geni in regulacija njihovega prepisa -...
TRANSCRIPT
Geni in regulacija njihovega prepisa
• regulacija encimske aktivnosti
• indukcija in represija
• pozitivna in negativna kontrola, atenuacija
• globalna kontrola
• dvokomponentni sistemi
• pogovor bakterij
Regulacija sinteze in aktivnosti proteinov
V celici ločimo dve vrsti regulacije:
- regulacijo aktivnosti že sintetiziranih proteinov
- regulacijo sinteze proteinov
konstitutivno izraženi geni inducibilni geni
Regulacija encimov na različnih nivojih
transkripcija
translacija
gen B
regulacija encimske aktivnosti
protein C
gen C
protein D
produkt
gen Dgen A
Regulacija encimske aktivnosti
Obstaja več mehanizmov regulacije encimske aktivnosti:
• aktivacija s posttranslacijsko cepitvijo proteina
• kovalentna modifikacija proteina (npr. dodajanje acilne skupine,
AMP, ADP, fosfata, metilne skupine)
• deaktivacija z razgradnjo proteina
• mehanizem povratne zanke (pozitivna in negativna)
Mehanizem povratne zanke
substratKončni produkt metabolne poti inhibitorno
deluje na prvi encim v metabolni poti. Na
ta način je zelo učinkovito regulirana
koncentracija metabolitov v celici (npr.
aminokislin).
intermediat 1
intermediat 2
intermediat 3
intermediat n
produkt
Povratna zanka - alosteričen učinek
Regulacija transkrpicije: represija in indukcija
represija encima indukcija encima
Genska represija (negativna kontrola)
Neaktiviran represor
omogoča sintezo proteina.
Prisotnost korepresorja
prepreči, kar negativno
vpliva, na sintezo proteina.
Genska represija (negativna kontrola)
Induktor deaktivira represor,
sprosti negativno kontrolo in
tako omogoči sintezo
proteina.
Prisotnost represorja
prepreči, negativno vpliva,
na sintezo proteina.
Genska indukcija (pozitivna kontrola)
Brez induktorja ni možna
vezava aktivatorskega proteina
na RNA polimerazo, kar slednji
onemogoča vezavo na DNA.
Aktivatorski protein za razliko
od represorja pozitivno vpliva
na sintezo proteina.
Genska indukcija (pozitivna kontrola)
Lahko pa je oddaljeno nekaj
100 bp od mesta za vezavo RNA
polimeraze.
Mesto za vezavo aktivatorja je lahko v neposredni bližini mesta za vezavo RNA polimeraze.
Regulacija translacije - atenuacija
Višek triptofana, transkripcija zaustavljena. Regija 2 in 3 se ne moreta pariti.
Pomankanje triptofana, transkripcija poteka.
DNA regulatorni proteini
Regulacijo prepisa DNA vršijo
regulatorni proteini, ki imajo
specifične interakcije z
regulatorno regijo tarčnega
gena. Običajno so regulatorni
proteini dimeri, ki se vežejo na
invertirane sekvence DNA.
DNA regulatorni proteini
cinkovi-prsti
Cink interagira z dvema cisteinoma in dvema histidinoma
levcinska zadrga
vsaka 7. amino kislina v delu proteina, ki skrbi za interakcije medregulatornimi proteini, je levcin
Regulacija več genov - katabolna represija
Če sta v gojišču na voljo dva vira
ogljika, potem običajno zasledimo
preferenčno rast na enem viru ogljika,
kar imenujemo diauksična rast.
Represijo genov, ki so odgovorni za
izrabo drugega vira ogljika imenujemo
katabolna represija.
rast na laktozi
laktoza
glukoza
rast na glukozi
čas
konc
entr
acija
Lac operon, prototip genske regulacije
O mesto vezave represorja
P promotor RNA polimeraze
LacI gen za represor
Pi promotor za LacI
LacZ gen za beta-galaktozidazo
LacY gen za laktozno permeazo
LacA gen za tioglikozid transacetilazo
Cap gen za sintezo CAP proteina (aktivator)
lacI Pi P O lacZ lacY lacA
RNA polimeraza
cap
mRNAmRNA
Z Y Ainhibitor
Lac operon, ko v mediju ni prisotne laktoze
lacI Pi P O lacZ lacY lacA
RNA polimeraza inhibitor
inhibitor
mRNA
Lac operon, ko je v mediju prisotna laktoza
lacI Pi P O lacZ lacY lacA
Z Y A
mRNAmRNA
RNA polimeraza
inhibitor
laktoza
Lac operator v primeru, ko sta v mediju prisotna glukoza in laktoza
Z Y A
mRNA
Cap
mRNA
inhibitor
RNA polimeraza
lacI Pi P O lacZ lacY lacAcap
cAMPglukoza
cAMP
cAMP
Cap
počasen prepis brez cAMP-Cap
Ko je v mediju prisotna glukoza je vedno tudi izrabljena. Ostali sistemi za izrabo sladkorjev morajo
biti inducirani. Ko je v mediju veliko glukoze, je konc. cAMP nizka. Če se konc. glukoze zmanjša se
poveča konc. cAMP, kar omgoča vezavo cAMP na CAP protein, le ta pa stimulira vezavo RNA
polimeraze na DNA in bistveno večji prepis genov za metabolizem laktoze.
Dvokomponentni regulacijski sistemi
senzor
ligand
vezava liganda P Hisavtofosforilacijasenzorja
prenos fosfata iz histidina senzorja na aspartat odzivnega regulatorja
PHis
AspRNA
polimeraza
promotor operator gen
PAsp
PAsp
odzivni regulator
Nekateri dvokomponentni regulacijski sistemi v mikrobnih celicah
sistem okoljski signal senzorska kinaza odzivni regulator
Arc O2 ArcB ArcA
Nar NO3-, NO2
- NarX, NarQ NarL
Ntr NH4+ NrII NrI
Pho regulon Pi PhoR PhoB
porinski reg. ozmotski pritisk EnvZ OmpR
Evg nizka temp. EvgS EvgA
Tox pH, temp., ozmoza ToxS ToxR
Bvg temp., nikotinskak. BvgS BvgA
“Quorum” zaznava gostote bakterij
Quorum zaznava je vrsta globalne kontrole mikroorganizmov, kjer je
okoljski signal gostota bakterijske kulture. Bakterija ima encim za sintezo
feromona (npr. aciliranega homoserin laktona). Feromon difundira iz
celice. Njegova koncentracija postane znatna šele pri zelo gosti kulturi.
celični agregatcelice začnejo agregirati
celica proizvaja feromon
Kako se bakterije pogovarjajo?
Veliko signala pomeni veliko celic v okolici, čas za spremembo obnašanja!
• produkcija ekstracelularnih signalnih molekul - feromonov
• detekcija povišane celične koncentracije preko membranskih in
citoplazmatskih receptorjev
• sprememba transkripcijskega vzorca in sprememba obnašanja
Kemijska narava signalnih molekul - feromonov
OO
NH
OH
O
3-oxo-C6-HSL iz Vibrio fischeri
homoserinlaktoniG- bakterije
H-Tyr-Ile-Asn- NHAsp
PheLeu
NH
SMe
Me
O
O
G+ bakterijepeptidi
Ciklični peptid iz S. aureus
Druge signalne molekule: γ-butirolaktoni , quinoloni , furanoni
Kateri procesi so regulirani
s quorum zaznavo?
virulenca
transfer genetskega materialaantibiotiki
bakteriocini
plodno telesceekstracelularni encimi
sporulacijabioluminescencabiofilm
Globalna kontrola sinteze proteinov
Organizirani sočasni kontroli več različnih genov v organizmu pravimo
globalna ali integralna kontrola.
sistem signal število reguliranih genov
katabolna represija ciklični AMP >300
aerobna respiracija prisotnost O2 >50
anaerobna respiracija odsotnost O2 70
toplotni šok temperatura 36
asimilacija dušika pomankanje NH4+ >12
oksidativni stres oksidanti >30
SOS odgovor poškodovana DNA >20
Globalana kontrola
signal
citoplazmatska membrana
signalni intermediat
ekspresija induciranih genov
primarni nivo regulacija genov
sekundarni nivo regulacije genov
Mikrobna genetika
• mutacije
• homologna genska rekombinacija:
transformacija
transdukcija
konjugacija
• nehomologna genska rekombinacija
• primerjalana genomika
Mutacije in mutanti
• Mutacija je dedna sprememba, ki se prenaša iz generacije v generacijo.
Mutant je organizem, ki nosi dedno spremembo.
• Gene pišemo z malo črko, npr. hisC, recA.
• Proteine, ki nastanejo iz gena pišemo z veliko črko, npr. HisC, RecA
• Fenotip mutante označujemo z oznako + ali - npr. His+ (organizem lahko
naredi histidin) ali pa His- (organizem ne more narediti histidina).
Vrste mutacij
Tihe mutacije: spremenjena je tretja baza kodona (ohrani se isto aminokislina)
Nesmiselne mutacije: formiranje stop kodona, nekompleten protein
Zamenjava aminokisline: spremenjena prva baza kodona
Pogojno letalne mutante: npr. rast pri 30 oC, odsotnost rasti pri 40 oC
Sprememba bralnega okvirja: popolnoma spremenjene aminokisline
Revartante: povratna mutacija, ki povzroči nastanek divjega seva
Vrste mutacij
Supresorske mutacije: vrne fenotip divjega seva (sprememba je lahko v istem
genu, vendar ne na istem mestu kot revartanta, lahko je v drugem genu, ki
komplementira mutiran gen, kar vrne fenotip)
Delecije: izguba večjega števila nukleotidov
Insercije: vgradnja večjega števila nukleotidov
Translokacije: premikanje večjega dela DNA med različnimi lokacijami na
kromosomu
Inverzije: zamenjana orientacija DNA segmenta
Spontana frekvenca mutacij
DNA
~ 10-10/bp
DNA
~10-5/bp
RNA
~ 10-4/bp
protein
• spontana frekvenca mutacij v populaciji celic je ~ 10-6 na generacijo
• spontana frekvenca transpozicij je ~ 10-4 na generacijo
• spontana frekvenca mutacij RNA virusov je ~ 10-3 na generacijo
• mutatorski geni povečajo stopnjo mutacij za ~ 10-15 x
Biološka ura: 10-9 mutacij/bp/leto
Inducirana naključna mutageneza
sredstvo učinkovanje sprememba
analogi baz spremenjeno parjenje A : T T analog : G G : C
HNO2 deaminacija A in C A : T G : C
NH2OH reakcija s C G : C A : T
etilmetansulfonat dodajanje CH3 na G G : C A : T
etidijev bromid interkalacija mikroinsercije, mikrodelecije
mitomicin povezava DNA vijačnic delecije
UV pirimidinski dimeri delecije
X-žarki prosti radikali delecije
Točkasta mutageneza
Omogočajo zamenjavo ene same
aminokisline v proteinu tako, da
na mutiranem mestu v genu
dodamo oligonukleotidni začetnik
z nepopolnim parjenjenjem
nukleotidov. Uporabljamo v
biotehnologiji za pridobivanje
željenih mutiranih proteinov.
Kasetna mutageneza
Željeni del DNA lahko nadomestimo z
mutiranim. Z vgradnjo genske kasete
v izbrani gen na plazmidu po
homologni rekombinaciji s
kromosomalnim genom onsposobimo
gen, obenem pa lahko vnesemo
željene gene in molekularne markerje.
Horizontalni prenos genov
Za razliko od prenosa genov iz generacije v generacijo (vertikalni
prenos genov) pri horizontalnem prenosu prehaja do izmenjave
(rekombinacije) genov znotraj iste generacije. Ločimo:
• homologno gensko rekombinacijo
• nehomologno gensko rekombinacijo
Homologna genska rekombinacija prokariontov
Pri prokariontih so homologni fragmenti DNA lahko transportirani med
celicami in s homologno rekombinacijo integrirani v gostiteljevo DNA. Trije
najpomembnejši procesi homologne rekombinacije so:
• transformacija (prenos proste DNA)
• transdukcija (prenos DNA z virusi)
• konjugacija (prenos plazmidne DNA med celicami)
Homologna genska rekombinacija
Homologna genska rekombinacija
Rec A in SOS odgovor na DNA poškodbo
Genska transformacija
Transformacija - vnos tuje DNA
ECECEAEA
NucANucANuclease?Nuclease?
ATPATP ADPADP
FAFA
Načini vnosa tuje DNA
Frekvenco vnosa povečamo s Ca2+
ioni in nizko temperaturo. DNA lahko
vnesemo z elektroporacijo. Pri
evkariontih DNA transformiramo z
virusi, endocitozo, elektroporacijo in
balističnimi izstrelki obloženimi z
DNA.
Litični in lizogeni cikel bakteriofagov
Indukcija temperiranega faga
Specializirana transdukcija
Fagna konverzija
bakterija fag protein ali fenotip
Escherichia coli φFC3208, λ enterohemolizin, rezistenca na serum
Shigella flexneri sf6, sfII O-antigen acetilaza, glukozil-transferaza
Salmonella enterica Gifsy-2, superoksid dismutaza, neuraminadaza
Vibrio cholerae CTXφ, VPIφ kolera toksin, TCP pilini
Pseudomonas aeruginosa φCTX citotoksin
Clostridium botulinum C1 neurotoksin
Staphylococcus aureus NA, TSST-1 enterotoksin, šok sindrom
C. diphtheriae β-fag diftereja toksin
Plazmidi
• plazmid je izven kromosomska DNA
• podvojuje se neodvisno od kromosomske DNA.
• nima proteinskega plašča
• plazmidi imajo dvojnovijačno DNA, večinoma krožno
• vsebujejo od 1 do 100 kb, so supernaviti
• encime za replikacijo plazmid večinsko dobi od gostitelja. Število kopij
varira od 1 do 100 na celico.
• plazmidi, ki so transportirani v celico morajo biti kompatibilni z že
obstoječimi plazmidi v celici, sicer so izločeni.
• plazmide, ki se lahko vgradijo v kromosom, imenujemo episome
Vrste plazmidov
• rezistenčni (R) plazmidi: kodirajo zapis za odpornost na antibiotike, težke
kovine, bakteriocine
• plazmidi s fiziološkimi funkcijami: npr. razgradnja oktanov, herbicidov,
nastanek acetona, butanola, nodulacija, izraba laktoze in saharoze,
produkcija pigmentov
• virulenčni plazmidi: imajo zapis za invazivnost: npr. koagulaze, hemolizin,
eneterotoksin, K-antigen, tvorba tumorjev
R 100 (rezistenčni plazmid)
Kodira zapis za rezistenco na:
- živo srebro (mer)
- sulfonamide (sul)
- tetracikline (tet)
- streptomicin (str)
- kloramfenikol (clm)
F-plazmid
gen funkcija
tra transfer
oriT začetek za transfer
oriS začetek replikacije
inc inkompatibilnost
rep replikacija
IS3, IS2, Tn/1000 (transpozoni) potencialna mesta vgradnje v gostiteljski kromosom
Konjugacija
Informacija za konjugacijo je kodirana na plazmidu. Za konjugacijo so
potrebni pili, ki skrbijo za vezavo donorske in recipientske celice, in jih imajo
samo donorski sevi. Ko sta celici stabilizirani pride do fuzije obeh membran
in do prehoda DNA.
Prenos DNA pri konjugaciji
Za prenos DNA je potrebna
sinteza DNA tako v donorju
kot v akceptorju. Po
končanem procesu ima vsaka
celica eno kopijo plazmida.
Akceptorska celica po
ekspresiji plazmidnih genov
lahko postane donorska.
Mobilizacija kromosoma
Po integraciji F plazmida v kromosom postane tak sev Hfr ali sev z visoko
sposobnostjo rekombinacije. Pri konjugaciji Hfr seva, poleg plazmida,
potuje v recipientsko celico tudi del kromosoma, v katerega je vgrajen F
plazmid.
Plazmidi in virulenčni faktorji
Veliko virulenčnih faktorjev (npr. toksinov, bakteriocinov), ki omogočajo
bakteriji vezavo in kolonizacijo gostitelja je kodiranih na plazmidih.
Virulenčne faktorje poleg plazmidov najdemo tudi na mobilnih genskih
elementih (npr. transpozoni in bakteriofagi) ter na kromosomih.
Transpozicija - nehomologna rekombinacija
Transpozicija omogoča premikanje genov po kromosomu. Pojavlja se s
frekvenco 10-5 do 10-7 na generacijo. Po kromosomu se lahko premikajo le
tisti geni, ki imajo transpozabilne elemente. Ločimo:
• konzervativno transpozicijo (transpozon se izreže in vstavi na novo mesto)
• replikativno transpozicijo (transpozon se podvoji, parentalni ostane na istem
mestu, hčerinski se vgradi na novo lokacijo na kromosomu).
Konzervativna transpozicija
Replikativna transpozicija
Mutageneza s transpozoni
Če se transpozon naključno vgradi v gen ga deaktivira. Za izolacijo mutant
uporabljamo transpozonske gene, ki kodirajo zapis za rezistenco na
antibiotike (vgradnja pomeni rezistenco na antibiotik). Najbolj običajno
uporabljamo Tn10, ki ima marker za tetraciklinsko rezistenco ali Tn5 z
rezistenco na kanamicin in neomicin.
gen A gen B gen C gen D
IS IS
transpozon
Integroni
Nekateri transpozoni vsebujejo poleg genov za rezistenco na antibiotike še
druge gene (genske kasete). Na genskih kasetah je lahko veliko genov za
rezistenco na antibiotike. Najbolj poznan je Tn7 integron.
intI1 P attI aadB sull
intI1 integraza
P promotor
attI mesto vgradnje
sull rezist. na sulfonamide
aadB genska kaseta/rezistenca na aminoglikozilirane antibiotike
Kaj vemo o genomu E.coli
• kromosom ima 4.639.221 bp
• kromosom ima 4.288 bralnih okvirjev (88 % genoma), za okrog 35 %
genskih produktov še vedno ne poznamo fiziološke funkcije
• 1 % genoma predstavljajo geni za tRNA
• 0.5 % genoma so visoko ponavljajoče se sekvence, ki ne kodirajo proteinov
• 10 % genoma predstavljajo regulatorne sekvence (promotorji, operatorji,
začetek podvojevanja, konci podvojevanja DNA)
• geni so bodisi organizirani v klastre-operone (npr. hisG, hisD, hisC, hisB,
hisH, hisA, hisF, hisI, hisE), ali pa razmetani po kromosomu (npr. arg geni)
• okrog 70 % genov je monocistronskih, 6 % je policistronskih
Kaj vemo o genomu E.coli
• na obeh vijačnicah je približno enako število operonov
• na kromosomu je 10 insercijskih elementov IS
• na kromosomu je do 30 % fagnih sekvenc
• na genomu obstaja več patogenih otokov
• približno 20 % celotnega genoma je E.coli pridobila s horizontalnim
genskim prenosom
Primerjava genov pri različnih mikroorganizmih
Transportni sistemi Mycoplasma pneumoniae
Transportni sistemi Haemophilus influenzae
Genomika
Genomika je disciplina, ki se ukvarja z mapiranjem, sekvenciranjem in
analizo genoma. S primerjavo znanih sekvenc lahko določimo potrebne in
zadostne pogoje za opravljanje določenega procesa. Določimo oziroma
sklepamo lahko na:
• konzervativne in variabilne regije v genomu
• urejenost in grupiranje genov
• metabolne poti
• regulatorne mehanizme
• ortologne proteinskih družin (obstja okrog 100 ortolognih proteinskih družin, med
katerimi je možen horizontalen genski prenos)
Postopki pri delu z DNA čipom
• populacijo celic običajno podvržemo okoljskemu faktorju in počakamo da sistem
pride v stacionarno stanje
• ekstrahiramo mRNA in jo reverzno prepišemo (mRNA je hitro razgrajena, zato je
potreben reverzen prepis, žal ta ni kvantitativen)
• fluorescentno označimo cDNA (ker je vezava fluorofora odvisna od dolžine in
sestave DNA ni možno kvantitativno določanje koncentracije)
• hibridizacija cDNA na DNA čip (DNA čip je lahko narejen poljubno in vsebuje ORF
ali poznane gene)
• posnamemo vzorec (vzbujamo z laserjem, detektiramo s CCD kamero)
• interpretacija dobljenega vzorca (težavna, ker hibridizacija ni kvantitativna)
Uporaba DNA čipov
• proučevanje fiziologije organizmov
• proučevanje ekologije organizmov
• odkrivanje genov
• diagnoza bolezni
• odkrivanje novih zdravil
• toksikološke raziskave
Molekularno kloniranje
• molekularna orodja
• vektorji
• izolacija ustreznega klona
• uporaba kloniranja
Genski inženiring
Genski inženiring so postopki izolacije, manipulacije in ekspresije
genetskega materiala s katerim proučujemo mehanizme genske replikacije,
ekspresije in jih uporabljamo za produkcijo različnih koristnih produktov.
Aplikativni uporabi genskega inženiringa pravimo tudi biotehnologija.
Molekularno kloniranje
1. Izbira ustreznega DNA fragmenta. DNA je lahko genomska, fragmentirana
z restrikcijskimi encimi, DNA sintetizirana iz RNA, sintetiziranan s PCR ali
sintetična DNA.
2. spajanje izbranega DNA fragmentov v vektor za kloniranje
3. prenos vektorja za kloniranje v izbrane gostitelje, pomnoževanje
vektorja za kloniranje, ustvarjanje genske knjižnice
4. izolacija in čiščenje ustreznega klona
5. pomnoževanje izbranega klona
Iskanje ustreznega gena za kloniranje
Gen, ki ga želimo klonirati je potrebno dobiti v relativno visokem številu (>
106), saj je vgradnja gena v vektor stohastični proces. Željeni gen za
kloniranje lahko v ustrezni koncentraciji dobimo s:
• PCR pomnoževanjem izbranega gena
• iz poznane mRNA sekvence z reverzno transkripcijo in PCR pomnoževanjem
• iz poznane proteinske sekvence s kemijsko sintezo DNA
Molekularna orodja - molekularne škarje
Restrikcijski encimi so visokospecifične
endonukleaze, ki režejo na izbranih mestih
v DNA sekvenci. Za rezanje z restrikcijskimi
encimi potrebujemo os simetrije okrog
katere režejo restrikcijski encimi. Odrezani
konci so lahko lepljivi ali pa topi.
SmaIEcoRI PstI
Molekularna orodja - molekularno DNA lepilo
DNA konce, ki jih dobimo z restrikcijskimi encimi je potrebno med seboj
zlepiti ali ligirati. Zato uporabljamo encim DNA ligazo. DNA ligaza zlepi 5’
fosfatni konec z 3’ hidroksilnim koncem sosednjih nukleotidov.
Ustvarjanje rekombinantnih DNA molekul
G A A T T CC T T A A G
G A A T T CC T T A A G
restrikcijsko mesto restrikcijsko mesto
G C T T A A
A A T T CG
G C T T A A
A A T T CG
lepljivi konec
G C T T A A
A A T T CG
gostiteljeva DNAgostiteljeva DNA donorska DNA
A A T T CG
G C T T A A
donorska DNA
A A T T CG
G C T T A A
Ostala molekularna orodja
• fosfataze
• kinaze
• ssDNA nukleaze
• DNA polimeraze
• RNA nukleaze
• RNA ligaze
• reverzne transkriptaze
Vektorji za molekularno kloniranje
• plazmidi
• bakteriofagi (M13, lambda)
• kozmidi (plazmidni vektorji s kohezivnimi konci iz bakteriofaga lambda)
• evkariontski virusi (adenovirusi, SV40, vakcinia, retrovirusi, bakulovirusi)
• sintetični kromosomi (HAC, YAC, BAC)
Specifični vektorji za molekularno kloniranje
• fuzijski vektorji (fuzija želejenega gena z drugim genom)
• ekspresijski vektorji (velika ekspresija kloniranega gena)
• sekrecijski vektorji (izboljšano izločanje proteinov)
• taksi (“shuttle”) vektorji (prenos DNA med nesorodnimi organizmi)
Plazmidi kot vektorji
• so majhni
• enostavna manipulacija
• DNA je krožna in zelo stabilna
• imajo neodvisno replikacijo od gostiteljevega krmosoma
• v celici so lahko v več kopijah
• prisotnost selekcijskih markerjev olajša detekcijo in selekcijo
Prototip plazmida za kloniranje - pBR322
• je majhen, 4361 bp
• običajno 20-30 kopij v gostitelju
• lahko dosežemo 1000-3000 kopij
• enostavna izolacija zaradi supernavitja DNA
• inserti so lahko veliki do 10kb
• znana je njegova DNA sekvenca
• ima več mest za enkratno cepljenje s PstI, SalI, EcoRI, HindII, BamHI
• ima gen za rezistenco na ampicilin in tetraciklin,
• s transformacijo gre enostavno v gostitelja
Kloniranje s pBR322
AmpR TcR
BamHI restrikcija
DNA ligaze
transformanta občutljiva na tetraciklin, rezistentna na ampicilin
transformanta rezistentna na tetraciklin in ampicilin
BamHI restrikcija
tuja DNA
Bakteriofag lambda kot vektor za kloniranje
neesencialni delZa kloniranje ima divji sev lambde
preveč restrikcijskih mest. V
rekombinantnem fagu (npr. Charon 4A)
je število restrikcijskih mest manjše.
Lahko kloniramo večje fragmente kot
pri plazmidih. Uspešnost transdukcije je
večja kot uspešnost transformacije.
donorska DNA
pakiranje DNA
infektivni fag
Bakteriofag M13 kot vektor za kloniranje
BamHISmai PstI
SalIEcoRI XbalKpnI
....G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G....
lacZ
polilinkerska sekvenca
Bakteriofag M13 ima polilinkersko sekvenco (večje število enkratnih restrikcijskih
mest. Polilinkerska sekvenca ne spremeni bralnega okvirja za prepis lacZ gena. Če
pride do vgradnje DNA segmenta se bralni okvir poruši in s tem sinteza LacZ.
Fuzijski vektor
kontrolira Ptac promotor, obdodatku glukoze pride do indukcije
fuzija inaktivira lacZ
malE uporaben za izolacijo
amp rezistenca na antibiotikmesto za začetek
podvojevanja vektorja
Spojimo, fuziramo dva gena, zaradi lažje izolacija ali detekcije
izbranega genskega produkta.
Sintetični kvasni kromosom (YAC) kot vektor za kloniranje
TEL TELARS CEN Not I Not I URA3klonirana DNA
Kvasni kromosom, ki ga uporabljamo za kloniranje mora vsebovati:
- mesto za začetek replikacije (ARS)
- telomerazo (TEL)
- centromero (CEN)
- mesto za kloniranje (Not I)
- selekcijski marker (npr. gen za uracil URA3)
V YAC kromosom lahko kloniramo relativno velike segmente DNA od 250 do 1000 kb.
Velikost klonirane DNA pri različnih vektorjih
vektor velikost (kb)
plazmid < 15
bakteriofag < 90
sintetični bakterijski kromosom 100 - 500
sintetični kvasni kromosom 250 - 1000
Selekcija rekombiniranih celic
Pri rekombinaciji tuje DNA dobimo tri vrste celic:
• celice, ki nimajo vgrajenega vektorja (npr. celice so občutljive za antibiotik)
• celice ki imajo vgrajen vektor, vendar nimajo želejene DNA (npr. celice
rezistentne na antibiotik, brez nove fenotipske lastnosti)
• celice, ki imajo vgrajen vektor in željeno DNA (npr. celice rezistentne na
antibiotik, imajo novo fenotipsko lastnost)
Selekcija ustreznega klona
Željeno transformanto dobimo bodisi preko spremenjenega fenotipa ali
spremenjenega genotipa:
• iskanje, ko je gen ekspresiran: uporabimo gostitelja, ki je mutiran za
klonirani gen, kar omogoča rast samo transformantam. Alternativno
uporabljamo protitelo za izbrani protein.
• iskanje, ko gen ni ekspresiran: uporabimo označene DNA ali RNA probe
za željeni gen in naredimo hibridizacijo s klonirano DNA
Praktična uporaba genskega inženirstva - biotehnologija
• metabolni inženiring
• rekombinantne vakcine
• produkcija proteinov sesalcev
• transgene živali in rastline
• okoljska biotehnologija
• genska regulacija in genska terapija
Metabolni inženiring
• inkorporacija genov za večji razpon substratov na katerih organizem
raste
• genetska sprememba metabolnih poti
• več produktov manj biomase
Proizvodnja rekombinantnih humanih proteinov
protein funkcija
inzulin uravnavanje krvnega sladkorja
α-1-antitripsin proteazni inhibitor
epidermijski rastni faktor rast epitelijskih celic
humani rastni hormon rast celic
eritropoetin stimulira rast krvnih celic
faktor IX strjevanje krvi
interlevkini a, b, g protivirusna terapija
interlevkini stimulacija imunskega sistema
urogastron kontrola gastrointestinalne sekrecije
Rekombinantne vakcine
• produkcija antigenov (npr. hepatitis B)
• uporaba spremenjenih virusov (npr. vakcinija virus za črne koze,
steklino)
• uporaba gensko spremenjenih bakterij (npr. Salmonella typhi)
• produkcija antigenskih epitopov (npr. M13)
Uporaba rekombinantne tehnologije v kmetijstvu
• toleranca na herbicide
• rezistenca na škodljivce (Baciullus thurigiensis)
• kontrola patogenih gliv (Pseudomonas fluorescens)
• rezistenca na viruse
• utišanje genov gostitelja
• fiksacija dušika
Gensko spremenjena hrana
••
Nekatere od potencialnih koristi GMO
• povečana hranilna vrednost in obstojnost hrane
• povečana odpornost na škodljivce
• eliminacija alergenov
• produkcija farmacevtskih učinkovin
• bioremediacija toksinov in eksploziv
• produkcija biorazgradljive plastike
• zmanjševanje produkcije polutantov
Nekatere od potencialnih nevarnosti GMO
• neželjen prenos toksičnih genov med vrstami
• nepričakovani rezultati rekombinacije
• zmanjševanje biološke pestrosti
• navzkrižna kontaminacija med GMO in ne-GMO
• nezmožnost dolgoročne napovedi vpliva GMO na okolje
Sproščanje GMO v okolje
• Predno spustimo GMO v okolje moramo odgovoriti na naslednja vprašanja:
• ali lahko GMO preživi izven laboratorija
• ali se lahko razmnožuje z nemodificiranimi predstavniki iste vrste
• ali ima GMO selekcijsko prednost pred ostalimi organizmi v okolju
• ali lahko prihaja do horizontalnega prenosa genov
• ali se GMO lahko premika v okolju