatal concentration of the

tripeptide, tyr-gly-gly, provides an index of increased enkephalin release in vivo. J Neurochem. 54:

1360-1365. 1990.

Hughes J, Smith TW, Kosterlitz HW, Fothergill LA, Morgan BA, Morris HR.

Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity. Nature.

258: 541-546. 1975.

Hughes J. Opioid peptides: Introduction. Br. Med. Bull. 39: 17-24. 1983.

Hui KS, Wang YJ, Lajtha A. Purification and characterization of an enkephalin

aminopeptidase from rat brain membranes. Biochemestry. 22: 1062-1067. 1983.

Bibliografia

Doktore-tesia

253

Hui KS, Wang YJ, Tsai H, Wong KH, Lajtha A. The effect of naloxone on enkephalin

catabolism. Peptides. 1: 89-94. 1981.

Hsia J, Moss J, Hewlett EL, Vaughan M. Requirement for both choleragen and pertussis

toxin to obtain maximal activation of adenylate cyclase in cultured cells. J. Biol. Chem. 229: 1086-

1090. 1984.

Idänpään-Heikkila JJ, Rauhala P, Tuominen RK, Tuomainen P, Nikolai Zotolov,

Männistö PT. Morphine withdrawal alters pituitary hormone secretion, brain endopeptidase activity

and brain monoamine metabolism in the rat. Pharmacology and toxicology. 78: 129-135.

1996.

Inoue M, Ueda H. Protein kinase C-mediated acute tolerance to peripheral mu-oppioid in the

bradykinin-nociception test in mice. J Pharmacol. Exp. Ther. 293: 662-669. 2000.

Irazusta J, Silveira PF, Gil J, Varona A, Casis L. Effects of hydrosaline treatments on prolyl

endopeptidase activity in rat tissues. Regul. Pept. 101: 141-147. 2001.

Ishino T, Ohtsuki S, Homma K, Katori S. cDNA cloning of mouse prolyl endopeptidase

and its involvement in DNA synthesis by swiss 3T3 cells. J Biochem. 123: 540-545. 1998.

Iversen LL. Overview: peptides in the nervous system. “Neuropeptides and their

peptidases”-en. AJ Turner Ed. Ellis Horwood Ltd., Chichester, U.K. 1987.

Kakidani H, Furutani Y, Takahashi H, Noda M, Morimoto Y, Hirose T, Asai M,

Inayama S, Nakanishi S, Numa S. Cloning and sequence analysis of cDNA for porcine beta-neo-

endorphin/dynorphin precursor. Nature 298, 245-249. 1982.

Kalwant S, Porter AG. Purification and characterization of human brain prolyl endopeptidase.

Biochem. J. 276: 237-244. 1991.

Kato T, Okada M, Nagatsu T. Distribution of post-proline cleaving enzyme in human brain

and the peripheral tissues. Moll. Cell. Biochem. 32: 117-121. 1980.

Bibliografia

Doktore-tesia

254

Kelly JA, Neidle EL, Neidle A. An aminopeptidase from mouse brain cytosol that cleaves N-

terminal acidic aminoacid residues. J. Neurochem. 40: 1727-1734. 1983.

Kenny AJ. Cell surface peptidases are neither peptide nor organ specific. Trends Biochem. Sci.,

11: 40-42. 1986.

Kenny AJ, Bourne A. Cellular reorganisation of membrane peptidases in Wallerian

degeneration of pig peripheral nerve. J Neurocytol. 20: 875-885. 1991.

Kettmann U, Humbel B, Holzhausen HJ, Bahn H, Aurich H. Inmunoelectron

microscopion localization of microsomal alanine aminopeptidase. Acta Histochem. 93: 333-340.

1992.

Kimes AS, Vaupel DB, London ED. Attenuation of some signs of opioid withdrawal by

inhibitors of nitric oxide synthase. Psychpharmacology. 112: 521-524. 1993.

Kimura A, Matsui H, Takahashi T. Expression and localization of prolyl oligopeptidase in

mouse testis and its posible involvement in sperm motility. Zoolog. Sci. 19: 93-102. 2002.

Kioussi C, Matsas R. Endopeptidase-24.11, a cell-surface peptidase of central nervous system

neurons, is expressed by Schwann cells in the pig peripheral nervous system. J Neurochem. 57: 431-

440. 1991.

Kish SJ, Kalasinsky KS, Derkatch P, Schmunk GA, Guttman M, Ang L, Adams V,

Furukawa Y, JW Haycock. Striatal dopaminergic and serotoninergic markers in human

heroin users. Neuropsychopharmacology. 24: 561-567. (2001).

Köening JFR, Klippel RA. The rat brain: a stereoataxic atlas of the forebrain and lower parts

of the brainstem. Robert E. Grieger Ed. 1970.

Kohno H, Kanda S, Kanno T. Immunoaffinity purification and characterization of leucine

aminopeptidase from human liver. J. Biol. Chem. 261: 10744-10748. 1986.

Bibliografia

Doktore-tesia

255

Konkoy CS, Waters SM, Davis TP. Subchronic haloperidol administration decreases

aminopeptidase N activity and [Met5] enkephalin metabolism in rat striatum and cortex. Eur J

Pharmacol. 297: 47-51. 1996.

Koob GF, Nestler EJ. The neurobiology of drug addiction. J Neuropsychiatry and Clinical

Neurosciences. 9: 482-497. 1997.

Koob GF, Sanna PP, Bloom FE. Neuroscience of addiction. Neuron. 21: 467-476. 1998.

Korányi L, Walentin S, Hepp J, Endröczi E. Changes of dipeptidyl peptidase (DP IV)

activity in the T lymphocites of rats following administration of ACTH, dexametasone and opiates.

Exp. Clin. Endocrinol. 93: 61-68. 1989.

Kosterlitz HW, Waterfield AA. In vitro models in the study of structure-activity relationships

of narcotic analgesics. Annu. Rev. Pharmacol. 15:29-47. 1975.

Kovoor A, Celver JP, Wu A, Chavkin C. Agonist induced homologous desensitization of mu-

opioid receptors mediated by G-protein-coupled receptor kinases is dependent on agonis efficacy. Mol.

Pharmacol. 54: 704-711. 1998.

Kovoor A, Douglas JH, Chavkin C. Agonist-induced desensitization of the mu-opioid

receptor coupled potassium channel (GRK1). J. Biol. Chem. 270: 589-595. 1995.

Krueger BK, Forn J, Greengard P. Despolarization-induced phosphorilation of specific

proteins mediated by calcium ion influx, in rat brain synaptosomes. J. Biol. Chem., 252 (8): 2764-

2773. 1979.

Kurauchi O, Mizutani S, Okano K, Narita O, Tomoda Y. Purification and

characterization of human placental microsomal aminopeptidase: immunological difference between

placental microsomal aminopeptidase and pregnancy serum cystyl-aminopeptidase. Enzyme. 35: 197-

205. 1986.

Bibliografia

Doktore-tesia

256

Lane-Ladd SB, Pineda J, Boundy VA, Pfeuffer T, Krupinski J, Aghajanian GK,

Nestler EJ (1997). CREB (cAMP response element binding protein) in the locus coeruleus:

biochemical, physiological and behavioral evidence for a role in opiate dependence. J Neurosci. 17:

7890-7901. 1997.

Legradi G, Rand WM, Hiltz S, Nillni EA, Jackson IM, Lechan RM. Opiate withdrawal

increases proTRH gene expression in the ventrolateral column of the midbrain periacueductal grey.

Brain Res. 729: 10-19. 1996.

Lemaire S, Magnan J, Regoli D. Rat vas deferens: A specific bioassay for endogenous opioid

peptides. Br. J. Pharmacol. 64: 327-329. 1978.

Leshner AI. Drug abuse and addiction treatment research. Archives of General Psychiatry.

54: 691-694. 1997.

Li CH, Chung D. Isolation and structure of an untriakontapeptide with opiate activity from

camel pituitary glands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73: 1145-1148. 1976.

Lightman SL, Young WS. Changes in hypothalamic preproenkephalin A mRNA following

stress and opiate withdrawal. Nature. 328: 643-645. 1987.

Ling GSF, Mc Leod JM, Lee S, Lochart SH, Pasternak GW. Separation of morphine

analgesia from physical dependence. Science. 226: 462-464. 1984.

Ling GSF, Spiegel K, Lochart SH, Pasternak GW. Separation of morphine’s analgesic and

respiratory depression: evidence for different receptor mechanisms. J. Pharmacol. Exp. Ther. 232:

149-155. 1985.

Ling GSF, Spiegel K, Nishimura SL, Pasternak GW. Dissociation of morphine’s analgesic

and respiratory depressant actions. Eur. J. Pharmacol. 86: 487-488. 1983.

Bibliografia

Doktore-tesia

257

Lord J, Waterfield A, Hughes J, Kosterlitz H, 1977. Endogenous opioid peptides: Multiple

agonists and receptors. Nature. 267: 495-499. 1977.

Lorenzo P, Ladero JM, Leza JC, Lizasoain I. Drogodependencias. Editorial

Panamericana. 1999.

Lynch DR, Snyder SH. Neuropeptides: multiple molecular forms, metabolic pathways and

receptors. Annu. Rev. Biochem. 55: 773-779. 1986.

Maldonado R, Blendy JA, Tzavara E, Gass P, Roques BP, Hanoune J, Schültz G.

Reduction of morphine abstinence in mice with a mutation in the gene encoding CREB. Science.

273: 657-659. 1996.

Maldonado R, Derrien M, Noble F, Roques BP. Association of the peptidase inhibitor RB

101 and a CCK-B antagonist strongly enhances antinociceptive responses. Neuroreport 4: 947-

950. 1993.

Maldonado R, Fournié-Zaluski MC, Roques BP. Attenuation of the morphine withdrawal

syndrome by inhibition of catabolism of endogenous enkephalins in the periacueductal gray matter.

Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 345: 466-472. 1992.

Malfroy B, Swerts JP, Guyon A, Roques BP, Schwartz JC. High-affinity enkephalin-

degrading peptidase in mouse brain and its enhanced activity following morphine. Nature. 276: 523-

526. 1978.

Mansour A1, Fox CA, Burke S, Meng F, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. Mu,

delta, and kappa opioid receptor mRNA expression in the rat CNS: an in situ hybridisation study.

J. Comp. Neurol. 350(3): 412-438. 1994.

Mansour A2, Fox CA, Burke S, Meng F, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. Mu-

opioid receptor mRNA expression in the rat CNS: comparison to mu-receptor binding. Brain Res.

643: 245-265. 1994.

Bibliografia

Doktore-tesia

258

Mantle D, Falkous G, Ishiura S, Blanchard PJ, Perry EK. Comparison of proline

endopeptidase activity, in brain tissue from normal cases and cases with Alzheimer’s disease, Lewy

body dementia, Parkinson’s disease anh Hungtinton’s disease. Clin. Chim. Acta. 249: 129-139.

1996.

Maroux S. Structural and topological aspects. “Mammalian Ectoenzymes”. 15-45. Kenny

AJ eta Turner AJ eds. Elsevier Science publisher, Amsterdam, The Netherlands. 1987.

Martin WR, Eades C, Thompson J, Huppler R, Gilbert P. The effects of morphine and

nalorphine-like drugs in nondependent and morphine-dependent chronic spinal dog. J. Pharmacol.

Exp. Ther. 197: 517-532. 1976.

Matsas R, Stephenson SL, Hryszko J, Kenny AJ, Turner AJ. The metabolism of

neuropeptides: phase separation of synaptic membrane preparations with Triton X-114 reveals the

presence of aminopeptidase N. Biochem. J. 231: 445-449. 1985.

Mayas MD, Ramírez-Expósito MJ, García MJ, Ramírez M, Martínez-Martos JM.

Ethanol modifies differently aspartyl- and glutamyl-aminopeptidase activities in mouse frontal cortex

synaptosomes. Brain. Res. Bull. 57: 195-203. 2002.

Mayas MD, Ramírez-Expósito MJ, García MJ, Ramírez M, Martínez-Martos JM.

Influence of alcohol on brain aminopeptidases. An in vitro study. Rev. Neurol. 32: 1031-1041.

2001.

McLellan S, Dyer SH, Rodriguez G, Hersh LB. Studies on the tissue distribution of the

puromycin-sensitive enkephalin-degrading aminopeptidases. J. Neurochem. 51: 1552-1559. 1988.

Melzig MF, Heder H, Siems EW, Zipper J. Stimulation of endothelial angiotensin-converting

enzyme by morphine via non-opioid receptor mediated processes. Pharmazie. 53: 634-637. 1998.

Mentzel S, Dijkman HB, Van Son JP, Koene RA, Assmann KJ. Organ distribution of

aminopeptidase A and dipeptidyl peptidase IV in normal mice. J. Histochem. Cytochem. 44:

445-461. 1996.

Bibliografia

Doktore-tesia

259

Meunier JC, Mollereau C. Toll L. Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid

receptor-like ORL-1 receptor. Nature. 377: 532-535. 1995.

Mocchetti I, Costa E. Down regulation of hypothalamic proopiomelanocortin system during

morphine tolerance. Clin Neuropharmacol. 4: 125-127. 1986.

Mocchetti I, Ritter A, Costa E. Down-regulation of proopiomelanocortin synthesis and beta-

endorphin utilization in hypothalamus of morphine-tolerant rats. J Mol Neurosci. 1: 33-38. 1989.

Mogenson GJ, Jones DL, Jim CY. From motivation to action: functional interface between the

limbic system and the motor system. Prog. Psychobiol. 14: 607-697. 1980.

Morain P, Lastage P, De Nanteuil G, Jochemsen R, Robin JL, Guez D, Boyer PA. S

17092: a prolyl endopeptidase inhibitor as potential therapeutic drug for memory imparment.

Preclinical and clinical studies. CNC Drug Rev. 8: 31-52. 2002.

Mosnaim AD, Puente J, Saavedra R, Diamond S, Wolf ME. In vitro human plasma

leucine(5)-enkephalin degradation is inhibited by a select number of drugs with the phenotiazine

molecule in their chemical structure. Pharmacology. 67: 6-13. 2003.

Murphy NP, Ly HT, Maidment NT. Intracerebroventricular orphanin FQ/nociceptin

supresses dopamine release in the nucleus accumbens of anaesthetized rats. Neuroscience 75: 1-4.

1996.

Naghettini AV, Nogueira pC, Juliano M, Bueno AA, Casarini DE, de Abreu

Carvalhaes JT. Tubular urinary enzymes in acute post-infectous glomerulonephritis. Pediatr.

Nephrol. 16: 719-722. 2001.

Nakanishi N, Inoue A, Kita T. Nucleotide sequence of clones cDNA for bovine corticotropin-

beta-lipotropin precursor. Nature 278. 1979.

Nestler EJ. Molecular mechanisms of drug addiction. J. Neurosci. 12: 2439-2450. 1992.

Bibliografia

Doktore-tesia

260

Nestler EJ. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nature Reviews

Neuroscience. 2: 119-128. 2001.

Nestler EJ, Aghajanian GK. Molecular and cellular basis of addiction. Science. 278: 58-63.

1997.

Nestler EJ, Tallman JF. Chronic morphine treatment increases cyclic AMP-dependent protein

kinase activity in the rat locus coeruleus. Mol. Pharmacol. 33: 127-132. 1988.

Nieto MM, Wilson J, Walker J, Benavides J, Fournié-Zaluski MC, Roques BP,

Noble F. Facilitation of enkephalins catabolism inhibitor-induced antinociception by drugs classically

used in pain management. Neuropharmacology. 41: 496-506. 2001.

Nieuwenhuys R, Voogd J, van Huijzen C. The human nervous system: a sinopsis atlas.

Springer. Berlin. 1988.

Nillni EA, Lee A, Legradi G, Lechan RM. Effect of precipitated morphine withdrawal on

post-translational processing of prothyrotropin releasing hormone (proTRH) in the ventrolateral column

of the midbrain periacueductal grey. J Neurochem. 80: 874-884. 2002.

Nishimura SL, Recht LD, Pasternak GW. Biochemical characterization of high-affinity 3H-

opioid binding. Further evidence for µ1 sites. Mol. Pharmacol. 25: 29-37. 1984.

Nishizawa Y, Kurihara T, Takahasi Y. Spectrophotometric assay, solubilization and

purification of brain 2’-3’-cyclic nucleotide-3’-phosphodiesterase. Biochem J. 191: 71-82. 1980.

Noble F, Banisadr G, Jardinaud F, Popovici T, Lai-Kuen R, Chen H, Bischoff L,

Parsadaniantz SM, Fournié-Zaluski MC, Roques BP. First discrete autoradiographic

distribution of aminopeptidase N in various structures of rat brain and spinal cord using the selective

iodinated inhibitor [125I] RB 129. Neuroscience. 105: 479-488. 2001.

Bibliografia

Doktore-tesia

261

Noble F, Fournié-Zaluski MC, Roques BP. Enkephalin catabolism inhibitors and antalgics

of the future: from preclinical research to clinical trials. Therapie. 54: 121-133. 1999.

Noble F, Smadja C, Valverde O, Maldonado R, Coric C, Turcaud S, Fournié-Zaluski

MC, Roques BP. Pain-supressive effects on various nociceptive stimuli (thermal, chemical, electrical

and inflamatory) of the first orally active enkephalin-metabolizing enzyme inhibitor RB120. Pain. 73:

383-391. 1997.

North RA. Opioid receptor types and membrane ion channels. Trends in Neurosci. 9: 114-

117. 1993.

North RA, Williams JT, Suprenant A, Christie MJ. Mu and delta receptors belong to a

family of receptors that are coupled to potassium chanels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 5487-

5491. 1987.

O’Connor B, O’Cuinn G. Purification and kinetic studies on a narrow specificity synaptosomal

membrane pGlu-aminopeptidase from guinea-pig brain. 144: 271-278. 1985.

O’Cuinn G, O’Connor B, Elmore M. Degradation of thyrotropin-releasing hormone and

luteinizing hormone by enzymes of brain tissue. J Neurochem. 54: 1-13. 1990.

O’Leary RM, O’Connor B. Identification and localisation of a synaptosomal membrane prolyl

endopeptidase from bovine brain. Eur. J. Biochem. 227: 277-283. 1995.

O’Leary RM, Gallagher SP, O’Connor B. Purification and characterizaton of a novel

membrane-bound form of prolyl endopeptidase from bovine brain. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 28:

441-449. 1996.

Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. Design of specific inhibitors of angiotensine-converting

enzyme: New class of orally active antihypertensive agents. Science, 196: 441 – 444. 1977.

Bibliografia

Doktore-tesia

262

Ortega-Alvaro A, Chover-González AJ, Lai-Kuen R, Mico JA, Giber-Rahola J,

Fournié-Zaluski MC, Roques BP, Maldonado R. Antinociception produced by the peptidase

inhibitor, RB101, in rats with adrenal medullary transplant into the spinal cord. Eur J Pharmacol.

356: 139-148. 1998.

Ozaita A, Escribá PV, Vebtanyol P, Murga C, Mayor F, García-Sevilla JA. Regulation

of G-protein coupled receptor kinase 2 in brains of opiate-treated rats and human opiate addicts. 70:

1249-1257. 1998.

Paik SH, Camarao GC, Bauer JA, Leite PE, Oliveira ES, Camargo AC, Farges RC.

Effects of morphine withdrawal syndrome on endo-oligopeptidase (EC 3.4.22.19) activity. Eur J

Pharmacol. 253: 101-106. 1994.

Palczewski K, Benovic JL. G-protein coupled receptor kinases. Rends Biochem Sci. 16: 387-

391. 1991.

Pasternak GW. Múltiple morphine and enkephalin receptors: Biochemical and pharmacological

aspects. Ann. NY. Acad. Sci. 467: 130-139.

Peckys D, Landwehrmeyer GB. Expression of mu, kappa, and delta opioid receptor

messenger RNA in the human CNS: a 33P in situ hybridization study. Neuroscience. 88(4):

1093-1135. 1999.

Pert C, Pert A, Chang JK, Fong BTW. [D-Ala2-] – Met-enkephalinamide: A potent, long-

lasting synthetic pentapeptide analgesic. Science. 194: 330332. 1976.

Pert C, Snyder S. Opiate receptor; demonstration in nervous tissue. Science. 179: 1011-1014.

1973.

Pilapil C, Welner, Magnan J, Gauthier S, Quirino R. Autoradigraphic distribution of

multiple classes of opioid receptor binding sites in human forebrain. Brain. Res. Bull. 19: 611-615.

1987.

Bibliografia

Doktore-tesia

263

Pineda-Ortiz Joseba. Bases neurobiológicas y clínicas de la dependencia a opiáceos. Cuadernos

de Ciencias Médicas, Osasunaz-4, Eusko Ikaskuntza. 159-176. 2001.

Pommier B, Beslot F, Simon A, Pophillat M, Matsui T, Dauge V, Roques BP, Noble

F. Deletion of CCK2 receptor in mice results in an upregulation of the endogenous opioid system. J

Neurosci. 22: 2005-2011. 2002.

Porter JN, Hewitt RI, Hesseltine CW, Krupka G, Lowery JA, Wallace WS, Bohonos

N, Williams JH. Antibiot. and Chemotherapy. 2: 409. 1952.

Propst F, Hamprecht B. Opioids, noradrenaline and GTP analogs inhibit cholera toxin

activated adenylate cyclase in neuroblastoma x glioma hybrid cells. J. Neurochem. 36: 580-588.

1981.

Przewlocki R, Höllt V, Duka T, Kleber G, Gramsch C, Haarmann I, Herz A. Long-

term morphine treatmen decreases endorphin levels in rat brain and pituitary. Brain Res. 174: 357-

361. 1979.

Punch LJ, Self DW, Nestler EJ, Taylor JR. Opposite modulation of opiate withdrawal

behaviors on microinfusion of a protein kinase A inhibitor versus activator into the locus coeruleus or

periacueductal grey. J Neurosci. 17: 8520-8527. 1997.

Ramarao P, Bhargava HN. Effect of tyrotropin releasing hormone in the development of

tolerance to the analgesic and hyperthermic actions of morphine in rat. Neuropeptides. 15: 213-

217. 1990.

Ramírez-Expósito Mj, Martínez JM, Prieto I, Alba F, Ramírez M. Comparative

distribution of glutamyl and aspartyl aminopeptidase activities in mouse organs. Horm. Metab. Res.

32: 161-163. 2000.

Rasmussen K, Aghajanian GK. Withdrawal-induced activation of locus coeruleus neurons in

opiate-dependent rats: attenuation by lesions of the nucleus paragigantocellularis. Brain Res. 505:

346-350. 1989.

Bibliografia

Doktore-tesia

264

Re RN. The origins of intracrine hormone action. Am J Med Sci. 323: 43-48. 2002.

Re RN. The intracrine hypothesis and intracellular peptide hormone action. Bioessays. 25: 401-

409. 2003.

Reaux A, Fournie-Zaluski MC, David C, Zini S, Roques BP, Corvol P, Llorens-

Cortes C. Aminopeptidase A inhibitors as potential central antihypertensive agents. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. 96: 13415-13420. 1999.

Reche I, Ruiz-Gayo M, Fuentes JA. Inhibition of opioid-degrading enzymes potentiates

delta9-tetrahydrocannabinol-induced antinociception in mice. Neuropharmacology. 37: 215-222.

1998.

Reddy TL, Weber MM. Solubilization, purification and characterization of succinate

dehidrogenase from membranes of mycobacterium phlei. J. Bacteriol. 167: 1-6. 1986.

Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A. Orphanin FQ: a neuropeptide that activates

an opioid-like G-potein-coupled receptor. Science. 270: 792-794. 1995.

Reinscheid RK, Nothacker H, Civelli O. The orphaninFQ/nociceptin gene: structure, tissue

distribution of expression and functional implications obtained from knockout mice. Peptides 2000.

21(7): 901-906. 2000.

Relton JM, Gee NS, Matsas R, Turner AJ, Kenny AJ. Purification of endopeptidase 24.11

(enkephalinase) from pig brain by inmunoadsorbent chromatography. Biochem. J. 215: 519-523.

1983.

Romualdi P, Landuzzi D, D’addario C, Candeletti S. Modulation of proorphanin FQ/N

gene in the rat of mesocorticolimbic system. Neuroreport. 13: 645-648. 2002.

Romualdi P, Lesa G, Ferri S. Chronic opiate agonists down-regulate prodynorphin gene

expression in rat brain. Brain Res. 563: 132-136. 1991.

Bibliografia

Doktore-tesia

265

Roques BP, Fournie-Zaluski, Soroca E, Lecomte JM, Malfroy B, Llorens C,

Schwartz JC (1980). The enkephalinase inhibitor tiorphan shows antinociceptive activity in mice.

Nature, 288: 286-288. 1980.

Roques BP, Noble F. Dual inhibitors of enkephalin-degrading enzymes (neutral endopeptidase

24.11 and aminopeptidase N) as potential medications in the management of pain and opioid

addiction. NIDA Res Monogr. 147: 104-145. 1995.

Roques BP, Noble F, Fournie-Zaluski MC. Endogenous opioid peptides and analgesia. In

“Opioids in pain control. Basic and clinical aspects”. Ed. Stein C. Cambridge University

Press, 1999.

Rothman RB. A review of the role of anti-opioid peptides in morphine tolerance and dependence.

Synapse. 12: 129-138. 1992.

Safavi A, Hersh LB. Degradation of dynorphin-related peptides by the puromycin-

sensitive aminopeptidase and aminopeptidase M. J. Neurochem. 65: 389-395. 1995.

Santillán R, Hurle MA, Armijo JA, De los mozos R, Florez J. Nimodipine-enhanced

opiate analgesia in cancer patients requiring morphine dose escalation: a double-blind, placebo-

controlled study. Pain. 76: 17-26. 1998.

Saria A, Hauser KF, Traurig HH, Turbek CS, Hersh L, Gerard C. Opioid-related

changes in nociceptive threshold and in tissue levels of enkephalins after target disruption of the gene for

neutral endopeptidase (EC 3.4.24.11) in mice. Neuroscience Letters. 234: 27-30. 1997.

Sharma SK, Niremberg M, Klee WA. Morphine receptors as regulators of adenylate cyclase

activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 590-594.

Scharrer B. Facts and trends. Gen. Comp. Endocrinol. 34:50-62. 1978.

Bibliografia

Doktore-tesia

266

Schmidt P, Schmolke C, Musshoff F, Menzen M, Prohaska C, Madea B. Numerical

density of delta-opioid expressing neurons in the frontal cortex of drug related fatalities. Forensic Sci

Int. 113: 423-433. 2000.

Schmidt P, Schmolke C, Musshoff F, Menzen M, Prohaska C, Madea B. Numerical

density of mu-opioid expressing neurons in the frontal cortex of drug related fatalities. Forensic Sci

Int. 115: 219-229. 2001.

Schmitmeier S, Thole H, Bader A, Bauer K. Purification and characterization of the

tyrotropin-releasing hormone (TRH)-degrading serum enzyme and its identification as a product of

liver origin. Eur. J. Biochem. 269: 1278-1286. 2002.

Schneider JS, Giardiniere M, Morain P. Effects of the prolyl endopeptidase inhibitor S17092

on cognitive deficits in chronic low dose MPTP-treated monkeys. Neuropsychofarmacology. 26:

176-182. 2002.

Schomburg L, Turwitt S, Prescher G, Lohmann D, Horthemke B, Bauer K. Human

TRH-degrading ectoenzyme cDNA cloning, functional expression, genomic structure and chromosomal

assignment. Eur. J. biochem. 265: 415-422. 1999.

Schroeder JE, Fischbach PS, Zheng D, McCleskey EW. Activation of mu opioid receptors

inhibits trasient high and slow threshold C2+ currents, but spares a sustained current. Neuron 6: 13-

20. 1991.

Schujit MP, Danser AH. Cardiac angiotensin II: an intracrine hormone?. Am J Hypertens.

15: 1109-1116. 2002.

Schwartz JC,. Metabolism of enkephalin and the inactivating neuropeptide concept. Trends

Neurosci., 6: 45-48. 1983.

Schwartz JC, Malfroy B, De la Baume S. Biological inactivation of enkephalins and the role

of enkephalin dipeptdyl-carboxipeptidase as neuropeptidase. Life Sci. 29: 1715-1740. 1981.

Bibliografia

Doktore-tesia

267

Seward E, Hammond C, Henderson G. Mu-opioid receptor-mediated inhibition of the N-

type calcium chanel current. Proc. Roy. Soc. London B 244: 129-135. 1991.

Serizawa A, Dando PM, Barrett AJ. Characterization of a mitochondrial metallopeptidase

reveals neurolysin as a homologue of thimet oligopeptidase. J Biol Chem. 270: 2092-2098. 1995.

Shan L, Molberg O, Parrot I, Hausch F, Filiz F, Gray GM, Sollid LM, Khosla C.

Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. Science. 297: 2275-2279. 2002.

Shani J, Azov R, Weissman BA. Enkephalin levels in rat brain after various regimens of

morphine administration. Neurosci Lett. 12: 319-322. 1979.

Sharma SK, Nirenberg M, Klee WA. Morphine receptors as regulators of adenylate cyclase

activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 590-594. 1975.

Shimizu T, Tani K, Ogawa H, Huang L, Shinomiya F, Sone S. CD13 / aminopeptidase

N-induced lymphocyte involvement in inflamed joints of patients with rheumathoid arthritis. Arthritis

Reum. 46: 2330-2338. 2002.

Shippenberg TS, Herz A, Spanagel R, Bals-Kubik R, Stein C. Condioting of opioid

reinforcement: neuroanatomical neurochemical substrates. Ann. N. Y. Acad Sci. 654: 347-356.

1992.

Shippenberg TS, Rea W. Sensitization to the behavioral effects of cocaine: modulation by

dynorphin and kappa-opiod receptor agonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 57: 449-455. 1997.

Shishido Y, Furushiro M, Tanabe S, Taniguchi A, Hashimoto S, Yokokura T,

Shibata S, Yamamoto T, Watanabe S. Effect of ZTTZ, a prolyl endopeptidase inhibitor, on

memory impairment in a passive avoidance test of rats with basal forebrain lesions. Pharm Res. 15:

1907- 1910. 1998.

Siegel GJ, Agranoff BW, Albers RW, Molinoff PB. Basic neurochemestry. 331-368.

Raven press, New York. 1993.

Bibliografia

Doktore-tesia

268

Siems W, Maul B, Krause W, Gerard C, Hauser KF, Hersh LB, Fischer HS, Zerning

G, Saria A. Neutral endopeptidase and alcohol consumption, experiments in neutral endopeptidase-

deficien mice. Eur J Pharmacol. 397: 327-334. 2000.

Simantov R, Snyder SH. Elevated levels of enkephalin in morphine-dependent rats. Nature.

262: 505-507. 1976.

Simon E, Hiller J, Edelman I. Stereospecific binding of the potent narcotic analgesic 3H-

etorphine to rat brain homogenate. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 70: 1947-1949. 1973.

Simonin F, Befort K, Gavériaux-Ruff C, Matthens H, Nappey V, Lannes B,

Micheletti G, Kieffer B. The human delta-opioid receptor: Genomic organization, cDNA cloning,

functional expression, and distribution in human brain. Mol. Pharmacol. 46(6): 1015-21. 1994.

Snyder SH. Drogas y cerebro. Biblioteca Scientific American.1993.

Solhonne B, Gros C, Pollard H, Schwartz JC. Major localization of aminopeptidase M in

rat brain microvessels. Neuroscience. 22: 225-232. 1987.

Stefano GB, Kushnerik V, Rodríguez M, Bilfinger TV. Inhibitory effect of morphine on

granulocyte stimulation by tumor necrosis factor and substance P. Int J Inmunopharmacol. 16:

329-334. 1994.

Stein C. Peripheral mechanisms of opioid analgesia. Anesth. Analg. 76:182-191. 1993.

Sternini C, Spann M, Anton B, Keith DEJ, Bunnett NW, Von Zastrow M, Evans C,

Brecha NC. Agonist-selective endocytosis of mu opioid receptor by neurons in vivo. Proc. Natl.

Acad. Sci. 93: 9241-9246. 1996.

Suprenant KM, Chien CC, Whalestedt C, Brown GP, Pasternak GW. Inhibition of

calcium currents by noradrenaline, somatostatin and opioids in guinea-pig submucosal neurons. J.

Physiol. 431:585-608. 1990.

Bibliografia

Doktore-tesia

269

Szczepanska R, Harding S, Grupp LA. Characterization of the decline in alcohol

consumption by aminopeptidase inhibition. Drug Alcohol Depend. 43: 133-141. 1996.

Taylor A. Aminopeptidases: towards a mechanism of action. Trends Bichem. Sci. 18: 167-

171. 1993.

Tempel A, Habas J, Paredes W, Barr GA. Morphine-induced downregulation of mu-opioid

receptors in neonatal rat brain. Brain Res. 469: 129-133. 1988.

Terenius L. Stereospecific interaction between narcotic analgesics and a presynaptic plasma

membrane fraction of rat brain cortex. Acta Pharmacol. Toxicol. (Copenh.). 32:317-320.

1973.

Terenius L, Wahlström A. Inhibitors of narcotic receptor binding in brain extracts and

cerebrospinal fluid. Acta Pharmacol. 35 (suppl 1): 15. 1974.

Terwilliger RZ, Beitner-Johnson D, Sevarino KA, Crain SM, Nestler EJ. A general

role for adaptations in G-proteinsand the cyclic AMP system mediating the chronic actions of porphine

and cocaine on neuronal function. Brain Res. 548: 100-110. 1991.

Terwilliger RZ, Ortiz J, Guitart X, Nestler EJ. Chronic morphine administration increases

β-adrenergic receptor kinase (βARK) levels in the rat locus coeruleus. J. Neurochem. 63: 1983-

1986. 1994.

Thorn NA, Russell JT, Torp-Pedersen C, Treiman M. Calcium and neurosecretion. Ann.

N. Y. Acad. Sci. 307: 618-639. 1978.

Tobler AR, Constam DB, Schmitt-Gräff A, Malipiero U, Schlapbach R, Fontana A.

Cloning of the human puromycin-sensitive aminopeptidase and evidence for expression in neurons. J.

Neurochem. 68: 889-897. 1997.

Bibliografia

Doktore-tesia

270

Toide K, Iwamoto Y, Fujiwara T, Abe H. JTP-4819: a novel prolyl endopeptidase inhibitor

with potential as cognitive enhancer. J Pharmacol. Exp. Therapeutics. 274: 1370-1378. 1995.

Trujillo KA, Akil H. Pharmacological regulation of striatal prodynorphin peptides. Prog. Clin.

Biol. Res. 328: 223-226. 1990.

Trujillo KA, Akil H. Opiate tolerance and dependence: recent findings and synthesis. Th e New

Biologist. 10: 915-923. 1991.

Trujillo KA, Bronstein DM, Sánchez IO, Akil H. Effects of chronic opiate and opioid

antagonist treatment on striatal opioid peptides. Brain Res. 698: 69-78. 1995.

Tseng LF, Loh HH, Li CH. β-Endorphin: cross tolerance to and cross physical

dependence on morphine. Proc. Natl. Acad. Sci. 73: 4187-4189. 1976.

Turner AJ, Matsas R, Kenny AJ. Are there neuropeptide specific peptidases? Biochem.

Pharmacol. 34: 1347-1356. 1985.

Turner AJ. Processing and metabolism of neuropeptides. Essays Biochem. 22: 69-119. 1986.

Turner AJ. Endopeptidase-24.11 and neuropeptide metabolism. “Neuropeptides and their

peptidases”. Turner AJ, Ellis Horwood Ltd., Chichester, U.K. 1987.

Turzynski A, Mentlein R. Prolyil aminopeptidase from rat brain and kidney. Action on

peptides and identification as leucyl aminopeptidase. Eur. J. Biochem. 190: 509-515. 1990.

Uhl GR, Ryan JP, Schwartz JP. Morphine alters preproenkephalin gene expression. Brain

Res. 459: 391-397. 1988.

Ulibarri I, García-Sevilla JA, Ugedo L. Modulation of brain α2– adrenoceptor and µ– opioid

receptor densities during morphine dependence and spontaneus withdrawal in rats. Naunyn –

Schmied. Arch. Pharmacol. 336: 530-537. 1987.

Bibliografia

Doktore-tesia

271

Vallee BL, Galdes A. The metallobiochemestry of zinc enzymes. Adv. Enzimol. 56: 283-

430. 1984.

1Vaupel DB, Kimes AS, London ED. Comparison of 7-nitroindazole with other nitric oxide

synthase inhibitors as attenuators of opioid withdrawal. Psychopharmacology. 118: 361-368.

1995.

2Vaupel DB, Kimes AS, London ED. Nitric oxide synthase inhibitors. Preclinical studies of

potential use for treatment of opioid withdrawal. Neuropsychopharmacology. 13: 315-322.

1995.

Ventanyol P, Busquets X, García-Sevilla JA. Modulation of unmunoreactive protein kinase

C-alpha and beta isoforms and G proteins by acute and chronic treatments with morphine and other

opiate drugs in rat brain. Naunyn-Schmied. Arch. Pharmacol. 355: 491-500. 1997.

Vincent B, Beaudet A, Dauch P, Vincent JP, Checler JF. Distinct properties of neuronal

and astrocytic endopeptidase 3.4.24.16: a study on differentiation, subcellular distribution, and

secretion processes. J. Neurosci. 16: 5049-5059. 1996.

Wagner GW, Tavianini MA, Herrmann Km, Dixon JE. Purification and characterization

of an ekephalin aminopeptidase from brain. Biochemestry, 20: 3884-3890. 1981.

Walter R, Shlank H, Glass JD, Schwartz YL, Kerenyi TD. Leucylglycinamide released

from oxytocin by human enzyme. Science. 173: 827-829. 1971.

Waksman G, Boboutou R, Devin J, Bourgoin S, Cesselin F, Hamon M, Fournié-

Zaluski MC, Roques BP. In vivo and in vitro effects of kelatorphan on enkephalin metabolism in

rodent bbrain. Eur. J. Pharmacol. 117: 233-243. 1985.

Waksman G, Hamel E, Fournié-Zaluski MC, Roques BP. Autoradiographic comparison

of the neutral endopeptidase “enkephalinase” and of mu and delta opioid receptors in rat brain. Proc.

Natl.Acad. Sci. U.S.A. 83: 1523-1527. 1986.

Bibliografia

Doktore-tesia

272

Waters SM, Konkoy CS, Davis TP. Haloperidol and apomorphine differentialy affect

neuropeptidase activity. J Pharmacol Exp Ther. 277: 113-120. 1996.

Weissman BA, Zamir N. Differential effects of heroin on opioid levels in the rat brain. Eur J

Pharmacol. 139: 121-123. 1987.

Welche WR, Brosniham KB, Ferrario CM,. A comparison of the properties and enzymatic

activities of three angiotensin processing enzymes: angiotensin converting enzyme, prolyl endopeptidase

and neutral endopeptidase 24.11. Life Sci. 52: 1461-1480. 1993.

Wen HL, Ho WK, Wen PY. Comparison of the effectiveness of diferent opioid peptides in

supressing heroin withdrawal. Eur J Pharmacol. 100: 155-162. 1984.

Whittaker VP. Structure and function of neurones tissue. B.H. Bourne ed. 3: 1-24. 1969.

Wickelgren I. Teaching the brain to take drugs. Science. 280: 2045-2046. 1997.

Wilk S. Prolyl endopeptidase. Life Sci. 33: 2149-2157. 1983.

Wilk S, Wilk E, Magnusson RP. Purification, characterization and cloning of a cytosolic

aspartyl aminopeptidase. J. Biol. Chem. 273: 15961-15970. 1998.

Wilk S, Wilk E, Magnusson RP. Identification of histidine residues important in the catalysis

and structure of aspartyl aminopeptidase. Arch. Biochem. Biophys. 407: 176-183. 2002.

Wise RA. Addictive drugs and brain stimulation reward. Annu. Rev. Neurosci. 19: 319-

340. 1990.

Wimpey TL, Chavkin C. Opioids activate both and inward rectifier a novel voltage-gated

potassium conductance in the hippocampal formation. Neuron. 6: 281-289.1991.

Wüster M, Schultz R, Herz A. Inquiry into endorphinergic feedback mechanism during the

development of opiate tolerance/dependence. Brain Res. 189: 403-11. 1980.

Bibliografia

Doktore-tesia

273

Xu Y, Wellner D, Scheinberg DA. Substance P and bradykinin are natural inhibitors of

CD13 / aminopeptidase N. Biochem. Biophys. Res. Commun. 208: 664-674. 1995.

Yamamoto M, Chikuma T, Yajima R, Hirano H, Yamamoto Y, Nishi K, Ohkubo I,

Kato T. Axonal transport of puromycin-sensitive aminopeptidase in rat sciatic nerves. Neurosci.

Res. 42: 133-140. 2002.

Yasothornsrikul S, Toneff T, Hwang SR, Hook VY. Arginine and lysine aminopeptidase

activities in chromaffin granules of bovine adrenal medulla: relevance to prohormone processing. J.

Neurochem. 70: 153-163. 1998.

Zadina JE, Hackler L, Ge LJ, Kastin AJ. A potent and selective endogenous agonist for the

µ-opiate receptor. Nature. 386: 499-502. 1997.

Zadina JE, Martin-Schild S, Gerall AA, Kastin AJ, Hackler L, Ge LJ, Zhang X.

Endomorphins: novel endogenous mu-opiate receptor agonists in regions of high mu-opiate receptor

density. Ann. Y. Acad. Sci. 897: 136-144. 1999.

Zagon IS, McLaughlin PJ. Endogenous opioid systemsregulate cell proliferation in the

developing rat brain. Brain Res. 412: 68-72. 1987.

Zagon IS, Verderame MF, McLaughlin PJ. The biology of the opioid growth factor receptor

(OGFr). Brain Res Rev. 38: 351-376. 2002.

Zhou Q, Karlsson K, Liu Z, Johansson P, Le Greves M, Kiuru A, Nyberg F.

Substance P endopeptidase-like activity is altered in various regions of the rat central nervous system

during morphine tolerance and withdrawal. Neuropharmacology. 41: 246-253. 2001.