Università degli Studi di PERUGIA

EPIGENETICAEPIGENETICA

Giuseppe ServilloGiuseppe ServilloDip. Di Medicina Clinica e SperimentaleDip. Di Medicina Clinica e Sperimentale

Università di PerugiaUniversità di Perugia

EPIGENETICA

Definizioni: Definizioni:

�La branca della biologia che studia le interazioni causali fra i geni e il loro prodotto cellulare per determinare il fenotipo.C.H.Waddington(1942)

� Studio dei cambiamenti ereditabili nell'espressione genica ereditabili nell'espressione genica che si manifestano indipendentemente dai cambiamenti nella sequenza del DNA

EPIGENETICA

Comporta modificazioni a livello della cromatina che:

� Non modificano la struttura primaria del DNA

� Possono essere ereditabili

� Influenzano l'accessibilità del DNA, regolando

l'attivazione e l'inibizione di determinati geni

Le cellule staminali embrionali (ES) sono capaci di differenziarsiin tutti i tipi cellulari (totipotenza)

Regolazione genica negli eucariotiRegolazione genica negli eucariotiDifferenzazione cellulare

Epigenetica e Differenti Aspetti della Vita

• Sviluppo di organismi multicellulari

• Interazioni Ambiente-organismo• Interazioni Ambiente-organismo

Per esempio: Nutrizione e ambiente (eventi fisici,

biologici e chimici)

• Patogenesi di malattia

IMPRINTING

L’espressione di una piccola

minoranza di geni, nei minoranza di geni, nei

mammiferi, è determinata dalla

propria origine parentale

L'imprinting è un meccanismo

genetico importante per:

� trasferimento di sostanze

nutritive dalla madre al fetonutritive dalla madre al feto

� crescita nel grembo materno e

comportamento dopo la

nascita

� imprinting aberrante causa

svariate sindromi

IMPRINTING

Durante il ciclo vitale di un Durante il ciclo vitale di un

organismo l'imprinting varia

passando per tre fasi:

� Cancellazione

� Impianto� Impianto

� Manutenzione

EPIGENETICA

vs

LAMARCK DARWIN

CROMATINA

� Eucromatina, trascrizionalmente attiva

� Eterocromatina� Eterocromatina

� Costitutiva, trascrizionalmente inattiva

� Facoltativa, trascritta in alcune fasi della vita

dell'organismo

CROMATINA

Le differenze strutturali tra i due stati della cromatina

sono dovuti:

� Diversa interazione tra DNA linker e istone H1

� Diverso stato di acetilazione degli istoni

� Metilazione degli istoni

� Ubiquitinazione

� Sumolazione

NUCLEOSOMI

Il nucleosoma è l'unità fondamentale della cromatina,

costituito da un core di istoni intorno al quale si avvolge

il DNA, tra due nucleosomi vi è un tratto di DNA

denominato DNA linker

NucleosomiNucleosomi • Otto molecole istoniche

formano un ottameroottamero

– 2 molecole di H2AH2A

– 2 molecole di H2BH2B

– 2 molecole di H3H3– 2 molecole di H3H3

– 2 molecole di H4H4

• 146 bp di DNA

arrotolate intorno

all'ottamero

•• Istone H1Istone H1

– Stabilizza il DNA

negli e tra gli

ottameri

ISTONI

Sono proteine basicheSono proteine basiche

utilizzate per compattare il

DNA, vengono suddivise in due

classi:

� H2A, H2B, H3 E H4, H2A, H2B, H3 E H4,

formano strutture

ottameriche

� H1, stabilizza il nucleosoma

ESPRESSIONEGENICA

Processo attraverso il quale l’informazione codificata da un

particolare gene è decodificata in proteinaparticolare gene è decodificata in proteina

La regolazione dell'espressione

genica serve per:

� Sviluppo embrionale

� Differenziamento cellulare e

tessutale

CpG ISLAND

o Regioni di DNA di 0,5-5 kb

o Ricche di GC (60%)

o Localizzate a livello del promotore (50% dei geni)

Nonostante la stabilità del nucleosoma e dell’alto grado di compattezza nel nucleo la cromatina è sorprendentemente dinamica.

Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle

Dinamicità della cromatina

Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle necessità della cellula di regolare i processi biologici dall’espressione genica, alla riparazione del DNA, alla replicazione e ricombinazione.

Modificazioni epigenetiche degli istoni: acetilazione, metilazione ed altre.

Uso di sistemi di rimodellamento che cambiano la stabilità e/o la posizione del nucleosoma.

Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3.

MECCANISMI EPIGENETICI

•Acetilazione: implicata nella regolazione dell’espressione genica. Interessa le LISINE (K).

•Metilazione: associata a differenti funzioni cromatiniche e alla regolazione della trascrizione. Interessa le ARGININE e le LISINE (R

Tipi di modificazione istoniche

regolazione della trascrizione. Interessa le ARGININE e le LISINE (R e K).

•Fosforilazione: coinvolta nella regolazione della trascrizione, nei processi di riparo del DNA e nella condensazione cromosomica durante la mitosi. Interessa le SERINE (S).

•Ubiquitinazione: critica per i processi di mitosi e di meiosi. Interessa le LISINE (K).le LISINE (K).

•poli(ADP)Ribosilazione:associata a varie funzioni cromatiniche(condensazione e decondensazione), principalmente al rilevamento di danni al DNA, ma anche ad altre funzioni genomiche. Interessa le GLUTAMINE (E).

Conseguenze funzionali delle modificazioni istoniche

•Le modificazioni non influenzano la stabilità del core nucleosomale, ma alterano solamente la carica elettrostatica delle code N-terminali. Ciò modifica le proprietà strutturali dell’istone o il suo legame al DNA.

•Si crea un meccanismo che altera la struttura della cromatina, la cui conseguenza è una modificazione dello stato trascrizionale (“on-off”) oppure la definizione di strutture cromosomali di ordine superiore.superiore.

•Modificazioni transitorie e quindi reversibili.

H3R2 K4 K9 S10 K14 R17 K18 K23 R26 K27 S28

Modificazioni covalenti delle code ammino-terminali

K79

H2A

H4

H2B

S1 R3 K5 K8 K12 K16 K20

K9K5 K119

S1 E3 K12 K15 K20 K24 K120

Metilazione Acetilazione Fosforilazione

Ubiquitinazione

METILAZIONE DEL DNA

� Effettuata da DNA-metiltrasferasi DNMT:

• De novo: DNMT3a, DMNT3b;• De novo: DNMT3a, DMNT3b;

• Di mantenimento: DNMT1;

� Il donatore di metili è S-adenosil metionina SAM

METILAZIONE DEL DNA

� Avviene soprattutto nei CpG:

� CpG island;� CpG island;

� CpG island shore;

� Esoni;

� Sequenze ripetute.

� Riconosciuta da proteine MBD.

� Azione variabile:� Azione variabile:

� Silenziamento;

� Efficienza della trascrizione;

� Stabilità cromosomica.

MODIFICAZIONE DEGLI ISTONI

� Gli istoni più interessati sono H3 e H4;

� Possono essere modificati da:� Possono essere modificati da:

o Acetiltrasferasi HAT e deacetilasi HDAC = gruppo acetile

o Metiltrasferasi = gruppi metile

o Chinasi = gruppi fosfato

MODIFICAZIONE DEGLI ISTONI

� L’acetilazione degli istoni regola la trascrizione genica;

� La metilazione è variamente associata a:

• Eterocromatina, es H3 K9me;

• Eucromatina, es H3 K4me.

CODICE ISTONICO

RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA

� Effettuato da complessi con attività ATPasica:ATPasica:

� SWI/SNF;

� ISWI;

� CHD;

� INO80.

� Permettono scivolamento e rimozione � Permettono scivolamento e rimozione dei nucleosomi.

CROSS-TALK

� I meccanismi epigenetici funzionano in maniera coordinata, esempi:

• Metilazione degli istoni e metilazione del DNA;

• Metilazione del DNA e acetilazione degli istoni;

• Reclutamento dei complessi di rimodellamento della cromatina.

Scopo:

PROGETTO EPIGENOMA

� Produrre mappe dettagliate di:

• Metilazione del DNA,

• Modificazione degli istoni,

• Posizione dei nucleosomi;

� Identificare marker di cellule sane e malate;

� Rendere i dati disponibili gratuitamente;

� Migliorare le tecnologie e abbassarne i costi.

mammalsFive kingdom

system(Haeckel, 1879)

animals invertebrates

vertebrates

plants

animals

monera

fungi

protistsprotozoa

invertebrates

Page 516

Tree of life from David Hillis’ lab (based on ~3000 rRNAs)

animalsplants

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http://www.zo.utexas.edu/faculty/antisense/Download.html

fungi

protists

bacteriaarchaea

Noi Siamo quì

Tree of life from David Hillis’ lab (based on ~3000 rRNAs)

http://www.zo.utexas.edu/faculty/antisense/Download.html

Cos'è il genoma?

• Il genoma è l'intero patrimonio genetico di un orga nismo vivente. Si può paragonare ad un'enorme enciclopedia in cui sono contenute le istruzioni che regolano lo sviluppo e il contenute le istruzioni che regolano lo sviluppo e il funzionamento dell'organismo

• Il genoma è "scritto" in un composto chimico chiama to DNA (DeoxyriboNucleic Acid, acido desossiribonucleico)

• Il DNA è identico per tutte le cellule di un individuo ed è contenuto nel nucleo

1976: first viral genomeFiers et al. sequence bacteriophage MS2 (3,569 base pairs,Accession NC_001417).

Chronology of genome sequencing projects

Accession NC_001417).

1977:Sanger et al. sequence bacteriophage φX174.This virus is 5,386 base pairs (encoding 11 genes).See accession J02482; NC_001422.

1981Human mitochondrial genome16,500 base pairs (encodes 13 proteins, 2 rRNA, 22 tRNA)

Chronology of genome sequencing projects

16,500 base pairs (encodes 13 proteins, 2 rRNA, 22 tRNA)Today (10/09), over 1800 mitochondrial genomes sequenced

1986Chloroplast genome 156,000 base pairs (most are 120 kb to 200 kb)

1995: first genome of a free-living organism,the bacterium Haemophilus influenzae

Chronology of genome sequencing projects

1996: first eukaryotic genome

The complete genome sequence of the budding yeast

Chronology of genome sequencing projects

The complete genome sequence of the budding yeastSaccharomyces cerevisiae was reported. We willdescribe this genome soon.

Also in 1996, TIGR reported the sequence of the firstarchaeal genome, Methanococcus jannaschii.

1997:More bacteria and archaeaEscherichia coli

Chronology of genome sequencing projects

Escherichia coli4.6 megabases, 4200 proteins (38% of unknown function)

1998: first multicellular organismNematode Caenorhabditis elegans97 Mb; 19,000 genes.

1999: first human chromosomeChromosome 22 (49 Mb, 673 genes)

2000:Fruitfly Drosophila melanogaster (13,000 genes)

Chronology of genome sequencing projects

Plant Arabidopsis thaliana

Human chromosome 21

2001: draft sequence of the human genome(public consortium and Celera Genomics)(public consortium and Celera Genomics)

1999: Human chromosome 22 sequenced

1999: Human chromosome 22 sequenced

49 MB701 genes

Timeline of largeTimeline of large--scale genomic analysesscale genomic analyses

• La grandezza totale del genoma umano aploide è di 3.070.000.000 basi di cui 2.843.000.000 sono di basi di cui 2.843.000.000 sono di eucromatina

1 245,203,898 218,712,898

2 243,315,028 237,043,673

3 199,411,731 193,607,218

4 191,610,523 186,580,523

5 180,967,295 177,524,972

6 170,740,541 166,880,540

7 158,431,299 154,546,299

8 145,908,738 141,694,337

9 134,505,819 115,187,714

10 135,480,874 130,710,865

11 134,978,784 130,709,420

12 133,464,434 129,328,332

13 114,151,656 95,511,656

14 105,311,216 87,191,216

15 100,114,055 81,117,055

16 89,995,999 79,890,791

17 81,691,216 77,480,855

18 77,753,510 74,534,531

19 63,790,860 55,780,86019 63,790,860 55,780,860

20 63,644,868 59,424,990

21 46,976,537 33,924,742

22 49,476,972 34,352,051

X 152,634,166 147,686,664

Y 50,961,097 22,761,097

Human Genome Human Genome

Genes

(exons)

1.5-2 %

CNCs

1-3%

1.5-2 %

sea3093

95.0%

CNC= conserved non coding sequences

Il metodo Sanger

Nel sequenziamento a terminazione di catena nella reazione serve:

• uno stampo a singola elica

• un innesco specifico della reazione di sequenza (primer)

• la sintesi della catena con un dNTP* marcato, di solito con 35S

• miscela di ddNTP (A,C,G,T), uno per ogni reazione di sequenza• miscela di ddNTP (A,C,G,T), uno per ogni reazione di sequenza

5’- A T C T T T T A G A G T A C C3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

PRIMER DNA Polimerasi

Sintesi del filamento marcato

5’- A T C T T T T A G A G T A C C T G A G* A G A T G A T A G * A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

DNA Polimerasi

PRIMER

La sintesi del filamento complementare, tuttavia non prosegueindefinitamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossi nucleotiditrifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento

perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Terminazione della catena

perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G A G A T G A T A G A

3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

DNA Polimerasi

PRIMER

+ ddNTP ( per es. ddATP)

STOP

5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G A G A T G A T A G A T G T ddA

3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascunoin corrispondenza di ogni dATP

ddATPddATP

ddATPddATP

ddATPddATP

DNA stampo asingola elica

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC5’ 3’

Ibridazione con

Il primer

+

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

+[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTTP(dNTP)+Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC-C ddC

-CC ddG-CCGATT ddG

-CCGA ddT

-CCGAT ddTA C G T

-CCGATT ddG

Sequenza: 5’-CCGATTG

-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC

-ddC

GT

TAGCC Direzione di

lettura

4 Coloranti - 1 Corsia

Unica reazione ed unica corsa;

Sequenziamento automatico

Ad ogni nucleotide è associata una diversa colorazione:

ddATP

ddTTP

ddGTP

ddCTP

Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la variabilità di corsa

ddCTP

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTPun diverso marcatore fluorescente, è

possibile effettuare le quattro reazioni di possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggioe caricare il tutto in un solo pozzetto di gel

ddA

ddT

ddC

ddT

ddG

Metodi di Marcatura

� Marcatura dei Primers

primers progettati con “tag” colorati a:

Sequenziamento automatico

primers progettati con “tag” colorati a:

Fluorescenza UV

Fluorescenza IR minore Background

maggiore Sensibilità

� Marcatura dei Terminatori� Marcatura dei Terminatori

ddNTPs marcati con fluorofori o differenti coloranti

Terminatori BigDye

Sistemi a trasferimento di energia a singola molecola, costituiti da accettore e donatore legati da un linker

Sequenziamento automatico

accettore e donatore legati da un linker

Vantaggi:

Segnale omogeneo, basso rumore di fondo, luminosità maggiore, facilità interpretativa per A e G

attigue D Aattigue D A

Dalla cycle sequencingall’elettroferogramma...

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore

diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

OMICS is a general term for a broad discipline of science and engineering for analyzing the interactions of biological information objects in various omes.

The Proteome is the totality of proteins (expressed genes) in an organism, tissue type or cell, and proteomics is now well-established as a term for studying the proteome. Interactome is the study of molecular interactions in a holistic fashion. The Glycome is the total list of sugar (carbohydrate) molecules in an organism, and glycomics (sometimes glycobiology) has become an established term.Ligandome is the whole set of ligands in biological cells, tissues or species. The Transcriptome is the mRNA complement of an entire organism, tissue type, or cell; the associated field is Transcriptomics; The Metabolome is the totality of metabolites in an organism; the associated field is metabolomics; The Metabolome is the totality of metabolites in an organism; the associated field is metabolomics; The Lipidome is the totality of lipids; the associated field is Lipidomics; *The Localizome. The whole set of localization information of protein domains and proteins. The Spliceome (see spliceosome) is the totality of the alternative splicing protein isoforms; the associated field is spliceomics. Textome: The body of scientific literature which can be analysed by text mining. Textomics: The study of the textome. Kinome: The totality of protein kinases in a cell. Kinomics: The study of the kinome. Publications exist. * Glycosilome: Related to glycosylation. Glycosilomics: The associated field of study. Physiome: Related to physiology. Physiomics: The associated field of study. MetabolomeNeurome: The complete neural makeup of an organism. Something a neurobiologist might be heard to say in the Neurome: The complete neural makeup of an organism. Something a neurobiologist might be heard to say in the future. Neuromics: The study of the neurome. See Neurome.ORGPatentome (Patentomics): The whole set of sequences and structured patented. Predictome: A complete set of predictions. Reactionome : The complete set of biological reactions in cells, biological tissues or organisms. Reactome: A Knowledgebase of Biological Processes. Sociome and sociomics: a proposed new name for sociology. Econome: an economy (see economics).Epigenomics:

DNARNA PROTEINA

Trascrizione Traduzione

SplicingmiRNA

Trascrizione Traduzione

Modificazioni post-traduzionali

• Acetilazione, • Metilazione• Fosforilazione• Fosforilazione• Glicosilazione (enzimatica)• Glicazione (non enzimatica)• Nitrazione/denitrazione• Cleavage• Tagging

Proteomica & Genomica Funzionale

La Proteomica classica concentra il suo interesse sullo studio dei proteomi completi, mentre la proteomica funzionale studia gruppi più limitati di proteine.

Le tre domande più importanti della proteomica sono :

1) Quali proteine sono presenti in una cellula o in un tessuto?

2) Con quali altre proteine interagisce la mia proteina di interesse (network)?

3) Come appare una particolare proteina (struttura)?

• Valutazione di marcatori diagnostici in fluidi corporei

• Studi di farmacologia quali identificazione e/o validazione

SCOPO DELL’APPROCCIO PROTEOMICO

• Studi di farmacologia quali identificazione e/o validazione

di nuovi target proteici per trattamenti farmacologici e

“drug profiling”

• Studi di tossicità

• Glicosilazioni, fosforilazioni o processamenti proteici

• Analisi tissutali in situazioni patologiche

Tools of proteomics

�Database

�Mass spectrometry

�Softwares�Softwares

�Analytical protein-separation technology

TECNOLOGIA LEGATA ALLA PROTEOMICA

• Elettroforesi bidimensionale

• Rilevazione degli “spot” proteici

• Analisi di immagine

• Excisione degli “spot” proteici

• Digestione enzimatica

• Spettrometria di massa

• Bioinformatica