genome editing - microsoft...genome editing research & development center/ institute of...

フナコシニュースNews 6/152017

No.636

デザイン・構築トランスフェクション受託サービス関連製品

p.6p.20p.25p.28

ゲノム編集Genome Editing

ゲノム編集の登場

どのようにゲノム編集するの？

2012 年，CRISPR/Cas9 の登場から，ゲノム編集技術が一気に広まった。ヒト iPS 細胞や動物の受精卵で遺伝子を効率的に改変するだけでなく，農作物や畜産動物の品種改良，再生医療やゲノム編集治療など，さまざまな分野へ利用されている。また，遺伝子改変だけでなく，遺伝子発現制御やエピゲノム修飾，DNA/RNA蛍光修飾などにも利用されている。

ZFN，TALEN，CRISPRなどのゲノム編集ツールは，‘はさみ’のように狙った遺伝子を正確に切ることができる（図1）。切断された遺伝子は，非相同末端結合（NHEJ）により修復され，その際に遺伝子がノックアウト（破壊）される。あるいは，‘はさみ’と一緒に外来遺伝子を入れると，遺伝子をノックイン（挿入）することもできる。このようなゲノム編集を利用することで，2万個以上ある遺伝子の自由自在な書換え（ゲノム編集）が可能になった。

ゲノム編集の最先端

真下知士准教授Tomoji Mashimo

大阪大学大学院医学系研究科附属共同研ゲノム編集センター／附属動物実験施設Genome Editing Research & Development Center/ Institute of Experimental Animal Sciences, Graduate School of Medicine, Osaka University

大阪大学　ゲノム編集センター（真下研）の皆様（前列右から 3 人目が真下先生）

図 1CRISPR/Cas9 システムは，ゲノム中で任意の領域を切断できる遺伝子改変ツール。切断したい標的塩基配列に相補的な配列を含む gRNA と DNA 切断酵素 Cas9 タンパク質により，ゲノム上の任意の配列を切断する。

DNA二本鎖切断（DSB）

ノックアウト

ノックイン

遺伝

遺伝子

子

Cas9gRNA

遺子

非相同末端結合（NHEJ）

相同組換え（HR）

図 2Cas9 タンパク質：

ガイド RNA（gRNA）を頼りに，標的 DNA の PAM 領域近傍を直接切断する。

gRNA：ゲノム上の相同配列に Cas9 タンパク質を誘導する。相同配列がPAM 近傍にあるときのみ切断させる。

PAM（protospacer adjacent motif）：gRNA の相同領域の上流にあり，NGG を含む。

TARGET GENOMIC LOCUS

PROTOSPACERADJACENT MOTIF(PAM)

Cas9/gRNA複合体

5’3’

3’

3’

5’

5’GGGGCCACUAGGGACAGGAU GUUUUAGAGCUA

CGAUCUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUU

UUGAAAAAGUGGCACCGA

UUUUUCGUGGCU

Target sequenceto cleave

Your guide RNAsequence

Cas9

tracrRNA built into vectors

CC

N

NGG

CCCCGGTGATCCCTGTCCTA

G

G

G

AAA

AA

AAC

※図の PAM は SpCas9 の配列

フナコシニュース 2017 年 6 月 15 日号（No.636）funakoshi news

コラム「ゲノム編集の最先端」

本誌に掲載されている製品はすべて研究用です

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ヒト疾患モデル，ヒト化動物の開発

大阪大学にゲノム編集センターが設立

課題と未来展望

ゲノム編集により，ヒト病気の遺伝子変異と同じ変異を持った疾患モデル動物を作ることができる。我々は，CRISPR と一緒に短い一本鎖の DNA（ssODN）を利用して，ラットでゲノム編集に成功している（文献 1）。CRISPR を導入するマイクロインジェクション法に代わって，一度にたくさんの受精卵に導入するエレクトロポレーション法を開発し，超簡単ゲノム編集を実施している（文献 2）。さらに，長鎖一本鎖 DNA（lssDNA）法や 2H2OP 法を開発して，これまで困難であった大きなヒト遺伝子をノックイン（200 kb 以上）することにも成功した（文献 3）。lssDNA を利用することで，効率的なコンディショナルマウスの作製にも成功している（論文投稿中）。動物とヒトのゲノム遺伝子を置き換えた‘ヒト化動物’の作製が次々と進められている。

2016 年 4 月，日本ゲノム編集学会（http://jsgedit.jp）が始まった。2017 年 6 月には第 2 回大会が開催される（下記お知らせ参照）。日本国内の研究者が集まって，研究発表や情報交換を行う。また，若手研究者の育成，倫理・規制などの課題について議論する場にもなっている。2016 年 12 月には大阪大学において，国内初の「ゲノム編集センター」が設立された。マウス，ラット，ウサギにおけるゲノム編集動物の作製支援を行っている。また，ゲノム編集に関する技術指導，実習支援により，医学研究，ライフサイエンス研究の発展を支えていく。

ゲノム編集は，ヒト体細胞や幹細胞，iPS 細胞での遺伝子修復に利用される。さらに，AAV やレンチウイルスによる‘ゲノム編集治療’も行われようとしている。狙った場所以外の遺伝子を傷つけるオフターゲット効果や，倫理面，遺伝子組換えに関する規制などの課題は残されているが，製薬企業やベンチャー企業における治療戦略競争は既に始まっている。また，CRISPR/Cas9 や Cpf1，その他の新しいゲノム編集ツールが次々と開発され，米国ではその知財競争が白熱している。日本初のゲノム編集ツールが開発されることを願っている。

お知らせ

日本ゲノム編集学会第 2回大会会期：2017 年 6 月 29 日（木）～30 日（金）会場：千里ライフサイエンスセンター

文献1. �Yoshimi K. et al., Nature Communications, 5: 4240 （2014）.2. �Kaneko T. et al., Scientific Reports, 4: 6382 （2014）.3. �Yoshimi K. et al., Nature Communications, 7: 10431 （2016）.

図3ゲノム DNA，およびプラスミド DNA をそれぞれ認識する 2 種類のgRNA（gRNA-1，gRNA-2）により，CRISPR/Cas9 が「はさみ」としてゲノム上とプラスミド上の標的配列を切断する。それぞれの切断末端を，ホモロジーアームに持つ 2 種類の ssODN が「のり」として結合修復することで，プラスミド DNA を特定のゲノム上に正確かつ効率的にノックインできる。

2H2OP（2ヒット 2オリゴ）法による遺伝子ノックイン

特許申請

哺乳動物の標的ゲノム領域にDNAをノックインする方法及び細胞出願人：京都大学（真下知士，吉見一人，金子武人）出願日：平成 26 年 11 月 20 日　　出願番号：2014-235898

コラム「ゲノム編集の最先端」


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フナコシニュース2017年 6月 15日号（No.636）funakoshi news

INDELS v i a NHE J

HR Donor Vector

ノックアウト

GENE KNOCK-OUT(with HR vector)

GENE INSERT ION(with HR vector)

NN

OR

ノックイン

CORRECTED GOI

loxPExcision of

selection cassette

loxP

HR Donor Vector

HR Donor Vector

デザイン遺伝子のノックアウトやノックインなど，どのような実験を行うかを計画し，標的配列を決定します。

構築標的配列に対する相補的な配列のgRNAやノックインしたい配列を設計し，それらの断片を各ベクターにクローニングします。

トランスフェクション作製した各ベクターを目的細胞へコトランスフェクションすると，CRISPR/Cas9 により標的領域が切断されます。

選択スクリーニングなどにより変異体を選択します。

確認DNAシークエンシングなどで変異の導入を確認します。

gRNAのデザイン方法標的 DNA 配列は，末端に「GG」が配置されている領域を選択し，NGG の上流 20 塩基で設計します。切断したい標的 DNA 配列を含む gRNA およびその相補鎖をオリゴ合成などで作製します。

標的 DNA 配列 5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG 3'デザインする配列の例＊

5'ATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3'3'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA 5'

＊ベクターにより，標的配列の両端に付加する配列は変わります。

ATCG

〈CRISPR/Cas9 プラスミドベクターによるゲノム編集〉

ゲノム編集ワークフローフナコシニュース2017年 6月 15日号（No.636）funakoshi news

ゲノム編集


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NOTE※本紙に記載されている価格は，2017 年 6 月 15 日現在です。表示価格に，消費税等は含まれていま

せん。一部価格が予告なく変更される場合がありますので，あらかじめご了承下さい。※本紙に掲載されている製品は，すべて研究目的用にのみ販売しています。医薬品，診断用医薬品，

食品，食品検査等の用途には使用できません。※ 印の製品は，「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律

（通称：カルタヘナ法）」使用規制対象となりますので，ご使用に際しては規制に則し，適切にお取り扱い下さい。

※ 印の製品は，取り扱いに厳重な注意を要する製品であり，ご購入時に「使用目的確約書」が必要になります。ご注文の際は，「使用目的確約書」に直筆でご記入の上，販売店経由で当社までお送り下さい。確約書受領後に製品を発送させていただきます。また，これらの製品をご購入後は，鍵の掛かる場所での保管をお願いいたします。

※ 印の製品は,「毒物及び劇物取締法」に基づく医薬用外毒劇物です。法規制に従って，保管，廃棄等して下さい。

※ 印の製品は，毒性があるため，取り扱いに注意または厳重な注意が必要です。製品は，鍵の掛かる場所に保管して下さい。添付されているデータシートや商品ラベルをよくお読み下さい。

※ 印の製品には安全にご利用いただくための警告ラベルが貼られています。表示に従って安全対策を実施して下さい。

※ 印は，液体窒素中での保存を要する製品です。ドライアイス包装で配送していますが，製品到着後，直ちに液体窒素中で保存して下さい。

※ 印は，－80℃ での保存を要する製品です。ドライアイス包装で配送していますが，製品到着後，直ちに－80℃ のフリーザー等に保存して下さい。

※外観・仕様は改善のため，予告なく変更することがあります。※R&D Systems はテクネコーポレイションの登録商標です。

使用に当たっては同社の許可が必要な場合があります。※記載されている会社および商品名は，各社の商標または登録商標です。※本紙には各メーカーから提供された画像・図表が掲載されています。なお，画像・図表の著作権は

各メーカーが保有しています。※ご注文の際は，［品名，メーカー，商品コード，包装，数量］をお知らせ下さい。

Cas9 や gRNAの導入方法プラスミドで導入する p.6～9

RNA で導入する p.10～11

タンパク質で導入する（組換え体 Cas9） p.11

ウイルス・ウイルスベクターで導入する p.12～15

最初から入っている（Cas9 発現細胞） p.24

細胞への導入トランスフェクション試薬 p.20～21

発現の確認Cas9 検出プライマー p.22

Cas9 検出抗体 p.22～23

相同組換え修復効率を向上する化合物 p.24

gRNAgRNA 作製キット p.10

gRNA ベクターまたは Cas9 All-in-one ベクターに一度に複数の gRNA をクローニングできるキット

p.19

ドナーベクターノックアウト用 HR ドナーベクター p.16

ノックイン用 HR ドナーベクター p.17

タグ付け用 HR ドナーベクター p.17

痕跡を残さず変異導入 p.18

GFP やサイズの大きい遺伝子をノックイン p.32

受託内容遺伝子改変マウスの作製 p.25

CRISPR/Cas9，gRNA 発現プラスミドや HR ドナーベクターのデザインおよび作製 p.26

遺伝子ノックインのオフターゲットにより生じた遺伝子挿入の位置決定 p.30

遺伝子改変細胞株の作製 p.31

人工遺伝子合成 p.31

その他のゲノム編集関連製品アイソジェニック細胞株の作製 p.28～29

受託サービス作業をプロにお任せしたいあなたはこちら！

System Biosciences 社（以下，SBI 社）は，特にゲノム工学やエクソソーム研究などに関わるユニークで革新的なツールと受託サービスを提供しているメーカーです。今回のニュースでは，SBI 社が誇るゲノム工学関連の end-to-end の製品ラインナップをまとめてご紹介しています。

イノベーションで科学を推進する p.27

Tel. 03-5684-1653　Fax 03-5684-6539e-mail：[email protected]

研究成果の製品化・販売をサポートします！フナコシは，ライフサイエンスの更なる発展を目指し，皆様の研究成果の製品化や販売のお手伝いをさせて頂きます。詳細については，是非当社までお気軽にご相談・お問い合わせ下さい。

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HR ドナーベクターCas9 と組み合わせて使用します。Cas9 単体でも DSB（二本鎖切断）により遺伝子ノックアウトが可能ですが，ノックアウト用の HR ドナーベクターを用いることで，相同組換えに成功した細胞を効率よく選択できます。また，Cas9 で切断した部位に特定の配列をノックインしたい場合には，その目的配列を含むドナーベクターを一緒にトランスフェクションすると，相同組換え（HDR）によりその配列をノックインすることができます。

それぞれの特長は？プラスミド細胞株でのゲノム編集に有用です。

mRNA・タンパク質ES 細胞や in vivo 実験での使用に特に有用です。

レンチウイルスCas9 安定発現細胞株の構築などに有用です。

Multiplex gRNA cloning Kit1 回のトランスフェクションで複数遺伝子をノックアウトするコンストラクトを作成できます。

ゲノム編集


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製品／サービスラインナップフナコシニュース 2017 年 6 月 15 日号（No.636）funakoshi news

線状化されているため，ライゲーションが容易なAll-in-one ベクターです。※相同組換えによるノックアウト／ノックインには，別途HRドナーベクターが必要です。詳細はp.18～19をご覧下さい。

gRNA と野生型 Cas9 を 1 つのベクターで発現できますPrecisionX Cas9 SmartNuclease All-in-one Vectors

46070Web ページ番号タグベクター

7686Web ページ番号野生型 Cas9 ベクター

使用例�

キット内容�●�Linearized�Cas9-H1�SmartNuclease�Vector●� ligation�buffer●�Fast�ligase●�Fwd�Sequencing�primer（5�µM）

0.00%

20.00%

40.00%

60.00%

80.00%

100.00%

120.00%

A. Luciferase Assays1. 100bp ladder2. EF1-hspCas9H1-Luc-gRNA13. EF1-hspCas9H1-Luc-gRNA2

B. Surveyor Assays

Relative Luciferase Activity

Luc-gRNA1

Luc-gRNA2

1 2 3

100bp

500bp

30% 22%

Neg.Control

Luciferase 切断用ベクターを用いた Luciferase の切断Luciferase を標的とする gRNA を組み込んだ CRISPR ベクターを作製し，Luciferase発現 293 細胞にトランスフェクションし，切断効果を検証した。gRNAは標的配列の異なる 2種類（gRNA1および gRNA2）を作成した。A）�Luciferase 活性測定による検証。Negative�control に対して，gRNA1 およびgRNA2では Luciferase 遺伝子の破壊による活性の低下が見られた。

B）�Surveyor�Assay を行ったところ，gRNA1および gRNA2においてそれぞれ 30％および 22％の切断効果が見られた。

Phase

RFP

wtCas9-H1-Luc-gRNA1＋ HR Donor

wtCas9-H1-Luc-gRNA2+ HR Donor

HR DonorAlone Control

Luciferase 切断用All-in-oneベクターおよびRFPドナーベクターを用いてRFP遺伝子をノックインした例

製品ラインナップ�

■PrecisionX T7 Cas9 gRNA linearized SmartNuclease vector（10 reactions）［メーカー：SBI］

Cas9 プロモータータ　グ商品コード包　装価格（￥）

EF1-T7-hspCas9-H1-gRNA

野生型（hspCas9�wt）

EF1

なし CAS700A-1

1�kit

131,000 SBI137001

EF1-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS700G-1 136,000 SBI137000

EF1-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS701R-1 136,000 SBI137010

CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA

CAG

なし CAS720A-1 131,000 SBI137201

CAG-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS720G-1 136,000 SBI137200

CAG-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS721R-1 136,000 SBI137210

CMV-T7-hspCas9-H1-gRNA

CMV

なし CAS740A-1 131,000 SBI137401

CMV-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS740G-1 136,000 SBI137400

CMV-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS741R-1 136,000 SBI137410

ノックインノックアウト

特　長�●�gRNAおよび Cas9 タンパク質は 1つの CRISPR ベクターから発現できるため，細胞への導入が必要となる CRISPR ベクターは 1種類のみです。

●�CRISPR ベクターは線状化されているため，ライゲーションが容易に行えます。

●�10 反応分の量が含まれています。●�プロモーターの異なる3種類のCRISPRベクターがあります。●�トランスフェクション効率のチェック用に GFP/RFP 配列が挿入されているベクター（Tagged�Vector）もあります。

ベクターマップ�Promoter(EF1a,CAG,CMV)

KanR NLST7

NLS

pUCOri

SV40ori

gRNAscaffold

H1promoter

WPRE

hspCas9Gene

Cas9SmartNucleaseTMAll-in-oneVectorSV40

poly(A)

Promoter(EF1a,CAG,CMV)

KanR NLS

NLS

pUCOri

SV40ori

gRNAscaffold

H1promoter

WPRE

T2AGFPRFP

hspCas9Gene

or

Cas9SmartNucleaseTMAll-in-one

Tagged VectorsSV40poly(A)

Memo野生型／変異型Cas9 とは

野生型 Cas9 DSB（二本鎖切断）によりゲノムを切断します。

変異型 Cas9（D10A） DSB（二本鎖切断）ではなく，一本鎖のみを切断しニックを入れます。ペアのニックにより，オフターゲットを 50～1,500 分の 1の確率まで低減できます。


Ｃａｓ9プラスミド


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お問い合わせ先：〈試薬〉TEL：03-5684-1620 ／ FAX：03-5684-1775 ／ e-mail：[email protected]

線状化されているため，ライゲーションが容易なAll-in-one ベクターです。変異型 Cas9（D10A）はニッカーゼとして機能し，オフターゲット効果を低減した相同組換えによるゲノム編集が行えます。※相同組換えによるノックアウト／ノックインには，別途HRドナーベクターが必要です。詳細はp.18～19をご覧下さい。

gRNA と変異型 Cas9 を 1 つのベクターで発現できますPrecisionX Cas9 SmartNickase All-in-one Vectors

46070Web ページ番号タグベクター

8198Web ページ番号変異型 Cas9 ベクター

ベクターマップ� 使用例�


■Cas9 Double Mutant: gRNA linearized SmartNuclease vector Kit（10 reactions）

Null�Nuclease（D10A/H840A の 2重変異体）を発現するベクターです。ヌクレアーゼ活性および�ニッカーゼ活性が完全に失われていますが，標的配列への結合能を有し，オフターゲット効果の少ない転写リプレッサーとして機能すると考えられています。

wtCas9＋gRNA

GFP Fluorescence Bright Field Phase 1 2 3 4 5

1. DNA marker

2. wtCas9＋gRNA

3. Cas9 Nickase＋gRNA

4. Null Nuclease＋gRNA

5. Negative control EGIP cell

Cas9 Nickase＋gRNA

Null Nuclease＋gRNA

HR Integration at AAVS1 Images Surveyor Nuclease Assays

［メーカー：SBI］


EF1-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA

変異型（hspCas9，Nickase）

EF1

なし CAS750A-1

1�kit

131,000 SBI137501

EF1-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS750G-1 136,000 SBI137500

EF1-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS751R-1 136,000 SBI137510

CAG-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA

CAG

なし CAS770A-1 131,000 SBI137701

CAG-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS770G-1 136,000 SBI137700

CAG-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS771R-1 136,000 SBI137710

CMV-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA

CMV

なし CAS790A-1 131,000 SBI137901

CMV-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS790G-1 136,000 SBI137900

CMV-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS791R-1 136,000 SBI137910



EF1-hspCas9-DM-H1-gRNA 変異型（Null�Nuclease） EF1 なし CAS805A-1 1�kit 131,000 SBI998537


GFP 発現ドナーベクターとCRISPR/Cas9 ベクターをトランスフェクションし，AAVS1 に GFP を導入した。

pUCori Cas9

SmartNickaseTMAll-in-oneVectors

SV40ori

gRNAscaffold

H1Promoter

WPRENLS

NLS

myc-tagPromoterChoice

hspCas9Nickase

Kan＊

SV40poly（A）

pUCori Cas9

NullNucleaseAll-in-oneVectors

SV40ori

gRNAscaffold

H1Promoter

WPRENLS

NLS

myc-tagPromoterChoice

hspCas9DoubleMutant

Kan＊

SV40poly（A）

■Cas9 Nickase: gRNA linearized SmartNickase vector（10 reactions）

Memo変異型Cas9（D10A）とはCas9タンパク質のD10Aサイトのあるアミノ酸変異により，ヌクレアーゼ活性が不活性化し，ニッカーゼ活性を持つようになります。Cas9（D10A）は，野生型 Cas9 のようにDNA二本鎖を切断せず，一本鎖のみを切断しニックを入れます。そのため，二本鎖切断によるDNA 修復機構 NHEJ（非相同末端結合）が起こらず，標的領域以外での遺伝子欠失・挿入やオフターゲット効果を抑制できます。また，ペアのニックにより，細胞株におけるオフターゲット効果を 50～1,500 倍まで減少した例もあります。

5’ CCN

GGN3’ 5’3’

3’

3’

gRNA 1

gRNA 2

Cas9(D10A)NickaseCas9(D10A)Nickase

TAGCCGTAACGAATGGCAAT -5’

TAGCCGTAACGAATGGCAAT

ATCGGCATTGCTTACCGTTA CGTAAGCTTACGCGATGCAC

Targeting site

NGG

NCCGCATTCGAATGCGCTACGTG

5’-CGTAAGCTTACGCGATGCAC

標的部位のアンチセンス鎖に対する gRNA�1 とセンス鎖に対する gRNA�2 を作製し，Cas9（D10A）を用いてペアでニックを入れ，ゲノム編集の効率を向上させる。



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構築済みの Cas9 / gRNA 発現ベクターと相同組換え用のドナーベクターのセットです。19,000 種類以上の標的遺伝子に対するキットを取りそろえています。マーカー遺伝子によるノックアウト細胞のスクリーニングに有用です。

19,000 種類以上の目的遺伝子に対する gRNA が組み込み済みのノックアウト用キットGene Knockout Kit via CRISPR / Cas9

26712Webページ番号詳しくはWebで

特　長�

包装／価格�

キット内容�●�CRISPR によりORFの 5’ 末端周辺を切断します。●�異なる配列の gRNA がクローニングされたベクターが 2 種類含まれ，確実に目的遺伝子をノックアウトできます。

●�GFP と Puro によってセレクションできます。

1�kit／￥364,000※受注発注品

［メーカー：ORI］

●�目的遺伝子に対する gRNA と Cas9 を 1 つのベクターで発現するpCas-Guide ベクター 2種類（#KN2xxxxxG1，#KN2xxxxxG2）●�ホモロジーアームが組み込まれたGFP-puro ドナーベクター（#KN2xxxxxD）●�ネガティブスクランブルコントロールベクター（#GE100003）

操作方法概略�

ChromosomeHomologous Repair

Edited Chromosome

LHAGFP Puro

GFP Puro

PGK

RHALoxp Loxp

PGK

Loxp Loxp

ターゲット配列がクローニング済みの pCas-Guide ベクターとHomologous�Arms と Functional�Cassette を含むドナーテンプレートDNAをコトランスフェクション

CRISPR/Cas9 によりターゲット遺伝子がノックアウトされ，GFP（外来プロモーター連結）とピューロマイシン（PGK プロモーター連結）がノックインされる。細胞を～20日間継代・希釈培養し，選択を行う。

使用例�

ATG5–human�gene�knockout�kit�via�CRISPR（#KN210563）を用いてバリデーションを行った。

製品の検索方法／ご注文方法�

選抜前の細胞からゲノム DNA を抽出し，ATG5配列からGFP配列を増幅するプライマーを用いて PCRを行った。 GFP-puro�Cassette の導入により，ATG5がノックアウトされGFPがノックインしたこ

とが分かる。

①フナコシWebのWebページ番号検索に【26712】を入力

②�ご注文の際には，上記ラインナップ検索で表示される品名，メーカー（ORI），商品コード，包装（1�kit），数量をお知らせ下さい。

26712

ノックアウト




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遺伝子が挿入されても表現型への影響がなく安全な遺伝子領域として知られる AAVS1 Safe Harbor Site に，任意の目的遺伝子や Cas9 などを簡便にノックインするキットです。

安全領域に目的遺伝子／Cas9／GFP をノックインAAVS1 Safe Harbor Targeting System

64619Web ページ番号詳しくは Web で

特　長�

キット内容�

MemoSafe Harbor とはSafe�Harbor は様々な細胞で転写活性を有し，かつその領域に遺伝子導入を行ってもフェノタイプに影響を及ぼさない遺伝子領域です。ゲノムに外来遺伝子を導入する際に，遺伝子導入による影響や導入遺伝子の発現に影響が生じないように Safe�Harbor を標的として利用する手法が確立されています。

●�導入遺伝子は恒常的に発現します。●�同質遺伝子細胞株を簡便に構築できます。●�オフターゲット効果を最小化できます。●�hspCAS9�AAVS1�Safe�Harbor�Knock-in�Donor� �（#CAS620A-KIT）は，CRISPR/Cas9 ライブラリーの効率的なスクリーニングに有用です。

●�HR ドナーベクター（#GE62xA-1）●�AAVS1 用 gRNA/Cas9 発現 All-in-one ベクター（#CAS601A-1）●� junction�PCR プライマー（#GE640PR-1，AAVS へのノックイン確認用）

※それぞれ単品でのご購入も可能です。


目的遺伝子をノックインするキット

AAVS1-SA-puro-EF1-MCS

メーカー商品コード包　装価格（￥）

SBI GE622A-KIT 1�kit 337,000 SBI166221

Cas9 をノックインするキット

AAVS1-SA-puro-EF1-hspCas9


SBI CAS620A-KIT 1�kit 356,000 SBI136201

任意のプロモーターとレポーター遺伝子（GFP）をノックインするキット

AAVS1-SA-puro-MCS-GFP



任意のプロモーターと目的遺伝子をノックインするキット

AAVS1-SA-puro-MCS



使用例�

M 11. Cas9 stable cell　 line in AAVS1　 locus #8

2. Cas9 stable cell　 line in AAVS1　 locus #17

3. Non transfected　 293 cells

2 3Cas9 knock in at AAVS1 locus

ノックイン細胞

NC

9000800070006000500040003000200010000

8 11 17 20 28 32

Relative expression

左：本製品を用いて作製した HEK293 細胞株各クローン AAVS1 遺伝子座における Cas9 遺伝子の qPCR による発現量解析

右：Cas9 高発現細胞 8 と 17 の Surveyor Assay の結果矢印（←）のバンドはCas9による切断を示す。コントロール�細胞（NC，lane3）には，このバンドが存在しない。

ノックイン

Cas9 安定発現 HEK293 細胞株AAVS1の Safe�Harbor 遺伝子座にhspCas9 を組み込んだ，Cas9の安定発現 HEK293 細胞株です。gRNA を本細胞に直接導入するだけでゲノム編集が行えます。品　　名

メーカー商品コード包装 / 価格（￥）Stable Cas9 HEK293 Cell Line with Cas9 stably integrated at AAVS1 Safe Harbor LocusSBI CAS630A-1 1�vial�/ 187,000 SBI136300

Check�it�out! ［メーカー：SBI］


ノックイン


9



野生型／変異型 Cas9RNA と gRNA 作製キットTransfection-ready Cas9 SmartNuclease mRNA & gRNA Vector Kit


特　長�

■Transfection-ready Cas9 SmartNuclease mRNA ［メーカー：SBI］

用　途 Cas9 タ　グ商品コード包　装価格（￥）

SBI998540

真核生物用

野生型（hspCas9�wt）

なし CAS500A-1� 20�μg� 65,000

SBI135301 GFP CAS530G-1� 10�μg� 58,000

SBI135311 RFP CAS531R-1� 10�μg� 58,000

SBI998536変異型

（hspCas9，Nickase）

なし CAS504A-1� 20�μg� 65,000

SBI135341 GFP CAS534G-1� 10�μg� 58,000

SBI135351 RFP CAS535R-1� 10�μg� 58,000

SBI998539 原核生物用 spCas9 なし CAS502A-1� 20�μg� 65,000

■ポジティブコントロール用 mRNA品　　名

メーカー商品コード包装 / 価格（￥）mRNAExpress Positive Control mRNA, Transfection-ready

SBI999162 SBI MR700A-2 GFP 2×10�μg�/ 53,000SBI998769 SBI MR800A-2 RFP 2×10�μg�/ 53,000

●�任意の gRNA（crRNA-tracrRNAキメラ転写産物）を組み込んだ T7�gRNA�Cloning�Vector により，PCR 用または in�vitro 転写用のテンプレートとして，高効率に gRNA を作製できます。

品　　名メーカー商品コード包装 / 価格（￥）

Cas9 SmartNuclease AAVS1 gRNA, Transfection-readySBI CAS520A-1 10�μg�/ 47,000 SBI998534AAVS1 に対する gRNA。


Linearized T7 gRNA SmartNuclease Vector KitSBI998542 SBI CAS510A-1 1�kit�/ 112,000

gRNAクローニングベクター作製キット。

T7 gRNA SmartNuclease Synthesis KitSBI998541 SBI CAS510A-KIT 1�kit�/ 131,000

gRNAクローニングベクター作製キット（#CAS510A-1）に in�vitro 転写を行うための試薬が付属したキット。



野生型Cas9 またはニッカーゼ型Cas9（D10A）と gRNAを，RNAの状態で細胞などのホストに導入するシステムです。挿入・欠失により遺伝子をノックアウトしたい場合に有用です。※相同組換えによるノックアウト／ノックインには，別途HRドナーベクターが必要です。詳細はp.18～19をご覧下さい。※野生型／変異型Cas9 については，p.6～7をご覧下さい。

●�gRNA 作製キットで作製した gRNA と Cas9�SmartNucle-ase�mRNA を同時に細胞にトランスフェクションして，ゲノム編集を行います。

●�RNA の状態で細胞にトランスフェクションするため，免疫原性が低く，タンパク質発現までの時間が短く，速やかにゲノム編集が行われます。ES細胞にも適しています。

●�トランスフェクション効率のチェックに有用なGFP�/�RFPタグ付きCas9�mRNAもあります。

AAVS1 gRNA

gRNA Scaffold

KanR

T7 gRNA Cloningand Production Vector

＃CAS510A-1

pUC ori

T7 Promoter

Cas9 mRNA(# CAS500A-1)

AAVS1 gRNA(# CAS520A-1)

+5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’

※受注発注品

トランスフェクション試薬については，p.20～21をご覧下さい。

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コントロール用gRNA�gRNA作製キット�


Ｃａｓ9ＲＮＡ


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Cas9 または Cre リコンビナーゼの高発現用 mRNA

Genome Editing mRNACRISPR/Cas9 または Cre リコンビナーゼの mRNA の5' 末端にポリアデニル tail を有する，安定性の高い非免疫原性の修飾 mRNA です。それぞれ野生型 Cas 9 または核局在化配列融合 Cre リコンビナーゼを高発現します。

特　長�●�CRISPR/Cas9�mRNA は gRNA と混合し，トランスフェクション試薬とインキュベートした後，細胞へ添加して導入します。

●�細胞質内で直接タンパク質を発現するため，核への取り込みは不要です。

●�DNA トランスフェクションよりもタンパク質の発現が迅速です。

●�ゲノムへの組み込みはありません。●�非分裂細胞に用いることができます。●�プロモーター非依存的にタンパク質を発現します。


SV40 由来の核移行シグナル（NLS）を持つ組換え Cas9タンパク質です。

CRISPR/Cas9 によるゲノム編集の効率を向上させます

組換え Cas9 タンパク質

特　長�●�バクテリア由来のプラスミドを用いる必要が無いため，細胞の免疫応答を低く抑えられます。

●�gRNA と共にインキュベート後，トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより，細胞や胚に導入できます。

●�産生：E.�coli

Memo従来のゲノム編集では，プラスミドやmRNAを細胞などにトランスフェクションし，細胞内でCas9タンパク質を合成させていましたが，Cas9タンパク質を直接トランスフェクションすることにより，オフターゲット効果を抑制し，ゲノム編集の効率を向上させることができるという報告があります。1.�Ramakrishna�S.,�et�al.,�Genome�Res.,�24:�1020～1027�（2014）.［PMID:�24696462］2.�Wang�L.,�et�al.,�Sci.�Rep.,�5:�17517�（2015）.［PMID:�26620761］3.�Chen�S.,�et�al.,�J.�Biol.�Chem.,�291:�14457～14467�（2016）.［PMID:�27151215］


Cas9 with NLS, Streptococcus pyogenes, RecombinantSBI CAS400A-1 50�μg�/ 68,000 SBI998301


Cas9 Protein and T7 gRNA SmartNuclease Synthesis KitSBI CAS400A-KIT 1�kit�/ 183,000 SBI998300

組換え Cas9 タンパク質（#CAS400A-1）と gRNA のクローニング・合成試薬キットの T7�gRNA�SmartNuclease�Syn-thesis�Kit（#CAS510A-KIT，p.10 参照）がセットになった製品です。




CRISPR-CAS9 Encoding mRNAOZB273100 OZB MRNA31-20 20�μg�/ 42,000OZB273110 OZB MRNA31-100 100�μg�/ 105,000

Cre Recombinase Encoding mRNAOZB273200 OZB MRNA32-20 20�μg�/ 42,000OZB273210 OZB MRNA32-100 100�μg�/ 105,000

From mRNA to Protein

核への取り込みなし

ゲノムへの組み込みなし

トランスフェクションしにくい細胞に最適

タンパク質

核

エンドサイトーシス

エンドソーム

複合体形成翻訳

mRNA

mRNAのリリース

トランスフェクション試薬については，p.20～21をご覧下さい。

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関連製品�

MemoCre リコンビナーゼとはバクテリオファージ P1由来の TypeⅠトポイソメラーゼで，loxP 部位間の DNA の組換えを触媒します。組換え産物は loxP 部位の場所と相対配向に依存します。●�2 つの loxP 部位間のDNAの切除●� loxP 部位を含むDNA分子の融合●� loxP 部位間のDNAの反転



Ｃａｓ9ＲＮＡ－Ｃａｓ9タンパク質


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トランスフェクションの難しい細胞でノックアウトしたい場合や，Cas9 安定発現細胞株を樹立し，複数のノックアウト細胞を効率良く作製したい場合に有用です。

gRNA と野生型／変異型 Cas9 をレンチウイルスで導入しますLentiviral CRISPR / Cas9 System



①Cas9 と gRNA を同時に発現させるレンチウイルスベクター…All-in-one レンチウイルスベクター

②Cas9 と gRNA をそれぞれ発現させるレンチウイルスベクター…Cas9 / gRNA 発現用レンチウイルスベクター


Cas9 プロモーターマーカー商品コード包　装価格（￥）

野生型�（hspCas9�wt）発現用

CMV Puro CASLV300PA-1

1�kit

131,000 SBI998421

MSCV Puro CASLV320PA-1 131,000 SBI998420

変異型（hspCas9（D10A）mut，Nickase）発現用

CMV Puro CASLV400PA-1 131,000 SBI998419

MSCV Puro CASLV420PA-1 131,000 SBI998418




CMV Puro CASLV100PA-1 10�μg� 112,000 SBI998445

MSCV Puro CASLV120PA-1 10�μg� 112,000 SBI998441

CMV EF1a copGFP CASLV105PA-1 10�μg� 112,000 SBI998443

MSCV EF1a copGFP CASLV125PA-1 10�μg� 112,000 SBI998439


CMV Puro CASLV200PA-1 10�μg� 112,000 SBI998437

MSCV Puro CASLV220PA-1 10�μg� 112,000 SBI998433

CMV EF1a copGFP CASLV205PA-1 10�μg� 112,000 SBI998435

MSCV EF1a copGFP CASLV225PA-1 10�μg� 112,000 SBI998431

gRNA発現用

EF1a H1 Blasticidin�R CASLV500PA-B 1�kit� 112,000 SBI998417

EF1a H1 copGFP CASLV501PA-G 1�kit� 112,000 SBI998416

EF1a H1 RFP CASLV502PA-R 1�kit� 112,000 SBI998415

EF1a U6 Blasticidin�R CASLV510PA-B 1�kit� 112,000 SBI998414

EF1a U6 copGFP CASLV511PA-G 1�kit� 112,000 SBI998413

EF1a U6 RFP CASLV512PA-R 1�kit� 112,000 SBI998412

ノックアウト

本製品はウイルスベクター関連製品のため，購入時にご使用者確認書が必要です。ご注文の際は，フナコシホームページ（http://www.funakoshi.co.jp/download/pdf/Viral.pdf）にある「ウイルスベクター関連製品ご使用者確認書」に必要事項をご記入の上，販売店担当者にお渡し下さい。なお，製品をご使用の際には「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（カルタヘナ法）」および所属組織における安全管理規定に従い，しかるべき施設で実験を行って下さい。詳細は文部科学省ライフサイエンス課のホームページをご覧下さい。

●！ウイルスベクター関連製品ご購入時のご注意




CMV Puro CASLV100VA-1

2×25�μl�

112,000 SBI998429

MSCV Puro CASLV120VA-1 112,000 SBI998427

CMV EF1a copGFP CASLV105VA-1 112,000 SBI998428

MSCV EF1a copGFP CASLV125VA-1 112,000 SBI998426


CMV Puro CASLV200VA-1 112,000 SBI998425

MSCV Puro CASLV220VA-1 112,000 SBI998423

CMV EF1a copGFP CASLV205VA-1 112,000 SBI998424

MSCV EF1a copGFP CASLV225VA-1 112,000 SBI998422

③パッケージング済みの Cas9 発現用レンチウイルス

GFP および RFP を安定発現する HEK293T 細胞に，MSCV-Cas9-T2A-Puro（#CASLV120VA-1）および EF1α-Blasticidin-H1-RFP�gRNA（#CASLV500PA-B にRFP に対する gRNA配列を挿入）を導入し，蛍光を観察した。

Phase GFP RFP

GFP RFPPhase

No RFP gRNA

Plus RFP gRNA

使用例�


Ｃａｓ９レンチウイルス


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Q1.プレートにコロニーがほとんど生えません。

A1.以下の原因が考えられます。1）形質転換効率が高いコンピテントセルを使用して下さい。例：形質転換効率＞1×109CFUs/μgofpUC18plasmid

2）プラスミドが損傷した可能性があります。保存したプラスミドの凍結融解は行わないで下さい。プラスミドは，1～2週間程度の短期間の冷蔵保存，または反応ごとに別チューブに分注し，－20℃での保存をお勧めします。

Q4.Cas9/Nickase 発現ベクターをパッケージングしたウイルスの力価が非常に低くなってしまいました。

A4.以下の原因が考えられます。1）HEK293T 細胞の密度が高すぎる，または低すぎるため，トランスフェクション効率が低くなった可能性があります。トランスフェクションの際に，プレート中の細胞密度が 50～80％になるように調節して下さい。

2）293T 細胞の品質が悪かったため，偽ウイルス粒子の産生が不十分であった可能性があります。以下の点を参考に，生育条件の最適化を行って下さい。・増殖培地を再確認して下さい。・細胞を 20 回以上継代していないことを確認して下さい。

・細胞がマイコプラズマ感染していないことを確認して下さい。

・細胞を増殖させすぎていないか確認して下さい（培養を対数増殖期に維持するため，細胞密度を 90％以上にしないようにして下さい）。

3）偽ウイルス粒子を含む細胞培養上清の回収タイミングが早すぎた，または遅すぎた可能性があります。培養上清は少なくとも 2度回収して下さい（トランスフェクション後 48 時間および 72 時間の時点）。回収した上清を合わせて，ウイルスの濃縮を行って下さい。PEG沈殿によるウイルス粒子濃縮用試薬 PEG-it（下記参照）の使用をお勧めします。

4）使用している Cas9/Nickase レンチベクターが，パッケージング効率の限界に近づいている可能性があります。レンチウイルスシステムにおけるパッケージングでは，レンチベクターの5’LTR-3’LTR 間は 8.5kb までが限界です（Cas9/Nickase ベクターは 8kb までが限界）。cDNAインサートのサイズが2kb以上になると，パッケージング効率は著しく低下します（Cas9/Nickaseベクターでは，4kb までのインサートサイズをパッケージング可能）。3kb を組み込んだ場合は，1kb の場合に比べ，パッケージング効率が 1/10 以下になることがあります。これを回避するためには，パッケージングする細胞のプレート数を増やして，十分量のCas9/Nickase ウイルスを得られるようにして下さい。

Q2.1 種類の標的配列に対し，何種類の gRNAを設計すれば良いですか？

A2.作製したgRNAの切断効率の予測はできないため，最適な結果を得るために，2種類以上の gRNAコンストラクトの作製をお勧めします。

Q3.Cas9/Nickase 安定発現細胞株を樹立し，gRNA をパッケージングさせたウイルス粒子を作製し標的細胞に感染させましたが，活性がありません。

A3.以下の原因が考えられます。1）標的細胞での形質導入効率が低かった可能性があります。特定の細胞（初代細胞，幹細胞，浮遊細胞など）においては，形質導入は必ずしも高効率ではありません。そのような場合は，30～50 の高い感染多重度（MOI）での感染や，Spin-Inoculation による強制的ウイルス感染をお勧めします。また T細胞などの細胞型では，効率的な形質導入のために，G0期から人工的に刺激を与える必要がある場合もあります。

2）gRNA のデザインにミスがあった可能性があります。設計上の規則に従って正確にオリゴ DNA を合成したかどうか再確認して下さい。

3）標的 DNA配列に変異の可能性があります。標的DNA配列に変異があった場合，gRNA 配列の認識に影響を与え，切断の失敗につながります。予め標的 DNA 配列の変異の存在を知ることは難しいですが，もし何度も切断が失敗するようであれば，他の gRNA 配列を使用するか，gRNA 設計前に標的ゲノム配列の検証が必要です。

4）アッセイ前の時間の長さに問題がある可能性があります。DNA標的の切断に際し，感染後最低でも 72 時間経過後にアッセイを始めることを推奨しています。しかし，場合によっては，十分な切断の効果を見るため，感染後 7～10日間待った方が良いこともあります。

製品の技術的なお問い合わせ

TEL : 03-5684-1620　　FAX : 03-5684-1775e-mail : [email protected]

フナコシテクニカルサポート（試薬担当）

レンチウイルスやレトロウイルスのポリエチレングリコール（PEG）沈殿による濃縮を簡便に行える試薬PEG-it●ほとんどのレンチウイルスまたはレトロウイルスを 10～100 倍に濃縮可能です。●本製品 100ml で，400ml のウイルス産生細胞の培養上清からレンチウイルスを濃縮できます。

Checkitout!� ［メーカー：SBI］


品　　名メーカー商品コード包装�/ 価格（￥）

Virus�Precipitation�Solution,�PEG-itSBI LV810A-1 100ml/ 54,000 SBI681010SBI LV825A-1 250ml/ 117,000 SBI682510

Ｃａｓ９レンチウイルス


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Lentiviral CRISPR / Cas9 Systemの FAQ フナコシニュース 2017 年 6 月 15 日号（No.636）funakoshi news


受　託

最適デザインの gRNA と Cas9 を組み込んだレンチウイルス発現ベクターtransEDIT CRISPR-Cas9 Lentiviral Reagents


特　長�●�レンチウイルスベクターに，ヒト／マウス／ラット遺伝子をターゲットにしたgRNAをクローニングします。●�transOMIC 独自のアルゴリズムにより最適なgRNA配列をデザインし，オフターゲットを最低限に抑えます。●�上位 3種類の gRNAをクローニングしたレンチベクターを納品します。納品形態はグリセロールストックまたはウイルス粒子をお選びいただけます。

●�ネガティブコントロールとして，ノンターゲティングベクターが含まれます。

ベクターの種類� ゲノム編集用ベクターの実験例�

■ターゲットDNA切断の機能評価

MemoSurveyor Assay によるゲノム切断効率の測定ターゲティングの目安として，Surveyor�Assay で求められる「挿入欠失（indel）頻度」を使用できます（Guschin�D.�Y.,�et.�al.,�2010）。PCR で標的遺伝子を増幅すると，遺伝子対が増幅されます。CRISPR/Cas9 による変異は，染色体間の塩基配列の相違となって現れるため，遺伝子対それぞれから生じる増幅産物は，配列が異なる場所にバルジを生じます。PCR産物をヌクレアーゼ消化し，バイオアナライザーやアガロースゲル電気泳動で分析すると，挿入欠失の起こった細胞の割合を推定することができます。

Surveyor�Assay により，本製品を用いた挿入欠失頻度の分析を行った。（A）�Cas9 を恒常的に発現しているHEK293T 細胞に，DYRK1A と Irak4 を標的とした

gRNAを導入した。（B）�HEK293T 細胞に，TP53 を標的とした All-in-one ベクター（gRNA＋Cas9）を導

入した。図中の＊は予想されるフラグメントサイズで，gRNA を加えた場合に挿入欠失頻度が高まり検出されることが，Surveyor�Assay により分かる。

（1）All-in-one�vector：・gRNAと Cas9 が 1つのベクターから発現します。・単一マーカーで選択可能です。

（2）Co-selectionn（two-vector�system）：・Cas9とgRNAの発現を，それぞれ別のベクターで行います。・系に合わせた最適化やCas9 の選択も可能です。

BlastR

ZsGhCMV

PuroRgRNA EFS

tRFP

3’LTRCas9P2A

CMV─LTR U6

BlastR

ZsG

PuroRgRNA EFS

tRFP

3’LTRCMV─LTR U6

RNA�plus�Cas9�expression�vectors（pCLIP-All）

gRNA�expression�vectors（pCLIP-gRNA）

Cas9�expression�vectors�（pCLIP-Cas9�Nuclease,�pCLIP-Cas9�Nickase）

ご注文方法／価格�

お問い合わせはこちらまで！

Tel. 03-5684-1645　　Fax 03-5684-6539e-mail : [email protected]

受託・特注品担当

詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。※transOMIC 社 Web にアクセスし，目的遺伝子・プロモーター・レポーター・希望納品形態などを確認の上，専用の注文書に必要事項をご記入下さい。詳細はフナコシWeb（Webページ番号：63308）をご覧頂くか，当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。

［メーカー：TOT］

ノックアウト


Ｃａｓ9レンチベクター


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お問い合わせ先：〈受託〉TEL：03-5684-1645 ／ FAX：03-5684-6539 ／ e-mail：[email protected]

様々な CRISPR/Cas9 ゲノム編集システムと強力な組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）技術を組み合わせ，最先端の in vivo のアプリケーションに適応できるゲノム編集システムです。SaCas9は，広く使用されているSpCas9よりもサイズが小さいながらSpCas9と同様の効率を持ち，rAAVベクターへの挿入が可能です。※本製品に，ウイルス粒子を産生するためのパッケージングベクターは含まれていません。※相同組換えによるノックアウト／ノックインには，別途HRドナーベクターが必要です。詳細はp.18～19をご覧下さい。

NEW

in vivo で効率的に SaCas9 を導入する組換え AAV ベクターAAV-Cas9 SmartNuclease System



linearized all-in-one SmartNuclease AAV Plasmid

EF1a-hsaCas9-U6-gRNA（SA） NEW

SaCas9 と gRNAを一つのベクターで発現できます。

メーカー商品コード包装価格（￥）

SBI998305 SBI CASAAV100PA-1 1�kit 131,000


MemoAAV による Cas9 導入における問題点と SaCas9 の発見AAVは分裂・非分裂細胞の両方に遺伝子を導入し，長期間発現させる能力があるため，組換え体 AAV（rAAV）は遺伝子治療やゲノム工学研究におけるベクターとして頻繁に使用されます。しかし，rAAV によるin�vivo における遺伝子導入を行う際には，最も広く使用される Cas9であるStreptococcus�pyogenes�Cas9�gene（SpCas9）のサイズが問題となっていました。この問題を克服するために，Ran らは，よりサイズの小さい Cas9 遺伝子オーソログの特性を解析し，Staphylococcus�aureus 由来の Cas9（SaCas9）を発見しました。SaCas9 はサイズが SpCas9 より 1�kb 程度短いにも関わらず，SpCas9 と同様の効率を持ち，rAAV ベクターへの挿入が可能です。※SaCas9 は gRNAデザインが異なります。

■参考文献Ran�F.�A.,�et�al.,�Nature,�520:�186～191�（2015）．

ワンステップで rAAV 粒子を濃縮する試薬AAVanced Concentration Reagent・�ウイルス産生細胞の培養上清を回収し，遠心（1,500×g）するだけで rAAVを濃縮できます。・�従来の rAAV 粒子の濃縮方法とは異なり，細胞の溶解および CsCl密度勾配超遠心，クロマトグラフィー，またはアフィニティーマトリックスカラムへの結合などは不要です。・�形質導入する細胞への毒性はありません。

品名メーカー商品コード包装 / 価格（￥）

AAVanced Concentration ReagentSBI011000 SBI AAV100A-1 100�ml�/ 75,000SBI011100 SBI AAV110A-1 250�ml�/ 150,000

本製品を用いて濃縮した AAV-2（ITR-PGK-GFP-ITR）1.5�μl を 6 週齢 C57 マウスの海馬および中脳に定位注射した。3週間後マウスを PFAで灌流固定し，40�μmの脳切片を作成してGFPの蛍光を観察した。

Check�it�out! ［メーカー：SBI］


SaCas9 と gRNAを別々に導入するシステム AAV-Cas9 Two-vector System

EF1a-hsaCas9 SmartNuclease AAV Plasmid NEW EF1-RFP-U6-gRNA（SA） NEW

EF1α�プロモーターに連結された単量体の RFP マーカーが組み込まれており，赤色蛍光シグナルにより感染効率を確認できます。

メーカー商品コード包装価格（￥）メーカー商品コード包装価格（￥）

SBI998304 SBI CASAAV200PA-1 10�μg 112,000 SBI CASAAV300PA-1 1�kit 112,000 SBI998303

ＡＡＶベクター


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タンパク質コード領域およびタンパク質非コード領域を標的とした，ノックアウトに最適なベクターです。CRISPR/Cas9 と組み合わせて使用します。

ノックアウト用ドナーベクターPrecisionX HR Knock-out Targeting Vector


特　長�●�MCS1/MCS2 に CRISPR/Cas9 の切断サイトの両端の相同配列をそれぞれクローニングして使用します。●�選択マーカーにより，ノックアウト（相同組換え）を起こした細胞株を選択できます。●�インスレーター配列により，ホストゲノムのクロマチン環境に依存せずに，選択マーカーカセット領域が安定的に発現します。●�選択マーカーを含むカセットは，Cre リコンビナーゼを一過性発現させることで除去できます。※Cre リコンビナーゼについては，p.11 をご覧下さい。

ノックアウト

LoxP Sites Insulator SequencesMCS Multiple Cloning Sites

Basic KO HR Targeting Vector（RFP＋Puro） KO HR Targeting Vector（GFP＋Puro＋TK）EcoRI,SacI,KpnI,NruI,NsiI,BglII

XbaI,NotI

BamHI,SphI

EF1 MCS2MCS1 RFP-T2A-Puro-PolyA

5767 bp

AmpR Replication

SpeI,BsrGI,BsaI BbsI,MluI,NotI,SalI,AgeI

EF1 MCS2MCS1 GFP-T2A-Puro-P2A-TK-PolyA

6903 bp

KanR Replication

メーカー商品コード包装価格（￥）メーカー商品コード包装価格（￥） SBI998583

SBI HR110PA-1 10�μg 153,000 SBI HR210PA-1 10�μg 172,000 SBI998570

KO HR Targeting Vector（GFP＋Puro） KO HR Targeting Vector（RFP＋Hygro）

GFP-T2A-Puro-PolyA

EcoRI,SacI,KpnI,NruI,NsiI,BglII

XbaI,NotI

BamHI,SaI,SphI

EF1 MCS2MCS1

5840 bp

AmpR Replication

SacI,KpnI,NruI,NsiI,BglII

XbaI,NotIBamHI,SalI,SphI

EF1 MCS2MCS1

6193 bp

AmpR Replication

RFP-T2A-Hygro-PolyA



3’MCS の外に PGK-hsvTK カセットが挿入されたベクターです。ネガティブセレクションにより，相同組換え以外でドナープラスミドがゲノムに導入された細胞を排除できます。

KO HR Targeting Vector（GFP＋Puro＋TK） KO HR Targeting Vector（RFP＋Hygro＋TK）

BsrGI,Bsal Bbsl,Mlul,Notl,Sall

EF1 PGKMCS2 hsvTKMCS1 GFP-T2A-Puro-PolyA

7402 bp

KanR Replication

BsrGI,Bsal Mlul,Notl,Sall

EF1 PGKMCS2MCS1 RFP-T2A-Hygro-PolyA

7744 bp

KanR Replication

hsvTK



KO HR Targeting Vector（Blasticidin＋TK）

BsrGI,Bsal Bbsl,Mlul,Notl,Sall

EF1 PGKMCS1 Blasticidin-PolyA

6385 bp

KanR Replication

hsvTKMCS2


SBI HR720PA-1 10�μg 172,000 SBI998320

ネガティブセレクションHRベクター�

デュアルマーカーHRベクター�


ドナーベクター


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GFP-PolyA ベクター

フレームシフトを起こさずに，GFP-PolyA を目的遺伝子の 3’ 末端に連結させるベクターです。

EcoRI

EF1

BamHI,Sall

7672 bp

MCSRFP-T2A-Puro-PolyAGFP-PolyA

Xbal,Notl

ReplicationAmpR

BamHI,SphlXbal,Notl

Clal,Nhel,Xhol,BstBI

GFP-PolyA EF1 MCSRFP-T2A-Hygro-PolyA

8098 bpReplicationAmpR


SBI HR120PA-1 10 μg 153,000 SBI HR220PA-1 10 μg 153,000 SBI998494

T2A-GFP-PolyA ベクター

T2A-GFP-PolyA を目的遺伝子の 3’ 末端に連結させるベクターです。GFP の発現は，バイシストロニック発現用配列 T2A により制御されるため，目的遺伝子の機能に影響を及ぼす可能性がある際に有用です。

EcoRI

EF1

BamHI,Sphl

MCSRFP-T2A-Puro-PolyAT2A-GFP-PolyA



SBI HR130PA-1 10 μg 153,000 SBI998581

タンパク質コード領域およびタンパク質非コード領域を標的とした，目的遺伝子／GFPタグのノックイン用ベクターです。CRISPR/Cas9 と組み合わせて使用します。

ノックイン・GFP タグ付け用ドナーベクターPrecisionX HR Tagging Targeting Vector


特　長

● 相同組換えにより，任意の場所に目的遺伝子あるいは GFP タグを組み込むためのターゲティングベクターです。● 選択マーカーを含むカセットは，Cre リコンビナーゼを一過性発現させることで除去できます。

※Cre リコンビナーゼについては，p.11 をご覧下さい。

● 細胞内での目的遺伝子産物の局在や動態の解析に最適です。● 選択マーカーにより，相同組換えを起こした細胞株を選択できます。

● 目的遺伝子をゲノムに組み込むためのターゲッティングベクターです。

● 発現カセットを任意にカスタマイズ可能です。

KI HR Targeting VectorEcoRI,Sacl,Kpnl,Nrul,Nsil,Bglll

BstBI,Sacll

BamHI,Sall,Sphl,Hindlll

XbaI,Notl

Replication3856 bp

MCS MCSPolyA

AmpR


SBI HR100PA-1 10 μg 140,000 SBI998584LoxP Sites Insulator SequencesMCS Multiple Cloning Sites

ノックイン

遺伝子ノックイン用ドナーベクター

GFPタグベクター

GFP-T2A-Luciferase-PolyA ベクター

フレームシフトを起こさずに，GFP-T2A-Luciferase を目的遺伝子の 3’ 末端に連結させるベクターです。

GFP-T2A-Luci-PolyA

EcoRI

EF1

BamHI,Sall

MCSRFP-T2A-Puro-PolyA



SBI998580 SBI HR150PA-1 10 μg 153,000

GFP＋ルシフェラーゼタグベクター

IRES-GFP-PolyA ベクター

IRES-GFP-PolyA を目的遺伝子の 3’ 末端に連結させるベクターです。GFP の発現は IRES により制御されるため，目的遺伝子中にストップコドンが存在していたり，目的遺伝子がインフレームに存在していても，その発現に影響を及ぼしません。miRNA，lincRNA といったタンパク質非コード遺伝子の発現のモニタリングに最適です。

EcoRI,Sacl,Nrul,Nsil

EF1

Xbal

IRES-GFP-PolyA

7565 bp

BamHI,Sphl

MCSRFP-T2A-Puro-PolyA

AmpR Replication


SBI HR180PA-1 10 μg 153,000 SBI998579

IRES-GFP共発現ベクター



17



CRISPR/Cas9 を併用し，ゲノムの特定箇所の修正や，変異の導入を行うための相同組換え用ドナーベクターです。導入したセレクションマーカーカセットは，PiggyBac Transposase により痕跡を残さずに除去できます。

組み込んだ配列を痕跡を残さず除去できますPiggyBac HR Vector


PiggyBac HR Vector（GFP＋Puro＋TK）

Nhel, Swal, Notl, Bsal BspQI, BamHI, Spel, EcoRI

MCS1

MCS Multiple Cloning Sites PiggyBac ITRs Insulator Sequences

MCS2

PB5' ITR

PB3' ITR

AmpR

#PBHR100A-17,925 bp

Replication

EF1 GFP-2A-Puro-2A-hTK-polyA


SBI998637 SBI PBHR100A-1 10 μg 202,000

Excision only PiggyBac Transposase Expression Vector

除去用 Smal(269)

Excision onlyPiggyBacTransposase

Excision OnlyPiggyBacTransposaseExpression Vector

(6964 bp)

SV40poly-A

SV40 late16s Intron

Sad(2000)Hindlll

(4347)

CMVPromoter

メーカー商品コード包装価格（￥） SBI998509

SBI PB220PA-1 10 μg 73,000 SBI998508

■Transposase 発現ベクター■PiggyBac HR Vector

※Transposase 発現ベクターは，使い切りの製品です。

ご注文の際には，専用の使用者確約書が必要です。Web に掲載の使用者確約書をご確認いただき，必要事項をご記入の上，販売店担当者にお渡し下さい。

●！ご購入時のご注意

PiggyBac システムの原理1. 目的 cDNA 配列などを挿入した PiggyBac Transposon Vector と，切り出し用 Transposase 発現

ベクター（Super PiggyBac Transposase Expression Vector，#PB210PA-1，詳細は Web をご覧下さい。）を宿主細胞にコトランスフェクションする。

2. Super PiggyBac Transposase Expression Vector から発現した PiggyBac Transposase により，PiggyBac Transposon Vector 中の両端に存在するトランスポゾン特異性末端逆位配列（PiggyBac Terminal Repeat）の部分で配列が切り出される。

3. 切り出された配列が，宿主細胞ゲノム中の TTAA 部位に組み込まれ，安定発現細胞株が樹立される。4. 安定発現細胞株に除去用 Transposase 発現ベクター（Excision only PiggyBac Transposase Ex-

pression Vector，#PB220PA-1）のみを再度トランスフェクションすると，発現した Transposaseにより，組み込んだ目的配列が痕跡を残さずに除去される。

切り出し

組み込み

ITR ITR

ITR ITR

ITR ITR

ITR ITR

Super PiggyBacTransposase

痕跡を残さずに除去

PiggyBacTransposon

Excision onlyPiggyBacTransposase再切り出し

ゲノムDNA TTAA 配列

トランスポゾンによるゲノムへの組み込み・除去が可能な発現システムPiggyBac Transposon Vector System・ PiggyBac は，トランスポゾンを用いて，非ウイルス的に目的 cDNA・miRNA・shRNA 配列を宿主細胞のゲノムに

組み込み，安定発現細胞株を樹立することができるシステムです。・ゲノムに組み込んだ目的配列は，Excision only PiggyBac Transposase（#PB220PA-1）を用いて痕跡を残さずに除去できます。・ゲノムへの組み込み（下記「PiggyBac システムの原理」の手順 1.～3.）には，目的配列を発現させるための PiggyBac vector の他に，別途切

り出し用 Transposase Vector（#PB210PA-1）が必要です。製品ラインナップは，Web をご覧下さい。


Check it out! ［メーカー：SBI］

特　長

● ホモロジーアームに任意の変異を導入し，相同組換えを起こすことで，特定の箇所への点変異の導入や修正などが可能となります。● 選択マーカー（Puro 耐性および蛍光（RFP または GFP））により，相同組換えを起こした細胞株を選択できます。● ホストゲノムに導入した選択マーカーは，Transposase 発現ベクターを発現させることにより，ほとんど痕跡を残さずに除去す

ることができます。マーカーの除去の際にはチミジンキナーゼを利用したセレクションが可能です。※ゲノムに導入した目的遺伝子の除去には，別売品の Excision-only Super PiggyBac Transposase Expression Vector（#PB220PA-1）が必要です。




18


直線化した gRNA ベクターまたは Cas9 All-in-one ベクターに，一度に複数の gRNA をクローニングできるキットです。最大 8 つの gRNA をクローニングできます。

複数の gRNA を同時発現させるベクターの構築キットPrecisionX Multiplex gRNA Cloning Kit


特　長�

参考文献�

●�1 回のトランスフェクションで複数遺伝子をノックアウトするコンストラクトを作製できる，ユニークなキットです。

●�必要な gRNA量は最小限で済みます。●�ほとんどの gRNAベクターに対応します。

Tsui-Ting�Ho,�et�al.,�Nucleic�Acids�Research，�（2014）.

操作方法概略�

Single tube reactionFusion mastermix5 min.room temperature10 min.on iceTransform to clone

プライマー＃1

スキャフォールド

プライマー＃2

線状化 gRNA ベクターまたは

Cas9 All-in-one ベクター

gRNA2gRNA1H1

U6

オーバーラップ PCR

gRNA1H1 scaffold gRNA2U6 scaffold

scaffold

scaffold scaffoldU6

gRNA2gRNA1H1 scaffold scaffoldU6

デュアル gRNA ベクター


PrecisionX Multiplex gRNA Cloning KitSBI CAS9-GRNA-KIT 10 tests 1�kit�/ 65,000 SBI906170

使用例�

CMV-GFP-T2A-RFP 遺伝子カセットを導入した細胞に，RFP 配列を標的とする２種類のgRNAを発現するCas9�All-in-one ベクターを導入した。RFP配列に対する PCRを行った結果，ベクターを導入した細胞では，切断が行われたことで短い断片が増幅された。RFPの蛍光を調べた結果，ベクターを導入した細胞では，RFPの蛍光が低減した。

CMV GFP RFP

458bp

711bp

1kb

500bp400bp300bp200bp100bp

T2AgRNA1 gRNA7

M

gRNA1とgRNA7によるRFPの2カ所切断

1 2 3

1.CMV-hsp-Cas9-H1-RFP gRNA1-U6-RFP gRNA72.Untransfected GFP-RFP reporter cells3.PCR negative control

Control Dual RFP gRNA

■Multiplex gRNA Cloning Kit と Cas9 発現 All-in-one ベクターとのセット（10 reactions）［メーカー：SBI］


EF1-T7-hspCas9-H1-gRNA野生型

（hspCas9�wt）

EF1 なし CAS700A-KIT

1�kit

187,000 SBI137002

CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA CAG なし CAS720A-KIT 187,000 SBI137202

CMV-T7-hspCas9-H1-gRNA CMV なし CAS740A-KIT 187,000 SBI137402

EF1-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA変異型�

（hspCas9，Nickase）

EF1 なし CAS750A-KIT

1�kit

187,000 SBI137502

CAG-T7-hspCas9-nickase--H1-gRNA CAG なし CAS770A-KIT 187,000 SBI137702

CMV-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA CMV なし CAS790A-KIT 187,000 SBI137902

※Cas9�All-in-one ベクターについては，p.6～7をご覧下さい。

ｇＲＮＡ


19



CRISPR/Cas9 や gRNAの細胞導入用に開発された，トランスフェクション試薬です。

サンプルキャンペーン

CRISPR/Cas9 研究に有用なトランスフェクション試薬


導入分子 Cas9 や gRNA を発現するプラスミド DNA/mRNA

導入手法 Magnetofection

用　途初代細胞やトランスフェクションが困難な細胞

導入分子ウイルス粒子

導入手法 Magnetofection

用　途初代細胞やトランスフェクションが困難な細胞，非許容細胞

※1 回あたりの使用量は条件によって異なります。使用回数は 24 ウェルプレートを用いた場合の目安です。導入にはマグネットプレートが必要です。Starting Kit 以外の製品には含まれておりませんので，別途ご用意下さい。

品　　名メーカー商品コード包装 /

通常　　価格（￥）

キャンペーン価格（￥）

ViroMag CRISPR OZB VMC50200 約 30 transfections 200 μl / 46,000 32,200 OZB150200OZB VMC51000 約160 transfections 1 ml / 192,000 134,400 OZB151000OZB KVC50100 Starting Kit 1 kit / 139,000 97,300 OZB150100#KVC50100 は，ViroMag CRISPR 100 μl とマグネットプレート（#MF-10000）のセットです。




PolyMag CRISPR OZB240200 OZB PNC40200 約200 transfections 200 μl / 57,000 39,900OZB241000 OZB PNC41000 約1,000 transfections 1 ml / 250,000 175,000OZB240100 OZB KPC40100 Starting Kit 1 kit / 142,000 99,400

#KPC40100 は，PolyMag CRISPR 100 μl とマグネットプレート（#MF-10000）のセットです。

OZB社 magnetofection 試薬 30％OFF キャンペーン2017 年 6 月 1 日～2017 年 8 月 31 日

プラスミドDNA導入 PolyMag CRISPR ウイルス粒子導入 ViroMag CRISPR

NIH-3t3，HeLa，MDCK 細胞をそれぞれ 24 ウェルプレートに播種し，PolyMag CRISPR を用いて GFP-Cas9 発現プラスミドと RFP 発現プラスミドをトランスフェクションした。37℃ で一晩インキュベーションし，導入 24 時間後に GFP と RFP の発現を蛍光顕微鏡を用いて観察した。

各細胞を 24 ウェルプレートに播種し，完全培地で 50～70％コンフルエントになるよう培養した。レンチウイルスを加え，37℃ で一晩インキュベートした。24 時間後，GFP と RFP の発現を観察した。

Magnetofection シリーズ用マグネットプレート

#MF-10000 #MF-10096 #MF14000

797 検索Web ページ番号

マグネットプレートの使用方法と貸出デモについては




Super Magnetic PlateOZB MF-10000 貸出しOK 1 piece / 98,000 68,600 OZB210010様々なプレート／ディッシュ／フラスコに使用できるタイプ

Magnetic PlateOZB MF-10096 1 piece / 89,000 62,300 OZB10096096 ウェルプレートに適したタイプ

Mega Magnetic PlateOZB MF14000 1 piece / 201,000 140,700 OZB214000100 mm ディッシュ 4 枚を一度に使用可能なタイプ

Check it out! ［メーカー：OZB］

導入分子 Cas9 タンパク質，Cas9/gRNA RNP 複合体

導入手法 Lipofection


Pro-DeliverIN CRISPR OZB PIC60100 100 μl / 47,000 OZB160100OZB PIC60500 500 μl / 163,000 OZB160500

タンパク質導入 Pro-DeliverIN CRISPR

MEF 細胞を 24 ウェルプレートに播種し，Pro-DeliverIN CRISPR を用いて組換え体Phycoerythrin をトランスフェクションした。導入 24 時間後に細胞を蛍光顕微鏡で観察した。

マークで示した製品は，小包装のサンプル品をご用意しています。ご希望の方は，当社テクニカルサポート（試薬担当）までお問い合わせ下さい。

サンプル品あります！


トランスフェクション


20



神経細胞，幹細胞，免疫細胞，線維芽細胞など，特にトランスフェクションが困難な細胞にも高い効率でmRNAを導入可能です。CRISPR/Cas9 の遺伝子編集，iPS 細胞の作製，幹細胞分化および免疫療法研究に最適です。

使用例�

本製品または他社製品を用いて各細胞に eGFP�mRNAまたは eGFP をコードするプラスミドDNAをトランスフェクションし，24 時間後にフローサイトメトリーにより導入効率を評価した。

■本製品■他社製品

本製品または他社製品を用いて，各細胞に eGFP�mRNAをトランスフェクションし，48時間後に明視野および蛍光顕微鏡により解析した。

本製品

初代ラット皮質ニューロン

ヒトHepG2細胞

マウス幹細胞

他社製品

各種細胞へのトランスフェクション効率�

分類細胞名トランスフェクション効率

Brain�cellsU-87MG ＞90％

Cortex�neurons 40～60％

Epithelial�cellsCaco-2 ＞90％

MCF-7 ＞90％

Fibroblasts

MDCK 40～60％

BJ ＞90％

Primary�fibroblasts 70～90％

IMR-90 ＞90％

CPRE2 ＞90％

MEF 60～80％

Hepatocytes Hep�G2 ＞90％

LymphocytesJurkat 40～60％

K562 40～60％

Macrophages Macrophages 50～70％

MonocytesPrimary�monocytes 10～30％

THP-1 80～90％

Stem�cellshMSC ＞90％

mES 50～70％

©樹庵じゅあん

フナコシホームページで各製品の詳細をご覧いただけます。

検索Web ページ番号

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Webページ番号について

品名メーカー商品コード包装 / 価格（￥）

jetMESSENGERPPU 150-01 0.1 ml 1�kit�/ 16,000 PPU150010PPU 150-07 0.75 ml 1�kit�/ 88,000 PPU150070PPU 150-15 1.5 ml 1�kit�/ 148,000 PPU150150

トランスフェクションが困難な細胞へのmRNA導入試薬jetMESSENGER

トランスフェクション


21



細胞内における Cas9 mRNA の発現を確認するための RT-PCR 用プライマーのセットです。

Cas9発現をmRNAレベルで確認Cas9 増幅プライマーセット


●増幅サイズの異なる2種類のプライマーセットが付属します。●wtCas9，NickaseCas9，doublemutantCas9 のいずれも検出可能です。

●SBI 社の Cas9SmartNuclease システムにより発現させたCas9 や，Dr.FengZhang 研究室のベクターから発現させたCas9 の検出に使用できます。

219bp122bp

Cas9 発現細胞とコントロール細胞由来の cDNAを用いて PCR を行い，増幅産物を電気泳動した。Cas9 発現細胞由来試料の Ct 値はおよそ 17 であり，ネガティブコントロールではバンドが検出されなかった。

使用例特　長


Cas9 RT-PCR Primer SetSBI CAS9-PR-1 1kit/ 18,000 SBI998324各プライマー 50µl（5µM），50回分

抗 Cas9 抗体 53091 検索Web ページ番号

Epigentek Group Inc. はエピジェネティクス研究のリーディングカンパニーです。

（本拠地：アメリカ）

使用文献FullerKK.,et.al.,EukaryotCell.,14:1073～1080（2015）.［PMID：26318395］

ChewWL.,et.al.,NatMethods.,13:868～874（2016）.［PMID：27595405］

WangD.,et.al.,HumGeneTher.,26:432～442（2015）.［PMID：26086867］

WB

ELISA ELISA

品　名抗原種免疫動物（クローン）標識適用メーカー商品コード包　装価格（￥）

Anti-CRISPR/Cas9クラス：IgG，性状：PAPu

E. coli Mouse-Mono （7A9）

－ ELISA, IF, IP, West

EPG A-9000-010 10 μg 13,000 EPG090000EPG A-9000-050 50 μg 34,000 EPG090001EPG A-9000-100 100 μg 60,000 EPG090002

抗 CRISPR/Cas9 モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット像A：非導入 293細胞，B：Cas9 導入 293細胞

※略号：Mono:Monoclonal,Poly:Polyclonal,AAPu:AntigenAffinityPurified,PAPu:ProteinA/GAffinityPurified,APu:AffinityPurified,Pu:Purified,Dot:DotBlotting,EMSA:Electro-phoreticMobilityShiftAssay,FCM:FlowCytometry,IC:Immunocytochemistry,IF:Immunofluorescence,IHC:Immunohistochemistry,IP:Immunoprecipitation,Neut:Neutral-ization,West:WesternBlotting

抗体をお探しならフナコシで！http://www.funakoshi.co.jp/フナコシWebのトップページから，

簡単に抗体検索ができるようになりました！


Ｃａｓ9プライマー・抗体


22



GENETEX, Inc. は幅広い研究分野の論文で使用実績のある信頼性の高い製品を多数取り扱っています。約 50,000 点を超える一次抗体を取り扱っており，小包装サイズが充実しています。

（本拠地：台湾）

使用文献Guo J., et. al., Protein Cell, 8: 379～393（2017）.

［PMID：28116670］WB

品　名抗原種免疫動物（クローン）標識適用メーカー商品コード包　装通常価格

（￥）キャンペーン価格（￥）

Anti-Cas9クラス：IgG，性状：PAPu，交差性：Bacteria

Mouse-Mono （7A9）

－ IC, IF, IP, West

GNT GTX53807 25 μg 32,000 25,600 GNT940415

20％OFF キャンペーン　　　～2017 年 7 月 14 日


Novus biologicals, LLC は，オートファジー，低酸素，がん研究をはじめ，幅広い研究分野の抗体を取り扱っています。製品を使用したユーザーのレビューがメーカーホームページで閲覧できます。

（本拠地：アメリカ）

使用文献Choi JG., et al., Gene Ther., 23: 627～633 （2016）.

［PMID：27052803］

El Fatimy R., et al., Mol Ther., 25: 368～378 （2017）.［PMID：28153089］

Chu VT., et al., BMC Biotechnol., 16: 4 （2016）.［PMID：26772810］

Chew W. et al., Nat. Methods, 13: 868～74 （2016）.［PMID：27595405］

Chiou SH., et al., Genes Dev., 29: 1576～1585 （2015）.［PMID：26178787］

IC IF

WB IC IHCIF WB

WB


Anti-Cas9クラス：IgG，性状：PAPu，交差性：Bacteria

Mouse-Mono （7A9-3A3）

－ IC, IF, IHC, IP, West

NOV NBP2-36440SS 0.025 ml 29,000 NOV236441NOV NBP2-36440 0.1 ml 68,000 NOV736440

Anti-CRISPR-Cas9クラス：IgG，性状：PAPu，交差性：Bacteria

Mouse-Mono （6G12）

－ ChIP, IC, IF, IP, West

NOV NBP2-52398SS 0.025 ml 29,000 NOV721047NOV NBP2-52398 0.1 ml 66,000 NOV721060

Anti-CRISPR-Cas9 Packクラス：IgG，性状：PAPu，交差性：Bacteria※#NBP2-36440SS（0.025 ml，1.0 mg/ml）と #NBP2-52398SS（0.025 ml，1.0 mg/ml）が 1 vial ずつ含まれるセットです。

Mouse-Mono － NOV NBP2-52986 1 set 49,000

NOV668108

■関連製品：抗 Cpf1 ウサギポリクローナル抗体※キャンペーン対象外です。


Anti-CPF1クラス：IgG，性状：AAPu

Rabbit-Poly － IC, IF, West GNT GTX133296 25 μl 23,000 GNT935571

抗Cas9 抗体（#GTX53807）を用いた免疫沈降結果試料：FLAG タグ付加 Cas9 発現 HEK293T 細胞ライセートCas9 Sup：抗 Cas9 抗体で反応後，プロテイン A/G（1：1）セファロースビーズとインキュベートCas9 X-link：抗 Cas9 抗体で反応後，プロテイン A/G（1：1）セファロースビーズとクロスリンク★：IgG 重鎖

★ ★

Ｃａｓ9プライマー・抗体


23





Cas9 タンパク質を長期間安定に発現するヒトおよびマウスの細胞株です。gRNAを導入するだけで，CRISPR/Cas9 システムによるゲノム編集が可能です。

gRNA を入れるだけで CRISPR/Cas9 のゲノム編集が可能

Cas9 安定発現細胞株

CRISPR/Cas9 システムでの相同組換え効率を向上させます

L-755, 507

特　長�●�Tet-on システムにより Cas9 タンパク質の発現量を制御できる細胞と，定常発現する細胞があります。

※Tet-on発現誘導型の製品は，購入時にTetシステムライセンス確認・同意書の提出が必要です。

使用例�

Tet-on システムによるCas9 タンパク質の誘導（#CLHKCAS902）Doxycyclin の培地添加によって，任意のタイミングでCas9 タンパク質を発現誘導できる。

293T

Dox:

f-Cas9 ── 175 kd

Tubulin ─

－＋

■Tet-on 発現誘導型細胞

■定常発現細胞


Cas9 Stable Cell Line for CRISPR, induciblePRC210260 PRC CLHKCAS902 293T 1�vial�/ 300,000PRC210250 PRC CLHKCAS901 C2C12 1�vial�/ 300,000PRC210480 PRC CLHKCAS906 HeLa 1�vial�/ 300,000PRC210510 PRC CLHKCAS910 MCF-7 1�vial�/ 300,000PRC210550 PRC CLHKCAS913 MIA PaCa-2 1�vial�/ 300,000PRC210540 PRC CLHKCAS905 U2OS 1�vial�/ 300,000

GFP-Foxp3 and Cas9 Combo cell linePRC210360 PRC CLHKCOMBO1 293T 1�vial�/ 300,000


Cas9 Stable Cell Line for CRISPR, non-induciblePRC210490 PRC CLHKCAS907 293T 1�vial�/ 300,000PRC210390 PRC CLHKCAS904 3T3-L1 1�vial�/ 300,000PRC210380 PRC CLHKCAS903 NIH 3T3 1�vial�/ 300,000

ヒト iPS 細胞で，CRISPR/Cas9 による相同組換え修復効率を促進します。


L-755, 507RSD 2197/10 10�mg�/ 46,000 RSD021970RSD 2197/50 50�mg�/ 191,000 RSD121970β3-アドレナリンレセプターのパーシャルアゴニスト（EC50＝0.43�nM）。iPS 細胞において，CRISPR/Cas9 による相同組換え修復（HDR）効率を 2～3 倍（large�fragment）または最大 9倍（点変異の場合）に向上させる。化学式：C30H40N4O6S，M.W.：584.73，純度：＞98％，CAS�No.：159182-43-1

OH

OHO

HN

NH

NH

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O

O

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THE�FUNAKOSHI�INDEX

参考文献�

Pinder�J.,�et.�al.,Nuclear�domain�‘knock-in’�screen�for�the�evaluation�and�identification�of�small�molecule�enhancers�of�CRIS-PR-based�genome�editing.Nucleic�Acids�Res.,�43:�9379～9392�（2015）.［PMID：26429972］

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再生医療研究に有用な幹細胞／�iPS 細胞関連製品や三次元培養用製品の他，細胞培養実験に必須の汎用製品をまとめて紹介したカタログです。注目製品として細胞イメージング用の新規プローブもご紹介しています。

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再生医療研究　細胞培養カタログ


Ｃａｓ9発現細胞


24


受　託

安い・早い・高効率CRISPR/Cas9 による遺伝子改変マウス作製受託サービス


特　長� お客様のご要望に応じた工程での実施例�●�標的遺伝子に対するgRNA設計からCas9 発現ベクターの構築，受精卵へのインジェクションを行います。

●�産子の約 50％が変異個体であることが期待されます。●�ssDNAを用いた 80�bp までのノックインも承ります。●�相同組換え法よりも短時間で作製できます。●�ベクターの設計からマウス作製まで，トータルサービスのご提供が可能です。また，一部工程のみの実施も可能です。

作業概要（標準工程）�

■ES 細胞への導入ES 細胞を用いて，相同組換え法との組み合わせにより，2箇所の loxP 配列を挿入したコンディショナル・ポテンシャルの ES細胞クローンを取得しております。■受精卵へのインジェクションCas9 ベクターと一緒に ssOligoDNA を受精卵にインジェクションし，ポイントミューテーション（点変異）等をノックインしました。これまでに，数塩基欠失，1塩基欠失，1塩基置換などの変異アレルを持つマウスを得ることに成功しております。

1. Cas9 発現ベクターの作製

2. Cas9 発現ベクターを受精卵にインジェクション

変異が導入されている産子（ファウンダーマウス）をスクリーニングし，ダイレクトシーケンスによって変異体の検出を実施します。※解析の結果，ファウンダーマウスが得られなかった場合，3．の費用はご請求致しません。

3. ファウンダーマウスの同定

4. F1 ヘテロマウスの取得

標的遺伝子に対して gRNA を設計し，Cas9 ベクターに組み込むことで，その遺伝子配列を特異的に認識・切断できるCas9 発現ベクターを構築します。構築した Cas9 ベクターはin�vitro で切断活性評価を行います。ご要望に応じて，mRNA でのインジェクションも実施いたします。

ガイドRNA

市販 Cas9 ベクター

Cas9

既存のトランスジェニックマウス作製と同様の方法を用いて，Cas9 発現ベクターを受精卵にインジェクションします。ただし，受精卵インジェクションでは難しい設計の場合は，ES 細胞へのエレクトロポレーションという方法をとる場合もあります。※実施内容については，ご要望を踏まえてご提案させていただきます。

ファウンダーマウスのうち，目的通りの変異が導入されている個体を選択し，次世代（F1）マウスを作製します。ファウンダーマウスはモザイク（変異が導入された細胞とされていない細胞が混在している）なので，次世代マウスに生殖系列伝播した個体を作出し，かつ変異を特定する必要があります。この工程で作出される次世代マウスは，ヘテロ（＋／－）マウスです。※価格には Broad 研究所へのライセンス料を含みます。マウスの輸送費・微生物検査費は，別途申し受けます。

詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。［メーカー：TRG］

（株）トランスジェニックは，2015 年 4 月 21 日に米国 Broad 研究所から CRISPR/Cas9 に関する特許群（US8697359B1 他）の日本国内における非独占的実施権を取得しております。（株）トランスジェニックで受託作製した遺伝子組換えマウスは，お客様の機関内における研究目的での使用が認められています。※作成費用にはBroad 研究所へのライセンス料を含みます。

CRISPR/Cas9 のライセンス内容

約2ヶ月

4～5ヶ月

7～8ヶ月

オプション工程�

■自然交配による次世代マウスの作製ファウンダーマウスと野生型マウスとの自然交配により，次世代マウスを作製します。産子全頭について，ダイレクトシーケンスによる導入変異の解析をいたします。納期：約 3ヶ月※SPF 施設の飼育ラック 1棚を占有させ，1世代（3か月間）の飼育・繁殖を行います。産子については，8 週齢までの飼育とダイレクトシーケンスによる変異配列の解析を実施します。※1棚は 10 ケージを収納する規模です。交配・繁殖の進行に伴い，適宜，ケージ数を調整します。※妊娠出産に至らず産子が得られないときは，交配費用のみでの精算とさせていただきます。※上記の他，様々な技法（ノックイン，flox マウス作製など）についても，ご相談を承ります。


※標準工程 1. に含まれます。

構築したCas9ベクターの切断活性（ガイドRNAの特異性）の評価方法

作製した Cas9 発現ベクターの切断活性（gRNA の特異性）評価として，HEK293 細胞に Cas9 ベクターと標的配列で分断された GFP 発現ベクターをコトランスフェクションします。Cas9 による切断を受け，再構成されて発現する GFP をフローサイトメーターで検出し，活性を評価します。

Cas9 の標的配列

Cas9 により切断

Homology dependent repair によりGFPを再構成


受託サービス


25


受　託

ゲノム編集のエキスパートがあなたの研究をサポートCRISPR/Cas9 関連受託サービス

ご指定頂いたゲノム領域を標的とする CRISPR/Cas9・gRNA発現プラスミドやHRドナーベクターのデザインおよび作製を行う受託サービスです。


特　長�

SBI 社のゲノム編集実験のエキスパートがあなたの研究をお手伝いします。●�目的遺伝子のどこをターゲットにすべきか？●�gRNAをどうデザインすべきか？●�ノックアウト／ノックイン／タグ付け／ゲノム編集がしたいが，ホモロジーアームをどうデザインすべきか？

目的遺伝子（accession�number）やDNAシーケンス情報をお送りいただき，やりたい研究・欲しい情報をお伝え下さい。


詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。［メーカー：SBI］

まずはお気軽にご相談下さい！



10

Relative miR-21（fold） 1

0.1

0.01

0.001

0.0001

Vector

KO1

KO2

KO3

KO4

KO5

AGFP

+Cre

-Cre

Bright FieldB

カスタム gRNA およびカスタムHRドナーベクターを用いたHEK293細胞におけるmiR-21 遺伝子のノックアウト（A）�miR-21遺伝子の発現量をqPCRで測定したところ，gRNAを導入した細胞（KO1～

KO5）では遺伝子のノックアウトが確認された。（B）�GFP マーカーを除去するため，HR ドナーベクターの LoxP 領域で組換えを起こす

Cre リコンビナーゼで処理したところ，効率的に GFP マーカーが除去されていることが分かる。

カスタムCRISPR/Cas9・gRNA発現プラスミド作製サービス�

カスタムHRドナーベクター作製サービス�

ゲノム編集済み細胞株作製サービス�

特定の配列を標的とするgRNAのデザイン，発現プラスミドの作製を行うサービスです。●�SBI 社の SmartNuclease（p.6）または SmartNickase（p.7）ベクターにクローニングします。野生型／変異型 Cas9 からベクターをお選び下さい。

※変異型Cas9 については，p.7 をご覧下さい。

特定の配列を標的とするホモロジーアームのデザイン，およびHRドナーベクターを作製するサービスです。●�遺伝子のノックアウト，ノックイン，タギング，単一ヌクレオチド修飾に有用です。●�ホモロジーアームは，SBI 社のHRドナーベクター（p.16～17）に導入します。

特定の配列を標的として，カスタム作製したCas9 およびHRドナーベクターを用いて細胞株を作製する受託サービスです。●�遺伝子のノックアウト，ノックイン，タギング，単一ヌクレオチド修飾が可能です。●�改変された安定細胞株をお送りし，クローンの単離，特性評価はお客様に行って頂くDeliver�unscreened�cells サービスと，ご希望通りの修飾がなされた細胞株のスクリーニングを実施してお届けするDesired�modification サービスがあります。


受託サービス


26


連載企画

FRONTIERS Vol.11イノベーションで

科学を推進する

フロンティアーズ

https://www.systembio.com/

System Biosciences 社（以下，SBI 社）は，サンフランシスコ近郊，カリフォルニア州パロアルト市に本拠を置く，ゲノム工学，エクソソーム研究，レンチウイルスベクターなどに関わるユニークで革新的なツールと受託サービスを提供しているメーカーです。SBI 社は最先端技術を高品質な製品・サービスとしてお届けすることを使命としています。今回は，同社が特に注力している 3 分野について，簡単にご紹介します。

レンチウイルスベクター関連製品の幅広いラインナップSBI 社では各種プロモーターのレンチウイルス発現系をはじめ，簡便なウイルス濃縮試薬，ウイルスパッケージングキット，ウイルス力価測定キットなどの幅広いレンチウイルス関連製品および受託サービスも取り扱っており，10 余年にわたる豊富な経験で研究者の皆様をサポートします。

エクソソーム関連試薬のパイオニアエクソソームは，細胞から分泌される 30～200 nm の膜小胞で，血液，尿，羊水，腹水などの体液や細胞培養液中に存在し，細胞内の老廃物を排出する機能を担うことが知られていました。近年の研究から他にも様々な機能を持つことが明らかになってきました。SBI 社は 2010 年に簡便なエクソソーム濃縮試薬「Exo-Quick」をリリースして以来，エクソソーム関連試薬のパイオニアとしてエクソソーム検出・定量，エクソソーム中のバイオマーカー探索，エクソソーム工学に関わる製品・サービスを幅広く取り扱っており，エクソソーム研究を総合的にサポートします。

保存版エクソソーム特別号

（フナコシニュース2017 年 5 月 15 日号）

エクソソームの●回収・精製●検出・定量●探索●輸送・導入・標識●受託サービスをまとめてご紹介した保存版です。

A4版　32ページ

好評配布中！

※ご希望の方は，当社営業担当（Fax 03-5684-1634）までお申し込み下さい。

保存版　エクソソーム特別号

いち早くCRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集に注目SBI 社は 2013 年 4 月に CRISPR/Cas9 関連製品を製品としてリリースした最初のメーカーで，現在では世界中の多くの研究者の皆様に Cas9 SmartNuclease システム（p.6～7 参照）をご愛用いただいています。例えば米国 NIH では，SBI 社Cas9 SmartNuclease システムを用いてマウス接合子におけるダイレクト変異導入において 75％の変異導入に成功した実績があります。SBI 社では Cas9 タンパク質導入用製品（プラスミド，mRNA，組換え体タンパク質）の他，各種相同組換え用ドナーベクターや gRNA 作製キットを取り揃えており，ゲノム編集を利用した研究を総合的にサポートします。

エンドtoエンドの製品ラインナップ


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プロモーターと発現遺伝子の組み合わせなどの遺伝的特徴をゲノム部位特異的に導入できます。様々な目的遺伝子をゲノム上の同部位にノックインし，同じ遺伝的背景を持つアイソジェニック細胞株を作製できます。

同じ遺伝的背景を持つノックイン細胞株を作製できますPinPoint Targeted Integration System


特　長�●�ノックイン位置が異なることによる影響を排除できるため，より正確に遺伝子と表現型の関連性を解析できます。●�二段階反応で目的遺伝子をゲノムに組み込むシステムです。●�目的遺伝子発現カセットは PinPoint インテグラーゼを用いて標的ゲノムに部位特異的に導入します。

PinPoint�Site�Placement ベクターを用いて，ゲノム上に目的遺伝子の挿入サイト（PinPoint�Site）を指定します。［PinPoint-FC システム］PinPoint-FC�Placement�Vector と phiC31 インテグラーゼ発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし，phiC31 インテグラーゼにより，標的部位に PinPoint�Site を導入する。※phiC31 インテグラーゼ発現用ベクターについては，p.29 をご覧下さい。

①標的部位へ PinPoint Site を導入する

PinPoint ドナーベクターと PinPoint インテグラーゼ発現ベクターを細胞にトランスフェクションし，①で指定した Pin-Point�Site に目的遺伝子カセットを挿入する。

②PinPoint Site に目的遺伝子を導入する

［PinPoint-HR システム］CRISPR/Cas9 と PinPoint-HR�Placement�Vector を細胞にトランスフェクションし，相同組み換え修復（HDR）により切断した領域に PinPoint�Site を導入する。※CRISPR/Cas9 と gRNA を一つのプラスミドで発現する All-in-oneベクターについては，p.6～7をご覧下さい。

③ （オプション）Cre / LoxP 反応により遺伝子カセットを除去する


PinPoint-FC attP Placement VectorSBI998559 SBI PIN300A-1 10�μg�/ 115,000


PinPoint-HR attP Placement VectorSBI998565 SBI PIN400A-1 10�μg�/ 192,000

PinPoint-HR attP AAVS1 Placement VectorSBI998563 SBI PIN410A-1 10�μg�/ 192,000

相同組換えによりAAVS1 遺伝子に PinPoint�Site を導入するベクター。

LoxPLoxP

cHS4 cHS4FRT FRTFRT FRT

Selection Cassette

PGKPromoter

PGK

PinPointSite

PinPointSite

LoxP

LoxP LoxPFRT FRTPGK

PinPointSite

PinPointSite

PinPoint Donor Vector

PuroRPuroR

Gene Expression CassetteGene Expression

Cassette

ノックイン

ワークフローと製品ラインナップ� ベクターマップ�

CMV_Promoter

ColE1_Origin

SV40_pA

Amp

PinPointIntegrase

F1_ori

PinPointインテグラーゼ発現ベクター

ドナーベクター(# PIN200A-1)


alpha PinPoint Donor VectorSBI PIN500A-1 EF1 10�μg�/ 153,000 SBI998561pPP-EF1a-MCS-pA-attB-Puro-pA

PinPoint Donor VectorSBI PIN510A-1 CAG 10�μg�/ 153,000 SBI998554pPP-CAG-MCS-WPRE-pA-attB-Puro-pA

PinPoint Donor VectorSBI PIN520A-1 Empty 10�μg�/ 153,000 SBI998553pPP-MCS-WPRE-pA-attB-Puro-pA


PinPoint Integrase Expression PlasmidSBI PIN200A-1 10�μg�/ 111,000 SBI998560

PinPoint�Site を導入した HEK293 細胞に PinPoint�Integrase�Expression�Plasmid（#PIN200A-1）と PinPoint�Donor�Positive�Control�Vector（#PIN600A-1）をトランスフェクションした。Neomycin を添加して培養した後，GFPの発現を確認した。

Puromycin-Resistant HEK293T Coloniesafter Targeting with #PIN600A-1

GFP(10x)

GFP(40x)

ColE1Origin

phiC31attBKan/

NeoR

LoxP

SV40Promoter

PGKPromoter SV40poly-A

TKpoly-A

cHS4Insulator

cHS4Insulator

PinPointattP Site

FRT

FRT

ColE1Origin

KanR

CMVPromoter

bGHpoly-A

phiC31Integrase

インテグラーゼ発現ベクター

PinPoint-FC attPPlacementVector(# FC200PA-1)

(# PIN300A-1)

※詳細はp.29 をご覧下さい。

PinPoint Site Placement ベクター�

PinPoint インテグラーゼ発現用ベクター�

PinPoint ドナーベクター�


ゲノム工学


28


ウイルスを使わずに目的遺伝子をゲノムの pseudo-attP 配列に導入phiC31 Integrase Vector System


MemophiC31 インテグラーゼとはphiC31 インテグラーゼは，バクテリオファージ phiC31 ゲノム内にコードされる配列特異的セリンリコンビナーゼで，ファージゲノム内の attP siteと宿主バクテリアゲノム内の attB site の 2 つの 34 bp 配列（attachment site：att）間の組換えを触媒します。このインテグラーゼは，哺乳動物細胞を含む多くの細胞で効果的に機能することが知られ，どのようなサイズのドナーベクターにもシングルコピーとして結合することができ，コファクターを必要としません。導入遺伝子は，安定的に発現します。

pseudo-

attB

目的遺伝子目的遺伝子を組み込んだ

attB ドナーベクター

結合サイト

標的ゲノムphiC31 インテグラーゼ

目的遺伝子

attL attR

attP

phiC31 インテグラーゼ存在下で，attB を含むドナーベクターは，ネイティブ attP site と類似の配列をもつ pseudo-attP site を組換えることにより，目的遺伝子内に一方向で結合することができます。

特　長

● 非ウイルス性ベクターです。● 転写活性化部位にてシングルコピーで組換えを起こします。● 導入する遺伝子のサイズに制限がありません。

● トランスフェクションにより，容易に安定細胞株を樹立できます。

● 幹細胞や in vivo モデル動物にも適用可能です。

pFC-CMV-GFP-SV40-Neo

ポジティブコントロール用


SBI FC520A-1 10 μg 114,000 SBI998616

phiC31 Integrase Expression Plasmid


SBI998632 SBI FC200PA-1 10 μg 80,000

pFC-EF1-MCS-pA-PGK-RFP-T2A-Puro pFC-PGK-MCS-pA-EF1-GFP-T2A-Puro

デュアルプロモーターデュアルプロモーター


SBI FC550A-1 10 μg 114,000 SBI FC551A-1 10 μg 114,000 SBI998614

pFC-CMV-MCS-pA-SV40-Neo pFC-MCS-pA-SV40-Neo

シングルプロモータープロモーターレス


SBI FC501A-1 10 μg 114,000 SBI FC500A-1 10 μg 114,000 SBI998618

phiC31インテグラーゼ発現ベクター


ドナーベクター（ポジティブコントロール用）


ゲノム工学


29


受　託

ノックイン遺伝子の挿入位置を安価に解析します外来DNAの挿入位置解析受託サービス

合同会社PGL（ピージーエル）独自の技術であるPGL法を用いて，生物のゲノム中に含まれる外来遺伝子を検出／解析するサービスです。


Memo特許申請中の技術「PGL法」とは生物のゲノム中に含まれる外来遺伝子を検出する方法です。探索したい遺伝子配列がわかっていれば，ゲノム内のどこに入っているかが安価に解析できます。複数箇所にも対応でき，前後のゲノム配列との融合遺伝子として外来遺伝子を検出できます。

応用例：�トランスジーンの導入位置の探索，ウイルスのインテグレーション位置の探索，融合遺伝子の探索など。

外来DNA特異的プライマー（　：ビオチン）

任意プライマー

PCR①

②④

③

ゲノムDNA

PCR

カラム精製

DNAシークエンス

1.�トランスジーンやウイルス DNA などの外来 DNA に特異的なプライマー（5’ 末端ビオチン化）と任意プライマーを用いて，外来DNAの近傍配列を増幅する。

2.�アフィニティー精製により，近傍配列を含む PCR産物を濃縮する。3.�濃縮された PCR 産物を鋳型に再度 PCR を行い，外来DNAの近傍配列を特異的に増幅する。

4.�アガロース電気泳動により DNA フラグメントを分取後，キャピラリーシーケンサーにより近傍配列を解読し，外来DNAの挿入位置を決定する。

解析例�

■形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定

手順

1.�マイクロインジェクションによって作製された形質転換マウスからゲノムDNAを抽出する。

2.�PGL 法を用いてトランスジーン近傍配列の特異的増幅を行う。（下図）

3.�アガロース電気泳動によって分離されたDNAフラグメントを回収する。

4.�キャピラリーシーケンサーを用いてトランスジーン近傍配列を解読する。

5.�マウスゲノムとトランスジーンの融合配列を確認する。

6.�近傍配列の Blast 検索でマウスゲノム上のトランスジーンの挿入位置を決定する。

結果異なるトランスジーンを持つ形質転換マウス 4系統において，それぞれの系統で複数のトランスジーン挿入およびその挿入位置を決定することができた。

［決定されたトランスジーン挿入位置］（系統 1）�a：Chr8:124，…，…．�

b：Chr6:52，…，…．（系統 2）�c：Chr3:10，…，…．�

d：Chr1:154，…，…．�e：Chr8:115，…，…．

（系統 3）�f：Chr16:54，…，…．�g：Chr14:82，…，…．

（系統 4）�h：Chr12:120，…，…．�i：Chr10:79，…，…．�j：Chr1:98，…，…．�k：Chr12:37，…，…．

※未発表データのため，挿入位置の下 6桁は「…，…．」で表示しています。

M：DNA size markerP：parent line1～ 4：形質転換マウス

Mbp

8000

4000

2000

1000

500

P 1 2 3 4

●�トランスジーンの配列情報●�使用したウイルス，ウイルスベクターなどの情報●�トランスジェニック生物のゲノムDNA�（100�ng/μg，A260/A280＞1.6，A260/A230＞1.6）

ご用意いただくもの�

利用例�●�CRISPR/Cas9 を用いた遺伝子ノックインのオフターゲットによって生じた遺伝子挿入の位置決定

●�HTLV，HBV，HIV などのウイルスによって宿主ゲノムに挿入されたウイルスゲノムの挿入位置の決定

●� iPS 細胞などの再生医療向け細胞株の安全性評価●�形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定


詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。［メーカー：PGL］


受託サービス


30


CRISPR/Cas9 を用いて遺伝子のノックアウト，ノックイン，タグ付け，単一ヌクレオチド修飾を行った細胞株を作製する受託サービスです。

サービスの作業工程（例）�

1.�細胞培養条件の検討

2.�gRNA設計と Cas9 ベクター構築

3.�細胞株への遺伝子導入

4.�1 次スクリーニング

5.�陽性クローンの解析

6.�リクローニングと解析

7.�遺伝子改変細胞株の樹立※ご依頼内容を伺った上で，作業工程の詳細をご相談させていただきます。


ゲノム編集をご希望の細胞種，ゲノム編集の内容，対象遺伝子などをご準備の上，当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。［メーカー：FUN］


受　託

CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集遺伝子改変細胞株の作製受託サービス

まずはお気軽にご相談下さい！




受　託

大好評！クローニング不要！人工遺伝子合成受託サービス

特　長�

MemoOptimumGene テクノロジーとはGenScript 社独自の配列最適化技術 OptimumGene のアルゴリズムは，コドン出現頻度，mRNA の構造や転写・翻訳の際の調節領域などタンパク質発現における様々なステージでのパラメータを加味して最適化を行います。

150

KDM M

75

50

32

発現誘導を行っていない系

他社システムによりコドン最適化した配列

最適化を行っていない元来の配列

OptimumGeneによりコドン最適化した配列

タンパク質α

哺乳動物由来のタンパク質�α�をE.�coli で発現させた。OptimumGeneでコドン最適化させた場合，最適化を行っていない場合の 10倍に，また他社システムの 3倍に発現量が増大した。

納　品�

目的配列が挿入されたベクター（凍結乾燥品，約 4�μg＊1）＊1 �他の容量での納品をご希望の際は，当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。

価　格�●�最低価格� ……￥19,400／1断片●� ～3�kb……￥45/base＊2

●�3�kb～5�kb……￥55/base＊2

●�5�kb～8�kb……￥65/base＊2

＊2 �価格は鎖長，配列の複雑さ（GC の含有量，リピート配列など）により変動いたします。

フナコシWeb（http://www.funakoshi.co.jp/online_orders/）のオンラインオーダーフォームからご注文下さい。［メーカー：GSJ］

ご注文方法�

●�配列情報のみから人工遺伝子を合成します。●�シークエンシング解析データ，プラスミドマップもご提供します。

●�独自のOptimumGene テクノロジーにより，発現宿主（E.�coli，酵母，昆虫，哺乳動物，植物など）のコドン最適化による発現タンパク質の最大化を無償で行います。

※繰り返し配列が含まれるDNA断片は，合成できない場合もあります。

オンラインオーダー

任意の配列のDNAを合成し，ベクターに挿入する受託サービスです。cDNA ライブラリーから PCR により目的のDNA断片を増幅することが煩雑な場合などに有用です。

フナコシニュースの送付について

新規申込

毎月2回，フナコシニュースは最新の情報をお届けします。定期送付の新規お申し込み（無料）・送付先の変更など下記までご連絡下さい。

e-mail：[email protected]　　FAX：03-5684-1634

フナコシホームページ（http://www.funakoshi.co.jp）からオンラインでのお申し込みもできます。

［皆様の声］

・最新技術を取り入れた製品を期待しています。・日頃から愛読しています。・�新規技術の概略を知る第一歩となってくれるので役立っています。

・�いつもフナコシさんの最先端技術情報が研究の役に立っています。


受託サービス


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ご注文の際に使用目的確約書が必要です。Web に掲載の使用目的確約書に必要事項をご記入の上，当社受託・特注品担当まで FAX でお送り下さい。本製品または技術を商用目的で使用される場合は，予め当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。

●！ご購入時のご注意

世界初

サイズの大きな遺伝子を効率よくノックイン

Long ssDNA Preparation Kit

BioDynamics Laboratory 社は，大阪大学大学院真下知士准教授と共同で長鎖の一本鎖DNA（long ssDNA）の調製キットを開発しました。本キットで調製した long ssDNAをドナーDNAとし，CRISPR/Cas システムを用いることで，GFP配列を正確かつ効率よくノックインすることに成功した報告があります。

※参考文献：Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 7: 10431 （2016）.［PMID: 26786405］

本キットを利用すると，半日間で簡単に高純度な long ssDNA を調製することができます。

※調製したい long ssDNAの長さに応じた製品をお選び下さい。※着色済みRNA分子量マーカーが付属しています。

1．目的の DNA 断片を添付のプラスミドの MCS の 2 つの Nicking 酵素サイトの間，あるいはNicking 酵素サイトと制限酵素サイトの間にクローニングする。

2．そのプラスミドを，クローニングに用いたサイトで，対応する Nicking 酵素や制限酵素を用いて消化する。

3．消化したプラスミドを，Denaturing Gel-loading Buffer で変性させた後，通常の電気泳動を行う。

4．先頭のバンドを切り出し抽出，精製するだけで目的の ssDNAが得られる。



Long ssDNA Preparation KitBDL006100 BDL DS610 for 1.5kb 1 kit / 40,000BDL006200 BDL DS620 for 3.0kb 1 kit / 40,000

long ssDNA（long single-stranded DNA）

1～3 kbp ほどの長い一本鎖オリゴ

Cas9gRNA

CRISPR/Cas9 と一緒に導入

これまで難しかった・蛍光タンパク質・組織特異的 Cre・ヒト遺伝子など大きな遺伝子を効率的にノックインできる！

最大3,000塩基♪

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funakoshi newsfunakoshi news フナコシニュース2017年 6月 15日号（No.636）

販売店

※本紙に記載されている価格は，2017年 6月15日現在です。 FUN-5862（ 2017.6, № 636 ）

フナコシ株式会社　〒113-0033　東京都文京区本郷2丁目9番7号http://www.funakoshi.co.jp/　e-mail : info＠funakoshi.co.jp

e-mail : kiki＠funakoshi.co.jp

e-mail : reagent＠funakoshi.co.jp試薬に関して : Tel.03-5684-1620　　Fax.03-5684-1775

機器に関して : Tel.03-5684-1619　　Fax.03-5684-5643

genome editing - microsoft...genome editing research & development center/ institute of...

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