GENETIC MOLECULARINTRODUCEREGenetica este tiina care studiaz ereditatea i variabilitatea organismelor.Termenul de genetic a fost introdus de englezul William Bateson (1861-1926), n 1906, la a treia Conferin Internaional de Hibridarea Plantelor. n 1909, Wilhelm Johannsen a dat denumirea de gene unitilor de informaie ereditar. Ereditatea (lat. hereditas motenire) este proprietatea fundamental a fiinelor vii prin care se asigur transmiterea cu fidelitate a caracterelor de la prini la descendeni i prin care este astfel determinat asemnarea dintre acetia. Reprezint aspectul continuitii fenomenului ereditar. Caracterele ereditare sunt acele trsturi morfo-anatomice, fiziologice, biochimice i comportamentale care se transmit constant, cu mare fidelitate, de la prini la descendeni, dea lungul generaiilor. Dar descendenii doar seamn, nu sunt identici cu prini, avnd i trsturi proprii, adic exist i deosebiri ntre prini i descendeni, denumite variaii expresia discontinuitii fenomenului ereditar. Variaiile de care se ocup genetica sunt variaii ereditare odat aprute ntr-o generaie se vor transmite i generaiilor urmtoare. Variabilitatea este o latur a fenomenului ereditar i o lege universal a lumii vii care st la baza apariiei unor diferene prin care descendenii nu sunt identici prinilor, dar nici ntre ei, fiecare individ fiind cu adevrat unic din punct de vedere genetic. Exist i variaii neereditare = modificaii deosebiri aparente, exterioare, aprute n urma aciunii unor condiii particulare de mediu unele maladii, bronzarea pielii, prul vopsit, membre amputate, informaia acumulat n cursul vieii etc. 1. 2. 3. 4. Etapele dezvoltrii geneticii ca tiin Genetica clasic/factorial Johann Gregor Mendel, 1865 Citogenetica Thomas Hunt Morgan, 1906-1913 Genetica molecular 1944 i 1953 Ecogenetica/genetica populaiilor

1

SCURT ISTORIC AL GENETICIIPrimele cunotine legate de ereditate se contureaz odat cu sedentarizarea omului. Acesta renun la viaa nomad i ncepe s creasc animale i s cultive plante (adic s practice agricultura). n cadrul acestor ndeletniciri, omul, n vederea amplificrii unor proprieti ale animalelor crescute i ale plantelor cultivate, recurge la selecie artificial alegerea i pstrarea pentru perpetuare a acelor indivizi care prezint calitile dorite. Selecia artificial se bazeaz pe cunoaterea faptului c trsturile organismelor se motenesc n mare msur n form identic sau foarte asemntoare de la o generaie la alta, care nseamn chiar fenomenul ereditar. Sub forma seleciei artificiale a fost neles i s-a operat cu fenomenul ereditar, n mod empiric, pn n 1865, an n care au fost puse bazele tiinifice ale tiinei care urma s se numeasc genetic. 1865 Johan Gregor Mendel, prin experimentele sale ale cror rezultate s-au materializat n lucrarea Cercetri asupra hibridrii plantelor, pune bazele geneticii ca tiin; acest an este considerat anul naterii geneticii, iar Mendel printele acesteia. 1869 anatomistul elveian de origine german Friedrich Miescher (1844-1895) descoper n nucleii celulelor lizate pe cale natural din puroiul colectat din plgi o substan pe care a numit-o nuclein i pe care a izolat-o ulterior i din lapii de somon i din sperma altor animale. Nucleina este o substan foarte bogat n fosfor. 1875 este elucidat mitoza. 1889 patologul i histologul german Richard Altmann (1852-1900) redenumete acid nucleic substana descoperit de Miescher, constatnd caracterul acid consecutiv separrii din aceasta a unei fracii bogate n acid fosforic (reprezentnd acidul nucleic propriuzis) i a unei componente proteice. Altmann a lucrat pe nucleina de la drojdie. 1890 este elucidat meioza. 1900 trei cercettori Carl Correns (Germania), Erich von Tschermak (Austria) i Hugo de Vries (Olanda) redescoper independent primele legi ale ereditii, formulate anterior de J. G. Mendel n 1865, dar care nu ajunseser s fie cunoscute i acceptate. 1902 zoologii W. S. Sutton (SUA) i T. Boveri (Germania) pun bazele teoriei cromosomale a ereditii observnd similaritile ntre comportamentul factorilor ereditari (a cror existen a fost postulat de Mendel) i comportamentul cromosomilor n mitoz, meioz i fecundaie; ei aduc dovezi citologice i genetice prin care demonstreaz c substratul citologic al ereditii, i deci sediul genelor, sunt cromosomii 1903 P. A. T. Levene a lucrat cu acidul nucleic din celulele de timus de viel, n structura cruia a identificat patru baze azotate A, G, C, T, numindu-l acid timonucleic (astzi acid deoxiribonucleic, ADN). 1906 cercettorul britanic W. Bateson introduce termenul de genetic, pe care l propune la a III-a Conferin internaional de hibridare i ameliorare a plantelor, desfurat la Londra. El folosete termenul pentru prima dat ntr-o coresponden adresat lui Adam Sedgwick, n 1905; termenul deriv din grecescul gennao/genn a da natere. 1906 Thomas Hunt Morgan ncepe cercetrile pe Drosophila melanogaster; pe baza rezultatelor obinute, postuleaz n 1913 cele patru teze ale teoriei cromosomale a ereditii, continund i finaliznd astfel ceea ce ncepuser Sutton i Boveri. 1909 P. A. T. Levene stabilete structura de baz a ADN, introducnd termenii de nucleozid i nucleotid. A analizat acidul nucleic de la drojdii, n care a identificat patru baze azotate A, G, C, U, numind acidul analizat acid zimonucleic (astzi se numete acid ribonucleic, ARN). 1928 cercetrile lui F. Griffith pe Streptococcus pneumoniae reprezint prima etap n dovedirea faptului c ADN este substratul chimic al ereditii; tot prin aceste cercetri descoper fenomenul de transformare bacterian/genetic. 1930 Feulgen i Levene realizeaz depolimerizarea enzimatic a ADN, dovedind pentru prima dat natura polimeric a acestuia. Levene lanseaz ipoteza tetranucleotidului 2

conform creia n structura polimeric a ADN monomerii se succed ntr-o ordine riguroas i monoton: A-G-C-T. Pn la invalidarea acestei ipoteze n 1944, a fost ntrziat implicarea ADN n ereditate, considerndu-se c proteinele sunt cele mai potrivite pentru rolul de substrat chimic al ereditii, ca urmare a marii lor diversiti; monotonia structural a ADN postulat de Levene nu ar fi putut asigura marea diversitate de genotipuri i implicit de fenotipuri. 1932 J. L. Alloway i 1937 M. H. Dawson i R. H. P. Sia, prin experimentele realizate, exclud posibilitatea ca glucidele s fie implicate n transformarea genetic i deci n ereditate. 1938-1940 Babara McClintock descoper la porumb elementele genetice mobile sau transpozonii. 1944 Oswald T. Avery, Colin M. MacLeod i Maclyn McCarty relund experimentele lui Griffith, dovedesc c ADN, i nu alt substan chimic, este substratul chimic al ereditii; descoperirea a fost numit de ctre J. Watson bomba lui Avery deoarece a surprins comunitatea tiinific revoluionnd concepia puternic nrdcinat conform creia proteinele sunt substana ereditar. 1948-1952 chimistul austriac Erwin Chargaff analizeaz cantitativ compoziia chimic a acizilor nucleici de la mai multe specii de organisme, concluziile sale devenind legi. 1951 a fost secveniat prima protein. 1952 Alfred D. Hershey i Martha Chase, folosind marcajul radioactiv cu 35S pentru proteine i cu 32P pentru ADN, dovedesc c n timpul infeciei fagice, n bacterie ptrunde doar acidul nucleic, care este suficient pentru multiplicarea bacteriofagului n celula infectat. Concluzia era evident ADN-ul fagic deine informaia genetic att pentru propria sa sintez, ct i pentru sinteza proteinelor fagice. 1953 descoperirea i modelarea structurii bicatenare a ADN de ctre James D. Watson, Francis H. C. Crick, Maurice Wilkins i Rosalind Franklin. 1955-1956 Heinz Ludwig Fraenkel-Conrat i Robley C. Williams pe de o parte i A. Gierer i G. Schramm pe de alt parte, dovedesc c la unele virusuri ribovirusuri rolul de material ereditar este ndeplinit de ARN i nu de ADN. 1956 A. Kornberg realizeaz prima sintez de ADN in vitro. 1960 F. Jacob i J. Monod elaboreaz teoria operonului cu privire la reglajul genetic la PK. 1977 s-a descoperit c genele de la EK sunt alctuite din exoni i introni. 1981 Th. Cech descoper ribozimele la ARNr de la Tetrahymena. 1995 a fost secveniat genomul bacterian. 2001 a fost fcut public schia secvenei genomului uman.

3

COMPOZIIA CHIMIC A ACIZILOR NUCLEICIn materia vie, pe lng ap i alte substane anorganice, se gsesc patru categorii de compui bioorganici: glucide, lipide, proteine i acizi nucleici. Acizii nucleici sunt cele mai complexe substane de pe Terra. Ei reprezint substratul chimic al ereditii deoarece depoziteaz i opereaz cu informaia genetic, responsabil de toate trsturile unui organism. 1869 F. Miescher descoper n nucleii din celulele lizate din puroiul uman o substan pe care o numete nuclein. 1889 R. Altmann numete acid nucleic nucleina descoperit anterior de Miescher, deoarece i constat proprietile acide. 1903 Phoebus Aaron Theodore Levene analizeaz acidul nucleic din celulele de timus i l numete acid timonucleic (astzi ADN); constat c are n compoziie patru baze azotate A, G, C, T. 1909 P. A. T. Levene analizeaz celulele de drojdie i descoper un alt acid nucleic, pe care l numete acid zimonucleic (astzi ARN); constat c are n compoziie patru baze azotate A, G, C, U. Acidul timonucleic = ADN. Acidul zimonucleic = ARN Acizii nucleici sunt substane macromoleculare polimere. Unitile de baz sau monomerii din care sunt alctuii acizii nucleici se numesc nucleotide => acizii nucleici sunt compui polinucleotidici. Un nucleotid la rndul su este alctuit din trei componente: 1. Radical/i fosfat (1-3) 2. Glucid cu 5 atomi de C i grupare funcional aldehidic aldopentoz 3. Baz azotat

Nucleotid

Radicalul fosfat este comun tuturor nucleotidelor, att celor din ARN, ct i celor din ADN. ntr-un nucleotid se poate gsi un singur radical fosfat (n cazul nucleotidelor incluse n macromolecula polimer) sau se pot gsi doi sau trei radicali fosfat (nucleotidele libere). Pentoza este riboza (-D-ribofuranoza) n nucleotidele ARN i deoxiriboza (-D-2deoxi-ribofuranoza) n nucleotidele ADN.

a)

b)Pentoza din nucleotid: a) riboza; b) deoxiriboza

4

Baza azotat exist cinci baze azotate, toate fiind derivai de substituie de la pirimidin sau purin, fiind deci de dou tipuri, n funcie de nucleul de origine: purinice i pirimidinice.

Pirimidin este un heterociclu derivat de la benzen, avnd n alctuire 4 atomi de C i 2 atomi de N. Bazele azotate pirimidinice sunt: 1. Uracilul U 2,4-dicetopirimidin sau 2,4-dihidroxipirimidin (forme tautomere); se gsete exclusiv n ARN.

2. Timin T 5-metil-uracil sau 5-metil-2,4-dicetopirimidin; exist doar n ADN.

3. Citozin C 2-ceto-4-amino-pirimidin; se gsete att n ARN, ct i n ADN.

5

Purina este un heterobiciclu cu 5 atomi de C i 4 atomi de N, rezultat prin condensare unui inel pirimidinic (cu 6 atomi) cu un inel imidazolic (cu 5 atomi). Bazele azotate purinice sunt: 1. Adenina A 6-amino-purin; se gsete att n ARN, ct i n ADN.

2. Guanina G 2-amino-6-ceto-purin; se gsete att n ARN, ct i n ADN.

Legarea covalent a celor trei componente ntre ele: radicalul fosfat se leag la C5 al pentozei; legtura dintre o baz azotat pirimidinic i pentoz se face ntre N1 al bazei i C1 al pentozei; legtura dintre o baz azotat purinic i pentoz se face ntre N 9 al bazei i C1 al pentozei.

Baza azotat mpreun cu pentoza formeaz un/o nucleozid/. Nucleozidul mpreun cu 1-3 radical/i fosfat formeaz un/o nucleotid/ (denumit nucleozid-mono/di/tri-fosfat). Nucleozide din ARN: adenozin, guanozin, citidin, uridin; din ADN: deoxiadenozin, deoxiguanozin, deoxicitidin, (deoxi)timidin. Nucleotidele din ARN sunt: AMP adenozin-monofosfat, GMP guanozinmonofosfat, CMP citidin-monofosfat, UMP uridin-monofosfat. Nucleotidele din ADN sunt: dAMP deoxiadenozin-monofosfat, dGMP, dCMP, dTMP. n stare liber se gsesc i formele di- i trifosfat ale acestor nucleotide: ADP adenozin-difosfat, GDP, CDP, UDP, ATP, GTP, CTP, UTP, respectiv dADP, dGDP, dCDP, dTDP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

6

STRUCTURA PRIMAR A ACIZILOR NUCLEICIEste reprezentat de numrul, tipul i succesiunea/secvena nucleozidmonofosfailor legai covalent ntr-o monocaten de acid nucleic. Legtura covalent ntre dou nucleozide-monofosfat succesive se realizeaz prin intermediul radicalului fosfat al unui nucleozid i pentoza nucleozidului urmtor. Astfel, radicalul fosfat asigur legtura ntre C5 al unui nucleozid i C3 al pentozei nucleozidului urmtor, constituind o punte covalent fosfodiesteric (fosfo deoarece este realizat de acidul fosforic; diesteric deoarece acidul fosforic particip cu dou grupri OH la formarea a dou legturi esterice una cu OH de la C5 al pentozei unui nucleotid, cealalt cu OH de la C3 al pentozei nucleotidului succesiv).

Ca urmare a acestui mod de legare covalent prin puni fosfodiesterice ntre nucleozide succesive ntre atomii de C3 i C5, n final monocatena de acid nucleic va fi polarizat deoarece la un capt va rmne liber carbonul 5 al pentozei nucleotidului terminal, deoarece nu mai particip la o alt punte fosfodiesteric, iar la cellalt capt al monocatenei va rmne liber carbonul 3 al ribozei acestui nucleotid terminal.

7

Polaritatea monocatenelor de acid nucleic deriv din polaritatea nucleotidului prezint doi atomi de carbon diferii C3 i C5 care vor participa la legarea covalent a nucleotidelor succesive. De obicei la C5 terminal este legat covalent un radical fosfat, acest capt numindu-se captul 5-fosfat. Carbonul 3 de la cellalt capt rmne doar cu gruparea hidroxil i se numete capt 3-OH. Structura primar att a ARN ct i a ADN este reprezentat de monocatena polinucleotidic: poliribonucleotidic n cazul ARN i polideoxiribonucleotidic n cazul ADN. Legtura ntre componentele nucleotidului i ntre nucleotide succesive (1) n cazul ribonucleotidelor, pentoza este riboza i de ea se leag gruparea fosfat a nucleotidului respectiv, gruparea fosfat a nucleotidului urmtor i baza azotat astfel: dac baza azotat este pirimidinic legtura se face ntre C 1 al ribozei i N1 al bazei; dac baza azotat este purinic, legtura se face ntre C1 al ribozei i N9 al bazei purinice. Fosfatul propriu al nucleotidului se leag la C5 al ribozei, iar la C3 se va lega fosfatul nucleotidului urmtor. (2) n cazul deoxiribonucleotidelor legturile se fac identic.

Cazurile posibile de nucleozide: A-R, A-dR, G-R, G-dR, C-R, C-dR, U-R, T-dR, unde R riboz, dR deoxiriboz, A, G, C, T, U baze azotate. Monocatena de acid nucleic, ca urmare a modului de formare a punilor fosfodiesterice (3 5) este polarizat: prezint un capt 5-P i un capt 3-OH. Partea nespecific a monocatenelor de acizi nucleici este coloana glucidofosforic/pentozo-fosforic (alctuit din pentoze legate covalent prin puni fosfodiesterice). Componenta specific a fiecrei monocatene de acid nucleic este reprezentat de succesiunea (ordonarea) caracteristic (unic) pentru fiecare caten n parte a bazelor azotate n cadrul catenei. n cazul unui singur nucleotid, partea nespecific a acestuia este reprezentat de radicalul fosfat i de pentoz, comune tuturor nucleotidelor din ADN, respectiv din ARN. Partea specific a unui nucleotid, cea care l particularizeaz, este baza azotat.

8

Bazele azotate se fixeaz lateral, perpendicular pe axul glucido-fosforic, prin legtura atomului N1, respectiv N9 al bazei azotate i C1 al pentozei. Bazele azotate ale aceleiai catene nu prezint niciodat legturi ntre ele. De asemenea, prezena unei baze azotate la nivelul unui nucleotid nu exclude prezena nici uneia din cele patru baze azotate la nivelul celor dou nucleotide nvecinate bazele azotate ale unei catene au libertate complet de asociere n lungul catenei, fapt esenial pentru rolul de stocare a informaiei genetice (i care infirm ipoteza tetranucleotidului).

STRUCTURA SECUNDAR A ACIZILOR NUCLEICIEste reprezentat de structura bicatenar a acizilor nucleici. n general, moleculele de ARN au doar structur primar, fiind deci monocatenare (exist i excepii n cazul anumitor tipuri de ARN molecula monocatenar se pliaz pe ea nsi i se formeaz astfel regiuni bicatenare vezi ARNt). Deoarece ADN este o molecul bicatenar, de obicei se vorbete despre structura secundar a ADN. ADN este o macromolecul alctuit din dou monocatene ataate una de cealalt prin puni de hidrogen formate ntre bazele azotate aparinnd nucleotidelor din cele dou catene; cele dou monocatene sunt rsucite spiral (helical/elicoidal) spre dreapta rsucire dextrogir n jurul unui ax virtual comun. ADN macromolecul dublucatenar helical dextrogir. Cele dou monocatene ale dublului helix ADN sunt geometric paralele, dar biochimic antiparalele, deoarece fiecare monocaten este polarizat 5-3, dar ele sunt dispuse n molecula bicatenar invers orientate una fa de cealalt captului 5 al unei catene i corespunde captul 3 al celeilalte catene i invers.

9

Cele dou catene ale dublului helix sunt complementare, deoarece fiecrei baze azotate aparinnd unui nucleotid dintr-o caten i corespunde doar o anumit baz azotat a unui nucleotid din cealalt caten, cele dou baze corespondente, numite baze complementare, legndu-se prin puni de hidrogen. Exist doar patru mperecheri posibile de baze azotate, n fiecare pereche una fiind purinic, iar cealalt pirimidinic. Deoarece structura ADN a fost descoperit de Watson i Crick, aceste mperecheri posibile de baze azotate se numesc perechi Watson-Crick: A=T, T=A, GC i CG.

Legtura dintre cele dou monocatene se realizeaz prin punile de hidrogen care se formeaz ntre bazele azotate mperecheate pe criterii de complementaritate astfel: ntre A i T se formeaz dou puni de hidrogen, iar ntre G i C se formeaz trei puni de hidrogen. Perechile de baze Watson-Crick sunt perechi de baze complementare. Deoarece perechile Watson-Crick conin baze complementare rezult c i i monocatenele de ADN vor fi n ansamblul lor complementare i codeterminate (prezena unei baze azotate pe una dintre catene impune prezena pe cealalt caten a bazei azotate complementare). Acest fapt ne permite s deducem imediat secvena unei monocatene de ADN, cunoscnd-o pe cea a catenei complementare. 10

Macromolecula de ADN are diametrul constant pe ntreaga sa lungime, de 19-20 (1,9-2 nm), cu excepia neregularitilor periodice reprezentate de fosele (incizuri, anuri) major i minor, care sunt locuri preferate pentru interaciunea dintre ADN i proteine. La nivelul fosei majore se ataeaz factori proteici implicai n transcriere i traducere, iar la nivelul fosei minore se ataeaz histonele (proteine bazice cu rol structural n organizarea i stabilizarea cromatinei). Un tur de spir sau pasul elicei (distana liniar parcurs de helix ntrun tur complet) este de 34 (3,4 nm), iar fragmentul de ADN corespunztor unui tur de spir conine 10 perechi de baze complementare, deci distana dintre dou perechi succesive este de 3,4 (0,34 nm).

Dublul helix ADN este organizat steric astfel nct cele dou coloane glucido-fosforice sunt dispuse la exterior, iar perechile de baze azotate complementare sunt orientate spre interiorul moleculei, perpendicular pe axul lung al acesteia. Se poate realiza o analogie ntre structura secundar a ADN i o scar n spiral: balustradele scrii sunt cele dou coloane glucido-fosforice ale celor dou monocatene de ADN, iar treptele sunt perechile de baze azotate dintre coloane, care sunt dispuse 11

perpendicular pe axul virtual comun al macromoleculei i deci paralele ntre ele, dar ntre oricare dou asemenea perechi succesive formndu-se un unghi de 36 (360/10 perechi ntrun tur de spir).

Exist doar patru perechi de baze azotate complementare, n fiecare pereche obligatoriu o baz este purinic, iar cealalt este pirimidinic, deoarece dublul helix ADN avnd diametrul constant nu tolereaz mperecheri purin-purin sau pirimidin-pirimidin deoarece acestea perturb spaial diametrul helixului local macromolecula se poate ngusta sau lrgi.

Denaturare i renaturaren condiii fiziologice normale, macromolecula de ADN este o structur stabil. Stabilitatea este conferit de legturile fosfo-diesterice intracatenare, de legturile de hidrogen intercatenare (dou ntre A i T, trei ntre G i C, regiunile din ADN bogate n perechi GC fiind mai stabile dect cele bogate n perechi A=T) i de forele de stivuire (rezultate din suprapunerea perechilor de baze n cadrul structurii bicatenare). Aceste fore fac ca o molecul ADN cu minim 10 perechi de nucleotide s fie stabil la temperatura camerei. Peste 12

anumite limite de temperatur (limite care sunt situate n intervalul 63-100C) stabilitatea legturilor de hidrogen cedeaz, avnd drept consecin desfacerea dublului helix n cele dou monocatene complementare fenomen numit denaturare termic. Cea mai sczut temperatur de denaturare cunoscut este de 65C i se nregistreaz n cazul polinucleotidului poli-d(A=T). Denaturarea ADN poate fi cercetat studiind absorbana capacitate unei soluii ADN de a absorbi o radiaie cu o anumit lungime de und (se folosete radiaia UV). nclzirea treptat a unei soluii de ADN permite trasarea unei curbe de topire (bazat pe variaia absorbanei bazele azotate au absorbana mai mare dect a monocatenelor ADN, iar acestea au absorbana mai mare dect a moleculei bicatenare ADN, de aceea creterea absorbanei odat cu creterea temperaturii arat trecerea treptat a ADN de la starea bicatenar la cea monocatenar). Temperatura de topire cerut pentru denaturarea ADN constituie un indicator indirect asupra compoziiei n baze azotate a ADN un ADN bogat n perechi A=T va prezenta o temperatur de denaturare mai mic fa de un ADN n care predomin perechile GC. In vivo, ADN este o structur dinamic n care regiunile bicatenare se deschid frecvent (denatureaz local) formndu-se ochiuri sau bucle monocatenare, permind interaciunea cu diferite proteine. Acest fenomen este mai frecvent n regiunile bogate n perechi A=T, care sunt mai uor de desfcut deoarece conin mai puine puni de hidrogen. Acest tip de denaturare se numete denaturare fiziologic sau enzimatic i este realizat de ctre enzime i proteine de destabilizare a helixului (n replicarea ADN intervin helicazele i proteinele ssb vezi Replicarea ADN). n unele procese fiziologice, denaturarea este reversibil, la final refcndu-se structura bicatenar a ADN. Temperaturile mai mari de 100C rup legturile covalente ale coloanei glucidofosforice. Denaturarea termic este complet/total la temperaturi de peste 90C. i pH-ul influeneaz stabilitatea punilor de hidrogen, ADN-ul din soluiile cu pH mai mare de 11,3 fiind complet denaturat. Renaturarea (reasocierea) reprezint refacerea structurii native bicatenare a ADN pornind de la monocatene separate n prealabil prin denaturare. Se realizeaz la concentraii saline mari 0,150,5 M NaCl, iar temperatura trebuie s fie suficient de nalt (20-25C) pentru a elimina legturile de hidrogen intracatenare aprute la ntmplare. Dac amestecul de monocatene rezultate prin denaturarea dublului helix ADN se rcete brusc, monocatenele rmn permanent separate, acest ADN numindu-se ADN denaturat. Dac amestecul de monocatene se rcete treptat, lent, are loc reasocierea catenelor cu refacerea punilor de hidrogen dintre ele i restabilirea structurii bicatenare a ADN, numit ADN renaturat. Importana fenomenelor de denaturare i renaturare Prin renaturare, n funcie de procentul su i de vitez, se poate stabili relaia filogenetic dintre dou specii. De asemenea, se poate stabili i dac o anumit secven apare repetat n ADN (adic punerea n eviden a fraciilor de ADN repetitiv). Prin tehnica de renaturare in vitro s-au realizat hibrizi moleculari ADN-ADN i chiar ADN-ARN. Astfel, procentul de renaturare ntre monocatene ADN de la om i de la cimpanzeu este de aproximativ 90%, iar ntre monocatene ADN de la om i cele de la oarece este de doar 25%. Tehnica de renaturare ajut i la cartarea genelor prin hibridizarea in situ (fr extracie de ADN din celula de interes) se incubeaz cromosomii care se dorete a fi cartai cu molecule monocatenare de ADN sau ARN (sonde moleculare) cu secven cunoscut i marcate radioactiv sau fluorescent i se stabilete ulterior locul din cromosom unde sonda molecular s-a asociat prin complementaritate.

13

STRUCTURA ARN. TIPURI DE ARNARN este o molecul monocatenar poliribonucleotidic, care conine ribonucleotide (nucleotide care au n alctuire riboza, iar baza azotat este una dintre A, G, C i U). Anumite tipuri de ARN au o structur secundar rezultat prin plierea monocatenei, uneori chiar cu formarea de regiuni dublu catenare. n toate sistemele biologice i la unele virusuri, singura molecul care conine informaia genetic este ADN, iar ARN opereaz cu aceast informaie. n funcie de rol i de structur, exist mai multe tipuri de ARN: 1. ARNv (ARN viral) se ntlnete la unele virusuri la ribovirusuri precum virusul gripal, virusul poliomielitei, HIV etc. La aceste virusuri ARNv este purttorul de informaie genetic. 2. ARNr (ARN ribozomal) prezent n celulele procariote i eucariote n alctuirea subunitilor ribozomale, n care are rol att structural, ct i funcional catalitic (catalizeaz reacii din procesul de sintez a proteinelor care se realizeaz la nivelul ribozomului). Este sintetizat pe baza informaiei din ADN (ADNr = gene din ADN care codific pentru sinteza de ARNr) la nivelul nucleolului i tot aici diferitele tipuri de ARNr sunt asamblate cu proteine ribozomale (sintetizate n citoplasm i importate n nucleu), formndu-se subunitile ribozomale. Reprezint 80-90% din cantitatea total de ARN dintr-o celul. 3. ARNm (ARN mesager) reprezint 2-5% din ARN celular. Are dimensiuni variate, deoarece dimensiunea lui corespunde cu lungimea genei ADN a crei informaie o copiaz i o transport n citoplasm. Genele ADN conin informaia genetic, dar nu prsesc nucleul; ns utilizarea informaiei genetice se realizeaz n citoplasm. De aceea trebuie s existe o molecul cu valoare de mesager care s preia informaia din genele nucleare i s o transporte n citoplasm la aparatul de biosintez proteic, unde va fi folosit. Astfel, ARNm aduce la nivelul ribozomilor mesajul genetic copiat din ADN, mesaj care va fi folosit la sinteza unei proteine specifice. La procariote, ARNm care a copiat gena ADN este utilizat ca atare de ctre ribozomi. La eucariote exist un pre-ARNm (ARNm precursor) care copiaz informaia din ADN, dar care nu este utilizat direct de ctre ribozomi, ci dup o prelucrare n urma creia se formeaz ARNm matur (ARNmm). 4. ARNt (ARN de transport sau de transfer) este o molecul monocatenar mic, de cca. 80 nucleotide, care formeaz i regiuni bicatenare ca urmare a plierii pe ea nsi; are astfel o structur bidimensional n form de frunz de trifoi, fiind alctuit din patru brae bicatenare, trei dintre ele prezentnd terminal cte o bucl monocatenar, iar al patrulea coninnd capetele libere 3-OH i 5-P ale monocatenei. Uneori apare o bucl/bra suplimentar, numit bucl variabil.

14

Poriunile bicatenare sunt stabilizate prin puni de hidrogen formate ntre A i U, respectiv G i C. La captul 3-OH exist ntotdeauna 3 nucleotide ACC, iar la captul 5 exist ntotdeauna o G.

n molecula de ARNt se ntlnesc i baze azotate atipice i anume (psi) care nseamn pseudouracil, DHU dihidrouracil. De asemenea T este atipic pentru ARN. La nivelul buclei NODOC sau anticodon exist o triplet de nucleotide care individualizeaz pe fiecare din cele 40-60 de molecule de ARNt. Acest grup de nucleotide este complementar cu o triplet de nucleotide din ARNm (numit CODON) i cele 2 triplete se vor recunoate i lega prin puni de hidrogen la nivelul ribozomului n timpul sintezei proteice. La captul 3-OH, ARNt va lega un aminoacid activat i l va transporta n ribosom n vederea includerii ntr-o caten polipeptidic n procesul de biosintez proteic.

15

Deci, moleculele de ARNt sunt molecule adaptor, care transport aminoacizii n ribozomi i coreleaz mesajul genetic din ARNm cu sinteza proteinei. Modelul frunzei de trifoi reprezint structura secundar a ARNt deoarece prezint regiuni bicatenare cu aspect helical; ns molecula se rsucete tridimensional ntr-o structur cu aspect general al literei L ntors, reprezentnd structura teriar a ARNt. 5. ARNsn (ARN nuclear mic) are rol structural i catalitic n spliceosom = complex ARN-proteine care prelucreaz pre-ARNm. 6. ARNsno (ARN nucleolar mic) ajut la procesarea pre-ARNr n vederea formrii subunitilor ribozomale n nucleol. 7. SRP-ARN este component al SRP (particula de recunoatere a semnalului) = complex ARN-proteine care recunoate secvenele semnal ale proteinelor cu destinaie spre reticulul endoplasmic. 8. ARNsi (interferent mic) 9. ARNmi (microARN) Att ARNsi ct i ARNmi sunt implicai n reglarea expresiei genice. 10. XISTARN este implicat n procesul de inactivare prin heterocromatinizare a cromozomilor X suplimentari din celul. ntotdeauna ntr-o celul trebuie s existe un singur cromozom X funcional, cellalt sau ceilali fiind inactivai, rezultnd cromatina sexual sau corpusculul Barr. Toate tipurile de ARN de la 5 la 10 se numesc colectiv ARNhn (ARN heterogen).

16

FUNCIILE ADN-ULUIFUNCIA AUTOCATALITIC REPLICAREA SEMICONSERVATIV A ADN-ULUIADN are 2 funii: 1. funcia AUTOCATALITIC, prin care ADN i dirijeaz replicarea 2. funcia HETEROCATALITIC, prin care ADN dirijeaz sinteza diferitelor tipuri de ARN i a proteinelor. Existena n spaiu i timp a tuturor organismelor vii depinde de desfurarea a dou procese fundamentale: fotosinteza replicarea ADN Sinteza de noi molecule de ADN care s fie transmise din generaie n generaie, reprezint un proces de copiere unic n lumea vie numit replicare. Dintre toate moleculele din natur, ADN este unic prin abilitatea de a-i coordona propria replicare, pornind de la monomeri (nucleotide). Asemnarea descendenilor cu prinii se bazeaz tocmai pe replicarea exact, cu mare fidelitate a ADN-ului i transmiterea copiilor rezultate, dintr-o generaie n urmtoarea. Replicarea este caracteristic doar acizilor nucleici deoarece au o structur potrivit realizrii acestui proces, dar i datorit existenei i funcionrii unor mecanisme de control foarte riguroase. Replicarea asigur: o reproducerea fidel i continuitatea fenomenului ereditar. o dublarea, la fiecare generaie, a cantitii de informaie genetic, care are drept consecin multiplicarea sistemelor biologice. Principiul fundamental al replicrii este c dintr-o molecul iniial de ADN = ADN parental, rezult 2 molecule fiice identice ntre ele i identice cu molecula parental care dispare ca entitate distinct, ns se regsete pe jumtate n fiecare din cele 2 molecule fiice, adic exist pe jumtate n fiecare molecul fiic de ADN (se spune c molecula parental de ADN i topete identitatea n cele dou molecule fiice care rezult prin replicare).

Principiile sistemelor autoreplicative 1) Informaia genetic din acizii nucleici este reprezentat de secvena de baze azotate i de aceea rolul oricrei modaliti de replicare este dublarea secvenei de baze a moleculei parentale pentru ca descendenii s primeasc aceeai informaie genetic (ereditate). 2) Exactitatea autoreproducerii este dat de specificitatea mperecherii dintre bazele azotate (A cu T i G cu C), acesta fiind mecanismul esenial al autoreplicrii. 17

3) Nucleotidele (monomerii) sunt adugate individual la captul unei catene n cretere de ctre o enzim polimerizatoare. 4) n toate cazurile de sintez de acizi nucleici este utilizat o matri reprezentat de o caten polinucleotidic preexistent numit caten matri. 5) Secvena de baze azotate din catena fiic (numit caten replic) este complementar secvenei de baze azotate a catenei parentale copiate. n cursul istoriei geneticii moleculare au existat 3 modele care s explice replicarea ADN: 1) Modelul dispersiv la finalul replicrii toate cele 4 catene ADN reprezint un amestec, un mozaic de ADN nou i ADN vechi. 2) Modelul conservativ molecula parental, dup replicare, se reasambleaz, iar cele 2 catene replic se asambleaz ntre ele, formnd o molecul fiic de ADN cu totul nou. Molecula parental deci se conserv. Obs: Aceste 2 modele sunt greite. Replicarea ADN nu se face nici dispersiv, nici conservativ. 3) Modelul semiconservativ a fost propus n 1953 de J. D. Watson i F. H. C. Crick i prezice c n urma replicrii sau duplicrii unui dublu helix ADN, fiecare din cele 2 molecule fiice va conine o caten veche (provenit din molecula parental) i o caten nou sintetizat, deci molecula parental se pstreaz sau conserv pe jumtate (semi) n fiecare din cele dou molecule fiice rezultate.

Replicarea semiconservativ a ADN18

Bacteriile au ca material genetic un singur cromozom circular (o singur macromolecul de ADN dublu catenar circular nchis covalent) care la Escherichia coli are cca. 4,6 milioane perechi de baze. La Homo sapiens exist 46 de cromozomi, adic 46 de molecule de ADN dublu catenar liniar, care nsumeaz cca. 6 miliarde de perechi de baze. La speciile de eucariote, care au o cantitate de ADN mult mai mare dect procariotele, replicarea ntregului material genetic nu dureaz foarte mult deoarece fiecare molecul parental de ADN se replic din mai multe puncte simultan => copiere rapid. La cromozomul bacterian exist un singur punct din care ncepe replicarea, iar la cromosomii celulelor eucariote mai multe puncte. Replicarea unor asemenea cantiti enorme de informaie genetic se face cu foarte puine erori (1/1010 nucleotide), deci copierea ADN este remarcabil prin vitez i prin precizie. In vivo, sinteza acizilor nucleici se realizeaz n 3 etape: 1) sinteza precursorilor nucleotidelor purinice (acidul inozinic) i pirimidinice (acidul uridilic). 2) sinteza nucleotidelor n ADN: dATP, dGTP, dCTP, dTTP; n ARN: ATP, GTP, CTP, UTP. 3) polimerizarea ordonat a nucleotidelor n secven complementar cu o matri, proces numit replicare. Replicarea ADN se desfoar dup modelul unui fermoar: acesta se desface treptat, formndu-se un ochi de replicare ale crui capete n form de Y, numite bifurcaii de replicare, se deschid n continuare expunndu-se treptat cele 2 matrie lng care se aeaz succesiv prin complementaritate nucleotide-trifosfat libere, care vor fi legate covalent n cte o caten replic prin intervenia a numeroase enzime. Acest mecanism al replicrii de tip fermoar se desfoar n 3 etape: 1) Iniierea replicrii 2) Alungirea catenelor replic 3) Terminarea replicrii

I. Iniierea replicriiReplicarea ncepe din locuri speciale ale moleculei de ADN numite origini ale replicrii. Cromozomul bacterian are o singur origine a replicrii numit Ori C. Cromozomul eucariot este liniar i mult mai mare i are mai multe origini ale replicrii. Aceste locuri speciale din ADN (originile) sunt bogate n perechi A=T (numrul mic de legturi de hidrogen face ca dublul helix s fie uor de desfcut n aceast regiune) mrginite de perechi G C. G G C G C C G C AATATTAATATTTATAA C C G G C G C C ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| || || || || || || || || || || || || || || || || || ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| C C G C G G C G TTATAATTATAAATATT G G C C G C G G 1) La nivelul originii replicrii se ataeaz o enzim i desface dublul helix separnd cele dou monocatene ncepnd din zona cu perechile A=T, prin ruperea punilor de hidrogen dintre acestea. Aceast enzim este helicaza. n urma interveniei helicazei se formeaz un ochi de replicare care are la capete bifurcaii de replicare care avanseaz i la nivelul crora se vor alungi catenele replic. La fiecare bifurcaie de replicare acioneaz cte o helicaz care determin desfacerea n continuare a dublului helix dup modelul fermoarului. 2) Topoizomerazele sunt enzime care intervin asupra dublului helix i i determin modificri topologice (de conformaie spaial) de tip relaxare sau supratensionare. Topoizomeraza I acioneaz pe molecula parental de ADN n aval de helicaz i relaxeaz dublul helix permind helicazei s avanseze. Topoizomeraza se ataeaz la dublul helix ADN i taie una dintre catenele acestuia/introduce o cresttur monocatenar, rezultnd dou capete libere. Unul dintre capete se rsucete de cteva ori n jurul catenei ntregi, care 19

funcioneaz ca pivot; astfel, tensiunea acumulat n dublul helix ADN ca urmare a avansrii helicazei este anulat; ulterior, topoizomeraza re-unete covalent cele dou capete libere, refcnd continuitatea catenei. n absena topoizomerazei, la un moment dat, prin intervenia helicazei, dublul helix ar deveni supratensionat, iar helicaza nu ar mai putea s avanseze. 3) Proteinele ssb sunt proteine de legare la monocaten (single strand binding) sau proteine de destabilizare a dublului helix (HDP). Pe msur ce ochiul de replicare se mrete prin intervenia helicazei, cele dou monocatene libere au tendina de a se apropia una de cealalt i de a-i reface punile de hidrogen (refcnd astfel dublul helix) situaie incompatibil cu replicarea. Acest fenomen se numete renaturare reasocierea monocatenelor ntr-un dublu helix. Pentru a fi mpiedicat renaturarea, de fiecare monocaten a ochiului de replicare se ataeaz proteinele ssb. 4) ARN-polimeraza dependent de ADN (primaza) este o enzim polimerizatoare de ribonucleotide, cataliznd sinteza unor fragmente de ARN pe matria ADN. Nu are specificitate de sens, adic se poate deplasa spre ambele capete ale matriei ADN.

Are specificitate de secven, adic recunoate i se leag la o anumit zon din ADN care conine o anumit secven se nucleotide. Catalizeaz sinteza, pe matria ADN, a unui scurt fragment de ARN (oligoribonucleotid) care are 6-8 (5-10) ribonucleotide i se numete primer; primerul ofer ADN-polimerazei captul 3-OH. Primaza are capacitatea de a sintetiza de novo (de la zero) oligoribonucleotide.

II. Alungirea catenelor replic5) ADN-polimeraza III (enzima polimerizatoare propriu-zis de la PK) La procariote exist trei ADN-polimeraze: ADN-polimeraza I (enzima lui Kornberg), ADN-polimeraza II i ADN-polimeraza III care este enzima polimerizatoare propriu-zis. Polimeraza I intervine n excizia primerilor i umplerea golurilor rmase cu deoxiribonucleotide i n corecia citirii. ADN-polimeraza II se consider c este implicat n recombinarea genetic. La eucariote exist cca. zece ADN polimeraze, dintre care ADN-polimeraza este enzima polimerizatoare propriu-zis. Nici o ADN polimeraz nu are specificitate de secven, adic nu are nevoie de o zon sau o secven anumit din ADN pe care s o recunoasc, la care s se lege i de la care s nceap polimerizarea. Toate ADN-polimerazele au specificitate de sens, adic se deplaseaz pe matria ADN ntotdeauna n sens 3-5, i deci catalizeaz sinteza catenei replic n sens 5-3, adic n sens antiparalel. ADN-polimerazele nu pot sintetiza de novo o caten ADN, doar pot s continue alungirea unei catene preexistente. Pentru a continua alungirea unei catene preexistente, au 20

nevoie de captul 3-OH al acestei catene pe care l va recunoate, la care se va lega i ncepnd de la care va aduga succesiv nucleotide libere, fiecare nou nucleotid fiind legat la cel precedent printr-o punte fosfodiesteric.

ADN-polimerazele au n molecul trei situsuri specifice: 1) situs pentru captul 3-OH al catenei n curs de alungire 2) situs pentru ataarea la matri 3) situs pentru nucleotidul liber care urmeaz a fi ataat covalent la catena n curs de alungire. n urma activitii helicazei se formeaz ochiul de replicare alctuit din cele dou monocatene ADN cu rol de matrie i care au polariti opuse, fiind antiparalele.

Pe matria 3-5, n originea replicrii acioneaz primaza care catalizeaz sinteza unui primer. Acesta ofer captul su 3-OH unei ADN polimeraze, care ncepe s alungeasc n mod continuu n sens 5-3 o caten replic, polimeraza deplasndu-se pe matri n sens 35 (spre bifurcaia de replicare). Catena replic astfel sintetizat este o caten conductoare (leading strand). Deci pe matria 3-5 acioneaz primaza o singur dat, iar ADNpolimeraza III (n cazul procariotelor) se ataeaz la matri o singur dat i alungete catena replic, ncepnd de la captul 3-OH al primerului, n mod continuu, pn la completa copiere a respectivei matrie a ADN-ului parental. 21

Pe cealalt caten matri, 5-3, catena replic va crete tot spre bifurcaia de replicare dar n mod discontinuu, deoarece ADN-polimeraza III sintetizeaz catena replic n mod fragmentar i n sens opus bifurcaiei de replicare. Astfel, iniial, pe catena matri 5-3 intervine, la nivelul bifurcaiei, primaza i sintetizeaz un primer de la care ADN polimeraza va sintetiza napoi, n sens 3-5 (spre originea replicrii) un fragment de ADN = fragment Okazaki. Ochiul de replicare se mrete prin desfacerea n continuare a monocatenelor ADN, iar bifurcaia de replicare avanseaz. Din nou, la nivelul bifurcaiei acioneaz primaza care sintetizeaz un nou primer de la care ADNpolimeraza III va sintetiza un nou fragment Okazaki spre primerul precedent. Deci pe matria 5-3, ADN-polimeraza III i primaza acioneaz de mai multe ori, cataliznd sinteza unei catene replic alctuit n prim faz din fragmente ADN (100-200 nucleotide la eucariote i 1000-2000 nucleotide la procariote), intercalate/care alterneaz cu primeri. Alungirea acestei catene se face tot n sensul avansrii bifurcaiei de replicare, dar deoarece ADN-polimeraza III sintetizeaz fragmentele n sens invers (fiecare fragment Okazaki se alungete n sens 53), alungirea net a catenei replic este puin defazat temporal fa de alungirea celeilalte catene replic i de aceea catena replic sintetizat discontinuu se numete caten replic ntrziat (lagging strand). 6) ADN-polimeraza I = enzima lui Kornberg ADN-polimeraza I are toate caracteristicile unei ADN polimeraze, ns nu este enzim polimerizatoare propriu-zis. Deoarece o monocaten de ADN nu poate s conin ribonucleotide, primerii trebuiesc ndeprtai, att cel din catena conductoare, ct i cei din catena ntrziat. Excizia primerilor o realizeaz ADN-polimeraza I. n urma exciziei rmn goluri n catenele replic, umplerea lor cu deoxiribonucleotide fiind asigurat tot de ADN-polimeraza I. Dup ndeprtarea primerului, ADN polimeraza I se leag la captul 3-OH rmas liber al fragmentului Okazaki urmtor i adaug succesiv deoxiribonucleotide complementare matriei spre fragmentul Okazaki precedent - cel al crui primer a fost excizat, fragment care are captul 5-P liber. Activitatea ADN-polimerazei I de excizie a primerilor = activitate RN-azic (ribonucleazic). ADN-polimeraza I completeaz integral golul lsat n urma exciziei primerului, dar nu poate s realizeze ultima legtur covalent fosfodiesteric ntre captul 3OH al fragmentului de ADN pe care l-a sintetizat n locul primerului i captul 5-P al fragmentului Okazaki (al crui primer a fost nlocuit) din catena replic. 22

Primerul primului fragment Okazaki Primul fragment Okazaki

Primerul celui de-al doilea fragment Okazaki Al treilea fragment Al doilea fragment Okazaki Okazaki

3 3 5 3 5 3

5 5 Fragment deoxiribonucleotidic sintetizat de ADN-polimeraza I n locul primerului excizat

3

5 3

5 3

5

7) ADN-ligaza realizeaz legtura covalent ntre captul 3-OH al fragmentului de ADN sintetizat de polimeraza I i captul 5-fosfat al fragmentului Okazaki precedent, stabilind astfel continuitatea covalent a catenei replic. 8) Topoizomerazele acioneaz pe fiecare din cele 2 molecule-fiice de ADN rezultate, introducnd spiralizri, stabilindu-le astfel conformaia tridimensional normal, helical dextrogir.

23

III. Terminarea replicriiLa procariote, replicarea se ncheie cnd enzimele implicate n replicare (ADNpolimeraza III) ajung ntr-un punct T (punct terminus al replicrii) de pe macromolecula de ADNdc circular, punct situat diametral opus lui Ori C. La eucariote, replicarea se ncheie prin fuzionarea tuturor ochiurilor de replicare i prin desprinderea enzimelor de pe moleculele-fiice de ADN rezultate, fiecare ochi de replicare avnd la capetele sale cte un punct terminus al replicrii. Totalitatea proteinelor i enzimelor implicate n replicare constituie REPLISOMUL. REPLICONUL este unitatea din ADN n care se desfaoar un singur eveniment replicativ; conine n mod obligatoriu i definitoriu o origine a replicrii i un punct terminus al replicrii. Cromosomul bacterian este o structur monorepliconic, adic are o singur origine i un singur punct terminus.

24

Cromosomii de la eucariote sunt structuri multirepliconice au mai multe origini ale replicrii i se vor forma mai multe ochiuri de replicare ntr-un singur cromozom.

25

CODUL GENETICntreaga organizare molecular a organismelor se bazeaz pe existena i funcionarea proteinelor. Unele proteine au rol structural, iar altele diverse roluri funcionale (ex. enzime). Proteinele sunt polimeri de aminoacizi; o protein este caracterizat prin numrul, tipul i succesiunea aminoacizilor din alctuirea ei, trsturi care i definesc structura primar. Exist 20 de aminoacizi uzuali, din care sunt constituite n mod curent proteinele: glicin (Gly), alanin (Ala), izoleucin (Ile), valin (Val), cistein (Cys), serin (Ser), metionin (Met), leucin (Leu), triptofan (Trp), fenilalanin (Phe), histidin (His), acid aspartic (Asp), asparagin (Asn), acid glutamic (Glu), glutamin (Gln), arginin (Arg), prolin (Pro), tirozin (Tyr), lisin (Lys), treonin (Thr). Iniial s-a considerat c informaia genetic (care este foarte divers i n cantitate mare, n strns legtur cu numrul de caractere) este deinut de proteine, care prezint un numr suficient de mare de uniti diferite (monomerii aminoacizii) ca s realizeze foarte multe combinaii diferite, fiecare combinaie fiind rspunztoare de un caracter. La nceputul sec. al XX-lea, Levene a enunat teoria tetranucleotidului conform creia ADN este alctuit dintr-o succesiune monoton de 4 nucleotide (AGCT)n. Ipoteza lui Levene s-a dovedit greit. Experimentul lui O. T. Avery din 1944 a infirmat aceaste teorii (rolul codificator al proteinelor i monotonia ADN) i s-a dovedit c informaia genetic este coninut (codificat biochimic) n ADN. S-a demonstrat ulterior c proteinele sunt sintetizate pe baza informaiei din ADN. Deci aceast informaie trebuie s precizeze, pentru fiecare protein n parte, numrul de aminoacizi, tipul aminoacizilor i poziia fiecruia n protein, adic structura primar a proteinei. A aprut ns curnd o problem: numrul foarte mare de caractere implic un numr foarte mare de molecule sau secvene ADN diferite necesare pentru codificarea tuturor caracterelor. Dar numrul de uniti diferite din alctuirea ADN este mic i anume patru uniti diferite cele patru tipuri de nucleotide. Cum reuesc doar aceste patru uniti s constituie o aa de mare diversitate de secvene ADN care s codifice ntreaga diversitate a proteinelor? Deci cele patru nucleotide ale ADN trebuie s se organizeze cumva astfel nct s codifice caracteristicile structurii primare a proteinelor. Dac un aminoacid ar fi codificat de un sigur nucleotid, ar fi acoperii patru aminoacizi i deci ar rmne 16 aminoacizi pe care nu ar avea cine s-i codifice. Dac un aminoacid ar fi codificat de o pereche/dublet de nucleotide, deoarece se pot forma cu cele patru nucleotide doar 16 asemenea dublete diferite, tot ar rmne patru aminoacizi pentru care nu ar exista dublete codificatoare. De aceea, singura variant posibil pentru ca toi cei 20 de aminoacizi s aib cte o unitate codificatoare n ADN este ca aceast unitate s fie alctuit din cte trei nucleotide triplete de nucleotide numite codoni. Cu cele patru nucleotide din ADN se pot forma n total 64 de codoni diferii (combinaii de cte trei nucleotide, 4 3 = 64), care s codifice pentru cei 20 de aminoacizi uzuali. Deci, n ADN unitatate codificatoare pentru un aminoacid este secvena de trei nucleotide succesive numit codon.

26

Codul genetic este o colecie de triplete de nucleotide (codoni) care determin structura primar a proteinelor, n esen preciznd poziia aminoacizilor n catena polipeptidic. Codificarea biochimic presupune traducerea informaiei ereditare din secvena de baze azotate a acidului nucleic ntr-o secven de aminoacizi din catena polipeptidic. ntre secvena de nucleotide din ADN i secvena de aminoacizi din catenele polipeptidice exist o strns coresponden numit coliniaritate. Unitatea de codificare genetic este codonul, iar codul genetic reprezint totalitatea celor 64 de codoni. Exista 2 tipuri de cod genetic : - cod genetic informaional reprezentat de succesiunea sau secvena de codoni din ADN ; acesta este perpetuat si conservat prin replicare de-a lungul generaiilor. - cod genetic operaional care copiaz prin complementaritate pe cel informaional i este reprezentat de secvena de codoni din ARNm, secven care va fi folosit direct n sinteza proteinelor; acest cod genetic nu este depozitar de informaie genetic, ci doar depozitar de mesaj genetic, nefiind peren (permanent) i transmisibil i funcioneaz doar temporar. Codul genetic operaional = secvena de ribonucleotide a unui ARNm matur (ARNmm), organizat n codoni i care decide la nivelul ribozomilor numrul, ordinea i tipul aminoacizilor n catena polipeptidic. Pentru un ARNmm dat, totalitatea codonilor cuprins ntre un codon START i un codon STOP constituie cadrul de citire. Codul genetic ARN conine 64 de codoni, dintre care: 61 codoni sens codoni care codific pentru cte un aminoacid. Dintre acetia codonul AUG este codon START. 3 codoni nonsens (UAA, UAG, UGA) i au rol de codoni STOP: nu codific pentru vreun aminoacid, doar marcheaz terminarea mesajului genetic.

Caracteristicile codului genetic1. Codul genetic este neacoperit sau nesuprapus: secvena de ribonucleotide a ARNmm este organizat n codoni individuali, codonii vecini neavnd nucleotide comune. 2. Codul genetic este far virgule: secvena de ribonucleotide a ARNmm este citit n ribozomi n mod continuu, codon dup codon, ntre codoni neexistnd semne de punctuaie. 3. Codul genetic este redundant sau degenerat: exist 61 de codoni sens, dar doar 20 de aminoacizi rezultnd c mai muli codoni numii codoni sinonimi vor codifica pentru acelai aminoacid. Excepii de la redundan: UGG i AUG. 4. Codul genetic este universal: n toate sistemele supramoleculare, de la virusuri la om, aceiai codoni codific pentru aceiai aminoacizi. 27

CODUL GENETIC OPERAIONALU U UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG Fenilalanin Leucin UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG C Serin UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG A Tirozin STOP Histidin Glutamin Asparagin Lizin Acid aspartic Acid glutamic UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G Cistein STOP Triptofan Arginin U C A G U C A G U C A G U C A G

C

Leucin

Prolin

A

Izoleucin Metionin/START Valin

Serin Arginin

Treonin

G

Alanin

Glicin

Codonul GUG n mod tipic codific pentru valin, dar foarte rar are rol i de codon START. Codul genetic mitocondrial. UGA este codon sens i codific pentru triptofan. UAA, UAG, AGA i AGG sunt codoni STOP. AUA, AUU, AUG sunt codoni START. AUU este i codon sens, codificnd pentru izoleucin, iar AUA codific pentru metionin.

28

FUNCIA HETEROCATALITIC A ADN-ULUI DE LA GEN LAPROTEIN

Genele sau factorii ereditari sunt unitaile structural-funcionale ale fenomenului ereditar. Definiia 1: Gena este un segment din macromolecula de ADN la toate organismele (sau de ARN la ribovirusuri) care conine informaia ereditar ce dirijeaz sinteza unei anumite catene polipeptidice. Definiia 2: Gena este o regiune din ADN al crei produs final este fie un polipeptid, fie o molecul de ARN. 1. 2. ADN are 2 funcii: funcia autocatalitic prin care dirijeaz propria sintez (replicare) funcia heterocatalitic prin care dirijeaz sinteza proteinelor.

Procesul prin care ADN dirijeaz sinteza proteinelor = expresie genic. Etape n stabilirea relaiei gen-produsul ei final 1. gena codific pt.enzim 2. gena protein 3. gena caten polipeptidic 4. gena caten polipeptidic sau un tip de ARN 29

Expresia genelor are drept finalitate sinteza unei proteine. Acest proces se realizeaz n dou etape: a) transcrierea (transcripia) = copierea informaiei genetice dintr-o gen ADN ntr-o macromolecul de ARNm. b) traducerea (translaia) = sinteza catenei polipeptidice pe baza mesajului genetic din ARNm. Deci ntre gen (ADN) i protein se interpune ARN.

Dogma central a geneticiireplicare

ADN

transcrierereverstranscriere

ARN

traducere

protein

Fluxul de informaie de la ADN la proteine poate fi descris n termeni lingvistici deoarece ambele tipuri de molecule sunt polimere i se poate considera c sunt alctuite dintro succesiune de cuvinte aparinnd la dou limbi diferite, dar corespondente (adic unui cuvnt din limba ADN i corespunde un cuvnt din limba proteinelor). Deci ADN i proteinele conin informaie scris n dou limbi chimice diferite (codonii n acizi nucleici i aminoacizii n proteine).

Transcrierea generalitiTranscrierea = sinteza ARN dirijat de ADN. Deoarece ambele tipuri de acizi nucleici utilizeaz acelai limbaj chimic (nucleotidele), informaia este doar transcris (scris dintr-o parte n alta). Ca i n replicare, catenele ADN constituie matrie pentru sinteza unei monocatene complementare, ns n locul T va fi inclus U ca baz azotat complementar lui A din catena matri ADN. Aceast molecul de acid nucleic care copiaz informaia din ADN i o va folosi n sinteza proteinelor este ARNm. Transcrierea ns este un termen general folosit pentru a descrie copierea informaiei din ADN n orice tip de ARN.

Traducerea generalitiTraducerea = sinteza efectiv de polipeptide, proces dirijat de ARNm. 30

Celula traduce secvena de ribonucleotide, organizat n codoni, din ARNm n secvena de aminoacizi a unei catene polipeptidice. Procesul se realizeaz la nivelul ribozomilor care asigur legarea covalent, ordonat a aminoacizilor ntr-o caten polipeptidic conform mesajului din ARNm. De ce este necesar ARNm? De ce nu este utilizat direct n traducere macromolecula de ADN? 1. pentru protejarea ADN i a informaiei genetice. 2. ADN poate fi copiat n mai multe molecule de ARNm pentru aceeai gen i deci pot fi sintetizate simultan mai multe copii ale aceleiai proteine. Principiile generale ale transcrierii sunt aceleai la procariote i la eucariote, ns mecanismul este puin diferit deoarece procariotele nu au materialul genetic protejat ntr-un nucleu. De aceea: la procariote cele dou procese se desfoar n acelai compartiment celular n citoplasm, cvasisimultan (aproape simultan). la eucariote cele dou procese sunt separate spaial i temporal, transcrierea avnd loc n nucleu, iar traducerea n citoplasm. n urma transcrierii unei gene, la procariote rezult direct un ARNmm; la eucariote rezult un ARNm precursor = pre-ARNm care este prelucrat rezultnd ARNmm care iese din nucleu i va fi tradus n proteine la nivelul ribozomilor. Pre-ARNm reprezint transcriptul primar.

31

TRANSCRIEREAARN-polimeraza recunoate o secven specific de nucleotide din ADN secven numit promotor i care marcheaz/conine locul unde trebuie s nceap transcrierea, se leag la acest nivel de ADN, realizeaz denaturarea local a dublului helix ADN i va cataliza polimerizarea (legarea covalent) ribonucleotidelor aliniate prin complementaritate pe una din cele dou catene ADN care va funciona ca matri, rezultatul fiind o molecul de ARN. ARN polimeraza sintetizeaz catena sau transcriptul ARN n direcia 5-3, deci alunec pe matri n direcia 3-5. ns ARN polimeraza nu necesit primer, putnd iniia de novo sinteza unei catene ARN. La procariote locul din ADN unde se ncheie transcrierea se numete terminator, caracterizat de asemenea de o secven specific de nucleotide. Promotorul este situat n amonte de terminator. Segmentul de ADN care este transcris constituie o unitate de transcriere.

Procariotele au o singur ARN polimeraz pentru transcrierea tuturor tipurilor de ARN. Eucariotele au trei ARN polimeraze: ARN-polimeraza I, ARN-polimeraza II, ARNpolimeraza III, dintre care ARN-polimeraza II catalizeaz sinteza ARNm. Transcrierea se realizeaz n trei etape: 1. Legarea ARN-polimerazei la catena ADN i iniierea transcrierii: Promotorul unei gene ncorporeaz i punctul de start al transcrierii (nucleotidul de unde ncepe efectiv sinteza ARN) i se extinde pe cteva zeci de nucleotide n amonte de punctul de start. Promotorul are trei funcii importante: servete ca situs de ataare a ARN-polimerazei. determin locul de unde ncepe transcrierea. determin care dintre cele dou catene de ADN va fi folosit ca matri. La procariote ARN-polimeraza recunoate singur promotorul i se leag la acesta fr ajutorul unor intermediari. La eucariote legarea ARN polimerazei II la promotor i iniierea transcrierii sunt mediate de proteine numite factori transcripionali. Doar dup ce anumii asemenea factori se ataeaz la promotor se va lega i ARN polimeraza II. Ansamblul ARN polimeraza II + factori transcripionali legai la promotor constituie i se numete complexul de iniiere a transcrierii. 32

Promotorii de la eucariote includ o secven particular situat cu 25 de nucleotide n amonte de punctul de start numit cutia TATA (TATA-box), situat pe catena ADN care nu va funciona ca matri n transcriere.

2. Alungirea catenei ARN: ARN-polimeraza se deplaseaz pe ADN, desface dublul helix i expune 10-20 de baze ADN la care se mperecheaz prin complementaritate ribonucleotide (formnd puni de hidrogen) care sunt adugate succesiv la captul 3-OH al catenei ARN n cretere de ctre ARN-polimeraz. n urma ARN-polimerazei, catena ARN sintetizat se desprinde de matria ADN, iar cele dou catene ADN renatureaz.

33

La eucariote rata de transcriere este de 60 de nucleotide pe secunde. O singur gen poate fi transcris simultan de mai multe ARN polimeraze care acioneaz succesiv pe matri, rezultnd mai multe molecule de ARNm pentru aceeai protein i ca urmare se vor sintetiza mai multe catene polipeptidice identice ntr-un timp mai scurt. 3. Termina(liza)rea transcrierii: Mecanismul este diferit la procariote fa de eucariote. La procariote transcrierea se realizeaz pn la o secven terminator. Secvena terminator transcris (este deci o secven din molecula de ARN) funcioneaz ca semnal de terminare, determinnd detaarea/desprinderea de ADN a ARN-polimerazei i eliberarea transcriptului care este disponibil pentru utilizare direct, imediat ca ARNm. La eucariote, pre-ARNm este tiat din catena ARN n cretere n timp ce ARNpolimeraza II continu s transcrie ADN-ul. Polimeraza transcrie o seven din ADN numit secven pentru semnalul de poliadenilare, care codific pentru semnalul de poliadenilare (AAUAAA) din pre-ARNm. Apoi la 10-35 nucleotide n aval de semnalul AAUAAA, proteine asociate cu ARN n cretere l taie din transcriptul ARN elibernd pre-ARNm. ARNpolimeraza continu s transcrie sute de nucleotide n aval de locul unde a fost tiat preARNm, iar terminarea transcrierii se realizeaz prin cderea sau desprinderea ARNpolimerazei de pe ADN, prin mecanism incomplet cunoscut.

34

PROCESAREA PRE-ARNmSunt dou tipuri de modificri pe care le sufer pre-ARNm: I. Modificarea capetelor pre-ARNm a) bonetarea (cpcirea) captului 5: acest capt este este primul transcris i nainte de a se finaliza transcrierea la acesta se adaug covalent o fosfoguanozin numit bonet (sau cap 5) b) poliadenilarea: dup terminarea transcrierii, la captul 3 (care a fost ultimul transcris) este adugat enzimatic o succesiune de 50-250 de nucleotide cu adenin, adic preARNm este poliadenilat la captul 3, rezultnd o coad poli-A.

35

Rolurile bonetei i ale cozii poli-A: faciliteaz exportul ARNmm din nucleu n citoplasm. protejeaz ARNm de degradarea enzimatic. odat ARNmm ajuns n citoplasm, ambele structuri ajut ribozomul s se ataeze la captul 5 al acestuia. II. Editarea ARNm (splicing) O unitate transcripional ADN are n medie circa 8000 nucleotide. Fiecare aminoacid este codificat de un codon (trei nucleotide), deci pre-ARNm va avea 8000 de nucleotide, dar doar 1200 de nucleotide vor codifica pentru o protein de 400 de aminoacizi; deci genele ADN i transcriptele lor primare au regiuni, secvene mari non-informaionale, netraduse. Aceste secvene non-informaionale (necodificatoare) se numesc introni i sunt intercalate printre secvenele codificatoare (care se numesc exoni) ale genei, deci i printre secvenele codificatoare ale pre-ARNm. La sinteza unui transcript primar ARN, ARN-polimeraza II transcrie i intronii i exonii din gena ADN, dar molecula de ARNm ajunge n citoplasm doar cu exonii. Intronii sunt excizai din pre-ARNm, iar exonii sunt unii la loc rezultnd un ARNmm cu secven informaional continu, alctuit n ntregime din codoni.

36

Acest proces de excizie a intronilor i sudare a exonilor se numete splicing. Procesul este realizat de ctre spliceosom alctuit din proteine + ARNsn; spliceosomul interacioneaz cu anumite situsuri din introni, excizeaz intronii i unete capetele celor doi exoni care flancau (mrgineau) intronul. pre-ARNmE15

I1

E2

I2

E33

C

bonet

E15

E2

E3

Coad poli-A 3

spliceosom

nve

Coad poli-A 5 3

ARNmm

TRADUCEREA (SINTEZA PROTEINELOR)37

n procesul traducerii o celul interpreteaz mesajul genetic i construiete o protein n conformitate cu acesta. Mesajul este reprezentat de o succesiune de codoni n lungul ARNm, iar interpretul (sau traductorul) este ARNt. Funcia ARNt este de a transfera aminoacizi din soluia citoplasmatic la ribozomi. n citoplasm exist toate cele 20 de tipuri de aminoacizi, fie sintetizai de ctre celul din alte substane, fie preluai din mediul extracelular. Ribozomul adaug fiecare aminoacid adus de ARNt la captul n cretere al unei catene polipeptidice. Moleculele de ARNt nu sunt identice. Cheia traducerii mesajului genetic ntr-o secven specific de aminoacizi este reprezentat de faptul c fiecare tip de ARNt traduce un anumit codon din ARNm ntr-un anumit aminoacid. ARNt sosete la ribozom purtnd un aminoacid specific la un capt, iar la cellalt capt al ARNt este o triplet de nucleotide = anticodon care se mperecheaz prin complementaritate cu codonul adecvat din ARNm. De ex.: anticodonul AAA se mperecheaz cu codonul UUU. Pe msur ce molecula de ARNm se deplaseaz prin ribozom, aminoacizii adui de ARNt vor fi adugai covalent la catena polipeptidic ori de cte ori apare n ARNm codonul corespunztor.

Codon dup codon mesajul genetic este tradus pe msur ce ARNt-urile aduc aminoacizi n ordinea prescris, iar ribozomul i unete covalent ntr-o caten polipeptidic. ARNt este traductor sau molecul adaptor deoarece citete cuvintele din ARNm sau codonii i le traduce n cuvinte ale proteinei i anume aminoacizi.

FUNCIILE ARNt38

1.

Acurateea traducerii mesajului genetic implic doi pai de recunoatere: Trebuie s se realizeze o potrivire corect ntre ARNt i un aminoacid. Un ARNt care se leag la un codon care specific pentru un aminoacid trebuie s transporte la ribozom doar acel aminoacid codificat de codonul respectiv. Fiecare aminoacid este ataat la ARNt corect de ctre o enzim specific numit aminoacil-ARNt sintetaza. Situsul activ al fiecrui tip de sintetaz permite doar o combinaie specific de ARNt i aminoacid. Exist 20 de tipuri diferite de sintetaze, cte una pentru fiecare aminoacid. Fiecare sintetaz este capabil s lege aminoacidul specific la toate tipurile diferite de ARNt care conin anticodoni complementari codonilor sinonimi care codific pentru aminoacidul caracteristic sintetazei. Sintetaza catalizeaz ataarea covalent a aminoacidului la ARNt specific, proces energizat prin hidroliza ATP i numit activarea aminoacidului, rezultatul fiind aminoacilARNtaa = aminoacid activat, este eliberat de enzim i n acest fel ARNt transport aminoacidul ctre catena polipeptidic n cretere din ribozom. (Aminoacid activat = aminoacid legat covalent la ARNt, la captul 3 de la nivelul braului acceptor al moleculei.) 2. Al doilea pas de recunoatere presupune o potrivire corect ntre anticodonul din ARNt i codonul din ARNm. Dac ar exista cte un tip de ARNt pentru fiecare codon ARNm ar trebui s fie 61 tipuri de ARNt. De fapt sunt doar cca. 45, deci unii ARNt trebuie s fie capabili s recunoasc i s se lege la mai mult de un codon. O asemenea versatilitate este posibil deoarece regulile de mperechere ntre a treia baz a codonului i baza corespondent din anticodonul ARNt nu se poate aplica la fel de strict ca n replicare i n transcriere. De exemplu: U de la captul 5 al anticodonului se poate mperechea cu A sau G din poziia a treia (captul 3) a codonului. Relaxarea regulii de mperechere = WOBBLE explic de ce codoni sinonimi difer prin baza a treia, dar n mod normal nu i prin celelalte baze.

RIBOSOMUL39

Ribosomul faciliteaz cuplarea specific ntre anticodonul ARNt i codonul ARNm n timpul sintezei proteice. Ribosomul, care este suficient de mare pentru a fi vazut la microscopul electronic, este alctuit din dou subuniti subunitatea mare i subunitatea mic. Subunitile ribozomale sunt alctuite din proteine i un tip de ARN ARNr. La EK genele pentru ARNr din cromosom (vezi Tipuri de ARN) sunt transcrise i ARNr este procesat i asamblat la nivelul nucleolului cu proteine importate din citoplasm, rezultnd subunitile ribosomale care sunt apoi exportate, prin porii nucleari, n citoplasm. Att la PK ct i la EK, subunitile (mic i mare) se asociaz pentru a forma ribozomul funcional doar cnd se ataeaz de o molecul ARNm. Aproximativ 2/3 din masa ribosomului este ARNr. Deoarece o celul conine mii de ribosomi, ARNr este cel mai abundent tip de ARN. Cu toate c ribosomii de la PK i cei de la EK sunt foarte similari ca structur i funcie, cei de la EK sunt puin mai mari i difer ntructva prin compoziia molecular. Aceste diferene au importan n clinic (clinic semnificative). Anumite antibiotice pot inactiva ribozomii de la PK fr a inhiba abilitatea ribosomilor EK de a sintetiza proteine. Aceste antibiotice (tetraciclin si streptomicin) sunt utilizate n combaterea infeciilor bacteriene. Structura ribosomului i reflect funcia aducerea mpreun a ARNm i ARNt-uri purttoare de aminoacizi. n afar de un situs de legare la ARNm, fiecare ribosom are 3 situsuri pentru legarea ARNt: - situsul P situsul peptidil-ARNt conine ARNt care poart catena polipeptidic n cretere. - situsul A situsul aminoacil-ARNt conine ARNt-ul care poart urmtorul aminoacid care va fi adugat la catena polipeptidic - ARNt descarcat de aminoacid prsete ribosomul din situsul E (exit)

Ribosomul ine ARNt i ARNm n strns apropiere i poziioneaz noul aminoacid pentru adiia la captul COOH al unui polipeptid n cretere, apoi catalizeaz formarea unei legturi peptidice. Pe masur ce se alungete, polipeptidul trece printr-un tunel de ieire (exit tunnel) din subunitatea mare. Cnd polipeptidul este complet, este eliberat n citosol prin tunelul de ieire.

40

Cercetri recente susin ipoteza c nu proteinele, ci ARNr este responsabil n mod primar att de structura ct i de funcia ribosomului. Proteinele, situate mai ales la exterior, constituie suport pentru modificrile conformaionale ale moleculelor de ARNr pe care acestea le sufer n timp ce catalizeaz traducerea. ARN este principalul component al interfeei dintre cele dou subuniti pe de o parte i situsurile A i P pe de alt parte; ARN este catalizatorul formrii legturii peptidice. Astfel, ribosomul poate fi considerat o ribozim uria.

TRADUCEREA = SINTEZA UNUI POLIPEPTIDSe desfoar n 3 etape: 1. iniierea; 2. alungirea; 3. terminarea Toate cele trei etape necesit factori proteici care ajut ARNm, ARNt si ribozomul n procesul traducerii. Iniierea i alungirea necesit energie asigurat prin hidroliza GTP (guanozin-trifosfat).

1) Asamblarea ribozomului i iniierea traduceriiEtapa de iniiere aduce mpreun ARNm, ARNt (purttor al primului aminoacid din polipeptid) i cele 2 subuniti ribozomale. Subunitatea mic se leag de ARNm si de ARNt iniiator care poart aminoacidul metionin (Met). ARNt iniiator = Met-ARNtMet adic metionil-ARNt. Subunitatea mic se deplaseaz n aval pe molecula de ARNm pe care o scaneaz pn cnd gsete codonul START (AUG) care semnalizeaz nceputul traducerii i marcheaz nceputul cadrului de citire din ARNm. ARNt iniiator, deja asociat n acest complex, se leag la codonul START din ARNm care formeaz cu anticodonul puni de H. La complexul [ARNm ARNt subunitatea ribozomal mic] se ataeaz i subunitatea mare, completnd complexul de iniiere a traducerii.

Proteine = factori de iniiere sunt necesare pentru a aduce aceste componente mpreun. Celula consum energie sub form de GTP pentru formarea complexului de iniiere. La finalul formrii complexului de iniiere: - Met-ARNtMet sau ARNt iniiator ocup situsul P din ribosom - Situsul A vacant este pregtit s primeasc urmtorul aminoacil-ARNtaa Polipeptidul este ntotdeauna sintetizat ntr-o singur direcie de la Metonina iniial de la captul amino-terminal (NH2-terminal sau N-terminal) spre ultimul aminoacid de la captul carboxil-terminal (COOH-terminal sau C-terminal). 41

2) Alungirea catenei polipeptidiceAminoacizii noi sunt adugai unul cte unul la aminoacidul precedent. Fiecare adiie implic participarea ctorva proteine factori de elongare i se desfoar ntr-un ciclu cu trei etape: a) recunoaterea codonului anticodonul unui aminoacil-ARNtaa care tocmai a ajuns la ribosom se mperecheaz prin complementaritate cu codonul corespunztor din situsul A. Hidroliza GTP crete acurateea i eficiena acestei etape. b) formarea legturii peptidice o molecul de ARNr din subunitatea mare catalizeaz formarea unei legturi peptidice ntre noul aminoacid din situsul A i captul COOH al catenei polipeptidice n cretere, ataat de un ARNt n situsul P. Polipeptidul se va ataa la ARNt din situsul A, la care era legat noul aminoacid adugat. c) translocarea ribosomul transloc ARNt din situsul A n situsul P. ARNt gol (neocupat) din situsul P este mutat n situsul E i de aici este eliberat din ribosom. Situsul A devine din nou liber s primeasc un alt aminoacil-ARNtaa i ciclul se reia.

Consum de energie se realizeaz n etapele a) i c). Recunoaterea codonului necesit hidroliza a dou molecule de GTP, proces care crete precizia i acurateea etapei. nc un GTP este hidrolizat ca s asigure energia necesar deplasrii cu un codon a ribosomului pe ARNm (translocare). ARNm este deplasat prin ribosom ntr-o singur direcie, adic ribosomul se deplaseaz pe ARNm n sensul 5-3. ARNm i ribosomul se mic relativ unul fa de cellalt, unidirecional, codon dup codon. Ciclul de elongare/alungire la PK dureaz mai puin de 1/10 secunde i se repet pn cnd polipeptidul este complet. 42

3) Terminarea traduceriiAlungirea continu pn cnd un codon STOP (UAG, UGA sau UAA) din ARNm ajunge n situsul A al ribosomului. O protein numit factor de eliberare se leag direct la codonul STOP din situsul A i determin adiia unei molecule de ap n loc de un aminoacid la catena polipeptidic. Aceast reacie hidrolizeaz polipeptidul complet de ARNt din situsul P, elibernd polipeptidul prin tunelul de ieire al subunitii mari a ribosomului. Ulterior se dezasambleaz i restul complexului de traducere.

REZUMAT

43

TEST I SEMESTRUL I 1.Ce este genetica? 2.Cine i cnd a introdus termenii de genetic i de gene? 3.Definii ereditatea. 4.Ce sunt caracterele ereditare? Ce proprietate a lor le face s fie ereditare? 5.Ce sunt i de ce variaiile sunt expresia discontinuitii fenomenului ereditar? 6.Definii variabilitatea. 7.Explicai ce nseamn modificaie. 8.Comparai variaiile ereditare cu cele neereditare asemnri i deosebiri. 9.Ce este selecia artificial i care este relaia ei cu genetica? 10. Ce nseamn anul 1865 pentru genetic? 11. Care este contribuia lui Correns, Tschermak i de Vries la dezvoltarea geneticii? 12. Care este relaia dintre Sutton, Boveri, Morgan, Drosophila melanogaster i cromosomi? 13. Ce au nsemnat cercetrile lui F. Griffith pentru dezvoltarea geneticii? 14. Cine i cnd a emis ipoteza tetranucleotidului i ce importan a avut aceasta n genetic? 15. Care este i ce semnificaie are bomba lui Avery? 16. Ce semnificaie are anul 1953 n istoria geneticii i a tiinei n general? 17. n afar de acizii nucleici, care sunt celelalte categorii de compui bioorganici din alctuirea materiei vii? 18. Ce roluri au acizii nucleici? 19. Stabilii relaia dintre Miescher, Altmann, Levene, nuclein, acid nucleic, acid timonucleic i acid zimonucleic. 20. De ce acizii nucleici sunt polimeri? 21. Care este monomerul acizilor nucleici? 22. Din ce este alctuit un ribonucleotid? 23. Care este baza azotat specific ARN-ului? 24. Din ce este alctuit un deoxiribonucleotid? 25. Care este compusul chimic comun tuturor nucleotidelor, att din ADN, ct i din ARN? 26. Care sunt pentozele din acizii nucleici? Stabilii diferena/diferenele ntre ele. 27. De cte tipuri (i care sunt acestea) sunt bazele azotate? 28. Care sunt bazele azotate pirimidinice? 29. Care sunt bazele azotate purinice? 30. Din ce este alctuit un nucleozid? 31. Care sunt nucleozidele din ARN? 32. Care sunt nucleozidele din ADN? 33. Scriei formula nucleotidului dTDP. Denumii-l. 34. Scriei formula nucleotidului dGDP. Denumii-l. 35. Scriei formula nucleotidului dATP. Denumii-l. 36. Scriei formula nucleotidului dAMP. Denumii-l. 37. Scriei formula nucleotidului dCDP. Denumii-l. 38. Scriei formula nucleotidului dUTP. Denumii-l. 39. Scriei formula nucleotidului TMP. Denumii-l. 40. Scriei formula nucleotidului UTP. Denumii-l. 41. Scriei formula nucleotidului AMP. Denumii-l. 42. Scriei formula nucleotidului GMP. Denumii-l. 43. Care este diferena ntre nucleotidele incluse n catena de acid nucleic i cele libere? 44

44. Ce caracteristici ale acidului nucleic i definesc structura primar? 45. Cine asigur legtura (i ce fel de legtur este) ntre nucleotidele succesive dintr-o monocaten de acid nucleic? 46. Cum se formeaz puntea fosfodiesteric i de ce se numete aa? 47. n ce const polaritatea unui nucleotid? Ce consecine decurg din aceast caracteristic? 48. Explicai ce nseamn c o monocaten de acid nucleic este polarizat? Ce determin polarizarea catenei? 49. Care atomi ai nucleotidelor nvecinate particip la formarea punii fosfodiesterice? 50. Unde se face legtura ntre o baz purinic i o pentoz i ce rezult din legarea covalent a celor dou? 51. Unde se face legtura ntre o baz pirimidinic i o pentoz i ce rezult din legarea covalent a celor dou? 52. Cum se numesc capetele monocatenei de acid nucleic, care sunt semnificaia i originea lor? 53. Care este componenta nespecific a unei monocatene de acid nucleic? 54. Care este componenta nespecific a unui nucleotid? 55. Care este componenta specific a unei monocatene de acid nucleic? 56. Ce este i cum se formeaz coloana glucidofosforic a unei catene de acid nucleic? 57. De ce coloana glucidofosforic a unei catene de acid nucleic reprezint partea nespecific a acesteia? 58. De ce atunci cnd vorbim de structura secundar a acizilor nucleici, ne referim de fapt la structura ADN? 59. Care este diferena esenial ntre structura primar i cea secundar a acizilor nucleici? 60. Explicai i schematizai faptul c ADN este bicatenar helical dextrogir. 61. Caracterizai succint ntr-o fraz structura secundar a ADN. 62. Explicai antiparalelismul catenelor din molecula de ADN. 63. Explicai complementaritatea monocatenelor din molecula de ADN. Exemplificai. 64. Cum sunt poziionate bazele azotate n ansamblul dublului helix ADN? 65. Care sunt perechile posibile de baze azotate complementare deduse de Watson i Crick? 66. De ce o pereche de baze azotate nu poate s conin baze de acelai tip? 67. Care sunt argumentele pe baza crora Watson i Crick au dedus complementaritatea bazelor azotate i implicit a catenelor ADN? 68. Ce fel de i cte legturi se stabilesc ntre A i T? Care este tria lor? 69. Ce fel de i cte legturi se stabilesc ntre G i C? Care este tria lor? 70. Ce importan au legturile de hidrogen n structura secundar a ADN? Unde se ntlnesc? 71. Ce importan au legturile covalente n structura secundar a ADN? Unde se ntlnesc? 72. Care este importana practic a cunoaterii fenomenului de complementaritate ntre bazele azotate? 73. Ce i care sunt fosele moleculei de ADN i ce importan au ele? 74. Cum sunt meninute mpreun cele dou monocatene ADN? Care componente ale lor particip la aceast solidarizare? 75. Descriei analogia dintre molecula de ADN i o scar n spiral. 76. Ce este pasul elicei ADN, ce lungime are, cte perechi de baze conine un tur de spir? 45

77. Care este defazarea unghiular ntre dou perechi succesive de baze azotate din structura ADN? Cum se deduce aceast valoare? 78. Ce s-ar ntmpla dac n dublul helix ADN s-ar mperechea dou baze purinice? 79. Ce s-ar ntmpla dac n dublul helix ADN s-ar mperechea dou baze pirimidinice? 80. Ce este denaturarea enzimatic? 81. Care este contribuia lui Astbury i Bell la elucidarea structurrii secundare a ADN? 82. Enunai legea nti a lui Chargaff. Precizai n ce fel a ajutat aceast lege la elucidarea structurii secundare a ADN. 83. Enunai legea a doua a lui Chargaff i precizai semnificaia acesteia. 84. Ce s-a dedus din imaginile rezultate n urma difraciei n raze X realizate pe ADN, privitor la structura acesteia? 85. Ce este denaturarea termic? Ce rezult prin acest proces? 86. Ce se ntmpl dac readucem brusc temperatura unei soluii cu ADN denaturat, de la 90C la 40C? 87. Ce se ntmpl dac readucem lent temperatura unei soluii cu ADN denaturat, de la 90C la 40C? 88. Precizai dou diferene ntre denaturarea fiziologic i cea termic. 89. Care este importana practic a proceselor de denaturare i renaturare a ADN? 90. Explicai ce nseamn c ARN este o molecul poliribonucleotidic. 91. Care sunt compuii chimici care se gsesc doar n alctuirea ARN-ului? 92. Ce rol general are ADN n toate sistemele biologice i la deoxiribovirusuri? 93. Ce rol general are ARN n toate sistemele biologice i la deoxiribovirusuri? 94. Ce rol are ARN la ribovirusuri? 95. Dai exemple de virusuri cu genom ARN. 96. Pe ce criterii se difereniaz diversele tipuri de ARN? 97. Care sunt principalele tipuri de ARN celulare? 98. Unde se gsete i care sunt rolurile ARNr? 99. n ce const rolul funcional al ARNr? 100. Ce sunt genele ADNr i unde sunt localizate? 101. Din ce i unde se formeaz subunitile ribozomale? 102. De ce moleculele de ARNm sunt de dimensiuni variate? 103. De ce este nevoie de ARNm n procesul de exprimare/utilizare a informaiei genetice? 104. Unde (n care compartimente celulare) se gsete depozitat informaia genetic i unde se utilizeaz acesta la eucariote? 105. Ce rol are ARNm? 106. Care este diferena ntre ARNm de la procariote i ARNm de la eucariote? 107. Ce este pre-ARNm i ce se soart are? 108. Ce form bidimensional are molecula de ARNt i din cte nucleotide este alctuit? 109. Care sunt nivelurile structurale ale moleculei de ARNt? 110. Descriei structura teriar a ARNt. 111. Care sunt particularitile moleculelor de ARNt? 112. Schematizai forma bidimensional a moleculei de ARNt. 113. Cum sunt stabilizate regiunile bicatenare ale moleculei de ARNt? 114. Care sunt perechile de baze azotate complementare din structura regiunilor bicatenare ale ARNt? 115. Care sunt bazele azotate atipice din structura ARNt? 116. Care sunt braele i buclele caracteristice ARNt? 46

117. Unde sunt situate capetele 3 i 5 ale moleculei de ARNt i ce particulariti prezint? 118. Ce conine i ce rol are bucla NODOC? 119. Ce rol are cptul 3 al moleculei de ARNt? 120. Care este rolul ARNt n procesul de sintez proteic? 121. Descriei ARNsn i ARNsno. 122. Descriei SRP-ARN, ARNsi i miARN. 123. Ce rol are XISTARN? TEST II i TEZ SEMESTRUL I 1. 2. 3. 4. 5. Care sunt funciile ADN-ului? Ce presupune funcia autocatalitic a ADN-ului i prin ce proces se realizeaz? Ce presupune funcia heterocatalitic a ADN-ului? Care sunt etapele expresiei genice? Care sunt procesele biologice i biochimice fundamentale de care depinde existena i persistena spaio-temporal a vieii pe Pmnt? 6. De ce replicarea este caracteristic doar acizilor nucleici? 7. Care este explicaia molecular a asemnrii dintre prini i descendeni (pe ce se bazeaz aceast asemnare)? 8. Cum asigur replicarea persistena spaio-temporal a sistemelor biologice? 9. Enunai principiul fundamental al replicrii. 10. La finalul replicrii mai exist molecula parental de ADN? Dac da, n ce form? 11. Stabilii gradul se asemnare ntre moleculele-fiice de ADN rezultate prin replicare i ntre acestea i molecula parental. 12. Care sunt principiile sistemelor autoreplicative? 13. Care caracteristic a ADN-ului reprezint informaia genetic? 14. De ce replicarea are drept scop dublarea cantitii de informaie genetic? 15. Care este fundamentul autoreproducerii i mecanismul esenial al replicrii? 16. Care este relaia dintre secvena de baze azotate a catenei replic i cea a catenei matri? 17. Care sunt modelele care explic mecanismul replicrii? 18. Explicai i schematizai modelul dispersiv al replicrii. 19. Explicai i schematizai modelul conservativ al replicrii. 20. Cine i cnd a propus modelul semiconsevativ al replicrii? 21. Explicai i schematizai modelul semiconservativ al replicrii. 22. Cum este organizat materialul genetic la procariote? 23. Care este dimensiunea aproximativ (exprimat n perechi de baze) i unde este localizat materialul genetic la procariote? 24. Cum este organizat materialul genetic la eucariote? 25. Care este dimensiunea aproximativ (exprimat n perechi de baze) i unde este localizat materialul genetic la eucariote? 26. De ce durata replicrii la eucariote nu este cu mult mai mare dect la procariote? 27. Comparai cantitativ i ca localizare materialul genetic de la procariote cu cel de la eucariote. 28. Care sunt etapele sintezei in vivo a acizilor nucleici? 29. Care sunt precursorii biochimici ai nucleotidelor purinice i pirimidinice? 30. Care sunt nucleotidele care vor participa la polimerizare ntr-o caten nou de acid nucleic? 31. Prin ce proces se realizeaz polimerizarea ordonat a nucleotidelor ntr-o caten nou de acid nucleic? 32. Explicai i schematizai modelul fermoar al replicrii. 47

33. Ce este i cum se formeaz un ochi de replicare? 34. Ce sunt bifurcaiile de replicare? Ce form au i unde sunt situate? 35. Care sunt etapele replicrii? 36. De unde ncepe replicarea? Ce particulariti au aceste regiuni? 37. De ce originile replicrii sunt bogate n perechi A=T? 38. Comparai numrul de origini ale replicrii la procariote i la eucariote. Corelai cu durata replicrii. 39. Care este prima enzim care intervine la nivelul originii i cum acioneaz aceasta? 40. Care este efectul interveniei helicazei pe molecula de ADN la nivelul originii replicrii? 41. Cte molecule de helicaz acioneaz la nivelul unui ochi de replicare? Unde sunt situate i ce efect au asupra ochiului de replicare? 42. Ce sunt topoizomerazele? 43. Unde acioneaz topoizomeraza I pe molecula parental de ADN i ce efect are? 44. De ce trebuie s intervin topoizomeraza pe molecula parental de ADN? 45. Care este mecanismul de aciune a topoizomerazei I pe molecula parental de ADN? 46. Ce s-ar ntmpla n absena topoizomerazei I? 47. Ce sunt proteinele ssb? La ce nivel vor aciona acestea? 48. Ce rol au proteinele ssb? De ce este nevoie de aceste proteine? 49. Ce este primaza i ce rol are? 50. Ce rezult n urma aciunii primazei? 51. Ce este primerul? 52. Ce rol are primerul? 53. Primaza folosete o matri pentru sinteza primerului? Dac da, care este aceasta? 54. Cte i care sunt ADN-polimerazele de la procariote? 55. Ce roluri are enzima lui Kornberg? 56. Care dintre ADN-polimerazele de la procariote este enzima polimerizatoare propriuzis? Dar la eucariote? 57. Ce nseamn c ADN-polimerazele au specificitate de sens? 58. n ce sens se deplaseaz pe matri ADN-polimerazele? Cum se numete proprietatea lor de a se deplasa doar n acest sens? 59. n ce sens se alungete catena replic sub influena ADN-polimerazelor? 60. De ce ADN-polimerazele au nevoie de un capt 3-OH? 61. Cum acioneaz ADN-polimerazele la captul 3-OH al unei catene preexistente? 62. Prin ce fel de legturi (i cum se numesc) sunt legate nucleotidele noi la captul 3 al catenei n cretere? 63. Care sunt situsurile specifice ale moleculelor de ADN-polimeraz? 64. De cte ori i unde acioneaz primaza pe matria 3-5? 65. Cum se alungete catena replic 5-3? 66. De cte ori acioneaz ADN-plimeraza III pe matria 3-5? 67. Care este catena conductoare i cum este aceasta sintetizat? 68. n ce sens se realizeaz alungirea net a catenei replic 3-5 (folosii ca repere originea replicrii i bifurcaia de replicare)? 69. De cte ori i unde acioneaz primaza pe matria 5-3? 70. Ce sintetizeaz ADN-polimeraza III pe matria 5-3? n ce sens? 71. Ce sunt fragmentele Okazaki? Cine i pe ce matri le sintetizeaz? 72. Care este sensul n care se alungesc fragmentele Okazaki (folosii ca repere att polaritatea fragmentului, ct i originea replicrii)? 73. Care caten replic este sintetizat discontinuu? Ce nseamn acest lucru? 74. De ce catena replic 3-5 se numete ntrziat? 75. De cte ori acioneaz ADN-polimeraza III pe catena matri 5-3? 76. Care este dimensiunea fragmentelor Okazaki la procariote i la eucariote? 48

77. Explicai activitatea RN-azic a ADN-polimerazei I. De ce este necesar o asemenea activitate? 78. Cum acioneaz ADN-polimeraza I asupra primerilor din catena ntrziat? 79. De ce trebuiesc excizai primerii din catena replic 3-5? 80. Ce se va ntmpla cu golul rmas n catena replic 3-5 n urma exciziei primerului? 81. Ce fel de nucleotide vor fi folosite i de ctre ce enzim pentru umplerea golului rmas dup excizia primerului? 82. n ce sens sunt adugate (i de ctre ce enzim) deoxiribonucleotide n locul primerului excizat? 83. Cine ofer ADN-polimerazei I captul 3-OH necesar aciunii enzimei i n ce const aceast aciune? 84. De ce nu poate asigura ADN polimeraza I continuitatea covalent a catenei replic 35? 85. Ce nu poate s realizeze ADN polimeraza I la finalul activitii ei de umplere a golului rmas n urma exciziei primerului? 86. Pe ce caten replic acioneaz i ce rol are ADN-ligaza? 87. Care este ultima enzim care acioneaz pe catena replic 3-5 i ce efect are aceasta? 88. Ce rol au topoizomerazele pe moleculele-fiice de ADN dup terminarea replicrii? 89. Cum se termin replicarea la procariote? 90. Cum se termin replicarea la eucariote? 91. Ce este replisomul? 92. Ce este un replicon? Care sunt elementele definitorii? 93. De ce cromozomul bacterian este monoreplicon? 94. De ce cromozomul eucariot este multireplicon? 95. Ce roluri pot ndeplini proteinele n sistemele biologice? Exemplificai. 96. Ce sunt proteinele dpdv biochimic? 97. De ce s-a crezut iniial c informaia genetic este deinut de proteine? 98. Care a fost problema generat de dovedirea c ADN este substratul chimic al ereditii i nu proteinele? 99. Ce este un codon? 100. De ce ipoteza lui Levene a ntrziat mult stabilirea c acizii nucleici dein informaia genetic, i nu proteinele? 101. Ce nseamn coliniaritate? 102. Care este corespondena ntre nucleotide i aminoacizi, care este relaia numeric? 103. Care este unitatea de codificare genetic? 104. Ci codoni exist, cum s-a ajuns la acest numr i ce reprezint totalitatea codonilor? 105. Ce este codul genetic informaional? Ce proprieti are? 106. Ce este codul genetic operaional? Ce proprieti are? 107. Ce este cadrul de citire? 108. Ce sunt (i ci) codonii sens? 109. Care este i ce rol are codonul START? Este i codon sens? Dac da, pentru ce aminoacid codific? 110. Ce sunt i care sunt codonii STOP? Ce rol au? 111. Explicai neacoperirea sau nesuprapunerea codului genetic. 112. Explicai lipsa virgulelor din codul genetic. 113. Explicai redundana codului genetic. Precizai excepiile de la redundan. 114. De ce codul genetic este considerat a fi universal? 115. Dai cele dou definiii ale genei. 116. Care sunt etapele evoluiei relaiei dintre gen i produsul ei final? 117. Caracterizai, pe scurt, transcrierea, apelnd la o analogie lingvistic adecvat. 118. Caracterizai, pe scurt, traducerea, apelnd la o analogie lingvistic adecvat. 49

119. Unde se realizeaz i ce presupune traducerea mesajului genetic? 120. Prezentai dogma central a geneticii, identificnd cele dou funcii ale ADN-ului. 121. Care este utilitatea prezenei ARN-ului ntre ADN i proteine n dogma central? 122. Comparai desfurarea funciei heterocatalitice la procariote i la eucariote dpdv al locului desfurrii. 123. Comparai rezultatul transcrierii de la procariote cu cel de la eucariote. 124. Precizai, pe scurt, mecanismul transcrierii. 125. n ce sens se deplaseaz pe matri ARN polimeraza? Comparai cu ADN polimerazele. 126. Ce este o unitate de transcriere? 127. Cte ARN polimeraze exist la procariote? Dar la eucariote? 128. Comparai ARN polmeraza cu primaza. 129. Comparai ARN polimeraze cu ADN polimeraza. 130. Ce este i unde este situat promotorul? 131. Care sunt rolurile promotorului? 132. Din ce este alctuit complexul de iniiere a transcrierii la procariote? 133. Din ce este alctuit complexul de iniiere a transcrierii la eucariote? 134. Comparai ARN polimeraza de la procariote cu ARN polimeraza II. 135. Ce sunt factorii transcripionali? Ce rol au? 136. Ce este, unde este situat i ce rol are cutia TATA? 137. Prin ce capt crete catena ARN? 138. Sinteza ARNm necesit matri? Dac da, care este aceasta? 139. Ce se ntmpl cu molecula de ARN n urma ARN polimerazei? Dar cu cele dou catene ADN i cu ochiul de transcriere? 140. Cum pot rezulta mai multe copii ale aceleiai molecule de ARNm, folosind o singur gen? 141. Cum se termin transcrierea la procariote? 142. Ce este secvena pentru semnalul de poliadenilare? 143. Ce este i ce rol are semnalul de poliadenilare? 144. Cum i cnd este eliberat transcriptul primar pre-ARNm din catena ARN n cretere? 145. Care i ce presupun sunt modificrile suferite de capetele moleculei de ARNm? Care modificare se realizeaz prima? 146. Care sunt rolurile modificrilor capetelor moleculei de ARNm? 147. Ce sunt intronii i unde se gsesc? 148. Ce sunt exonii i unde se gsesc? 149. De ce trebuiesc eliminai intronii din ARNm? 150. Cine i unde realizeaz excizia intronilor? Cum se numete procesul? Ce se ntmpl cu exonii ulterior? 151. Ce fel de ARNm (din ce este alctuit) prsete nucleul spre a fi tradus n ribozom? 152. Care sunt situsurile ribozomului i ce rol are fiecare? 153. Explicai de ce sunt suficiente doar 45 de tipuri de ARNt pentru cei 61 de codoni. 154. Care sunt etapele traducerii i care dintre acestea neesit energie pentru desfurare? 155. Descriei starea final a complexului de iniiere a traducerii. 156. Descriei etapa a doua a ciclului de elongare a catenei polipeptidice. 157. Care dintre etapele ciclului de elongare a catenei polipeptidice sunt consumatoare de energie i n ce scop se consum?